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Die
Erfindung betrifft ein Datenerfassungsverfahren mit einem Laser
Scanner-Gerät zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern
befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden
Proben. Ein zur Verwendung mit dem erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahren
geeignetes Laser Scanner-Gerät umfasst einen Probentisch
mit einer Aufnahme für Objektträger in einer Probenebene;
mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum Bereitstellen
mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden
Proben; einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden
Scanner-Kopf mit einem optischen Umlenkelement zum Umlenken der
Laserstrahlen zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in
mindestens einer Bewegungsrichtung; ein erstes Objektiv zum Fokussieren
der Laserstrahlen auf der Probe in der Ebene; ein zweites optisches
System zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen an der Probe
ausgelösten und durch das erste Objektiv und das Umlenkelement
umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln zu mindestens einem
Detektor; einen Weggeber, der Weggeber-Signale aussendet, die den momentanen
Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen;
ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen des
Detektors mit einer definierten Zeitkonstante; und einen A/D-Wandler
zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale.
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Zum
Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, fluoreszierenden
Proben werden seit langem konventionelle optische Rastermikroskope
verwendet. Immer häufiger finden wegen der verbesserten
Auflösung konfokale optische Rastermikroskope Verwendung.
Ein solches Mikroskop ist beispielsweise aus
GB 2 184 321 A bekannt. Dieses
Mikroskop lenkt das Licht einer Laserquelle entlang eines opti schen
Pfads, um mit dem fokussierten Lichtstrahl eine sich in der Objektebene
des Mikroskops befindende Probe abzurastern bzw. „zu scannen".
Der von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahl wird zum Entrastern
durch den gleichen optischen Pfad zurückgelenkt, mittels
eines Dichroidspiegels vom Anregungsstrahl getrennt und auf einer
konfokalen Öffnung vor einem Detektor abgebildet. Damit
wird aus der Fluoreszenz einer Probe ein Bild geformt, ohne dass
das auf die Probe gerichtete Licht zum Auslösen der Fluoreszenz
auf den Detektor treffen kann.
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Viele
der im Handel erhältlichen Mikroskope beruhen auf dieser
Konstruktion und weisen Strahlteiler oder Filter zum Unterteilen
des von der Probe emittierten Lichts in Strahlen mit unterschiedlichem
Wellenlängenbereich auf. Dadurch können auch zwei
fluoreszierende Farbstoffe verwendet und deren Emission mit zwei verschiedenen
Detektoren gemessen werden.
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Allerdings
weisen alle konfokalen Scanner-Systeme, welche die beiden Anregungslichtstrahlen
mit den beiden unterschiedlichen Wellenlängen auf denselben
Abtastfleck lenken, den Nachteil auf, dass die Abgrenzung der beiden
Emissionssignale nur spektral erfolgen kann. Da die Absorption und/oder
die Fluoreszenzemissionsspektren der verwendeten Farbstoffe sich
meist überlappen, können sie (insbesondere bei
grösseren Intensitätsunterschieden) nicht zuverlässig
und quantitativ unterschieden werden. Damit nicht in zeitraubender
Weise zuerst ein Bild mit einem ersten Fluoreszenzspektrum und dann
ein zweites Bild mit einer anderen Art des Anregungsstrahls erzeugt
werden muss, wurden Abtastmikroskope und „Scanner-Geräte"
vorgeschlagen, die zumindest zwei Anregungsstrahlen mit unterschiedlicher
Ausrichtung bereitstellen.
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Ein
solches Mikroskop ist beispielsweise aus
US 5,304,810 bekannt, welches mit
zwei oder mehr räumlich voneinander getrennten Beleuchtungsstrahlen
zwei oder mehr räumlich voneinander getrennte Beleuchtungspunkte
erzeugt und eine Probe simultan mit diesen Beleuchtungspunkten abrastert.
Die dadurch simultan erzeugten, räumlich voneinander getrennten
Fluoreszenzemissionsstrahlenbündel werden entsprechend
ihrer jeweiligen Rasterposition simultan mittels individuellen,
auf diese räumlich voneinander getrennten Beleuchtungspunkte
ausgerichteten Detektoren gemessen. Auch aus
US 6,628,385 B1 ist ein
solches Mikroskop bekannt, das mittels zwei Anregungslasern zwei
separate Lichtflecke auf einer Probe erzeugt. Dabei durchstossen
die beiden Anregungsstrahlen unter leicht unterschiedlichen Winkeln
eine Öffnung in einem 45°-Spiegel und treffen
dann auf ein Objektiv-Element. Dies bewirkt das Bereitstellen von
zwei voneinander getrennten Lichtflecken auf der Probe, wobei an
jedem Lichtfleck ein Emissionsstrahlenbündel erzeugt wird. Die
beiden resultierenden Emissionsstrahlenbündel werden am
45°-Spiegel reflektiert und treffen auf eine Sekundärlinse
auf, wonach sie direkt oder nach einer zweiten Umlenkung jeweils
einen von zwei Detektoren erreichen. Zudem können optische
Trennelemente, wie Dichroidfilter oder Prismen vor den als Photomulitplier ausgebildeten
Detektoren positioniert werden. Zum Abrastern der Proben kann ein
zwischen dem 45°-Spiegel und dem Objektiv-Element angeordnetes
Rastersystem verwendet werden.
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Aus
WO 02/059677 A1 ist
ein optisches System zum Anregen und Messen von Fluoreszenz an oder in
mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten Proben bekannt. Dieses System
umfasst zumindest einen Laser zum Anregen der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe,
einen Spiegel zum Umlenken des Laserlichts in Richtung einer Probe,
ein Umlenkelement zum Umlenken des Lichts aus dem Laser auf diesen
Spiegel in einer Y-Richtung eines (hier kartesischen) Koordinatensystems,
eine Optik zum Bilden eines ersten Brennpunktes des Laserlichts
auf der Probe, eine den Spiegel und die Optik umfassende, in der
Y-Richtung bewegliche Raster-Einheit, einen in der X- und Z-Richtung
des Koordinatensystems bewegbaren Probentisch zum Ausrichten der
Probe gegenüber dem ersten Brennpunkt, eine optische Anordnung
zum Abbilden des von der Probe emittierten Lichts in einer in einem
zweiten Brennpunkt angeordneten Lochblende und einen Detektor zum
Messen der Intensität des die Lochblende durchtretenden
Lichts.
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Diese
bekannten Mikroskope zum hochempfindlichen Abrastern von in einem
regelmässigem Muster (einem sogenannten Array) angeordneten
Proben sind zudem befähigt, einen ganzen Standard-Objektträger für
die Lichtmikroskopie abzurastern und arbeiten bei mittlerer Auflösung
zufriedenstellend. Es ist aber zu beachten, dass beim Erhöhen
der Auflösung zusätzliche Effekte, wie dynamische
Verschiebungen zwischen den Farbkanälen sichtbar werden
können. Dadurch liegen beispielsweise die Abbildungspunkte
des roten und des grünen Kanals nicht mehr genau übereinander.
Die relative Verschiebung kann sich zwischen den Kanälen über
die Ausdehnung des Bildes dynamisch ändern. Zudem hängt
diese Verschiebung wesentlich von der Positioniergenauigkeit der
Probe im Fokus ab. Aus diesen Gründen ist eine relative
Verschiebung nachträglich per Software nur sehr schwer
korrigierbar.
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Sollen
die beiden Kanäle nicht nur spektral sondern auch räumlich
voneinander getrennt werden, so müssen die beiden Fokalpunkte
der Anregungslaser auf der Probe voneinander getrennt werden. Dies
lässt sich nur dadurch erreichen, dass die gebündelten
Lichtstrahlen der beiden Laser in einem zwar kleinen aber doch signifikanten
Winkel zueinander auf das Scanobjektiv fallen. Es ist allgemein
bekannt, dass alle in einem bestimmten Winkel auf das Objektiv auftreffenden
Strahlen auf denselben Punkt innerhalb der Fokalebene fokussiert
werden. Ein bestimmter Einfallswinkel vor dem Objektiv entspricht
also immer einem bestimmten Ort hinter dem Objektiv. In diesem Zusammenhang
ist es unerheblich, ob der Laserstrahl das Objektiv in dessen Mitte
oder in irgend einem anderem Teilbereich der Objektivapertur trifft;
die Bündelung in ein und demselben Fokuspunkt ist davon
nicht betroffen. Unterschiedlich ist jedoch der Strahlwinkel hinter
dem Objektiv, die Strahlen treffen nun aus unterschiedlichen Richtungen
im Fokuspunkt zusammen. Im exakten Fokalpunkt spielt dies keine
Rolle, in Ebenen die geringfügig darunter oder darüber
liegen, jedoch schon. Dort entfernen sich die Strahlen vom exakten
Fokuspunkt in Abhängigkeit von diesem Winkel unterschiedlich
schnell.
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Sollen
nun zwei Laserstrahlen entsprechend diesen Vorgaben auf einer Probe
und in der Fokalebene räumlich getrennt voneinander fokussiert
werden und bilden diese Laserstrahlen deshalb beim Einfall auf das Scanobjektiv
einen Winkel zueinander, so führt dies zwangsläufig
dazu, dass zumindest einer der beiden Laserstrahlen vor dem Auftreffen
auf das Spiegelelement jetzt auch nicht mehr exakt parallel zur
Scanachse verlaufen kann.
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Wird
nun der Scanner-Kopf bewegt, ändert sich der Auftreffpunkt
des Laserstrahls auf das Objektiv. Der Strahl wird zwar nach wie
vor auf denselben Fokalpunkt abgelenkt werden, aber unter verschiedenen
Winkeln. Ausserhalb der Fokalebene ergeben sich dann entsprechend
dem oben gesagten unterschiedliche Positionen je nach Stellung des
Scanner-Kopfes in X-Richtung und je nach der Abweichung der Probenebene von
der exakten Fokalebene in Z-Richtung. Die letztere Abweichung ist
im Rahmen von realistischen Gerätetoleranzen nie vollständig
auszuschliessen und als zufällige Toleranz auch nicht beliebig
gut kontrollierbar.
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Die
beschriebenen Effekte sind an sich klein, sie machen sich jedoch
im Beispielsaufbau bei Auflösungen unterhalb von 5 μm
signifikant bemerkbar. Die beschriebenen Effekte können
dazu führen, dass die Bilder der beiden Detektionskanäle
nicht über den gesamten Bildbereich deckungsgleich sind,
und dass das Ausmass der Abweichungen unkontrolliert über
das Bild variiert. Quantitative Vermessungen von sehr kleinen Strukturen
werden dadurch unmöglich oder zumindest verfälscht.
