DE112004001972T5

DE112004001972T5 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweisen von kleinen Anzahlen an Molekülen unter Verwendung der oberflächenverstärkten kohärenten anti-Stokes'schen Ramanspektroskopie

Info

Publication number: DE112004001972T5
Application number: DE112004001972T
Authority: DE
Inventors: Tae-Woong Cupertino Koo; Christopher Santa Clara Gerth; Mineo Campbell Yamakawa
Original assignee: Intel Corp
Current assignee: Intel Corp
Priority date: 2003-10-17
Filing date: 2004-10-18
Publication date: 2006-08-17
Also published as: WO2005038419A3; GB2423579A; GB2423579B; WO2005038419A2; GB0609804D0; WO2005038419A8; JP2007509322A

Abstract

Verfahren zum Detektieren oder Identifizieren eines Analyten, das folgendes umfaßt:
a) Aussetzen von weniger als 10⁵ Molekülen eines Anayten wenigstens einer Ramanaktiven Oberfläche;
b) Bestrahlen der Grenzschicht zwischen wenigstens einem Molekül und der Oberfläche mit einem Laserstrahl bei einer ersten Wellenlänge, so daß das Molekül eine spontane Stokes-Raman-Emission bei einer zweiten Wellenlänge erzeugt und eine spontane Anti-Stokes-Raman-Emission bei einer dritten Wellenlänge;
c) im wesentlichen gleichzeitig mit b) Bestrahlen der Grenzfläche zwischen dem Molekül und der Oberfläche mit einem zweiten Strahl bei der zweiten Wellenlänge, so daß die Intensität der Anti-Stokes-Raman-Emission von dem ersten Molekül bei der dritten Wellenlänge ansteigt; und
d) Detektieren oder Identifizieren des Analyten durch Detektieren oder Identifizieren der Intensitätsänderung der Anti-Stokes-Emission aus der Grenzfläche bei der dritten Wellenlänge nach b) und c).

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die Anmeldung ist ein Continuation-in-Part der US-Anmeldung Nr. 10/688,680, eingereicht am 17. Oktober 2003, deren Offenbarung hier im Wege der Bezugnahme aufgenommen ist.
GEBIET DER ERFINDUNG
Ausführungen der Erfindung betreffen das Gebiet der molekularen Analyse der Spektroskopie. Genauer betrifft die Erfindung allgemeine Verfahren und Vorrichtungen zur Verwendung beim biologischen, biochemischen und chemischen Testen, und insbesondere Verfahren, Instrumente und die Verwendung von Instrumenten, welche die Oberflächen-verstärkte kohärente Anti-Stokes'sche Ramanspektroskopie (SECARS) zum Nachweisen, Identifizieren oder Sequenzieren von Molekülen, wie etwa Nukleinsäuren verwenden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der empfindliche und genaue Nachweis und/oder die Identifizierung von kleinen Anzahlen an Molekülen aus biologischen und anderen Proben hat sich als ein schwer faßbares Ziel erwiesen mit ausgedehnten potentiellen Anwendungen in der medizinischen Diagnostik, Pathologie, Toxikologie, bei der Probennahme aus der Umwelt, in der chemischen Analyse, Forensik und zahlreichen anderen Gebieten. Es sind Versuche unternommen worden, die Raman-Spektroskopie und/oder Oberflächenplasmonresonanz zu verwenden, um dieses Ziel zu erreichen. Wenn Licht ein interessierendes Medium passiert, wird eine bestimmte Menge aus seiner ursprünglichen Richtung abgelenkt. Dieses Phänomen ist als Streuung bekannt. Ein Teil des gestreuten Licht unterscheidet sich in der Frequenz von dem ursprünglich anregenden Licht aufgrund von a) der Absorption von Licht durch das Medium, b) Anregung von Elektronen in dem Medium zu einem höheren Energiezustand, und c) anschließende Emission des Lichts aus dem Medium bei einer anderen Wellenlänge. Wenn der Frequenzunterschied mit dem Energieniveau der molekularen Schwingungen des interessierenden Mediums zusammenpaßt, ist dieser Vorgang als Raman-Streuung bekannt. Die Wellenlängen des Raman-Emissionspektrums sind für die chemische Zusammensetzung und Struktur der Moleküle, welche das Licht in einer Probe absorbieren, charakteristisch, während die Intensität der Lichtstreuung von der Konzentration von Molekülen in der Probe ebenso wie von der Struktur des Moleküls abhängt. Wenn die Wellenlänge des emittierten Lichts bei der Raman-Streuung länger ist als die Wellenlänge des Anregungslichts, ist dies als Stokes'sche Raman-Streuung bekannt. Wenn die Wellenlänge des emittierten Lichts kürzer ist als die Wellenlänge des Anregungslichts ist dies als Anti-Stokes'sche Raman-Streuung bekannt.
Die Wahrscheinlichkeit, daß eine Raman-Wechselwirkung zwischen einem Anregungslichtstrahl und einem einzelnen Molekül in einer Probe auftritt ist sehr gering, was zu einer geringen Empfindlichkeit und begrenzten Anwendbarkeit der Raman-Analyse führt. Der „optische Wirkungsquerschnitt" ist ein Begriff, der die Wahrscheinlichkeit angibt, daß ein optisches Ereignis auftritt, welches durch ein bestimmtes Molekül oder ein Partikel induziert wird. Wenn Photonen auf ein Molekül auftreffen, treten nur einige der Photonen, die geometrisch auf das Molekül auftreffen, mit dem Molekül optisch in Wechselwirkung. Der Wirkungsquerschnitt ist ein Vielfaches von dem geometrischen Querschnitt und der Wahrscheinlichkeit des optischen Ereignisses. Optische Wirkungsquerschnitte schließen einen Absorptionswirkungsquerschnitt (bei dem Photon-Absorptionsverfahren), Rayleigh-Streuung-Wirkungsquerschnitt oder Streuwirkungsquerschnitt (bei der Rayleigh-Streuung) und Raman-Streuung-Wirkungsquerschnitt (Raman-Streuung) ein.
Für den optischen Nachweis und die Spektroskopie von kleinen Anzahlen an Molekülen sind Wirkungsquerschnitte von >10^–16 cm²/Molekül oder mehr gewünscht, und Wirkungsquerschnitte von mehr als 10^–21 cm²/Molekül oder mehr sind notwendig. Typische spontane Raman-Streuungstechniken weisen Wirkungsquerschnitte von ungefähr 10^–30 cm²/Molekül auf und sind folglich zum Einzelmolekülnachweis nicht geeignet.
Es ist gezeigt worden, daß Moleküle in der Nähe aufgerauhter Silberoberflächen eine verstärkte Raman-Streuung von soviel wie sechs bis sieben Größenordnungen aufweist. Dieser Effekt der Oberflächen-verstärkten Raman-Spektroskopie (SERS) hängt mit dem Phänomen der Plasmonresonanz zusammen, wobei eine Metalloberfläche eine ausgeprägte optische Re sonanz als Antwort auf einfallende elektromagnetische Strahlung aufgrund der kollektiven Kopplung von Leitungselektronen in dem Metall. Im wesentlichen kann eine Metalloberfläche als Mini-„Antenne" wirken, um die lokalisierten Wirkungen der elektromagnetischen Strahlung zu steigern. Moleküle, die in der Nachbarschaft derartiger Oberflächen lokalisiert sind, zeigen eine sehr viel größere Empfindlichkeit für eine Analyse durch Raman-Spektroskopie.
Die SERS wird gewöhnlich durch Verwendung von entweder rauhen Metallfilmen erreicht, die an ein Substrat als ein Teil der Probenzelle der spektroskopischen Meßvorrichtung angefügt sind oder durch Einführen von metallischen Nanopartikeln oder Kolloiden als Teil einer Suspension in die Probenzelle. Die Probe wird dann auf diesen Metalloberflächen aufgetragen. SERS-Techniken können starke Intensitätssteigerungen um einen Faktor von bis zu 10¹⁴ bis 10¹⁶ liefern, jedoch nur für bestimmte Moleküle (beispielsweise Farbstoffmoleküle, Adenin, Hämoglobin und Tyrosin), was in der Nähe des Bereichs eines Einzelmolekülnachweis liegt (siehe Kneipp et al., Physical Review E, 57 (6): R6281-R6284 (1998); Nie et al., Science, 275: 1102 (1997)). Bei den meisten anderen Molekülen allerdings bleiben die Verstärkungen unter Verwendung von SERS-Techniken noch im Bereich von 10³ bis 10⁶, was weit unter dem Bereich liegt, der für einen Einzelmolekülnachweis notwendig ist.
Kohärente Anti-Stokes'sche Raman-Streuung (CARS) ist ein Vierwellen-Mischungsverfahren, das einen Pumpstrahl oder eine -Welle von Raman-Licht in Kombination mit einem Stokes'schen Strahl mit Mittelfrequenzen von ω_p bzw. ω_s( verwendet. Wenn ω_p-ω_s so eingestellt wird, daß es mit einem gegebenen Schwingungsmodus in einem Molekül in Resonanz ist, wird ein CARS-Signal von verstärkter Intensität aus dem sich ergebenen Streuungslicht bei der Anti-Stokes'schen Frequenz von 2ω_p-ω_s beobachtet. Anders als die spontane Raman-Streuung ist CARS hoch empfindlich und kann in Gegenwart einer Hintergrund-Fluoreszenz, die durch Ein-Photon-Anregung induziert wurde, nachgewiesen werden (siehe Cheng et al. J. Phys. Chem. 105: 1277 (2001)). Die CARS-Techniken liefern eine Intensitätssteigerung um einen Faktor von ungefähr 10⁵, was Wirkungsquerschnitte im Bereich von 10-²⁵ cm²/Molekül ergibt, was immer noch zu klein ist für den optischen Nachweis und die Spektroskopie von Einzelmolekülen.
Wenn theoretisch CARS und SERS-Techniken in Kombination verwendet werden, können Wirkungsquerschnitte von bis zu ungefähr 10^–21 bis 10^–16 cm²/Molekül durchgängig über ei nen breiten Bereich von Molekülen beobachtet werden. Steigerungen in diesem Bereich würden durchgängig im Bereich des Einzelmolekülnachweises liegen. Die Kombination von SERS und CARS, Oberflächen-verstärkter kohärenter Anti-Stokes'sche Raman-Spektroskopie (hier nachfolgend als SECARS bezeichnet) ist unter Verwendung der Metallfilm-SERS-Technik gezeigt worden (Chen et al. Phys. Rev. Lett. 43:946 (1979); Y.R. Shen, The Principles of Non-Linear Optics, John Willey & Sons, 1984, S. 492). Allerdings liegen die Steigerungen, die unter Verwendung dieser Metallfilmtechnik beobachtet wurden, nicht in dem Bereich, der einen Einzelmolekülnachweis ermöglicht. Steigerungen, welche die SERS-Metallfilmtechnik verwenden, sind im allgemeinen nicht so groß wie diejenigen, die für die SERS-Technik unter Verwendung von suspendierten Metallpartikeln beobachtet wurden. Um zusätzlich SECARS-Steigerungen um einen Faktor von 10⁹ bis 10¹⁸ oder mehr zu erreichen, müssen die speziellen Bedingungen auf jede Art von Molekül fein abgestimmt werden.
Ein Teil des Problems beim Realisieren dieser Steigerungen zum Nachweisen kleiner Anzahlen an Molekülen ist, daß die Fähigkeit, kleine Anzahlen von Molekülen nachzuweisen, ebenso eine Frage der Empfindlichkeit als auch des Hintergrundgeräuschs ist. Wenn ein bestimmtes fluoreszierendes Molekül in Lösung nachgewiesen werden soll, muß es vom Hintergrund, der mit dem Lösungsmittel verbunden ist, unterscheidbar sein. Um den Beitrag des Hintergrunds zu minimieren, müssen die kleinsten möglichen Probenvolumina verwendet werden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß der Hintergrund proportional zu dem Probenvolumen ist, während das Signal von einem Molekül von dem Probenvolumen unabhängig ist. Ein Raman-Nachweis von kleinen Anzahlen von Molekülen kann deshalb Probenvolumina von 10 pl oder weniger verwenden. Es besteht ein Bedarf an Verfahren zum Erhöhen von Signalverstärkungen von Molekülen, welche die Raman-Spektroskopie verwenden, und Vorrichtungen zum Verwenden von SECARS, um kleine Anzahlen von Molekülen nachzuweisen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Damit die Erfindung besser verstanden werden kann, werden etliche Ausführungen davon nun lediglich beispielhaft beschrieben unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen:
1 ist ein Schema eines synchronisierten SECARS-Systems, das verschiedene Optiken verwendet, um die Strahle zu fokussieren, und auch um das Raman-Streuungslicht aus der Probe zu sammeln, gemäß einer Ausführung der Erfindung;
2 zeigt den Bereich der Probenzelle von 1. Der Maßstab der Zeichnung ist derart, daß die Raman-aktiven Oberflächen innerhalb von Zehntel von Nanometern von dem Analyten positioniert sind, um die Steigerungen der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen.
3 ist ein SECARS-Spektrum von Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP) bei einer Konzentration von 100 Nanomolar. Dies entspricht ungefähr 1000 Molekülen von dAMP. A stellt das SECARS-Signal von dAMP bei 730 cm^–1 dar (was 742 mit mit einem 785 nm-Pumplaser entspricht) und erzeugt ungefähr 70.000 Counts. B stellt das Pumplasersignal bei 785 nm dar. C stellt das Stokes'sche Lasersignal bei 833 nm dar. Das Spektrum wurde für 100 Millisekunden aufgenommen. Der Pump- und der Stokes'sche Laser werden mit ∼2 Picosekunden gepulst. Die mittlere Leistung des Pumplasers betrug 500 mW, und die mittlere Leistung des Stokes'schen Lasers betrug 300 mW.
4 ist ein vergleichendes SERS-Spektrum von Desoxyadenosinmonophoshat (dAMP) bei derselben 100 nanomolaren Konzentration. A stellt das SERS-Signal von dAMP bei 730 cm^–1 dar (was 833 nm mit einem 785 nm-Pumplaser entspricht) und erzeugt nur ungefähr 1.500 Counts. Das Spektrum wurde für 100 Millisekunden aufgenommen. Der Pumplaser arbeitete im Continuous-Wave-Betrieb. Die mittlere Leistung des Pumplasers lag bei 500 mW, und der Stokes'sche Lasers wurde nicht verwendet.
5 ist ein vergleichendes CARS-Spektrum von Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP) ebenfalls bei einer Konzentration von 100 Millimolar. A stellt das CARS-Signal von dAMP bei 730 cm^–1 dar (was 742 nm mit einem 785 nm-Pumplaser entspricht), erzeugt ungefähr 2.500 Counts. B stellt das Pumplasersignal bei 785 nm dar. C stellt das Stokes'sche Lasersignal bei 833 nm dar. Das Spektrum wurde auch für 100 Millisekunden aufgenommen. Der Pump- und der Stokes'sche Laser wurden bei ∼2 Picosekunden gepulst. Die mittlere Leistung des Pumplasers betrug 500 mW, und die mittlere Leistung des Stokes'schen Lasers betrug 300 mW. Das CARS-Spektrum von 100 Nanomolar dAMP konnte mit einer spektralen Aufnahmezeit von 100 Millisekunden nicht erhalten werden.
6 zeigt das SECARS-Signal von dAMP und dGMP bei einer Konzentration von 90 pM.
7 zeigt das SECARS-Signal von Angiotensin I-Peptid bei einer Konzentration von 90 ng/μl.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Zu Zwecken der vorliegenden Offenbarung haben die vorliegenden Begriffe die folgenden Bedeutungen. Begriffe, die nicht definiert sind, werden gemäß ihrer einfachen und gewöhnlichen Bedeutung verwendet.
Wie hier verwendet, kann „ein", „eine" oder „eines" einen oder mehr als einen Gegenstand bedeuten.
Wie hier verwendet bedeutet „ungefähr" innerhalb von 10 Prozent eines Werts. Beispielsweise würde „ungefähr 100" einen Wert zwischen 90 und 110 bedeuten.
Wie hier verwendet, bedeutet eine „Vielzahl" eines Gegenstands zwei oder mehrere des Gegenstands.
