DE102006036171B4

DE102006036171B4 - Anordnung und Verfahren zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben

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Publication number: DE102006036171B4
Application number: DE200610036171
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. rer. nat. Winter; Andreas Dipl.-Ing. Möbius
Original assignee: Analytik Jena AG
Current assignee: Analytik Jena Gmbh+co Kg De
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2026-07-29
Also published as: WO2008011875A1; DE102006036171A1

Abstract

Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben umfassend
• einen Heizblock (1) mit Aufnahme (2) für PCR-Proben aufnehmende Kavitäten (41) einer Mikrotiterplatte (4),
• eine transparente Folie (9) zum Verschließen der Kavitäten (41),
• einen Messkopf (3), gegen den der Heizblock (1) hebbar und absenkbar angeordnet ist, wobei sich im Messkopf (3) eine Anregungslichteinheit (A), eine Detektionseinheit (D) sowie eine mechanische Einheit (M) befinden, dadurch gekennzeichnet,
• dass die Detektionseinheit (D) eine drehbare Scheibe (26) mit Strahlteilermodulen (21; 31), einen Umlenkspiegel sowie einen Detektor (30) enthält wobei die Strahlteilermodule (21; 31) Filter einen dichroitischen Strahlteiler (27) eine Linse umfassen so dass Licht von der Anregungslichteinheit (A), nachdem es einen ersten Filter passiert hat, nacheinander in eine Vielzahl auf einer Kreisbahn angeordneter Lichtleiter (7) einkoppelbar ist, über die das Licht über vor den probenseitigen Enden der Lichtleiter (7) befindliche Linsen (5; 6) adressierbar in die Kavitäten (41) einkoppelbar...

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung und Verfahren zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß der Gattung der Patentansprüche.
Derzeit ist eine Vielzahl von so genannten Thermocyclern bekannt, die lediglich zur Vermehrung einer Target-Sequenz geeignet sind, ohne den Vermehrungsprozess direkt beobachten zu können. Diese Verfahren erfordern stets eine nachfolgende qualitative oder semiquantitative Analyse der Reaktionsprodukte (Anteil doppelsträngiger DNA mit einer bestimmten Länge), um die gewünschte Information (Vorhandensein einer bestimmten Basensequenz) zu erhalten. Die Gelelektrophorese mit Fluoreszenzfärbung der Banden und Sichtbarmachen dieser im UV-Transilluminator ist dabei das am häufigsten benutzte Analyseverfahren. Exakte quantitative Fragestellungen, wie sie in der modernen Analytik gestellt werden, können damit nicht beantwortet werden.
Auch ist die DNA-Sequenzanalyse seit geraumer Zeit bekannt. Diese Analyse ist jedoch bezüglich der DNA-Vervielfältigung stets eine Endpunktbestimmung, die keine Aussage über den Ablauf des DNA-Vermehrungsprozesses ermöglicht. Damit sind falsch-positive aber auch falsch-negative Aussagen relativ wahrscheinlich. Limitierende Faktoren, wie z. B. das Fehlen der Bausteine für den Aufbau der DNA (Nukleotide) oder das Versagen des Enzyms (Polymerase), können nicht erkannt werden. Quantitative Analysen mittels PCR sind daher mit einem hohen Fehler behaftet.
Da die PCR eine exponentielle Reaktion darstellt, ist sie grundsätzlich für die Durchführung quantitativer Messungen geeignet. Die Reaktion wird mit N_A = N₀·(2·E)ⁿ, (N_A = Anzahl Moleküle nach Amplifikation, N₀ = Anzahl Moleküle der ursprünglichen DNA-Matrix, E = Effektivitätsfaktor, n = Anzahl Zyklen) beschrieben.