Visuell machen sich die Fehler als lokal variierende Farbsäume
bemerkbar.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein alternatives
Datenerfassungsverfahren zum Abbilden von auf Objektträgern
befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben
mit einem Laser Scanner-Gerät vorzuschlagen, mit welchem
die Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts zusätzlich
verbessert wird.
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Diese
Aufgabe wird mit einem Datenerfassungsverfahren mit einem Laser
Scanner-Gerät zum pixelgenauen Abbilden von auf Objektträgern
befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden
Proben gelöst, das die Merkmale des unabhängigen
Anspruchs 1 umfasst. Ein zur Durchführung dieses Datenerfassungsverfahrens
geeignetes Laser Scanner-Gerät umfasst:
- a)
einen Probentisch mit einer Aufnahme für Objektträger
in einer Probenebene;
- b) mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum
Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden
Proben;
- c) einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden
Scanner-Kopf mit einem optischen Umlenkelement zum Umlenken der
Laserstrahlen zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in
mindestens einer Bewegungsrichtung;
- d) ein erstes Objektiv zum Fokussieren der Laserstrahlen auf
der Probe in der Ebene;
- e) ein zweites optisches System zum Weiterleiten von durch die
Laserstrahlen an der Probe ausgelösten und durch das erste
Objektiv und das Umlenkelement umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln
zu mindestens einem Detektor;
- f) einen Weggeber, der Weggeber-Signale aussendet, die den momentanen
Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen;
- g) ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen
des Detektors mit einer definierten Zeitkonstante; und
- h) einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale.
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Das
erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren ist dadurch
gekennzeichnet, dass die gefilterten Detektor-Signale des A/D-Wandlers
und die Weggeber-Signale unabhängig, parallel und kontinuierlich
von einer Rechnereinheit bzw. einer Steuerung erfasst und auf eine
gemeinsame Zeitbasis bezogen werden, wobei die A/D-Wandlung so häufig
erfolgt, dass jedem Pixel eines Bildes stets mehr als ein Datenpunkt
des A/D-Wandlers zugeordnet wird.
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Zusätzliche
bevorzugte Ausführungsformen und erfindungsgemässe
Merkmale ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Vorteile
des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens umfassen:
- – Durch die kontinuierliche Datenerfassung
ist die tatsächliche Datenerfassungszeit identisch mit
der insgesamt zur Verfügung stehenden Scanzeit. Das heisst,
100% der anfallenden Signale, insbesondere der eintreffenden Photonen,
werden auch erfasst. Es gibt somit keine Lücken oder Totzeiten
in denen die Datenerfassung eintreffende Signale nicht registrieren
kann. Dies steht im Gegensatz zu den herkömmlichen Systemen,
die aktiv geschaltete Integratoren verwenden und deren tatsächliche
Integrationszeit stets um die Löschzeit verringert ist.
Die Löschzeit entfällt im vorgestellten Verfahren,
sämtliche eintreffenden Photonensignale werden ohne Lücke
erfasst. Diese höhere Erfassungsrate bedeutet eine höhere
Empfindlichkeit des Systems, da diese entsprechend den Gesetzen
der Photonenstatistik direkt von der Gesamtzahl der erfassten Photonensignale
abhängt.
- – Im herkömmlichen Ansatz wird der Beginn
der Integrationszeit durch die aufeinanderfolgenden Weggebersignale
ausgelöst. Dies hat zur Folge, dass stets sichergestellt
sein muss, dass Integrationszeit und Löschzeit immer vollständig
abgeschlossen sind, bevor der nachfolgende Triggerimpuls eintrifft.
Da die Weggebersignale einen signifikanten „Jitter" (Instabilität)
aufweisen (bis zu ±30%) kann das fixe Integrationsintervall
maximal so gross sein, wie der kleinste mögliche Abstand
zwischen 2 Triggersignalen des Weggebers. Dadurch gehen im konventionellen
Verfahren wiederum bis zu 30% der eigentlich verfügbaren Messzeit
verloren. Im Gegensatz dazu nutzt das erfindungsgemäße
Verfahren den Duty Cycle (Arbeitszyklus) voll aus, was wiederum
ein gesteigerte Empfindlichkeit zur Folge hat.
- – Da Weggebersignale und Datenerfassung unabhängig
voneinander aufgezeichnet werden, ist die einstellbare Pixelauflösung
des Systems frei skalierbar und unabhängig von der Weggeberteilung
wie dies in konventionell betriebenen Systemen der Fall ist.
- – Da mindestens zwei Rohdatenpunkte pro Pixel verwendet
werden, kann ein Filter mit kleinerer Integrationskonstante verwendet
werden. Somit ist das Abklingverhalten zwischen zwei aufeinanderfolgenden
Pixeln beschleunigt und es resultiert eine bessere Auflösung
an starken Hell/Dunkel Übergängen.
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Das
erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren mit dem dafür
bevorzugten Laser Scanner-Gerät soll nun an Hand von schematischen
Zeichnungen, die den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken
sollen und die lediglich Beispiele von besonders bevorzugten Ausführungsformen
darstellen, erläutert werden. Dabei zeigen:
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1 einen
vertikalen Teilschnitt durch zwei Objektträgermagazine
und einen vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines
Objektträgers aus dem Proben-Magazin auf den Objekttisch;
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2 einen
horizontalen Teilschnitt durch die Objektträgermagazine
und eine Draufsicht auf den vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer
eines Test-Objektträgers aus dem Testobjekt-Magazin auf
den Objekttisch;
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3 vertikale Ansichten der Objektträgermagazine
mit geöffnetem Testobjekt-Magazin, wobei
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3A die
Einschubseite der beiden Objektträgermagazine in einer
Frontansicht vom Objekttisch her gesehen, und
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3B die
beiden Objektträgermagazine im Vertikalschnitt mit Blick
gegen den Objekttisch hin zeigt;
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4 vertikale Teilschnitte durch den Objekttisch
und dessen Querneigevorrichtung, wobei:
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4A den
Objekttisch mit Blick gegen die Objektträgermagazine und
mit einem im geschlossenen Objekttisch doppelt gehaltenen Objektträger,
und
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4B den
Objekttisch mit Blick von den Objektträgermagazinen weg,
mit geöffnetem Objekttisch, nach dem Entfernen bzw. vor
dem Einschieben eines Objektträgers zeigt;
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5 einen
vertikalen Teilschnitt durch den Objekttisch und dessen Höhenverstellung
und Längsneigevorrichtung;
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6 eine
Prinzipskizze mit wesentlichen optischen Elementen des Laser Scanner-Geräts
mit einem Scanner-Kopf gemäss einer ersten Ausführungsform;
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7 Prinzipskizzen des Scanner-Kopfes, wobei:
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7A eine
zweite Ausführungsform des Scanner-Kopfes, und
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7B eine
dritte Ausführungsform des Scanner-Kopfes zeigt;
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8 einen
horizontalen Teilschnitt durch ein Laser Scanner-Gerät
mit wesentlichen optischen Elementen, einer Scanner-Einrichtung
mit Scanner-Kopf und einem Objekttisch mit Objektträgermagazinen;
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9 einen
horizontalen Teilschnitt durch den Scanner-Kopf des Laser Scanner-Geräts
mit dem zugeordneten Weggeber;
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10 eine
Prinzipskizze des Weggebers für den Scanner-Kopf und dessen
nichtlineare Bewegung beim Scannen als X/t-Diagramm, welches auf
die unterschiedliche Zeitdauer (Δt1; Δt2) für die Erfassung des von einem
Objekt ausgehenden Fluoreszenzlichtes je nach der Position einer
Anzahl Pixel (Δx) auf der X-Achse hinweist;
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11–15 Diagramme
von Lösungsvorschlägen, in denen die Signalintegration
(I) in Funktion der Zeit (t) dargestellt ist, wobei:
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11 einen
ersten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem der Weggeber
die Datenerfassung mit einem passiven Integrator triggert;
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12 einen
zweiten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem der Weggeber
die Datenerfassung mit einem schaltbaren Integrator bei konstanter
Integrationszeit triggert;
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13 einen
dritten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem das Weggeber-Signal
als Ereignis zeitlich erfasst und jedem Signal über eine
Zeitbasis der Zeitpunkt seines Auftretens zugeordnet wird, wobei
die Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis getriggert
wird;
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14 einen
vierten Lösungs-Vorschlag entsprechend dem dritten Lösungs-Vorschlag
zeigt, wobei jedoch ein passives RC-Glied zur Integration verwendet
wird;
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15 einen
fünften Lösungs-Vorschlag zeigt, welcher dem vierten
Lösungs-Vorschlag entspricht, wobei aber mehrere Messungen
pro Pixel ausgeführt werden.
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1 zeigt
einen vertikalen Teilschnitt durch zwei Objektträgermagazine
und einen vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines
Objektträgers aus dem Proben-Magazin auf den Objekttisch.
Diese beiden Objektträgermagazine gehören zu einem
erfindungsgemässen Laser Scanner-Gerät 1 zum
Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen,
mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben.
Dieses Laser Scanner-Gerät umfasst einen eine Probenebene 49 definierenden
Probentisch 2 und eine motorisierte Transportvorrichtung 3 zum
Bewegen eines Objektträgers von einer Aufbewahrungseinheit 4 zum
Probentisch 2 und zurück. Dabei umfasst die Aufbewahrungseinheit 4 je
einen, zumindest je eine Lagerstelle 6 aufweisenden und
während des Betriebs des Laser Scanner-Geräts 1 für
die Transportvorrichtung 3 zugänglichen Probenteil 7 für
Proben-Objektträger 8 und Testteil 9 für
Test-Objektträger 10. In diesem erfindungsgemässen
Laser Scanner-Gerät ist der Testteil 9 vom Probenteil 7 getrennt
und als mit dem Laser Scanner-Gerät 1 fest verbundenes
Testteil-Magazin 9' für einen oder mehrere Test-Objektträger 10 ausgebildet.