Wie hier verwendet, ist ein „Mikrokanal" jeder Kanal mit einem Durchmesser des Querschnitts von zwischen einem Mikrometer (μm) und 999 μm, während ein „Nanokanal" jeder Kanal mit einem Durchmesser des Querschnitts von zwischen einem Nanometer (nm) und 999 nm ist. In bestimmten Ausführungen der Erfindung kann ein „Nanokanal" oder „Mikrokanal" ungefähr 999 μm oder weniger im Durchmesser betragen. Ein „Mikrofluidkanal" ist ein Kanal, in dem Flüssigkeiten sich durch mikrofluiden Fluß bewegen können. Die Wirkungen von Kanaldurchmesser, Fluidviskosität und Flußrate auf den mikrofluiden Fluß sind im Stand der Technik bekannt.
Wie hier verwendet, bedeutet „funktionsfähig gekoppelt", daß es eine funktionelle Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Einheiten einer Vorrichtung und/oder eines Systems gibt. Beispielsweise kann ein Raman-Detektor 195 „funktionsfähig gekoppelt" sein mit einer Durchflußzelle (Probenzelle) 175, einem Nanokanal, den Mikrokanal oder Mikrofluidkanal 185, wenn der Raman-Detektor 195 derart angeordnet ist, daß er Einzelmolekülanalyten 210, wie etwa Nukleotide, nachweisen kann, wenn sie die Probenzelle 175, den Nanokanal, den Mikrokanal oder Mikrofluidkanal 185 passieren. Auch kann beispielsweise ein Raman-Detektor 195 mit einem Computer 200 „funktionsfähig gekoppelt" sein, wenn der Computer 200 Daten von Raman-Signalen, die durch den Raman-Detektor nachgewiesen wurden, erhalten, bearbeiten, speichern und/oder übertragen kann.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Analyt" 210 jedes Atom, jede Chemikalie, jedes Molekül, jede Verbindung, Zusammensetzung oder jedes Aggregat von Interesse zum Nachweis und/oder Identifikation. Beispiele von Analyten schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Aminosäure, ein Peptid, Polypetid, Protein, Glycoprotein, Lipoprotein, Nukleosid, Nukleotid, Oligonukleotid, eine Nukleinsäure, ein Zucker, Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Polysaccharid, Fettsäure, Lipid, Hormon, einen Metaboliten, ein Cytokin, Chemokin, einen Rezeptor, Neurotransmitter, ein Antigen, Allergen, einen Antikörper, ein Substrat, einen Metaboliten, Cofaktor, Inhibitor, einen Arzneistoff, ein Pharmazeutikum, einen Nährstoff, einen Prion, Toxin, Gift, einen Sprengstoff, ein Pestizid, ein chemisches Kampfmittel, ein biologisch gefährliches Mittel, Radioisotop, Vitamin, eine heterozyklisch aromatische Verbindung, ein Carcinogen, Mutagen, Narkotikum, Amphetamin, Barbiturat, Halocinogen, Abfallprodukt und/oder Verunreinigung ein. In bestimmten Ausführungen der Erfindung können ein oder mehrere Analyten mit einem oder mehreren Raman-Markierungen markiert sein, wie unten offenbart.
Der Begriff „Markierung" wird verwendet, um auf jedes Atom, Molekül, jede Verbindung oder Zusammensetzung Bezug zu nehmen, die verwendet werden kann, um einen Analyten 210 zu identifizieren, an den die Markierung angefügt ist. In verschiedenen Ausführungen der Erfindung kann eine derartige Anfügung entweder covalent oder nicht-covalent sein. In nicht beschränkenden Beispielen können die Markierungen fluoreszierend, phosporeszierend, lumineszierend, elektrolumineszierend, chemolumineszierend, sein, oder jede sperrige Gruppe oder können Raman- oder andere spektroskopische Charakteristika aufweisen.
Eine „Raman-Markierung" kann jedes organische oder inorganische Molekül, Atom, jeder Komplex oder jede Struktur sein, die in der Lage ist, ein nachweisbares Raman-Signal zu erzeugen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, synthetische Moleküle, Farbstoffe, natürlicherweise vorkommende Pigmente, wie etwa Phycoerythrin, organische Nanostrukturen, wie etwa C₆₀, „Buckyballs" und Kohlenstoffnanotubes, Metallnanostrukturen, wie etwa Gold- oder Silber-Nanopartikel oder Nanoprismen, und Halbleiter im Nanomaßstab, wie etwa Quanten-Dots. Zahlreiche Beispiele von Raman-Markierungen werden unten offenbart. Derjenige, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, wird realisieren, daß derartige Bespiele nicht beschränkend sind, und daß „Raman-Markierung" jedes organische oder anorganische Atom, Molekül, jede Verbindung oder Struktur, die im Stand der Technik bekannt ist, umfaßt, die bzw. das durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen werden kann.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „nanokristallines Silicium" auf Silicium, das Siliciumkristalle im Nanometermaßstab umfaßt, typsicherweise im Größenbereich von 1 bis 100 Nanometern (nm). „Poröses Silicium" 220 bezieht sich auf Silicium, das geätzt oder auf andere Weise behandelt wurde, um eine poröse Struktur zu bilden.
Oberflächen-verstärkte kohärente Anti-Stokes'sche Raman-Spektroskopie
Eine Ausführung der Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweisen einer kleinen Anzahl von Molekülen unter Verwendung der Oberflächen-verstärkten kohärenten Anti-Stokes'schen Raman-Spektroskopie (hier nachfolgend als „SECARS" bezeichnet) – eine Kombination von Oberflächen-verstärkter Raman-Spektroskopie (hier nachfolgend als „SERS" bezeichnet) mit der kohärenten Anti-Stokes'schen Raman-Streuung (hier nachfolgend als „CARS" bezeichnet). Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung umfaßt das Abgeben von sowohl einem Stokes-Licht als auch einem Pumplicht von verschiedenen Raman-Wellenlängen in einem Zielbereich, der durch die Grenzfläche zwischen den nachzuweisenden und/oder den zu identifizierenden Molekülen definiert ist und einer Raman-aktiven Oberfläche. Kleine Anzahlen von Molekülen schließen weniger als ungefähr 10⁷ vorzugsweise weniger als ungefähr 10⁶, vorzugsweise weniger als ungefähr 10⁵, vorzugsweise weniger als ungefähr 10⁴, vorzugsweise weniger als ungefähr 10³, vorzugsweise weniger als ungefähr 10², vorzugsweise weniger als ungefähr 10, vorzugsweise weniger als, vorzugsweise ein Molekül und Bereiche dazwischen ein. In einer Ausführung ist eine Raman-aktive Oberfläche funktionsfähig an eine oder mehrere Raman-Nachweiseinheiten 195 gekoppelt.
Bezugnehmend auf 1 stellt die Vorrichtung in einer Ausführung zwei Einlaß-Anregungsstrahlen oder -Wellen 130 und 135 von elektromagnetischer Strahlung von Quellen 120 bzw. 125 zur Verfügung. Diese Quellen können individuell eine gewöhnliche Lichtquelle umfassen, mit geeigneten Filtern und Kollimatoren, oder vorzugsweise werden diese Quellen durch zwei Diodenlaser, Festkörperlaser, Ionenlaser oder derartigem verfügbar gemacht. Diese Laser können von jeder speziellen Größe sein. Da es jedoch wünschenswert ist, die Verfahren der Erfindung als Teil einer Mikrovorrichtung auszuführen, ist die Verwendung von Mikrolasern bevorzugt. Geeignete Quellen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine 514,5 nm Linie eines Argon-Ionenlasers von SpectraPhysics, Model 166, eine 647,1 nm-Linie eines Krypton-Ionenlasers (Innova 70, Coherent); einen Stickstofflaser bei 337 nm (Laser Science Inc.); einen Helium-Cadmiumlaser bei 325 nm (Liconox; siehe US-Patent Nr. 6,174,677); einen ND:YLF-Laser und/oder verschiedene Ionenlaser und/oder Farbstofflaser; Vertical-Cavity-Surface-Emitting-Lasers („VCSEL") (Honeywell, Richardson, TX; oder Schott, Southbridge, MA); andere Mikrolaser, wie etwa Nanowire-Laser (siehe Huang et al. Science 292:1897 (2001)); einen frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser bei einer Wellenlänge von 532 nm oder einen frequenzverdoppelten Ti:Saphir-Laser 370 bei jeder Wellenlänge zwischen 700 nm und 1.000 nm; oder eine lichtemittierende Diode ein.
Die Signalstärke von Oberflächen-verstärkter CARS hängt von der Stärke des Einlaß-Pumpstrahls ab. Allerdings ist die maximale Laserintensität an der Grenzfläche häufig durch optische Schädigung begrenzt. Aus diesem Grund ist zu bevorzugen, einen kürzeren gepulsten Pumplaserstrahl zu verwenden, der eine große Peakleistung aufweist, anstelle eines herkömmlichen Continuous-Wave-Laserstrahls. Continuous-Wave-Laser („CW"-Laser) liefern typischerweise Mikrowatts bis zu einem Watt bei großen Peakleistungsniveaus, während gepulste Laser Kilowatt bis Gigawatt bei großen Peakleistungsniveaus liefern, wenn sie bei derselben mittleren Leistung betrieben werden. Dies ergibt stärkere Signale, die unterhalb der Schwelle des optischen Schadens liegen. Die Breite der Pulse liegt im Bereich von ungefähr 100 Nanosekunden bis ungefähr 80 Femtosekunden. Typischerweise liefern die Pulsbreiten von ungefähr 100 Femtosekunden bis ungefähr sieben Picosekunden die besten Ergebnisse, was von der Peakleistung und der Spektrallinienbreite des Strahls abhängt.
Gepulste Laserstrahlen oder CW-Laserstrahlen können verwendet werden. Wenn ein Laser verwendet wird, müssen die Eingangsstrahlen auch synchronisiert werden, um eine Überlappung der Strahlen zu garantieren. Dies kann durch eine geeignete Lasersteuerung oder eine andere Art von Synchronisationselektronik 110 erreicht werden. Beispiele für kommerziell verfügbare Elektronik, die verwendet werden kann, schließt ein, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Lok-to-Clock-Vorrichtung (Spectra-Physics) oder eine SynchroLock-Vorrichtung (Cohererent). Diese elektronischen Vorrichtungen können zusätzliche Photodioden und Strahlteiler für ihren Betrieb erfordern, die in den Figuren nicht dargestellt sind. Eine alternative Ausführung verwendet einen optischen parametrischen Oszillator (OPO), der einen Einzellaserstrahleinlaß verwendet und zwei synchronisierte Strahle bei verschiedenen abgleichbaren Wellenlängen erzeugt.
Der Wellenvektor der Pumpwelle kann justiert werden, um die mit der Oberflächen-Phasen-Anpaß-Bedingung zu erfüllen: 2k1 – k2 = ka (ωa) = K'(ωa)wobei k₁ der Wellenvektor des ersten Strahls ist; k₂ der Wellenvektor des zweiten Strahls ist; k_a (ω_a) der Wellenvektor des Anti-Stokes'schen Signals ist; und K'(ω_a) der Wellenvektor der Oberflächen-EM-Welle ist.
Es gibt verschiedene Arten, um diese zwei Lichtstrahlen an die Probe abzugeben. Wie in 1 dargestellt, kann eine Ausführung einer SECARS-Vorrichtung entweder Standard-Full Field-Optik oder konfokale Optik, wie etwa eine Serie von Spiegeln 145 und 150, verwenden und einen dichroitischen Spiegel 155 und/oder Prismen 140, um die Einlaßstrahlen 130 und 135 in die Probenzelle zu lenken. Die Strahlen können durch eine hemizylindrische (rechtwinklig oder äquilateral) Linse oder Objektivlinse 160, die aus transparentem Material, wie etwa Glas oder Quartz hergestellt ist, fokussiert werden. Beispiele derartiger fokussierender Linsen schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroskop-Objektivlinsen, verfügbar von Nikon, Zeiss, Olympus und Newport, wie etwa eine 6X Objektivlinse (Newport, Modell L6X) oder 100X Objektivlinse (Nikon, Epi 100X Achromat). Die fokussierende Linse 160 wird verwendet, um den Anregungsstrahl auf den Bereich zu fokussieren, der die Ramanaktive Oberfläche und den Analyten enthält, und auch, um das Raman-Streulicht aus der Probe zu sammeln.
Diese Strahlen können wahlweise andere Vorrichtungen passieren, welche die Eigenschaften der Strahlen ändern oder das Hintergrundsignal reduzieren, wie etwa ein Polarisator, ein Spalt, zusätzliche Linsen, ein holographischer Strahlenteiler und/oder Sperrfilter, Monochromator, dichroitische Filter, Bandpaßfilter, Spiegel, Grenzfilter und konfokale Nadellöcher oder derartiges. Beispielsweise erzeugt ein holographischer Strahlenteiler (Kaiser Optical Systems, Inc., Modell HB 647-26N18) eine rechtwinklige Geometrie für den Anregungsschall 135 und das emittierte Raman-Signal. Ein holographischer Sperrfilter (Kaiser Optical Systems, Inc.) kann verwendet werden, um die Rayleigh-gestreute Strahlung zu reduzieren. Auf ähnliche Weise kann/können die Anregungsstrahl(en) 130 und 135 spektral gereinigt werden, beispielsweise mit einem Bandpaßfilter (Corion).
Die fokussierende Linse fokussiert das Licht 165 in eine optisch durchlässige Probenzelle 175, die genauer in den 2A und B gezeigt ist. Wie in den 2A und B gezeigt, wird das Licht in einen Bereich fokussiert, der eine Grenzfläche zwischen dem nachzuweisenden Analyten, allgemein gezeigt als 210, und einer Raman-aktiven Oberfläche, die unten genauer beschrieben wird, enthält.
Bestimmte Ausführungen der Erfindung betreffen die Verwendung von Raman-Oberlächen von verschiedenen Formen. Beispielsweise schließen Raman-aktive Oberflächen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, eine metallische Oberfläche 220 und 230, oder 270 und 280, wie etwa eine oder mehrere Schichten eines nanokristallinen und/oder porösen Siliciums, beschichtet mit einem Metall oder anderem leitfähigen Material; einen Partikel 240, wie etwa einen metallischen Nanopartikel; ein Aggregat von Partikeln 250, wie etwa ein metallisches Nanopartikelaggregat; ein Kolloid von Partikeln (240 mit ionischen Verbindungen 260), wie etwa ein metallisches Nanopartikelkolloid; oder Kombinationen davon.
Der Anti-Stokes'sche Strahl der Strahlung 190, die von der Grenzfläche zwischen dem Analyten und der Raman-aktiven Oberfläche emittiert wird, tritt aus der Probenzelle aus und wandert als kohärenter Strahl, der durch die konfokale oder Standardoptik gesammelt wird und wahlweise mit einem Monochromator zur spektralen Trennung gekoppelt ist. Der Strahl wird mit einer Raman-Detektoreinheit 195 nachgewiesen. Der hochgradig gerichtete Ausgang des Anti-Stokes'schen Strahl erlaubt seinen Nachweis selbst in Gegenwart eines stark lumineszierenden Hintergrunds.
Raman-Detektoreinheit
Die Raman-Detektoreinheit ist nicht besonders wichtig und kann jeder gewöhnliche optische Detektor mit ausreichender Empfindlichkeit und Geschwindigkeit sein, um kleine Anzahlen an Molekülen eines bestimmten Analyten nachzuweisen. Eine Empfindlichkeit, die mit der von gekühlten, Ladungs-gekoppelten Vorrichtungs- (charge coupled device, „CCD")-Arrays vergleichbar ist, ist ausreichend. Die Detektionsgeschwindigkeit liegt im Bereich von Millisekunden bis Nanosekunden. Die Raman-Detektoreinheit kann einen Detektor mit großer oder kleiner Fläche, einer Anordnung von Dektoren oder derartiges umfassen. Beispiele derartiger Dektoren schließen Photodioden, Lawinen-Photodioden, CCD-Anordnungen, komplementäre Metalloxid-Halbleiter (complementary metal oxide semiconductur, „CMOS")-Anordnungen, verstärkte CCDs (intensified CCDs) und derartiges ein. CCD, CMOS und Lawinen-Photodioden werden bevorzugt. Der Differentialdetektor 195 erzeugt elektrische Ausgangssignale, was auf die Veränderung der Lichtintensität mit einer Position quer zur Anti-Stokes'schen Welle oder dem Strahl 190 hinweist, wobei der SECARS-Effekt vorgibt, daß eine starke Absorption bei einem bestimmten Winkel oder einer Intensität auftritt, wie durch das Material in der zu untersuchenden Probe bestimmt wird. Diese elektrischen Signale werden abgetastet/gezählt und digitalisiert und über eine zugehörige Schaltung (nicht gezeigt) in eine geeignete Daten analysierende Anordnung (gemeinsam 200) eingespeist, die ein Informationsverarbeitungs- und Steuersystem oder einen Computer einschließt.