In den meisten Anwendungen wird die PCR über ca. 30–40 Zyklen geführt und erreicht bei einem sehr hohen Amplifikationsniveau eine Plateauphase. Die Phase der beschriebenen exponentiellen Vermehrung wird bei ca. 20 Zyklen verlassen. Daher sind bei konventioneller Auswertung der PCR am Endpunkt der Amplifikation durch Gelelektrophorese, Sequenzierung oder Immunoassays keine Aussagen über die Anzahl der RNA/DNA-Moleküle am Anfang der Reaktion (N_A) möglich. Zudem führen alle Abweichungen vom exponentiellen Verlauf zu falschen Ergebnissen. Der Einsatz definierter quantitativer Standards löst die Probleme nur teilweise, da die Anzahl der Zyklen bis zum Erreichen der Plateauphase bei den einzelnen PCR-Systemen sehr unterschiedlich sein kann.
Eine Vorrichtung für die Durchführung einer solchen konventionellen PCR ist bspw. aus der Schrift EP 1088590 A1 bekannt. Diese Schrift offenbart einen Thermocycler mit einer Heizplatte, welche eine Heizfläche zur Aufnahme einer Mikrotiterplatte bildet, deren Kavitäten in Vertiefungen der Heizfläche aufgenommen werden, sowie mit einem gegen die Heizfläche absenkbaren und hebbaren Deckel, wobei über die Heizfläche mehrere elastisch komprimierbare Hebeelemente verteilt sind, welche mindestens bei abgehobenem Deckel über die Ränder der Vertiefungen überstehen.
Erst die Entwicklung der real-time PCR hat eine routinemäßige quantitative PCR ermöglicht. In der real-time PCR wird die Entstehung des „Reaktionsproduktes", der amplifizierten DNA, durch eine simultane Fluoreszenzdetektion quantitativ verfolgt. Die Fluoreszenzmessungen erfolgen nach jedem Temperaturzyklus in allen Proben in den Phasen konstanter Temperatur, häufig in der Annealingphase, aber auch in der Elongationsphase. Dabei werden Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die entweder spezifisch doppelsträngige DNA „erkennen" und durch verstärkte Fluoreszenz anzeigen, oder die an speziellen Sonden endständig gebunden sind und beim Strangwachstum so verändert werden, dass verstärkte Fluoreszenz auftritt. Die Fluoreszenzintensität wird nach jedem Temperaturzyklus registriert und grafisch dargestellt. In jeder Probe können auch mehrere Sonden eingesetzt werden, die auf bestimmte nachzuweisende Sequenzen selektiv reagieren. Jede dieser Sonden ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert, so dass eine Unterscheidung anhand der Emissionsspektren erfolgen kann. Dieses als Fluoreszenz-Multiplexing bezeichnete Verfahren wird von den meisten gattungsgemäßen real-time PCR-Maschinen unterstützt.
Die Anordnungen zur real-time-Fluoreszenzdetektion von gattungsgemäßen Geräten sind vielfältig. Sie erlauben die Detektion von Fluoreszenzintensitäten bei bis zu sechs Anregungs- und Emissionswellenlängen über mehrere Größenordnungen hinweg. Zur Realisierung der Fluoreszenzdetektion während der PCR-Reaktion werden Epi-Fluoreszenztechniken eingesetzt, die entweder eine simultane Beobachtung aller Proben einer zweidimensionalen Anordnung – z. B als bildgebendes Verfahren (ABI PRISM^® 7000) – oder ein schnelles Proben-Multiplexing (z. B. Chromo4, ROCHE LightCycler) ermöglichen. Filter und dichroitische Strahlteiler – soweit verwendet – sind dabei auf die am meisten verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. FAM, TET, JOE/VIC, HEX, TAMRA, ROX, Cy3^®, Cy5^®) zugeschnitten.
Die Fluoreszenzmarkierung der DNA erfolgt bei Real-Time PCR:

– mittels doppelstrang-sensitiver Farbstoffe (SYBR^® Green, Ethidiumbromid)
– mittels fluorogener Farbstoffe (TaqMan^®-Assay, Cy3^®, Cy5^®)
– mittels fluoreszenzmarkierter Primer (Scorpions^®Primers, Molecular Beacons)
– Systemen auf der Basis des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FREI)

PCR-Reaktionen werden gegenwärtig bevorzugt in speziellen Mikroplatten ausgeführt, die bis zu 96 oder 384 Proben in zweidimensionaler Anordnung enthalten können und deren Probenanordnung standardisiert ist, so dass automatische Pipettiertechnik zur Probenvorbereitung eingesetzt werden kann. Die Bewältigung eines hohen Probenaufkommens erfordert auch PCR-Geräte, die die notwendige Anzahl an thermischen Zyklen in einer kurzen Zeit bewältigen, indem die Aufheiz- und Kühlphasen sowie die Phasen konstanter Temperatur stark verkürzt werden (sogenannte Rapid-PCR). Damit bleibt auch für die Messung der Fluoreszenzen nach jedem Zyklus wesentlich weniger Zeit.
