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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Transportprozessen
in einer vorzugsweise biologischen Probe, wobei ein Laserlichtstrahl mittels
einer Scanvorrichtung innerhalb vorgebbarer Probenbereiche zeilenweise über die
Probe geführt wird
und das von der Probe ausgehende Licht mittels einer Detektionsvorrichtung
nachgewiesen wird.
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Verfahren
der hier in Rede stehenden Art sind seit langem in unterschiedlichen
Ausführungsformen
aus der Praxis bekannt. Von den bekannten Verfahren seien lediglich
beispielhaft FRAP (fluorescence recovery after photobleaching),
FLIP (fluorescence loss in photobleaching) oder die Photoaktivierung
genannt. Für
diese Verfahren ist charakteristisch, dass eine vorgebbare ROI (Region
of Interest) in besonderer Weise beleuchtet wird. Bei FRAP-, FLIP-
oder Photoaktivierungsexperimenten ist diese sogenannte Manipulationsbeleuchtung
zum Beispiel durch eine besonders hohe Helligkeit gekennzeichnet.
Bei den entsprechenden inversen Experimenten – inverses FRAP, inverses FLIP,
inverse Photoaktivierung – wird
demgegenüber
eine besonders dunkle Manipulationsbeleuchtung gewählt. Bekannt
sind auch Verfahren, bei denen sich die Beleuchtung beim normalen
Imaging und die Manipulationsbeleuchtung durch die jeweilige spektrale
Zusammensetzung voneinander unterscheiden.
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Zweck
der Manipulationsbeleuchtung ist es, bestimmte Prozesse in der zu
untersuchenden Probe in Gang zu setzen, wobei es sich beispielsweise
um das Bleichen oder die Photoaktivierung eines Fluorophors handeln
kann. Denkbar ist auch eine Umorganisation im Inneren eines Fluorophors.
Diese Prozesse können Änderungen
der spektralen Eigenschaften oder sonstige nachweisbare Veränderungen
zur Folge haben.
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Durch
eine lokal unterschiedlich gewählte Manipulationsbeleuchtung
können
der Probe lokale Eigenschaften aufgeprägt werden, so dass zum Beispiel
bestimmte Teile von Zellen nach der Manipulationsbeleuchtung besonders
gut bzw. besonders schlecht sichtbare Fluorophore aufweisen. Die
der Probe aufgeprägten
lokalen Eigenschaften können sodann
in einem Konfokalmikroskop sichtbar gemacht werden.
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Durch
Transportprozesse im Inneren der Probe – zum Beispiel innerhalb von
Zellen – findet eine
Umverteilung der Fluorophore statt. In vielen Fällen führen die Transportprozesse
letztendlich zu einer mehr oder weniger homogenen Verteilung der Fluorophore.
Mit Hilfe von mikroskopischen Aufnahmen lässt sich das zeitliche Verhalten
dieser Prozesse sichtbar machen, was Rückschlüsse über die Transportprozesse in
der Probe erlaubt.
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Konventionelle
Experimente der oben beschriebenen Art werden im Allgemeinen derart durchgeführt, dass
die Probe zunächst
einmal oder mehrmals mit einem Laserlichtstrahl für die Manipulationsbeleuchtung
abgerastert wird. In einem nachfolgenden Schritt wird die Probe
dann zur eigentlichen Bildaufnahme gerastert. Im Ergebnis erhält man dadurch
eine Serie von Bildern in unterschiedlichen zeitlichen Abständen. Bei
einer typischen Bildaufnahmegeschwindigkeit, die in der Größenordnung von
1 bis 100 Frames/Sekunde liegt, beträgt der zeitliche Abstand zwischen
zwei aufeinander folgenden Bildern 10 ms bis 1 s. Äußerst problematisch
ist in diesem Zusammenhang, dass Diffusionsprozesse in biologischen
Proben im Allgemeinen deutlich schneller ablaufen. Typischerweise
bewegt sich ein Fluorophor in wenigen Mikrosekunden aus dem Fokus
eines Konfokalmikroskops heraus. Lokale Eigenschaften von Transportprozessen,
wie zum Beispiel lokale Flussrichtungen, Barrieren, etc., lassen
sich durch derartige Schnappschüsse
folglich nur äußerst schlecht
untersuchen, da sich eine durch die Manipulationsbeleuchtung bewirkte
lokale Anregung zwischen zwei aufeinander folgenden Bildern zu stark ausbreitet.
