WO2009103663A1 - Datenerfassungsverfahren mit einem laser scanner-gerät - Google Patents

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WO2009103663A1
WO2009103663A1 PCT/EP2009/051689 EP2009051689W WO2009103663A1 WO 2009103663 A1 WO2009103663 A1 WO 2009103663A1 EP 2009051689 W EP2009051689 W EP 2009051689W WO 2009103663 A1 WO2009103663 A1 WO 2009103663A1
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sample
data acquisition
acquisition method
laser
plane
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PCT/EP2009/051689
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Alois Schausberger
Andreas GFÖRER
Wolfgang Fuchs
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Tecan Trading Ag
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a data acquisition method comprising a laser scanner device for imaging and / or measuring fluorescent samples treated with microscope slides, a laser scanner device suitable for use with the data acquisition method according to the invention comprises a sample table with a receptacle for slides in a sample level; at least one laser and a first optical system for providing at least one laser beam for exciting the fluorescent samples; a motor driven, non-linearly moving in space scanner head with an optical deflecting element for deflecting the laser beams to the sample and for scanning this sample in at least one direction of movement; a first objective for focusing the laser beams on the
  • a second optical system for relaying emission beams to at least one detector triggered by the laser beams on the sample and deflected by the first objective and the deflection element; a transmitter which transmits encoder signals indicative of the current location of the scanner head with respect to a zero point; an electronic element for filtering detector signals of the detector with a defined time constant; and an A / D converter for digitizing the filtered detector signals.
  • optical scanning microscopes have long been used to image specimen-based fluorescent specimens.
  • confocal optical scanning microscopes are being used because of the improved resolution.
  • Such a microscope is known for example from GB 2 184 321 A known.
  • This microscope directs the light from a laser source along an optical path in order to scan or "scan" a specimen located in the object plane of the microscope with the focused light beam
  • the fluorescence beam emitted by the specimen is deswisted by the same optical path is deflected from the excitation beam by means of a dichroic mirror and imaged on a confocal aperture in front of a detector, thereby forming an image from the fluorescence of a sample without allowing the light directed to the sample to strike the detector.
  • Such a microscope is known, for example, from US Pat. No. 5,304,810, which generates two or more spatially separated illumination points with two or more spatially separated illumination beams and scans a sample simultaneously with these illumination points.
  • the spatially separated fluorescence emission bundles which are generated simultaneously thereby, are simulta- neously separated by means of individual scanning according to their respective raster position. len, on these spatially separated illumination points aligned detectors measured.
  • Such a microscope is also known from US Pat. No. 6,628,385 B1, which generates two separate light spots on a sample by means of two excitation lasers. The two excitation beams pierce an opening in a 45 ° mirror at slightly different angles and then hit an objective element.
  • optical separation elements such as dichroic filters or prisms, can be positioned in front of the detectors designed as photomultipliers.
  • a grid system arranged between the 45 ° mirror and the lens element can be used.
  • WO 02/059677 A1 discloses an optical system for exciting and measuring fluorescence on or in samples treated with fluorescent dyes.
  • This system comprises at least one laser for exciting the fluorescent dyes used, a mirror for deflecting the laser light in the direction of a sample, a deflecting element for deflecting the light from the laser onto this mirror in a Y direction of a (here Cartesian) coordinate system, optics for Forming a first focus of the laser light on the sample, a grid unit movable in the Y direction comprising the mirror and the optics, a sample table movable in the X and Z direction of the coordinate system for aligning the sample with the first focus, an optical arrangement for imaging the light emitted by the sample in a pinhole disposed in a second focal point and a detector for measuring the intensity of the light passing through the pinhole.
  • the two focal points of the excitation laser on the sample must be separated from one another. This can only be achieved if the collimated light beams of the two lasers fall onto the scan lens at a small but significant angle to one another. It is generally known that all of the rays incident on the lens at a certain angle are focused at the same point within the focal plane. A certain angle of incidence in front of the lens thus always corresponds to a specific location behind the lens. In this context, it does not matter whether the laser beam hits the lens in its center or in any other part of the objective aperture; the bundling in one and the same focal point is not affected.
  • the described effects are intrinsically small, but they make themselves significantly noticeable in the example setup at resolutions below 5 ⁇ m.
  • the described effects can lead to the fact that the images of the two detection channels are not congruent over the entire image area, and that the extent of the deviations varies uncontrollably over the image. Quantitative measurements of very small structures are thereby impossible or at least falsified. Visually, the errors are noticeable as locally varying color fringes.
  • the object of the present invention is to propose an alternative data acquisition method for imaging specimen-based fluorescent dye-treated fluorescent specimens with a laser scanner apparatus which further improves the sensitivity of the laser scanner apparatus.
  • a laser scanner apparatus suitable for carrying out this data collection method comprises: a) a sample table with a receptacle for slides in a sample plane; b) at least one laser and a first optical system for providing at least one laser beam for exciting the fluorescent samples; c) a motor driven, non-linearly moving in space scanner head with an optical deflecting element for deflecting the laser beams toward the sample and for scanning this sample in at least one direction of movement; d) a first objective for focusing the laser beams on the sample in the
  • a second optical system for relaying emission beam bundles triggered by the laser beams on the sample and deflected by the first objective and the deflection element to at least one detector; f) a transmitter which transmits encoder signals indicating the current location of the scanner head with respect to a zero point; g) an electronic element for filtering detector signals of the detector with a defined time constant; and h) an A / D converter for digitizing the filtered detector signals.
  • the inventive data acquisition method is characterized in that the filtered detector signals of the A / D converter and the Weggeber- signals independently, in parallel and continuously detected by a computer unit or a controller and based on a common time base, wherein the A / D conversion occurs so frequently that each pixel of an image is always assigned more than one data point of the A / D converter.
  • Advantages of the data acquisition method according to the invention include: Due to the continuous data acquisition, the actual data acquisition time is identical to the total available scan time. This means that 100% of the resulting signals, in particular the incoming photons, are also recorded. There are thus no gaps or dead times in which the data acquisition can not register incoming signals. This is in contrast to the conventional systems which use actively connected integrators and their actual integration time always around the erase time is reduced. The deletion time is eliminated in the presented method, all incoming photon signals are detected without gap. This higher detection rate means a higher sensitivity of the system, since it depends directly on the total number of detected photon signals according to the laws of photon statistics.
  • Weggebersignale have a significant "jitter” (instability) (up to ⁇ 30%), the fixed integration interval can be at most as large as the smallest possible distance between 2 trigger signals of the encoder. In contrast, the inventive method fully utilizes the duty cycle, which in turn results in increased sensitivity.
  • the adjustable pixel resolution of the system is freely scalable and independent of the path distribution as is the case in conventionally operated systems.
  • FIG. 2 shows a horizontal partial section through the slide magazines and a plan view of the object table placed in front of them during the transfer of a test slide from the test object magazine onto the object table;
  • FIG. 3 vertical views of the slide magazines with open test object magazine, wherein
  • Fig. 3A the insertion side of the two slide magazines seen in a front view of the object table ago
  • Fig. 3B shows the two slide magazines in vertical section with a view towards the stage down
  • FIG. 4A shows the object table with a view against the slide magazines and with a double object held in the closed object stage
  • FIG. 4B shows the object table looking away from the slide magazines, with the object table opened, after the removal or before the insertion of a slide
  • FIG. 5 shows a vertical partial section through the object table and its height adjustment and longitudinal tilting device
  • Fig. 6 is a schematic diagram showing essential optical elements of the laser scanner apparatus with a scanner head according to a first embodiment; 7 shows schematic sketches of the scanner head, wherein:
  • Fig. 7A shows a second embodiment of the scanner head
  • Fig. 7B shows a third embodiment of the scanner head
  • Figure 8 is a horizontal partial section through a laser scanner device with essential optical elements, a scanner device with scanner head and a stage with slide magazines.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of the scanner for the scanner head and its non-linear movement when scanning as an X / t - diagram, which on the different time duration (.DELTA.ti, .DELTA.t 2 ) for detecting the emanating from an object fluorescent light depending on the position of a Number of pixels ( ⁇ x) on the X axis;
  • Fig. 11 shows a first solution proposal, in which the
  • Encoder triggers data acquisition with a passive integrator
  • Fig. 12 shows a second solution proposal, in which the
  • Positioner triggers the data acquisition with a switchable integrator at a constant integration time
  • Fig. 13 shows a third solution proposal in which the displacement sensor signal as an event detected in time and each
  • Fig. 14 shows a fourth solution proposal according to the third solution proposal, but using a passive RC element for integration
  • Fig. 15 shows a fifth solution proposal, which the fourth
  • FIG. 1 shows a vertical partial section through two slide magazines and a slide placed in front of them during the transfer of a slide from the sample magazine to the slide.