Die bisher bekannten Anordnungen sind nicht in der Lage, in dieser kurzen Zeit bei mehreren Anregungs- und Emissionswellenlängen die Fluoreszenzen einer Vielzahl von PCR-Proben zu messen.
Die Schrift WO 002004104547 A2 offenbart bspw. ein Verfahren, welches bis zu 96 Proben sequentiell abtastet und dabei in vier nebeneinander liegenden Proben die Fluoreszenz in vier Farbkanälen messen kann.
Die zur Messung benötigte Verweilzeit über den Proben gemäß WO 002004104547 A2 sowie die Zeit zum Positionswechsel erlaubt keine Anwendung dieser Vorrichtung für die Rapid-PCR.
Außerdem ist es nachteilig, dass im Falle des Wechsels der Fluoreszenzfarbstoffe die komplette Detektionseinheit ausgetauscht werden muss.
Aus DE 101 31 687 A1 ist eine Vorrichtung bekannt, die ohne bewegte Teile auskommt und daher prinzipiell eine schnelle Detektion ermöglicht. Die Zuordnung des Detektorsignals zur entsprechenden Probe wird dadurch erreicht, dass jeder Probe eine Anregungslichtquelle (LED) zugeordnet ist, die einzeln nacheinander eingeschaltet werden und die jeweilige Probe zur Fluoreszenz anregt. Das Fluoreszenzlicht wird vom Anregungslicht durch einen dichroitischen Spiegel getrennt und zum Detektor geleitet. Der Spiegel muss dabei mindestens die Größe der zweidimensionalen Probenanordnung besitzen, um alle Proben erfassen zu können.
Nachteilig an dieser Anordnung ist jedoch, dass nur eine kurzwellige Lichtquelle genutzt werden kann, um eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen anzuregen. Dabei muss in Kauf genommen werden, dass manche Farbstoffe – insbesondere die im roten Spektralbereich absorbierenden – nicht optimal zur Fluoreszenz angeregt werden können und daher eine verringerte Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens bewirken. Wollte man eine Anregung mit beispielsweise rotem Licht realisieren, müsste zumindest der Strahlteiler bei jeder Messung einmal ausgetauscht werden, was in der bei PCR verfügbaren Messzeit nicht möglich ist.
Die WO 2006/052682 A2 offenbart eine Anordnung zur Floureszenzmessung bspw. in PCR-Proben, die einen Heizblock mit Aufnahme für PCR-Proben aufnehmende Kavitäten einer Mikrotiterplatte, einen Messkopf mit Anregungslichteinheit, eine Detektionseinheit und eine mechanische Einheit umfasst, wobei Licht verschiedener, vorgebbarer Wellenlänge von der Anregungslichteinheit optisch über Lichtleiter, Filter und Strahlteiler in die Kavitäten adressierbar einkoppelbar ist und Fluoreszenzlicht über einen weiteren Lichtleiter sowie weitere Filter zur Detektionseinheit geführt wird und wobei ein in zwei Dimensionen beweglicher Abtastarm die mechanische Einheit bildet.
Diese Anordnung gestattet es zwar das schnelle Abtasten einer zweidimensionalen Probenanordnung, löst jedoch nicht das Problem des schnellen Wechsels der auf die Emissionsspektren der Farbstoffe zugeschnittenen Filter und Strahlteiler, der für eine schnelle, mehrkanalige Fluoreszenzmessung erforderlich ist.
Die WO 2005/068976 A2 offenbart eine Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung in PCR-Proben, bei der Licht über einen auf einer rotierenden Scheibe befindlichen Spiegel direkt auf eine zweidimensionale Anordnung von Proben gelenkt wird.
