DE4221063A1 - Optisches System für Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein optisches System nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Die Beobachtung und Messung von Lumineszenz (z. B. Fluoreszenz) ist eine Möglichkeit, die Eigenschaft von z. B. biologischen Zellen zu untersuchen. Solche Analysen können gemacht werden, indem die Zellen mit unterschiedlichen chemischen Substanzen behandelt und mit Licht bestrahlt werden. Zellen können mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt werden, die Fluoreszenzlicht ausstrahlen, das spezifisch ist für Zellinhaltsstoffe wie z. B. DNA, RNA, Gesamtprotein oder bestimmte Proteine, die mit monoklonalen Antikörpern markiert sind.

Farbstoffe für solche Analysen zeigen Absorptionsmaxima bei bestimmten Wellenlängen. In Systemen vor der hier beschriebenen Erfindung werden für die Beobachtung und Analyse von Zellen, die mit zwei oder mehr als zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen mit Absortpionsmaxima in weit voneinander entfernt liegenden Spektralbereichen gefärbt sind, vollständige Sätze von optischen Komponenten ausgetauscht, die aus Anregungsfiltern, einem Sperrfilter, und einem dichroitischen Farbteiler bestehen. Solch ein Filter und Spiegel-Satz, dessen spektrale Charakteristik zu den Absorptions- und Fluoreszenzemissionseigenschaften von einem Farbstoff paßt, wird durch einen anderen Filter und Spiegel-Satz ersetzt, der zu den Eigenschaften eines anderen Farbstoffs paßt und so weiter. Eine Vorrichtung, die kleine, austauschbare Blocks mit solchen Filter und Spiegel-Sätzen enthält hat Ploem beschrieben (Leitz Ploemopak).

Kürzlich hat die Firma Zeiss einen Doppelfiltersatz eingeführt, der es ermöglicht, mit Hilfe einer einzelnen Lampe als Lichtquelle die Fluoreszenz von zwei unterschiedlichen Fluorochromen zu beobachten, die in unterschiedlichen Spektralregionen absorbieren. Diese Regionen, die eine liegt bei 490 nm, die andere bei etwa 550 nm, sind nicht weit voneinander entfernt. Die Effekte von chromatischen Aberrationen im Anregungslichtweg sind also nur gering. Das Prinzip dieses Systems berücksichtigt und korrigiert nicht chromatische Fehler, die sich nachteilig auswirken können, wenn Anregungslichtwellenlängen aus weit voneinander entfernt liegenden Spektralbereichen gewählt werden. In Mikroskopen, die solche optischen Komponenten verwenden, ist die Anzahl von Anregungslichtwellenlängen offenbar auf zwei beschränkt, und exakte quantitative Fluoreszenz-Analysen sind nicht möglich, wenn die Emissionsspektren der Farbstoffe überlappen oder wenn Energietransfer von einem Fluorochrom zum anderen vorkommt.

Für die ausschließlich quantitative Analyse von Fluoreszenz in Zellen, die mit zwei oder mehr als zwei Fluorochromen gefärbt sind, existieren Durchflußcytometer-Systeme, die in zwei oder drei getrennten Bereichen in der Objektebene die Fluoreszenzen mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen anregen. Solche Systeme werden beschrieben von M. Stöhr in "Double Beam Application in Flow Technique and Recent Results", Pulse-Cytophotometry, 1976, 139-145, und von W. Göhde (U.S. Patent No. 4, 225, 229). In diesen Systemen fließt jede Zelle, die analysiert wird, der Reihe nach durch diese Bereiche und strahlt Fluoreszenzlicht aus, das quantitativ gemessen wird. Die Morphologie von Zellen oder die Architektur von ganzen, intakten Geweben kann jedoch nicht in solchen Systemen betrachtet oder analysiert werden.

Es ist ein wichtiges Ziel der hier dargestellten Erfindung, ein optisches System zu beschreiben, das Licht von einer Lichtquelle in mehrere Strahlenbündel aufteilt, die unabhängig voneinander modifiziert werden können und die dann ineinander überführt werden, um ein Strahlenbündel zu bilden, das aus Licht unterschiedlicher Wellenlänge besteht und das in das Objektiv eines Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskops reflektiert wird.

