DE69115701T2 - Konfokales optisches rastermikroskop - Google Patents
Konfokales optisches rastermikroskopInfo
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf ein konfokales optisches Abtastmikroskop.
- Die UK-Patentschrift Nr. 2 184 321 A offenbart ein konfokales optisches Abtastmikroskop, das insbesondere zum Studium von fluoreszierenden oder reflektierenden Proben dient. Dieses Gerät beruht auf dem Bündeln von Licht auf einen einzigen, über der Probe hin und her geführten Lichtfleck, wobei dieser ausgeleuchtete Lichtfleck nach dem Auswerten auf der konfokalen Öffnung vor einem Detektor abgebildet wird.
- In dem Fall, in dem aus der Fluoreszenz einer Probe ein Bild zu formen ist, wird die Wellenlänge des auf die Probe gerichteten Lichtes so ausgewählt, daß es die Fluoreszenz auslöst. Mit einem geeigneten Strahlenteiler wird das emittierte Licht von dem auslösenden Licht getrennt und durch gegenüber der Wellenlänge selektive Filter in solcher Weise weitergeleitet, daß der Detektor nur auf das durch die Fluoreszenz emittierte Licht anspricht. Auf dieser Konstruktion beruhende Geräte sind im Handel erhältlich. Sie enthalten Vorkehrungen zum Unterteilen des emittierten Lichtes in Strahlen verschiedener Wellenlängenbereiche durch einen geeigneten Strahlenteiler und Filter. Nach dieser Teilung können zwei Farbstoffe verwendet werden, die verschiedene Fluoreszenzfarben, die an zwei Detektoren unterschieden werden können, emittieren. Alternativ kann zur gleichen Zeit ein Reflexionsbild durch die Verwendung geeigneter Strahlenteiler gemäß angenommener optischer Praxis als Fluoreszenzbild erhalten werden.
- Die bekannten Geräte arbeiten zufriedenstellend. Sämtliche konfokalen Abtastmikroskope, die auf der Anwendung eines einzigen Abtastflecks beruhen, leiden jedoch unter dem Mangel, daß die gesamte spektrale Selektivität des Systems in der Auftrennung des emittierten oder reflektierten Strahls in Bereiche verschiedener Wellenlänge liegt. Falls die Fluoreszenz-Emissionsspektren der beiden Farbstoffe sich beträchtlich überlappen, können sie nicht unterschieden werden. Zum Beispiel erläutern Bacallao u.a. in Handbook of Confocal Microscopy, Plenum Press, 1990, daß die allgemein verwendeten Farbstoffe Fluoreszein und Rhodamin in einem System dieser Bauart nicht wirksam getrennt werden können. Zum Erzielen einer annehmbaren Trennung muß die Erregungswellenlänge geändert werden. Dies kann durch einen Wechsel von einer Laserlichtart auf eine andere mit spektral unterschiedlichen Eigenschaften erfolgen. Zuerst wird ein Bild durch Betreiben des Systems mit einer Art der Erregung und dann ein zweites Bild mit einer anderen Art des erregenden Strahls erzielt. Diese Betriebsweise ist langsam und mühevoll.
- Awamura, Ode und Yonezawa beschrieben ein Mikroskop, bei dem rote, grüne und blaue Laserstrahlen unabhängig voneinander über die Probe geführt werden, und die reflektierten Strahlen werden mit dichroischen Filtern getrennt, und jeder führt über einer von drei getrennten linearen CCD-Detektoranordnungen eine Abtastbewegung durch. Die Beschreibung wurde in Proceedings of SPIE, The International Society for Optical Engineering (1987), Band 765, Seiten 53 bis 60, veröffentlicht. Im Prinzip kann das System von Awamura u.a. als Fluoreszenzmikroskop verwendet werden. Es würde dann während jeder linienförmigen Abtastung die Erregung von mehr als einer Farbstoffart in rascher Aufeinanderfolge zulassen. Im Fall von zwei Farbstoffen mit identischen Emissionsspektren oder einem einzigen ratiometrischen Farbstoff, bei dem das Emissionsspektrum in einem einzigen Wellenband zu überwachen ist, bietet das System von Awamura u.a. keinen Vorteil gegenüber dem von White (UK-Patentanmeldung Nr. 2 184 321 A), da keins der beiden Systeme die beiden Emissionssignale trennen kann.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein konfokales optisches Abtastmikroskop vorgesehen, bestehend aus:
- - einem optischen Abtastsystem,
- - Mitteln zum gleichzeitigen Erzeugen von zwei oder mehreren Eingabestrahlen fakultativ verschiedener spektraler Zusammensetzung und sich unterscheidender Ausrichtungen derart, daß nach dem Durchgang durch das Abtastsystem eine sich in der Prüfung bef indende Probe mit zwei oder mehr verschiedenenartigen und getrennten elementaren Beleuchtungsflächen abgetastet wird, und
- - zwei oder mehreren Detektoren zum Aufnehmen von zwei oder mehr Ausgabestrahlen nach dem Auswerten durch Zurückführen durch das Abtastsystem, wobei jeder Detektor einen Ausgabestrahl empfängt, der auf das von einer der beleuchteten elementaren Flächen abgeleitete Ausgabelicht im wesentlichen beschränkt ist.
