DE102008010435B4

DE102008010435B4 - Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät

Info

Publication number: DE102008010435B4
Application number: DE102008010435A
Authority: DE
Inventors: Alois Schausberger; Andreas GFRÖRER; Wolfgang Fuchs
Original assignee: Tecan Trading AG
Current assignee: Tecan Trading AG
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2010-07-29
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: WO2009103663A1; US8222615B2; DE102008010435A1; US20110006219A1

Abstract

Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät (1) zum pixelgenauen Abbilden von auf Objektträgern (8) befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben, wobei dieses Laser Scanner-Gerät (1) umfasst:
(a) einen Probentisch (2) mit einer Aufnahme (34) für Objektträger (8) in einer Probenebene (49);
(b) mindestens einen Laser (51, 52) und ein erstes optisches System (53) zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls (54, 55) zur Anregung der fluoreszierenden Proben;
(c) einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner-Kopf (50) mit einem optischen Umlenkelement (56) zum Umlenken der Laserstrahlen (54, 55) zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung (75);
(d) ein erstes Objektiv (57) zum Fokussieren der Laserstrahlen (54, 55) auf der Probe in der Ebene (49);
(e) ein zweites optisches System (58) zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen (54, 55) an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv (57) und das Umlenkelement...

Description

Die Erfindung betrifft ein Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben. Ein zur Verwendung mit dem erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahren geeignetes Laser Scanner-Gerät umfasst einen Probentisch mit einer Aufnahme für Objektträger in einer Probenebene; mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden Proben; einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner-Kopf mit einem optischen Umlenkelement zum Umlenken der Laserstrahlen zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung; ein erstes Objektiv zum Fokussieren der Laserstrahlen auf der Probe in der Ebene; ein zweites optisches System zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv und das Umlenkelement umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln zu mindestens einem Detektor; einen Weggeber, der Weggeber-Signale aussendet, die den momentanen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen; ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen des Detektors mit einer definierten Zeitkonstante; und einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale.
Zum Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, fluoreszierenden Proben werden seit langem konventionelle optische Rastermikroskope verwendet. Immer häufiger finden wegen der verbesserten Auflösung konfokale optische Rastermikroskope Verwendung. Ein solches Mikroskop ist beispielsweise aus GB 2 184 321 A bekannt. Dieses Mikroskop lenkt das Licht einer Laserquelle entlang eines opti schen Pfads, um mit dem fokussierten Lichtstrahl eine sich in der Objektebene des Mikroskops befindende Probe abzurastern bzw. ”zu scannen”. Der von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahl wird zum Entrastern durch den gleichen optischen Pfad zurückgelenkt, mittels eines Dichroidspiegels vom Anregungsstrahl getrennt und auf einer konfokalen Öffnung vor einem Detektor abgebildet. Damit wird aus der Fluoreszenz einer Probe ein Bild geformt, ohne dass das auf die Probe gerichtete Licht zum Auslösen der Fluoreszenz auf den Detektor treffen kann.
Viele der im Handel erhältlichen Mikroskope beruhen auf dieser Konstruktion und weisen Strahlteiler oder Filter zum Unterteilen des von der Probe emittierten Lichts in Strahlen mit unterschiedlichem Wellenlängenbereich auf. Dadurch können auch zwei fluoreszierende Farbstoffe verwendet und deren Emission mit zwei verschiedenen Detektoren gemessen werden.
Allerdings weisen alle konfokalen Scanner-Systeme, welche die beiden Anregungslichtstrahlen mit den beiden unterschiedlichen Wellenlängen auf denselben Abtastfleck lenken, den Nachteil auf, dass die Abgrenzung der beiden Emissionssignale nur spektral erfolgen kann. Da die Absorption und/oder die Fluoreszenzemissionsspektren der verwendeten Farbstoffe sich meist überlappen, können sie (insbesondere bei grösseren Intensitätsunterschieden) nicht zuverlässig und quantitativ unterschieden werden. Damit nicht in zeitraubender Weise zuerst ein Bild mit einem ersten Fluoreszenzspektrum und dann ein zweites Bild mit einer anderen Art des Anregungsstrahls erzeugt werden muss, wurden Abtastmikroskope und ”Scanner-Geräte” vorgeschlagen, die zumindest zwei Anregungsstrahlen mit unterschiedlicher Ausrichtung bereitstellen.
Ein solches Mikroskop ist beispielsweise aus US 5,304,810 bekannt, welches mit zwei oder mehr räumlich voneinander getrennten Beleuchtungsstrahlen zwei oder mehr räumlich voneinander getrennte Beleuchtungspunkte erzeugt und eine Probe simultan mit diesen Beleuchtungspunkten abrastert. Die dadurch simultan erzeugten, räumlich voneinander getrennten Fluoreszenzemissionsstrahlenbündel werden entsprechend ihrer jeweiligen Rasterposition simultan mittels individuellen, auf diese räumlich voneinander getrennten Beleuchtungspunkte ausgerichteten Detektoren gemessen. Auch aus US 6,628,385 B1 ist ein solches Mikroskop bekannt, das mittels zwei Anregungslasern zwei separate Lichtflecke auf einer Probe erzeugt. Dabei durchstossen die beiden Anregungsstrahlen unter leicht unterschiedlichen Winkeln eine Öffnung in einem 45°-Spiegel und treffen dann auf ein Objektiv-Element. Dies bewirkt das Bereitstellen von zwei voneinander getrennten Lichtflecken auf der Probe, wobei an jedem Lichtfleck ein Emissionsstrahlenbündel erzeugt wird. Die beiden resultierenden Emissionsstrahlenbündel werden am 45°-Spiegel reflektiert und treffen auf eine Sekundärlinse auf, wonach sie direkt oder nach einer zweiten Umlenkung jeweils einen von zwei Detektoren erreichen. Zudem können optische Trennelemente, wie Dichroidfilter oder Prismen vor den als Photomulitplier ausgebildeten Detektoren positioniert werden. Zum Abrastern der Proben kann ein zwischen dem 45°-Spiegel und dem Objektiv-Element angeordnetes Rastersystem verwendet werden.
Aus WO 02/059677 A1 ist ein optisches System zum Anregen und Messen von Fluoreszenz an oder in mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten Proben bekannt. Dieses System umfasst zumindest einen Laser zum Anregen der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe, einen Spiegel zum Umlenken des Laserlichts in Richtung einer Probe, ein Umlenkelement zum Umlenken des Lichts aus dem Laser auf diesen Spiegel in einer Y-Richtung eines (hier kartesischen) Koordinatensystems, eine Optik zum Bilden eines ersten Brennpunktes des Laserlichts auf der Probe, eine den Spiegel und die Optik umfassende, in der Y-Richtung bewegliche Raster-Einheit, einen in der X- und Z-Richtung des Koordinatensystems bewegbaren Probentisch zum Ausrichten der Probe gegenüber dem ersten Brennpunkt, eine optische Anordnung zum Abbilden des von der Probe emittierten Lichts in einer in einem zweiten Brennpunkt angeordneten Lochblende und einen Detektor zum Messen der Intensität des die Lochblende durchtretenden Lichts.
Diese bekannten Mikroskope zum hochempfindlichen Abrastern von in einem regelmässigem Muster (einem sogenannten Array) angeordneten Proben sind zudem befähigt, einen ganzen Standard-Objektträger für die Lichtmikroskopie abzurastern und arbeiten bei mittlerer Auflösung zufriedenstellend. Es ist aber zu beachten, dass beim Erhöhen der Auflösung zusätzliche Effekte, wie dynamische Verschiebungen zwischen den Farbkanälen sichtbar werden können. Dadurch liegen beispielsweise die Abbildungspunkte des roten und des grünen Kanals nicht mehr genau übereinander. Die relative Verschiebung kann sich zwischen den Kanälen über die Ausdehnung des Bildes dynamisch ändern. Zudem hängt diese Verschiebung wesentlich von der Positioniergenauigkeit der Probe im Fokus ab. Aus diesen Gründen ist eine relative Verschiebung nachträglich per Software nur sehr schwer korrigierbar.
Sollen die beiden Kanäle nicht nur spektral sondern auch räumlich voneinander getrennt werden, so müssen die beiden Fokalpunkte der Anregungslaser auf der Probe voneinander getrennt werden. Dies lässt sich nur dadurch erreichen, dass die gebündelten Lichtstrahlen der beiden Laser in einem zwar kleinen aber doch signifikanten Winkel zueinander auf das Scanobjektiv fallen. Es ist allgemein bekannt, dass alle in einem bestimmten Winkel auf das Objektiv auftreffenden Strahlen auf denselben Punkt innerhalb der Fokalebene fokussiert werden. Ein bestimmter Einfallswinkel vor dem Objektiv entspricht also immer einem bestimmten Ort hinter dem Objektiv. In diesem Zusammenhang ist es unerheblich, ob der Laserstrahl das Objektiv in dessen Mitte oder in irgend einem anderem Teilbereich der Objektivapertur trifft; die Bündelung in ein und demselben Fokuspunkt ist davon nicht betroffen. Unterschiedlich ist jedoch der Strahlwinkel hinter dem Objektiv, die Strahlen treffen nun aus unterschiedlichen Richtungen im Fokuspunkt zusammen. Im exakten Fokalpunkt spielt dies keine Rolle, in Ebenen die geringfügig darunter oder darüber liegen, jedoch schon. Dort entfernen sich die Strahlen vom exakten Fokuspunkt in Abhängigkeit von diesem Winkel unterschiedlich schnell.
Sollen nun zwei Laserstrahlen entsprechend diesen Vorgaben auf einer Probe und in der Fokalebene räumlich getrennt voneinander fokussiert werden und bilden diese Laserstrahlen deshalb beim Einfall auf das Scanobjektiv einen Winkel zueinander, so führt dies zwangsläufig dazu, dass zumindest einer der beiden Laserstrahlen vor dem Auftreffen auf das Spiegelelement jetzt auch nicht mehr exakt parallel zur Scanachse verlaufen kann.
Wird nun der Scanner-Kopf bewegt, ändert sich der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf das Objektiv. Der Strahl wird zwar nach wie vor auf denselben Fokalpunkt abgelenkt werden, aber unter verschiedenen Winkeln. Ausserhalb der Fokalebene ergeben sich dann entsprechend dem oben gesagten unterschiedliche Positionen je nach Stellung des Scanner-Kopfes in X-Richtung und je nach der Abweichung der Probenebene von der exakten Fokalebene in Z-Richtung. Die letztere Abweichung ist im Rahmen von realistischen Gerätetoleranzen nie vollständig auszuschliessen und als zufällige Toleranz auch nicht beliebig gut kontrollierbar.
Die beschriebenen Effekte sind an sich klein, sie machen sich jedoch im Beispielsaufbau bei Auflösungen unterhalb von 5 μm signifikant bemerkbar. Die beschriebenen Effekte können dazu führen, dass die Bilder der beiden Detektionskanäle nicht über den gesamten Bildbereich deckungsgleich sind, und dass das Ausmass der Abweichungen unkontrolliert über das Bild variiert. Quantitative Vermessungen von sehr kleinen Strukturen werden dadurch unmöglich oder zumindest verfälscht. Visuell machen sich die Fehler als lokal variierende Farbsäume bemerkbar.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein alternatives Datenerfassungsverfahren zum Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben mit einem Laser Scanner-Gerät vorzuschlagen, mit welchem die Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts zusätzlich verbessert wird.
Diese Aufgabe wird mit einem Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät zum pixelgenauen Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben gelöst, das die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 1 umfasst. Ein zur Durchführung dieses Datenerfassungsverfahrens geeignetes Laser Scanner-Gerät umfasst:

a) einen Probentisch mit einer Aufnahme für Objektträger in einer Probenebene;
b) mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden Proben;
c) einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner-Kopf mit einem optischen Umlenkelement zum Umlenken der Laserstrahlen zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung;
d) ein erstes Objektiv zum Fokussieren der Laserstrahlen auf der Probe in der Ebene;
e) ein zweites optisches System zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv und das Umlenkelement umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln zu mindestens einem Detektor;
f) einen Weggeber, der Weggeber-Signale aussendet, die den momentanen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen;
g) ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen des Detektors mit einer definierten Zeitkonstante; und
h) einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale.

Das erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die gefilterten Detektor-Signale des A/D-Wandlers und die Weggeber-Signale unabhängig, parallel und kontinuierlich von einer Rechnereinheit bzw. einer Steuerung erfasst und auf eine gemeinsame Zeitbasis bezogen werden, wobei die A/D-Wandlung so häufig erfolgt, dass jedem Pixel eines Bildes stets mehr als ein Datenpunkt des A/D-Wandlers zugeordnet wird.
Zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen und erfindungsgemässe Merkmale ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Vorteile des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens umfassen:

– Durch die kontinuierliche Datenerfassung ist die tatsächliche Datenerfassungszeit identisch mit der insgesamt zur Verfügung stehenden Scanzeit. Das heisst, 100% der anfallenden Signale, insbesondere der eintreffenden Photonen, werden auch erfasst. Es gibt somit keine Lücken oder Totzeiten in denen die Datenerfassung eintreffende Signale nicht registrieren kann. Dies steht im Gegensatz zu den herkömmlichen Systemen, die aktiv geschaltete Integratoren verwenden und deren tatsächliche Integrationszeit stets um die Löschzeit verringert ist. Die Löschzeit entfällt im vorgestellten Verfahren, sämtliche eintreffenden Photonensignale werden ohne Lücke erfasst. Diese höhere Erfassungsrate bedeutet eine höhere Empfindlichkeit des Systems, da diese entsprechend den Gesetzen der Photonenstatistik direkt von der Gesamtzahl der erfassten Photonensignale abhängt.
– Im herkömmlichen Ansatz wird der Beginn der Integrationszeit durch die aufeinanderfolgenden Weggebersignale ausgelöst. Dies hat zur Folge, dass stets sichergestellt sein muss, dass Integrationszeit und Löschzeit immer vollständig abgeschlossen sind, bevor der nachfolgende Triggerimpuls eintrifft. Da die Weggebersignale einen signifikanten ”Jitter” (Instabilität) aufweisen (bis zu ±30%) kann das fixe Integrationsintervall maximal so gross sein, wie der kleinste mögliche Abstand zwischen 2 Triggersignalen des Weggebers. Dadurch gehen im konventionellen Verfahren wiederum bis zu 30% der eigentlich verfügbaren Messzeit verloren. Im Gegensatz dazu nutzt das erfindungsgemäße Verfahren den Duty Cycle (Arbeitszyklus) voll aus, was wiederum ein gesteigerte Empfindlichkeit zur Folge hat.
– Da Weggebersignale und Datenerfassung unabhängig voneinander aufgezeichnet werden, ist die einstellbare Pixelauflösung des Systems frei skalierbar und unabhängig von der Weggeberteilung, wie dies in konventionell betriebenen Systemen der Fall ist.
– Da mindestens zwei Rohdatenpunkte pro Pixel verwendet werden, kann ein Filter mit kleinerer Integrationskonstante verwendet werden. Somit ist das Abklingverhalten zwischen zwei aufeinanderfolgenden Pixeln beschleunigt und es resultiert eine bessere Auflösung an starken Hell/Dunkel Übergängen.