Um dies zu erreichen, wird vom Licht einer z. B. Quecksilberdampf- oder Xenon-Bogenlampe, ein ungefähr paralleles Lichtstrahlenbündel mit einem Kondenserlinsensystem gebildet. Dieses Lichtstrahlenbündel passiert die Wärmeschutzfilter und wird dann mit einem konventionellen dichroitischen Spiegel in zwei Strahlenbündel aufgeteilt, die aus Licht von unterschiedlichen Bereichen des Lampenspektrums bestehen. Mit Hilfe eines weiteren dichroitischen Spiegels kann ein drittes Strahlenbündel erzeugt werden.

Diese Strahlenbündel werden unabhängig voneinander verändert, indem mit Hilfe von Farbglas- oder Interferenzfiltern spezifische, unterschiedliche Wellenlängen herausgefiltert werden. Die Durchmesser der Strahlenbündel werden reduziert und dem Eingangsdurchmesser des Objektives angepaßt. Diese Verkleinerung der Strahlenbündeldurchmesser wird unabhängig für jedes Strahlenbündel mit Hilfe von zwei Linsen erreicht. Die Positionen der Linsen werden so gewählt, daß Effekte chromatischer Aberrationen, die durch alle Linsen des Anregungslichtweges eingeführt werden können, für jedes Strahlenbündel der Wellenlänge seines Lichts entsprechend minimiert werden. Auf diese Weise kann das Köhlersche Beleuchtungsprinzip für die unterschiedlichen Strahlenbündel verwirklicht werden auch wenn das verwendete Mikroskop-Objektiv nicht für Farbfehler in den Spektralbereichen von Interesse korrigiert ist. Das heißt, daß die Lichtquelle jedes einzelnen Strahlenbündels in der "inneren Pupille" des Objektives abgebildet werden kann. Die Position der "inneren Pupille" kann für unterschiedliche Wellenlängen verschieden sein, abhängig von der Farbkorrektur des Objektives für diese Wellenlängen.

Die genannten unabhängigen Strahlenbündel werden, nachdem sie die Linsenpaare passiert haben, mit Hilfe von Vollspiegeln und einem konventionellen dichroitischen Spiegel ineinander überführt. Sie passieren eine weitere Linse und werden dann von einem dichroitischen Doppelspiegel oder einem Rejektionsbandfilter, der durch drei oder mehr Reflexionsbanden charakterisiert ist, fast vollständig reflektiert. Das reflektierte Licht, das aus unterschiedlichen Wellenlängen besteht, tritt in das Mikroskop-Objektiv ein und beleuchtet die Objektregion homogen entsprechend dem Köhlerschen Prinzip. Anstelle von Bogenlampen können auch Laser mit Linien unterschiedlicher Wellenlänge verwendet werden. Das Fluoreszenzlicht von z. B. Zellen, die mit zwei oder mehr als zwei Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt sind, welche durch die gewählten Wellenlängen der Anregungsstrahlenbündel angeregt werden, gelangt in das Mikroskop-Objektiv, passiert das Objektiv und passiert dann den genannten dichroitischen Doppelspiegel oder Reflexionsbandfilter, die eine hohe Transmission in den Spektralbereichen des Fluoreszenzlichtes haben. Ein zusätzlicher dichroitischer Spiegel desselben Typs wird als Sperrfilter verwendet, um Hintergrundlicht zu schwächen. Ein Bild des Objekts wird in der Ebene der Meßfeldblende im Emissionslichtstrahlengang gebildet. Falls es keine konventionellen Mikroskop-Objektive mit Linsensystemen gibt, die in den Spektralbereichen von Interesse für chromatische Fehler korrigiert sind, wird die Verwendung von Spiegelobjektiven, die frei von chromatischen Aberrationen sind, vorgeschlagen. Das Fluoreszenzlicht passiert einen zweiten Sperrfilter, tritt in das Mikroskop-Okular ein und das Objekt kann mit dem Auge betrachtet werden oder quantitativ mit Hilfe von elektronischen Vorrichtungen wie CCD-Kameras analysiert werden.

Mit diesem relativ einfachen optischen System, das mehrere Wellenlängen von einer einzelnen Lichtquelle ausnutzt, ist es möglich, mehrere Fluoreszenzen, auch aus weit voneinander entfernt liegenden Spektralbereichen, von statischen Objektiven wie biologischen Zellen zu analysieren. Diese Analysen können gleichzeitig gemacht werden; das System ist also beträchtlich schneller als Mikroskope, die austauschbare Filterblocks verwenden.

Diese und andere Vorteile der hier dargestellten Erfindung werden deutlich aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den gezeigten Abbildungen.