  • These two slide magazines belong to a laser scanner device 1 according to the invention for imaging and / or measuring fluorescent samples which are located on microscope slides and treated with fluorescent dyes.
  • This laser scanner device comprises a sample table 2 defining a sample plane 49 and a motorized transport device 3 for moving a slide from a storage unit 4 to the sample table 2 and back.
  • the storage unit 4 comprises one, at least one bearing 6 each having and accessible during operation of the laser scanner device 1 for the transport device 3 sample part 7 for sample slides 8 and test part 9 for test slides 10.
  • test part 9 is separated from the sample part 7 and designed as a fixed to the laser scanner device 1 test part magazine 9 'for one or more test slides 10.
  • a test object carrier 10 stored in the test part 9 is not manually accessible to an operator in the operating state of the laser scanner device 1.
  • the test part magazine 9 'shown here comprises an open insertion side 15.
  • the sample part 7 is arranged axially above the test part 9 and the test part 9 of the storage unit 4 is provided with a relative to the sample table 2 of the laser scanner device 1 movable actuator plate 11 of the storage unit 4 firmly connected.
  • the adjusting plate 11 of the storage unit 4 is substantially perpendicular to the sample plane 49 of the sample table 2 slidably.
  • any object carrier 8, 10 can be brought to the level of the sample plane 49 defined by the sample table 2 and made available for linear transport onto the sample table 2.
  • sample plane 49 of the sample table 2 is arranged essentially horizontally, the sample table 2 carrying a slide 8, 10 over it.
  • the sample table 2 can also be arranged overhead, so that the inserted slide 8, 10 is arranged under the sample table. Any other position of the sample plane 49 in the room is conceivable in principle, but is less preferred.
  • the laser scanner device 1 preferably comprises a housing 5, wherein the sample part 7 can be used as a magazine 7 'which can be inserted externally into the housing 5 of the laser scanner device 1 for a plurality of sample slides 8 is formed.
  • the sample part 7 is preferably reversibly mountable on the positioning plate 11 of the storage unit 4.
  • a pluggable dovetail connection connects the sample compartment magazine 7 'to the vertically movable control panel 11.
  • the sample compartment magazine 7' can be retained on the handle 42 and lowered in a substantially vertical direction into the housing 5 and on the dovetail 43 of the adjusting plate 11 are inserted. Since here the two magazines 7 ', 9' are arranged vertically one above the other, the test part magazine 9 'screwed firmly to the adjusting plate 11 preferably represents just the lower stop for the sample part magazine 7' inserted into the dovetail 43.
  • the bearings 6 in the sample section magazine 7 'and / or in the test section magazine 9' are designed to accommodate slides which essentially have the dimensions of a standard slide for light microscopy.
  • these bearings 6 are separated from each other by bearing webs 12, so that these slides rest in each case on two bearing webs 12 each extending essentially over the entire length of the slides 8, 10.
  • the sample table 2 shown in vertical section in FIG. 1 is designed to be movable for transferring sample slides 8 or test slides 10 by means of a spindle drive 84 arranged on a suspension 83 directly in front of a storage unit 4 for such slides 8, 10.
  • the receptacle 34 of the sample table 2 preferably comprises two opposing grooves 35 for receiving the two longitudinal edges 14 of a sample slide 8 or a test slide 10.
  • the sample plane 49 is preferably arranged substantially horizontally.
  • the sample table 2 comprises for clampingly holding a slide 8,10 in a direction substantially perpendicular to the surface of the slide two fixed webs 36 and a resiliently against these webs 36 movable jaws 37 with two upstanding side walls 38, which together with the lower edges of the webs 36 define the opening width of the grooves 35 (see also Fig. 4).
  • a controller 40 monitors or controls a motor 87 which drives the spindle drive 84. As a result, the controller 40 controls the movements of the sample table 2.
  • FIG. 2 shows a horizontal partial section through the slide magazines shown in FIG. 1 and a plan view of the slide placed in front of them during the transfer of a test slide from the test object magazine to the slide.
  • the illustrated here test part magazine 9 'includes an open
  • each of these bearing points 6 preferably comprises a contact pressure spring 13, which elastically acts on a longitudinal edge 14 of an inserted slide.
  • the respectively opposite longitudinal edge 14 of the object carrier 8, 10 is held in a position defined by the corresponding magazine 7 ', 9' by the spring pressure, which position is suitable for defining a reference for the origin of a coordinate system.
  • the sample table 2 is preferably provided with movable pressing parts 39 in the form of rollers (see Fig. 2), which also hold the same longitudinal edge 14 in a defined position, which in turn creates a reference for the origin of the coordinate system.
  • At least the sample compartment magazine 7 ' preferably comprises, at a corner opposite the insertion side 15, a control opening 21 extending substantially over the entire stack height for detecting the presence or absence of a slide in a specific depository 6.
  • the presence or absence a slide 8,10 in a particular bearing 6 can be determined with different methods and devices.
  • a substantially horizontally expanding light beam 23 or a light barrier of a control device 22 can be directed obliquely through the magazines 7 ', 9', if the control opening 21 is permeable to this light beam 23.
  • the deflection, scattering or attenuation of the light beam 23 through a slide present in a storage space 6 8,10,10 can be easily detected with a photosensitive sensor.
  • the transport device 3 of the laser scanner device 1 comprises a discharge slide 31 which engages substantially parallel to the sample plane 49 through the side opposite the insertion side 15 of the magazines 7 ', 9' and for transporting a sample slide 8 or a test slide.
  • Object carrier 10 is formed from its storage location 6 and from the insertion side 15 out to the sample table 2.
  • This transport device 3 preferably also comprises a loading slider 32, which is designed for transporting a sample slide 8 or a test slide 10 out of the sample table 2 and through the insertion side 15 into a storage space 6 in one of the magazines 7 ', 9' is.
  • loading slider 32 comprises a pivotable flap 33, which can be swung up and so can be moved over the slide 8,10 used in the sample stage 2, without this flap 33, which is tiltable about an axis 47, touches the slide.
  • this flap can be moved over the slide 8,10 and lowered behind this, after which the slide can be detected by the flap 33 and pulled out of the sample table 2.
  • the pivoting of the flap 33 allows moving the sample table 2 and the slide 8,10 inserted therein to the location of the scanner device 72. This pivoting of the flap 33 about the tilt axis 47 thus allows the free movement of the sample table 2, without the flap 33rd can come into contact with the slide 8,10 used.
  • the drive 44 for the movable control plate 11, the drive 45 for the discharge slide 31 and the drive 46 for the charging slide 32 are each an electric motor, which is controlled and monitored by the controller 40.
  • the specimen stage 2 shown in FIG. 2 comprises, for clamping a specimen slide 8, 10 in substantially a parallel direction to the surface of the specimen slides against at least one of the longitudinal edges 14 of the slide movable Anpressmaschine 39, which limit the opening width of the receptacle 34 resiliently.
  • the pressing parts 39 movable against at least one of the longitudinal edges 14 of the object carrier are preferably designed as rollers, each having a substantially vertical axis.
  • a controller 40 monitors or controls a motor 87 which drives the spindle drive 84. As a result, the controller 40 controls the movements of the sample table 2.
  • FIG. 3 shows vertical views of the slide magazines with the test object magazine open.
  • FIG. 3A shows the insertion side of the two slide magazines viewed in a front view from the object table.
  • the vertically movable control plate 11 is visible on the right side and marked their mobility with a double arrow.
  • the sample part 7 is arranged just above the test part 9, wherein the sample part magazine 7 'with here eight resting in the bearings 6 sample slides 8 axially above the test part magazine 9' with here two test- personnelträgem 10 is attached.
  • the swing-away flap 16 of the sample compartment magazine 7 ' is closed, while the swing-away flap 16 of the test section magazine 9' is opened and releases substantially the entire width of the insertion side of the test section magazine 9 '.
  • the pivoting away the wegschwenkbaren flap 16 of the test part magazine 9 ' is accomplished here by the eccentric roller 19, which presses on the angle plate 18 of this flap.
  • the eccentric roller 19 is preferably arranged at least near the sample plane 49 defined by the sample table 2, so that in spite of the displacement of the storage unit 4 in height, the correct flap 16 is always pivoted away.
  • the pressure springs of the test part magazine 9 ' are easy to see as they press resiliently on the one side edge 14 of the test slides 10.
  • FIG. 3B shows the two same slide magazines in vertical section, looking towards the stage.
  • the vertically movable control plate 11 is visible on the left side and marked their mobility with a double arrow.
  • the sample part magazine 7 ' is pushed over the dovetail 43 of the adjusting plate 11 and is held here by the test part magazine 9' in a constant position on the adjusting plate 11.
  • the test part magazine 9 ' is here firmly screwed to the control plate 11.
  • the pressure springs 13 of the sample compartment magazine 7 'and of the test part magazine 9' can be seen here well on the right side of the slide stack.