Zur Bildgebung, beispielsweise zur farblichen Darstellung von Bereichen
der Probe mit unterschiedlichen Transporteigenschaften, sind die
bekannten Verfahren aus den beschriebenen Gründen erst recht völlig ungeeignet.
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Des
Weiteren verursacht der sogenannte „Volumeneffekt" weitere Probleme
bei der Untersuchung der Probe. Der Volumeneffekt macht sich dadurch
bemerkbar, dass auch Transportprozesse räumlich aus der Bildebene eines
Konfokalmikroskops heraus bzw. in diese hinein stattfinden. Da die sich
außerhalb,
d. h. ober- und unterhalb der Bildebene befindlichen Bereiche der
Probe der Beobachtung nicht zugänglich
sind, ist eine Interpretation von gemessenen Diffusionskonstanten
oder sonstigen lokalen Gegebenheiten äußerst schwierig. So ist beispielsweise
eine lokale Transportbarriere in der Bildebene nicht sichtbar, wenn
der Transport diese Barriere durch Umgehung über das darüber- bzw. darunterliegende
Volumen überwindet.
Auch die Signalqualität
leidet unter dem Volumeneffekt, da manipulierte Fluorophore relativ
schnell in das der Beobachtung unzugängliche Volumen ober- bzw. unterhalb der
Bildebene wandern.
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Zur
Umgehung der mit dem Volumeneffekt einhergehenden Probleme werden
Messungen zur Untersuchung von Transportprozessen in Proben oftmals
mit geöffnetem
Pinhole des Konfokalmikroskops durchgeführt. Dadurch wird die Auflösung in
Laserstrahlrichtung verschlechtert und anstatt eines definierten
Schnittes der Probe ein Projektionsbild der Probe aufgenommen. Auf
diese Weise lassen sich die gewonnenen Daten zwar besser deuten,
allerdings muss gleichzeitig auf die wesentlichen Vorteile eines
Konfokalmikroskops wie hohe Auflösung, Streulichtunterdrückung, etc.
verzichtet werden.
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Aus
der
DE 100 43 986
A1 ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels
eines konfokalen Scan-Mikroskops bekannt, wobei die Probe zunächst mittels
eines Beleuchtungslichtstrahls abgerastert und ein Voransichtsbild
erstellt wird. Sodann wird mindestens ein interessierender Bereich
im Voransichtsbild markiert. Anschließend erfolgt ein Zuordnen individueller
Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen
und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu den markierten interessierenden
Bereichen. In einem nächsten
Schritt werden die markierten Bereiche der Probe gemäß der Zuordnung
beleuchtet, wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation
in einem der markierten Probenbereiche durchgeführt wird. Durch Auswählen von
mehreren interessierenden Bereichen nach der Bildgebung und Erstellung
des Voransichtsbildes können
die mehreren Bereiche jeweils unterschiedlich manipuliert werden, so
dass Vergleichsuntersuchungen durchgeführt werden können.
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Aus
der
US 2004/0042007
A1 ist für
sich gesehen ein Hochleistungs-Großfeld-Rastermikroskop mit zwei Anregungslichtstrahlen
bekannt, welche in leicht unterschiedlichen Winkeln auf die Probe
gelangen und dort zwei Beleuchtungspunkte erzeugen. Die von jedem
beleuchteten Punkt erzeugten Emissionsstrahlen werden mit getrennten
Detektoren nachgewiesen.