Dadurch ist ein im Testteil 9 aufbewahrter Test-Objektträger 10 im
Betriebszustand des Laser Scanner-Geräts 1 für
eine Bedienungsperson manuell nicht zugänglich. Dies hat
den Vorteil, dass jederzeit ein geeigneter Test-Objektträger
bereitgestellt werden kann, ohne dass ein solcher Test-Objektträger 10 durch
unsachgemässe Manipulationen durch Bedienungspersonen verschmutzt
oder gar beschädigt werden kann. Das hier abgebildete Testteil-Magazin 9' umfasst
eine offene Einschubseite 15.
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In
der hier dargestellten Ausführungsform ist der Probenteil 7 axial über
dem Testteil 9 angeordnet und der Testteil 9 der
Aufbewahrungseinheit 4 ist mit einer gegenüber
dem Probentisch 2 des Laser Scanner-Geräts 1 beweglichen
Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 fest
verbunden. Dabei ist hier die Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 im
Wesentlichen senkrecht gegenüber der Probenebene 49 des
Probentisches 2 verschiebbar. So kann ein beliebiger Objektträger 8, 10 auf
das Niveau der vom Probentisch 2 definierten Probenebene 49 gebracht
und zu einem linearen Transport auf den Probentisch 2 bereit
gestellt werden.
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Es
wird bevorzugt, dass die Probenebene 49 des Probentisches 2 im
Wesentlichen horizontal angeordnet ist, wobei der Probentisch 2 einen
Objektträger 8, 10 über sich
trägt. Allerdings kann der Probentisch 2 auch über
Kopf angeordnet werden, so dass der eingesetzte Objektträger 8, 10 unter
dem Probentisch angeordnet ist. Auch eine beliebige andere Lage
der Probenebene 49 im Raum ist grundsätzlich denkbar,
wird aber weniger bevorzugt.
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Das
Laser Scanner-Gerät 1, gemäss der in 1 abgebildeten,
ersten Ausführungsform umfasst vorzugsweise ein Gehäuse 5,
wobei der Probenteil 7 als von aussen in das Gehäuse 5 des
Laser Scanner-Geräts 1 einsetzbares Magazin 7' für
eine Vielzahl von Proben-Objektträgern 8 ausgebildet
ist. Der Probenteil 7 ist bevorzugt reversibel an der Stellplatte 11 der
Aufbewahrungseinheit 4 montierbar. In der gezeigten Ausführungsform
verbindet eine steckbare Schwalbenschwanzverbindung das Probenteil-Magazin 7' mit
der hier vertikal beweglichen Stellplatte 11. Somit kann
das Probenteil-Magazin 7' am Handgriff 42 festgehalten
und in im wesentlichen vertikaler Richtung in das Gehäuse 5 gesenkt
und am Schwalbenschwanz 43 der Stellplatte 11 eingesteckt
werden. Da hier die beiden Magazine 7', 9' senkrecht übereinander
angeordnet sind, stellt das fest mit der Stellplatte 11 verschraubte
Testteil-Magazin 9' vorzugsweise gerade den unteren Anschlag
für das in den Schwalbenschwanz 43 eingeschobene
Probenteil-Magazin 7' dar.
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Die
Lagerstellen 6 im Probenteil-Magazin 7' und/oder
im Testteil-Magazin 9' sind zur Aufnahme von Objektträgern
ausgebildet, welche im Wesentlichen die Abmessungen eines Standardobjektträgers
für die Lichtmikroskopie aufweisen. Vorzugsweise sind diese
Lagerstellen 6 voneinander durch Lagerstege 12 getrennt,
so dass diese Objektträger auf jeweils zwei sich jeweils
im Wesentlichen über die ganze Länge der Objektträger 8, 10 erstreckenden
Lagerstegen 12 ruhen.
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Der
in der 1 in einem Vertikalschnitt gezeigte Probentisch 2 ist
zum Transfer von Proben-Objektträgern 8 oder von
Test-Objektträgern 10 mittels eines an einer Aufhängung 83 angeordneten
Spindeltriebes 84 unmittelbar vor eine Aufbewahrungseinheit 4 für
solche Objektträger 8, 10 verfahrbar
ausgebildet. Die Aufnahme 34 des Probentisches 2 umfasst
vorzugsweise zwei einander gegenüber liegende Nuten 35 zum
Aufnehmen der beiden Längskanten 14 eines Pro ben-Objektträgers 8 oder
eines Test-Objektträgers 10. Die Probenebene 49 ist
dabei bevorzugt im Wesentlichen horizontal angeordnet. Der Probentisch 2 umfasst
zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in
im wesentlichen senkrechter Richtung zur Oberfläche der Objektträger
zwei feststehende Stege 36 und einen federnd gegen diese
Stege 36 beweglichen Backen 37 mit zwei aufstehenden
Seitenwänden 38, welche zusammen mit den Unterkanten
der Stege 36 die Öffnungsweite der Nuten 35 definieren
(vgl. auch 4).
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Bevorzugt überwacht
bzw. regelt eine Steuerung 40 einen Motor 87,
welche den Spindeltrieb 84 antreibt. Dadurch kontrolliert
die Steuerung 40 die Bewegungen des Probentisches 2.
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2 zeigt
einen horizontalen Teilschnitt durch die in der 1 gezeigten
Objektträgermagazine und eine Draufsicht auf den vor diesen
platzierten Objekttisch beim Transfer eines Test-Objektträgers
aus dem Testobjekt-Magazin auf den Objekttisch. Das hier abgebildete
Testteil-Magazin 9' umfasst eine offene Einschubseite 15,
welche in ihrer Breite zumindest teilweise von je einer, sich im
wesentlichen über die ganze Stapelhöhe des Magazins 9' erstreckenden,
individuell wegschwenkbaren Klappe 16 abdeckbar ist. Diese
Klappe 16 ist hier weggeschwenkt, so dass der abgebildete
Test-Objektträger aus der Einschubseite 15 des
Testteil-Magazins 9' herausgeschoben werden kann, ohne
dass er dabei von der wegschwenkbaren Klappe 16 behindert
würde.
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Damit
die Objektträger 8, 10 in den Magazinen 7', 9' im
wesentlichen spielfrei sitzen, umfasst jede dieser Lagerstellen 6 vorzugsweise
eine Anpressfeder 13, welche elastisch eine Längskante 14 eines
eingesetzten Objektträgers beaufschlägt. Zudem
wird durch den Federdruck die jeweils gegenüberliegende
Längskante 14 des Objektträgers 8, 10 in
einer durch das entsprechende Magazin 7', 9' definierten
Lage gehalten, welche geeignet ist, eine Referenz für den
Ursprung eines Koordinatensystems zu definieren. Desgleichen ist
der Probentisch 2 bevorzugt mit beweglichen Anpressteilen 39 in
der Form von Rollen ausgestattet (vgl. 2), welche
ebenfalls dieselbe Längskante 14 in einer definierten
Lage festhalten, wo durch wiederum eine Referenz für den
Ursprung des Koordinatensystems geschaffen wird.
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Zumindest
das Probenteil-Magazin 7' umfasst bevorzugt an einer der
Einschubseite 15 gegenüber liegenden Ecke eine
sich im wesentlichen über die ganze Stapelhöhe
erstreckende Kontrollöffnung 21 zum Feststellen
der An- oder Abwesenheit eines Objektträgers in einer bestimmten
Lagerstelle 6. Die An- oder Abwesenheit eines Objektträgers 8, 10 in
einer bestimmten Lagerstelle 6 kann mit unterschiedlichen
Methoden und Vorrichtungen festgestellt werden. So kann z. B. (vgl. 2)
ein sich im Wesentlichen horizontal ausdehnender Lichtstrahl 23 bzw.
eine Lichtschranke einer Kontrollvorrichtung 22 schräg
durch die Magazine 7', 9' gerichtet werden, falls
die Kontrollöffnung 21 für diesen Lichtstrahl 23 durchlässig
ist. Die Ablenkung, Streuung oder Abschwächung des Lichtstrahls 23 durch
einen in einem Lagerplatz 6 anwesenden Objektträger 8, 10 kann
einfach mit einem lichtempfindlichen Sensor festgestellt werden.
Während in 2 eine Kontrollöffnung 21 in
Form einer „abgeschnittenen Ecke" gezeigt ist, kann der
Lichtstrahl 23 auch durch die Einschubseite 15 in
die Magazine 7', 9' gesendet werden und auf der
entgegengesetzten, nicht abgeschnittenen Seite auf einen Sensor
auftreffen; eine schräge Ausrichtung gegenüber
der Transportrichtung der Objektträger 8, 10 und/oder das
Anbringen eines Umlenkspiegels (beides nicht gezeigt) ermöglichen
ebenfalls eine Detektion der Objektträger in ihren Magazinen
selbst bei angenähertem Probentisch 2.
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Bevorzugt
umfasst die Transportvorrichtung 3 des Laser Scanner-Geräts 1 einen
Entladeschieber 31, der im wesentlichen parallel zu der
Probenebene 49 durch die der Einschubseite 15 der
Magazine 7', 9' gegenüberliegende Seite
eingreifend und zum Transportieren eines Proben-Objektträgers 8 oder
eines Test-Objektträgers 10 aus seiner Lagerstelle 6 und
aus der Einschubseite 15 heraus zum Probentisch 2 ausgebildet ist.
Diese Transportvorrichtung 3 umfasst vorzugsweise zudem
einen Ladeschieber 32, der zum Transportieren eines Proben-Objektträgers 8 oder
eines Test-Objektträgers 10 aus dem Probentisch 2 und
durch die Einschubseite 15 hinein zu einem Lagerplatz 6 in
einem der Magazine 7', 9' ausgebildet ist. Besonders
bevorzugt wird, dass Ladeschieber 32 eine schwenkbare Klappe 33 umfasst,
welche hochgeschwenkt werden und so über den im Probentisch 2 eingesetzten
Objektträger 8, 10 wegbewegt werden kann,
ohne dass diese Klappe 33, welche um eine Achse 47 kippbar
ist, den Objektträger berührt. So kann diese Klappe über
den Objektträger 8, 10 bewegt und hinter
diesem abgesenkt werden, worauf der Objektträger von der
Klappe 33 erfasst und aus dem Probentisch 2 gezogen
werden kann. Das Hochschwenken der Klappe 33 ermöglicht
das Bewegen des Probentisches 2 und des darin eingesetzten
Objektträgers 8, 10 zum Ort der Scanner-Einrichtung 72.
Dieses Hochschwenken der Klappe 33 um die Kippachse 47 ermöglicht
somit die freie Bewegung des Probentisches 2, ohne dass
die Klappe 33 mit dem eingesetzten Objektträger 8, 10 in
Kontakt kommen kann.