Beispiele einer Raman-Detektoreinheit 195 schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Spex Modell 1403 Doppelgitterspektrometer mit einer Gallium-Arsenid-Photomultiplier-Röhre, die als ein Einzelphoton-zählendes Modell betrieben wird (RCA Modell C31034 oder Burle Indus. Modell C3103402; siehe US-Patent Nr. 5,306,403); ein ISA HR-320 Spektrograph, ausgerüstet mit einer rot verstärkten intensivierten Ladungs-gekoppelten Vorrichtung (red-enhanced intensified charge-coupled device, „RE-ICCD")-Detektorsystem (Princeton Instruments); Fourier-Transformationsspektrographen (auf der Grundlage von Michaelson-Interferometern), geladenen Injektionsvorrichtungen; Photodiodenanordnungen, einschließlich Lawinen-Photodiodenanordnungen; InGaAs-Detektoren; Elektronen-vervielfachten CCD; intensivierten CCD und/oder Phototransistoranordnungen.
Informationsverarbeitung und Steuersystem oder Computer und Datenanalyse
Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung kann die Vorrichtung ein Informationsverarbeitungssystem oder einen Computer 200 umfassen. Die offenbarten Ausführungen sind nicht auf den verwendeten Typen des Informations-verarbeitenden Systems oder Computers 200 beschränkt. Ein beispielhaftes Informations-verarbeitendes System oder ein Computer kann einen Bus zum Kommunizieren von Information umfassen und einen Prozessor zum Verarbeiten von Information. In einer Ausführung der Erfindung ist der Prozessor ausgewählt aus der Pentium^®II-Familie von Prozessoren, einschließlich ohne Beschränkung auf die Pentium II-Familie die Pentium^®III-Familie und die Pentium 4-Familie von Prozessoren, die von Intel Corp. (Santa Clara, CA) verfügbar sind. In alternativen Ausführungen der Erfindung kann der Prozessor ein Celeron^®, ein Itanium^® oder ein Pentium Xeon^®Prozessor (Intel Corp. Santa Clara, CA) sein. In verschiedenen anderen Ausführungen der Erfindung kann der Prozessor auf einer Intel^®Architektur beruhen, wie etwa einer Intel^®IA-32 oder Intel^®IA-64-Architektur. Alternativ können andere Prozessoren verwendet werden.
Das Informationsverarbeitungs- und Steuerungssystem oder Computer 200 kann weiterhin ein „Random Access Memory (RAM)" oder andere dynamische Speichervorrichtung, ein „Nur-Lese-Speicher" (ROM) oder einen anderen statischen Speicher und eine Datenspeichervorrichtung wie etwa eine magnetische Diskette oder optische Diskette und ihre entsprechenden Laufwerke umfassen. Das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem oder der Computer 200 kann weiterhin jede Peripherievorrichtung umfassen wie etwa einen Speicher, ein Anzeigegerät (z. B. eine Cathodenstrahlröhre oder eine Flüssigkristallanzeige („Liquid Crystal Display, LCD)), eine alphanumerische Eingabevorrichtung (z. B. eine Tastatur), eine Cursor-Steuervorrichtung (z. B. Maus, Trackball oder Cursor-Führungsschlüssel) und eine Kommunikationsvorrichtung (z. B. Modem, Netzwerk-Schnittstellen-Karte oder Schnittstellen-Vorrichtung, die zur Kopplung mit einem Ethernet, einem Token-Ring oder anderen Arten von Netzen verwendet wird).
Daten von der Detektionselement 195 können durch den Prozessor bearbeitet und die Daten in dem Speicher, wie etwa dem Hauptspeicher, gespeichert werden. Daten auf Emissionsprofilen für Standardanalyte können ebenfalls im Speicher gespeichert werden, wie etwa einem Hauptspeicher oder in einem ROM. Der Prozessor kann die Emissionsspektren aus der Probe von Analytmolekülen 210 und der Raman-aktiven Oberflächen verglichen werden, um die Art von Analyt(en) in der/den Probe(n) zu identifizieren. Beispielsweise kann das Informationsverarbeitende System Verfahren, wie etwa eine Subtraktion von Hintergrundsignalen und einer „Base Calling"-Bestimmung ausführen, wenn überlappende Signale als Teil einer Nukleotididentifizierung nachgewiesen werden. Es wird begrüßt, daß ein anders ausgerüsteter Computer 200 für bestimmte Implementationen verwendet werden kann. Deshalb kann die Konfiguration des Systems bei verschiedenen Ausführungen der Erfindung variieren.
Während die hier offenbarten Verfahren unter der Steuerung eines programmierten Prozessors ausgeführt werden können, können bei alternativen Ausführungen der Erfindung die Verfahren vollständig oder teilweise durch jede programmierbare oder fest programmierte Logik, wie etwa „Field Programmable Gate Arrays" (FPGAs), TTL-Logik oder „Application Specific Intergrated Circuits" (ASICs) implementiert werden. Zusätzlich können die offenbarten Verfahren durch jede Kombination aus Bestandteilen von programmierten Computern 200 zu allgemeinen Zwecken und/oder Kunden-spezifischen Hardware-Bestandteilen ausgeführt werden.
Nach der Datenerfassungsoperation werden die Daten typischerweise an eine Datenanalyseoperation berichtet. Um die Analyseoperation zu erleichtern, werden die Daten, die durch die Detektionseinheit 195 erhalten wurden, typischerweise unter Verwendung eines digitalen Computers, wie dem oben beschriebenen, analysiert. Typischerweise wird der Computer für den Empfang und die Speicherung der Daten aus der Detektionseinheit 195 ebenso wie zur Analyse und Berichten der erfaßten Daten geeignet programmiert sein.
In bestimmten Ausführungen der Erfindung können die Kunden-spezifisch entworfenen Software-Pakete verwendet werden, um die Daten zu analysieren, die von der Detektionseinheit 195 erhalten wurden. In alternativen Ausführungen der Erfindung kann die Datenanalyse unter Verwendung eines Informations-verarbeitenden Systems oder eines Computers 200 und frei verfügbaren Software-Paketen ausgeführt werden. Nicht beschränkende Beispiele von verfügbarer Software für die DNA-Sequenzanalyse schließen die PRISM^TM DNA Sequencing Analysis Software (Applied Biosystems, Foster City, CA), das Sequencher^TM-Paket (Gene Codes, Ann Arbor, MI) und eine Vielfalt von Software-Paketen, die über die National Biotechnology Information Facility auf der Website www.nbif.org/links/1.4.1.php verfügbar sind.
Raman-aktive Oberflächen
A. Nanopartikel, Aggregate und Kolloide
In bestimmten Ausführungen der Erfindung wird die Raman-aktive Oberfläche durch Nanopartikel 240 verfigbar gemacht, die alleine oder in Kombination mit anderen Raman-aktiven Oberflächen, wie etwa einem Metall-beschichteten porösen Siliciumsubstrat 220 mit 230 verwendet werden, um das Raman-Signal, das von kleinen Anzahlen an Molekülen eines Analyten 210 erhalten wurde, weiter zu verstärken. In verschiedenen Ausführungen der Erfindung sind die Nanopartikel Silber-, Gold-, Platin-, Kupfer-, Aluminum- oder andere leitfähige Materialien, obwohl alle Nanopartikel, die in der Lage sind, ein SECARS-Signal zu liefern, verwendet werden können. Partikel aus Silber oder Gold werden besonders bevorzugt.
Die Partikel- oder Kolloid-Oberflächen können von verschiedenen Formen und Größen sein. Bei verschiedenen Ausführungen der Erfindung werden Nanopartikel von zwischen 1 Nanometer (nm) und 2 Mikrometern (μm) im Durchmesser verwendet. In alternativen Ausführungen der Erfindung können Nanopartikel von 2 nm bis 1 μm, 5 nm bis 500 nm, 10 nm bis 200 nm, 20 nm bis 100 nm, 30 nm bis 80 nm, 40 nm bis 70 nm oder 50 nm bis 60 nm im Durchmesser verwendet werden. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können Nanopartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 50 nm, 50 bis 100 nm oder ungefähr 100 nm verwendet werden. Falls in Kombination mit einer anderen Raman-aktiven Oberfläche, wie etwa einem Metall-beschichteten porösen Siliciumsubstrat verwendet, wird die Größe der Nanopartikel von der anderen verwendeten Oberfläche abhängen. Beispielsweise der Durchmesser der Poren in dem Metall-beschichteten porösen Silicium 220 mit 230 und kann ausgewählt sein, damit die Nanopartikel in das Innere der Poren passen.
Die Nanopartikel können annähernd sphärisch, zylindrisch, dreieckig, stabartig, kantig, facettenreich, ein Prisma oder spitz in der Form sein, obwohl Nanopartikel von jeder regulären oder irregulären Form verwendet werden können. Verfahren zum Herstellen von Nanopartikeln sind bekannt (siehe z. B. US-Patente Nr. 6,054,495; 6,127,120; 6,149,868; Lee and Meisel, J. Phys. Chem. 86:3391-3395, 1982). Nanoprismen werden beschrieben in Jin et al., „Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms", Science 294:1901, 2001. Nanopartikel können auch aus kommerziellen Quellen bezogen werden (z. B. Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA).
Kolloide und Aggregate
Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können die Nanopartikel einzelne Nanopartikel 240 und/oder Zufallskolloide von Nanopartikeln (240 mit ionischen Verbindungen 260) sein. Kolloide von Nanopartikeln werden durch Standardtechniken, wie etwa durch Zugabe ionischer Verbindungen 260, wie etwa NaCl, zu den Nanopartikeln 240 synthetisiert (siehe Lee and Meisel, J. Phys. Chem 86:3391 (1982); J. Hulteen, et al., "Nanosphere Lithography: A materials general fabrication process for periodic particle array surfaces", J. Vac. Sci. Technol. A. 13:1553-1558 (1995)).
Die Aggregation kann durch den „Depletionsmechanismus" induziert werden, wobei die Zugabe von nicht-adsorbierenden Nanopartikeln wirksam zu einem Anziehungspotential aufgrund der Depletion der Nanopartikeln aus dem Bereich zwischen zwei sich eng annähernden Nanopartikeln fuhrt (siehe J. Chem. Phys., 110(4): 2280 (1999)).
Bei anderen Ausführungen der Erfindung können Nanopartikel 240 quervernetzt werden, um bestimmte Aggregate von Nanopartikeln 250, wie etwa Dimere, Trimere, Tetramere oder andere Aggregate hervorzubringen. Die Bildung von „Hot Spots" zur SECARS-Detektion kann mit bestimmten Aggregaten 250 oder Kolloiden (240 mit ionischen Verbindungen 260) von Nanopartikeln einhergehen. Bestimmte Ausführungen der Erfindung können heterogene Mischungen von Aggregaten oder Kolloiden von unterschiedlicher Größe sein, während andere Ausführungen homogene Populationen von Nanopartikeln 240 und/oder Aggregaten 250 oder Kolloiden (240 mit ionischen Verbindungen 260) verwendet werden können. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können Aggregate, die eine ausgewählte Anzahl an Nanopartikeln 250 (Dimeren, Trimeren, etc.) durch bekannte Techniken angereichert oder gereinigt werden, wie etwa Ultrazentrifugation in succrose Gradientenlösungen. Bei verschiedenen Ausführungen der Erfindung werden Nanopartikelaggregate 250 oder Kolloide (240 mit ionischen Verbindungen 260) von ungefähr 100, 200, 300 400, 500, 600, 700, 800, 900 bis 100 nm Größe oder größer verwendet. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können Nanopartikelaggregate 250 oder Kolloide (240 mit ionischen Verbindungen 260) eine Größe zwischen ungefähr 100 nm und ungefähr 200 nm aufweisen.
Verfahren zum Quervernetzen von Nanopartikeln, um Aggregate zu bilden, sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Feldheim, „Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges", The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, S. 22-25). Beispielsweise können Gold-Nanopartikel quervernetzt werden, beispielsweise unter Verwendung von bifunktionellen Linkerverbindungen, die terminale Thiol- oder Sulfhydryl-Gruppen tragen (Feldheim, 2001). Bei manchen Ausführungen der Erfindung kann eine einzelne Linkerverbindung mit Thiolgruppen an beiden Enden derivatisiert werden. Nach der Reaktion mit Gold-Nanopartikeln würde der Linker Nanopartikeldimere bilden, die durch die Länge von dem Linker getrennt werden. Bei anderen Ausführungen der Erfindung können Linker mit drei, vier oder mehreren Thiolgruppen verwendet werden, um gleichzeitig an eine Vielzahl von Nanopartikeln angeheftet zu werden (Feldheim, 2001). Die Verwendung eines Überschusses an Nanopartikeln gegenüber den Linkerverbindungen verhütet eine Bildung von multiplen Quervernetzungen und einer Nanopartikelpräzipitation. Aggregate von Silber-Nanopartikel können auch durch Standard-Syntheseverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gebildet werden.
In anderen Ausführungen der Erfindung können die Aggregate 250 von Nanopartikeln 240 oder Kolloide (240 mit ionischen Verbindungen 260) covalent an eine molekulare Probe eines Analyten 210 angeheftet sein. Bei alternativen Ausführungen der Erfindung kann die molekulare Probe des Analyten 210 direkt an die Nanopartikel 240 angeheftet sein oder sie können an Linkerverbindungen angeheftet sein, die covalent oder nicht covalent an die Nanopartikelaggregate 250 gebunden sind.
Verschiedene Verfahren, die für das Quervernetzen von Nanopartikeln bekannt sind, können auch verwendet werden, um ein Molekül/Moleküle eines Analyten 210 an Nanopartikel oder andere Raman-aktive Oberflächen anzufügen. Es wird in Erwägung gezogen, daß die Linkerverbindungen, die verwendet werden, um ein Molekül/Moleküle eines Analyten 210 anzuheften, von nahezu jeder Länge im Bereich von ungefähr 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 80, 90 bis 100 nm oder sogar mehr Länge sind. Bei bestimmten Ausführungsoptionen der Erfindung können Linker mit heterogener Länge verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform der offenbarten Erfindung kann das Molekül/die Moleküle eines Analyten 210 an Nanopartikel 240 angeheftet sein, wenn sie einen Kanal 185 abwärts wandern, um einen Molekül-Nanopartikel-Komplex zu bilden. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung kann die Länge der Zeit, die dafür zur Verfügung steht, damit die Quervernetzungsreaktion abläuft, sehr begrenzt sein. Derartige Ausführungen können hoch reaktive quervernetzende Gruppen mit raschen Reaktionsgeschwindigkeiten verwenden, wie etwa Epoxidgruppen, Azidogruppen, Arylazidogruppen, Triazingruppen oder Diazogruppen. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können die quervernetzenden Gruppen durch Aussetzen von intensivem Licht wie etwa einem Laser photoaktiviert werden. Beispielsweise führt eine Photoaktivierung von Diazo- oder Azidoverbindungen zu der Bildung von hoch reaktiven Carben- bzw. Nitrenresten. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können die reaktiven Gruppen derart ausgewählt sein, damit sie die Nanopartikel 240 nur an einen Analyten 210 anheften, anstatt die Nanopartikel 240 miteinander querzuvernetzen. Die Auswahl und Herstellung von reaktiven quervernetzenden Gruppen, die in der Lage sind, an einen Analyten 210 zu binden, ist im Stand der Technik bekannt. Bei alternativen Ausführungen der Erfindung können die Analyten 210 selbst covalent modifiziert sein, beispielsweise mit einer Sulflrydrylgruppe, die sich an Gold-Nanopartikel 240 anhängen kann.
Bei anderen Ausführungen der Erfindung können die Nanopartikel oder andere Ramanaktiven Oberflächen mit derivatisierten Silanen, wie etwa Aminosilan, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOP) oder Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) beschichtet sein. Die reaktiven Gruppen an den Enden der Silane können verwendet werden, um quervernetzte Aggregate von Nanopartikeln 240 zu bilden. Es wird in Betracht gezogen, daß die verwendeten Linkerverbindungen beinahe jede Länge im Bereich von 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 bis 100 nm oder sogar mehr Länge sind. Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung können Linker von heterogener Länge verwenden. Derart modifizierte Silane können auch covalent an Analyten 210 unter Verwendung von Standardverfahren angehängt werden.