  • FIG. 4 shows vertical partial sections through the object table 2 and its transverse pivoting device or the tilting mechanism 79, which comprises a motor-driven eccentric 80 and a unilateral axis of rotation 81.
  • This tilting mechanism 79 is used to align a sample or an object carrier 8, 10 with respect to a focal line 101, which runs in a raster plane 76 (see FIG.
  • the focus of the first objective 57 and the direction of movement 75 of the scanner head 50 of the laser scanner device 1 define this focal line 101.
  • This raster plane 76 becomes thus defined by the direction of movement 75 of the scanner head 50 and its optical deflection element 56.
  • This raster plane 76 is substantially perpendicular to the sample plane 49.
  • This focal line 101 is defined by the direction of movement 75 of the scanner head 50 and the focal point 65 of the scanner lens 57 and is in the correctly adjusted state of the device in the sample plane 49th Die
  • Rotary shaft 81 may be formed as an actual axis (not shown).
  • a virtual axis of rotation 81 is preferred, which is formed by a steel spring 104.
  • This steel spring 104 is preferably screwed by means of a respective yoke 105 on the sample table 2 or on the support part 103.
  • This steel spring 104 causes a counterforce to the eccentric 80, so that a simple, play-free tilting mechanism for the support part 103 of the sample table 2 is created.
  • FIG. 4A shows the object table 2 of the laser scanner device 1 with a view against the slide magazines 7 ', 9' and with a slide 8 held in a closed object table 2.
  • the sample table 2 comprises a tilting mechanism 79 with a motor-driven eccentric 80 and a one-sided rotation axis 81, with which tilting mechanism 79, a slide 8, 10 or a sample can be aligned with respect to a focal line 101.
  • This focal line 101 is preferably in the sample plane 49 and in a raster plane 76, which defines the scanner head 50 with its optical deflection element 56 and its direction of movement 75.
  • the raster plane 76 is preferably perpendicular to the sample plane 49 (see also Fig. 5).
  • the eccentric 80 which is preferably motor-driven, the transverse inclination of the slide can 8,10 and the sample table 2 are corrected so that the focal line 101 of the scanner device 72 comes to lie exactly in the sample plane 49.
  • the sample plane 49 is arranged substantially horizontally.
  • the receptacle 34 of the sample table 2 comprises two opposing grooves 35 (see Fig. 4B) for receiving the two longitudinal edges 14 of the sample slide 8 shown or a (not shown) test slide 10th
  • the specimen stage 2 preferably comprises a support part 103 with two fixed webs 36 for clamping a specimen slide 8, 10 in a substantially perpendicular direction to the surface of the specimen slides.
  • the specimen table 2 comprises a jaw 37 which is movable resiliently against these webs 36 and has two upstanding side walls 38 These movable side walls 38 together with the lower edges of the webs 36 define the opening width of the grooves 35.
  • the movable jaw 37 is resiliently supported by springs 30 against the support part 103 of the sample table 2 so that these springs 30 support the two upstanding side walls 38 of the movable jaw 37 press resiliently against the underside of the slide 8.
  • a sample slide or a test slide 10 which preferably has at least approximately the mass of a glass slide for light microscopy, is clamped in the sample table 2 in the vertical direction.
  • the sample table 2 comprises for clamped holding a slide 8,10 in a substantially parallel direction to the surface of the slide against at least one of the longitudinal edges 14 of the slide 8 movable Anpressmaschine 39, which limit the opening width of the receptacle 34 resiliently.
  • These pressing parts 39 which are movable against at least one of the longitudinal edges 14 of the object carrier 8, are preferably designed as rollers, each having a substantially vertical axis.
  • the grooves 35 opposite the rollers 39 define a stop of the sample slides 8 or test slides 10, which is suitable for defining the axis of a coordinate system of the laser scanner device 1.
  • FIG. 4B shows the object table 2 with a view away from the slide magazines 7 ', 9', with the object table 2 open, after the removal or before the insertion of a slide 8.10. Because there is currently no slide 8,10 in the sample table 2, the roller-shaped Anpressmaschine 39 are in their extreme position. From this extreme position, the roller-shaped pressing parts 39 are displaced against the pressure of spring elements as soon as a slide 8, 10 is inserted into the sample table 2. Also clearly visible here is how the
  • Senkdorn 88 runs on a ramp 89, so that the movable jaw 37 of the sample table 2 pulled down a little and so the insertion of a slide 8,10 in the receptacle 34 of the sample table 2 is possible.
  • Figure 5 shows a vertical partial section through the stage and its height adjustment and longitudinal tilt device.
  • the sample plane 49 defined by the sample table 2 can be adjusted substantially in the Z direction (here in the vertical direction) by the sample table 2 linearly attached to a suspension 83 and linearly displaceable together with this suspension 83 on a motor-driven eccentric 106 rests and is pivotally mounted on a frame 82 on one side. If the eccentric 106 is rotated slightly, the suspension 83 raises or lowers correspondingly with the sample table 2.
  • the plane of the sample table 2 that is the sample plane 49
  • the plane of a bearing 6 in the sample magazine 7 'or in the Test magazine 9 'of Aufbewahrung unit 4 are brought into line, so that a linear transfer between one of these magazines 7', 9 'and the sample table can be done.
  • the corresponding magazine in the Z-direction is provided by a displacement of the movable control plate 11, so that only a possible fine tuning must be done with the eccentric 106 of the sample table suspension 83.
  • the eccentric 106 which is preferably driven by a motor, the longitudinal inclination of the object carrier 8, 10 or of the sample table 2 can be corrected, so that the focal line 101 of the scanner device 72 comes to lie exactly in the sample plane 49.
  • the correction of the Longitudinal inclination also a shift in the height, ie along a Z-axis, instead.
  • the sample table 2 is preferably brought as far as possible closer to the storage unit 4 in the substantially horizontal Y direction.
  • a Senkdorn 88 in the sample table 2 When approaching the sample table 2 to the storage unit 4 penetrates a Senkdorn 88 in the sample table 2, thereby lowering a support of the receptacle 34 of the sample table 2 for receiving a slide from.
  • the sample table 2 is provided for receiving a specimen slide 8, 10.
  • This approach is preferably done by means of a mounted on the suspension 83 spindle drive 84 and along a linear guide 85.
  • the spindle drive 84 is connected via a flexible coupling 86 to the motor 87, so that an exact linear guide of the sample table 2 in substantially the Y direction also can then take place when the sample plane 49 includes a small angle of inclination to the horizontal.
  • the aim of the adjustability of the sample table 2 with the eccentric 80 is mainly the alignment of the sample plane 49 to a focal line 101, which is defined by a in the X direction (perpendicular to the plane of the drawing) oscillating scanner head 50 of the laser scanner device 1.
  • This scanner head 50 moves very quickly in the X-direction and on the top of a partition plate 99.
  • This partition plate has a grid opening 90.
  • the scanner head 50 is recessed into this raster aperture 90 so that the light rays emanating from it strike the sample at close range, and that the scanner head 50 receives the fluorescence emission coming from the sample as effectively as possible and to a detector 61 or to several detectors 61,61 'forward.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram with essential optical elements of the laser scanner device 1 with a scanner head 50 according to a first embodiment.
  • the laser scanner device 1 for imaging and / or measuring fluorescent samples treated on microscope slides and treated with two different fluorescent dyes comprises a motor-driven sample stage 2 with a receptacle for a sample slide 10 in a sample plane 49.
  • a first laser 51 and a second laser 52 and a first optical System 53 provide two parallel aligned and parallel to this plane 49 extending laser beams 54,55 different wavelength.
  • a scanner device 72 comprises a scanner head 50 which can be moved back and forth parallel to this plane 49 and has an optical deflection element 56 for deflecting the laser beams 54, 55 towards the sample.
  • a first objective 57 focuses the laser beams 54, 55 on the sample in the plane 49.
  • This first objective 57 has a main plane 107, which is preferably arranged parallel to the sample plane 49.
  • a second optical system 58 guides the emission beams 59, 60, triggered by the laser beams 54, 55 on the sample and deflected by the first objective 57 and the deflection element 56 in a direction substantially parallel to the plane 49, to detectors 61, 61 '. Two such detectors 61, 61 'detect the emission beams 59, 60 of different wavelengths coming from the samples.
  • the apertures of the apertures 48 preferably have a larger diameter than the focused emission beams 59,60, but they may also substantially correspond to the dimensions of the focused emission beams 59,60, whereby a confocal laser scanner device 1 would be created.
  • the optical deflection element 56 of the laser scanner device 1 comprises a wedge-shaped dichroic mirror 62 with front and rear dichroic surfaces 63, 64 arranged at an intermediate angle ⁇ to one another.
  • the wedge-shaped dichroic mirror 62 is adjusted so that the two laser beams 54, 55 are reflected on each of the surfaces 63, 64.