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Aus
der
US 5,304,810 ist
ein konfokales optisches Rastermikroskop bekannt, bei dem mit zwei unter
einem Winkel versetzt zueinander auf die Probe treffenden Anregungslichtstrahlen
zwei getrennte Beleuchtungsflächen
erzeugt werden. Das Mikroskop umfasst zwei Detektoren, von denen
jeder jeweils das von einer der Beleuchtungsflächen ausgehende Emissionslicht
detektiert.
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Aus
der
DE 198 29 981
A1 sind ein Verfahren und eine Anordnung zur konfokalen
Mikroskopie mit einem Beleuchtungslichtstrahl bekannt, wobei die spektrale
Zusammensetzung und die Intensität
des Beleuchtungslichtstrahls während
der Ablenkung des Laserlichtstrahls gezielt verändert werden. Die Veränderung
kann bspw. pixelweise erfolgen, so dass zwei nebeneinander liegende
Orte der Probe mit Licht unterschiedlicher Spektraleigenschaften und/oder
mit Laserstrahlung unterschiedlicher Intensität beaufschlagt werden.
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Aus
der
US 6,630,680 B2 ist
für sich
gesehen eine konfokale Scanvorrichtung mit insgesamt drei Laserlichtquellen
mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen bekannt, wobei die von
den Laserlichtquellen emittierten Lichtstrahlen in der zu untersuchenden
Probe Phosphoreszenz und/oder Fluoreszenz auslösen.
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Aus
der
US 2004/0178356
A1 ist ein Laserscanmikroskop bekannt, das zwei Laserlichtquellen umfasst,
denen jeweils eine separate Scaneinrichtung zugeordnet ist. Einer
der beiden Laserlichtstrahlen dient zum Aufbrechen einer in der
Probe vorhandenen caged-Verbindung. Der andere Laserlichtstrahl
dient der Bildgebung.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Untersuchung von Transportprozessen der eingangs genannten Art
anzugeben, mit dem insbesondere auch Prozesse innerhalb der Probe,
die auf einer kurzen Zeitskala ablaufen, mit hoher Genauigkeit untersucht werden
können.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Untersuchung von Transportprozessen löst die voranstehende Aufgabe
durch ein Verfahren mit den Merkmalen Patentanspruchs 1. Danach
ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass als Laserlichtstrahl
sowohl ein Bildgebungslichtstrahl zum Zwecke der Beobachtung der
Probe als auch ein Manipulationslichtstrahl zum Zwecke der Manipulation
der Probe durch Auslösen
von Transportprozessen in der Probe eingesetzt wird, wobei die beiden
Laserlicht strahlen eine feste Winkeldifferenz zueinander aufweisen
und synchron zueinander die Probe abrastern, und wobei der Bildgebungslichtstrahl
dem Manipulationslichtstrahl in einer Weise vorauseilt, dass mit dem
Bildgebungslichtstrahl noch nicht durch den Manipulationslichtstrahl
manipulierte Pixel der Probe beleuchtet und im Bild sichtbar gemacht
werden.
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Es
ist zunächst
erkannt worden, dass die Bildaufnahmegeschwindigkeit von Verfahren,
bei denen die Probe zunächst
mit der Manipulationsbeleuchtung und in einem nachfolgenden Schritt
für die eigentliche
Bildaufnahme gerastert wird, zu niedrig ist, um schnell ablaufende
Transportprozesse insbesondere in biologischen Proben, mit zufriedenstellender
Genauigkeit zu untersuchen. In erfindungsgemäßer Weise wird vorgeschlagen,
vorgebbare Bereiche der Probe von einem Laserlichtstrahl zunächst zum Zwecke
der Beobachtung der Probe und anschließend zum Zwecke der Manipulation
der Probe zu beleuchten. Das erfindungsgemäße Verfahren hat zur Folge,
dass ausschließlich
Bereiche der Probe beobachtet werden, die noch keiner Manipulationsbeleuchtung
ausgesetzt waren. Dabei macht sich die Erfindung den Effekt zunutze,
dass nach der Manipulationsbeleuchtung vorgebbarer Probenbereiche Transportprozesse
stattfinden, die beispielsweise dazu führen, dass Fluorophore in benachbarte
Pixel transportiert werden. Diese können von dem Bildgebungslichtstrahl – beispielsweise
in der nächsten
Zeile – erfasst
werden. Die Bildgebung folgt somit in äußerst kurzem zeitlichem Abstand
der Manipulationsbeleuchtung, so dass im Ergebnis auch schnell ablaufende
Transportprozesse der Beobachtung zugänglich gemacht sind.