Bei einer anderen alternativen Ausführung der Erfindung können die Nanopartikel modifiziert sein, um verschiedene reaktive Gruppen zu enthalten, bevor sie an Linkerverbindungen angefügt werden. Modifizierte Nanopartikel sind kommerziell erhältlich, wie etwa die Nanogold^®-Nanopartikel von Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY). Nanogold^®-Nanopartikel können mit entweder einzelnen oder multiplen Maleimid-Amid- oder anderen Gruppen, die an jeden Nanopartikel angefügt sind, bezogen werden. Die Nanogold^®-Nanopartikel sind auch verfügbar entweder in positiv oder negativ geladener Form, um eine Manipulation von Nanopartikeln in einem elektrischen Feld zu erleichtern. Derart modifizierte Nanopartikel können an eine Vielzahl von bekannten Linkerverbindungen angefügt werden, um Dimere, Trimere oder andere Aggregate von Nanopartikeln verfügbar zu machen.
Die Art von verwendeter Linkerverbindung ist nicht begrenzend, soweit sie zu einer Produktion von kleinen Aggregaten von Nanopartikeln 250 und/oder Analyten führt, die in Lösung nicht präzipitieren werden. Bei einigen Ausführungen der Erfindung kann die Linkergruppe Phenylacetylenpolymere umfassen (Feldheim, 2001). Alternativ können Linkergruppen Poly tetrafluorethylen, Polyvinylpyrrolidon, Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylamid, Polyethylen oder andere bekannte Polymere umfassen. Die Linkerverbindungen, die von Nutzen sind, sind nicht auf Polymere beschränkt, sondern können auch andere Arten von Molekülen, wie etwa Silanen, Alkanen, derivatisierten Silanen oder derivatisierten Alkanen einschließen. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können Linkerverbindungen von relativ einfacher chemischer Struktur, wie etwa Alkanen oder Silanen, verwendet werden, um eine Interferenz mit den durch einen Analyten emittierten Raman-Signalen zu vermeiden.
Alternativ können die verwendeten Linkerverbindungen eine einzelne reaktive Gruppe, wie etwa eine Thiolgruppe, enthalten. Nanopartikel, die eine einzelne angefügte Linkerverbindung enthalten, können zu Dimeren selbst aggregieren, beispielsweise durch eine nicht covalente Wechselwirkung von Linkerverbindungen, die an zwei verschiedene Nanopartikel angefügt sind. Beispielsweise können die Linkerverbindungen Alkanthiole umfassen. Nach dem Anfügen der Thiolgruppe an Gold-Nanopartikel werden die Alkangruppen dazu neigen, durch hydrophobe Interaktion zu assoziieren. Bei anderen alternativen Ausführungen der Erfindung können die Linkerverbindungen verschiedene funktionelle Gruppen an jedem Ende enthalten. Beispielsweise könnte eine Linkerverbindung eine Sulfhydrylgruppe an einem Ende enthalten, um ein Anfügen an Gold-Nanopartikel zu erlauben, und eine andere reaktive Gruppe an dem anderen Ende, um ein Anfügen an andere Linkerverbindungen zu erlauben. Viele derartige reaktive Gruppen sind im Stand der Technik bekannt und können bei dem vorliegenden Verfahren und dem Gerät verwendet werden.
Bei anderen Ausführungen der Erfindung ist ein Analyt 210 eng mit der Oberfläche der Nanopartikel 240 assoziiert oder kann auf andere Weise in nahe Nachbarschaft zu den Nanopartikeln 240 (zwischen ungefähr 0,2 und 1,0 nm) sein. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „nahe assoziiert mit" auf eine molekulare Probe eines Analyten, der an eine Ramanaktive Oberfläche angefügt (entweder covalent oder nicht-covalent) oder adsorbiert ist. Der Fachmann wird erkennen, daß ein covalentes Anfügen einer molekularen Probe eines Analyten 210 an Nanopartikel 240 nicht erforderlich ist, um ein Oberflächen-verstärktes Raman-Signal durch SECARS zu erzeugen.
B. Metall-beschichtetes und nicht-Metall-beschichtetes kristallines und/oder poröses Silicium
Verschiedene Verfahren zum Herstellen von rauhen Oberflächen oder Oberflächen mit großer Oberflächenausdehnung, wie etwa nanokristallines Silicium, sind im Stand der Technik bekannt (z. B. Petrova-Koch et al., „Rapid-thermal-oxidized porous solicon – the superior photoluminescent Si", Appl. Phys. Lett. 61:943, 1992; Edelberg et al., "Visible luminescence from nanocrystalline silicon films produced by plasma enhanced chemical vapor deposition", Appl. Phys. Lett., 68: 1415-1417, 1996; Schoenfeld, et al., "Formation of Si quantum dots in nanocrystalline silicon", Proc. 7th Int. Conf. on Modulated Semiconductor Structures, Madrid, S. 605-608, 1995; Zhao, et al., "Nanocrystalline Si: a material constructed by Si quantum dots", 1^st Int. Conf. on Low Dimensional Structures and Devices, Singapore, S. 467-471, 1995; Lutzen et al., "Structural characteristics of ultrathin nanocrystalline silicon films formed by annealing amorphous silicon", J. Vac. Sci. Technology B 16:2802-05, 1998; US-Patente Nr. 5,770,022; 5,994,164; 6,268,041; 6,294,442; 6,300,193). Die hier offenbarten Verfahren und das Gerät sind nicht durch das Verfahren zum Herstellen von rauhen oder Substraten mit großer Oberflächenausdehnung begrenzt, und es wird in Betracht gezogen, daß jedes bekannte Verfahren verwendet werden kann.
Beispielsweise schließen Verfahren zum Herstellen von nanokristallinem Silicium folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Silicium (Si)-Implantation in ein Silicium-reiches Oxid und Härten; Festphasekristallisation mit Metall-Keimbildungskatalysatoren; chemische Gasphasenabscheidung; PECVD (Plasma enhanced chemical vapor deposition); Gasevaporation; Gasphasepyrolyse; Gasphasephotopyrolyse; elektrochemisches Ätzen; Plasmaabau von Silanen und Polysilanen; Druck-Flüssigkeitsphase-Reduktion/Oxidation-Reaktionen; schnelles Härten von amorphen Siliciumschichten; Abscheiden einer amorphen Siliciumschicht unter Verwendung von LPCVD (low pressure chemical vapor deposition), gefolgt durch RTA (rapid thermal anneal)-Zyklen; Plasmalichtbogenabscheidung unter Verwendung einer Siliciumanode und Laserabtragung von Silicium (US-Patente Nr. 5,770,022; 5,994,164; 6,268,041; 6,294,442; 6,300,193). In Abhängigkeit von dem Verfahren können Si-Kristalle von irgendeiner Größe von 1 bis 100 nm oder mehr als eine dünne Schicht auf einem Chip, eine getrennte Schicht und/oder als aggregierte Kristalle gebildet werden. Bei einer bestimmten Ausführung der Erfindung kann eine dünne Schicht, die nanokristallines Silicium enthält, das an eine Substratschicht 220 angefügt ist, verwendet werden.
Allerdings sind die Ausführungen nicht auf die Zusammensetzung des Ausgangsmaterials beschränkt, und bei alternativen Ausführungen der Erfindung wird in Betracht gezogen, daß andere Materialien verwendet werden können, wobei das einzige Erfordernis ist, daß das Material in der Lage sein muß, ein Substrat 220 oder 270 zu bilden, das mit einem Ramansensitiven Metall beschichtet werden kann, wie in 2 beispielhaft gezeigt.
Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung kann die Größe und/oder Form von Siliciumkristallen und/oder Porengröße in porösem Silicium derart ausgewählt sein, daß sie innerhalb vorbestimmter Grenzen liegt, beispielsweise um die Plasmonresonanzfrequenz von Metallbeschichtetem porösem Silicum 220 mit 230 zu optimieren (siehe z. B. US-Patent Nr. 6,344,272). Die Plasmonresonanzfrequenz kann auch durch Steuern der Dicke der Metallschicht 230, mit der das poröse Silicium 220 beschichtet ist, eingestellt werden (US-Patent Nr. 6,344,272). Techniken zum Steuern der Größe von Siliciumkristallen im Nanobereich sind bekannt (z. B. US-Patente Nr. 5,994,164 und 6,294,442).
1. Poröses Silicium
Wie oben diskutiert, ist das rauhe Oberflächensubstrat 220 nicht auf reines Silicium beschränkt, sondern kann auch Siliciumnitrid, Germanium und/oder andere Materialien, die zur Chip-Herstellung bekannt sind, umfassen. Andere geringe Mengen an Material können ebenfalls vorhanden sein, wie etwa Metallkeimbildungskatalysatoren und/oder Dotiersubstanzen. Das einzige Erfordernis ist, daß das Substratmaterial in der Lage sein muß, ein Substrat 220 oder 270 zu bilden, das mit einem Raman-empfindlichen Metall oder anderem leitfähigem oder halbleitfähigem Material 230 oder 280 beschichtet ist, wie in 2 beispielhaft dargestellt. Poröses Silicium weist einen großen Oberflächenbereich von bis zu 783 m²/cm³ auf, was eine sehr große Oberfläche für Oberflächen-verstärkte Raman-Spektroskopie-Techniken verfügbar macht.
Wie im Stand der Technik bekannt, kann poröses Silicon 220 durch Ätzen eines Siliciumsubstrats mit verdünnter Floßsäure (hydrofluoric acid, HF) in einer elektrochemischen Zelle hergestellt werden. In bestimmten Fällen kann Silicium anfänglich in HF bei niedrigen Stromdichten geätzt werden. Nachdem die anfänglichen Poren gebildet sind, kann das Silicium aus der elektrochemischen Zelle entfernt werden und in hoch verdünnter HF geätzt werden, um die in der elektrochemischen Zelle gebildeten Poren zu weiten. Die Zusammensetzung des Siliciumsubstrats wird auch die Porengröße beeinflussen, was davon abhängt, ob das Silicium dotiert ist oder nicht, von der Art von Dotiermittel und dem Dotierungsgrad. Die Wirkung eines Dotierens auf die Siliciumporengröße ist im Stand der Technik bekannt. Für Ausführungen der Erfindung, welche einen Nachweis und/oder eine Identifikation von großen Biomolekülen einbeziehen, kann eine Porengröße von ungefähr 2 nm bis 100 oder 200 nm ausgewählt werden. Die Orientierung von Poren in porösem Silicium kann auch bei bestimmten Ausführungen der Erfindung ausgewählt werden. Beispielsweise wird eine geätzte 1,0,0 Kristallstruktur Poren aufweisen, die rechtwinklig zu den Kristallen orientiert sind, während 1,1,1 oder 1,1,0 Kristallstrukturen Poren aufweisen werden, die diagonal entlang der Kristallachse orientiert sind. Die Wirkung einer Kristallstruktur auf die Porenorientierung ist ebenfalls im Stand der Technik bekannt. Die Kristallzusammensetzung und -porosität kann auch reguliert werden, um die optischen Eigenschaften des porösen Siliciums zu verändern, um die Raman-Signale zu verstärken, um das Hintergrundrauschen zu vermindern. Optische Eigenschaften von porösem Silicium sind im Stand der Technik gut bekannt (z. B. Cullis et al., J. Appl. Phys. 82:909-965, (1997); Collins et al., Physics Today 50: 24-31, (1997)).
Bei verschiedenen Ausführungen der Erfindung können Teilbereiche des Siliciumwavers vor einer HF-Ätzung geschützt werden, indem eine Beschichtung mit jeder bekannten widerstandsfähigen Verbindung, wie etwa Polymethylmetacrylat, vorgenommen wird. Lithographieverfahren, wie etwa Photolitographie, die zur Exposition ausgewählter Teilbereiche eines Siliciumwavers gegenüber einer Ätzung mit HF von Nutzem sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ausgewähltes Ätzen kann von Nutzem sein, um die Größe und Form einer porösen Siliciumkammer zu steuern, die zur Raman-Spektroskopie verwendet werden soll. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung kann eine poröse Siliciumkammer von ungefähr 1 μm (Mikrometer) im Durchmesser verwendet werden. Bei anderen Ausführungen der Erfindung kann ein Schlitz oder Kanal aus porösem Silicium von ungefähr 1 μm Breite verwendet werden. Die Größe der porösen Siliciumkammer ist nicht einschränkend, und es wird in Betracht gezogen, daß jede Größe oder Form einer porösen Siliciumkammer verwendet werden kann. Eine Kammergröße von 1 μm kann von Nutzen sein, beispielsweise mit einem Anregungslaser der eine Größe von 1 μm aufweist.
Das oben offenbarte beispielhafte Verfahren ist nicht auf das Herstellen von porösen Siliciumsubstraten 220 beschränkt, und es wird in Betracht gezogen, daß jedes Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden kann. Nicht beschränkende Beispiele von Verfahren zum Herstellen poröser Siliciumsubstrate 220 können ein anodisches Ätzen von Siliciumwavers oder Netzen einschließen; Elektroplattieren; und Abscheiden eines Silicium/Sauerstoff-enthaltenden Materials, gefolgt durch gesteuertes Härten; (z. B. Canham, „Silicon quantum wire array fabrication by electrochemical and chemical dissolution of wafers", Appl, Phys. Lett. 57; 1046, 1990; US-Patente Nr. 5,561,304; 6,153,489; 6,171,945; 6,322,896; 6,358,613; 6,358,815; 6,359,276). Bei verschiedenen Ausführungen der Erfindung kann die poröse Siliciumschicht 220 an eine oder mehrere Trägerschichten angefügt sein, wie etwa Volumensilicium-Quartz-Glas und/odex Kunststoff. Bei bestimmten Ausführungen kann eine Ätzstoppschicht, wie etwa Siliciumnitrid, verwendet werden, um die Tiefe der Ätzung zu steuern.
Bei bestimmten alternativen Ausführungen der Erfindung wird in Betracht gezogen, daß zusätzliche Modifikationen des porösen Siliciumsubstrats 220 vorgenommen werden können, entweder vor oder nach dem Metallbeschichten 230. Beispielsweise kann nach dem Ätzen ein poröses Siliciumsubstrat 220 unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, zu Siliciumoxid und/oder Siliciumdioxid oxidiert werden. Eine Oxidation kann verwendet werden, um beispielsweise die mechanische Stärke und Stabilität des porösen Siliciumsubstrat 224 zu steigern. Alternativ kann das Metall-beschichtete Siliciumsubstrat 220 mit 230 weiterem Ätzen unterworfen werden, um das Siliciummaterial zu entfernen, wodurch ein Metallmantel zurückbleibt, der hohl bleiben kann oder mit anderen Materialien, wie etwa zusätzlichem Raman-aktivem Metall, gefüllt werden kann.
2. Metallbeschichtung von Siliciumsubstraten
Das Siliciumsubstrat 220 oder 270 kann mit einem Roman-aktivem Metall, wie etwa Gold, Silber, Platin, Kupfer oder Aluminium, durch jedes im Stand der Technik bekanntes Verfahren beschichtet werden. Nicht einschränkende beispielhafte Verfahren schließen ein Elektroplattieren; eine Kathodenelektrowanderung; Evaporation und Sputtern von Metallen; das Verwenden von Kristalisationskeim, um das Plattieren zu katalysieren (d, h. Verwenden eines Kupfer-/Nickelkeims, um Gold zu plattieren); Ionenimplantation; Diffusion; oder jedes andere Verfahren, das im Stand der Technik zum Plattieren von dünnen Metallschichten auf ein Siliciumsubstrat 220 oder 270 bekannt ist, ein (siehe, z. B. Lopez und Fauchet, „Erbium emission form porous silicium one-dimensional photonic band gap structures", Appl. Phys. Lett. 77:3704-6 (2000); US-Patente Nr. 5,561,304; 6,171,945; 6,359,276). Ein anderes nicht einschränkendes Beispiel eines Metallbeschichtens umfaßt ein stromloses Plattieren (z. B. Gole et al., "Patterned metallization of porous silicon from electroless solution for direct electrical contact", J. Electrochem. Soc. 147:3785, (2000)). Die Zusammensetzung und/oder Dikke der Metallschicht kann gesteuert werden, um die Plasmonresonanzfrequenz des Metallbeschichteten Siliciums 220 mit 230 oder 270 mit 280 zu optimieren.