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Bevorzugt
ist der Antrieb 44 für die bewegliche Stellplatte 11,
der Antrieb 45 für den Entladeschieber 31 und
der Antrieb 46 für den Ladeschieber 32 jeweils
ein Elektromotor, welcher von der Steuerung 40 gesteuert
und überwacht wird.
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Der
in der 2 gezeigte Probentisch 2 umfasst zum
klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in
im wesentlichen paralleler Richtung zur Oberfläche der
Objektträger gegen zumindest eine der Längskanten 14 des
Objektträgers bewegliche Anpressteile 39, welche
die Öffnungsbreite der Aufnahme 34 federnd begrenzen.
Dabei sind die gegen zumindest eine der Längskanten 14 des
Objektträgers beweglichen Anpressteile 39 bevorzugt
als Rollen mit je einer im Wesentlichen vertikalen Achse ausgebildet.
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Bevorzugt überwacht
bzw. regelt eine Steuerung 40 einen Motor 87,
welche den Spindeltrieb 84 antreibt. Dadurch kontrolliert
die Steuerung 40 die Bewegungen des Probentisches 2.
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3 zeigt vertikale Ansichten der Objektträgermagazine
mit geöffnetem Testobjekt-Magazin. Die 3A zeigt
dabei die Einschubseite der beiden Objektträgermagazine
in einer Frontansicht vom Objekttisch her gesehen. Die vertikal
bewegliche Stellplatte 11 ist auf der rechten Seite sichtbar
und ihre Beweglichkeit mit einem Doppelpfeil markiert. Der Probenteil 7 ist
gerade über dem Testteil 9 angeordnet, wobei das
Probenteil-Magazin 7' mit hier acht in den Lagerstellen 6 ruhenden
Proben-Objektträgern 8 axial über dem
Testteil-Magazin 9' mit hier zwei Test-Objektträgern 10 befestigt
ist. Die wegschwenkbare Klappe 16 des Probenteil-Magazins 7' ist
geschlossen, währenddem die wegschwenkbare Klappe 16 des
Testteil-Magazins 9' geöffnet ist und im Wesentlichen
die ganze Breite der Einschubseite des Testteil-Magazins 9' frei
gibt. Das Wegschwenken der wegschwenkbaren Klappe 16 des
Testteil-Magazins 9' wird hier durch die Exzenterwalze 19 bewerkstelligt,
welche auf die Winkelplatte 18 dieser Klappe drückt.
Die Exzenterwalze 19 wird bevorzugt zumindest nahe der
durch den Probentisch 2 definierten Probenebene 49 angeordnet,
so dass trotz dem Verschieben der Aufbewahrungseinheit 4 in
der Höhe immer die richtige Klappe 16 weggeschwenkt
wird. Die Anpressfedern des Testteil-Magazins 9' sind gut
zu sehen, wie sie federnd auf die eine Seitenkante 14 der Test-Objektträger 10 drücken.
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Die 3B zeigt
die beiden gleichen Objektträgermagazine im Vertikalschnitt
mit Blick gegen den Objekttisch hin. Die vertikal bewegliche Stellplatte 11 ist
auf der linken Seite sichtbar und ihre Beweglichkeit mit einem Doppelpfeil
markiert. Das Probenteil-Magazin 7' ist über den
Schwalbenschwanz 43 der Stellplatte 11 geschoben
und wird hier vom Testteil-Magazin 9' in einer konstanten
Position an der Stellplatte 11 gehalten. Das Testteil-Magazin 9' ist
hier mit der Stellplatte 11 fest verschraubt. Die Anpressfedern 13 des
Probenteil-Magazins 7' und des Testteil-Magazins 9' sind
hier gut auf der rechten Seite der Objektträgerstapel zu
sehen.
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4 zeigt vertikale Teilschnitte durch den
Objekttisch 2 und dessen Querneigevorrichtung bzw. den Kippmechanismus 79,
welcher einen motorisch angetriebenen Exzenter 80 und eine
einseitige Drehachse 81 umfasst. Dieser Kippmechanismus 79 dient
zum Ausrichten einer Probe bzw. eines Objektträgers 8, 10 gegenüber
einer Fokallinie 101, welche in einer Rasterebene 76 (vgl. 5)
verläuft. Der Fokus des ersten Objektivs 57 und
die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 des
Laser-Scanner Geräts 1 definieren diese Fokallinie 101.
Diese Fokallinie 101 selbst definiert zusammen mit dem
optischen Umlenkelement 56 des Scanner-Kopfs 50 die
Rasterebene 76. Diese Rasterebene 76 wird somit
durch die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 und
dessen optisches Umlenkelement 56 definiert. Diese Rasterebene 76 steht
dabei im Wesentlichen senkrecht zu der Probenebene 49.
Diese Fokallinie 101 ist definiert durch die Bewegungsrichtung 75 des
Scanner-Kopfes 50 und den Fokalpunkt 65 des Scannerobjektivs 57 und
liegt im richtig justierten Zustand des Geräts in der Probenebene 49.
Die Drehachse 81 kann als eigentliche Achse ausgebildet
sein (nicht gezeigt). Allerdings wird eine virtuelle Drehachse 81 bevorzugt,
welche durch eine Stahlfeder 104 gebildet wird. Diese Stahlfeder 104 ist
vorzugsweise mittels je eines Jochs 105 an dem Probentisch 2 oder
an dem Auflageteil 103 angeschraubt. Diese Stahlfeder 104 bewirkt
eine Gegenkraft zum Exzenter 80, so dass ein einfacher,
spielfreier Kippmechanismus für das Auflageteil 103 des
Probentischs 2 geschaffen wird.
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Die 4A zeigt
den Objekttisch 2 des Laser-Scanner Geräts 1 mit
Blick gegen die Objektträgermagazine 7', 9' und
mit einem im geschlossenen Objekttisch 2 doppelt gehaltenen
Objektträger 8. Der Probentisch 2 umfasst
einen Kippmechanismus 79 mit einem motorisch angetriebenen
Exzenter 80 und einer einseitigen Drehachse 81,
mit welchem Kippmechanismus 79 ein Objektträger 8, 10 oder
eine Probe gegenüber einer Fokallinie 101 ausgerichtet
werden kann. Diese Fokallinie 101 liegt vorzugsweise in
der Probenebene 49 und in einer Rasterebene 76,
die der Scanner-Kopf 50 mit seinem optischen Umlenkelement 56 und
seiner Bewegungsrichtung 75 definiert. Dabei steht die
Rasterebene 76 vorzugsweise senkrecht zu der Probenebene 49 (vgl.
auch 5). Mit dem Exzenter 80, der vorzugsweise
motorisch angetrieben ist, kann die Querneigung des Objektträgers 8, 10 bzw.
des Probentisches 2 korrigiert werden, so dass die Fokallinie 101 der
Scanner-Einrichtung 72 exakt in die Probenebene 49 zu
liegen kommt.
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Vorzugsweise
ist die Probenebene 49 im Wesentlichen horizontal angeordnet.
Die Aufnahme 34 des Probentisches 2 umfasst zwei
einander gegenüber liegende Nuten 35 (vgl. 4B)
zum Aufnehmen der beiden Längskanten 14 des gezeigten
Proben-Objektträgers 8 oder eines (nicht gezeigten)
Test-Objektträgers 10.
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Der
Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in
im Wesentlichen senkrechter Richtung zur Oberfläche der
Objektträger vorzugsweise ein Auflageteil 103 mit
zwei feststehenden Stegen 36. Zudem umfasst der Probentisch 2 einen
federnd gegen diese Stege 36 beweglichen Backen 37 mit
zwei aufstehenden Seitenwänden 38. Diese Seitenwände 38 definieren
zu sammen mit den Unterkanten der Stege 36 die Öffnungsweite
der Nuten 35. Der bewegliche Backen 37 ist mit
Federn 30 elastisch gegenüber dem Auflageteil 103 des
Probentisches 2 abgestützt, so dass diese Federn 30 die
beiden aufstehenden Seitenwände 38 des beweglichen
Backens 37 federnd gegen die Unterseite des Objektträgers 8 drücken.
Dadurch wird ein Proben-Objektträger bzw. ein Test-Objektträger 10,
der bevorzugt zumindest annähernd die Masse eines Glasobjektträgers
für die Lichtmikroskopie aufweist, in vertikaler Richtung
klemmend im Probentisch 2 gehalten.
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Der
Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8, 10 in
im Wesentlichen paralleler Richtung zur Oberfläche der
Objektträger gegen zumindest eine der Längskanten 14 des
Objektträgers 8 bewegliche Anpressteile 39,
welche die Öffnungsbreite der Aufnahme 34 federnd
begrenzen. Diese gegen zumindest eine der Längskanten 14 des
Objektträgers 8 beweglichen Anpressteile 39 sind
vorzugsweise als Rollen mit je einer im Wesentlichen vertikalen
Achse ausgebildet. Die den Rollen 39 gegenüber
liegende Nute 35 definiert einen Anschlag der Proben-Objektträger 8 bzw.
Test-Objektträger 10, der sich zur Definition der
Achse eines Koordinatensystems des Laser Scanner-Geräts 1 eignet.
In eine Aussparung 98 eintauchend ist hier zudem ein Senkdorn 88 dargestellt,
der beim Annähern des Probentisches 2 and die
Aufbewahrungseinheit 4 in den Probentische eindringt und
mit diesem Eindringen den Backen 37 und die Seitenwände 38 von den
Stegen 36 des Auflageteils 103 wegzieht.
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Die 4B zeigt
den Objekttisch 2 mit Blick von den Objektträgermagazinen 7', 9' weg,
mit geöffnetem Objekttisch 2, nach dem Entfernen
bzw. vor dem Einschieben eines Objektträgers 8, 10.
Weil sich gerade kein Objektträger 8, 10 im
Probentisch 2 befindet, sind die rollenförmigen
Anpressteile 39 in ihrer Extremposition. Aus dieser Extremposition
werden die rollenförmigen Anpressteile 39 gegen
den Druck von Federelementen verdrängt, sobald ein Objektträger 8, 10 in
den Probentisch 2 eingeschoben wird. Ebenfalls gut sichtbar
ist hier, wie der Senkdorn 88 an einer Rampe 89 aufläuft,
so dass der bewegliche Backen 37 des Probentischs 2 etwas
heruntergezogen und so das Einschieben eines Objektträgers 8, 10 in
die Aufnahme 34 des Probentischs 2 ermöglicht
wird.