Abb. 1 zeigt eine schematische Skizze des optischen Systems gemäß der hier beschriebenen Erfindung. Der rechte Teil zeigt das ganze optische System, während der linke Teil nur die Emissionslicht-Optik darstellt. Als ein Beispiel wird die Exzitationslicht-Optik für ultravioletts und grünes Licht einer Quecksilberdampflampe gezeigt. Die Bezeichnungen der speziellen Komponenten, die nur in diesem Beispiel verwendet werden, sind in Klammern gesetzt. Das in der Abbildung gezeigte optische System hat eine Lichtquelle 1 (z. B. eine Quecksilberdampflampe HBO 100). Das Kollektorlinsensystem 2 sammelt einen Teil des Lichts, das von der Lichtquelle ausgestrahlt wird, und bündelt es zu einem ungefähr parallelen Lichtstrahlenbündel. Das Licht passiert dann die Wärmeschutzfilter 3 z. B. Schott Filter KG1 und BG 38) und wird dann in zwei Strahlenbündel aufgeteilt mit Hilfe eines konventionellen dichroitischen Spiegels 10 (dichroitischer Spiegel mit Kante bei 420 nm), der mit einem Winkel von 45 Grad zur optischen Achse des Mikroskop-Objektives geneigt ist. Zwei Strahlenbündel werden also aus zwei unterschiedlichen, Spektralregionen der Lichtquelle gebildet.

Diese Strahlenbündel werden unabhängig voneinander verändert, zuerst, indem annähernd monochromatisches Licht unterschiedlicher Wellenlänge mit Hilfe von optischen Filtern 4a (Schott Filter UG1) und 4b (Bandpaßfilter F546) herausgefiltert wird. Dann werden die Lichtbündeldurchmesser mit Hilfe von Linsenpaaren 5 und 7 verrringert. Diese Veränderung kann für jedes der Strahlenbündel separat so gemacht werden, daß für jede Wellenlänge die Lichtquelle in die "innere Pupille" des Mikroskop-Objektives abgebildet wird unter Berücksichtigung von Effekten von chromatischen Aberrationen der Linsen im Anregungslichtweg. Auf diese Art kann Köhlersche Beleuchtung für beide Wellenlängen erreicht werden.

Der abgelenkte Lichtstrahl wird von zwei Vollspiegeln 6 und 8 und einem konventionellen dichroitischen Spiegel (Strahlenteiler mit Kante bei 420 nm) reflektiert. Die drei Spiegel sind mit einem Winkel von 45 Grad zur optischen Achse des Mikroskop-Objektives geneigt. Indem die Spiegel so angeordnet werden wie es in Abb. 1 gezeigt ist, werden die beiden Strahlenbündel ineinander überführt. Einer der beiden Vollspiegel ist in allen drei Richtungen justierbar, so daß durch eine Feineinstellung gewährleistet ist, daß die Strahlenbündel richtig ineinander überführt werden. Leuchtfeldblenden 9a können angewendet werden, um den ausgeleuchteten Bereich in der Objekt-Ebene zu begrenzen.

Die kombinierten Strahlenbündel passieren eine Linse 11 und werden dann fast vollständig von einem Reflexionsfilter oder einem dichroitischen Doppelspiegel 12 (in diesem Beispiel ein Spiegel mit Reflexionsbanden im ultravioletten und grünen Spektralbereich; Transmissionsspektrum des Spiegels siehe Abb. 2), der auch mit einem Winkel von 45 Grad zur Mikroskop-Objektiv Achse geneigt ist, reflektiert. Das Licht passiert dann das Mikroskop-Objektiv 13, das ein Glycerin-Immersions-Objektiv mit hoher numerischer Apertur sein kann, passiert das Glycerin 14, das Deckglas 15 und beleuchtet dann z. B. eine Zelle 16 in der Objektebene.

Ein Teil des Fluoreszenzlichts der Zelle, die mit zwei unterschiedlichen Fluorochromen gefärbt ist, tritt in das Mikroskop-Objektiv ein, passiert das Objektiv und passiert zum großen Teil den Reflexionsbandfilter oder dichroitischen Doppelspiegel 12, der eine hohe Transmission in den Spektralbereichen der Fluoreszenzlichtfarben aufweist. Ein zweiter Spiegel desselben Typs 12 dient als Sperrfilter zur Schwächung von Hintergrundlicht. In der Ebene der Meßfeldblende 19a wird ein Bild der Zelle geformt. Diese Blende begrenzt den Teil des Objekt-Bildes, der betrachtet oder analysiert wird. Das Licht passiert dann einen zusätzlichen Sperrfilter (Schott Filter GG 435). Das Fluoreszenzlichtbild kann durch ein Okular 22 betrachtet werden oder mit Hilfe von elektronischen Vorrichtungen wie zum Beispiel CCD-Kameras analysiert werden.