Das erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren mit dem dafür bevorzugten Laser Scanner-Gerät soll nun an Hand von schematischen Zeichnungen, die den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken sollen und die lediglich Beispiele von besonders bevorzugten Ausführungsformen darstellen, erläutert werden. Dabei zeigen:
1 einen vertikalen Teilschnitt durch zwei Objektträgermagazine und einen vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Objektträgers aus dem Proben-Magazin auf den Objekttisch;
2 einen horizontalen Teilschnitt durch die Objektträgermagazine und eine Draufsicht auf den vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Test-Objektträgers aus dem Testobjekt-Magazin auf den Objekttisch;
3 vertikale Ansichten der Objektträgermagazine mit geöffnetem Testobjekt-Magazin, wobei
3A die Einschubseite der beiden Objektträgermagazine in einer Frontansicht vom Objekttisch her gesehen, und
3B die beiden Objektträgermagazine im Vertikalschnitt mit Blick gegen den Objekttisch hin zeigt;
4 vertikale Teilschnitte durch den Objekttisch und dessen Querneigevorrichtung, wobei:
4A den Objekttisch mit Blick gegen die Objektträgermagazine und mit einem im geschlossenen Objekttisch doppelt gehaltenen Objektträger, und
4B den Objekttisch mit Blick von den Objektträgermagazinen weg, mit geöffnetem Objekttisch, nach dem Entfernen bzw. vor dem Einschieben eines Objektträgers zeigt;
5 einen vertikalen Teilschnitt durch den Objekttisch und dessen Höhenverstellung und Längsneigevorrichtung;
6 eine Prinzipskizze mit wesentlichen optischen Elementen des Laser Scanner-Geräts mit einem Scanner-Kopf gemäss einer ersten Ausführungsform;
7 Prinzipskizzen des Scanner-Kopfes, wobei:
7A eine zweite Ausführungsform des Scanner-Kopfes, und
7B eine dritte Ausführungsform des Scanner-Kopfes zeigt;
8 einen horizontalen Teilschnitt durch ein Laser Scanner-Gerät mit wesentlichen optischen Elementen, einer Scanner-Einrichtung mit Scanner-Kopf und einem Objekttisch mit Objektträgermagazinen;
9 einen horizontalen Teilschnitt durch den Scanner-Kopf des Laser Scanner-Geräts mit dem zugeordneten Weggeber;
10 eine Prinzipskizze des Weggebers für den Scanner-Kopf und dessen nichtlineare Bewegung beim Scannen als X/t-Diagramm, welches auf die unterschiedliche Zeitdauer (Δt₁; Δt₂) für die Erfassung des von einem Objekt ausgehenden Fluoreszenzlichtes je nach der Position einer Anzahl Pixel (Δx) auf der X-Achse hinweist;
11–15 Diagramme von Lösungsvorschlägen, in denen die Signalintegration (I) in Funktion der Zeit (t) dargestellt ist, wobei:
11 einen ersten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem der Weggeber die Datenerfassung mit einem passiven Integrator triggert;
12 einen zweiten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem der Weggeber die Datenerfassung mit einem schaltbaren Integrator bei konstanter Integrationszeit triggert;
13 einen dritten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem das Weggeber-Signal als Ereignis zeitlich erfasst und jedem Signal über eine Zeitbasis der Zeitpunkt seines Auftretens zugeordnet wird, wobei die Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis getriggert wird;
14 einen vierten Lösungs-Vorschlag entsprechend dem dritten Lösungs-Vorschlag zeigt, wobei jedoch ein passives RC-Glied zur Integration verwendet wird;
15 einen fünften Lösungs-Vorschlag zeigt, welcher dem vierten Lösungs-Vorschlag entspricht, wobei aber mehrere Messungen pro Pixel ausgeführt werden.
1 zeigt einen vertikalen Teilschnitt durch zwei Objektträgermagazine und einen vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Objektträgers aus dem Proben-Magazin auf den Objekttisch. Diese beiden Objektträgermagazine gehören zu einem erfindungsgemässen Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben. Dieses Laser Scanner-Gerät umfasst einen eine Probenebene 49 definierenden Probentisch 2 und eine motorisierte Transportvorrichtung 3 zum Bewegen eines Objektträgers von einer Aufbewahrungseinheit 4 zum Probentisch 2 und zurück. Dabei umfasst die Aufbewahrungseinheit 4 je einen, zumindest je eine Lagerstelle 6 aufweisenden und während des Betriebs des Laser Scanner-Geräts 1 für die Transportvorrichtung 3 zugänglichen Probenteil 7 für Proben-Objektträger 8 und Testteil 9 für Test-Objektträger 10. In diesem erfindungsgemässen Laser Scanner-Gerät ist der Testteil 9 vom Probenteil 7 getrennt und als mit dem Laser Scanner-Gerät 1 fest verbundenes Testteil-Magazin 9' für einen oder mehrere Test-Objektträger 10 ausgebildet. Dadurch ist ein im Testteil 9 aufbewahrter Test-Objektträger 10 im Betriebszustand des Laser Scanner-Geräts 1 für eine Bedienungsperson manuell nicht zugänglich. Dies hat den Vorteil, dass jederzeit ein geeigneter Test-Objektträger bereitgestellt werden kann, ohne dass ein solcher Test-Objektträger 10 durch unsachgemässe Manipulationen durch Bedienungspersonen verschmutzt oder gar beschädigt werden kann. Das hier abgebildete Testteil-Magazin 9' umfasst eine offene Einschubseite 15.
In der hier dargestellten Ausführungsform ist der Probenteil 7 axial über dem Testteil 9 angeordnet und der Testteil 9 der Aufbewahrungseinheit 4 ist mit einer gegenüber dem Probentisch 2 des Laser Scanner-Geräts 1 beweglichen Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 fest verbunden. Dabei ist hier die Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 im Wesentlichen senkrecht gegenüber der Probenebene 49 des Probentisches 2 verschiebbar. So kann ein beliebiger Objektträger 8, 10 auf das Niveau der vom Probentisch 2 definierten Probenebene 49 gebracht und zu einem linearen Transport auf den Probentisch 2 bereit gestellt werden.
Es wird bevorzugt, dass die Probenebene 49 des Probentisches 2 im Wesentlichen horizontal angeordnet ist, wobei der Probentisch 2 einen Objektträger 8, 10 über sich trägt. Allerdings kann der Probentisch 2 auch über Kopf angeordnet werden, so dass der eingesetzte Objektträger 8, 10 unter dem Probentisch angeordnet ist. Auch eine beliebige andere Lage der Probenebene 49 im Raum ist grundsätzlich denkbar, wird aber weniger bevorzugt.
Das Laser Scanner-Gerät 1, gemäss der in 1 abgebildeten, ersten Ausführungsform umfasst vorzugsweise ein Gehäuse 5, wobei der Probenteil 7 als von aussen in das Gehäuse 5 des Laser Scanner-Geräts 1 einsetzbares Magazin 7' für eine Vielzahl von Proben-Objektträgern 8 ausgebildet ist. Der Probenteil 7 ist bevorzugt reversibel an der Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 montierbar. In der gezeigten Ausführungsform verbindet eine steckbare Schwalbenschwanzverbindung das Probenteil-Magazin 7' mit der hier vertikal beweglichen Stellplatte 11. Somit kann das Probenteil-Magazin 7' am Handgriff 42 festgehalten und in im wesentlichen vertikaler Richtung in das Gehäuse 5 gesenkt und am Schwalbenschwanz 43 der Stellplatte 11 eingesteckt werden. Da hier die beiden Magazine 7', 9' senkrecht übereinander angeordnet sind, stellt das fest mit der Stellplatte 11 verschraubte Testteil-Magazin 9' vorzugsweise gerade den unteren Anschlag für das in den Schwalbenschwanz 43 eingeschobene Probenteil-Magazin 7' dar.
Die Lagerstellen 6 im Probenteil-Magazin 7' und/oder im Testteil-Magazin 9' sind zur Aufnahme von Objektträgern ausgebildet, welche im Wesentlichen die Abmessungen eines Standardobjektträgers für die Lichtmikroskopie aufweisen. Vorzugsweise sind diese Lagerstellen 6 voneinander durch Lagerstege 12 getrennt, so dass diese Objektträger auf jeweils zwei sich jeweils im Wesentlichen über die ganze Länge der Objektträger 8, 10 erstreckenden Lagerstegen 12 ruhen.
Der in der 1 in einem Vertikalschnitt gezeigte Probentisch 2 ist zum Transfer von Proben-Objektträgern 8 oder von Test-Objektträgern 10 mittels eines an einer Aufhängung 83 angeordneten Spindeltriebes 84 unmittelbar vor eine Aufbewahrungseinheit 4 für solche Objektträger 8, 10 verfahrbar ausgebildet. Die Aufnahme 34 des Probentisches 2 umfasst vorzugsweise zwei einander gegenüber liegende Nuten 35 zum Aufnehmen der beiden Längskanten 14 eines Pro ben-Objektträgers 8 oder eines Test-Objektträgers 10. Die Probenebene 49 ist dabei bevorzugt im Wesentlichen horizontal angeordnet. Der Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in im wesentlichen senkrechter Richtung zur Oberfläche der Objektträger zwei feststehende Stege 36 und einen federnd gegen diese Stege 36 beweglichen Backen 37 mit zwei aufstehenden Seitenwänden 38, welche zusammen mit den Unterkanten der Stege 36 die Öffnungsweite der Nuten 35 definieren (vgl. auch 4).
Bevorzugt überwacht bzw. regelt eine Steuerung 40 einen Motor 87, welche den Spindeltrieb 84 antreibt. Dadurch kontrolliert die Steuerung 40 die Bewegungen des Probentisches 2.
2 zeigt einen horizontalen Teilschnitt durch die in der 1 gezeigten Objektträgermagazine und eine Draufsicht auf den vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Test-Objektträgers aus dem Testobjekt-Magazin auf den Objekttisch. Das hier abgebildete Testteil-Magazin 9' umfasst eine offene Einschubseite 15, welche in ihrer Breite zumindest teilweise von je einer, sich im wesentlichen über die ganze Stapelhöhe des Magazins 9' erstreckenden, individuell wegschwenkbaren Klappe 16 abdeckbar ist. Diese Klappe 16 ist hier weggeschwenkt, so dass der abgebildete Test-Objektträger aus der Einschubseite 15 des Testteil-Magazins 9' herausgeschoben werden kann, ohne dass er dabei von der wegschwenkbaren Klappe 16 behindert würde.
Damit die Objektträger 8, 10 in den Magazinen 7', 9' im wesentlichen spielfrei sitzen, umfasst jede dieser Lagerstellen 6 vorzugsweise eine Anpressfeder 13, welche elastisch eine Längskante 14 eines eingesetzten Objektträgers beaufschlägt. Zudem wird durch den Federdruck die jeweils gegenüberliegende Längskante 14 des Objektträgers 8, 10 in einer durch das entsprechende Magazin 7', 9' definierten Lage gehalten, welche geeignet ist, eine Referenz für den Ursprung eines Koordinatensystems zu definieren. Desgleichen ist der Probentisch 2 bevorzugt mit beweglichen Anpressteilen 39 in der Form von Rollen ausgestattet (vgl. 2), welche ebenfalls dieselbe Längskante 14 in einer definierten Lage festhalten, wo durch wiederum eine Referenz für den Ursprung des Koordinatensystems geschaffen wird.
Zumindest das Probenteil-Magazin 7' umfasst bevorzugt an einer der Einschubseite 15 gegenüber liegenden Ecke eine sich im wesentlichen über die ganze Stapelhöhe erstreckende Kontrollöffnung 21 zum Feststellen der An- oder Abwesenheit eines Objektträgers in einer bestimmten Lagerstelle 6. Die An- oder Abwesenheit eines Objektträgers 8, 10 in einer bestimmten Lagerstelle 6 kann mit unterschiedlichen Methoden und Vorrichtungen festgestellt werden. So kann z. B. (vgl. 2) ein sich im Wesentlichen horizontal ausdehnender Lichtstrahl 23 bzw. eine Lichtschranke einer Kontrollvorrichtung 22 schräg durch die Magazine 7', 9' gerichtet werden, falls die Kontrollöffnung 21 für diesen Lichtstrahl 23 durchlässig ist. Die Ablenkung, Streuung oder Abschwächung des Lichtstrahls 23 durch einen in einem Lagerplatz 6 anwesenden Objektträger 8, 10 kann einfach mit einem lichtempfindlichen Sensor festgestellt werden. Während in 2 eine Kontrollöffnung 21 in Form einer ”abgeschnittenen Ecke” gezeigt ist, kann der Lichtstrahl 23 auch durch die Einschubseite 15 in die Magazine 7', 9' gesendet werden und auf der entgegengesetzten, nicht abgeschnittenen Seite auf einen Sensor auftreffen; eine schräge Ausrichtung gegenüber der Transportrichtung der Objektträger 8, 10 und/oder das Anbringen eines Umlenkspiegels (beides nicht gezeigt) ermöglichen ebenfalls eine Detektion der Objektträger in ihren Magazinen selbst bei angenähertem Probentisch 2.
Bevorzugt umfasst die Transportvorrichtung 3 des Laser Scanner-Geräts 1 einen Entladeschieber 31, der im wesentlichen parallel zu der Probenebene 49 durch die der Einschubseite 15 der Magazine 7', 9' gegenüberliegende Seite eingreifend und zum Transportieren eines Proben-Objektträgers 8 oder eines Test-Objektträgers 10 aus seiner Lagerstelle 6 und aus der Einschubseite 15 heraus zum Probentisch 2 ausgebildet ist. Diese Transportvorrichtung 3 umfasst vorzugsweise zudem einen Ladeschieber 32, der zum Transportieren eines Proben-Objektträgers 8 oder eines Test-Objektträgers 10 aus dem Probentisch 2 und durch die Einschubseite 15 hinein zu einem Lagerplatz 6 in einem der Magazine 7', 9' ausgebildet ist. Besonders bevorzugt wird, dass Ladeschieber 32 eine schwenkbare Klappe 33 umfasst, welche hochgeschwenkt werden und so über den im Probentisch 2 eingesetzten Objektträger 8, 10 wegbewegt werden kann, ohne dass diese Klappe 33, welche um eine Achse 47 kippbar ist, den Objektträger berührt. So kann diese Klappe über den Objektträger 8, 10 bewegt und hinter diesem abgesenkt werden, worauf der Objektträger von der Klappe 33 erfasst und aus dem Probentisch 2 gezogen werden kann. Das Hochschwenken der Klappe 33 ermöglicht das Bewegen des Probentisches 2 und des darin eingesetzten Objektträgers 8, 10 zum Ort der Scanner-Einrichtung 72. Dieses Hochschwenken der Klappe 33 um die Kippachse 47 ermöglicht somit die freie Bewegung des Probentisches 2, ohne dass die Klappe 33 mit dem eingesetzten Objektträger 8, 10 in Kontakt kommen kann.
Bevorzugt ist der Antrieb 44 für die bewegliche Stellplatte 11, der Antrieb 45 für den Entladeschieber 31 und der Antrieb 46 für den Ladeschieber 32 jeweils ein Elektromotor, welcher von der Steuerung 40 gesteuert und überwacht wird.
Der in der 2 gezeigte Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in im wesentlichen paralleler Richtung zur Oberfläche der Objektträger gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers bewegliche Anpressteile 39, welche die Öffnungsbreite der Aufnahme 34 federnd begrenzen. Dabei sind die gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers beweglichen Anpressteile 39 bevorzugt als Rollen mit je einer im Wesentlichen vertikalen Achse ausgebildet.
Bevorzugt überwacht bzw. regelt eine Steuerung 40 einen Motor 87, welche den Spindeltrieb 84 antreibt. Dadurch kontrolliert die Steuerung 40 die Bewegungen des Probentisches 2.
3 zeigt vertikale Ansichten der Objektträgermagazine mit geöffnetem Testobjekt-Magazin. Die 3A zeigt dabei die Einschubseite der beiden Objektträgermagazine in einer Frontansicht vom Objekttisch her gesehen. Die vertikal bewegliche Stellplatte 11 ist auf der rechten Seite sichtbar und ihre Beweglichkeit mit einem Doppelpfeil markiert. Der Probenteil 7 ist gerade über dem Testteil 9 angeordnet, wobei das Probenteil-Magazin 7' mit hier acht in den Lagerstellen 6 ruhenden Proben-Objektträgern 8 axial über dem Testteil-Magazin 9' mit hier zwei Test-Objektträgern 10 befestigt ist. Die wegschwenkbare Klappe 16 des Probenteil-Magazins 7' ist geschlossen, währenddem die wegschwenkbare Klappe 16 des Testteil-Magazins 9' geöffnet ist und im Wesentlichen die ganze Breite der Einschubseite des Testteil-Magazins 9' frei gibt. Das Wegschwenken der wegschwenkbaren Klappe 16 des Testteil-Magazins 9' wird hier durch die Exzenterwalze 19 bewerkstelligt, welche auf die Winkelplatte 18 dieser Klappe drückt. Die Exzenterwalze 19 wird bevorzugt zumindest nahe der durch den Probentisch 2 definierten Probenebene 49 angeordnet, so dass trotz dem Verschieben der Aufbewahrungseinheit 4 in der Höhe immer die richtige Klappe 16 weggeschwenkt wird. Die Anpressfedern des Testteil-Magazins 9' sind gut zu sehen, wie sie federnd auf die eine Seitenkante 14 der Test-Objektträger 10 drücken.