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5 zeigt
einen vertikalen Teilschnitt durch den Objekttisch sowie dessen
Höhenverstellung und Längsneigevorrichtung. Die
durch den Probentisch 2 definierte Probenebene 49 ist
in im wesentlichen der Z-Richtung (hier in der Vertikalen) verstellbar,
indem der an einer Aufhängung 83 linear befestigte
und linear verschiebbare Probentisch 2 zusammen mit dieser
Aufhängung 83 auf einem motorisch angetriebenen
Exzenter 106 aufliegt und schwenkbar an einem Rahmen 82 einseitig
befestigt ist. Wird der Exzenter 106 etwas gedreht, so
hebt oder senkt sich entsprechend die Aufhängung 83 mit
dem Probentisch 2. Mit dieser Bewegung kann die Ebene des
Probentischs 2, also die Probenebene 49, mit der
Ebene einer Lagerstelle 6 im Probenteil-Magazin 7' oder
im Testteil-Magazin 9' der Aufbewahrungseinheit 4 in Übereinstimmung
gebracht werden, so dass ein linearer Transfer zwischen einem dieser
Magazine 7', 9' und dem Probentische erfolgen
kann. Vorzugsweise wird das entsprechende Magazin in der Z-Richtung
durch eine Verschiebung der beweglichen Stellplatte 11 bereitgestellt,
so dass nur eine allfällige Feinabstimmung mit dem Exzenter 106 der
Probentischaufhängung 83 erfolgen muss. Mit dem
Exzenter 106, der vorzugsweise motorisch angetrieben ist,
kann die Längsneigung des Objektträgers 8, 10 bzw.
des Probentisches 2 korrigiert werden, so dass die Fokallinie 101 der
Scanner-Einrichtung 72 exakt in die Probenebene 49 zu
liegen kommt. Tatsächlich findet mit der Korrektur der
Längsneigung auch eine Verschiebung in der Höhe,
also entlang einer Z-Achse, statt.
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Zum
Zweck eines solchen Objektträgertransfers wird der Probentisch 2 vorzugsweise
möglichst weit der Aufbewahrungseinheit 4 in der
im Wesentlichen horizontalen Y-Richtung angenähert. Beim
Annähern des Probentischs 2 an die Aufbewahrungseinheit 4 dringt
ein Senkdorn 88 in den Probentisch 2 ein und senkt
dadurch eine Auflage der Aufnahme 34 des Probentischs 2 zum
Aufnehmen eines Objektträgers ab. Dadurch wird der Probentisch 2 zur
Aufnahme eines Objektträgers 8, 10 bereit
gestellt. Diese Annäherung geschieht bevorzugt mittels
eines an der Aufhängung 83 gelagerten Spindeltriebes 84 und
entlang einer Linearführung 85. Der Spindeltrieb 84 ist über
eine flexible Kupplung 86 mit dem Motor 87 verbunden,
so dass eine exakte Linearführung des Probentischs 2 in
im Wesentlichen der Y-Richtung auch dann erfolgen kann, wenn die
Probenebene 49 einen geringen Neigungswinkel zur Horizontalen
einschliesst. Ziel der Verstellbarkeit des Probentischs 2 mit
dem Exzenter 80 ist hauptsächlich das Ausrichten
der Probenebene 49 zu einer Fokallinie 101, die
durch einen in der X-Richtung (hier senkrecht zur Zeichnungsebene)
schwingenden Scanner-Kopf 50 des Laser Scanner-Geräts 1 definiert
wird. Dieser Scanner-Kopf 50 bewegt sich sehr schnell in
der X-Richtung und auf der Oberseite einer Trennplatte 99.
Diese Trennplatte weist eine Rasteröffnung 90 auf.
Bevorzugt ist der Scanner-Kopf 50 in diese Rasteröffnung 90 eingesenkt,
so dass die von ihm ausgehenden Lichtstrahlen die Probe in geringem
Abstand treffen, und dass der Scanner-Kopf 50 die von der
Probe kommenden Fluoreszenzemission so effektiv wie möglich
aufnehmen und an einen Detektor 61 oder an mehrere Detektoren 61, 61' weiter
leiten kann.
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Die 6 zeigt
eine Prinzipskizze mit wesentlichen optischen Elementen des Laser
Scanner-Geräts 1 mit einem Scanner-Kopf 50 gemäss
einer ersten Ausführungsform. Das Laser Scanner-Gerät 1 zum
Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen,
mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden
Proben umfasst einen motorisch verfahrbaren Probentisch 2 mit
einer Aufnahme für einen Proben-Objektträger 10 in
einer Probenebene 49. Ein erster Laser 51 und
ein zweiter Laser 52 sowie ein erstes optisches System 53 stellen
zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu dieser Ebene 49 verlaufenden
Laserstrahlen 54, 55 unterschiedlicher Wellenlänge
bereit. Eine Scanner-Einrichtung 72 umfasst einen parallel
zu dieser Ebene 49 hin und her beweglichen Scanner-Kopf 50 mit
einem optischen Umlenkelement 56 zum Umlenken der Laserstrahlen 54, 55 zu
der Probe hin. Ein erstes Objektiv 57 fokussiert die Laserstrahlen 54, 55 auf
der Probe in der Ebene 49. Dieses erste Objektiv 57 weist
eine Hauptebene 107 auf, welche vorzugsweise parallel zur
Probenebene 49 angeordnet ist.
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Ein
zweites optisches System 58 leitet die durch die Laserstrahlen 54, 55 an
der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv 57 und
das Umlenkelement 56 in eine zur Ebene 49 im Wesentlichen
parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 zu
Detektoren 61, 61'. Zwei solche Detektoren 61, 61' erfassen
die von den Proben kommenden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 unterschiedlicher
Wellenlänge. Die Öffnungen der Blenden 48 weisen
bevorzugt einen grösseren Durchmesser als die fokussierten
Emissionsstrahlenbündel 59, 60 auf, sie können
jedoch auch den Dimensionen der fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 im
wesentlichen entsprechen, wodurch ein konfokales Laser Scanner-Gerät 1 geschaffen
würde.
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Das
optische Umlenkelement 56 des erfindungsgemässen
Laser Scanner-Geräts 1 umfasst einen keilförmigen
Dichroidspiegel 62 mit in einem Zwischenwinkel β zueinander
angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen 63, 64.
Dabei ist der keilförmige Dichroidspiegel 62 so
eingestellt, dass die beiden Laserstrahlen 54, 55 an
je einer der Oberflächen 63, 64 reflektiert
werden. Dabei bewirkt der keilförmige Dichroidspiegel 62 durch
den Zwischenwinkel β eine räumliche Trennung der
beiden resultierenden Fokuspunkte 65 und der beiden in
Richtung der Detektoren 61, 61' gelenkten Emissionsstrahlenbündel 59, 60.
Die beiden resultierenden Fokuspunkte 65, 65' sind
in einem Abstand 6 zu einander in der Probenebene 49 angeordnet.
In dieser in der 6 gezeigten ersten Ausführungsform
ist das optische Umlenkelement 56 ein keilförmiger
Dichroidspiegel 62. Bevorzugt ist dabei die hintere dichroidische
Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum
Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere
dichroidische Oberfläche 63 zum Spiegeln eines
zweiten Laserstrahls 55 und der beiden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 ausgebildet.
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Das
zweite optische System 58 umfasst an sich bekannte Elemente
wie ein zweites Objektiv 57', das die eintretenden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 in
je einem Punkt fokussiert. Das zweite optische System 58 umfasst
zudem eine Blende 48, deren Öffnungen bevorzugt
wesentlich grösser sind als die diese Öffnungen durchtretenden,
fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60.
Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform
beruht das Laser Scanner-Gerät 1 somit auf einem
nicht-konfokalen Abbildungsprinzip. Diese fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 treffen
danach auf je einem Detektor 61, 61' auf, welcher
die Intensität der jeweiligen Emissionsstrahlenbündel 59, 60 misst.
Dieses zweite Objektiv 57' kann als Achromat oder als einfache
Linse ausgebildet sein.
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Die 7 zeigt Prinzipskizzen des Scanner-Kopfes
des erdfindungsgemässen Laser-Scanner Geräts. Dabei
zeigt 7A eine zweite Ausführungsform
des Scanner-Kopfes 50, bei dem das optische Umlenkelement 56 als
Pentaspiegela nordnung 66 mit einem keilförmigen
Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet
ist. Wie schon in der ersten Ausführungsform (vgl. 6)
ist die hintere dichroidische Oberfläche 64 des
keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln
eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische
Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 und
der beiden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 ausgebildet.
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Die 7B zeigt
eine dritte Ausführungsform des Scanner-Kopfes 50,
bei dem das optische Umlenkelement 56 ebenfalls als Pentaspiegelanordnung 66 mit
einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem
einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist. Im Unterschied zu
der zweiten Ausführungsform (vgl. 7A) ist
die Anordnung des Dichroidspiegels 62 und des einfachen
Spiegels 67 vertauscht. Dabei ist die hintere dichroidische Oberfläche 64 des
keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln
eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische
Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 sowie
der ersten und zweiten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 ausgebildet.
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Es
versteht sich von selbst, dass die eben beschriebenen Ausführungsformen
und weitere Kombinationen beliebig vertauscht werden können.
Allerdings wird die erste Ausführungsform gemäss
der 6, bei der das optische Umlenkelement 56 als
keilförmiger Dichroidspiegel 62 ausgebildet ist
oder die zweite Ausbildungsform gemäss der 7A,
bei der das optische Umlenkelement 56 als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem
keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen
Spiegel 67 ausgebildet ist, bevorzugt. Für alle Pentaspiegelanordnungen 66 gilt,
dass die vordere Oberfläche 63 und der einfache
Spiegel 67 bevorzugt einen Winkel von 22.5° einschliessen.
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Die 8 zeigt
einen horizontalen Teilschnitt durch ein Laser Scanner-Gerät 1 mit
wesentlichen optischen Elementen eines ersten optischen Systems 53 zum
Bereistellen von Anregungslicht und eines zweiten optischen Systems 58 zum
Erfassen der ausgelösten Fluoreszenzemission der Proben,
einer Scanner-Einrichtung 72 mit Scanner-Kopf 50 und
einem Objekttisch 2 mit einer Objektträgermagazine 7', 9' umfassenden
Aufbewahrungseinheit 4. Bevorzugt sind alle wesentlichen
optischen Elemente und die Scanner-Einrichtung 72 auf einer
gemeinsamen Trennplatte 99 und der Probentisch 2 unterhalb
dieser Trennplatte 99 (vgl. 5) angeordnet.