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In
vorteilhafter Weise wird jede Zeile der Probe von Laserlichtstrahlen
zweimal überstrichen.
Dabei dient die erste Beleuchtung der Bildgebung und die zweite
Beleuchtung der Manipulation der Probe. Nachdem der Manipulationslichtstrahl
die von ihm überstrichenen
Pixel der Probe beeinflusst hat, werden Fluorophore aufgrund von
Transportprozessen in benachbarte Pixel transportiert. Diejenigen
Fluorophore, die in die nächste
aufgenommene Bildzeile transportiert werden, werden sodann von dem
Bildgebungslichtstrahl in der nächsten
Zeile erfasst und im Bild sichtbar. Somit ergibt sich ein Bild,
in dem nur diejenigen Fluorophore sichtbar sind, die aufgrund eines
Transportprozesses in Richtung der nachfolgenden Bildzeile transportiert
wurden. Definiert man ein kartesisches Koordinatensystem, in dem
die Probe beispielsweise in positiver x-Richtung abgerastert wird,
so stellt die gemessene Bildhelligkeit ein direktes Maß für den lokalen
Transportfluss in y-Richtung dar.
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Im
Hinblick auf eine einfache Auswertbarkeit und hohe Aussagekraft
der aufgenommenen Bilder erweist sich eine feste zeitliche Korrelation
zwischen der Bildgebungsbeleuchtung und der Manipulationsbeleuchtung
der Probe als vorteilhaft.
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Zur
Bildgebung und zur Manipulation der Probe wird jeweils ein eigener
Laserlichtstrahl verwendet. Mit anderen Worten wird neben dem üblicherweise
zur Bildgebung verwendeten Laserlichtstrahl ein zweiter Laserlichtstrahl
verwendet, wobei beide Laserlichtstrahlen eine feste Winkeldifferenz zueinander
aufweisen. Dadurch ergeben sich zwei Beleuchtungspunkte an unterschiedlichen
Stellen auf der Probe, die einen festen räumlichen Abstand zueinander
besitzen und synchron zueinander die Probe abrastern. Durch eine
feste Winkeldifferenz, deren Größe jeweils
in Abhängigkeit
von der konkreten Anwendung und den konkreten Probeneigenschaften festgelegt
werden kann, ergibt sich stets ein fester zeitlicher Abstand zwischen
dem Bildgebungslichtstrahl und dem Manipulationslichtstrahl der
vorhergehenden Zeile.
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In
besonders vorteilhafter Weise wird die Untersuchung mittels eines
Konfokalmikroskops durchgeführt.
Da das Bild nahezu sofort nach der Manipulation erzeugt wird und
Volumenprozesse demzufolge eine untergeordnete Rolle spielen, können sämtliche
Vorteile des Konfokalmikroskops genutzt werden. Insbesondere ist
es nicht notwendig, die Untersuchung mit geöffnetem Pinhole des Konfokalmikroskops
durchzuführen,
d. h. mit anderen Worten, dass mit einer hohen Auflösung in
Laserstrahlrichtung zur Erzielung einer hochgenauen Bildgebung gearbeitet werden
kann.
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Im
Hinblick auf ein hohes Maß an
Flexibilität kann
vorgesehen sein, dass die Geschwindigkeit der Scanvorrichtung an
die Geschwindigkeit der zu untersuchenden Transportprozesse angepasst
wird. Auf diese Weise ist es möglich,
die Untersuchung an Proben mit unterschiedlichen Eigenschaften sowie an
unterschiedliche experimentelle Situationen anzupassen, um stets
möglichst
weitreichende Aussagen über
die in der jeweiligen Probe stattfindenden Transportprozesse treffen
zu können.