Die 3B zeigt die beiden gleichen Objektträgermagazine im Vertikalschnitt mit Blick gegen den Objekttisch hin. Die vertikal bewegliche Stellplatte 11 ist auf der linken Seite sichtbar und ihre Beweglichkeit mit einem Doppelpfeil markiert. Das Probenteil-Magazin 7' ist über den Schwalbenschwanz 43 der Stellplatte 11 geschoben und wird hier vom Testteil-Magazin 9' in einer konstanten Position an der Stellplatte 11 gehalten. Das Testteil-Magazin 9' ist hier mit der Stellplatte 11 fest verschraubt. Die Anpressfedern 13 des Probenteil-Magazins 7' und des Testteil-Magazins 9' sind hier gut auf der rechten Seite der Objektträgerstapel zu sehen.
4 zeigt vertikale Teilschnitte durch den Objekttisch 2 und dessen Querneigevorrichtung bzw. den Kippmechanismus 79, welcher einen motorisch angetriebenen Exzenter 80 und eine einseitige Drehachse 81 umfasst. Dieser Kippmechanismus 79 dient zum Ausrichten einer Probe bzw. eines Objektträgers 8, 10 gegenüber einer Fokallinie 101, welche in einer Rasterebene 76 (vgl. 5) verläuft. Der Fokus des ersten Objektivs 57 und die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 des Laser-Scanner Geräts 1 definieren diese Fokallinie 101. Diese Fokallinie 101 selbst definiert zusammen mit dem optischen Umlenkelement 56 des Scanner-Kopfs 50 die Rasterebene 76. Diese Rasterebene 76 wird somit durch die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 und dessen optisches Umlenkelement 56 definiert. Diese Rasterebene 76 steht dabei im Wesentlichen senkrecht zu der Probenebene 49. Diese Fokallinie 101 ist definiert durch die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfes 50 und den Fokalpunkt 65 des Scannerobjektivs 57 und liegt im richtig justierten Zustand des Geräts in der Probenebene 49. Die Drehachse 81 kann als eigentliche Achse ausgebildet sein (nicht gezeigt). Allerdings wird eine virtuelle Drehachse 81 bevorzugt, welche durch eine Stahlfeder 104 gebildet wird. Diese Stahlfeder 104 ist vorzugsweise mittels je eines Jochs 105 an dem Probentisch 2 oder an dem Auflageteil 103 angeschraubt. Diese Stahlfeder 104 bewirkt eine Gegenkraft zum Exzenter 80, so dass ein einfacher, spielfreier Kippmechanismus für das Auflageteil 103 des Probentischs 2 geschaffen wird.
Die 4A zeigt den Objekttisch 2 des Laser-Scanner Geräts 1 mit Blick gegen die Objektträgermagazine 7', 9' und mit einem im geschlossenen Objekttisch 2 doppelt gehaltenen Objektträger 8. Der Probentisch 2 umfasst einen Kippmechanismus 79 mit einem motorisch angetriebenen Exzenter 80 und einer einseitigen Drehachse 81, mit welchem Kippmechanismus 79 ein Objektträger 8, 10 oder eine Probe gegenüber einer Fokallinie 101 ausgerichtet werden kann. Diese Fokallinie 101 liegt vorzugsweise in der Probenebene 49 und in einer Rasterebene 76, die der Scanner-Kopf 50 mit seinem optischen Umlenkelement 56 und seiner Bewegungsrichtung 75 definiert. Dabei steht die Rasterebene 76 vorzugsweise senkrecht zu der Probenebene 49 (vgl. auch 5). Mit dem Exzenter 80, der vorzugsweise motorisch angetrieben ist, kann die Querneigung des Objektträgers 8, 10 bzw. des Probentisches 2 korrigiert werden, so dass die Fokallinie 101 der Scanner-Einrichtung 72 exakt in die Probenebene 49 zu liegen kommt.
Vorzugsweise ist die Probenebene 49 im Wesentlichen horizontal angeordnet. Die Aufnahme 34 des Probentisches 2 umfasst zwei einander gegenüber liegende Nuten 35 (vgl. 4B) zum Aufnehmen der beiden Längskanten 14 des gezeigten Proben-Objektträgers 8 oder eines (nicht gezeigten) Test-Objektträgers 10.
Der Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in im Wesentlichen senkrechter Richtung zur Oberfläche der Objektträger vorzugsweise ein Auflageteil 103 mit zwei feststehenden Stegen 36. Zudem umfasst der Probentisch 2 einen federnd gegen diese Stege 36 beweglichen Backen 37 mit zwei aufstehenden Seitenwänden 38. Diese Seitenwände 38 definieren zu sammen mit den Unterkanten der Stege 36 die Öffnungsweite der Nuten 35. Der bewegliche Backen 37 ist mit Federn 30 elastisch gegenüber dem Auflageteil 103 des Probentisches 2 abgestützt, so dass diese Federn 30 die beiden aufstehenden Seitenwände 38 des beweglichen Backens 37 federnd gegen die Unterseite des Objektträgers 8 drücken. Dadurch wird ein Proben-Objektträger bzw. ein Test-Objektträger 10, der bevorzugt zumindest annähernd die Masse eines Glasobjektträgers für die Lichtmikroskopie aufweist, in vertikaler Richtung klemmend im Probentisch 2 gehalten.
Der Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in im Wesentlichen paralleler Richtung zur Oberfläche der Objektträger gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers 8 bewegliche Anpressteile 39, welche die Öffnungsbreite der Aufnahme 34 federnd begrenzen. Diese gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers 8 beweglichen Anpressteile 39 sind vorzugsweise als Rollen mit je einer im Wesentlichen vertikalen Achse ausgebildet. Die den Rollen 39 gegenüber liegende Nute 35 definiert einen Anschlag der Proben-Objektträger 8 bzw. Test-Objektträger 10, der sich zur Definition der Achse eines Koordinatensystems des Laser Scanner-Geräts 1 eignet. In eine Aussparung 98 eintauchend ist hier zudem ein Senkdorn 88 dargestellt, der beim Annähern des Probentisches 2 and die Aufbewahrungseinheit 4 in den Probentische eindringt und mit diesem Eindringen den Backen 37 und die Seitenwände 38 von den Stegen 36 des Auflageteils 103 wegzieht.
Die 4B zeigt den Objekttisch 2 mit Blick von den Objektträgermagazinen 7', 9' weg, mit geöffnetem Objekttisch 2, nach dem Entfernen bzw. vor dem Einschieben eines Objektträgers 8, 10. Weil sich gerade kein Objektträger 8, 10 im Probentisch 2 befindet, sind die rollenförmigen Anpressteile 39 in ihrer Extremposition. Aus dieser Extremposition werden die rollenförmigen Anpressteile 39 gegen den Druck von Federelementen verdrängt, sobald ein Objektträger 8, 10 in den Probentisch 2 eingeschoben wird. Ebenfalls gut sichtbar ist hier, wie der Senkdorn 88 an einer Rampe 89 aufläuft, so dass der bewegliche Backen 37 des Probentischs 2 etwas heruntergezogen und so das Einschieben eines Objektträgers 8, 10 in die Aufnahme 34 des Probentischs 2 ermöglicht wird.
5 zeigt einen vertikalen Teilschnitt durch den Objekttisch sowie dessen Höhenverstellung und Längsneigevorrichtung. Die durch den Probentisch 2 definierte Probenebene 49 ist in im wesentlichen der Z-Richtung (hier in der Vertikalen) verstellbar, indem der an einer Aufhängung 83 linear befestigte und linear verschiebbare Probentisch 2 zusammen mit dieser Aufhängung 83 auf einem motorisch angetriebenen Exzenter 106 aufliegt und schwenkbar an einem Rahmen 82 einseitig befestigt ist. Wird der Exzenter 106 etwas gedreht, so hebt oder senkt sich entsprechend die Aufhängung 83 mit dem Probentisch 2. Mit dieser Bewegung kann die Ebene des Probentischs 2, also die Probenebene 49, mit der Ebene einer Lagerstelle 6 im Probenteil-Magazin 7' oder im Testteil-Magazin 9' der Aufbewahrungseinheit 4 in Übereinstimmung gebracht werden, so dass ein linearer Transfer zwischen einem dieser Magazine 7', 9' und dem Probentische erfolgen kann. Vorzugsweise wird das entsprechende Magazin in der Z-Richtung durch eine Verschiebung der beweglichen Stellplatte 11 bereitgestellt, so dass nur eine allfällige Feinabstimmung mit dem Exzenter 106 der Probentischaufhängung 83 erfolgen muss. Mit dem Exzenter 106, der vorzugsweise motorisch angetrieben ist, kann die Längsneigung des Objektträgers 8, 10 bzw. des Probentisches 2 korrigiert werden, so dass die Fokallinie 101 der Scanner-Einrichtung 72 exakt in die Probenebene 49 zu liegen kommt. Tatsächlich findet mit der Korrektur der Längsneigung auch eine Verschiebung in der Höhe, also entlang einer Z-Achse, statt.
Zum Zweck eines solchen Objektträgertransfers wird der Probentisch 2 vorzugsweise möglichst weit der Aufbewahrungseinheit 4 in der im Wesentlichen horizontalen Y-Richtung angenähert. Beim Annähern des Probentischs 2 an die Aufbewahrungseinheit 4 dringt ein Senkdorn 88 in den Probentisch 2 ein und senkt dadurch eine Auflage der Aufnahme 34 des Probentischs 2 zum Aufnehmen eines Objektträgers ab. Dadurch wird der Probentisch 2 zur Aufnahme eines Objektträgers 8, 10 bereit gestellt. Diese Annäherung geschieht bevorzugt mittels eines an der Aufhängung 83 gelagerten Spindeltriebes 84 und entlang einer Linearführung 85. Der Spindeltrieb 84 ist über eine flexible Kupplung 86 mit dem Motor 87 verbunden, so dass eine exakte Linearführung des Probentischs 2 in im Wesentlichen der Y-Richtung auch dann erfolgen kann, wenn die Probenebene 49 einen geringen Neigungswinkel zur Horizontalen einschliesst. Ziel der Verstellbarkeit des Probentischs 2 mit dem Exzenter 80 ist hauptsächlich das Ausrichten der Probenebene 49 zu einer Fokallinie 101, die durch einen in der X-Richtung (hier senkrecht zur Zeichnungsebene) schwingenden Scanner-Kopf 50 des Laser Scanner-Geräts 1 definiert wird. Dieser Scanner-Kopf 50 bewegt sich sehr schnell in der X-Richtung und auf der Oberseite einer Trennplatte 99. Diese Trennplatte weist eine Rasteröffnung 90 auf. Bevorzugt ist der Scanner-Kopf 50 in diese Rasteröffnung 90 eingesenkt, so dass die von ihm ausgehenden Lichtstrahlen die Probe in geringem Abstand treffen, und dass der Scanner-Kopf 50 die von der Probe kommenden Fluoreszenzemission so effektiv wie möglich aufnehmen und an einen Detektor 61 oder an mehrere Detektoren 61, 61' weiter leiten kann.
Die 6 zeigt eine Prinzipskizze mit wesentlichen optischen Elementen des Laser Scanner-Geräts 1 mit einem Scanner-Kopf 50 gemäss einer ersten Ausführungsform. Das Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben umfasst einen motorisch verfahrbaren Probentisch 2 mit einer Aufnahme für einen Proben-Objektträger 10 in einer Probenebene 49. Ein erster Laser 51 und ein zweiter Laser 52 sowie ein erstes optisches System 53 stellen zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu dieser Ebene 49 verlaufenden Laserstrahlen 54, 55 unterschiedlicher Wellenlänge bereit. Eine Scanner-Einrichtung 72 umfasst einen parallel zu dieser Ebene 49 hin und her beweglichen Scanner-Kopf 50 mit einem optischen Umlenkelement 56 zum Umlenken der Laserstrahlen 54, 55 zu der Probe hin. Ein erstes Objektiv 57 fokussiert die Laserstrahlen 54, 55 auf der Probe in der Ebene 49. Dieses erste Objektiv 57 weist eine Hauptebene 107 auf, welche vorzugsweise parallel zur Probenebene 49 angeordnet ist.
Ein zweites optisches System 58 leitet die durch die Laserstrahlen 54, 55 an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv 57 und das Umlenkelement 56 in eine zur Ebene 49 im Wesentlichen parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 zu Detektoren 61, 61'. Zwei solche Detektoren 61, 61' erfassen die von den Proben kommenden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 unterschiedlicher Wellenlänge. Die Öffnungen der Blenden 48 weisen bevorzugt einen grösseren Durchmesser als die fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 auf, sie können jedoch auch den Dimensionen der fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 im wesentlichen entsprechen, wodurch ein konfokales Laser Scanner-Gerät 1 geschaffen würde.
Das optische Umlenkelement 56 des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 umfasst einen keilförmigen Dichroidspiegel 62 mit in einem Zwischenwinkel β zueinander angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen 63, 64. Dabei ist der keilförmige Dichroidspiegel 62 so eingestellt, dass die beiden Laserstrahlen 54, 55 an je einer der Oberflächen 63, 64 reflektiert werden. Dabei bewirkt der keilförmige Dichroidspiegel 62 durch den Zwischenwinkel β eine räumliche Trennung der beiden resultierenden Fokuspunkte 65 und der beiden in Richtung der Detektoren 61, 61' gelenkten Emissionsstrahlenbündel 59, 60. Die beiden resultierenden Fokuspunkte 65, 65' sind in einem Abstand 6 zu einander in der Probenebene 49 angeordnet. In dieser in der 6 gezeigten ersten Ausführungsform ist das optische Umlenkelement 56 ein keilförmiger Dichroidspiegel 62. Bevorzugt ist dabei die hintere dichroidische Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 und der beiden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 ausgebildet.
Das zweite optische System 58 umfasst an sich bekannte Elemente wie ein zweites Objektiv 57', das die eintretenden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 in je einem Punkt fokussiert. Das zweite optische System 58 umfasst zudem eine Blende 48, deren Öffnungen bevorzugt wesentlich grösser sind als die diese Öffnungen durchtretenden, fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform beruht das Laser Scanner-Gerät 1 somit auf einem nicht-konfokalen Abbildungsprinzip. Diese fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 treffen danach auf je einem Detektor 61, 61' auf, welcher die Intensität der jeweiligen Emissionsstrahlenbündel 59, 60 misst. Dieses zweite Objektiv 57' kann als Achromat oder als einfache Linse ausgebildet sein.
Die 7 zeigt Prinzipskizzen des Scanner-Kopfes des erdfindungsgemässen Laser-Scanner Geräts. Dabei zeigt 7A eine zweite Ausführungsform des Scanner-Kopfes 50, bei dem das optische Umlenkelement 56 als Pentaspiegela nordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist. Wie schon in der ersten Ausführungsform (vgl. 6) ist die hintere dichroidische Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 und der beiden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 ausgebildet.
Die 7B zeigt eine dritte Ausführungsform des Scanner-Kopfes 50, bei dem das optische Umlenkelement 56 ebenfalls als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist. Im Unterschied zu der zweiten Ausführungsform (vgl. 7A) ist die Anordnung des Dichroidspiegels 62 und des einfachen Spiegels 67 vertauscht. Dabei ist die hintere dichroidische Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 sowie der ersten und zweiten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 ausgebildet.
Es versteht sich von selbst, dass die eben beschriebenen Ausführungsformen und weitere Kombinationen beliebig vertauscht werden können. Allerdings wird die erste Ausführungsform gemäss der 6, bei der das optische Umlenkelement 56 als keilförmiger Dichroidspiegel 62 ausgebildet ist oder die zweite Ausbildungsform gemäss der 7A, bei der das optische Umlenkelement 56 als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist, bevorzugt. Für alle Pentaspiegelanordnungen 66 gilt, dass die vordere Oberfläche 63 und der einfache Spiegel 67 bevorzugt einen Winkel von 22.5° einschliessen.