Die Fluoreszenz einer Vielzahl von Proben wird damit simultan erfasst, erfordert jedoch einen ortsauflösenden Detektor, bspw. eine CCD-Matrix. Zum Erreichen einer hinreichenden Nachweisempfindlichkeit muss die rotierende Scheibe ähnlich einem Filterrad jeweils angehalten werden, bis die Integrationszeit der CCD abgelaufen ist. Erst dann kann durch Drehen der Scheibe ein weiterer spektraler Kanal gemessen werden. Eine schnelle, mehrkanalige Fluoreszenzmessung, wie sie für die Rapid-PCR benötigt wird, ist damit nur eingeschränkt möglich.
Eine andere Gruppe von Thermocyclern ist durch eine spezifische Probenanordnung gekennzeichnet, die von den Standardmaßen einer Mikroplatte (SBS-Standard) deutlich abweicht und daher eine spezielle Probenvorbereitung erfordert, die mit etablierter Automatisierungstechnik nicht kompatibel ist (z. B. ROCHE Light Cycler).
Diese Geräte sind jedoch extrem schnell und erfüllen somit das Kriterium der Rapid-PCR. [Rapid-PCR ist definiert durch PCR-Zyklen von ca. 20 Sekunden (konventionelle PCR: ca. 3–5 min) und daraus resultierende kurze Dauer für das gesamte PCR-Experiment von unter 30 min für 30 Zyklen (konventionelle PCR: 2–3 Stunden)].
Die Rapid-PCR stellt ganz neue Anforderungen an die Fluoreszenzmesstechnik, da für den Messvorgang nur wenig Zeit zur Verfügung steht. So muss die gesamte Probenanordnung in weniger als 4 Sekunden gemessen werden können. Eine messtechnisch bedingte Verlängerung der Annealing- oder Elongationsphase kann nicht toleriert werden, da sie einerseits die insgesamt benötigte Analysenzeit verlängern, aber auch die auf die Rapid-PCR zugeschnittenen Analysenprotokolle verändern würde.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Anordnung und ein Verfahren zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben anzugeben, die innerhalb einer kurzen Zeit (bspw. etwa 4 Sekunden) in einer Vielzahl von Proben (bspw. 96 Proben) die Messung der Fluoreszenzen in mehreren Farbkanälen ermöglicht, wobei sicherzustellen ist, dass die Fluoreszenzfarbstoffe nahezu in ihrem Absorptionsmaximum angeregt werden.
Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des ersten und des 8. Patentanspruchs gelöst sowie durch die Merkmale der Unteransprüche vorteilhaft ausgestaltet.
Wesentlich für die Erfindung ist, dass in der erfindungsgemäßen Vorrichtung/bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die erforderliche Messgeschwindigkeit durch einen mehrkanaligen Aufbau und schnelles Multiplexing erreicht wird.
So werden in einer bevorzugten Ausführungsform die probenseitigen Enden von mehreren, mit ihrer Anzahl an das Format der verwendeten Mikrotiterplatten angepassten Lichtleitern, vorzugsweise Lichtleitfasern, die im Abstand der Proben zueinander angeordnet sind, parallel und schrittweise über ein zweidimensionales Linsenarray geführt, welches das aus der Faser austretende Anregungslicht in die Probe und das dort generierte Fluoreszenzlicht zurück in die Faser abbildet. Das Linsenarray ist dabei beidseitig plan und bildet den oberen Abschluss des Probenvolumens. Die detektorseitigen Enden der Lichtleiter sind auf einer Kreisbahn mit dem Radius R in einem definierten Abstand zu einer rotierenden Scheibe angeordnet. Auf der Scheibe befinden sich in gleichmäßigen Abständen mehrere dichroitische Strahlteiler auf einer Kreisbahn mit dem Radius R, die erforderlichen unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsfilter sowie eine Linse. Die Filter, die Linse und der dichroitische Strahlteiler sind in der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Strahlteilermodul zusammengefasst. An Stelle der Scheibe kann auch ein anderer relativ bewegbarer Träger für die Strahlteilermodule Verwendung finden, dem ggf. eine abweichende Anordnung der Enden der Lichtleiter zugeordnet ist.