  • the wedge-shaped dichroic mirror 62 causes by the intermediate angle ß a spatial separation of the two resulting focus points 65 and the two in the direction of the detectors 61,61 'directed emission beam 59,60.
  • the two resulting focus points 65, 65 ' are arranged at a distance ⁇ to one another in the sample plane 49.
  • the optical deflection element 56 is a wedge-shaped dichroic mirror 62.
  • the rear dichroic surface 64 of the wedge-shaped dichroic mirror 62 is preferred for mirroring a first laser beam 54 and its front end.
  • re dichroidische surface 63 for reflecting a second laser beam 55 and the two emission beams 59,60 formed.
  • the second optical system 58 comprises elements known per se, such as a second objective 57 ', which focuses the incoming emission beams 59, 60 in one point at a time.
  • the second optical system 58 additionally comprises a diaphragm 48 whose apertures are preferably substantially larger than the focused emission beams 59, 60 passing through these apertures.
  • the laser scanner device 1 is thus based on a non-confocal imaging principle. These focused emission beams 59, 60 then impinge on a respective detector 61, 61 ', which measures the intensity of the respective emission beams 59, 60.
  • This second objective 57 ' can be designed as an achromatic lens or as a simple lens.
  • FIG. 7 shows schematic diagrams of the scanner head of the laser scanner device according to the invention.
  • FIG. 7A shows a second embodiment of the scanner head 50, in which the optical deflection element 56 is designed as a pentagonal seal arrangement 66 with a wedge-shaped dichroic mirror 62 and a simple mirror 67.
  • the rear dichroic surface 64 of the wedge-shaped dichroic mirror 62 for mirroring a first laser beam 54 and its front dichroic surface 63 is for mirroring a second laser beam 55 and the two emission beams 59, 60 educated.
  • FIG. 7B shows a third embodiment of the scanner head 50, in which the optical deflecting element 56 is likewise designed as a pentagonal seal arrangement 66 with a wedge-shaped dichroic mirror 62 and a simple mirror 67.
  • the arrangement of the dichroic mirror 62 and the simple mirror 67 is reversed.
  • the rear dichroic surface 64 of the wedge-shaped dichroic mirror 62 is configured to mirror a first laser beam 54 and its front dichroic surface 63 to mirror a second laser beam 55 and the first and second emission beams 59, 60.
  • the optical deflecting element 56 is in the form of a wedge-shaped dichroic mirror 62, or the second embodiment according to FIG. 7A, in which the optical deflecting element 56 is designed as a PTZ seal assembly 66 with a wedge-shaped dichroic mirror 62 and a simple mirror 67 is formed, preferably.
  • PentaLitean isten 66 holds that the front surface 63 and the simple mirror 67 preferably enclose an angle of 22.5 °.
  • FIG. 8 shows a horizontal partial section through a laser scanner device 1 with essential optical elements of a first optical system 53 for providing excitation light and a second optical system 58 for detecting the triggered fluorescence emission of the samples, a scanner device 72 with scanner
  • all the essential optical elements and the scanner device 72 are mounted on a common separating plate 99 and the sample table 2 below this separating plate 99 (see FIG ) arranged.
  • the essential optical elements of the first optical system 53 are arranged in a housing 5 and comprise at least a first laser 51 and optionally a second laser 52, filter wheels 97 for the laser beams 54, 55 emanating from the one or more lasers 51, 52 and a number of dichroic mirrors 62 and simple mirror 67 for deflecting the laser beams 54,55 from the lasers 51,52 in a direction parallel to the X direction.
  • the essential optical elements of the second optical system 58 are arranged in the same housing 5 and comprise one or more detectors 61, 61 'of these upstream filter wheels 97 and apertures 48 for the emission beams 59, 60 emanating from the samples as well as a number of dichroic mirrors 62 and simple mirrors 67 for deflecting the emission beam 59,60 from a direction parallel to the X direction in the direction of the detectors 61,61 '.
  • the scanner device 72 comprises a drive 71, the scanner head 50 and preferably a counteroscillator 73 with an equal or at least equivalent mass to the scanner head 50 for pulse compensation.
  • Scanner head and counter-oscillator are connected by means of connecting rods 70,70 'to the drive 71 and each fixed to a precise linear guide (not shown).
  • the drive 71 brings the scanner head 50 into rapid reciprocation in a direction of movement 75 (see filled double arrows) which simultaneously defines the scanning axis 75.
  • the counteroscillator 73 always performs an opposite movement, which makes it possible to keep the partition plate 99 and thus the entire laser scanner device 1 despite the preferred high scanning speed of the scanner head 50 quiet.
  • the scan axis 75 is parallel to or coincident with the X axis.
  • the scanner head 50 comprises an optical deflection element 56, which is designed, for example, as a dichroic mirror 62.
  • This deflection element 56 can be configured as a full mirror, prism, pentaprism, pentagonal mirror configuration or as a combination of these elements listed here. On the one hand, this deflecting element 56 directs the laser beams 54, 55 of the first optical system 53 onto the samples on the sample table 2 and, on the other hand, the emission beams 59, 60 emitted by the samples in the direction of the second optical system 58.
  • the direction of movement of the sample table 2 arranged beneath the partition plate 99 extends in the direction of the Y axis.
  • the storage unit 4 with the sample slides 8 mounted in a sample magazine 7 'and the test slides 10 mounted in a test part magazine 9' are preferably arranged in a region outside the partition plate 99.
  • the presence of a slide 8, 10 in a particular bearing 6 of these magazines 7 ', 9' is preferably checked by means of a control device 22.
  • This control device preferably comprises a light beam 23, which passes through a control opening 21 for these control purposes.
  • a service specialist inserts one or more test slides 10 individually into a sample magazine 7 'and this Sample part magazine 7 'on the ordinary way in the laser scanner device 1 is used.
  • a correspondingly programmed firmware in the controller 40 of the laser scanner device 1 is then preferably activated by entering a personal identification number (PIN) of the service specialist or by entering a code for the service specialist.
  • PIN personal identification number
  • the thus activated firmware enables the controller 40 of the laser scanner device 1 to control the automatic transport of each of these test slides 10 from the sample compartment magazine 7 'onto the sample table 2 and further into a storage location 6 of the test section magazine 9'.
  • any manual intervention in the test part magazine 9 ' is made impossible. Only in special emergencies, a service person with suitable tools could bring out the preferably enclosed in the additional housing 29 test slide 10.
  • the controller 40 of the laser scanner device 1 according to the invention is designed to control an automated, internal test performed on the basis of test slides 10.
  • the sample table 2 is designed to be driven by a motor until immediately before the storage unit 4 and its position and movement are controlled by the controller 40.
  • the same also applies to the setting plate 11 of the storage unit 4 for selecting the object carrier 8, 10 to be examined and for the rotatable eccentric roller 19 for swinging the flaps 16.
  • the unloading slide 31 also transport a slide 8, 10 to the sample table 2 for the automated selection and provision of a sample slide 8 or test slide 10 on the sample stage 2 designed to be driven by a motor and whose position and movement are controlled by the controller 40.
  • the same also applies to the loading slider 32 for transporting a slide 8, 8 to the storage unit 4 when it is returned to a storage location 6 of the sample compartment magazine 7 'or the test magazine 9'.
  • FIG. 9 shows a horizontal partial section through the scanner head 50 of the laser scanner device 1 with the associated displacement sensor 91.
  • a linear guide 68 to which the scanner head 50 in the X-axis is attached, is fastened to a frame 82.
  • Direction and immersed in a grid opening 90 is movably arranged.
  • the X-axis coincides with the direction of movement 75 of the scanner head 50, this movement direction 75 together with the first and second laser beams 54, 55 deflected towards the sample (not shown) located below the scanner head 50 a raster plane 76 defined.
  • This raster plane 76 is preferably perpendicular to the sample plane 49.
  • the scanner head 50 comprises a scale 77, which is arranged at a distance from a fixed, linear measuring system 78 of the laser scanner device 1 and in this raster plane 76.
  • the sample table 2 is preferably designed to be linearly movable in a Y-direction of a Cartesian coordinate system arranged at right angles to the X-axis 75 and to be driven by a motor.
  • the scanner head with all its optical elements, fastening means, the scale 77 and a part of the linear guide has a center of mass 74.
  • This center of gravity 74 is arranged in the direction of movement 75 of the scanner head 50 in line with a connecting point 69, which connects the connecting rod 70 of the scanner head 50 with the drive 71.
  • This connecting point 69 can be e.g. be designed as an axis; However, it is preferred to form the Pleuelangriffstician as a cross-spring joint.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of the displacement sensor 91 for the scanner head 50 and its non-linear movement when scanning as an X / t diagram.
  • This X / t diagram indicates the different time duration ( ⁇ tj . ⁇ t 2 ) for the detection of a pixel ( ⁇ x) depending on the position on the X-axis.
