DE10131687A1

DE10131687A1 - Vorrichtung zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen bei gleichzeitiger Verfolgung der Bildung von Amplifikationsprodukten

Info

Publication number: DE10131687A1
Application number: DE10131687A
Authority: DE
Inventors: Reiner Spolaczyk
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2003-01-16
Also published as: WO2003002991A3; WO2003002991A2; US7102131B2; US20040141178A1

Abstract

Vorrichtung zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktionen bei gleichzeitiger Verfolgung der Bildung von Amplifikationsprodukten, mit einem Thermocycler mit mehreren temperierbaren Aufnahmen für Reaktionsgefäße, einer Beleuchtungseinrichtung mit der Anregungslicht in die Aufnahmen des Thermocyclers strahlbar ist, einem zwischen der Beleuchtungseinrichtung und den Aufnahmen angeordneten Strahlteiler, der aus Aufnahmen emittiertes Licht reflektiert und einem Detektor, der vom Strahlteiler reflektiertes Licht erfaßt, ist dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung mehrere Leuchtdioden (14) umfaßt, die jeweils mindestens einer Aufnahme (12) zugeordnet sind.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.
Gattungsgemäße Vorrichtungen dienen zur Durchführung von Nukleinsäure- Amplifizierungsverfahren (im folgenden auch PCR-Reaktion genannt). Als Zusatzfunktion bieten sie die Möglichkeit, die Bildung der Amplifikationsprodukte (PCR-Produkte) während der PCR-Reaktion zu verfolgen.
Die Verfolgung der Bildung der PCR-Produkte während der PCR-Reaktion ist interessant, da die Auswertung der PCR-Reaktion erleichtert bzw. deutlich beschleunigt wird, wenn man bereits während der Reaktion die amplifizierten PCR- Produkte quantifizieren kann und nicht erst in einer nachgeschalteten Analyse. Außerdem können die während der PCR-Reaktion gemessenen Werte zur Optimierung des laufenden Reaktion verwenden werden, z. B. zur Anpassung der Annealing-Temperatur etc.
Üblicherweise ist in den in gattungsgemäßen Vorrichtungen untersuchten PCR- Ansätzen mind. ein spezieller Fluoreszenzindikator enthalten. Bei dem Fluoreszenzindikator karin es sich z. B. um fluoreszenzmarkierte DNA-Hybridisierungssonden handeln, die an komplementäre Regionen der Target-DNA binden und in gebundenen Zustand nach Bestrahlung mit Anregungslicht ein meßbares Fluoreszenzsignal emittieren.
Denkbar ist auch die Verwendung intercalierender Farbstoffe, z. B. Sybr-Green, die sich unspezifisch in Doppelstrang-DNA einlagern und in eingelagertem Zustand ein Fluoreszenzsignal abgeben.
In beiden Fällen läßt sich eine mit fortschreitender PCR-Reaktion erfolgte Zunahme der PCR-Produkte über einen meßbaren Fluoreszenzanstieg verfolgen. Es gibt noch weitere geeignete Fluoreszenzindikatoren, auf die hier im einzelnen nicht eingegangen werden soll. Es wird ergänzend auf die Veröffentlichung von: "Neusser; Transkript Laborwelt Nr. 2/2000; "Echtzeit-PCR-Verfahren zur Quantifizierung von PCR-Produkten" verwiesen, in der die unterschiedlichen Möglichkeiten ausführlich beschrieben sind.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung ist z. B. aus der EP 0640828 bekannt. Die bekannte Vorrichtung weist einen Thermocycler mit mehreren temperierbaren Aufnahmen für Reaktionsgefäße auf, der im wesentlichen den üblichen PCR-Cyclern entspricht. Weiterhin ist eine Beleuchtungseinrichtung vorgesehen, mit der Anregungslicht in die Aufnahmen des Thermocylcers gestrahlt werden kann. Zwischen Beleuchtungseinrichtung und Aufnahmen ist ein dichroitischer Spiegel vorgesehen, der in Abhängigkeit von der Wellenlänge das auftreffende Licht durchläßt oder reflektiert. Bei der gattungsgemäßen Vorrichtung läßt der Spiegel das von der Beleuchtungseinrichtung kommende Anregungslicht zu den Aufnahmen durch, und reflektiert das aus den Aufnahmen emittierte etwas langwelligere Fluoreszenzsignal seitlich auf einen Detektor. Nachteilig an der bekannten Vorrichtung ist, daß alle Aufnahmen gleichzeitig von der Beleuchtungseinrichtung mit Anregungslicht bestrahlt werden. Die von den Aufnahmen emittierten Fluoreszenzsignale müssen daher im Detektor ortsabhängig aufgelöst werden. Der Aufbau des Detektor ist daher relativ aufwendig. Ein weiterer Nachteil ist, daß sich die emittierten Fluoreszenzsignale aus den einzelnen Aufnahmen gegebenenfalls nicht sauber trennen lassen (Crosstalk), was zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen kann.
Eine weitere gattungsgemäße Vorrichtung mit in etwa dem oben beschriebenen grundsätzlichen Aufbau ist aus der EP 0706649 bekannt. Bei dieser Vorrichtung ist eine Lichtquelle vorgesehen, die über eine Multiplexeinrichtung optisch mit den Aufnahmen gekoppelt ist. Die Multiplexeinrichtung weist jeder Aufnahme zugeordnete Lichtleitfasern zu, in die das Anregungslicht sequentiell eingekoppelt werden kann. Die Fluoreszenzsignale werden über den selben Lichtweg zurück auf einen dichroitischen Spiegel gestrahlt, der diese auf den Detektor reflektiert. Die Multiplexeinrichtung ermöglicht einen in sich geschlossenen Lichtweg von und zu den Aufnahmen und verhindert dadurch den oben erwähnten Crosstalk. Nachteilig ist, daß die beschriebene Vorrichtung sehr aufwendig ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ausgehend vom Stand der Technik eine Vorrichtung bereitzustellen, bei der ein Auftreten von Crosstalk zwischen den Aufnahmen vermieden werden kann und die mit deutlich geringerem Aufwand als den bekannten Vorrichtungen zur realisieren ist.