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Die
wesentlichen optischen Elemente des ersten optischen Systems 53 sind
in einem Gehäuse 5 angeordnet und umfassen zumindest
einen ersten Laser 51 und optional einen zweiten Laser 52,
Filterräder 97 für die von dem oder den
Lasern 51, 52 ausgehenden Laserstrahlen 54, 55 sowie
eine Anzahl Dichroidspiegel 62 und einfacher Spiegel 67 zum
Umlenken der Laserstrahlen 54, 55 aus den Lasern 51, 52 in
eine zur X-Richtung parallelen Richtung.
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Die
wesentlichen optischen Elemente des zweiten optischen Systems 58 sind
im gleichen Gehäuse 5 angeordnet und umfassen
einen oder mehrere Detektoren 61, 61' diesen vorgeordnete
Filterräder 97 und Blenden 48 für
die von den Proben ausgehenden Emissionsstrahlenbündel 59, 60 sowie
eine Anzahl Dichroidspiegel 62 und einfacher Spiegel 67 zum
Umlenken der Emissionsstrahlenbündel 59, 60 aus
einer zur X-Richtung parallelen Richtung in Richtung der Detektoren 61, 61'.
Die Scanner-Einrichtung 72 umfasst einen Antrieb 71,
den Scanner-Kopf 50 und vorzugsweise einen Gegenschwinger 73 mit
einer dem Scanner-Kopf 50 gleichen oder zumindest äquivalenten
Masse zur Impulskompensation. Scanner-Kopf und Gegenschwinger sind
mittels Pleuelstangen 70, 70' mit dem Antrieb 71 verbunden
und an je einer präzisen Linearführung (nicht gezeigt)
befestigt. Durch den Antrieb 71 wird der Scanner-Kopf 50 in
eine schnelle hin und her Bewegung in einer Bewegungsrichtung 75 (vgl.
ausgefüllte Doppelpfeile) gebracht, welche gleichzeitig
die Scan-Achse 75 definiert. Dabei führt der Gegenschwinger 73 immer
eine entgegengesetzte Bewegung aus, wodurch es gelingt, die Trennplatte 99 und
damit das ganze Laser Scanner-Gerät 1 trotz der
bevorzugt hohen Rastergeschwindigkeit des Scanner-Kopfes 50 ruhig
zu halten. Die Scan-Achse 75 ist parallel zur X-Achse oder
fällt gerade mit dieser zusammen. Der Scanner-Kopf 50 umfasst
ein optisches Umlenkelement 56, welches z. B. als Dichroidspiegel 62 ausgebildet
ist. Dieses Umlenkelement 56 kann als Vollspiegel, Prisma,
Pentaprisma, Pentaspiegel-Konfiguration oder als Kombination aus
diesen hier aufgeführten Elementen ausgebildet sein. Dieses
Umlenkelement 56 lenkt einerseits die Laserstrahlen 54, 55 des
ersten optischen Systems 53 auf die Proben auf dem Probentisch 2 und
andererseits die von den Proben ausgesandten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 in
Richtung des zweiten optischen Systems 58.
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Senkrecht
zur X-Achse und Scan-Achse 75 verläuft die Bewegungsrichtung
des unterhalb der Trennplatte 99 angeordneten Probentischs 2 in
Richtung der Y-Achse. Vorzugsweise in einem Bereich ausserhalb der
Trennplatte 99 ist die Aufbewahrungseinheit 4 mit
den in einem Probenteil-Magazin 7' gelagerten Proben-Objektträgern 8 und
den in einem Testteil-Magazin 9' gelagerten Test-Objektträgern 10 angeordnet.
Die Anwesenheit eines Objektträgers 8, 10 in
einer bestimmten Lagerstelle 6 dieser Magazine 7', 9' wird
bevorzugt mittels einer Kontrollvorrichtung 22 überprüft.
Diese Kontrollvorrichtung umfasst vorzugsweise einen Lichtstrahl 23,
der zu diesen Kontrollzwecken eine Kontrollöffnung 21 durchdringt.
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Besonders
bevorzugt wird, dass ein Service Fachmann einen oder mehrere Test-Objektträger 10 individuell
in ein Probenteil-Magazin 7' einschiebt und dieses Probenteil-Magazin 7' auf
dem ordentlichen Wege in das Laser Scanner-Gerät 1 einsetzt.
Eine entsprechend programmierte Firmware in der Steuerung 40 des Laser
Scanner-Geräts 1 wird dann vorzugsweise per Eingabe
einer persönlichen Identifikationsnummer (PIN) des Service
Fachmanns bzw. per Eingabe eines Codes für die Service-Fachleute
aktiviert. Die so aktivierte Firmware befähigt die Steuerung 40 des
Laser Scanner-Geräts 1, den automatischen Transport
jedes dieser Test-Objektträger 10 aus dem Probenteil-Magazin 7' auf
den Probentisch 2 und weiter in eine Lagerstelle 6 des Teststeil-Magazins 9' zu
steuern. Gemäss diesem besonders bevorzugten Verfahren
wird jeder manuelle Eingriff in das Testteil-Magazin 9' verunmöglicht.
Nur in besonderen Notfällen könnte ein Service-Fachmann
mit geeigneten Werkzeugen die vorzugsweise in dem zusätzlichen
Gehäuse 29 eingeschlossenen Test-Objektträger 10 herausholen.
Vorzugsweise ist die Steuerung 40 des erfindungsgemässen
Laser Scanner-Geräts 1 zum Steuern einer automatisierten,
internen und an Hand von Test-Objektträgern 10 ausgeführten
Instrumentprüfung ausgebildet.
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Vorzugsweise
ist der Probentisch 2 zum Verfahren bis unmittelbar vor
die Aufbewahrungseinheit 4 motorisch angetrieben ausgebildet
und dessen Lage und Be wegung durch die Steuerung 40 kontrolliert.
Dasselbe gilt auch für die Stellplatte 11 der
Aufbewahrungseinheit 4 zum Auswählen des zu untersuchenden
Objektträgers 8, 10 und für
die drehbare Exzenterwalze 19 zum Wegschwenken der Klappen 16.
Zudem wird bevorzugt, dass auch der Entladeschieber 31 zum
Transportieren eines Objektträgers 8, 10 zu
dem Probentisch 2 für das automatisierte Auswählen
und Bereitstellen eines Proben-Objektträgers 8 oder
Test-Objektträgers 10 auf dem Probentisch 2 motorisch
angetrieben ausgebildet und dessen Lage und Bewegung durch die Steuerung 40 kontrolliert
sind. Dasselbe gilt auch für den Ladeschieber 32 zum
Transportieren eines Objektträgers 8, 10 zu der
Aufbewahrungseinheit 4 beim Zurücklegen derselben
in eine Lagerstelle 6 des Probenteil-Magazins 7' oder
des Testteil-Magazins 9'.
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Die 9 zeigt
einen horizontalen Teilschnitt durch den Scanner-Kopf 50 des
Laser Scanner-Geräts 1 mit dem zugeordneten Weggeber 91.
An einem Rahmen 82 ist eine Linearführung 68 befestigt,
an welcher der Scanner-Kopf 50 in der X-Richtung und in
eine Rasteröffnung 90 eintauchend, beweglich angeordnet
ist. In diesem Fall fällt die X-Achse mit der Bewegungsrichtung 75 des
Scanner-Kopfes 50 zusammen, wobei diese Bewegungsrichtung 75 gemeinsam
mit den zur unter dem Scanner-Kopf 50 angeordneten Probe
(nicht gezeigt) hin umgelenkten ersten und zweiten Laserstrahlen 54, 55 eine
Rasterebene 76 definiert. Diese Rasterebene 76 steht
bevorzugt senkrecht zu der Probenebene 49. Der Scanner-Kopf 50 umfasst
einen Massstab 77, der in einem Abstand zu einem fixierten,
linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 und
in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Der Probentisch 2 ist
vorzugsweise in einer rechtwinklig zur X-Achse 75 angeordneten
Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahrbar
ausgebildet und motorisch angetrieben.
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Der
Scanner-Kopf mit allen seinen optischen Elementen, Befestigungsmitteln,
dem Massstab 77 und einem Teil der Linearführung
weist einen Massenschwerpunkt 74 auf. Dieser Massenschwerpunkt 74 ist
in der Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 auf
einer Linie mit einem Pleuelangriffspunkt 69 angeordnet, welche
die Pleuelstange 70 des Scanner-Kopfes 50 mit
dem Antrieb 71 verbindet. Dieser Pleuelangriffspunkt 69 kann
z. B. als Achse ausgebildet sein; es wird jedoch bevorzugt, den
Pleuelangriffspunkt als Kreuzfedergelenk auszubilden.
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Die 10 zeigt
eine Prinzipskizze des Weggebers 91 für den Scanner-Kopf 50 und
dessen nichtlineare Bewegung beim Scannen als X/t-Diagramm. Dieses
X/t-Diagramm weist auf die unterschiedliche Zeitdauer (Δt1; Δt2)
für die Erfassung eines Pixels (Δx) je nach der
Position auf der X-Achse hin. Das Weggeber-Signal 92 entspricht
in etwa einer Sinuskurve, welche ihre Maxima an den Extrempunkten
(Endpunkten) einer Scan-Linie des Laser-Kopfes 50 aufweist.
Wegen der Umkehr der Scan-Richtung in diesen Endpunkten und der
dadurch verlangsamten Bewegung braucht der Scanner-Kopf in der Nähe
dieser Wendepunkte eine länger Zeit (Δt2) für die selbe Wegstrecke (Δx),
als mit der erreichbaren Höchstgeschwindigkeit des Scanner-Kopfes in
einer Mittelstellung zwischen den Wendepunkten, bei der dieselbe
Wegstrecke (Δx) in einer viel kürzeren Zeit (Δt1) durchlaufen wird. Das Pixel (Δx)
sowie der entsprechende Ort und Zeitpunkt wird miteinander korreliert
und der zu diesem Zeitpunkt gemessenen Intensität zugeordnet.
Die Summe aller gemessenen Pixel ergibt dann ein zweidimensionales
Bild. Die Korrelation des Ortes dieser Pixel in der Probenebene 49 mit
der Intensität der an diesem Ort gemessenen Fluoreszenzintensität
bestimmt in Kombination mit der Pixelgrösse letztendlich
die Auflösung des Laser-Scanner Geräts 1.