- Die Erfindung läßt die Anwendung von zwei oder mehr Mikroskopkanälen mit verschiedenen Erregungs-, aber identischen Emissionswellenbändern zu und ermöglicht damit Erregungsverhältnis-Bildmessungen gemäß angenommener Praxis.
- Die Erfindung läßt auch zwei oder mehr Mikroskopkanäle mit identischen Erregungs-, aber verschiedenen Emissionswellenbändern zu und ermöglicht damit Emissionsverhältnis-Bildmessungen gemäß angenommener Praxis.
- Die vorliegende Erfindung ist damit bei vielen Arten von optischen Abtastmikroskopen anwendbar. Sie sieht ein Mittel vor, mit dem zwei oder mehr spektral unterschiedliche Erregungslichtflecke oder -streifen gleichzeitig über der Probe während jeder Auslenkung des Abtastsystems zusammen abgetastet werden können. Die Emission von jedem Lichtfleck wird einzeln und getrennt einer ortsfesten konfokalen, zu einem Detektor führenden Öffnung zugeleitet, wobei für jeden Lichtfleck mindestens eine Öffnung und ein Detektor vorgesehen sind.
- Der von jedem Lichtfleck emittierte Strahl kann infolge der Fluoreszenz oder Reflexion der Probe gemäß angenommener Praxis spektral gefiltert oder zwischen den Detektoren unterteilt oder nicht selektiv dem Detektor zugeführt werden. In einem einzigen Abtastzyklus können damit zwei oder mehr vollständige Bilder erzielt werden, wobei sich jedes sowohl im Erregungs- als auch im Emissionswellenband von den anderen Bildern unterscheiden kann.
- Die Erfindung kann als "ein optisches Multiplex-System" angesehen werden, da sie zwei oder mehr Gruppen von unabhängigen, aber nahezu parallelen Strahlwegen umfaßt, die durch das gleiche Abtastsystem und die gleiche Objektivlinse durchtreten, wobei die optischen Wege im wörtlichen Sinne eines Zusammenfaltens im Multiplex-Verfahren verschachtelt werden.
- Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der Ausführungsformen unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen. Dabei ist:
- Fig. 1 eine schematische Darstellung eines konfokalen Abtastmikroskops mit dem optischen Multiplex-System der vorliegenden Erfindung,
- Fig. 2 eine schematische Darstellung mit der Wiedergabe einer alternativen und bevorzugten optischen Anordnung des oberen Teils von Fig. 1 und
- Fig. 3 eine schematische Darstellung mit der Wiedergabe ei nes optischen Mittels, mit dem mehrere Strahlen unterschiedlicher spektraler Eigenschaften von einem einzigen, zum Beispiel einem Vielmoden-Gaslaser (multiline laser), zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung erhalten werden können.
- Gemäß den Zeichnungen sieht die vorliegende Erfindung eine optische Anordnung vor, die die gleichzeitige Anwendung einer Anzahl von unabhängigen optischen Kanälen zur Erregung in einem konfokalen Abtastlasermikroskop mit einem ausgedehnten Emissionsstrahlweg zuläßt, aber nicht auf eine Anwendung bei dieser Art von Mikroskop beschränkt ist. Die Erfindung kann bei konfokalen Mikroskopen verwendet werden, bei denen ein Lichtstreifen oder -schlitz über der Probe hin und her geführt wird, wie auch bei denen, bei denen mit einem einzigen Lichtfleck abgetastet wird.