Die optimale Anregung der Farbstoffe wird dadurch sichergestellt, dass für jeden Farbstoff ein Strahlteilermodul realisiert ist, welches die geeigneten Bandpassfilter für die Fluoreszenzanregung und -emission sowie einen angepassten dichroitischen Strahlteiler enthält.
Diese Module sind austauschbar auf der genannten rotierenden Scheibe angeordnet und koppeln das Licht nacheinander in die zum Linsenarray führenden Lichtleiter ein bzw. das erzeugte Fluoreszenzlicht aus. Dabei gelangt das Licht nur in den Lichtleiter und damit zur Probe, wenn sich der Strahlteiler in einer Position befindet, bei welcher das Licht der zugehörigen Lichtquelle, die auf einem Radius S mit S > R stationär angeordnet ist, vom Strahlteiler reflektiert und von der Linse fokussiert wird. Die Lichtquelle kann dabei das Ende eines weiteren Lichtleiters sein, der von einer Lampe oder LED kommt, oder aber eine entsprechende Anordnung von LEDs, die mehrere Farben emittieren können.
Das aus dem Lichtteiler austretende, von der Linse kollimierte und den Strahlteiler sowie den Emissionsfilter passierende Fluoreszenzlicht gelangt über einen Hohlspiegel auf einen Detektor, vorzugsweise einen Photomultiplier.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der schematischen Zeichnungen und des Ausführungsbeispiels näher erläutert. Im Einzelnen zeigen:
1: eine schematische Übersichtsdarstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung;
2: einen Längsschnitt durch den Heizblock mit Mikrotiterplatte und darüber angeordneter Anregungseinheit einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung gemäß 1;
3: eine schematische Draufsicht auf eine mechanische Einheit einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung gemäß 1;
4: einen Längsschnitt durch eine Ausführungsform der Scheibe mit Strahlteilermodulen der erfindungsgemäßen Anordnung gemäß 1,
5: eine schematische Draufsicht auf eine Detektionseinheit einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung gemäß 1;
6: einen Längsschnitt durch eine Ausführungsform des Strahlteilermoduls
Die in 1 dargestellte Anordnung zur PCR mit mehrkanaliger Fluoreszenzmessung umfasst einen Heizblock 1, welcher eine Aufnahme 2 für eine Mikrotiterplatte 4 aufweist, wobei Kavitäten 41 der Mikrotiterplatte 4 von in dem Heizblock 1 eingebrachten Vertiefungen aufgenommen und mit einer transparenten Folie 9 verschlossen werden, so dass die PCR-Proben in den Kavitäten 41 temperierbar und vor Verdunstung geschützt lagerbar sind, und einem gegen den Messkopf 3 hebbaren und absenkbaren Heizblock 1, wobei sich im Messkopf 3 eine Anregungslichteinheit A, eine Detektionseinheit D sowie eine mechanische Einheit M befinden, wobei Licht verschiedener, vorgebbarer Wellenlänge von der Anregungslichteinheit A optisch über Lichtleitfasern 7 und ein Linsenarray 5 mit Heizeinrichtung 8 in die Kavitäten 41 adressierbar einkoppelbar und von der Detektionseinheit D, welche eine drehbare Scheibe 20 mit Strahlteilermodulen 21; 31, einen Umlenkspiegel 29 sowie einen Detektor 30 enthält, detektierbar ist, wobei eine Trägerplatte 19, ein Schlitten 12, eine Führung 13 (3), ein Motor 14, eine Spindel 15 und ein Rahmen 16 (3) die mechanische Einheit M bilden.