Bei alternativen Ausführungen der Erfindung können die Raman-aktiven Oberflächen, die zum Nachweis des Analyten verwendet werden, Kombination aus verschiedenen Arten aus ausgewählten Raman-aktiven Oberflächen umfassen, wie etwa ein Metall-beschichtetes, nanokristallines, poröses Siliciumsubstrat in Kombination mit immobilisierten Kolloiden von Metall-beschichteten nanokristallinen, porösen Siliciumnanopartikeln. Eine solche Zusammensetzung würde eine sehr große Oberflächenausdehnung von Raman-aktivem Metall aufweisen, mit relativ kleinen Kanälen für Analyten in Lösung. Obwohl dies weniger günstig wäre bei großen Analytmolekülen, wie etwa großen Proteinen oder Nukleinsäuren, würde es eine bessere Empfindlichkeit und einen Nachweis von kleinen Molekülanalyten verfügbar machen, wie etwa einzelnen Nukleotiden oder Aminosäuren.
Flußwege, Kanäle und mikroelektromechanische Systeme (MEMS)
Wie in 1 beispielhaft dargestellt wird bei bestimmten Ausführungen der Erfindung eine molekulare Probe eines Analyten 210 abwärt eines Flußweges oder Kanals, wie etwa eines Mikrofluidkanals, Nanokanals oder Mikrokanals 185 und/oder einer Probenzelle 175 abwärts bewegt und passiert eine Detektionseinheit 195 des Geräts. In Übereinstimmung mit solchen Ausführungen können die Raman-aktiven Oberflächen und Analyten in ein größeres Gerät und/oder System aufgenommen sein. Bei bestimmten Ausführungen können die Raman- aktiven Oberflächen in ein mikroelektromechanisches System (MEMS) aufgenommen sein.
MEMS sind integrierte Systeme, die mechanische Elemente, Sensoren, Aktuatoren und Elektronik umfassen. Alle diese Bestandteile können durch bekannte Mikrofabrikationstechniken auf einem gewöhnlichen Chip hergestellt werden, der ein Substrat auf Siliciumbasis oder ein äquivalentes Substrat umfaßt (z. B. Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng. 1:401-425, (1999)). Die Sensorbestandteile von MEMS können verwendet werden, um mechanische, thermische, biologische, chemische, optische und/oder magnetische Phänomene zu messen. Die Elektronik kann die Information von den Sensoren bearbeiten und Steueraktuatorbestand teile, wie etwa Pumpen, Ventile, Heizungen, Kühlungen, Filter etc. steuern, um dabei die Funktion des MEMS zu steuern.
a. Herstellung integrierter Chips
Alternativ kann bei bestimmten Ausführungen der Erfindung die Metall-beschichtete poröse Siliciumschicht 220 mit 230 oder die nicht poröse Schicht 270 mit 280 als ein integraler Teil der Probenzelle des MEMS-Halbleiter-Chips aufgenommen sein, wobei bekannte Verfahren zur Chipherstellung verwendet werden. Bei alternativen Ausführungen kann die Metallbeschichtete poröse Siliciumkammer 220 mit 230 aus einem Siliciumwafer ausgeschnitten sein und in einen Chip und/oder eine andere Vorrichtung aufgenommen sein.
Zusätzlich können die elektronischen Bestandteile von MEMS unter Verwendung von integriertem Schaltkreis („integrated circuit", IC)-Processen (z. B. CMOS-, Bipolar- oder BICMOS-Prozessen) hergestellt sein. Sie können unter Verwendung von photolitographischen und Ätzungsverfahren, die für die Herstellung von Computerchips bekannt sind, gestaltet werden. Die mikromechanischen Bestandteile können unter der Verwendung kompatibler „Mikrobearbeitungs"-Vorgängen hergestellt werden, die selektive Teile des Siliciumwafers wegätzen oder neue strukturelle Schichten hinzufügen, um die mechanischen und/oder elektromechanischen Komponenten zu bilden. Die Grundlagentechniken bei der MEMS-Herstellung umfassen das Auftragen von dünnem Materialfilmen auf ein Substrat, das Anwenden einer gemusterten Maske aus der Oberseite des Films durch photolitographisches Abbilden oder andere bekannte Litographieverfahren und das selektive Ätzen der Filme. Ein dünner Film kann eine Stärke im Bereich zwischen wenigen Nanometern bis 100 Mikrometern aufweisen. Die verwendeten Auftragungstechniken können chemische Verfahren wie Gasabscheidung (chemical vapor deposition, CVD), Elektroabscheidung, epitaktische und thermische Oxidation und physikalische Verfahren wie PVD-Verfahren (physical vapor deposition) und Gießen. Herstellungsverfahren von nanoelektromechanischen Systemen können für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. (vgl. z. B. Craighead, Science 290: 1532-36, (2000)).
b. Mikrofluidkanäle und Mikrokanäle
In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann die Raman-aktive Oberfläche mit verschiedenen Fluid-gefüllten Sektionen verbunden sein, wie mit Mikrofluidkanälen, Nanokanälen und/oder Mikrokanälen. Diese und andere Bestandteile des Geräts können aus einer einzelnen Einheit gebildet sein, zum Beispiel in der Form eines Chips, wie sie von Halbleiterchips und/oder Mikrokapillar- oder Mikrofluidchips bekannt sind. Alternativ kann die Raman-aktive Oberfläche von einem Siliconwafer entfernt werden und auf andere Bestandteile des Geräts aufgebracht werden. Alle Materialien, die zum Gebrauch in solchen Chips bekannt sind, können in dem offenbarten Gerät verwendet werden, einschließlich ein Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrit, Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Kunststoff, Glas, Quartz etc.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist es berücksichtigt, daß der Kanal 185 einen Durchmesser zwischen etwa 3 nm und etwa 1 μm aufweist. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung kann der Durchmesser des Kanals 185 in der Größe etwas kleiner als ein Anregungslaserstrahl gewählt werden. Techniken zur Herstellung von Chips sind auf dem Gebiet der Herstellung von Computerchips und/oder der Herstellung von Mikrokapillarchips gut bekannt. Solche Chips können durch beliebiger im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden, wie durch Photolitographie und Ätzen, Laserablation, Spritzguß, Gießen, Molekularstrahlepitaxie, Dip-Pen-Nanolitographie, CVD-Herstellung, Elektronenstrahl- oder fokussierte Ionenstrahltechnologie oder Drucktechniken. Nicht einschränkende Beispiele umfassen konventionelles Gießen mit einem fließfähigen optisch klaren Material wie Kunststoff oder Glas; Photolitographie und Trockenätzen von Siliciumdioxid; Elektronenstrahllitographie unter Verwendung von Polymethylmethacrylatharz zum Gestalten einer Aluminiummaske auf einem Siliciumdioxidsubstrat gefolgt durch reaktives Ionenätzen; Herstellungsverfahren von nanoelektromechanischen Systemen können für verschiedene Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden (vgl. z. B. Craighead, Science 290:1532-36, 2000). Verschiedene Formen von mikrohergestellten Chips sind kommerziell erhältlich aus Quellen wie etwa Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA) und ACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA).
Für Fluid-gefüllte Sektionen, die verschiedenen einzelnen Biomolekülen, wie etwa Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Nukleotiden und derartigem ausgesetzt werden können, werden die Oberflächen, die solchen Molekülen ausgesetzt sind, durch Beschichten modifiziert, um beispielsweise eine Oberfläche von einer hydrophoben in eine hydrophile Oberfläche umzuwandeln und/oder um die Adsorption von Molekülen an eine Oberfläche zu vermindern. Eine Oberflächenmodifikation von gewöhnlichen Chip-Materialien, wie etwa Glas, Silicium, Quarz und/oder PDMS, ist im Stand der Technik bekannt (z. B. US-Patent Nr. 6,263,286). Derartige Modifikationen können einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Beschichten mit kommerziell verfügbaren Kapillarbeschichtungen (Supelco, Bellafonte, PA), Silanen mit verschiedenen funktionellen Gruppen, wie etwa Polyethylenoxid oder Acrylamid, oder jede andere im Stand der Technik bekannte Beschichtung.
Um den Nachweis von Analyten 210 zu erleichtern umfaßt eine Ausführung der Erfindung Materialien, die für elektromagnetische Strahlung bei den verwendeten Anregungs- und Emissionsfrequenzen durchlässig sind. Glas, Silicium, Quarz oder alle anderen Materialien, die im allgemeinen in den zur Raman-Spektroskopie verwendeten Frequenzbereichen durchlässig sind, können verwendet werden. Bei einigen Ausführungen kann der Nanokanal oder Mikrokanal 185 aus denselben Materialien hergestellt sein, die zur Herstellung der Ladekammer 180 unter Verwendung von Spritzgießen oder anderen bekannten Techniken verwendet werden. Jede Geometrie, Form und Größe ist für die Probenzelle möglich, da jede Brechung, welche dieser Bestandteil einführt, ignoriert oder kompensiert werden kann. Der Aufbau ist vorzugsweise derart, daß alle Lichtstrahlen in den konvergenten Strahlen, die aus der Linse 160 austreten, radial von der optisch durchlässigen Probenzelle 175 wandern und folglich keiner Brechung unterliegen. Die optisch durchlässige Probenzelle 175 und die Kanäle 185 können Teil einer Mikrofluidvorrichtung sein, wie sie in Keir et al. Anal. Chem. 74: 1503-1508 (2002) offenbart ist.
Eine Mikroherstellung von Mikrofluidvorrichtungen einschließlich mikrokapillarelektrophoretischen Vorrichtungen ist ebenfalls diskutiert worden, z. B. in Jacobsen et al. (Anal. Biochem, 209:278-283 (1994); Effenhauser et al. (Anal. Chem. 66:2949-2953, (1994)); Harrison et al. (Science 261:895-897, (1993)) und US-Patent Nr. 5,904,824.
c. Nanokanäle
Kanäle mit kleinem Durchmesser, wie etwa Nanokanäle 185 können durch bekannte Verfahren hergestellt werden, einschließlich Beschichten der Innenseite eines Mikrokanals 185, um den Durchmesser zu verengen, oder unter Verwendung von Nanolitographie, fokussiertem Elektronenstrahl-, fokussiertem Ionenstrahl- oder fokussiertem Atomlaser-Techniken, ohne darauf beschränkt zu sein.
Für die Herstellung von Nanokanälen 185 kann jede Technik verwendet werden, die im Stand der Technik zum Herstellen im Nanomaßstab bekannt ist. Die folgenden Techniken sind nur beispielhaft. Nanokanäle 185 können beispielsweise unter Verwendung eines Elektronenstrahl-Litographie-Systems mit hohem Durchsatz (kommerziell verfügbar von beispielsweise NOVA Scientific, Inc.; Sturbridge, MA) hergestellt sein. Die Elektronenstrahl-Litographie kann verwendet werden, um auf Siliciumchips Merkmale zu schreiben, die so klein wie 5 nm sind. Empfindlichkeitsabdeckungen, wie etwa Polymethylmethacrylat, geschichtet auf Siliciumoberflächen, können ohne Verwendung einer Maske gestaltet werden. Die Elektronenstrahlanordnung kann einen Feldemissionskluster mit einem Mikrokanalverstärker kombinieren, um die Stabilität des Elektronenstrahls zu erhöhen, wodurch ein Betrieb bei niedrigen Strömen erlaubt wird. Bei einigen Ausführungen der Erfindung kann das SoftMask^TM Computersteuersystem verwendet werden, um die Elektronenstrahl-Litographie von Merkmalen im Nanomaßstab auf einem Silicium- oder einen anderen Chip zu steuern.
Bei alternativen Ausführungen der Erfindung können Nanokanäle 185 unter Verwendung von fokussierten Atomlasern hergestellt werden (z. B. Bloch et al., „Optics with an atom laser beam", Phys. Rev. Lett. 87:123-321, (2001)). Fokussierte Atomlaser können zur Litographie verwendet werden, eher als Standardlaser oder fokussierte Elektronenstrahlen. Derartige Techniken sind in der Lage, Strukturen im Mikromaßstab oder sogar Nanomaßstab auf einem Chip herzustellen. Bei anderen alternativen Ausführungen der Erfindung kann „Dip-Pen"-Nanolitographie verwendet werden, um Nanokanäle 103 zu bilden (z. B. Ivanisevic et al., „Dip-Pen' Nanolithography on Semiconductor Surfaces", J. Am. Chem. Soc. 123: 7887-7889, (2001)). „Dip-Pen"-Nanolithographie verwendet Rasterkraftmikroskopie, um Moleküle auf Oberflächen, wie etwa Siliciumchips abzuscheiden. Merkmale, die so klein sind wie 15 nm, können gebildet werden mit einer räumlichen Auflösung von 10 nm. Kanäle 185 im Nanomaßstab können unter Verwendung von „Dip-Pen"-Nanolithographie in Kombination mit normalen Photolithographietechniken gebildet werden. Beispielsweise kann eine Linie im Mikromaßstab in einer Schicht einer Abdeckung durch Standardphotolithographie gebildet werden. Unter Verwendung der „Dip-Pen"-Nanolithographie kann die Breite der Linie (und der entsprechende Durchmesser des Kanals 185 nach dem Ätzen) durch Abscheiden einer zusätzlichen Abdeckverbindung auf die Ränder der Abdeckung verengt werden. Nach dem Ätzen der dünneren Linie kann ein Kanal 185 im Nanomaßstab gebildet werden. Alternativ kann die Rasterkraftmikroskopie verwendet werden, um eine Photoabdeckung zu entfernen, um Merkmale im Nanomaßstab zu bilden.
Bei anderen alternativen Ausführungen der Erfindung kann eine Ionenstrahllithographie verwendet werden, um Nanokanäle 185 auf einem Chip zu erzeugen (z. B. Siegel, „Ion Beam Lithography", VLSI Electronics, Microstructure Science, Bd. 16, Einspruch und Watts Hrgs., Academic Press, New York, 1987). Ein fein fokussierter Ionenstrahl kann verwendet werden, um direkt Merkmale, wie etwa Nanokanäle 185, auf eine Schicht einer Abdeckung ohne Verwendung einer Maske zu schreiben. Alternativ können breite Ionenstrahlen in Kombination mit Masken verwendet werden, um Merkmale zu bilden, die so klein sind wie 100 nm im Maßstab. Chemisches Ätzen, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure wird verwendet, um freiliegendes Silicium zu entfernen, das durch die Abdeckung nicht geschützt ist. Der Fachmann wird realisieren, daß die oben offenbarten Techniken nicht einschränkend sind, und daß Nanokanäle 185 durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gebildet werden können.