Gelöst wird die Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist.

Danach ist vorgesehen, daß die Beleuchtungseinrichtung mehrere Leuchtdioden aufweist, die jeweils mindestens einer Aufnahme zugeordnet sind. Ansonsten stimmt der Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung im wesentlichen mit der gattungsgemäßer Vorrichtungen überein.

Auch bei der Erfindung ist ein Strahlteiler zwischen den als Beleuchtungseinrichung dienenden Leuchtdioden und den Aufnahmen des Cyclers vorgesehen, der das aus den Aufnahmen emittierte Licht seitlich auf einen Detektor reflektiert, der einen lichtempfindlichen Sensor aufweist.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist jeder Aufnahme eine Leuchtdiode zugeordnet. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist eine Steuerung vorgesehen, die die Leuchtdioden in vorgegebener Reihenfolge ein- und ausschaltet, so daß jeweils nur eine bzw. eine Gruppe von Aufnahmen beleuchtet wird.

Die Erfindung stellt damit eine gegenüber dem Stand der Technik deutlich einfacher zu realisierende Vorrichtung da, mit der einzelne Aufnahmen bzw. Gruppen von Aufnahmen selektiv beleuchtet werden können. Das aus der bzw. den Aufnahmen imitierte Licht wird vom Strahlteiler auf den Detektor reflektiert und dort jeweils verarbeitet. Es besteht keine Gefahr, daß sich Signale aus den einzelnen Aufnahmen überlagern.

Anders als bei gattunsgemäßen Vorrichtungen muß ein in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendbarer Detektor nicht in der Lage sein, Signale ortsabhängig aufzulösen, da jeweils nur ein Fluoreszenzsignal aus einer Aufnahme bzw. ein gemeinsames Signal aus einer Gruppe von Aufnahmen erfaßt wird.

Im einfachsten Fall enthält der Detektor nur einen lichtempfindlichen Sensor und entsprechende optische Einrichtungen, mit denen das vom Strahlteiler reflektierte Signal auf den Sensor abgebildet wird.

Im Idealfall ist die erfindungsgemäße Vorrichtung so ausgelegt, daß zur Zeit immer nur eine Aufnahme mit Anregungslicht bestrahlt wird. Denkbar ist aber auch, daß, wie oben ausgeführt, mehrere Aufnahmen gleichzeitig mit einer zugeordneten Leuchtdiode bestrahlt werden. Dies ist z. B. dann möglich, wenn in diesen Aufnahmen mehrere Parallelen eines PCR-Ansatzes behandelt werden, und das aus diesen Aufnahmen reflektierte Signal als Mittelwert der betreffenden Aufnahmen erfaßt werden soll.