Abb. 2 zeigt das Transmissionsspektrum eines kommerziell erhältlichen Doppelspiegels, der in dem in Abb. 1 beschriebenen optischen System verwendet werden kann, das als ein Beispiel die Auflicht-Fluoreszenz-Anregung mit ultraviolettem (365 nm) und grünem (546 nm) Licht einer Quecksilberdampflampe gemäß der hier dargestellten Erfindung beschreibt. Das Spektrum wurde bei einem Einfallswinkel von 45 Grad aufgezeichnet. Dieser Spiegel ist charakterisiert durch Reflexionsbanden im ultravioletten (365 nm) und grünem (546 nm) Spektralbereich und durch eine hohe Transmission im blauen (400-500 nm) und roten (<600 nm) Spektralbereich. Dadurch wird eine starke Anregung mit ultraviolettem und grünem Licht und eine empfindliche Detektion von blauem und rotem Fluoreszenz-Licht ermöglicht.

Abb. 3 zeigt an einem praktischen Beispiel die Anwendung des optischen Systems, das in Abb. 1 beschrieben ist und das, als ein Beispiel für die hier dargestellte Erfindung, ultraviolettes und grünes Licht einer Quecksilberdampflampe für Auflicht-Fluoreszenz-Beleuchtung verwendet.

Die Fotografien in Abb. 3 zeigen einzelne Kerne von Zellen, die mit 5-Bromdesoxyuridin (BrdUrd) inkubiert waren, einer Thymidin-analogen Substanz, die nur von DNA-synthetisierenden Zellen inkorporiert wird. Diese Zellkerne sind mit zwei unterschiedlichen Fluorochromen gefärbt. Der an DNA bindende Farbstoff DAPI, der im Ultravioletten absorbiert (Exzitationsmaximum: 340 nm) und der im Blauen fluoresziert (Emissionsmaximum: 456 nm), wurde für die Färbung der Kern-DNA verwendet. Ein monoklaner Antikörper der nur an Zellkerne bindet, die inkorporiertes BrdUrd enthalten, und der mit TRITC gekoppelt ist, einem Fluorochrom, das im Grünen absorbiert (Exzitationsmaximum: 554 nm) und im Roten fluoresziert (Emissionsmaximum 582 nm), wurde für die Markierung der DNA-synthetisierenden Zellkerne gewählt. Das linke Foto zeigt ausschließlich die Fluoreszenz von an DNA gebundenem DAPI; die konventionelle UV-Licht Exzitation wurde verwendet. Drei Zellkerne können gesehen werden. Dieselben Zellkerne wurden dann mit Hilfe der konventionellen Grün-Exzitationsoptik beleuchtet; nur die beiden TRITC-markierten BrdUrd-enthaltenden Zellkerne sind sichtbar. Die rechte Fotografie zeigt dieselben Zellkerne bei Beleuchtung mit Exzitationslicht gemäß der hier dargestellten Erfindung. Es ist möglich, beide Fluoreszenzfarben gleichzeitig zu erkennen; alle drei Zellkerne können gesehen werden aufgrund ihrer blauen Fluoreszenz und zwei von ihnen können als Kerne von Zellen mit DNS-Synthese indentifiziert werden aufgrund ihrer zusätzlichen roten TRITC-Fluoreszenz.

Abb. 4 zeigt eine Modifikation des optischen Systems, das in der hier beschriebenen Erfindung dargestellt wird. Dieser Modifikation gemäß wird ein rotierendes Rad von Blenden 27 eingeführt, die als Verschluß jeweils ein Paar von Exzitations- und Emissionslichtstrahlen blockieren, während das andere Paar frei passieren kann. Auf diese Art können die beiden Fluoreszenzfarbstoffe unabhängig voneinander und exakt gemessen werden. Nach Abb. 1, die als Beispiel die Beleuchtung von Zellen, die mit zwei Fluorochromen gefärbt sind, zeigt, wird ein und dieselbe Region des Objektes zur selben Zeit mit beiden Anregungslichtbündeln beleuchtet. Die beiden resultierenden Fluoreszenzfarben werden ebenfalls in der selben Region des Objektes und zur selben Zeit analysiert. Mit einem solchen optischen System ist eine exakte quantitative Analyse der beiden Fluoreszenzen nicht möglich wenn Energietransfer von einem Farbstoff zum anderen vorkommt oder wenn die Emissionsspektren überlappen. Auch wenn die Emissionsspektren nur gering überlappen, ist eine exakte quantitative Messung beider Fluoreszenzintensitäten nicht möglich, wenn das Fluoreszenzlicht des einen Farbstoffs sehr viel stärker ist als das des anderen Farbstoffs.