Die 8 zeigt einen horizontalen Teilschnitt durch ein Laser Scanner-Gerät 1 mit wesentlichen optischen Elementen eines ersten optischen Systems 53 zum Bereistellen von Anregungslicht und eines zweiten optischen Systems 58 zum Erfassen der ausgelösten Fluoreszenzemission der Proben, einer Scanner-Einrichtung 72 mit Scanner-Kopf 50 und einem Objekttisch 2 mit einer Objektträgermagazine 7', 9' umfassenden Aufbewahrungseinheit 4. Bevorzugt sind alle wesentlichen optischen Elemente und die Scanner-Einrichtung 72 auf einer gemeinsamen Trennplatte 99 und der Probentisch 2 unterhalb dieser Trennplatte 99 (vgl. 5) angeordnet.
Die wesentlichen optischen Elemente des ersten optischen Systems 53 sind in einem Gehäuse 5 angeordnet und umfassen zumindest einen ersten Laser 51 und optional einen zweiten Laser 52, Filterräder 97 für die von dem oder den Lasern 51, 52 ausgehenden Laserstrahlen 54, 55 sowie eine Anzahl Dichroidspiegel 62 und einfacher Spiegel 67 zum Umlenken der Laserstrahlen 54, 55 aus den Lasern 51, 52 in eine zur X-Richtung parallelen Richtung.
Die wesentlichen optischen Elemente des zweiten optischen Systems 58 sind im gleichen Gehäuse 5 angeordnet und umfassen einen oder mehrere Detektoren 61, 61' diesen vorgeordnete Filterräder 97 und Blenden 48 für die von den Proben ausgehenden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 sowie eine Anzahl Dichroidspiegel 62 und einfacher Spiegel 67 zum Umlenken der Emissionsstrahlenbündel 59, 60 aus einer zur X-Richtung parallelen Richtung in Richtung der Detektoren 61, 61'. Die Scanner-Einrichtung 72 umfasst einen Antrieb 71, den Scanner-Kopf 50 und vorzugsweise einen Gegenschwinger 73 mit einer dem Scanner-Kopf 50 gleichen oder zumindest äquivalenten Masse zur Impulskompensation. Scanner-Kopf und Gegenschwinger sind mittels Pleuelstangen 70, 70' mit dem Antrieb 71 verbunden und an je einer präzisen Linearführung (nicht gezeigt) befestigt. Durch den Antrieb 71 wird der Scanner-Kopf 50 in eine schnelle hin und her Bewegung in einer Bewegungsrichtung 75 (vgl. ausgefüllte Doppelpfeile) gebracht, welche gleichzeitig die Scan-Achse 75 definiert. Dabei führt der Gegenschwinger 73 immer eine entgegengesetzte Bewegung aus, wodurch es gelingt, die Trennplatte 99 und damit das ganze Laser Scanner-Gerät 1 trotz der bevorzugt hohen Rastergeschwindigkeit des Scanner-Kopfes 50 ruhig zu halten. Die Scan-Achse 75 ist parallel zur X-Achse oder fällt gerade mit dieser zusammen. Der Scanner-Kopf 50 umfasst ein optisches Umlenkelement 56, welches z. B. als Dichroidspiegel 62 ausgebildet ist. Dieses Umlenkelement 56 kann als Vollspiegel, Prisma, Pentaprisma, Pentaspiegel-Konfiguration oder als Kombination aus diesen hier aufgeführten Elementen ausgebildet sein. Dieses Umlenkelement 56 lenkt einerseits die Laserstrahlen 54, 55 des ersten optischen Systems 53 auf die Proben auf dem Probentisch 2 und andererseits die von den Proben ausgesandten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 in Richtung des zweiten optischen Systems 58.
Senkrecht zur X-Achse und Scan-Achse 75 verläuft die Bewegungsrichtung des unterhalb der Trennplatte 99 angeordneten Probentischs 2 in Richtung der Y-Achse. Vorzugsweise in einem Bereich ausserhalb der Trennplatte 99 ist die Aufbewahrungseinheit 4 mit den in einem Probenteil-Magazin 7' gelagerten Proben-Objektträgern 8 und den in einem Testteil-Magazin 9' gelagerten Test-Objektträgern 10 angeordnet. Die Anwesenheit eines Objektträgers 8, 10 in einer bestimmten Lagerstelle 6 dieser Magazine 7', 9' wird bevorzugt mittels einer Kontrollvorrichtung 22 überprüft. Diese Kontrollvorrichtung umfasst vorzugsweise einen Lichtstrahl 23, der zu diesen Kontrollzwecken eine Kontrollöffnung 21 durchdringt.
Besonders bevorzugt wird, dass ein Service Fachmann einen oder mehrere Test-Objektträger 10 individuell in ein Probenteil-Magazin 7' einschiebt und dieses Probenteil-Magazin 7' auf dem ordentlichen Wege in das Laser Scanner-Gerät 1 einsetzt. Eine entsprechend programmierte Firmware in der Steuerung 40 des Laser Scanner-Geräts 1 wird dann vorzugsweise per Eingabe einer persönlichen Identifikationsnummer (PIN) des Service Fachmanns bzw. per Eingabe eines Codes für die Service-Fachleute aktiviert. Die so aktivierte Firmware befähigt die Steuerung 40 des Laser Scanner-Geräts 1, den automatischen Transport jedes dieser Test-Objektträger 10 aus dem Probenteil-Magazin 7' auf den Probentisch 2 und weiter in eine Lagerstelle 6 des Teststeil-Magazins 9' zu steuern. Gemäss diesem besonders bevorzugten Verfahren wird jeder manuelle Eingriff in das Testteil-Magazin 9' verunmöglicht. Nur in besonderen Notfällen könnte ein Service-Fachmann mit geeigneten Werkzeugen die vorzugsweise in dem zusätzlichen Gehäuse 29 eingeschlossenen Test-Objektträger 10 herausholen. Vorzugsweise ist die Steuerung 40 des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 zum Steuern einer automatisierten, internen und an Hand von Test-Objektträgern 10 ausgeführten Instrumentprüfung ausgebildet.
Vorzugsweise ist der Probentisch 2 zum Verfahren bis unmittelbar vor die Aufbewahrungseinheit 4 motorisch angetrieben ausgebildet und dessen Lage und Be wegung durch die Steuerung 40 kontrolliert. Dasselbe gilt auch für die Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 zum Auswählen des zu untersuchenden Objektträgers 8, 10 und für die drehbare Exzenterwalze 19 zum Wegschwenken der Klappen 16. Zudem wird bevorzugt, dass auch der Entladeschieber 31 zum Transportieren eines Objektträgers 8, 10 zu dem Probentisch 2 für das automatisierte Auswählen und Bereitstellen eines Proben-Objektträgers 8 oder Test-Objektträgers 10 auf dem Probentisch 2 motorisch angetrieben ausgebildet und dessen Lage und Bewegung durch die Steuerung 40 kontrolliert sind. Dasselbe gilt auch für den Ladeschieber 32 zum Transportieren eines Objektträgers 8, 10 zu der Aufbewahrungseinheit 4 beim Zurücklegen derselben in eine Lagerstelle 6 des Probenteil-Magazins 7' oder des Testteil-Magazins 9'.
Die 9 zeigt einen horizontalen Teilschnitt durch den Scanner-Kopf 50 des Laser Scanner-Geräts 1 mit dem zugeordneten Weggeber 91. An einem Rahmen 82 ist eine Linearführung 68 befestigt, an welcher der Scanner-Kopf 50 in der X-Richtung und in eine Rasteröffnung 90 eintauchend, beweglich angeordnet ist. In diesem Fall fällt die X-Achse mit der Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfes 50 zusammen, wobei diese Bewegungsrichtung 75 gemeinsam mit den zur unter dem Scanner-Kopf 50 angeordneten Probe (nicht gezeigt) hin umgelenkten ersten und zweiten Laserstrahlen 54, 55 eine Rasterebene 76 definiert. Diese Rasterebene 76 steht bevorzugt senkrecht zu der Probenebene 49. Der Scanner-Kopf 50 umfasst einen Massstab 77, der in einem Abstand zu einem fixierten, linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 und in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Der Probentisch 2 ist vorzugsweise in einer rechtwinklig zur X-Achse 75 angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahrbar ausgebildet und motorisch angetrieben.
Der Scanner-Kopf mit allen seinen optischen Elementen, Befestigungsmitteln, dem Massstab 77 und einem Teil der Linearführung weist einen Massenschwerpunkt 74 auf. Dieser Massenschwerpunkt 74 ist in der Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 auf einer Linie mit einem Pleuelangriffspunkt 69 angeordnet, welche die Pleuelstange 70 des Scanner-Kopfes 50 mit dem Antrieb 71 verbindet. Dieser Pleuelangriffspunkt 69 kann z. B. als Achse ausgebildet sein; es wird jedoch bevorzugt, den Pleuelangriffspunkt als Kreuzfedergelenk auszubilden.
Die 10 zeigt eine Prinzipskizze des Weggebers 91 für den Scanner-Kopf 50 und dessen nichtlineare Bewegung beim Scannen als X/t-Diagramm. Dieses X/t-Diagramm weist auf die unterschiedliche Zeitdauer (Δt₁; Δt₂) für die Erfassung eines Pixels (Δx) je nach der Position auf der X-Achse hin. Das Weggeber-Signal 92 entspricht in etwa einer Sinuskurve, welche ihre Maxima an den Extrempunkten (Endpunkten) einer Scan-Linie des Laser-Kopfes 50 aufweist. Wegen der Umkehr der Scan-Richtung in diesen Endpunkten und der dadurch verlangsamten Bewegung braucht der Scanner-Kopf in der Nähe dieser Wendepunkte eine länger Zeit (Δt₂) für die selbe Wegstrecke (Δx), als mit der erreichbaren Höchstgeschwindigkeit des Scanner-Kopfes in einer Mittelstellung zwischen den Wendepunkten, bei der dieselbe Wegstrecke (Δx) in einer viel kürzeren Zeit (Δt₁) durchlaufen wird. Das Pixel (Δx) sowie der entsprechende Ort und Zeitpunkt wird miteinander korreliert und der zu diesem Zeitpunkt gemessenen Intensität zugeordnet. Die Summe aller gemessenen Pixel ergibt dann ein zweidimensionales Bild. Die Korrelation des Ortes dieser Pixel in der Probenebene 49 mit der Intensität der an diesem Ort gemessenen Fluoreszenzintensität bestimmt in Kombination mit der Pixelgrösse letztendlich die Auflösung des Laser-Scanner Geräts 1.
Die 11 bis 15 zeigen Diagramme von Lösungsvorschlägen, in denen die Signalintegration (I) in Funktion der Zeit (t) dargestellt ist.
Die 11 zeigt einen ersten Lösungs-Vorschlag, bei welchem der Weggeber die Datenerfassung mit einem passiven Integrator (RC Glied) triggert. Dieser Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts beinhaltet aber noch einige mögliche Nachteile. So ist die gemessene Intensität am Rand des Scanbereichs höher, da hier pro Pixel länger integriert wird. Zudem wird die Auflösung des Laser Scanner-Geräts wegen der Abklingcharakteristik des RC Glieds reduziert.
Die 12 zeigt einen zweiten Lösungs-Vorschlag, bei welchem der Weggeber die Datenerfassung mit einem schaltbaren Integrator bei konstanter Integrationszeit triggert. Dieser Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts beinhaltet aber noch einige, nicht akzeptable Nachtei le. So reduziert die Löschzeit für den Integrator die Empfindlichkeit, da diese Zeit nicht für die Signalerfassung zur Verfügung steht. Diese Löschzeit besetzt insbesondere bei kleinen Auflösungen, d. h. sehr kleinen ,Pixelzeiten' (pixel dwell time) einen signifikanten Anteil der Messzeit. Zudem wird durch den Löschvorgang selbst zusätzliches Rauschen erzeugt. Es ergibt sich überdies ein sogenanntes ”Undersampling” am Rand des Scanbereichs. Auch können ungleiche Bedingungen der Datenerfassung (kürzere oder längere Abstände zwischen zwei Triggerpulsen) zu Inhomogenitäten zwischen Zentral- und Randbereichen führen.
Die 13 zeigt einen dritten Lösungs-Vorschlag, bei welchem das Weggeber-Signal als Ereignis zeitlich erfasst und jedem Signal über eine Zeitbasis der Zeitpunkt seines Auftretens zugeordnet wird, wobei die Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis getriggert wird. Dem Vorteil gegenüber dem zweiten Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts, gemäss welchem nun über den ganzen Scanbereich gleiche ”elektronische Bedingungen” herrschen, stehen die aus dem Lösungs-Vorschlag 2 bekannten Nachteile gegenüber. Diese Nachteile ergeben sich dadurch, dass das zusätzliche Rauschen, das durch den Löschvorgang erzeugt wird, dass die Löschzeit die Empfindlichkeit reduziert.
Die 14 zeigt einen vierten Lösungs-Vorschlag entsprechend dem dritten Lösungs-Vorschlag, wobei jedoch ein passives RC-Glied zur Integration verwendet wird. Der Vorteil gegenüber dem dritten Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts liegt hier darin, dass nun keine Einbussen bei der Empfindlichkeit mehr in Kauf genommen werden müssen, da die Löschzeit und das zusätzliche Rauschen durch den Löschvorgang entfallen. Hingegen besteht noch der klare Nachteil wegen der durch die Abklingcharakteristik des RC Glieds bedingte reduzierte Auflösung. Es wird hier angemerkt, dass die Verkleinerung der Zeitkonstante des RC Glieds zwar die Auflösungsproblematik lösen würde; dies würde jedoch Einbussen bei der Empfindlichkeit mit sich bringen. Die Zeitkonstante des RC Glieds muss mindestens in der Grössenordnung eines Pixels liegen bevorzugt aber in der Grössenordnung eines Datenerfassungsintervalls, da ansonsten kurze Signale (typischerweise von einzelnen Photonen) evtl. übersehen, d. h. nicht detektiert würden. Als Datenerfassungsintervall wird die Zeit zwischen zwei Wandlungspunkten des A/D Wandlers bezeichnet.
Die 15 zeigt einen fünften Lösungs-Vorschlag, welcher dem vierten Lösungs-Vorschlag entspricht, wobei aber mehrere Messungen pro Pixel ausgeführt werden. Vorzugsweise wird dabei die Intensität eines Pixels als Mittelwert aller Datenpunkte die innerhalb der Zeitmarken für dieses Pixel liegen berechnet (und gegebenenfalls durch Interpolation noch verfeinert). Der letzte noch bestehende Nachteil gegenüber dem vierten Vorschlag wird hier eliminiert, weil sich durch die geringere Abklingzeit des RC Glieds keine verringerte Auflösung mehr ergibt.
Die Erkenntnisse aus den gezeigten, unterschiedlichen Lösungs-Vorschlägen führen zu bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens:
Vorzugsweise wird jedes von einem Detektor (61) erzeugte Detektorsignal (93) von einem Integrator der Steuerung (40) integriert, wobei jedem Teil eines integrierten Detektorsignals (93) über die Zeitbasis (94) der Zeitpunkt des entsprechenden Weggeber-Signals (92) zugeordnet wird, und wobei jede Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis (94) getriggert und von der Steuerung (40) mit konstanter Integrationszeit durchgeführt wird.
Besonders bevorzugt wird, dass die Signal-Integration mit einem passiven RC-Glied ausgeführt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte Zeitkonstante mindestens in der Grössenordnung eines Datenerfassungsintervalls Δd liegt. Ein Datenerfassungsintervall ist eine in der Zeit konstant durchlaufende Erfassung der integrierten Detektorsignale 93 zwischen zwei Detektorsignalmaxima (vgl. Δd in 15).
Speziell bevorzugt wird, dass die Intensität eines Pixels 95 als Mittelwert aller Datenpunkte berechnet wird, die innerhalb von Zeitmarken 96 für dieses Pixel 95 liegen. Zur weiteren Verfeinerung kann auch ein Interpolationsverfahren, das un vollständig zwischen den Zeitmarken eines Pixels liegende Datenerfassungsintervalle Δd berücksichtigt und deren zugehörige Messwerte anteilig interpoliert, zum Einsatz kommen.
Die 16 zeigt einen bevorzugten Test-Objektträger 10, der das Format eines Standardobjektträgers für die Lichtmikroskopie aufweist und der ausschliesslich im Wesentlichen lichtstabile Teststrukturen 41 umfasst. Als ”im wesentlichen lichtstabil” wird eine Teststruktur bezeichnet, wenn diese bei normaler Benutzung, d. h. bei der während Testverfahren üblicherweise auftretenden Strahlenbelastung keinen messbaren Schaden erleidet. Eine minutenlange oder gar stundenlange Bestrahlung eines Test-Objektträgers 10 mit einem Laserstrahl 54, 55, bzw. das Liegelassen eines Test-Objektträgers 10 an einem ungeschützten Ort für längere Zeit (beispielsweise gegenüber dem Umgebungslicht exponiert) wird nicht als ”normale Benutzung” bezeichnet.