Derartige Techniken können leicht zur Verwendung in den offenbarten Verfahren und dem Gerät angepaßt werden. Bei einigen Ausführungen der Erfindung kann die Mikrokapillare aus denselben Materialien gefertigt sein, die zur Fertigung einer Ladekammer 180 verwendet werden, wobei Techniken verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
In einer Ausführung der Erfindung wird eine geschlossene Mikrofluidvorrichtung, die aus einem geeigneten inerten Material hergestellt ist, beispielsweise einem Material auf Siliciumbasis, derart aufgedruckt, daß eine Probe von zu analysierenden Molekülen und Ramanaktiven Oberflächen in die Probenzelle eingearbeitet oder darin abgegeben werden kann. Ein Glasfenster macht eine Sicht des fokussierten Laserpunkts verfügbar und verschließt auch die Lösung von der umgebenden Umgebung, was bei Luft-empfindlichen Molekülen wichtig ist. Die Zelle kann einen Anschluß zum Reinigen der Lösung mit einem inerten Gas aufweisen. Zusätzlich kann die Zellen Anschlüsse in einer Größe aufweisen, welche der Probe, die einen zu untersuchenden Analyten enthält, und den Raman-aktiven Nanopartikeln, Aggregaten und Kolloiden erlauben, in die Zelle zu fließen, miteinander Kontakt herzustellen und aus der Zel le zu fließen, wodurch es ermöglicht wird, während des Verlaufs des Tests die Probe dauernd aufzufüllen, was eine maximale Empfindlichkeit sicherstellt.
d. Flußwege
Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können Nanopartikel 240 in mikrofluide Kanäle, Nanokanäle oder Mikrokanäle 185 durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, wie etwa Mikrofluidik, Nanofluidik, hydrodynamisches Fokussieren oder Elektroosmose gebracht werden. Beispielsweise können in einer Ausführung der Erfindung die nachzuweisenden Analyten 210 und/oder Nanopartikel, Aggregate oder Kolloide durch Laden der Kammer 180 eingeführt und abwärts der Probenzelle 175 und/oder dem Mikrofluidkanal, Nanokanal und/oder Mikrokanälen 185 durch Massenfluß an Lösungsmittel bewegt werden. Bei anderen Ausführungen der Erfindung kann eine Mikrokapillarelektrophoräse verwendet werden, um Analyten 210 abwärts der Probenzelle 175 und/oder des Mikrofluidkanals, Nanokanals und/oder Mikrokanals 185 zu transportieren. Eine Mikrokapillarelektrophoräse umfaßt im allgemeinen die Verwendung einer dünnen Kapillare oder eines Kanals, die mit einem besonderen Trennmedium gefüllt sein können. Die Elektrophoräse von geeignet geladenen Molekülspezies, wie etwa negativ geladenen Analyten 210, tritt als Reaktion auf ein angelegtes elektrisches Feld auf, beispielsweise positiv an der Detektionseinheitsseite und negativ an der entgegengesetzten Seite. Obwohl eine Elektrophoräse häufig zur Größentrennung einer Mischung von Bestandteilen verwendet wird, die gleichzeitig in die Mikrokapillare gegeben werden, kann sie auch verwendet werden, um Analyten 210 von ähnlicher Größe zu transportieren. Weil einige Analyten 210 größer sind als andere und deshalb viel langsamer wandern würden, kann die Länge der Probenzelle 175 und/oder der Flußwege 185 und die entsprechende Durchgangszeit hinter der Detektionseinheit 195 auf einem Minimum gehalten werden, um differentielle Wanderung durch Aufmischen der Ordnung der Analyten 210 zu vermeiden, wenn verschiedene Arten von Analyten nachzuweisen oder zu identifizieren sind. Alternativ kann das Trennmedium, das die Mikrokapillare füllt, derart ausgewählt werden, daß die Wanderungsraten eines Analyten 210 die Probenzelle 175 und/oder Flußwege 185 hinunter ähnlich oder identisch sind. Verfahren zur Mikrokapillarelektrophoräse sind beispielsweise durch Woolley und Mathies (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11348-352, (1994)) offenbart worden.
Bei einigen Ausführungen der Erfindung kann die Verwendungen von geladenen Linker-Verbindungen oder geladenen Nanopartikeln 240 eine Manipulation von Nanopartikeln 240 durch die Verwendung von elektrischen Gradienten erleichtern. Bei anderen Ausführungen der Erfindung können die Probenzellen 175 und/oder Flußwege 185 wäßrige Lösungen mit relativ hoher Viskosität, wie etwa Glycerinlösungen, enthalten. Derartige Lösungen mit hoher Viskosität können dazu dienen, die Flußrate zu vermindern und die verfügbare Reaktionszeit zu erhöhen, beispielsweise zum Quervernetzen von Analyten 210 mit Nanopartikeln 240. Bei anderen Ausführungen der Erfindung können die Probenzellen 175 und/oder Flußwege 185 nicht-wäßrige Lösungen enthalten, einschließlich organischen Lösungsmitteln, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die Probe von zu analysierenden Analyten und die metallischen partikulären oder kolloidalen Oberflächen können an die Probenzelle durch verschiedene Mittel abgegeben werden. Beispielsweise können die metallischen partikulären oder kolloiden Oberflächen an die Probe von zu analysierendem analysierenden Molekül(en) abgegeben werden, wobei die Probe von zu analysierendem/analysierenden Molekül(en) an metallische Partikuläre oder kolloide Oberflächen abgegeben werden kann, oder das/die zu analysierende/analysierenden Molekül(e) und metallische Partikuläre oder kolloidale Oberflächen können gleichzeitig abgegeben werden. Wie in den 1 und 2 gezeigt, kann die Probe von zu analysierendem/analysierenden Molekül(en) und/oder metallischen Partikulären oder kolloidalen Oberflächen automatisch durch eine Vorrichtung abgegeben werden, welche die Probe pumpt oder ihr auf andere Weise erlaubt, in die Probenzelle durch Kanäle 185 zu fließen. Eine derartige Vorrichtung schließt lineare Mikrofluidvorrichtungen ein. Bei einer anderen Ausführung kann die Probe von zu analysierendem/analysierenden Molekül(en) und/oder den metallischen Partikulären oder kolloidalen Oberflächen manuell abgegeben werden, indem ein Tropfen oder mehrere Tropfen der Probenlösung direkt in die Probenzelle mit Hilfe eines Röhrchens, einer Pipette oder einer anderen derartigen manuellen Abgabevorrichtung plaziert werden. Andere Verfahren zum Einspeisen der molekularen Probe des Analyten und der Raman-aktiven Oberflächen sind ebenfalls möglich. Da die molekulare Probe des Analyten durch die Probenzelle 175 fließt, wird der Ausgangs-Anti-Stokes-Strahl 190 verändert, was während der Untersuchung kontinuierlich überwacht wird.
Wie aus diesen Figuren hervorgeht, macht die optische Instrumentierung einer SECARS-Vorrichtung die Einführung einer Raman-aktiven Oberfläche in die Nähe des nachzuweisen den und/oder zu identifizierenden Analyten (SIRS) durch eine Vorrichtung vom CARS-Typ verfügbar. Als Teil einer linearen Mikrofluidvorrichtung können die Nanopartikel, Aggregate oder Kolloide und der zu analysierende Analyt auf verschiedene Weisen kombiniert werden. Diese schließen folgende ein: a) Anfügen oder Adsorbieren der molekularen Probe des Analyten an den Nanopartikel, das Aggregat oder das Kolloid, die dann in die Probenzelle fließen gelassen werden; b) Fliesenlassen der molekularen Probe des Analyten in eine Probenzelle, die im Inneren der Zelle Nanopartikel, Aggregate oder Kolloide immobilisiert aufweist; oder c) Fliesenlassen der Nanopartikel, Aggregate oder Kolloide und der molekularen Probe des Analyten durch eine Vorrichtung mit gegabelten mikrofluiden Kanälen, welche einfließende Nanopartikel, Aggregate und Kolloide und die einfließende molekulare Probe des Analyten mischen und eine optische Messung ermöglicht, die durchzuführen ist, sobald die Nanopartikel, Aggregate oder Kolloide vollständig mit der molekularen Probe des Analyten gemischt sind.
Verschiedene Ausführungen werden vergegenwärtigt, um diese Technik in einem Mikromaßstab auszuführen, einschließlich der Verwendung von verschiedenen Wellenlängen, Wellenleitern, optischen Kopplungen/Wahl der Pumpstrahlen und derartigem, ohne darauf beschränkt zu sein, um eine präzise Emissionsorientierung zu erzielen, welche den Nachweis und die Identifizierung einer Probe von nur einer kleinen Anzahl von Molekülen eines Analyten erlaubt. Wie oben erwähnt, müssen die beiden Wellenlängen des Raman-Lichts entsprechend ausgewählt werden, daß sie mit dem Schwingungsenergieniveau des Zielanalyten korrespondieren und daß sie den hoch gerichteten Ausgang ausrichten. Beispielsweise kann das Anregungslicht, um den Adeninring-Atmungsmodus bei 735 cm^–1 zu sondieren, auf 785 nm eingestellt werden, und das Stokes-Licht kann auf 833 nm eingestellt werden, so daß ihre Energieniveauunterschiede mit dem Schwingungsenergieniveau von 735 cm ^–1 zusammenpassen.
Raman-Markierungen
Bestimmte Ausführungen der Erfindung können ein Anfügen einer Markierung an ein oder mehrere Moleküle eines Analyten 210 einschließen, um ihre Messung durch die Raman-Detektionseinheit 195 zu erleichtern. Nicht einschränkende Beispiele von Markierungen, die zur Raman-Spektroskopie verwendet werden können, schließen TRIT (Tetramethyl-Rhodamin-Isothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), Texas Rot-Farbstoff, Phthalsäure, Terephthalsäure, Isophthalsäure, Cresyl fast violett, Cresyl blau violett, brillant-Cresyl blau, Para-Aminobenzoisäure, Erythrosin, Biotin, Digoxigenin, 5-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxy-fluorescein, 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein, 5-Carboxyfluorescein, 5-Carboxy-rhodamin, 6-Carboxyrhodamin, 6-Carboxytetramethylaminophthalocyanine, Azomethine, Cyanine, Xanthine, Succinylfluoresceine, Aminoacridin, Quantendots, Kohlenstoff-Nanotubes, Fullerene, Organocyanide, wie etwa Isocyanid, und derartiges. Diese und andere Raman-Markierungen können von kommerziellen Quellen (z. B. Molecular Probes, Eugene, OR; Sigma Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) bezogen werden und/oder durch im Stand der Technik bekannte Verfahren synthetisiert werden (siehe Chem. Commun., 724 (2003)).
Polyzyklische aromatische Verbindungen können als Raman-Markierungen funktionieren, wie im Stand der Technik bekannt. Andere Markierungen, die für bestimmte Ausführungen der Erfindung verwendet werden können, schließen Cyanid, Thiol, Chlor, Brom, Methyl, Phosphor und Schwefel ein. Bei bestimmten Ausführungen der Erfindung können Kohlenstoff-Nanotubes als Raman-Markierungen von Nutzen sein. Die Verwendung von Markierungen in der Raman-Spektroskopie ist bekannt (z. B. US-Patente Nr. 5,306,403 und 6,174,677). Der Fachmann wird realisieren, daß die verwendeten Raman-Markierungen unterscheidbare Raman-Spektren erzeugen sollten und spezifisch an verschiedene Arten von Analyten 210 gebunden werden oder damit assoziiert werden können.
Markierungen können direkt an das/die Molekül(e) des Analyten 210 angefügt werden oder können durch verschiedene Linker-Verbindungen angefügt werden. Quervernetzende Reagenzien und Linker-Verbindungen, die in den offenbarten Verfahren von Nutzen sind, werden unten näher beschrieben. Alternativ sind Moleküle, die covalent an Raman-Markierungen angefügt sind, aus üblichen kommerziellen Quellen (z. B. Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; Promega Corp., Madison, WI; Ambion, Inc., Austin, TX; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) verfügbar. Raman-Markierungen, die reaktive Gruppen enthalten, die dazu entworfen sind, covalent mit anderen Molekülen, wie etwa Nukleotiden zu reagieren, sind kommerziell verfigbar B. Molecular Probes, Eugene, OR). Verfahren zum Herstellen markierter Analyten sind bekannt (z. B. US-Patente Nr. 4,962,037; 5,405,747; 6,136,543; 6,210,896).
Es gibt zwei Haupttheorien hinter den Verbesserungen dieser Erfindung, die aber weder gut verstanden sind noch für die Beschreibung der Erfindung wichtig sind.
Wie aus der vorangegangenen Beschreibung anerkannt werden wird, ist die Antwortzeit des Sensors dieser Erfindung und das Verfahren dieser Erfindung nur durch die Charakteristika der Differenzdetektionsvorrichtung und seiner damit verbundenen Probengewinnung und Rechnerschaltungen beschränkt. Kommerziell verfügbare integrierte Vorverstärker machen eine Antwortzeit im Bereich von wenigen Picosekunden verfügbar. Diese ultraschnellen Antwortzeiten ermöglichen, anfänglich schwankende und andere Verschiebungen, die während des zu überwachenden Tests oder der Analyse auftreten können, zu überwachen, und ermöglichen und auch erlauben schnelle kallibratorische Überprüfungen, die zu machen sind. Die Erfindung ermöglicht die gewünschten zu bestimmenden Reflektivitätscharakteristika auf einer Zeitskala, die so kurz ist, daß sie weniger als die Zeit beträgt, die das Ausbilden einer chemischen Bindung einnimmt, die zwischen dem relevanten Bestandteil der Probe und der metallischen oder halbleitenden partikulären oder kolloiden Oberfläche erzielt werden soll.
Die hohe Auflösung, schnelle Antwortzeiten und das geschlossene Design der Erfindung ermöglicht, daß die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung in zahlreichen biologischen, biochemischen und chemischen Anwendungen verwendet werden können, wo es nützlich ist, kleine Anzahlen von Molekülen von einem bestimmten Analyten nachzuweisen und zu identifizieren. Eine besondere Anwendung dieser Vorrichtungen und Verfahren ist es, ein Polymer zu sequenzieren, wie etwa ein Einzelstrang einer Nukleinsäure, wie etwa DNA oder RNA, durch Nachweisen und Identifizieren kleiner Anzahlen von markierten oder unmarkierten Nukleotidmolekülen, die sequentiell von einem Strang der Nukleinsäure abgespalten worden sind. Beispielsweise können sowohl die Nukleotid- als auch Metallpartikel durch eine wäßrige Puffer-Lösung in einen Mikrokanal zu einer miniaturisierten Probenzelle zum Nachweis eingefüllt werden.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um bestimmte Aspekte und Anwendungen dieser Erfindung weiter zu veranschaulichen. Diese Beispiele beschreiben besondere Ausführungen der Erfindung, sind jedoch nicht als Beschränkungen des Umfangs der Erfindung oder der beigefügten Ansprüche beabsichtigt.
BEISPIEL 1
SECARS Aufbau 1
Dieser Aufbau umfaßt zwei Laser. Ein Laser, der Pumplaser, emittiert die Pumpstrahlung und der andere Laser, der Stokes-Laser, emittiert die Stokes-Strahlung. Der Pumplaser erzeugt Impulse von 10 nJ mit einer Pulsbreite von 1 Picosekunde bei 76 MHz Repetitionsrate. Der Stokes-Laser erzeugt Impulse von 6 nJ mit einer Pulsbreite von 1 Picosekunde bei 76 MHz Repetitionsrate. Der Pumplaser und der Stokes-Laser werden synchron betrieben durch Verbinden mit einer elektrischen Steuerung (SynchroLock AP von Coherent), welcher die Zeitsteuerung der Ausgangspulse, die von den zwei Lasern erzeugt werden, synchronisiert. Zwei Titan-Saphir-Laser von Coherent (Santa Clara, CA) stellen die Pump- und Stokes-Strahlung zur Verfügung. Die zwei Strahlen werden räumlich durch dichroitische Spiegel überlappt und werden von Chroma (Brattleboro, VT) hergestellt. Die Strahlen werden auf spezielle Wellenlängen eingestellt, so daß sich die Differenz der Energieniveaus der zwei Strahlen an ein bestimmtes Schwingungsenergieniveau des Zielanalytens anpaßt. Die Strahlen werden an den Bereich des Detektionsfensters des mikrofluiden Kanals über eine Mikroskopobjektivlinse (Zeiss) abgegeben.
Vorbereitung der Reaktionskammer, des mikrofluiden Kanals und Mikrokanals
Borofloat Glas-Wafer (Precision Glass & Optics, Santa Ana, CA) werden vor einer Abscheidung einer amorphen Siliconopferschicht in irgendeinem System in einer Plasma-verstärkten chemischen Gasphasenabscheidung (PECVD) (PEII-A, Technics West, San Jose, CA) für eine kurze Zeit in konzentrierter HF (Flußsäure) vorgeätzt und gereinigt. Die Wafer werden mit Hexamethyldisalzin (HMDS) vorbehandelt, durch Spin-Coating mit Photolack beschichtet (Shipley 1818, Marlborough, MA) und schwach gebacken. Ein Contact-Mask-Aligner (Quintel Corp. San Jose, CA) wird benutzt, um die Photolackschicht mit einem oder mehreren Maskenmustern freizulegen und der freigelegte Photolack wird unter Verwendung einer Mischung aus Microposit Entwicklungskonzentrat (Shipley) und Wasser entfernt. Die entwickelten Wafer werden stark gebacken und das offenliegende amorphe Silicium wird unter Verwendung von CF₄ (Tetrafluorkohlenstoff)-Plasma in einem PECVD-Reaktor entfernt. Die Wafer werden chemisch geätzt mit konzentrierter HF, um die Reaktionskammer und die Mikrofluidkanäle oder die Mikrokanäle zu erzeugen. Der verbleibende Photolack wird abgestreift und das amorphe Silicium entfernt.