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Für eine effiziente
Untersuchung können
besonders interessierende Bereiche der Probe (regions of interest,
ROI) bestimmt werden und die Manipulationsbeleuchtung der Probe
kann auf die festgelegten ROIs beschränkt werden.
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Während des
Scanvorgangs, beispielsweise in x-Richtung, kann der Strahl zum
Zwecke der Manipulation kontinuierlich über die Probe geführt werden.
Demgegenüber
kann es für
bestimmte Anwendungen vorteilhaft sein, innerhalb einer Zeile abwechselnd
Bereiche zu beleuchten bzw. nicht zu beleuchten. Insbesondere ist
eine schachbrettmusterartige Manipulationsbeleuchtung denkbar.
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Im
Rahmen einer komplexeren Ausführungsform
kann eine spektralselektive Manipulationsbeleuchtung der Probe vorgesehen
sein, so dass unterschiedliche Arten von Fluorophoren in der Probe
gezielt angeregt werden können.
Bei einer derartigen Ausführungsform
ist es weiterhin von Vorteil, die Detektionsvorrichtung derart auszulegen,
dass auch eine spektralsensitive Detektion des von der Probe ausgehenden
Lichts möglich
ist.
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Um
möglichst
umfassende Aussagen über die
in der Probe stattfindenden Transportprozesse machen zu können, ist
es vorteilhaft, mehrere Bilder der Probe aufzunehmen, wobei die
einzelnen Bilder gegeneinander um einen vorgebbaren Winkel gedreht
sind. Die Drehung des Bildes für
eine erneute Aufnahme kann beispielsweise mittels eines Bildrotators
oder durch geeignete Ansteuerung der Scanvorrichtung realisiert
werden. Aus den aufgenommenen Bildern kann der Transportfluss im
Inneren der Probe dann auf einfache Weise berechnet werden, indem
z. B. durch geeignete Differenzbildung der Intensitätswerte
der einzelnen Bilder die Projektion des Flusses auf eine relativ
zur Probe feste x- bzw. y-Achse bestimmt wird. In der Praxis ist
es so z. B. denkbar, Bilder für
Drehungen von 0°, 90°, 180° und 270° aufzunehmen.
Alternativ ist es möglich,
nur einen Satz von drei Bildern aufzunehmen, beispielsweise für Drehungen
von 0°,
120° und
240°. Die
gewünschten
Informationen können
durch geeignete Linearkombinationen der Bilder leicht ermittelt
werden. Entsprechende Techniken einschließlich der zugehörigen Korrekturverfahren
sind aus der Welt der Quadratur-Encoder hinreichend bekannt und
brauchen an dieser Stelle nicht im Einzelnen erläutert zu werden.
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Im
Hinblick auf eine hohe Genauigkeit der Messergebnisse ist es von
Vorteil, für
die Untersuchung geeignete Korrekturverfahren anzuwenden. Dabei
sind sowohl Online-Korrekturen, bei denen die Probe bereits während der
Messung beeinflusst wird, als auch nachträgliche Offline-Korrekturen
möglich. Mit
Hilfe der eingesetzten Korrekturverfahren kann z. B. der Anreicherung
von Zellen mit photoaktivierten Fluorophoren über die Sequenz der Messung
hin, Offsets oder ähnlichen
unerwünschten
Effekten Rechnung getragen werden.
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Die
gewonnenen Daten können
in Abhängigkeit
von der jeweiligen speziellen Situation auf vielfältige Weise
dargestellt werden. Besonders vorteilhaft ist eine Visualisierung
der Messdaten über
Farbkodierungen, Vektordiagramme, Höhenliniengrafen oder dergleichen.
Darüber
hinaus ist es möglich,
in die aufgenommenen Bilder anhand der Messdaten Grenzlinien und/oder
Grenzflächen
einzuzeichnen. Dabei könnte
zudem der jeweilige Fluss durch die Grenzen quantitativ angegeben
werden. Eine darstellungsmäßige Kenntlichmachung
von Flussquellen und/oder Flusssenken ist ebenfalls denkbar.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
das Verfahren in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden.
Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten
Patentansprüche und
andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele
anhand der Zeichnung zu verweisen. In der Zeichnung zeigt
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1 in
einer schematischen Darstellung den Scanvorgang gemäß einem
ersten Ausführungsbeispiel
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Untersuchung von Transportprozessen,
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2 den
Scanvorgang aus 1 zu einem späteren Zeitpunkt,
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3 eine
schematische Darstellung von mit einem erfindungsgemäßen Verfahren
gewonnenen Bildaufnahmen und
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4 in
einer schematischen Darstellung den Scanvorgang gemäß einem
zweiten Ausführungsbeispiel
eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1,
in der die Pixel 1 einer Probe in einem x, y-Koordinatensystem
dargestellt sind, zeigt – schematisch – das zeilenweise
Abrastern der Probe mit zwei Laserlichtstrahlen 2, 3,
wobei der eine Laserlichtstrahl 2 als Manipulationslichtstrahl 4 und
der andere Laserlichtstrahl 3 als Bildgebungslichtstrahl 5 fungiert.
Die beiden Laserlichtstrahlen 2, 3 werden entlang
der positiven x-Richtung über
die Probe geführt.
Beim Erreichen eines Zeilenendes wird der Scanvorgang am Anfang
einer in y-Scanrichtung nachfolgenden Zeile fortgesetzt.
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Wie 1 deutlich
zu entnehmen ist, werden durch die Laserlichtstrahlen 2, 3 zwei
Beleuchtungspunkte an unterschiedlichen Stellen auf der Probe erzeugt.
Die beiden Beleuchtungspunkte, die durch einen dickeren Rahmen schematisch
angedeutet sind, besitzen einen festen räumlichen Abstand zueinander
und rastern die Probe synchron zueinander ab. Der räumliche
Abstand zwischen den beiden Beleuchtungspunkten wird durch eine
vorgebbare Winkeldifferenz zwischen dem Manipulationslichtstrahl 4 und
dem Beleuchtungslichtstrahl 5 erreicht. Dadurch, dass der
Bildgebungslichtstrahl 5 dem Manipulationslichtstrahl 4 vorauseilt
wird erreicht, dass der Bildgebungslichtstrahl 5 stets
eine noch vom Manipulationslichtstrahl 4 unbeeinflusste
Probe sieht.
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2 zeigt
schematisch den gleichen Scanvorgang wie in 1, jedoch
zu einem weiter fortgeschrittenen Zeitpunkt. Durch die Beeinflussung
der Probe durch den Manipulationslichtstrahl 4 finden in den
vom Manipulationslichtstrahl 4 überstrichenen Pixeln Transportprozesse
statt, die u. a. dazu führen, dass
Fluorophore in benachbarte Pixel transportiert werden. Dieser Prozess
ist durch Pfeile schematisch für
einen Pixel in der mit Nr. 6 bezifferten Zeile dargestellt.
Beim in 2 dargestellten Scanvorgang
der nachfolgenden, mit Nr. 7 bezifferten Zeile werden von dem
Bildgebungslichtstrahl 5 nunmehr diejenigen Fluorophore
erfasst und somit im Bild sichtbar gemacht, die aufgrund eines Transportprozesses
von einer vorhergehenden Bildzeile in die aktuell aufgenommene Bildzeile
transportiert wurden. Aufgrund der festen Winkeldifferenz zwischen
dem Manipulationslichtstrahl 4 und dem Bildgebungslichtstrahl 5 hat der
Bildgebungslichtstrahl 5 in jeder Zeile stets einen festen
zeitlichen Abstand zu dem Manipulationslichtstrahl 4 der
vorhergehenden Zeile, welcher die transportierten Fluorophore beeinflusst
hat. Insoweit lässt sich
das beschriebene Verfahren besonders vorteilhaft im Zusammenhang
mit photoaktivierbaren Fluorophoren einsetzen. Darüber hinaus
ist jedoch auch ein Einsatz für
FRAP-, FLIP- oder ähnliche
Experimente möglich.