Die 2 zeigt einen Längsschnitt durch den Heizblock 1 mit den Aufnahmen 2 für die Messproben, die sich in einer speziellen Mikrotiterplatte 4 befinden und mit einer transparenten Folie 9 verschlossen sind, sowie den darüber angeordneten Messkopf 3 zur Messung der Fluoreszenzen der Proben. Zur Beschickung des Thermocyclers 1 mit Messproben kann der Messkopf 3 nach oben geklappt oder nach hinten verschoben werden. Das an der Unterseite des Messkopfes 3 befindliche Linsenarray 5 wird während des Messvorganges gegen die Oberseite der Mikrotiterplatte 4 gepresst. Damit wird bewirkt, dass die Linsen 6 des Linsenarrays 5 optisch an die in der Mikrotiterplatte 4 befindlichen Proben angekoppelt werden, so dass Anregungslicht ungehindert zu den Proben und Fluoreszenzlicht der Proben durch die Linsen 6 ungehindert in die Lichtleitfasern 7 gelangen kann. Das Linsenarray wird durch eine Heizeinrichtung 8 auf eine Temperatur gebracht, die die Kondensation von Wasserdampf an der transparenten Folie 9 während des Messvorganges verhindert.
Oberhalb der Heizeinrichtung 8 befindet sich ein Schlitten 12, welcher acht rechtwinklig zur Zeichenebene in Reihe angeordnete Lichtleitfasern 7 (1 und 3) schrittweise über zwölf Spalten des Linsenarrays 5 hinweg bewegt, von denen eine Spalte in der Zeichenebene liegt und die anderen Spalten parallel dazu.
Die Steuerung aller Abläufe sowie die Erfassung und Auswertung der Messsignale wird von einem nicht dargestellten Computer übernommen,, der an dem Messkopf 3 angeschlossen ist.
Die 3 zeigt die mechanische Einheit M im Detail. Die acht in Reihe angeordneten Lichtleitfasern 7 befinden sich auf einem Schlitten 12, welcher von zwei parallelen Führungen 13 präzise in seiner Linearbewegung geführt wird. Angetrieben wird der Schlitten 12 vorzugsweise von einem Motor 14 mit angesetzter Spindel 15, welche eine für die Präzision der Positionierung geeignete Steigung aufweist. Ein Rahmen 16 dient zur Fixierung der Abtasteinrichtung über der Mikroplatte und zur Aufnahme der Anpressdrucks. In einer festen Trägerplatte 19 sind neben Bohrungen 17 an den Positionen der darunter liegenden Linsen zwei Referenzpositionen vorgesehen, in welche dauerhaft fluoreszierende Proben, vorzugsweise fluoreszierende Gläser 18, eingebracht sind. Diese dienen dazu, Unterschiede in der Empfindlichkeit der acht Messkanäle, sowie eine Langzeitdrift des Messgerätes auszugleichen. Bei einem Abtastvorgang wird der Schlitten 12 zunächst über den fluoreszierenden Gläsern 18 positioniert, eine Messung ausgelöst und danach über der ersten Spalte der Bohrungen 17, so dass sich die Kerne der Lichtleitfasern 7 zentrisch über den Bohrungen befinden. In dieser Position wird die nächste Messung ausgeführt und es werden die Fluoreszenzen der Proben der ersten Spalte ermittelt. Nach erfolgter Messung wird der Schlitten 12 um eine Spalte weiterbewegt und wiederum eine Messung ausgelöst. Der Vorgang wiederholt sich, bis alle Spalten der Probenanordnung gemessen sind.
Die 4 zeigt die Detektionseinheit D einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung in einer Schnittdarstellung mit der Scheibe 20, unterhalb derer sich die Strahlteilermodule 21, 31 befinden. Im Ausführungsbeispiel wird die Scheibe von einem Scheibenantrieb 22 angetrieben und dreht sich um eine Achse -X-X- mit ca. sechs pro Sekunde. Die Enden der zum Schlitten 12 (3) führenden acht Lichtleiter 7 sind auf einem Kreisbahn-Segment angeordnet. Zwei benachbarte Fasern schließen bezüglich der Rotationsachse -X-X- einen Winkel von 7,2° ein (5). An der Peripherie der Scheibe 20 sind im gleichen Winkelabstand acht Lichtquellen angeordnet. Im Ausführungsbeispiel sind dies die Austrittsflächen von acht weiteren Lichtleitern 23, wie in der in 5 gezeigten Draufsicht zu erkennen ist. Das austretende Licht wird jeweils durch eine Linse 24 zu einem Strahl von bspw. ca. zwei Millimeter Durchmesser kollimiert. Die Lichteintrittsflächen der acht Beleuchtungsfasern 23 werden am Lampenhaus 32 zusammengefasst und dort durch drei darin befindliche, blaues, grünes und rotes Licht emittierende Halbleiter (LED), die einzeln eingeschaltet werden können, beleuchtet. Bewegt sich das erste Strahlteilermodul 21 auf seiner Kreisbahn auf den ersten Lichtleiter 7 zu, so wird die zugehörige LED – beispielsweise mit blauer Emission – eingeschaltet.