Nanokanäle werden durch eine Variation dieses Ablaufs gebildet. Standardisierte Photolithographie, wie vorhergehend beschrieben, wird benutzt, um die Merkmale in der Größenordnung von Mikrometern des integrierten Chips zu erzeugen. Der Chip wird mit einer dünnen Schicht eines Abdecklacks beschichtet. Die Sondenspitze eines Mikroskops oder Tunnelmikroskops wird benutzt, um einen 5 bis 10 nm breiten Streifen des Abdecklacks von der Chipoberfläche zu entfernen. Der Chip wird kurz mit schwacher HF geätzt, um eine Rinne im Nanometerbereich auf der Oberfläche des Chips zu erzeugen. In dem vorliegenden nicht beschränkenden Beispiel wird ein Kanal mit einem Durchmesser zwischen 500 nm und 1 μm hergestellt.
Zugangslöcher werden in die geätzten Wafer mit einem Diamantenbohrbit (Crystalite, Westerville, OH) gebohrt. Ein fertiggestellter Chip wird durch thermisches Verbinden zweier komplementär geätzter und gebohrter Platten in einen programmierbaren Vakuumbrennofen (Centurion VPM, J. M. Ney, Yucaipa, CA) gefertigt. Ein Nylonfilter mit einem molekularen Ausschlußgewicht von 2.500 Dalton wird zwischen die Reaktionskammern und den Mikrofluidkanal eingeführt, um zu verhindern, daß Exonuklease die Reaktionskammer verläßt.
Herstellung von Nanopartikeln
Silber-Nanopartikel werden gemäß Lee und Meisel (J. Phys. Chem. 86:3391-3395, 1982) hergestellt. Gold-Nanopartikel werden von Polysciences, Inc. (Warrington, PA) oder von Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY) bezogen. Gold-Nanopartikel sind erhältlich von Polysciences, Inc. in Größen von 5, 10, 15, 20 40 und 60 nm und von Nanoprobes, Inc. in der Größe von 1,4 nm. In dem vorliegenden, nicht einschränkenden Beispiel werden Gold-Nanopartikel von 60 nm verwendet.
Die Gold-Nanopartikel läßt man mit Alkandithiolen mit Kettenlängen im Bereich zwischen 5 nm bis 50 nm reagieren. Die Linker-Verbindungen enthalten Thiolgruppen an beiden Enden des Alkans, um mit den Gold-Nanopartikeln zu reagieren. Es wird ein Überschuß von Nanopartikeln gegenüber den Linker-Verbindungen benutzt, und die Linker-Verbindungen werden langsam zu den Nanopartikeln hinzugefügt, um die Bildung von großen Nanopartikel-Aggregaten zu vermeiden. Nach einer Inkubation von zwei Stunden bei Zimmertemperatur werden die Nanopartikel-Aggregate von den einzelnen Nanopartikel durch eine Ultrazentrifu gation in 1 M Sucrose getrennt. Eine Elektronenmikroskopie macht deutlich, daß die durch dieses Verfahren hergestellten Aggregate zwischen 2 und 6 Nanopartikeln pro Aggregat enthalten. Die aggregierten Nanopartikel werden in die Mikrokanäle durch einen Mikrofluidstrom geladen. Eine Verengung an dem entfernten Ende des Mikrokanals hält die Nanopartikel-Aggregate in Position.
Herstellung des porösen Substrats
Das Substrat wurde durch ein anodisches, elektrochemisches Ätzen, wie vorhergehend beschrieben, hergestellt. Insbesondere wurde das Substrat hergestellt, indem ein stark Bordotierter p-Silicon-Wafer einem Ätzen in einer wäßrigen Elektrolytlösung ausgesetzt wird, die Ethanol und HF enthält, die in einer Konzentration von ungefähr 15 Volumenprozent bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung vorhanden ist (15 Vol.-% HF). Eine Anodisierung wurde von einem Computer-gesteuerten konstanten Strom ausgeführt, der über die Zelle (zwischen einer Platinkathode und einer Siliciumanode) angelegt wurde. Mehrere Schichten von porösem Silicium wurden aus 5 Perioden von zwei verschiedenen Stromdichteeinstellungen erzeugt. Eine solche Einstellung betrug 5 mA/cm² für 20 Sekunden, was eine Schicht mit einer Porosizität von etwa 42% und einer Dicke von etwa 80 nm lieferte. Die andere Einstellung betrug 30 mA/cm² für 10 Sekunden, was eine Schicht mit einer Porosizität von etwa 63% und einer Dicke von etwa 160 nm lieferte. Das gebildete Substrat besaß eine runde Scheibenform mit einem Durchmesser von etwa einem Zoll. Obgleich das gebildete Substrat allgemein als homogen betrachtet werden kann, waren leichte Veränderungen (beispielsweise in der Porosizität, der Dicke etc.) vorhanden, wenn man den mittleren Bereich des Substrats mit den Randbereichen des Substrats vergleicht. Solche Schichten können der Natur des Schicht-formenden Verfahrens zugeordnet werden. Die leichten Veränderungen werden sichtbar, wenn man das optische Emissionsspektrallicht (etwa 1 μm im Durchmesser des Querschnitts), das in Richtung zu dem mittleren Bereich des Substrats angeregt wird, mit dem Licht vergleicht, das in Richtung zu den Randbereichen des Substrats angeregt wird.
Nukleinsäure-Herstellung und Exonuklease-Behandlung
Menschliche chromosomale DNA wird nach Sambrook et al. (1989) gereinigt. Nach dem Verdau mit Bam H1 werden die genomischen DNA-Fragmente an der multiplen Klonierungsstelle (multiple cloning site) des pBluescript^®II-Phagemidvektors (Stratagene, Inc. La Jolla, CA) eingefügt und in E. coli wachsen gelassen. Nach dem Ausplattieren auf Ampicillinenthaltenden Agaroseplatten wird eine Einzelkolonie ausgewählt und zum Sequenzieren herangezüchtet. Einzelstrangige DNA-Kopien des genomischen DNA-Inserts werden durch Co-Infektion mit einem Helferphagen geerntet. Nach dem Verdau in einer Lösung aus Proteinase K:Natriumdodecylsulphat (SDS) wird die DNA mit Phenol extrahiert und dann durch Zugabe von Natriumacetat (pH 6,5, ungefähr 0,3 M) und 0,8 Volumen 2-Propanol präzipitiert. Das DNA-enthaltende Pellet wird in Tris-EDTA-Puffer resuspendiert und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Eine Agarose-Gelelektrophorese zeigt eine Einzelbande von gereinigter DNA.
M 13 Vorwärts-Primer, die zu der bekannten pBluescript^®-Sequenz komplementär sind und die neben dem genomischen DNA-Insert lokalisiert sind, werden von der Midland Certified Reagent Company (Midland, TX) bezogen. Die Primer werden kovalent modifiziert, damit sie einen Biotinrest, der an das 5'-Ende des Oligonukleotids angefügt sind, enthalten. Die Biotingruppe ist kovalent mit dem 5'-Phosphat des Primers durch einen (CH₂)₆-Spacer verbunden. Biotin-markierte Primer werden mit den ssDNA-Matrizenmolekülen, präpariert aus dem pBluescript^®-Vektor, hybridisieren gelassen. Die Primer-Matrizen-Komplexe werden dann an mit Streptavidin beschichtete Beads nach Dorre et al. (Bioimaging 5: 139-152 (1997)) angefügt. Bei geeigneten DNA-Verdünnungen wird ein einzelner Primer-Matrizen-Komplex an ein einzelnes Bead angefügt. Ein Bead, das einen einzelnen Primer-Matrizen-Komplex enthält, wird in die Reaktionskammer eines Sequenzierungsgeräts eingeführt.
Die Primer-Matrize wird mit modifizierter T7 DNA-Polymerase (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) inkubiert. Die Reaktionsmischung enthält unmarkiertes Desoxyadenosin-5'-triphosphat (dATP) und Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP), Digoxigeninmarkiertes Desoxyuridin-5'-triphosphat (Digoxigenin-dUTP) und Rhodamin-markiertes Desoxycytidin-5'-triphosphat (Rhodamin-dCTP). Die Polymerisierungsreaktion wird für 2 Stunden bei 37°C fortschreiten gelassen. Nach der Synthese der Digoxigenin- und Rhodaminmarkierten Nukleinsäure wird der Matrizenstrang von der markierten Nukleinsäure getrennt, und der Matrizenstrang, die DNA-Polymerase und nicht-eingebaute Nukleotide werden aus der Reaktionskammer ausgewaschen. Bei alternativen Ausführungen der Erfindung sind alle zur Polymerisation verwendeten Desoxynukleosidtriphosphate unmarkiert. Bei anderen alternativen Ausführungen können einzelstrangige Nukleinsäuren direkt sequenziert werden ohne Polymerisation eines komplementären Strangs.
Die Exonukleaseaktivität wird durch Zugabe von Exonuklease III in die Reaktionskammer gestartet. Die Reaktionsmischung wird bei pH 8,0 und 37°C gehalten. Da Nukleotide aus dem 3'-Ende der Nukleinsäure freigesetzt werden, werden sie durch Mikrofluidfluß in dem Mikrofluidkanal abwärts transportiert. Am Eingang des Mikrokanals leitet ein durch die Elektroden erzeugter elektrischer Potentialgradient die Nukleotide aus dem Mikrofluidkanal in den Mikrokanal. Wenn die Nukleotide die gepackten Nanopartikel passieren, werden sie einer Anregungsstrahlung von einem Laser ausgesetzt. Raman-Emissionspektren werden durch den unten offenbarten Raman-Detektor nachgewiesen.
Raman-Nachweis von Nukleotiden
Das Raman-gestreute Licht von der Probe von Molekülen wird durch dasselbe Mikroskopobjektiv gesammelt und passiert den dichroitischen Spiegel zum Raman-Detektor. Der Raman-Detektor umfaßt eine fokussierende Linse, einen Spektrographen und eine Detektoranordnung. Die fokussierende Linse fokussiert das Raman-gestreute Licht durch die Eintrittsblende des Spektrographen. Der Spektrograph (RoperScientific) umfaßt ein Gitter, welches das Licht in seine Wellenlängen zerlegt. Das zerlegte Licht wird auf einer Detektoranordnung (backilluminated deep-depletion CCD-Kamera von RoperScientific) abgebildet. Die Detektoranordnung ist mit einer Steuerschaltung verbunden, die mit einem Computer zur Datenübertragung und Steuerung der Detektorfunktion verbunden ist.
Der Raman-Detektor ist in der Lage, einzelne unmarkierte Moleküle, die sich hinter dem Detektor bewegen, nachzuweisen und zu identifizieren. Die Laser und der Detektor sind derart angeordnet, daß die Probe von Molekülen angeregt und nachgewiesen wird, wenn sie einen Bereich von eng gepackten Nanopartikeln in dem Nanokanal oder Mikrokanal passieren. Die Nanopartikel sind quervernetzt, um „hot spots" zum Raman-Nachweis zu bilden. Indem die Nukleotide die Nanopartikel-„hot spots" passieren, wird die Empfindlichkeit des Raman-Nachweises um viele Größenordnungen gesteigert.
Die Probe des/der zu analysierenden Moleküls/Moleküle und die metallischen Nanopartikel werden manuell abgegeben, indem ein Tropfen oder mehrere Tropfen der Probenlösung direkt in die Probenzelle mit Hilfe eines Röhrchens, einer Pipette oder einer anderen derartigen manuellen Abgabevorrichtung plaziert werden.
Die Probe von Molekül(en) und die kolloidalen Silberpartikel werden getrennt in den Mikrofluidchip eingeführt, und es wird gemischt, bevor der Strom das Detektionsfenster erreicht. Die Mischung aus der Probe von Molekül(en) und den Silberkolloiden erzeugen, wenn sie durch die beiden Laserstrahlen angeregt werden, das SECARS-Signal. Das Raman-Emissionssignal, das aus der Rückkehr der Elektronen auf einen niedrigeren Energiezustand resultiert, wird durch dasselbe Mikroskopobjektiv, das zur Anregung verwendet wird, gesammelt, und ein anderer dichroitischer Spiegel in dem Stromweg lenkt das Signal zu dem Raman-Spektroskopie-Detektor, einem Lawinen-Photodiodendetektor (EG&G). Ein Signalverstärker und ein Analog/Digital-Umwandler werden verwendet, um das Signal zu einer digitalen Nachricht umzuwandeln. Es wird ein Computer verwendet, um die digitale Ausgabe aufzuzeichnen und die Daten mathematisch zu verarbeiten.
BEISPIEL 2
SECARS Aufbau 2
In einer alternativen Ausführungsform des SECARS-Aufbaus erzeugt ein Titan-Saphir-Laser von Spectra-Physics (Mountain View, CA) einen gepulsten Laserstrahl. Die Laserpulse werden durch einen optischen parametrischen Oszillator (OPO), der von Spectra-Physics erhältlich ist, verwendet, der zwei synchronisierte Strahlen von zwei verschiedenen Wellenlängen erzeugt. Durch Abstimmung des optischen Kristalls mit dem OPO kann der Wellenlängenunterschied zwischen den zwei Strahlen variieren. Die zwei Strahlen, die von dem OPO erzeugt werden, werden an den Bereich des Detektionsfensters des Mikrofluidkanals unter Verwendung einer Mikrooptik abgegeben. Der Winkel der zwei Laserstrahlen wird entsprechend der Phasenabgleichbedingung (Fayer, Ultrafast Infrared und Raman spectroscopy, Marcel-Dekker, 2001) eingestellt, wobei bei dieser Bedingung die SECARS-Signale am effizientesten erzeugt werden. Die kolloidalen Silberpartikel sind bereits auf die Bodenoberfläche (z. B. Calciumfluorid- oder Magnesiumfluoridfenster) des Mikrofluidkanals angeheftet. Wenn die Probe des Moleküls/der Moleküle in den Mikrofluidkanal eingeführt wird/werden, absorbiert/absorbieren das Molekül/die Moleküle vorübergehend die kolloidalen Silberpartikel, die auf der Oberfläche angeheftet sind oder bewegt/bewegen sich näher zu diesen. Wenn ein Molekül von zwei Strahlen angeregt wird, wird das SECARS-Signal als ein kohärenter unidirektionaler Strahl erzeugt. Die Richtung des SECARS-Singals wird wieder durch die Phasenanpassbedingung bestimmt. Eine Röhre eines Photomultipliers (EG&G) wird in der Richtung des SECARS-Signals angeordnet und sammelt das Signal auf. Ein Verstärker, ein A/D- Wandler und ein Computer können verwendet werden, um die Daten aufzunehmen, anzuzeigen und zu verarbeiten.
BEISPIEL 3
SECARS Aufbau 3
In einem alternativen SECARS-Aufbau werden die Anregungsstrahlen durch zwei Titan-Saphir-Laser (Mira, von Coherent) erzeugt. Die Laserpulse der beiden Laser werden durch einen dichromatischen Interferenzfilter (hergestellt von Chroma oder Omega Optical) in kollinearer Geometrie zu dem aufgesammelten Strahl überlappt. Der überlappende Strahl tritt durch ein Mikroskopobjektiv (Nikon LU-Serie) hindurch und wird auf das Raman-aktive Substrat fokussiert, wo sich die Zielanalyten befinden. Das Raman-aktive Substrat weist metallische Nanopartikel auf. Die Analyten werden mit Lithiumchloridsalz gemischt. Das Raman-gestreute Licht von den Analyten wird von demselben Mikroskopobjektiv aufgesammelt und wird von einem zweiten dichroiden Spiegel zu dem Raman-Detektor reflektiert. Der Raman-Detektor umfaßt einen Bandpaßfilter, eine Fokussierungslinse, einen Spektrographen und einen Detektor-Aufbau. Der Bandpaßfilter dämpft die Laserstrahlen und überträgt das Signal an den Analyten. Die Fokussierungslinse fokussiert das Raman-gestreute Licht durch den Eintrittsspalt des Spektrographen. Der Spektrograph (Acton Research) umfaßt ein Gitter, welches das Licht in seine Wellenlängen zerlegt. Das zerlegte Licht wird auf einer Detektor-Anordnung abgebildet (back-illuminated deep-depletion CCD-Kamera von RoperScientific). Die Detektor-Anordnung ist mit einer Steuerschaltung verbunden, die mit einem Computer zur Datenübertragung und zum Steuern der Detektorfunktionen verbunden ist. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
VERGLEICHSBEISPIEL 4
SERS Aufbau 1
4 wurde unter Verwendung eines einzelnen Titan-Saphir-Laser erzeugt. Der Laser erzeugt eine Laserstrahlung von 0,5 bis 1,0 W bei einer Nah-Infrarot-Wellenlänge (700 nm 1000 nm) in einem Continuous-Wave-Modus oder in gepulster Arbeitsweise. Der Laserstrahl führt durch einen dichromatischen Spiegel und ein Mikroskopobjektiv hindurch und wird auf das Raman-aktive Substrat fokussiert, wo sich die Zielanalyten befinden. Das Raman-aktive Substrat umfaßt metallische Nanopartikel oder metallbeschichtete Nanostrukturen. Die Ana lyten werden mit Lithiumchloridsalz gemischt. Das Raman-gesteuerte Licht von den Analyten wird durch dasselbe Mikroskopobjektiv gesammelt und wird durch einen dichromischen Spiegel zu dem Raman-Detektor reflektiert. Der Raman-Detektor umfaßt einen Knotenfilter, eine Fokussierungslinse, einen Spektrographen und einen Detektor-Aufbau. Der Knotenfilter (Kaiser Optical) schwächt den Laserstrahl ab und überträgt das Signal von den Analyten. Die Fokussierungslinse fokussiert das Raman-gestreute Licht durch den Eintrittspalt des Spektrographen. Der Spektrograph (Acton Research) umfaßt ein Gitter, welches das Licht in seine Wellenlängen zerlegt. Das zerlegte Licht wird auf der Detektor-Anordnung abgebildet (backilluminated deep-depletion CCD-Kamera von RoperScientific). Die Detektor-Anordnung ist mit einer Steuerschaltung verbunden, die mit einem Computer zur Datenübertragung und zur Steuerung der Detektorfunktion verbunden ist.