  • the displacement signal 92 corresponds approximately to a sine curve which has its maxima at the extreme points (end points) of a scan line of the laser head 50. Due to the reversal of the scan direction at these endpoints and the slowed down motion, the scanner head needs a longer time ( ⁇ t 2 ) for these same inflection points for the same distance ( ⁇ x) than the maximum achievable speed of the scanner.
  • FIGS 11 to 15 are diagrams of proposed solutions in which the signal integration (I) in function of time (t) is shown.
  • FIG. 11 shows a first solution proposal in which the displacement sensor triggers the data acquisition with a passive integrator (RC element).
  • RC element passive integrator
  • FIG. 12 shows a second solution proposal, in which the displacement sensor triggers the data acquisition with a switchable integrator at a constant integration time.
  • this solution proposal to improve the sensitivity of the laser scanner device still involves some unacceptable disadvantages.
  • the erase time for the integrator reduces the sensitivity since this time is not available for signal acquisition. This erase time occupies especially at low resolutions, i. very small "pixel times" (pixel dwell time) a significant proportion of the measuring time.
  • additional noise is generated by the deletion process itself.
  • so-called "undersampling” occurs at the edge of the scan area, and uneven conditions of data acquisition (shorter or longer distances between two trigger pulses) can lead to inhomogeneities between the central and peripheral areas.
  • FIG. 13 shows a third solution proposal, in which the displacement sensor signal is recorded as an event in time and the time of its occurrence is assigned to each signal over a time base, wherein the signal integration is constantly triggered continuously by the time base.
  • Figure 14 shows a fourth solution proposal according to the third solution proposal, but using a passive RC element for integration.
  • the advantage over the third solution proposed to improve the sensitivity of the laser scanner device lies in the fact that now no loss in sensitivity must be taken into account, since the deletion time and the additional noise due to the deletion process omitted.
  • there is still the clear disadvantage because of the reduced resolution caused by the decay characteristic of the RC element.
  • the time constant of the RC element must be at least of the order of one pixel, but preferably of the order of one data acquisition interval, since otherwise short signals (typically of individual photons) may be missed, i. would not be detected.
  • the data acquisition interval is the time between two conversion points of the A / D converter.
  • FIG. 15 shows a fifth solution proposal which corresponds to the fourth solution proposal, but several measurements per pixel are carried out.
  • the intensity of a pixel is calculated as mean value of all data points lying within the time markers for this pixel (and possibly refined by interpolation).
  • the last remaining disadvantage compared to the fourth proposal is eliminated here, because there is no longer reduced resolution due to the lower decay time of the RC element.
  • each detector signal (93) generated by a detector (61) is integrated by an integrator of the controller (40), wherein each part of an integrated detector signal (93) over the time base (94) associated with the time of the corresponding encoder signal (92) and wherein each signal integration is constantly triggered continuously from the time base (94) and performed by the constant integration time controller (40).
  • the signal integration is carried out with a passive RC element, wherein the time constant selected for the RC element is at least of the order of magnitude of a data acquisition interval ⁇ d.
  • a data acquisition interval is a time-constant acquisition of the integrated detector signals 93 between two detector signal maxima (see ⁇ d in Fig. 15).
  • the intensity of a pixel 95 be calculated as the average of all data points that lie within timestamps 96 for that pixel 95.
  • an interpolation method which takes account of incomplete data acquisition intervals ⁇ d between the time marks of a pixel and interpolates their corresponding measured values proportionately can also be used.
  • FIG. 16 shows a preferred test slide 10 which has the format of a standard microscope slide for light microscopy and which comprises exclusively light-stable test structures 41.
  • a test structure is referred to as "essentially stable in light” if it undergoes no measurable damage during normal use, ie during the radiation exposure normally occurring during test procedures. or the left of a test slide 10 in an unprotected place for a long time (for example exposed to ambient light) is not referred to as "normal use”.
  • the exemplary test slide 10 depicted in FIG. 16 has a surface with a length A of 75 mm, a width B of 25 mm, and a thickness C of 1 mm.
  • One half of the area A / 2 is frosted (for example by means of loops).
  • the other half has a preferred line pattern with a width D of 20 mm.
  • This line pattern preferably consists of a vapor-deposited chromium layer created by means of a mask.
  • the erfi ⁇ du ⁇ gsdorfe laser scanner device 1 is designed for imaging and measurement of two-dimensional objects. Accordingly, sensitivity calibration must be accurate for these "flat" objects, but two-dimensional fluorescence probes that are stable to light and chemically stable for long periods of time are difficult or impossible to produce.
  • the orientation of the sample table 2 and the storage unit of the laser scanner device 1 in space is actually arbitrary. The same applies to the well-balanced or counter-oscillator 73 pulse-compensated scanner device 72.
  • the sample plane 49 of the sample table 2 can be arranged substantially horizontally but hanging upside down. However, a standing arrangement of the sample table according to FIGS. 1 and 2 or 4 to 7 is preferred.
  • Identical features or elements of the inventive laser scanner device 1 are each provided with the same reference numerals, even if these elements are not described in detail in all cases.
  • a component of the data acquisition method according to the invention with a laser scanner device 1 for imaging and / or measuring fluorescent samples treated with microscope slides and containing fluorescent dyes also form the following features, according to which:
  • the sample plane 49 is arranged substantially horizontally and the movement direction 75 of the scanner head 50 is preferably an X-axis or Defines scan axis, wherein the sample table 2 is moved linearly in a direction perpendicular thereto Y-direction of a Cartesian coordinate system.
  • Two laser beams 54, 55 of different wavelengths aligned parallel to one another and running parallel to the sample plane 49 are provided with the at least one laser 51, 52 and the first optical system 53 and deflected to the sample with an optical deflection element 56 of a scanner device 72.
  • these laser beams 54,55 are focused with the first objective 57 on the sample in the plane 49, after which the laser beams 54,55 triggered on the sample and through the first lens 57 and the deflecting element 56 in a plane to the plane 49 substantially parallel deflected emission beam bundle 59,60 different wavelengths with the second optical system 58 to two detectors 61,61 'and sensors 61,61' detected by these detectors.
  • the wedge-shaped dichroic mirror 62 is preferably set so that the two laser beams 54,55 at each one of the surfaces 63,64 are reflected, so that the wedge-shaped dichroic mirror 62 by the intermediate angle ß causes a spatial separation of both resulting focus points 65 and of both in the direction of the detectors 61,61 'directed emission beams 59,60.
  • a pentagonal mirror arrangement 66 is used with a wedge-shaped dichroic mirror 62 and a simple mirror 67, which deflects the scanner head 50 about a Y-axis extending at right angles to the scanning axis 75 such that the resulting Focus points 65 do not change their current position in the sample plane 49.
  • the deflection of the scanner head 50 in the X-axis 75 is measured at a scale 77 which is arranged at a distance from a linear measuring system 78 of the laser scanner device 1 in this raster plane 76 is.
  • the scanner head 50 with its optical deflection element 56 and its movement direction 75 define a raster plane 76 which is perpendicular to the sample plane 49, the deflection of the scanner head 50 in the X-axis 75 having a scale 77 is measured, which is arranged at a distance from a linear measuring system 78 of the laser scanner device 1 and in this raster plane 76.
  • This scale 77 is preferably arranged in the raster plane 76 or at least in the immediate vicinity of this raster plane 76.
  • This scale 77 is preferably also arranged in the main plane 107 of the first objective 57 (see FIGS. 6 and 7) or at least in the immediate vicinity of this main plane 107.
  • a scan in the XZ direction (Z profile) is performed by scanning a field which is at least substantially perpendicular to the sample plane 49 stands.
  • the maximum of the first ablation is thus a measure of the intensity measured by the laser scanner device 1 on the surface of the sample.
  • the materials 102 suitable for this calibration method can be arranged together with the vapor-deposited line patterns on the same test slide 10 or on a separate test slide.
  • These flat, three-dimensional materials 102 preferably have an extension parallel to the sample plane 49 of 2 ⁇ 2 mm to 10 ⁇ 10 mm and have a thickness of approximately 0.1 to 2 mm, preferably a thickness of approximately 1 mm (see FIG. ,
  • a dichroic mirror as an optical element that is transmissive to one part of the wavelength spectrum and reflects another part of that wavelength spectrum. The person skilled in the art therefore speaks here of a wavelength-selective transmission and reflection. For a person skilled in the art from the present description, resulting combinations or variants of the described embodiments of the present invention belong to its scope.