- In Fig. 1 werden zum Vereinfachen der Darstellung nur zwei unabhängige Lichtwege gezeigt. In der Praxis gibt es jedoch keine Beschränkung auf diese Zahl.
- Licht von den beiden Lasern L1 und L2 mit verschiedenen spektralen Eigenschaften wird auf einen Strahlenteiler BS1 gelenkt. Die beiden Strahlen stehen unter einem geringen Winkel zueinander, der in der Darstellung aus Gründen der Klarheit übertrieben ist. Die beiden Strahlen werden in ein Abtastsystem reflektiert, wie es dargestellt ist, das eine gleichzeitige winkelformige Abtastung mit den beiden Strahlen bewirkt. Die winkelmäßige Trennung der Strahlen wird während der Abtastung beibehalten und führt nach dem Durchtritt durch eine geeignete Mikroskopoptik, im typischen Fall ein Okular E und ein Objektiv O, auf der Probe zur Bildung von zwei unterschiedlichen, sich bewegenden Lichtflecke S1 und S2.
- Infolge von Reflexion oder Fluoreszenz wird das Licht von der Probe bei S1 emittiert, und ein Teil dieses emittierten Lichtes läuft durch das optische System zurück, wird ausgewertet, das heißt durch das Abtastsystem in einen stationären Strahl zurückverwandelt, tritt durch den Strahlenteiler BSL durch und fällt auf eine zu einem Detektor D1 führende konfokale Öffnung A1. Das Licht von S2 tritt entlang eines ähnlichen, aber bestimmten Pfades durch das optische System und fällt auf einen Detektor D2. Die bevorzugte winkelmäßige Trennung ist die kleinstmögliche, die mit einer zufriedenstellenden Trennung der optischen Kanäle konsistent ist. Zum Ermöglichen einer Bildaufzeichnung kann der kleine Zeitunterschied zwischen dem Abtasten eines gegebenen Punktes auf der Probe durch die Lichtflecke entsprechend S1 und S2 durch geeignete herkömmliche elelktronische Mittel ausgeglichen werden, zum Beispiel durch eine Bildbearbeitungssoftware. Für das Funktionieren des Systems ist es nicht wesentlich, daß die beiden oder mehr Lichtflecke auf der gleichen Abtastlinie liegen.
- Bei der bevorzugten Ausführungsform nach Fig. 2 werden die Abtastvorrichtung und das Mikroskop nicht in der Figur gezeigt, sondern sollten wie in Fig. 1 angenommen werden. Die Strahlen von den Lasern L1 und L2 gelangen wieder unter einem kleinen Winkel auf den Strahlenteiler BS1. Die zurückkehrenden Strahlen gelangen nach dem Durchgang durch den Strahlenteiler BS1 auf einen zweiten Strahlenteiler BS2, der dichromatische Eigenschaften aufweist, so daß das meiste Licht in einem der Strahlen, B1, bis zu der konfokalen Öffnung A1 weiterläuft und dann zum Detektor D1, während der andere Strahl B2 vorzugsweise auf A2 und D2 reflektiert wird. Diese Abwandlung wird bevorzugt, da sie die Verwendung des zweiten Strahlenteilers BS2 zum Erreichen einer Auswahl der Emissionswellenlängen zuläßt und auch mit einer nur geringen Abänderung der vorhandenen Geräte verwirklicht werden kann. Die Trennung der emittierten Strahlen nach Wellenlänge kann durch die zusätzliche Verwendung von gegenüber der Wellenlänge selektiven Filtern F1 und F2 verbessert werden.
- Das Zielen der Emissionsstrahlen, jeder auf die passende Öffnung A1 oder A2, kann mit der Verwendung (nicht gezeigter) zwischen BS2 und den Detektoren D1 oder D2 angeordneter Spiegel zweckmäßig erreicht werden
- Zusätzliche Spiegel und dichromatische Reflektoren stellen ein geeignetes Mittel zum Erreichen eines passenden Winkels zwischen den Eingabestrahlen L1 und L2 dar. Zum Beispiel zeigt Fig. 3 eins der vielen möglichen Mittel, mit denen Licht von einem einzigen Vielmoden-Gaslaser (multiline laser) L in Strahlen verschiedener spektraler Zusammensetzung und Winkel aufgetrennt werden kann.