Es versteht sich, daß die bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzten Leuchtdioden so gewählt werden, daß sie für den jeweils eingesetzten Fluoreszenzfarbstoff bzw., falls mehrere Indikatoren pro PCR-Ansatz vorgesehen sind, mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe abgestimmtes Anregungslicht ausstrahlen können.

Vorzugsweise wird den Leuchtdioden ein Kurzpaßfilter nachgeschaltet, der aus dem von den Leuchtdioden ausgestrahlten Licht den langwelligen Bereich abblockt.

Zwischen den Leuchtdioden und den Aufnahmen des Thermocyclers ist wie bei gattungsgemäßen Vorrichtungen ein Strahlteiler vorgesehen. Es kann sich dabei um einen üblichen Strahlteiler handeln, der jeweils einen bestimmten Prozentsatz des auftreffenden Lichtes durchläßt und den verbleibenden Teil reflektiert. Es kann sich aber auch um einen Wellenlängen abhängigen Strahlteiler handeln, z. B. einen dichroitischen Spiegel, der das Anregungslicht passieren läßt und das demgegenüber etwas langwelligere Fluoreszenzsignal reflektiert.

Wie oben angesprochen weist der Detektor mindestens einen lichtempfindlichen Sensor auf, der ein intensitätsabhängiges Signal generiert und enthält weiterhin optische Einrichtungen, die das aus den Aufnahmen emittierte und vom Strahlteiler reflektierte Licht auf dem Sensor abbilden. Bei dem Sensor kann es sich z. B. um einen CCD-Chip oder einen Fotomultiplier handeln.

Vorzugsweise weist die optische Einrichtung mehrere Lichtleiter auf, deren Eintrittsflächen jeweils mindestens einer Aufnahme zugeordnet sind und deren Lichtaustrittsflächen nebeneinander gebündelt angeordnet sind.

Mit den Lichtleitern können die aus den unterschiedlichen Aufnahmen des Thermocyclers emittierten Floureszenzsignale auf eine eng begrenzte Austrittsfläche zusammengeführt und von dort auf den Sensor weitergeleitet werden. Eine eng begrenzte Austrittsfläche kollimiert die austretenden Lichtstrahlen zu einem Bündel, dessen Ausbreitungsrichtungen sich nur wenig unterscheiden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die nachfolgenden Filter Interferenzfilter sind, deren spektrale Durchlaßcharakteristik abhängig vom Einfallswinkel auf das Filter ist.

Im weiteren Lichtweg ist vorzugsweise ein Langpaßfilter vorgesehen, der noch eventuell vorhandenes von den Leuchtdioden stammendes Anregungslicht herausfiltert. Gegebenenfalls können in dem Lichtweg noch weitere optische Linsen zur Fokussierung etc. vorgesehen werden.

Häufig werden PCR-Ansätze, bei denen die Bildung der PCR-Produkte verfolgt werden soll, nicht mit einem sondern mit mehreren bzw. ihrer Wellenlänge unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren durchgeführt. So kann z. B. zusätzlich ein nicht von der eigentlichen PCR-Reaktion beeinflußter Indikator vorgesehen werden, der lediglich zum Abgleich der einzelnen Ansätze untereinander gedacht ist.

Für diesen Fall und andere Fälle, in denen mehrere Fluoreszenzindikatoren eingesetzt werden, gibt es grundsätzlich die Möglichkeit, in dem Detektor einen Spektiometer vorzusehen, der die Signale von den unterschiedlichen Indikatoren wellenlängenabhängig auflöst, was allerdings sehr aufwendig ist.

Die Erfindung sieht in diesem Zusammenhang in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung vor, daß im Detektorstrahlengang mindestens ein dichroitischer Spiegel vorgesehen ist, der das Signal des einen Fluoreszenzindikators auf einen lichtempfindlichen Sensor durchläßt und das Signal eines anderen Fluoreszenzindikators auf einen weiteren lichtabhängigen Sensor reflektiert. Diese Ausgestaltung ist relativ einfach zu verwirklichen. Sie setzt lediglich voraus, daß der zusätzlich eingesetzte dichroitische Spiegel in seinen Eigenschaften auf die eingesetzten Fluoreszenzindikatoren abgestimmt ist.

Falls die spektrale Trennleistung der Spiegel nicht ausreicht, kann vor den Sensoren zusätzlich noch ein der Fluoreszenz des Farbstoffes angepaßtes Bandpaßfilter angeordnet werden.