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Die 11 bis 15 zeigen
Diagramme von Lösungsvorschlägen, in denen die
Signalintegration (I) in Funktion der Zeit (t) dargestellt ist.
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Die 11 zeigt
einen ersten Lösungs-Vorschlag, bei welchem der Weggeber
die Datenerfassung mit einem passiven Integrator (RC Glied) triggert.
Dieser Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des
Laser Scanner-Geräts beinhaltet aber noch einige mögliche
Nachteile. So ist die gemessene Intensität am Rand des
Scanbereichs höher, da hier pro Pixel länger integriert
wird. Zudem wird die Auflösung des Laser Scanner-Geräts
wegen der Abklingcharakteristik des RC Glieds reduziert.
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Die 12 zeigt
einen zweiten Lösungs-Vorschlag, bei welchem der Weggeber
die Datenerfassung mit einem schaltbaren Integrator bei konstanter
Integrationszeit triggert. Dieser Lösungs-Vorschlag zur
Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts
beinhaltet aber noch einige, nicht akzeptable Nachtei le. So reduziert
die Löschzeit für den Integrator die Empfindlichkeit,
da diese Zeit nicht für die Signalerfassung zur Verfügung
steht. Diese Löschzeit besetzt insbesondere bei kleinen
Auflösungen, d. h. sehr kleinen ,Pixelzeiten` (pixel dwell
time) einen signifikanten Anteil der Messzeit. Zudem wird durch
den Löschvorgang selbst zusätzliches Rauschen
erzeugt. Es ergibt sich überdies ein sogenanntes „Undersampling"
am Rand des Scanbereichs. Auch können ungleiche Bedingungen
der Datenerfassung (kürzere oder längere Abstände
zwischen zwei Triggerpulsen) zu Inhomogenitäten zwischen
Zentral- und Randbereichen führen.
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Die 13 zeigt
einen dritten Lösungs-Vorschlag, bei welchem das Weggeber-Signal
als Ereignis zeitlich erfasst und jedem Signal über eine
Zeitbasis der Zeitpunkt seines Auftretens zugeordnet wird, wobei die
Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis getriggert
wird. Dem Vorteil gegenüber dem zweiten Lösungs-Vorschlag
zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts,
gemäss welchem nun über den ganzen Scanbereich
gleiche „elektronische Bedingungen" herrschen, stehen die
aus dem Lösungs-Vorschlag 2 bekannten Nachteile
gegenüber. Diese Nachteile ergeben sich dadurch, dass das
zusätzliche Rauschen, das durch den Löschvorgang
erzeugt wird, dass die Löschzeit die Empfindlichkeit reduziert.
-
Die 14 zeigt
einen vierten Lösungs-Vorschlag entsprechend dem dritten
Lösungs-Vorschlag, wobei jedoch ein passives RC-Glied zur
Integration verwendet wird. Der Vorteil gegenüber dem dritten
Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit
des Laser Scanner-Geräts liegt hier darin, dass nun keine
Einbussen bei der Empfindlichkeit mehr in Kauf genommen werden müssen,
da die Löschzeit und das zusätzliche Rauschen
durch den Löschvorgang entfallen. Hingegen besteht noch
der klare Nachteil wegen der durch die Abklingcharakteristik des
RC Glieds bedingte reduzierte Auflösung. Es wird hier angemerkt,
dass die Verkleinerung der Zeitkonstante des RC Glieds zwar die
Auflösungsproblematik lösen würde; dies
würde jedoch Einbussen bei der Empfindlichkeit mit sich
bringen. Die Zeitkonstante des RC Glieds muss mindestens in der
Grössenordnung eines Pixels liegen bevorzugt aber in der
Grössenordnung eines Datenerfassungsintervalls, da ansonsten
kurze Signale (typischerweise von einzelnen Photonen) evtl. übersehen,
d. h. nicht detektiert würden. Als Datenerfassungsintervall
wird die Zeit zwischen zwei Wandlungspunkten des A/D Wandlers bezeichnet.
-
Die 15 zeigt
einen fünften Lösungs-Vorschlag, welcher dem vierten
Lösungs-Vorschlag entspricht, wobei aber mehrere Messungen
pro Pixel ausgeführt werden. Vorzugsweise wird dabei die
Intensität eines Pixels als Mittelwert aller Datenpunkte
die innerhalb der Zeitmarken für dieses Pixel liegen berechnet (und
gegebenenfalls durch Interpolation noch verfeinert). Der letzte
noch bestehende Nachteil gegenüber dem vierten Vorschlag
wird hier eliminiert, weil sich durch die geringere Abklingzeit
des RC Glieds keine verringerte Auflösung mehr ergibt.
-
Die
Erkenntnisse aus den gezeigten, unterschiedlichen Lösungs-Vorschlägen
führen zu bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen
Datenerfassungsverfahrens:
Vorzugsweise wird jedes von einem
Detektor (61) erzeugte Detektorsignal (93) von
einem Integrator der Steuerung (40) integriert, wobei jedem
Teil eines integrierten Detektorsignals (93) über
die Zeitbasis (94) der Zeitpunkt des entsprechenden Weggeber-Signals
(92) zugeordnet wird, und wobei jede Signal-Integration
konstant fortlaufend von der Zeitbasis (94) getriggert
und von der Steuerung (40) mit konstanter Integrationszeit durchgeführt
wird.
-
Besonders
bevorzugt wird, dass die Signal-Integration mit einem passiven RC-Glied
ausgeführt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte
Zeitkonstante mindestens in der Grössenordnung eines Datenerfassungsintervalls Δd
liegt. Ein Datenerfassungsintervall ist eine in der Zeit konstant
durchlaufende Erfassung der integrierten Detektorsignale 93 zwischen
zwei Detektorsignalmaxima (vgl. Δd in 15).
-
Speziell
bevorzugt wird, dass die Intensität eines Pixels 95 als
Mittelwert aller Datenpunkte berechnet wird, die innerhalb von Zeitmarken 96 für
dieses Pixel 95 liegen. Zur weiteren Verfeinerung kann
auch ein Interpolationsverfahren, das un vollständig zwischen
den Zeitmarken eines Pixels liegende Datenerfassungsintervalle Δd
berücksichtigt und deren zugehörige Messwerte
anteilig interpoliert, zum Einsatz kommen.
-
Die 16 zeigt
einen bevorzugten Test-Objektträger 10, der das
Format eines Standardobjektträgers für die Lichtmikroskopie
aufweist und der ausschliesslich im Wesentlichen lichtstabile Teststrukturen 41 umfasst.
Als „im wesentlichen lichtstabil" wird eine Teststruktur
bezeichnet, wenn diese bei normaler Benutzung, d. h. bei der während
Testverfahren üblicherweise auftretenden Strahlenbelastung
keinen messbaren Schaden erleidet. Eine minutenlange oder gar stundenlange
Bestrahlung eines Test-Objektträgers 10 mit einem
Laserstrahl 54, 55, bzw. das Liegelassen eines
Test-Objektträgers 10 an einem ungeschützten
Ort für längere Zeit (beispielsweise gegenüber
dem Umgebungslicht exponiert) wird nicht als „normale Benutzung"
bezeichnet.
-
Die
folgende Tabelle 1 gibt einen Überblick über die
gebräuchlichsten Glasobjektträger für
die Lichtmikroskopie:
Typ | Inch:
1 × 3 Zoll | Metrisch:
25 × 75 mm |
Dimensionen: |
Länge × Breite | 76.2
mm × 25.4 mm | 76
mm × 25 mm |
(Toleranzen) | (±0.5
mm) | (±0.5
mm) |
Dicke: |
"standard" | 1.02
mm (±0.05 mm) | 1.02 mm
(±0.05 mm) |
"dick" | 1.2
mm (±0.1 mm) |
Behandlung: |
Ecken | scharf,
gefast | scharf,
gefast |
Kanten | scharf,
gefast | scharf,
gefast |
Oberflächen | blank,
sandgestrahlt, auf einer oder beiden Seiten | blank,
sandgestrahlt, auf einer oder beiden Seiten |
-
Der
in der 16 abgebildete, beispielhafte
Test-Objektträger 10 weist eine Fläche
mit einer Länge A von 75 mm einer Breite B von 25 mm sowie
eine Dicke C von 1 mm auf. Die eine Hälfte der Fläche
A/2 ist (beispielsweise mittels Schlei fen) mattiert. Die andere
Hälfte weist ein bevorzugtes Linien-Muster mit einer Breite
D von 20 mm auf.
-
Dieses
Linienmuster besteht bevorzugt aus einer mittels Maske erstellten,
aufgedampften Chromschicht. Die Grossbuchstaben E, F, G bezeichnen
eine bestimmte Anzahl Linienpaare pro Millimeter (lp/mm) und die
Kleinbuchstaben l, m, n, o bezeichnen bestimmte Masse wie folgt:
E
= 50 lp/mm; F = 100 lp/mm; G = 10 lp/mm;
l = 0.5 mm; m = 2
mm; n = 1 mm; o = 7 mm.
-
Alle
diese Teststrukturen 41 sind bevorzugt ausschliesslich
im Wesentlichen lichtstabil und nicht fluoreszierend.
-
Das
erfindungsgemässe Laser Scanner-Gerät 1 ist
zur Abbildung und Vermessung von zweidimensionalen Objekten ausgelegt.
Dementsprechend muss eine Empfindlichkeitskalibrierung genau für
diese „flachen" Objekte gültig sein. Zweidimensionale
Fluoreszenzproben, die sowohl lichtstabil als auch chemisch über lange
Zeiträume beständig sind, sind jedoch nicht oder
nur sehr schwer herzustellen.
-
Dagegen
können Objekte, die eine dreidimensionale Ausdehnung haben,
vermessen werden. Weil die an solchen dreidimensionalen Objekten
gemessenen Intensitäten aber stark von der Tiefenschärfe
des Laser Scanner-Geräts und von der jeweiligen Positionierung
im Fokus (d. h. in der Z-Richtung) abhängen, sind solche
dreidimensionalen Objekte nicht direkt zur Kalibrierung von Signalintensität
oder Empfindlichkeit geeignet. Als sogenanntes „Bulk-Material"
existieren jedoch Materialien 102, wie beispielsweise in
Kunststoff eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe oder dotierte Gläser,
die weitestgehend lichtstabil und chemisch beständig sind.