  • Control device 50 Scanner head

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Abstract

Betrifft ein Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät zum pixelgenauen Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben. Ein solches Laser Scanner-Gerät umfasst einen Probentisch; mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden Proben; einen Scanner-Kopf (50) mit einem optischen Umlenkelement zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung (75); ein erstes Objektiv; ein zweites optisches System zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv und das Umlenkelement umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln zu mindestens einem Detektor; einen Weggeber (91), der Weggeber-Signale (92) aussendet, die den momentanen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs (50) in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen; ein elektronisches Element zur Filterung der Detektor-Signale (93) mit einer definierten Zeitkonstante; und einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale (93). Das erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die gefilterten Detektor-Signale (93) des A/D-Wandlers und die Weggeber-Signale (92) unabhängig, parallel und kontinuierlich von einer Rechnereinheit bzw. einer Steuerung (40) erfasst und auf eine gemeinsame Zeitbasis (94) bezogen werden, wobei die A/D-Wandlung so häufig erfolgt, dass jedem Pixel (95) eines Bildes stets mehr als ein Datenpunkt des A/D-Wandlers zugeordnet wird.

Description

Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät
Die Erfindung betrifft ein Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner- Gerät zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben, Ein zur Verwendung mit dem erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahren geeignetes Laser Scanner-Gerät umfasst einen Probentisch mit einer Aufnahme für Objektträger in einer Probenebene; mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden Proben; einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner-Kopf mit einem optischen Umlenkelement zum Umlenken der Laserstrahlen zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewe- gungsrichtung; ein erstes Objektiv zum Fokussieren der Laserstrahlen auf der
Probe in der Ebene; ein zweites optisches System zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv und das Umlenkelement umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln zu mindestens einem Detektor; einen Weggeber, der Weggeber-Signale aussendet, die den momenta- nen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen; ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen des Detektors mit einer definierten Zeitkonstante; und einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale.
Zum Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, fluoreszierenden Proben werden seit langem konventionelle optische Rastermikroskope verwendet. Immer häufiger finden wegen der verbesserten Auflösung konfokale optische Rastermikroskope Verwendung. Ein solches Mikroskop ist beispielsweise aus GB 2 184 321 A bekannt. Dieses Mikroskop lenkt das Licht einer Laserquelle entlang eines optischen Pfads, um mit dem fokussierten Lichtstrahl eine sich in der Objektebene des Mikroskops befindende Probe abzurastern bzw. „zu scannen". Der von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahl wird zum Entrastern durch den gleichen opti- sehen Pfad zurückgelenkt, mittels eines Dichroidspiegels vom Anregungsstrahl getrennt und auf einer konfokalen Öffnung vor einem Detektor abgebildet. Damit wird aus der Fluoreszenz einer Probe ein Bild geformt, ohne dass das auf die Probe gerichtete Licht zum Auslösen der Fluoreszenz auf den Detektor treffen kann.
Viele der im Handel erhältlichen Mikroskope beruhen auf dieser Konstruktion und weisen Strahlteiler oder Filter zum Unterteilen des von der Probe emittierten Lichts in Strahlen mit unterschiedlichem Wellenlängenbereich auf. Dadurch können auch zwei fluoreszierende Farbstoffe verwendet und deren Emission mit zwei verschiedenen Detektoren gemessen werden.
Allerdings weisen alle konfokalen Scanner-Systeme, welche die beiden Anregungslichtstrahlen mit den beiden unterschiedlichen Wellenlängen auf denselben Abtastfleck lenken, den Nachteil auf, dass die Abgrenzung der beiden Emissionssignale nur spektral erfolgen kann. Da die Absorption und/oder die Fluoreszenz- emissionsspektren der verwendeten Farbstoffe sich meist überlappen, können sie (insbesondere bei grosseren Intensitätsunterschieden) nicht zuverlässig und quantitativ unterschieden werden. Damit nicht in zeitraubender Weise zuerst ein Bild mit einem ersten Fluoreszenzspektrum und dann ein zweites Bild mit einer anderen Art des Anregungsstrahls erzeugt werden muss, wurden Abtastmikro- skope und „Scanner-Geräte" vorgeschlagen, die zumindest zwei Anregungsstrahlen mit unterschiedlicher Ausrichtung bereitstellen.
Ein solches Mikroskop ist beispielsweise aus US 5,304,810 bekannt, welches mit zwei oder mehr räumlich voneinander getrennten Beleuchtungsstrahlen zwei oder mehr räumlich voneinander getrennte Beleuchtungspunkte erzeugt und eine Probe simultan mit diesen Beleuchtungspunkten abrastert. Die dadurch simultan erzeugten, räumlich voneinander getrennten Fluoreszenzemissionsstrahlenbündel werden entsprechend ihrer jeweiligen Rasterposition simultan mittels individuel- len, auf diese räumlich voneinander getrennten Beleuchtungspunkte ausgerichteten Detektoren gemessen. Auch aus US 6,628,385 Bl ist ein solches Mikroskop bekannt, das mittels zwei Anregungslasern zwei separate Lichtflecke auf einer Probe erzeugt. Dabei durchstossen die beiden Anregungsstrahlen unter leicht un- terschiedlichen Winkeln eine Öffnung in einem 45°-Spiegel und treffen dann auf ein Objektiv-Element. Dies bewirkt das Bereitstellen von zwei voneinander getrennten Lichtflecken auf der Probe, wobei an jedem Lichtfleck ein Emissionsstrahlenbündel erzeugt wird. Die beiden resultierenden Emissionsstrahlenbündel werden am 45°-Spiegel reflektiert und treffen auf eine Sekundärlinse auf, wo- nach sie direkt oder nach einer zweiten Umlenkung jeweils einen von zwei Detektoren erreichen. Zudem können optische Trennelemente, wie Dichroidfilter oder Prismen vor den als Photomulitplier ausgebildeten Detektoren positioniert werden. Zum Abrastern der Proben kann ein zwischen dem 45°-Spiegel und dem Objektiv-Element angeordnetes Rastersystem verwendet werden.
Aus WO 02/059677 Al ist ein optisches System zum Anregen und Messen von Fluoreszenz an oder in mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten Proben bekannt. Dieses System umfasst zumindest einen Laser zum Anregen der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe, einen Spiegel zum Umlenken des Laserlichts in Richtung einer Probe, ein Umlenkelement zum Umlenken des Lichts aus dem Laser auf diesen Spiegel in einer Y-Richtung eines (hier kartesischen) Koordinatensystems, eine Optik zum Bilden eines ersten Brennpunktes des Laserlichts auf der Probe, eine den Spiegel und die Optik umfassende, in der Y-Richtung bewegliche Raster- Einheit, einen in der X- und Z-Richtung des Koordinatensystems bewegbaren Probentisch zum Ausrichten der Probe gegenüber dem ersten Brennpunkt, eine optische Anordnung zum Abbilden des von der Probe emittierten Lichts in einer in einem zweiten Brennpunkt angeordneten Lochblende und einen Detektor zum Messen der Intensität des die Lochblende durchtretenden Lichts.
Diese bekannten Mikroskope zum hochempfindlichen Abrastern von in einem re- gelmässigem Muster (einem sogenannten Array) angeordneten Proben sind zudem befähigt, einen ganzen Standard-Objektträger für die Lichtmikroskopie ab- zurastern und arbeiten bei mittlerer Auflösung zufriedenstellend. Es ist aber zu beachten, dass beim Erhöhen der Auflösung zusätzliche Effekte, wie dynamische Verschiebungen zwischen den Farbkanälen Sichtbar werden können. Dadurch liegen beispielsweise die Abbildungspunkte des roten und des grünen Kanals nicht mehr genau übereinander. Die relative Verschiebung kann sich zwischen den Ka- nälen über die Ausdehnung des Bildes dynamisch ändern. Zudem hängt diese Verschiebung wesentlich von der Positioniergenauigkeit der Probe im Fokus ab. Aus diesen Gründen ist eine relative Verschiebung nachträglich per Software nur sehr schwer korrigierbar.
Sollen die beiden Kanäle nicht nur spektral sondern auch räumlich voneinander getrennt werden, so müssen die beiden Fokalpunkte der Anregungslaser auf der Probe voneinander getrennt werden. Dies lässt sich nur dadurch erreichen, dass die gebündelten Lichtstrahlen der beiden Laser in einem zwar kleinen aber doch signifikanten Winkel zueinander auf das Scanobjektiv fallen. Es ist allgemein be- kannt, dass alle in einem bestimmten Winkel auf das Objektiv auftreffenden Strahlen auf denselben Punkt innerhalb der Fokalebene fokussiert werden. Ein bestimmter Einfallswinkel vor dem Objektiv entspricht also immer einem bestimmten Ort hinter dem Objektiv. In diesem Zusammenhang ist es unerheblich, ob der Laserstrahl das Objektiv in dessen Mitte oder in irgend einem anderem Teilbereich der Objektivapertur trifft; die Bündelung in ein und demselben Fokuspunkt ist davon nicht betroffen. Unterschiedlich ist jedoch der Strahlwinkel hinter dem Objektiv, die Strahlen treffen nun aus unterschiedlichen Richtungen im Fokuspunkt zusammen. Im exakten Fokalpunkt spielt dies keine Rolle, in Ebenen die geringfügig darunter oder darüber liegen, jedoch schon. Dort entfernen sich die Strahlen vom exakten Fokuspunkt in Abhängigkeit von diesem Winkel unterschiedlich schnell.