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3 zeigt – ebenfalls
schematisch – Bildaufnahmen,
wie sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
gewonnen werden können.
In 3a) ist zunächst ein möglicher Transportfluss innerhalb
der Probe dargestellt. Im Konkreten ist ein Transport dargestellt,
der entgegen dem Uhrzeigersinn um ein Zentrum verläuft. Während im
Zentrum selbst keine Transportprozesse stattfinden, nimmt die Stärke der Transportprozesse
mit zunehmender Entfernung vom Zentrum zu.
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In
den nachfolgenden 3b) bis e) sind
die dazugehörigen
aufgenommenen Intensitätsbilder
gezeigt. In 3b) ist eine Bildaufnahme
gezeigt, die wie in Zusammenhang mit 1 und 2 erläutert, durch
einen Probenscan in positiver x- und
positiver y-Richtung gewonnen wurde. Die helle linke Bildhälfte resultiert
aus dem starken Transportfluss in positive y-Richtung in diesem
Bereich. Die rechte Bildhälfte
erscheint demgegenüber
dunkel, da in dem korrespondierenden Probenbereich kein Transportfluss
in positive y-Richtung vorliegt.
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In 3c) ist eine mittels eines Bildrotators um
90° gedrehte
Aufnahme zu sehen. Der hellere obere Bildbereich ist auf den in
diesem Probenbereich vorhandenen Transportfluss in negative x-Richtung
zurückzuführen. 3d) zeigt eine um 180° gedrehte Bildaufnahme, die
durch eine im Vergleich zur in 3b) gezeigten
Bildaufnahme umgedrehte y-Scanrichtung gewonnen wurde. Hier ist
eine hohe Intensität
im rechten Bildteil gegeben, was auf den im entsprechenden Probenbereich
vorhandenen Transportfluss in negative y-Richtung zurückzuführen ist. Schließlich zeigt 3e) eine um 270° gedrehte Bildaufnahme. Dieses
Bild wurde mit Hilfe eines Bildrotators von 90° und einer y-Scanrichtung wie
bei der in 3d) dargestellten Bildaufnahme
aufgenommen.
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Aus
den einzelnen Bildern lässt
sich der Transportfluss im Inneren der Probe auf einfache Weise
berechnen, indem man z. B. durch Differenz der Intensitätswerte
in den 0°-
und 180°-Bildaufnahmen
bzw. in den 90°-
und 270°-Bildaufnahmen,
die Projektion des Flusses auf eine relativ zur Probe feste y- bzw.
y-Achse bestimmt und dadurch die zugehörigen Vektoren lokal erhält. Diese
sind – wie
oben bereits erläutert – in 3a) dargestellt. Auch lokale Senken und
Quellen des Transportflusses lassen sich so erkennen, wobei diese
ihre Ursachen u. a. entweder in der Produktion bzw. Vernichtung
von Fluorophoren oder aber in einem Transport in bzw. aus der Bildebene
haben können.
Es sei angemerkt, dass das beschriebene Verfahren nicht notwendigerweise in
einer Bildebene parallel zur Probenoberfläche durchgeführt werden
muss. Schräge
Schnitte durch die Probe sind ebenfalls möglich.
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4 zeigt
schließlich
schematisch den Scanvorgang gemäß einem
weiteren Ausführungsbeispiel
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Dabei wird der Manipulationslichtstrahl 4 derart gesteuert, dass
er abwechselnd Pixel 6 beleuchtet bzw. Pixel 7 von
der Beleuchtung ausspart, so dass sich insgesamt eine Manipulationsbeleuchtung
im Sinne eines Schachbrettmusters ergibt. Ansonsten sei zur Vermeidung
von Wiederholungen auf die Ausführungen im
Zusammenhang mit den 1 und 2 verwiesen.