-
Die
Ausrichtung des Probentischs 2 und der Aufbewahrungseinheit
des Laser Scanner-Geräts 1 im Raum ist eigentlich
beliebig. Dasselbe gilt für die gut ausgewuchtete bzw.
mittels Gegenschwinger 73 impulskompensierte Scanner-Einrichtung 72.
Auch kann die Probenebene 49 des Probentisches 2 im
Wesentlichen horizontal aber kopfüber hängend
angeordnet sein. Allerdings wird eine stehende Anordnung des Probentischs
gemäss den 1 und 2 bzw. 4 bis 7 bevorzugt.
-
Gleiche
Merkmale oder Elemente des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 sind
jeweils mit gleichen Bezugszeichen versehen, auch wenn diese Elemente
nicht in allen Fällen im Detail beschrieben sind.
-
Bestandteil
des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens mit einem
Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen
von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen
behandelten, fluoreszierenden Proben bilden auch folgende Merkmale,
gemäss welchen:
- – Die Probenebene 49 im
Wesentlichen horizontal angeordnet ist und die Bewegungsrichtung 75 des
Scanner-Kopfs 50 vorzugweise eine X-Achse oder Scan-Achse
definiert, wobei der Probentisch 2 in einer dazu rechtwinklig
angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear
verfahren wird.
- – Zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel
zu der Probenebene 49 verlaufende Laserstrahlen 54, 55 unterschiedlicher
Wellenlänge mit dem mindestens einen Laser 51, 52 und
dem ersten optischen System 53 bereitgestellt und mit einem
optischen Umlenkelement 56 einer Scanner-Einrichtung 72 zu
der Probe hin umgelenkt werden. Bevorzugt werden diese Laserstrahlen 54, 55 mit
dem ersten Objektiv 57 auf der Probe in der Ebene 49 fokussiert,
wonach die durch die Laserstrahlen 54, 55 an der
Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv 57 und
das Umlenkelement 56 in eine zur Ebene 49 im wesentlichen
parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel 59, 60 unterschiedlicher
Wellenlänge mit dem zweiten optischen System 58 zu
zwei Detektoren 61, 61' geleitet und von diesen
Detektoren 61, 61' erfasst werden. Besonders bevorzugt
wird die Verwendung eines keilförmigen Dichroidspiegels 62 mit
in einem Zwischenwinkel β zueinander angeordneten vorderen
und hinteren dichroidischen Oberflächen 63, 64 als
Teil des optischen Umlenkelements 56. Dabei ist der keilförmige
Dichroidspiegel 62 vorzugsweise so eingestellt, dass die
beiden Laserstrahlen 54, 55 an je einer der Oberflächen 63, 64 reflektiert
werden, so dass der keilförmige Dichroidspiegel 62 durch
den Zwischenwinkel β eine räumliche Trennung von
beiden resultierenden Fokuspunkten 65 und von beiden in Richtung
der Detektoren 61, 61' gelenkten Emissionsstrahlenbündeln 59, 60 bewirkt.
- – Ein als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem
keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen
Spiegel 67 ausgebildetes, optisches Umlenkelement 56 verwendet
wird, wobei diese Pentaspiegelanordnung 66 Verkippungen
des Scanner-Kopfes 50 um eine zur Scan-Achse 75 rechtwinklig
verlaufende Y-Achse so korrigiert, dass die resultierenden Fokuspunkte 65 ihre
aktuelle Position in der Probenebene 49 nicht verändern.
- – Die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der
X-Achse 75 mit einem Massstab 77 gemessen wird,
welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem 78 des
Laser Scanner-Geräts 1 in dieser Rasterebene 76 angeordnet
ist. Alternativ wird bevorzugt, die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in
der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 zu messen,
welcher zumindest in der Nähe der Hauptebene 107 des
ersten Objektivs 57 angeordnet ist.
-
Speziell
bevorzugt wird, dass der Scanner-Kopf 50 mit seinem optischen
Umlenkelement 56 und seiner Bewegungsrichtung 75 eine
Rasterebene 76 definiert, welche senkrecht zu der Probenebene 49 steht,
wobei die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit
einem Massstab 77 gemessen wird, welcher in einem Abstand
zu einem linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 und
in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Dieser Massstab 77 ist
bevorzugt in der Rasterebene 76 oder zumindest in der unmittelbaren
Nähe dieser Rasterebene 76 angeordnet. Dieser
Massstab 77 ist bevorzugt zudem in der Hauptebene 107 des
ersten Objektivs 57 (vgl. 6 und 7) oder zumindest in der unmittelbaren
Nähe dieser Hauptebene 107 angeordnet.
-
An
der Stelle eines normalen Scans bzw. eines normalen abgerasterten
Feldes in XY-Richtung und damit parallel zur Probenebene 49 wird
ein Scan in XZ-Richtung (Z-Profil) durchgeführt, indem
ein Feld abgerastert wird, welches zumindest im wesentlichen senkrecht
auf der Probenebene 49 steht. Das direkt gemessene Z-Profil
stellt die gemessene Intensität in Abhängigkeit
von der Z-Koordinate dar (I = I(Z)). An der Stelle dieses Z-Profils
wird nun vorzugsweise die erste Ableitung der entsprechenden Intensitäten
(dI = dI(z)/dz) berechnet, womit wieder eine zweidimensionale Intensitätsverteilung
vorliegt. Das Maximum der ersten Ablei tung ist somit ein Mass für
die vom Laser Scanner-Gerät 1 an der Oberfläche
der Probe gemessenen Intensität.
-
Die
für dieses Kalibrierverfahren geeigneten Materialien 102 können
zusammen mit den aufgedampften Linienmustern auf dem gleichen Test-Objektträger 10 oder
auf einem separaten Test-Objektträger angeordnet werden.
Diese flachen, dreidimensionalen Materialien 102 weisen
bevorzugt eine zur Probenebene 49 parallele Ausdehnung
von 2 × 2 mm bis 10 × 10 mm auf und haben eine
Dicke von etwa 0.1 bis 2 mm, bevorzugt eine Dicke von ca. 1 mm (vgl. 16).
-
Ein
Fachmann kennt die Funktion eines Dichroidspiegels als optisches
Element, das für einen Teil des Wellenlängenspektrums
durchlässig ist und einen anderen Teil dieses Wellenlängenspektrums
spiegelt. Der Fachmann spricht hier deshalb von einer wellenlängenselektiven
Transmission und Reflektion. Sich für einen Fachmann aus
der vorliegenden Beschreibung ergebende Kombinationen bzw. Varianten
der beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
gehören zu deren Umfang.
-
- 1
- Laser
Scanner-Gerät
- 2
- Probentisch
- 3
- Transportvorrichtung
- 4
- Aufbewahrungseinheit
- 5
- Gehäuse
- 6
- Lagerstelle
- 7
- Probenteil
- 7'
- Probenteil-Magazin
- 8
- Proben-Objektträger
- 9
- Testteil
- 9'
- Testteil-Magazin
- 10
- Test-Objektträger
- 11
- bewegliche
Stellplatte
- 12
- Lagerstege
- 13
- Anpressfeder
- 14
- Längskante
Objektträger
- 15
- Einschubseite
- 16
- wegschwenkbare
Klappe
- 18
- Winkelplatte
- 19
- Exzenterwalze
- 21
- Kontrollöffnung
- 22
- Kontrollvorrichtung
- 23
- Lichtstrahl
- 29
- Zusätzliches
Gehäuse
- 30
- Feder
- 31
- Entladeschieber
- 32
- Ladeschieber
- 33
- schwenkbare
Klappe
- 34
- Aufnahme
- 35
- gegenüber
liegende Nuten
- 36
- feststehende
Stege
- 37
- beweglicher
Backen
- 38
- aufstehende
Seitenwände
- 39
- bewegliche
Anpressteile
- 40
- Steuerung
- 41
- lichtstabile
Teststrukturen
- 42
- Handgriff
- 43
- Schwalbenschwanz
- 44
- Antrieb
zu 11
- 45
- Antrieb
zu 31
- 46
- Antrieb
zu 32
- 47
- Kippachse
von 33
- 48
- Blende
- 49
- Ebene,
Probenebene
- 50
- Scanner-Kopf
- 51
- erster
Laser
- 52
- zweiter
Laser
- 53
- erstes
optisches System
- 54
- erster
Laserstrahl
- 55
- zweiter
Laserstrahl
- 56
- optisches
Umlenkelement
- 57
- erstes
Objektiv
- 57'
- zweites
Objektiv
- 58
- zweites
optisches System
- 59
- erstes
Emissionsstrahlenbündel
- 60
- zweites
Emissionsstrahlenbündel
- 61
- erster
Detektor
- 61'
- zweiter
Detektor
- 62
- Dichroidspiegel
- 63
- vordere
Oberfläche
- 64
- hintere
Oberfläche
- 65
- resultierende
Fokuspunkte
- 66
- Pentaspiegelanordnung
- 67
- einfacher
Spiegel
- 68
- Linearführung
- 69,
69'
- Pleuelangriffspunkt
- 70,
70'
- Pleuel,
Pleuelstange
- 71
- Antrieb
- 72
- Scanner-Einrichtung
- 73
- Gegenschwinger
- 74
- Massenschwerpunkt
- 75
- Bewegungsrichtung
X-Achse, Scan-Achse
- 76
- Rasterebene
- 77
- Massstab
- 78
- lineares
Messsystem
- 79
- Kippmechanismus
- 80
- Exzenter,
Exzentervorrichtung
- 81
- Drehachse
- 82
- Rahmen
- 83
- Aufhängung
- 84
- Spindeltrieb
- 85
- Linearführung
- 86
- Kupplung
- 87
- Motor
- 88
- Senkdorn
- 89
- Rampe
- 90
- Rasteröffnung
- 91
- Weggeber
- 92
- Weggeber-Signal
- 93
- Detektor-Signal
- 94
- Zeitbasis
- 95
- Pixel
- 96
- Zeitmarken
- 97
- Filterrad
- 98
- Aussparung
- 99
- Trennplatte
- 101
- Fokallinie
- 102
- flache
Materialien
- 103
- Auflageteil
von 2
- 104
- Stahlfeder
- 105
- Joch
- 106
- Exzenter,
Exzentervorrichtung
- 107
- Hauptebene
des Objektivs 57
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - GB 2184321
A [0002]
- - US 5304810 [0005]
- - US 6628385 B1 [0005]
- - WO 02/059677 A1 [0006]