Sollen nun zwei Laserstrahlen entsprechend diesen Vorgaben auf einer Probe und in der Fokalebene räumlich getrennt voneinander fokussiert werden und bilden diese Laserstrahlen deshalb beim Einfall auf das Scanobjektiv einen Winkel zueinander, so führt dies zwangsläufig dazu, dass zumindest einer der beiden Laserstrahlen vor dem Auftreffen auf das Spiegelelement jetzt auch nicht mehr exakt parallel zur Scanachse verlaufen kann. Wird nun der Scanner-Kopf bewegt, ändert sich der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf das Objektiv. Der Strahl wird zwar nach wie vor auf denselben Fokalpunkt abgelenkt werden, aber unter verschiedenen Winkeln. Ausserhalb der Fokalebene ergeben sich dann entsprechend dem oben gesagten unterschiedliche Positionen je nach Stellung des Scanner-Kopfes in X-Richtung und je nach der Abweichung der Probenebene von der exakten Fokalebene in Z-Richtung. Die letztere Abweichung ist im Rahmen von realistischen Gerätetoleranzen nie vollständig auszuschliessen und als zufällige Toleranz auch nicht beliebig gut kontrollierbar.
Die beschriebenen Effekte sind an sich klein, sie machen sich jedoch im Beispielsaufbau bei Auflösungen unterhalb von 5 μm signifikant bemerkbar. Die beschriebenen Effekte können dazu führen, dass die Bilder der beiden Detekti- onskanäle nicht über den gesamten Bildbereich deckungsgleich sind, und dass das Ausmass der Abweichungen unkontrolliert über das Bild variiert. Quantitative Vermessungen von sehr kleinen Strukturen werden dadurch unmöglich oder zumindest verfälscht. Visuell machen sich die Fehler als lokal variierende Farbsäume bemerkbar.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein alternatives Datenerfassungsverfahren zum Abbilden von auf Objektträgem befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben mit einem Laser Scanner- Gerät vorzuschlagen, mit welchem die Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts zusätzlich verbessert wird.
Diese Aufgabe wird mit einem Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät zum pixelgenauen Abbilden von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben gelöst, das die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 1 umfasst. Ein zur Durchführung dieses Datenerfassungsverfahrens geeignetes Laser Scanner-Gerät umfasst: a) einen Probentisch mit einer Aufnahme für Objektträger in einer Probenebene; b) mindestens einen Laser und ein erstes optisches System zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls zur Anregung der fluoreszierenden Proben; c) einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner- Kopf mit einem optischen Umlenkelement zum Umlenken der Laserstrahlen zu der Probe hin und zum Abrastern dieser Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung; d) ein erstes Objektiv zum Fokussieren der Laserstrahlen auf der Probe in der
Ebene; e) ein zweites optisches System zum Weiterleiten von durch die Laserstrahlen an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv und das Umlenkelement umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln zu mindestens einem Detektor; f) einen Weggeber, der Weggeber-Signale aussendet, die den momentanen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs in Bezug auf einen Nullpunkt anzeigen; g) ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen des Detektors mit einer definierten Zeitkonstante; und h) einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale.
Das erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die gefilterten Detektor-Signale des A/D-Wandlers und die Weggeber- Signale unabhängig, parallel und kontinuierlich von einer Rechnereinheit bzw. einer Steuerung erfasst und auf eine gemeinsame Zeitbasis bezogen werden, wo- bei die A/D-Wandlung so häufig erfolgt, dass jedem Pixel eines Bildes stets mehr als ein Datenpunkt des A/D-Wandlers zugeordnet wird.
Zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen und erfindungsgemässe Merkmale ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Vorteile des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens umfassen : Durch die kontinuierliche Datenerfassung ist die tatsächliche Datenerfassungszeit identisch mit der insgesamt zur Verfügung stehenden Scanzeit. Das heisst, 100% der anfallenden Signale, insbesondere der eintreffenden Photo- nen, werden auch erfasst. Es gibt somit keine Lücken oder Totzeiten in denen die Datenerfassung eintreffende Signale nicht registrieren kann. Dies steht im Gegensatz zu den herkömmlichen Systemen, die aktiv geschaltete Integratoren verwenden und deren tatsächliche Integrationszeit stets um die Löschzeit verringert ist. Die Löschzeit entfällt im vorgestellten Verfahren, sämtliche eintreffenden Photonensignale werden ohne Lücke erfasst. Diese höhere Erfassungsrate bedeutet eine höhere Empfindlichkeit des Systems, da diese entsprechend den Gesetzen der Photonenstatistik direkt von der Gesamtzahl der erfassten Photonensignale abhängt.
Im herkömmlichen Ansatz wird der Beginn der Integrationszeit durch die aufeinanderfolgenden Weggebersignale ausgelöst. Dies hat zur Folge, dass stets sichergestellt sein muss, dass Integrationszeit und Löschzeit immer vollstän- dig abgeschlossen sind, bevor der nachfolgende Triggerimpuls eintrifft. Da die
Weggebersignale einen signifikanten „Jitter" (Instabilität) aufweisen (bis zu ±30%) kann das fixe Integrationsintervall maximal so gross sein, wie der kleinste mögliche Abstand zwischen 2 Triggersignalen des Weggebers. Dadurch gehen im konventionellen Verfahren wiederum bis zu 30% der eigent- lieh verfügbaren Messzeit verloren. Im Gegensatz dazu nutzt das erfindungsgemäße Verfahren den Duty Cycle (Arbeitszyklus) voll aus, was wiederum ein gesteigerte Empfindlichkeit zur Folge hat.
Da Weggebersignale und Datenerfassung unabhängig voneinander aufge- zeichnet werden, ist die einstellbare Pixelauflösung des Systems frei skalierbar und unabhängig von der Weggeberteilung wie dies in konventionell betriebenen Systemen der Fall ist.
Da mindestens zwei Rohdatenpunkte pro Pixel verwendet werden, kann ein Filter mit kleinerer Integrationskonstante verwendet werden. Somit ist das
Abklingverhalten zwischen zwei aufeinanderfolgenden Pixeln beschleunigt und es resultiert eine bessere Auflösung an starken Hell/Dunkel Übergängen.
Das erfindungsgemässe Datenerfassungsverfahren mit dem dafür bevorzugten Laser Scanner-Gerät soll nun an Hand von schematischen Zeichnungen, die den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken sollen und die lediglich Beispiele von besonders bevorzugten Ausführungsformen darstellen, erläutert werden. Dabei zeigen : Fig. 1 einen vertikalen Teilschnitt durch zwei Objektträgermagazine und einen vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Objektträgers aus dem Proben-Magazin auf den Objekttisch;
Fig. 2 einen horizontalen Teilschnitt durch die Objektträgermagazine und eine Draufsicht auf den vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Test-Objektträgers aus dem Testobjekt-Magazin auf den Objekttisch;
Fig. 3 vertikale Ansichten der Objektträgermagazine mit geöffnetem Testobjekt-Magazin, wobei
Fig. 3A die Einschubseite der beiden Objektträgermagazine in einer Frontansicht vom Objekttisch her gesehen, und Fig. 3B die beiden Objektträgermagazine im Vertikal schnitt mit Blick gegen den Objekttisch hin zeigt;
Fig. 4 vertikale Teilschnitte durch den Objekttisch und dessen Querneigevorrichtung, wobei:
Fig. 4A den Objekttisch mit Blick gegen die Objektträgermagazine und mit einem im geschlossenen Objekttisch doppelt gehaltenen Objektträger, und
Fig. 4B den Objekttisch mit Blick von den Objektträgermagazinen weg, mit geöffnetem Objekttisch, nach dem Entfernen bzw. vor dem Einschieben eines Objektträgers zeigt;
Fig. 5 einen vertikalen Teilschnitt durch den Objekttisch und dessen Höhenverstellung und Längsneigevorrichtung;
Fig. 6 eine Prinzipskizze mit wesentlichen optischen Elementen des Laser Scanner-Geräts mit einem Scanner-Kopf gemäss einer ersten Ausführungsform; Fig. 7 Prinzipskizzen des Scanner-Kopfes, wobei :
Fig. 7A eine zweite Ausführungsform des Scanner-Kopfes, und Fig. 7B eine dritte Ausführungsform des Scanner-Kopfes zeigt;
Fig. 8 einen horizontalen Teilschnitt durch ein Laser Scanner-Gerät mit wesentlichen optischen Elementen, einer Scanner-Einrichtung mit Scanner-Kopf und einem Objekttisch mit Objektträgermagazinen;
Fig. 9 einen horizontalen Teilschnitt durch den Scanner-Kopf des Laser Scanner-Geräts mit dem zugeordneten Weggeber;
Fig. 10 eine Prinzipskizze des Weggebers für den Scanner-Kopf und dessen nichtlineare Bewegung beim Scannen als X/t - Diagramm, welches auf die unterschiedliche Zeitdauer (Δti; Δt2) für die Erfassung des von einem Objekt ausgehenden Fluoreszenzlichtes je nach der Position einer Anzahl Pixel (Δx) auf der X-Achse hinweist;
Fig. 11-15 Diagramme von Lösungsvorschlägen, in denen die Signalintegration
(I) in Funktion der Zeit (t) dargestellt ist, wobei :
Fig. 11 einen ersten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem der
Weggeber die Datenerfassung mit einem passiven Integrator triggert;
Fig. 12 einen zweiten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem der
Weggeber die Datenerfassung mit einem schaltbaren Integrator bei konstanter Integrationszeit triggert;
Fig. 13 einen dritten Lösungs-Vorschlag zeigt, bei welchem das Weggeber-Signal als Ereignis zeitlich erfasst und jedem
Signal über eine Zeitbasis der Zeitpunkt seines Auftretens zugeordnet wird, wobei die Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis getriggert wird; Fig. 14 einen vierten Lösungs-Vorschlag entsprechend dem dritten Lösungs-Vorschlag zeigt, wobei jedoch ein passives RC- Glied zur Integration verwendet wird;
Fig. 15 einen fünften Lösungs-Vorschlag zeigt, welcher dem vierten
Lösungs-Vorschlag entspricht, wobei aber mehrere Messungen pro Pixel ausgeführt werden.