- In diesem Fall wird ein parallelseitiger Block B aus Glas oder einem anderen transparenten Werkstoff zum Erzeugen einer geringen seitlichen Trennung der Strahlen nach Maßgabe der Wellenlänge verwandt. Der Winkel zwischen den Strahlen wird dann durch deren Duchleiten durch ein Prisma P eingestellt, wobei sie wegen dessen Streukraft verschiedenen Winkelumlenkungen unterliegen. Durch geeignete Ausrichtung des Prismas werden parallele Strahlen, die jeweils einer einzigen Wellenlänge entsprechen, erzeugt. Diese konvergieren dann in Richtung auf den Strahlenteiler BS1. Der Konvergenzwinkel wird durch den Winkel des Prismas, dessen Brechungsindex und Streukraft bestimmt. In der Darstellung zeigt die durchgezogene Linie S einen Strahl auf einer kürzeren Wellenlänge, der stärker als der durch die strichlierte Linie D angezeigte Strahl gebrochen wird, der Licht mit einer längeren Wellenlänge entspricht.
- Im Rahmen der vorstehend beschriebenen Erfindung sind verschiedenartige Abänderungen der oben beschriebenen und erläuterten Anordnungen möglich.
Claims (13)
1. Ein konfokales optisches Abtastmikroskop, bestehend aus:
- einem optischen Abtastsystem,
- Mitteln (L1, L2) zum gleichzeitigen Erzeugen von zwei
oder mehreren Eingabestrahlen fakultativ verschiedener
spektraler Zusammensetzung und sich unterscheidender
Ausrichtungen derart, daß nach dem Durchgang durch das
Abtastsystem eine sich in der Prüfung bef indende Probe
mit zwei oder mehr verschiedenenartiqen und getrennten
elementaren Beleuchtunqsflächen (S1, S2) abgetastet
wird, und
- zwei oder mehreren Detektoren (D1, D2) zum Aufnehmen
von zwei oder mehr Ausgabestrahlen nach dem Abtasten
durch Zurückführen durch das Abtastsystem, wobei jeder
Detektor einen Ausgabestrahl empfängt, der auf das von
einer der beleuchteten elementaren Flächen abgeleitete
Ausgabelicht im wesentlichen beschränkt ist.
2. Ein Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die zwei oder
mehr Strahlen zwei oder mehr Mikroskopkanäle mit
verschiedenen Erregungs-, aber identischen
Emissionswellenbändern markieren.
3. Ein Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die zwei oder
mehr Strahlen zwei oder mehr Mikroskopkanäle mit
identischen Erregungs-, aber verschiedenen
Emissionswellenbändem markieren.
4. Ein Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die zwei oder
mehr Strahlen zwei oder mehr Mikroskopkanäle mit
verschiedenen Erregungs- und verschiedenen
Emissionswellenbändern markieren.
5. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4,
bei dem die Emission von jeder elementaren Fläche einer
zu einem Detektor führenden ortsfesten konfokalen
Öffnung (A1, A2) individuell und getrennt zugeführt wird
und für jede Fläche mindestens eine Öffnung und ein
Detektor vorgesehen sind.
6. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5,
bei dem die elementaren Flächen in der Form von Flecken
oder Streifen vorliegen.
7. Ein Mikroskop nach Anspruch 6, das ein
schlitzabtastendes konfokales Mikroskop ist, bei dem die Streifen durch
Schlitzbilder erzeugt werden.
8. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7,
bei dem die Eingabestrahlen unter einen kleinen Winkel
zueinander gesetzt werden.
9. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8,
bei dem die Eingabestrahlen durch Teilen des Lichtes von
einem Multiline-Laser (L) erhalten werden.
10. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9,
bei dem ein Strahlteiler (BS2) die Trennung der
Ausgabestrahlen besorgt.
11. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9,
bei dem die Trennung der Ausgabestrahlen in bezug auf
die Wellenlänge durch ein oder mehrere
Wellenlängen-Selektivfilter (F1, F2) gesteigert wird.
12. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11,
bei dem verschiedenartige Eingabestrahlen durch
Durchleiten eines eine multiple Wellenlänge aufweisenden
Strahles durch ein Prisma (P) erzielt werden.
13. Ein Mikroskop nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12,
bei dem Aufnahmezeitunterschiede aufgrund der
jeweiligen, sich auf die verschiedenen abgetasteten elementaren
Flächen beziehenden Weglängen elektronisch ausgeglichen
werden.
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