VERGLEICHSBEISPIEL 5
CARS Aufbau 1
In einem CARS-Aufbau werden die Anregungsstrahlen durch zwei Titan-Saphir-Laser (Mira von Coherent) erzeugt. Die Laserpulse aus beiden Laser werden von einem dichromatischen Interferenzfilter (hergestellt von Chroma oder Omega Optical) in einer kollinearer Geometrie mit dem gesammelten Strahl überlappt. Der überlappende Strahl tritt durch ein Mikroskopobjektiv (Nikon LU-Serie) hindurch und wird auf das Raman-aktive Substrat fokussiert, wo sich Analyten befinden. Es wird kein Raman-aktive Substrat verwendet. Die Analyten werden direkt in die Probenzelle eingeführt. Das Raman-gesteuerte Licht von den Analyten wird durch dasselbe Mikroskopobjektiv gesammelt und durch den zweiten dichromatischen Spiegel zu dem Raman-Detektor reflektiert. Der Raman-Detektor umfaßt einen Bandpaßfilter, eine Fokussierungslinse, einen Spektrographen und eine Detektor-Anordnung. Der Bandpaßfilter schwächt die Laserstrahlen ab und überträgt das Signal von dem Analyten. Die Fokussierungslinse fokussiert das Raman-gestreute Licht durch den Eintrittsspalt des Spektrographen. Der Spektrograph (Acton Research) umfaßt ein Gitter, welches das Licht in seine Wellenlängen zerlegt. Das zerlegte Licht wird auf einer Detektor-Anordnung (backilluminated deep-depletion CCD-Kamera von RoperScientific) abgebildet. Die Detektor-Anordnung ist mit einer Steuerschaltung verbunden, die mit einem Computer zur Datenübertragung und zur Steuerung der Detektorfunktionen verbunden ist. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Ein Vergleich der 3 mit den 4 und 5 zeigt, daß die SECARS-Technik eine 25-fach erhöhte Empfindlichkeit zeigt, wenn sie mit SERS alleine verglichen wird, und eine um 30.000.000-fache erhöhte Empfindlichkeit besitzt, wenn sie mit der Verwendung eines CARS alleine verglichen wird. Diese erhöhte Empfindlichkeit im Faktor 30.000.000 macht die Detektion von kleinen Zahlen von Molekülen (weniger als 1000, 100 oder 10 Molekülen oder sogar einzelnen Molekülen) möglich.
Die oben dargestellten Beispiele zeigen die Neuheit und Nützlichkeit der hochauflösenden SECARS-Vorrichtung und des Verfahrens der Erfindung. Die vohergehende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind nur für ein klares Verständnis der Erfindung gegeben worden. Es sollten keine unnötigen Beschränkungen daraus entnommen werden, da Modifikationen für den Durchschnittsfachmann offentlichltich sind. Variationen der Erfindung, wie sie hierin vorhergehend dargelegt wurde, können vorgenommen werden, ohne von ihrem Umfang abzuweichen. Daher sollten nur solche Beschränkungen eingeführt werden, wie sie durch beigefügten Ansprüche angezeigt sind.
BEISPIEL 6
Zwei Titan-dotierte Saphir-Laser (ti:Saphir) werden als Lichtquellen verwendet. Die Laser (Markenbezeichnung Mira) sind von Coherent (Santa Clara, CA) erhältlich. Jeder ti:Saphir-Laser wurde mit einem Dioden-gepumpten Festkörperlaser gepumpt, der Licht von 6 W mit 532 nm (Markenbezeichnung Verdi) erzeugt. Der Pumplaser wurde zur Erzeugung von Licht mit 785 nm abgestimmt. Der Stokes-Laser wurde entsprechend des Schwingungsniveaus der Zielmoleküle abgestimmt. Wenn beispielsweise ein dGMP-Molekül sondiert wurde, wurde der Stokes-Laser auf 827,7 nm eingestellt, und das SECARS-Signal wurde bei etwa 746,5 nm (was 657 cm^–1 entspricht) detektiert. Wenn Angiotensin I-Peptid (erhalten von New England Biolaps, Beverly, MA) sondiert wurde, wurde der Stokes-Laser auf 852,4 nm eingestellt. Das SECARS-Signal wurde bei etwa 727,7 nm emittiert (was 1007 cm^–1 entspricht).
Die Zielmoleküle von Interesse wurden in einer Mischung mit kolloidalen Silber-Nanopartikeln und Lithiumchloridsalz sondiert. Die Silber-Kolloide wurden wie vorhergehend beschrieben im eigenen Hause synthetisiert. Das Signal wurde von einer Vergleichsprobe, die eine Mischung von kolloidalen Silber-Nanopartikeln und Lithiumchloridsalzen ent hielt, aufgesammelt. Das Vergleichssignal wurde von dem Signal, das Proben erhalten wurde, subtrahiert.
6 zeigt das Signal, das von dAMP und dGMP bei 90 pM aufgenommen wurde. Aufgrund des Sammelvolumens von weniger als 100 fl vermuten wir, daß im Mittel weniger als fünf Moleküle in dem Sammelvolumen bei dieser Konzentration vorhanden waren. 7 zeigt das starke Signal von Angiotensin I Peptid bei einer Konzentration von 90 ng/μl. Dieses Ergebnis zeigt, daß SECARS über einen breiten Bereich von Molekülen verwendet werden kann, einschließlich Nukleotiden und Peptiden.
Zusammenfassung
Die Vorrichtung und das Verfahren, das hierin offenbart ist, betrifft die Detektion, Identifikation und/oder die Quantifizierung von Analyten, wie Nukleinsäuren, mit hoher Auflösung und schnellen Ansprechzeiten unter Verwendung von Oberflächen-verstärkter kohärenter Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung tritt eine kleine Anzahl von Molekülproben eines Analyten (210), wie ein Nukleotid, durch einen Mikrofluidkanal, einen Mikrokanal oder einen Nanokanal (185) und durch eine Probenzelle (175), die Raman-aktive Oberflächen enthält, und wird durch eine Oberflächen-verstärkte, kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (SECARS) detektiert. Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen ein Gerät zur Analytendetektion.

Claims

Verfahren zum Detektieren oder Identifizieren eines Analyten, das folgendes umfaßt: a) Aussetzen von weniger als 10⁵ Molekülen eines Anayten wenigstens einer Ramanaktiven Oberfläche; b) Bestrahlen der Grenzschicht zwischen wenigstens einem Molekül und der Oberfläche mit einem Laserstrahl bei einer ersten Wellenlänge, so daß das Molekül eine spontane Stokes-Raman-Emission bei einer zweiten Wellenlänge erzeugt und eine spontane Anti-Stokes-Raman-Emission bei einer dritten Wellenlänge; c) im wesentlichen gleichzeitig mit b) Bestrahlen der Grenzfläche zwischen dem Molekül und der Oberfläche mit einem zweiten Strahl bei der zweiten Wellenlänge, so daß die Intensität der Anti-Stokes-Raman-Emission von dem ersten Molekül bei der dritten Wellenlänge ansteigt; und d) Detektieren oder Identifizieren des Analyten durch Detektieren oder Identifizieren der Intensitätsänderung der Anti-Stokes-Emission aus der Grenzfläche bei der dritten Wellenlänge nach b) und c).
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin ein Aussetzen von weniger als etwa 10⁴ Molekülen eines Analyten wenigstens einer Raman-aktiven Oberfläche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin ein Aussetzen von weniger als etwa 10² Molekülen eines Analyten wenigstens einer Raman-aktiven Oberfläche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin ein Aussetzen von weniger als etwa 10 Molekülen eines Analyten wenigstens einer Raman-aktiven Oberfläche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin ein Bewegen des Analyten durch einen Kanal umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, das weiterhin ein Detektieren und Identifizieren des Analyten in einem wäßrigen Medium umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Oberfläche durch ein Element bereitgestellt wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Siliciumsubstrat, das mit einem Metall oder einem leitfähigen Material beschichtet ist, einem metallischen oder leitfähigen Nanopartikel, einem Aggregat von metallischen oder leitfähigen Nanopartikeln, einem Kolloid von metallischen oder leitfähigen Nanopartikeln und Kombinationen daraus besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Analyt aus einer Gruppe ausgewählt ist, die einer Aminosäure, Peptid, Polypetid, Protein, Polyprotein, Glycoprotein, Lipoprotein, Nukleosid, Nukleotid, Oligonukleotid, Nukleinsäure, Zucker, Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Polysaccharid, Fettsäure, Lipid, Hormon, Metabolit, Cytokin, Chemokin, Rezeptor, Neurotransmitter, Antigen, Allergen, Antikörper, Substrat, Metabolit, Cofaktor, Inhibitor, Arzneistoff, Pharmazeutikum, Nährstoff, Prion, Toxin, Gift, Sprengstoff, Pestizid, chemisches Kampfmittel, biologisch gefährliches Mittel, Bakterien, Virus, Radioisotop, Vitamin, heterozyklische aromatische Verbindung, Carcinogen, Mutagen, Narkotikum, Amphetamin, Barbiturat, Haluzinogen, Abfallprodukt und Verunreinigung besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Analyt ein Nukleosid, Nukleotid, Oligonukleotid, Nukleinsäure, Aminosäure, Peptid, Polypeptid oder Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem Analyt eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Analyt eng mit einer Raman-aktiven Oberfläche verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Raman-aktiven Oberflächen mit organischen Verbindungen covalent modifiziert sind.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Kanal aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Mikrofluidkanal, einem Nanokanal, einem Mikrokanal und Kombinationen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Nanopartikel eine Größe zwischen etwa 1 nm und 2 μm besitzen.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Größe der Nanopartikel aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus etwa 10 bis 50 nm, etwa 50 bis 100 nm, etwa 10 bis 100 nm, etwa 100 nm und etwa 200 nm besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, das aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Aluminium und Kombinationen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Raman-Detektionsvorrichtung aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Photodioden, Lawinenphotodioden, CCD-Anordnungen, CMOS-Anordnungen, verstärkten CCDs und Kombinationen davon besteht.
Verfahren wie im Anspruch 1 beansprucht, das weiterhin ein Vergleichen der detektierten Intensität für den Analyten mit einem vorhergehend identifizierten Analyten umfaßt, so daß die Identität des Analyten bestimmt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–22 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–20 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–19 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–18 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–17 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–16 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–15 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–14 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–13 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren einen optischen Wirkungsquerschnitt von wenigstens etwa 10^–12 cm² pro Molekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Analyt mit einer oder mehreren unterscheidbaren Raman-Markierungen markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin ein Anlegen eines elektrischen Felds zum Bewegen des Analyten durch den Kanal umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jede Art von Analyten ein eindeutiges Rahmen-Signal erzeugt.
Vorrichtung zum Detektieren von weniger als etwa 10³ Molekülen eines Analyten, wobei die Vorrichtung folgendes umfaßt: a) eine Einrichtung zum Erzeugen eines ersten Strahls einer elektromagnetischen Strahlung bei einer ersten Wellenlänge; b) eine Einrichtung zum Erzeugen eines zweiten Strahls einer elektromagnetischen Strahlung bei einer zweiten Wellenlänge, wobei sich die zweite Wellenlänge von der ersten Wellenlänge unterscheidet; c) eine Probenzelle; d) eine Einrichtung zum Einführen des Analyten und einer Raman-aktiven Oberfläche zu der Probenzelle; e) eine Optik zum Fokussieren des ersten Strahls und des zweiten Strahls auf eine Grenzfläche zwischen dem Analyten und der Raman-aktvien Oberfläche; und f) eine Einrichtung zum Detektieren einer aus der Grenzfläche zwischen dem Analyten und der Raman-aktiven Oberfläche emittierten Lichtintensität, die zum Empfangen der Emission angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei die Einrichtung zum Erzeugen des ersten Strahls einer elektromagnetischen Strahlung und die Einrichtung zum Erzeugen eines zweiten Strahls einer elektromagnetischen Strahlung zwei gepulste Laser umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei die Optik eine Mikroskopobjektivlinse, einen Spiegel, ein Prisma oder Kombinationen davon umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei die Probenzelle folgendes aufweist: a) einen Probenzellenkörper eines Materials, das die Probe von Umgebungsluft isoliert; b) ein Fenster in dem Probenzellenkörper aus einem Material, das für elektromagnetische Strahlung transparent ist, und c) wenigstens einen Anschluß zum Einführen und Entfernen des Analyten und optional der Raman-aktiven Oberfläche.
Vorrichtung nach Anspruch 32, bei der die Einrichtung zum Einführen eines Analyten und einer Raman-aktiven Oberfläche zu der Probenzelle eine Mikrofluidvorrichtung umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 32, bei der die Einrichtung zum Detektieren der aus der Grenzfläche emittierten Lichtintensität eine Differenz-Photodetektionsvorrichtung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Photodioden, Lawinen-Photodioden, CCD- Anordnungen, CMOS-Anordnungen, verstärkter CCDs und Kombinationen davon besteht.
Vorrichtung zum Detektieren von weniger als 10³ Molekülen eines Analyten, wobei die Vorrichtung folgendes aufweist: a) eine Reaktionskammer; b) einen ersten Kanal in Fluidverbindung mit der Reaktionskammer; c) einen zweiten Kanal in Fluidverbindung mit dem ersten Kanal; d) eine Probenzelle in Fluidverbindung mit dem ersten und dem zweiten Kanal; e) mehrere Nanopartikel, Nanopartikelaggregate, Nanopartikelkolloide oder ein Metallbeschichtetes Substrat in der Durchflußzelle; f) einen Laser; und g) einen Oberflächen-verstärkten kohärenten Anti-Stokes-Raman-Detektor, der funktionell mit der Durchflußzelle verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 38, bei der der Raman-Detektor eine CCD-Kamera oder eine Photodiodenanordnung aufweist.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem die CCD-Kamera oder die Photodiodenanordnung funktionell mit einer Datenverarbeitungseinheit verbunden ist.
Gerät nach Anspruch 3 8, bei dem die Datenverarbeitungseinheit einen Computer umfaßt.
Gerät nach Anspruch 38, das weiterhin eine erste Elektrode und eine zweite Elektrode aufweist, wobei die Elektroden dazu dienen, einzelne Analyten aus dem ersten Kanal in den zweiten Kanal zu bewegen.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem der erste Kanal ein Mikrofluidkanal ist.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem der zweite Kanal ein Nanokanal oder ein Mikrokanal ist.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem die Nanopartikel Metall sind.
Gerät nach Anspruch 45, bei dem das Metall Silber, Gold, Platin, Kupfer und/oder Aluminium umfaßt.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem eine Durchflußzelle funktionell mit dem Raman-Detektor verbunden ist, wobei der Fluß durch das Metall-beschichtete nanokristalline poröse Silicumsubstrat innerhalb der Probenzelle strömt.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem das Metall-beschichtete Substrat in einen integrierten Chip oder ein mikroelektromechanisches System (MEMS) eingebaut ist.
Gerät nach Anspruch 38, bei dem die Detektionseinheit einen Laser und eine CCD-Kamera umfaßt.