Der Detektor schließlich kann mit einer Auswerteinrichtung versehen sein, die z. B. die entsprechenden Fluoreszenzsignale in PCR-Produkte umrechnet. Denkbar ist es aber auch, den Detektor über eine Schnittstelle mit einer externen Auswert- und ggf. Steuereinrichtung zu verbinden.

Wie oben ausgeführt, enthält die erfindungsgemäße Vorrichtung einen Thermocycler, der grundsätzlich übliche Bauweise aufweisen kann. Denkbar ist daher, in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung, die Beleuchtungseinrichtung, den Strahlteiler und den Detektor als nachrüstbare Einheit für bestehende Thermocycler auszubilden.

Im folgenden soll die Erfindung anhand einer Figur näher erläutert werden, die ein Ausführungsbeispiel 10 der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt.
Die Vorrichtung 10 weist einen schematisch dargestellten üblichen Thermocycler 11 mit Aufnahmen 12 auf. Im Betrieb werden in die Aufnahmen 12 nicht dargestellte Reaktionsgefäße eingesetzt, in denen jeweils ein PCR-Ansatz mit dem oben erwähnten Fluoreszenzindikator, bzw. den Indikatoren enthalten ist.
Auf den Thermocycler 11 ist ein Deckelgehäuse 13 aufgesetzt mit einer Beleuchtungseinrichtung mit mehreren Leuchtdioden 14. Jeweils eine Leuchtdiode 14 ist einer Aufnahme 12 zugeordnet. Vorzugsweise sind die Leuchtdioden 14 arrayförmig angeordnet. Bei der Messung werden die Leuchtdioden 14 vorzugsweise so geschaltet, daß immer nur jeweils eine zugeordnete Aufnahme 12 bestrahlt wird.
Ein beispielhafter Lichtweg ist mit 15, 15' dargestellt. Das Licht 15 wird von der Leuchtdiode 14 abgestrahlt, und passiert dann zunächst einen Kurzpaßfilter 16, mit dem langweilige Anteile herausgefiltert werden sollen. Danach tritt das Licht 15 durch einen Strahlteiler 17 hindurch, der in dieser Richtung vorzugsweise vollständig durchlässig ist.
Wie oben mehrfach ausgeführt, soll das von der Leuchtdiode 14 abgestrahlte Licht 15 einen, in einem PCR-Ansatz in der Aufnahme 12 befindlichen Fluoreszenzindikator anregen, woraufhin dieser ein Fluoreszenzsignal 15' emittiert. Der Strahlteiler 17 ist so beschaffen, daß das Fluoreszenzsignal 15' zur Seite hin reflektiert wird.
Vorzugsweise wird als Strahlenteiler 17 ein dichroitischer Spiegel eingesetzt, der das Anregungslicht durchläßt, das emittierte längerwellige Fluoreszenzsignal jedoch reflektiert.
Das reflektierte Fluoreszenzsignal 15' wird dann von einem Detektor 18 erfaßt. Der Detektor 18 weist optische Einrichtungen 19 auf, mit denen das Fluoreszenzsignal 15' auf einen lichtempfindlichen Sensor 27 abgebildet werden kann.
Im einzelnen umfaßt die optischen Einrichtungen 19 eine Reihe von Lichtleitfasern 20 mit Lichteintrittsflächen 21, die jeweils einer Aufnahme 12 bzw. den aus den Aufnahmen 12 emittierten und am Strahlteiler 17 reflektierten Fluoreszenzsignalen 15' zugeordnet sind.
Vorzugsweise sind die Eintrittsflächen 21 wiederum wie die Leuchtdioden 14 arrayförmig angeordnet.
Die Lichtleitfasern 20 sind an ihrem Austrittsende zu einem Bündel 23 zusammengefaßt. Durch die Bündelung wird erreicht, daß die Signale aus allen Aufnahmen 12 relativ dicht nebeneinander austreten. Wie oben erwähnt, ist eine eng begrenzte Austrittsfläche erforderlich, um die austretenden Lichtstrahlen zu einem Bündel zu kollimieren, dessen Ausbreitungsrichtungen sich nur wenig unterscheiden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die nachfolgenden Filter Interferenzfilter sind, deren spektrale Durchlaßcharakteristik abhängig vom Einfallswinkel auf das Filter ist.
Das Fluoreszenzsignal 15' wird von dem Lichtleiterbündel 23 dann über eine Linse 24 durch einen Langpaßfilter 25 und eine weitere Linse 26 auf den Sensor 27 abgebildet. Der Langpaßfilter 25 ist erforderlich, um gegebenenfalls aus dem Anregungslicht stammende Wellenlängenbereiche herauszufiltern.
Der Aufbau der gezeigten Ausführungsform ist relativ einfach und mit geringem Aufwand zu verwirklichen.
Für den Fall, daß mehrere Fluoreszenzindikatoren im PCR-Ansatz untersucht werden sollen, kann im Bereich der optischen Einrichtungen 19 nach z. B. dem Langpaßfilter 25 ein weiterer Strahlenteiler vorgesehen werden, der eines der beiden Fluoreszenzsignale durchläßt und das andere Fluoreszenzsignal reflektiert. Ordnet man in den entsprechenden Lichtwegen jeweils einen lichtempfindlichen Sensor an, dann lassen sich auch zwei oder gegebenenfalls mit weiteren Strahlenteilern auch noch mehr unterschiedliche Fluoreszenzsignale gleichzeitig verarbeiten.
Bei mehreren Fluoreszenzindikatoren kann zusätzlich vor dem Sensor ein Bandpaßfilter vorgesehen werden, um den Emissionsbereich des jeweiligen Indikators durchzulassen und den der anderen Indikatoren abzublocken. Denkbar ist auch, um die Anzahl der erforderlichen Sensoren zu limitieren, wechselbare Bandpaßfilter vorzusehen.
Um die thermischen Einflüsse zu kompensieren, kann die Vorrichtung einen Referenzlichtweg aufweisen, der analog zu dem Lichtweg 15, 15' verläuft, mit dem Unterschied, daß die dem Referenzlichtweg zugeordnete Leuchtdiode nicht einen PCR-Ansatz beleuchtet sondern eine Referenzfläche. Das von dieser Fläche reflektierte Licht wird vom Detektor ausgewertet, wobei Veränderungen während der PCR zur Korrektur der Meßwerte verwendet werden.