Wenn zwei Vollspiegel 28 und 30 und ein Strahlenteilerspiegel 29 (dichroitischer Spiegel mit Kante bei 500 nm), wie in Abb. 6 gezeigt, zusätzlich verwendet werden, werden zwei Paare von Strahlenbündeln gebildet, das eine besteht aus ultraviolettem Anregungslicht und blauem Fluoreszenzlicht und das andere aus grünem Anregungslicht und rotem Fluoreszenzlicht. Ein rotierendes Rad von Blenden 27, das abwechselnd jeweils nur für eines der beiden Paare von Strahlenbündel öffnet, kann dann mit hoher Frequenz zwischen der einen und der anderen Art von Exzitation und Fluoreszenzdetektion hin- und herschalten. Auf diese Art können beide Fluoreszenzen zum Beispiel mit Hilfe von CCD-Kameras in einem statischen Objekt in derselben Objektregion aber unabhängig voneinander zu verschiedenen Zeiten analysiert werden, wobei eine hohe Frequenz des Umschaltens gewählt werden kann. Dadurch wird es möglich, die Effekte von Energietransfer und von Überlappungen der Emissionsspektra zu minimieren.

Modifikationen und Anwendungen der Erfindung in der Durchflußzytometrie, konventionellen Mikroskopie von statischen Objekten und der konfokalen Mikroskopie

Abb. 5 zeigt eine mögliche Modifikation des optischen Systems der hier dargestellten Erfindung, die es ermöglicht, quantitative, durchflußzytometrische Fluoreszenz-Analysen von Zellen entsprechend dem Prinzip der Zwei-Wellenlängen-Methode (beschrieben von W. Göhde, U.S. Patent No. 4 225 229) auszuführen. Diese Methode macht es möglich, ebenso wie die "double beam"-Exitations-Methode (beschrieben von M. Stöhr in "Double Beam Application in Flow Technique and Recent Results", Pulse-Cytophotometry, 1976, 39-45), die Fluoreszenzintensitäten von Zellen, die mit zwei Farbstoffen gefärbt sind, unabhängig voneinander quantitativ zu messen. Beide Systeme verwenden Beleuchtung mit zwei Exzitationslichtbündeln von unterschiedlicher Wellenlänge in zwei räumlich getrennten Bereichen der Objektebene, die beide von jeder zu analysierenden Zelle passiert werden.

Indem das optische System, das in der hier vorgestellten Erfindung beschrieben wird, in ein Durchflußzytometer eingebaut wird und indem es, wie in Abb. 5 gezeigt, mit Hilfe von zwei schlitzförmigen Leuchtfeldblenden 9b modifiziert wird, können zwei separate Bereiche in der Durchflußkammer 17b des Durchflußzytometers mit zwei Strahlenbündel von unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet werden. In dem in Abb. 4 gezeigten Beispiel wird ultraviolettes und grünes Licht einer Quecksilberdampflampe verwendet. Das blaue und rote Fluoreszenzlicht der Zellen, die mit zwei unterschiedlichen, mit ultraviolettem und grünem Licht anregbaren Fluorchromen gefärbt sind und die beide Exzitationsregionen durchfließen, passiert den dichroitischen Doppelspiegel 12. Mit Hilfe eines Strahlenteilers 18 (dichroitischer Spiegel mit Kante bei 500 nm), der mit einem Winkel von 45 Grad zur optischen Achse des Mikroskop-Objektives installiert ist, können die Fluoreszenzintensitäten in den zwei Beleuchtungsbereichen mit zwei Photomultiplikatoren 21 gemessen werden. Vor jedem der beiden Photomultiplikatoren ist eine schlitzförmige Meßfeldblende 19a so angebracht, daß nur das rote Fluoreszenzlicht aus dem Grün-Anregungsbereich die eine Blende passiert und nur das blaue Fluoreszenzlicht aus dem UV-Anregungsbereich die andere Blende passiert. Die Sperrfilter 20a und 20b (ein Bandpaß-Filter 435-490 und ein Schott-Filter OG590) sind so wie in Abb. 5 gezeigt vor den Photomultiplikatoren angebracht zur Schwächung von Hintergrundlicht und zur Selektion der zu analysierenden Fluoreszenzfarben.