Die 6 zeigt den Aufbau des Strahlteilermoduls im Detail. Die Vorrichtung ist so gestaltet, dass bei senkrechtem Einfall des Lichtes der ersten Beleuchtungsfaser 23 (5) auf den Anregungsfilter 25 durch den Strahlteiler 27 und die Linse 28 das Anregungslicht in den ersten Lichtleiter 7 eingekoppelt wird. Dadurch wird in der Probe Fluoreszenz erzeugt. Das von der Probe kommende Fluoreszenzlicht verlässt den ersten Lichtleiter 7, passiert die Linse 28 und den Strahlteiler 27 sowie das Emissionsfilter 26 und wird danach von einem Hohlspiegel 29 (4) auf einen Detektor 30 abgebildet. Der Vorgang wiederholt sich, bis das Strahlteilermodul alle acht Beleuchtungsfasern 23 passiert hat und damit die Fluoreszenzintensitäten der ersten acht Proben im ersten Farbkanal gemessen sind. Inzwischen hat sich das zweite Strahlteilermodul 31 dem ersten Lichtleiter genähert und es wird die zugehörige LED – beispielsweise mit grüner Emission – eingeschaltet. Das Strahlteilermodul 31 passiert wiederum alle acht Lichtquellen und der Detektor 30 registriert die Fluoreszenzintensitäten für die ersten acht Proben im zweiten Farbkanal. Die genannten Abläufe wiederholen sich für jedes montierte Strahlteilermodul (im vorliegenden Fall vier) bis zur vollständigen Umdrehung der Scheibe. Im Ausführungsbeispiel sind nach einer Umdrehung der Scheibe (166 ms) in acht Proben und vier Farbkanälen die Fluoreszenzen gemessen. Während der folgenden Umdrehung der Scheibe wird der Schlitten 12 auf die nächste Probenspalte bewegt, wobei keine Messungen ausgelöst werden. Die darauffolgende Umdrehung wird für die Messung der nächsten acht Proben verwendet. Die beschriebenen Vorgänge wiederholen sich, bis alle zwölf im Ausführungsbeispiel vorhandenen Messpositionen sowie die zwei Referenzpositionen gemessen sind.
Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

1: Heizblock
2: Aufnahme
3: Messkopf
4: Mikrotiterplatte
41: Kavitäten
5: Linsenarray
6: Linsen
7: Lichtleiter
8: Heizeinrichtung
9: transparente Folie
12: Schlitten
13: Linearführung
14: Motor
15: Spindel
16: Rahmen
17: Ausnehmungen/Bohrungen
18: dauerhaft fluoreszierende Proben
19: Trägerplatte
20: drehbare Scheibe
21; 31: Strahlteilermodule
22: Scheibenantrieb
23: Beleuchtungslichtleitfasern
24: Linsen
25: Anregungsfilter
27: Strahlteiler
28: Linse
29: Hohlspiegel
30: Detektor
32: Lampenhaus
321: LED's
A: Anregungslichteinheit
D: Detektionseinheit
M: mechanische Einheit

Claims

Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben umfassend • einen Heizblock (1) mit Aufnahme (2) für PCR-Proben aufnehmende Kavitäten (41) einer Mikrotiterplatte (4), • eine transparente Folie (9) zum Verschließen der Kavitäten (41), • einen Messkopf (3), gegen den der Heizblock (1) hebbar und absenkbar angeordnet ist, wobei sich im Messkopf (3) eine Anregungslichteinheit (A), eine Detektionseinheit (D) sowie eine mechanische Einheit (M) befinden, dadurch gekennzeichnet, • dass die Detektionseinheit (D) eine drehbare Scheibe (26) mit Strahlteilermodulen (21; 31), einen Umlenkspiegel sowie einen Detektor (30) enthält wobei die Strahlteilermodule (21; 31) Filter einen dichroitischen Strahlteiler (27) eine Linse umfassen so dass Licht von der Anregungslichteinheit (A), nachdem es einen ersten Filter passiert hat, nacheinander in eine Vielzahl auf einer Kreisbahn angeordneter Lichtleiter (7) einkoppelbar ist, über die das Licht über