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen bei gleichzeitiger Verfolgung der Bildung von Amplifikationsprodukten, mit einem Thermocycler mit mehreren temperierbaren Aufnahmen für Reaktiongefäße, einer Beleuchtungseinrichtung mit der Anregungslicht in die Aufnahmen des Thermocylcers strahlbar ist, einem zwischen der Beleuchtungseinrichtung und den Aufnahmen angeordneten Strahlteiler, der aus den Aufnahmen emittiertes Licht reflektiert und einem Detektor, der vom Strahlteiler reflektiertes Licht erfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung mehrere Leuchtdioden (14) umfaßt, die jeweils mindestens einer Aufnahme (12) zugeordnet sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Leuchtdiodenarray mit pro Aufnahme (12) einer Leuchtdiode (14) vorgesehen ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Steuerung vorgesehen ist, die die Leuchtdioden (14) in vorgegebener Reihenfolge an- und ausschaltet.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuerung zur Zeit immer nur jeweils eine definierte Anzahl von Aufnahmen bestrahlt.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aufnahmen einzeln nacheinander von der Beleuchtungseinrichtung bestrahlt werden.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Leuchtdioden (14) so gewählt werden, daß das von ihnen abgestrahlte Licht in der Lage ist, ausgewählte Fluoreszenzfarbstoffe anzuregen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Abstrahlrichtung den Leuchtdioden (14) ein Kurzpaßfilter (16) nachgeschaltet ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (17) ein dichroitischer Spiegel ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (18) mindestens einen lichtempfindlichen Sensor (27) aufweist, der ein intensitätsabhängiges Signal generiert und optische Einrichtungen (19) vorgesehen sind, die das aus den Aufnahmen (12) emittierte und vom Strahlteiler (17) reflektierte Lichtsignal (15') auf den Sensor (27) abbilden.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Einrichtung (19) mehrere Lichtleiter (20) umfaßt, deren Lichteintrittsflächen (21) jeweils min. einer Aufnahme (12) zugeordnet sind, und deren Lichtaustrittsflächen in einem Bündel (23) nebeneinander angeordnet sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Lichtleiter (20) pro Aufnahme (12) vorgesehen ist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in der optischen Einrichtung (19) ein den Lichtleitern (14) nachgeschalteter Langpaßfilter (25) vorgesehen ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Detektor (18) ein weiterer Strahlteiler und jeweils dem Durchlass- oder Reflexionsstrahlenganges des Strahlteilers zugeordnete Sensoren vorgesehen sind.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor eine Auswerteinrichtung aufweist.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Beleuchtungseinrichtung und/oder Strahlenteiler und/oder Detektor als von dem Thermocycler (11) separierbare, nachrüstbare Einheit ausgebildet sind.