Die Unterschiede und Vorteile dieser modifizierenden Optik im Vergleich zu der Zwei-Wellenlängen Optik von W. Göhde (U.S. Patent No. 4 225 229) sind, daß das hier vorgestellte optische System zwei Strahlenbündel erzeugt, die unabhängig voneinander zum Ausgleich von chromatischen Aberrationen modifiziert werden können, und daß es einen dichroitischen Doppelspiegel oder Rejektionsbandfilter verwendet, der mit hoher Effektivität sowohl beide Anregungslichtwellenlängen reflektiert als auch beide Fluoreszenzstrahlen transmittiert.

Die Abb. 6a und 6b zeigen eine andere mögliche Modifikation des optischen Systems der hier dargestellten Erfindung. Eine zweite Lichtquelle, zum Beispiel ein Argon-Ionen Laser kann zusätzlich angebracht werden. Mit Hilfe von einem Vollspiegel 23 und den dichroitischen Spiegeln 24 (Strahlenteiler mit Kante bei 420 nm) und 25 (Strahlenteiler mit Kante bei 500 nm) können drei unabhängige Lichtstrahlen ineinander überführt werden. Die kombinierten Lichtstrahlen werden dann von einem kommerziell erhältlichen Reflexionsbandfilter 26 reflektiert, dessen Transmissionsspektrum, das bei einem Einfallswinkel von 45 Grad aufgezeichnet wurde, in der Abb. 6b gezeigt wird.

Abb. 7 stellt eine mögliche Anwendung des optischen Systems der hier gezeigten Erfindung in einem konfokalen Mikroskop dar, das eine Nipkow-Scheibe 31, ein Spiegel-Objektiv 32 und eine CCD-Kamera verwendet. Das optische System ist so angeordnet, daß die Nipkow-Scheibe, die in der Ebene der Leuchtfeldblende und Meßfeldblende liegt und die Konfokalität für Beleuchtung und Abbildung erzeugt, mit den kombinierten Strahlenbündeln beleuchtet wird. Die Verwendung eines Spiegelobjektives 29, das frei von chromatischen Abberrationen ist, garantiert Konfokalität für beide Anregungswellenlängen und beide Fluoreszenzfarben. Auch schwache Fluoreszenzen können dann mit Hilfe der CCD-Kamera detektiert werden.

Claims (4)

1. Optisches System für Auflicht-Fluoreszenz- Mikroskopie zur Detektion von Charakteristika von beispielsweise biologischen Zellen, insbesondere für die Beobachtung von Fluoreszenz-Charakteristika bei Exzitation mit voneinander unabhängigen Strahlenbündeln, die von einer einzelnen Lichtquelle gebildet werden und die unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, gekennzeichnet durch eine Lichtquelle mit einem breiten spektralen Energiespektrum oder mit unterschiedlichen, distinkten Wellenlängen, konventionellen optischen Komponenten wie einem Kollektorlinsensystem, Linsen, dichroitischen Strahlenteilern, optischen Filtern, die so angeordnet werden, daß unabhängige Strahlenbündel gebildet werden, die separat modifiziert werden und die dann ineinander überführt werden, um ein Lichtstrahlenbündel zu bilden, das aus unterschiedlichen Wellenlängen besteht, und einem dichroitischen Doppelspiegel oder Rejektionsbandfilter, der mit hoher Effizienz sowohl die unterschiedlichen Exzitationsstrahlen reflektiert als auch die Fluoreszenzfarben transmittiert.

2. Optisches System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Effekte chromatischen Abberationen der Linsen im Exzitationslichtweg durch separate Modifikationen der voneinander unabhängigen Strahlenbündel minimiert werden.

3. Optisches System nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Ergänzung mit zusätzlichen Lichtquellen.

4. Optisches System nach Anspruch 1, 2 oder 3, gekennzeichnet durch die Messung - ergänzt durch ein rotierendes Rad von Blenden - unterschiedlicher Fluoreszenzen von unterschiedlichen Fluorochromen quantitativ in einem statistischen Objekt wie zum Beispiel biologischen Zellen mit minimierten Effekten von Energie-Transfer und Überlappungen von Emissionsspektren.