Die folgende Tabelle 1 gibt einen Überblick über die gebräuchlichsten Glasobjektträger für die Lichtmikroskopie:

Typ	Inch: 1 × 3 Zoll	Metrisch: 25 × 75 mm
Dimensionen:
Länge × Breite	76.2 mm × 25.4 mm	76 mm × 25 mm
(Toleranzen)	(±0.5 mm)	(±0.5 mm)
Dicke:
”standard”	1.02 mm (±0.05 mm)
”dick”	1.2 mm (±0.1 mm)	1.02 mm (±0.05 mm)
Behandlung:
Ecken	scharf, gefast	scharf, gefast
Kanten	scharf, gefast	scharf, gefast
Oberflächen	blank, sandgestrahlt, auf einer oder beiden Seiten	blank, sandgestrahlt, auf einer oder beiden Seiten

Der in der 16 abgebildete, beispielhafte Test-Objektträger 10 weist eine Fläche mit einer Länge A von 75 mm einer Breite B von 25 mm sowie eine Dicke C von 1 mm auf. Die eine Hälfte der Fläche A/2 ist (beispielsweise mittels Schlei fen) mattiert. Die andere Hälfte weist ein bevorzugtes Linien-Muster mit einer Breite D von 20 mm auf.
Dieses Linienmuster besteht bevorzugt aus einer mittels Maske erstellten, aufgedampften Chromschicht. Die Grossbuchstaben E, F, G bezeichnen eine bestimmte Anzahl Linienpaare pro Millimeter (lp/mm) und die Kleinbuchstaben l, m, n, o bezeichnen bestimmte Masse wie folgt:
E = 50 lp/mm; F = 100 lp/mm; G = 10 lp/mm;
l = 0.5 mm; m = 2 mm; n = 1 mm; o = 7 mm.
Alle diese Teststrukturen 41 sind bevorzugt ausschliesslich im Wesentlichen lichtstabil und nicht fluoreszierend.
Das erfindungsgemässe Laser Scanner-Gerät 1 ist zur Abbildung und Vermessung von zweidimensionalen Objekten ausgelegt. Dementsprechend muss eine Empfindlichkeitskalibrierung genau für diese ”flachen” Objekte gültig sein. Zweidimensionale Fluoreszenzproben, die sowohl lichtstabil als auch chemisch über lange Zeiträume beständig sind, sind jedoch nicht oder nur sehr schwer herzustellen.
Dagegen können Objekte, die eine dreidimensionale Ausdehnung haben, vermessen werden. Weil die an solchen dreidimensionalen Objekten gemessenen Intensitäten aber stark von der Tiefenschärfe des Laser Scanner-Geräts und von der jeweiligen Positionierung im Fokus (d. h. in der Z-Richtung) abhängen, sind solche dreidimensionalen Objekte nicht direkt zur Kalibrierung von Signalintensität oder Empfindlichkeit geeignet. Als sogenanntes ”Bulk-Material” existieren jedoch Materialien 102, wie beispielsweise in Kunststoff eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe oder dotierte Gläser, die weitestgehend lichtstabil und chemisch beständig sind.
Die Ausrichtung des Probentischs 2 und der Aufbewahrungseinheit des Laser Scanner-Geräts 1 im Raum ist eigentlich beliebig. Dasselbe gilt für die gut ausgewuchtete bzw. mittels Gegenschwinger 73 impulskompensierte Scanner-Einrichtung 72. Auch kann die Probenebene 49 des Probentisches 2 im Wesentlichen horizontal aber kopfüber hängend angeordnet sein. Allerdings wird eine stehende Anordnung des Probentischs gemäss den 1 und 2 bzw. 4 bis 7 bevorzugt.
Gleiche Merkmale oder Elemente des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 sind jeweils mit gleichen Bezugszeichen versehen, auch wenn diese Elemente nicht in allen Fällen im Detail beschrieben sind.
Bestandteil des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens mit einem Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben bilden auch folgende Merkmale, gemäss welchen:

– Die Probenebene 49 im Wesentlichen horizontal angeordnet ist und die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 vorzugweise eine X-Achse oder Scan-Achse definiert, wobei der Probentisch 2 in einer dazu rechtwinklig angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahren wird.
– Zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu der Probenebene 49 verlaufende Laserstrahlen 54, 55 unterschiedlicher Wellenlänge mit dem mindestens einen Laser 51, 52 und dem ersten optischen System 53 bereitgestellt und mit einem optischen Umlenkelement 56 einer Scanner-Einrichtung 72 zu der Probe hin umgelenkt werden. Bevorzugt werden diese Laserstrahlen 54, 55 mit dem ersten Objektiv 57 auf der Probe in der Ebene 49 fokussiert, wonach die durch die Laserstrahlen 54, 55 an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv 57 und das Umlenkelement 56 in eine zur Ebene 49 im wesentlichen parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 unterschiedlicher Wellenlänge mit dem zweiten optischen System 58 zu zwei Detektoren 61, 61' geleitet und von diesen Detektoren 61, 61' erfasst werden. Besonders bevorzugt wird die Verwendung eines keilförmigen Dichroidspiegels 62 mit in einem Zwischenwinkel β zueinander angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen 63, 64 als Teil des optischen Umlenkelements 56. Dabei ist der keilförmige Dichroidspiegel 62 vorzugsweise so eingestellt, dass die beiden Laserstrahlen 54, 55 an je einer der Oberflächen 63, 64 reflektiert werden, so dass der keilförmige Dichroidspiegel 62 durch den Zwischenwinkel β eine räumliche Trennung von beiden resultierenden Fokuspunkten 65 und von beiden in Richtung der Detektoren 61, 61' gelenkten Emissionsstrahlenbündeln 59, 60 bewirkt.
– Ein als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildetes, optisches Umlenkelement 56 verwendet wird, wobei diese Pentaspiegelanordnung 66 Verkippungen des Scanner-Kopfes 50 um eine zur Scan-Achse 75 rechtwinklig verlaufende Y-Achse so korrigiert, dass die resultierenden Fokuspunkte 65 ihre aktuelle Position in der Probenebene 49 nicht verändern.
– Die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 gemessen wird, welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Alternativ wird bevorzugt, die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 zu messen, welcher zumindest in der Nähe der Hauptebene 107 des ersten Objektivs 57 angeordnet ist.

Speziell bevorzugt wird, dass der Scanner-Kopf 50 mit seinem optischen Umlenkelement 56 und seiner Bewegungsrichtung 75 eine Rasterebene 76 definiert, welche senkrecht zu der Probenebene 49 steht, wobei die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 gemessen wird, welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 und in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Dieser Massstab 77 ist bevorzugt in der Rasterebene 76 oder zumindest in der unmittelbaren Nähe dieser Rasterebene 76 angeordnet. Dieser Massstab 77 ist bevorzugt zudem in der Hauptebene 107 des ersten Objektivs 57 (vgl. 6 und 7) oder zumindest in der unmittelbaren Nähe dieser Hauptebene 107 angeordnet.
An der Stelle eines normalen Scans bzw. eines normalen abgerasterten Feldes in XY-Richtung und damit parallel zur Probenebene 49 wird ein Scan in XZ-Richtung (Z-Profil) durchgeführt, indem ein Feld abgerastert wird, welches zumindest im wesentlichen senkrecht auf der Probenebene 49 steht. Das direkt gemessene Z-Profil stellt die gemessene Intensität in Abhängigkeit von der Z-Koordinate dar (I = I(Z)). An der Stelle dieses Z-Profils wird nun vorzugsweise die erste Ableitung der entsprechenden Intensitäten (dI = dI(z)/dz) berechnet, womit wieder eine zweidimensionale Intensitätsverteilung vorliegt. Das Maximum der ersten Ablei tung ist somit ein Mass für die vom Laser Scanner-Gerät 1 an der Oberfläche der Probe gemessenen Intensität.
Die für dieses Kalibrierverfahren geeigneten Materialien 102 können zusammen mit den aufgedampften Linienmustern auf dem gleichen Test-Objektträger 10 oder auf einem separaten Test-Objektträger angeordnet werden. Diese flachen, dreidimensionalen Materialien 102 weisen bevorzugt eine zur Probenebene 49 parallele Ausdehnung von 2 × 2 mm bis 10 × 10 mm auf und haben eine Dicke von etwa 0.1 bis 2 mm, bevorzugt eine Dicke von ca. 1 mm (vgl. 16).
Ein Fachmann kennt die Funktion eines Dichroidspiegels als optisches Element, das für einen Teil des Wellenlängenspektrums durchlässig ist und einen anderen Teil dieses Wellenlängenspektrums spiegelt. Der Fachmann spricht hier deshalb von einer wellenlängenselektiven Transmission und Reflektion. Sich für einen Fachmann aus der vorliegenden Beschreibung ergebende Kombinationen bzw. Varianten der beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören zu deren Umfang.