vor den probenseitigen Enden der Lichtleiter (7) befindliche Linsen (5; 6) adressierbar in die Kavitäten (41) einkoppelbar ist und • wobei die mechanische Einheit von einem Rahmen (16) mit einer Trägerplatte (19) und einem in Führungen beweglichen, von einem Motor (14) angetriebenen Schlitten (12) gebildet wird, mit dem die in einer Reihe angeordneten, probenseitigen Enden der Lichtleiter (7) schrittweise über die Kavitäten (41) hinweg bewegbar sind und • wobei aus den detektorseitigen Enden der Lichtleiter (7) austretendes Fluoreszenzlicht zeitgleich den dichroitischen Strahlteiler sowie einen zweiten Filter durchdringt und von dem Spiegel auf dem Detektor (30) abbildbar ist.
Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vor den Lichtleitern (7) befindlichen Linsen (6) zu einem Linsenarray (5) zusammengefasst sind, welches durch eine Heizeinrichtung (8) beheizbar ist.
Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtleiter (7) eine Lichtleitfaser ist.
Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichteinheit (A) mehrere lichtemittierende Halbleiterbauelemente (LED) oder eine Blitzlampe als Lichtquellen umfasst, wobei die Anregungslichteinheit (A) nur eine Öffnung besitzt, durch die Licht austreten kann.
Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (30) ein Photomuliplier ist.
Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Filter, der Strahlteiler und die Linse in einer austauschbaren Baugruppe zusammengefasst sind.
Anordnung zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die rotierende Scheibe eine oder mehrere austauschbare Baugruppen trägt, deren Filter und dichroitische Strahlteiler auf die Detektion von verschiedenen Fluoreszenzmarkern optimiert sind.
Verfahren zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem oder mehrer der voran stehenden Ansprüche bei dem: – Licht von einer oder mehreren Lichtquellen, nachdem es den ersten Filter passiert hat, mittels eines auf der drehbaren Scheibe (20) befindlichen dichroitischen Strahlteilers und einer Linse nacheinander in eine Vielzahl von Lichtleitern (7) eingekoppelt wird, die auf einem Kreisbahnsegment angeordnet sind, – aus den Lichtleitern (7) austretendes Fluoreszenzlicht zeitgleich den dichroitischen Strahlteiler sowie den zweiten Filter durchdringt und von einem Spiegel auf den Detektor abgebildet wird, – die probenseitigen Enden der Lichtleiter (7) schrittweise über eine zweidimensionale Anordnung von Proben hinwegbewegt werden, um mit Hilfe von Linsen Anregungslicht in die Proben zu fokussieren und Fluoreszenzlicht aus ihnen zu erfassen.
Verfahren zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (D) auf einer Kreisbahn umlaufende Strahlteilermodule (21; 31) umfasst, welche an die zu messenden Farbstoffe angepasste Filter enthalten und vermittels derer nacheinander eine Vielzahl von optischen Fasern abgetastet werden, so dass Anregungslicht zur Probe hin und Fluoreszenzlicht von der Probe weg geleitet werden, wobei das Fluoreszenzlicht von dem Umlenkspiegel (29) auf den Detektor (30) abgebildet wird.
Verfahren zur mehrkanaligen Fluoreszenzmessung in PCR-Proben unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vermittels der mechanischen Einheit (M) eine zweidimensionale Anordnung von Proben zeilenweise abgetastet wird, so dass die Fluoreszenzen der Proben spaltenweise vermittels der Detektionseinheit (D) ausgelesen werden.