1: Laser Scanner-Gerät
2: Probentisch
3: Transportvorrichtung
4: Aufbewahrungseinheit
5: Gehäuse
6: Lagerstelle
7: Probenteil
7': Probenteil-Magazin
8: Proben-Objektträger
9: Testteil
9': Testteil-Magazin
10: Test-Objektträger
11: bewegliche Stellplatte
12: Lagerstege
13: Anpressfeder
14: Längskante Objektträger
15: Einschubseite
16: wegschwenkbare Klappe
18: Winkelplatte
19: Exzenterwalze
21: Kontrollöffnung
22: Kontrollvorrichtung
23: Lichtstrahl
29: Zusätzliches Gehäuse
30: Feder
31: Entladeschieber
32: Ladeschieber
33: schwenkbare Klappe
34: Aufnahme
35: gegenüber liegende Nuten
36: feststehende Stege
37: beweglicher Backen
38: aufstehende Seitenwände
39: bewegliche Anpressteile
40: Steuerung
41: lichtstabile Teststrukturen
42: Handgriff
43: Schwalbenschwanz
44: Antrieb zu 11
45: Antrieb zu 31
46: Antrieb zu 32
47: Kippachse von 33
48: Blende
49: Ebene, Probenebene
50: Scanner-Kopf
51: erster Laser
52: zweiter Laser
53: erstes optisches System
54: erster Laserstrahl
55: zweiter Laserstrahl
56: optisches Umlenkelement
57: erstes Objektiv
57': zweites Objektiv
58: zweites optisches System
59: erstes Emissionsstrahlenbündel
60: zweites Emissionsstrahlenbündel
61: erster Detektor
61': zweiter Detektor
62: Dichroidspiegel
63: vordere Oberfläche
64: hintere Oberfläche
65: resultierende Fokuspunkte
66: Pentaspiegelanordnung
67: einfacher Spiegel
68: Linearführung
69, 69': Pleuelangriffspunkt
70, 70': Pleuel, Pleuelstange
71: Antrieb
72: Scanner-Einrichtung
73: Gegenschwinger
74: Massenschwerpunkt
75: Bewegungsrichtung X-Achse, Scan-Achse
76: Rasterebene
77: Massstab
78: lineares Messsystem
79: Kippmechanismus
80: Exzenter, Exzentervorrichtung
81: Drehachse
82: Rahmen
83: Aufhängung
84: Spindeltrieb
85: Linearführung
86: Kupplung
87: Motor
88: Senkdorn
89: Rampe
90: Rasteröffnung
91: Weggeber
92: Weggeber-Signal
93: Detektor-Signal
94: Zeitbasis
95: Pixel
96: Zeitmarken
97: Filterrad
98: Aussparung
99: Trennplatte
101: Fokallinie
102: flache Materialien
103: Auflageteil von 2
104: Stahlfeder
105: Joch
106: Exzenter, Exzentervorrichtung
107: Hauptebene des Objektivs 57

Claims

Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät (1) zum pixelgenauen Abbilden von auf Objektträgern (8) befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben, wobei dieses Laser Scanner-Gerät (1) umfasst: (a) einen Probentisch (2) mit einer Aufnahme (34) für Objektträger (8) in einer Probenebene (49); (b) mindestens einen Laser (51, 52) und ein erstes optisches System (53) zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls (54, 55) zur Anregung der fluoreszierenden Proben; (c) einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner-Kopf (50) mit einem optischen Umlenkelement (56) zum Umlenken der Laserstrahlen (54, 55) zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung (75); (d) ein erstes Objektiv (57) zum Fokussieren der Laserstrahlen (54, 55) auf der Probe in der Ebene (49); (e) ein zweites optisches System (58) zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen (54, 55) an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv (57) und das Umlenkelement (56) umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln (59, 60) zu mindestens einem Detektor (61); (f) einen Weggeber (91), der Weggeber-Signale (92) aussendet, die den momentanen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs (50) in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen; (g) ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen (93) des Detektors (61) mit einer definierten Zeitkonstante; und (h) einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale (93), dadurch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) an einer Linearführung (68), welche die Bewegungsrichtung (75) des Scanner-Kopfs (50) definiert, verschoben wird, dass die gefilterten Detektor-Signale (93) des A/D-Wandlers und die Weggeber-Signale (92) zeitlich parallel und kontinuierlich, aber unabhängig voneinander von einer Rechnereinheit bzw. einer Steuerung (40) erfasst und auf eine gemeinsame Zeitbasis (94) bezogen werden, wobei die A/D-Wandlung so häufig erfolgt, dass jedem Pixel (95) eines Bildes stets mehr als ein Datenpunkt des A/D-Wandlers zugeordnet wird, und dass das von einem Detektor (61) erzeugte Detektorsignal (93) von dem A/D-Wandler dieser Steuerung (40) digitalisiert wird, wobei jedem Wandlungspunkt des A/D Wandlers über die Zeitbasis (94) der Zeitpunkt des entsprechenden Weggeber-Signals (92) zugeordnet wird, und wobei jede Digitalisierung konstant fortlaufend von der Zeitbasis (94) getriggert und von der Steuerung (40) mit einer konstanten und gleichen Zeit für alle Datenerfassungsintervalle (Δd) durchgeführt wird.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Signal-Filterung mit einem passiven RC-Glied ausgeführt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte Zeitkonstante in der Grössenordnung eines Datenerfassungsintervalls (Δd) liegt.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Signal-Filterung mit einem passiven RC-Glied ausgeführt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte Zeitkonstante einen Teil der Grössenordnung eines Pixels (95) beträgt.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines Pixels (95) als Mittelwert aller Datenpunkte berechnet wird, die innerhalb von Zeitmarken (96) für dieses Pixel (95) liegen.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Messwerte von unvollständig zwischen den Zeitmarken eines Pixels liegenden Datenerfassungsintervallen anteilig interpoliert werden.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Laser Scanner-Gerät (1) beim Abbilden von auf Objektträgern (8) befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben eine Pixelauflösung erreicht wird, die 2.0 μm oder besser ist.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Laser Scanner-Gerät (1) Pixel (95) mit einer Grösse von 2 μm mit mindestens zwei individuellen Detektor-Signalen (93) abgebildet werden.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) einen Pleuelangriffspunkt (69) aufweist, die über einen Pleuel (70) mit einem Antrieb (71) einer Scanner-Einrichtung (72) verbunden ist, welche diesen Scanner-Kopf (50) umfasst.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Pleuelangriffspunkt (69) des Scanner-Kopfs (50) in der Bewegungsrichtung (75) auf einer Linie mit einem Massenschwerpunkt (74) des Scanner-Kopfs (50) angeordnet ist.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) mit seinem optischen Umlenkelement (56) und seiner Bewegungsrichtung (75) eine Rasterebene (76) definiert, wobei der Scanner-Kopf (50) einen Massstab (77) umfasst, der in einem Abstand zu einem linearen Messsystem (78) des Laser Scanner-Geräts (1) und in dieser Rasterebene (76) angeordnet ist.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) einen Massstab (77) umfasst, der zumindest in der Nähe einer Hauptebene (107) des ersten Objektivs (57) angeordnet ist.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Scanner-Einrichtung (72) einen Gegenschwinger (73) umfasst, der an einer Linearführung verschiebbar befestigt ist und einen Pleuelangriffspunkt (69') aufweist, die über einen Pleuel (70') mit dem Antrieb (71) der Scanner-Einrichtung (72) verbunden ist.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenebene (49) im Wesentlichen horizontal angeordnet ist.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegungsrichtung (75) des Scanner-Kopfs (50) eine X-Achse oder Scan-Achse definiert und der Probentisch (2) in einer dazu rechtwinklig angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahren wird.
Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu der Probenebene (49) verlaufende Laserstrahlen (54, 55) unterschiedlicher Wellenlänge mit dem mindestens einen Laser (51, 52) und dem ersten optischen System (53) bereitgestellt und mit einem optischen Umlenkelement (56) einer Scanner-Einrichtung (72) zu der Probe hin umgelenkt werden.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese Laserstrahlen (54, 55) mit dem ersten Objektiv (57) auf der Probe in der Ebene (49) fokussiert werden, wonach die durch die Laserstrahlen (54, 55) an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv (57) und das Umlenkelement (56) in eine zur Ebene (49) im wesentlichen parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel (59, 60) unterschiedlicher Wellenlänge mit dem zweiten optischen System (58) zu zwei Detektoren (61, 61') geleitet und von diesen Detektoren (61, 61') erfasst werden.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein keilförmiger Dichroidspiegel (62) mit in einem Zwischenwinkel (β) zueinander angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen (63, 64) als Teil des optischen Umlenkelements (56) verwendet wird, wobei der keilförmige Dichroidspiegel (62) so eingestellt ist, dass die beiden Laser strahlen (54, 55) an je einer der Oberflächen (63, 64) reflektiert werden, und wobei der keilförmige Dichroidspiegel (62) durch den Zwischenwinkel (β) eine räumliche Trennung von beiden resultierenden Fokuspunkten (65) und von beiden in Richtung der Detektoren (61, 61') gelenkten Emissionsstrahlenbündeln (59, 60) bewirkt.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein als Pentaspiegelanordnung (66) mit einem keilförmigen Dichroidspiegel (62) und einem einfachen Spiegel (67) ausgebildetes, optisches Umlenkelement (56) verwendet wird, wobei diese Pentaspiegelanordnung (66) Verkippungen des Scanner-Kopfes (50) um eine zur Scan-Achse (75) rechtwinklig verlaufende Y-Achse so korrigiert, dass die resultierenden Fokuspunkte (65) ihre aktuelle Position in der Probenebene (49) nicht verändern.
Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslenkung des Scanner-Kopfs (50) in der X-Achse (75) mit einem Massstab (77) gemessen wird, welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem (78) des Laser Scanner-Geräts (1) in dieser Rasterebene (76) angeordnet ist.
Datenerfassungsverfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslenkung des Scanner-Kopfs (50) in der X-Achse (75) mit einem Massstab (77) gemessen wird, welcher zumindest in der Nähe der Hauptebene (107) des ersten Objektivs (57) angeordnet ist.