Figur 1 zeigt einen vertikalen Teilschnitt durch zwei Objektträgermagazine und einen vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Objektträgers aus dem Proben-Magazin auf den Objekttisch. Diese beiden Objektträgermagazine gehören zu einem erfindungsgemässen Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben. Dieses Laser Scanner-Gerät um- fasst einen eine Probenebene 49 definierenden Probentisch 2 und eine motorisierte Transportvorrichtung 3 zum Bewegen eines Objektträgers von einer Aufbewahrungseinheit 4 zum Probentisch 2 und zurück. Dabei umfasst die Aufbewahrungseinheit 4 je einen, zumindest je eine Lagerstelle 6 aufweisenden und während des Betriebs des Laser Scanner-Geräts 1 für die Transportvorrichtung 3 zugänglichen Probenteil 7 für Proben-Objektträger 8 und Testteil 9 für Test- Objektträger 10. In diesem erfindungsgemässen Laser Scanner-Gerät ist der Testteil 9 vom Probenteil 7 getrennt und als mit dem Laser Scanner-Gerät 1 fest verbundenes Testteil-Magazin 9' für einen oder mehrere Test-Objektträger 10 ausgebildet. Dadurch ist ein im Testteil 9 aufbewahrter Test-Objektträger 10 im Betriebszustand des Laser Scanner-Geräts 1 für eine Bedienungsperson manuell nicht zugänglich. Dies hat den Vorteil, dass jederzeit ein geeigneter Test-Objektträger bereitgestellt werden kann, ohne dass ein solcher Test-Objektträger 10 durch unsachgemässe Manipulationen durch Bedienungspersonen verschmutzt oder gar beschädigt werden kann. Das hier abgebildete Testteil-Magazin 9' um- fasst eine offene Einschubseite 15.
In der hier dargestellten Ausführungsform ist der Probenteil 7 axial über dem Testteil 9 angeordnet und der Testteil 9 der Aufbewahrungseinheit 4 ist mit einer gegenüber dem Probentisch 2 des Laser Scanner-Geräts 1 beweglichen Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 fest verbunden. Dabei ist hier die Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 im Wesentlichen senkrecht gegenüber der Probenebene 49 des Probentisches 2 verschiebbar. So kann ein beliebiger Objekt- träger 8,10 auf das Niveau der vom Probentisch 2 definierten Probenebene 49 gebracht und zu einem linearen Transport auf den Probentisch 2 bereit gestellt werden.
Es wird bevorzugt, dass die Probenebene 49 des Probentisches 2 im Wesentli- chen horizontal angeordnet ist, wobei der Probentisch 2 einen Objektträger 8,10 über sich trägt. Allerdings kann der Probentisch 2 auch über Kopf angeordnet werden, so dass der eingesetzte Objektträger 8,10 unter dem Probentisch angeordnet ist. Auch eine beliebige andere Lage der Probenebene 49 im Raum ist grundsätzlich denkbar, wird aber weniger bevorzugt.
Das Laser Scanner-Gerät 1, gemäss der in Figur 1 abgebildeten, ersten Ausführungsform umfasst vorzugsweise ein Gehäuse 5, wobei der Probenteil 7 als von aussen in das Gehäuse 5 des Laser Scanner-Geräts 1 einsetzbares Magazin 7' für eine Vielzahl von Proben-Objektträgern 8 ausgebildet ist. Der Probenteil 7 ist be- vorzugt reversibel an der Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 montierbar. In der gezeigten Ausführungsform verbindet eine steckbare Schwalbenschwanzverbindung das Probenteil-Magazin 7' mit der hier vertikal beweglichen Stellplatte 11. Somit kann das Probenteil-Magazin 7' am Handgriff 42 festgehalten und in im wesentlichen vertikaler Richtung in das Gehäuse 5 gesenkt und am Schwalben- schwänz 43 der Stellplatte 11 eingesteckt werden. Da hier die beiden Magazine 7',9' senkrecht übereinander angeordnet sind, stellt das fest mit der Stellplatte 11 verschraubte Testteil-Magazin 9' vorzugsweise gerade den unteren Anschlag für das in den Schwalbenschwanz 43 eingeschobene Probenteil-Magazin 7' dar.
Die Lagerstellen 6 im Probenteil-Magazin 7' und/oder im Testteil-Magazin 9' sind zur Aufnahme von Objektträgern ausgebildet, welche im Wesentlichen die Abmessungen eines Standardobjektträgers für die Lichtmikroskopie aufweisen. Vorzugsweise sind diese Lagerstellen 6 voneinander durch Lagerstege 12 getrennt, so dass diese Objektträger auf jeweils zwei sich jeweils im Wesentlichen über die ganze Länge der Objektträger 8,10 erstreckenden Lagerstegen 12 ruhen.
Der in der Figur 1 in einem Vertikalschnitt gezeigte Probentisch 2 ist zum Trans- fer von Proben-Objektträgern 8 oder von Test-Objektträgern 10 mittels eines an einer Aufhängung 83 angeordneten Spindeltriebes 84 unmittelbar vor eine Aufbewahrungseinheit 4 für solche Objektträger 8,10 verfahrbar ausgebildet. Die Aufnahme 34 des Probentisches 2 umfasst vorzugsweise zwei einander gegenüber liegende Nuten 35 zum Aufnehmen der beiden Längskanten 14 eines Pro- ben-Objektträgers 8 oder eines Test-Objektträgers 10. Die Probenebene 49 ist dabei bevorzugt im Wesentlichen horizontal angeordnet. Der Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8,10 in im wesentlichen senkrechter Richtung zur Oberfläche der Objektträger zwei feststehende Stege 36 und einen federnd gegen diese Stege 36 beweglichen Backen 37 mit zwei auf- stehenden Seitenwänden 38, welche zusammen mit den Unterkanten der Stege 36 die Öffnungsweite der Nuten 35 definieren (vgl. auch Fig. 4).
Bevorzugt überwacht bzw. regelt eine Steuerung 40 einen Motor 87, welche den Spindeltrieb 84 antreibt. Dadurch kontrolliert die Steuerung 40 die Bewegungen des Probentisches 2.
Figur 2 zeigt einen horizontalen Teilschnitt durch die in der Fig. 1 gezeigten Objektträgermagazine und eine Draufsicht auf den vor diesen platzierten Objekttisch beim Transfer eines Test-Objektträgers aus dem Testobjekt-Magazin auf den Objekttisch. Das hier abgebildete Testteil-Magazin 9' umfasst eine offene
Einschubseite 15, welche in ihrer Breite zumindest teilweise von je einer, sich im wesentlichen über die ganze Stapelhöhe des Magazins 9' erstreckenden, individuell wegschwenkbaren Klappe 16 abdeckbar ist. Diese Klappe 16 ist hier weggeschwenkt, so dass der abgebildete Test-Objektträger aus der Einschubseite 15 des Testteil-Magazins 9' herausgeschoben werden kann, ohne dass er dabei von der wegschwenkbaren Klappe 16 behindert würde. Damit die Objektträger 8,10 in den Magazinen 7',9' im wesentlichen spielfrei sitzen, umfasst jede dieser Lagerstellen 6 vorzugsweise eine Anpressfeder 13, welche elastisch eine Längskante 14 eines eingesetzten Objektträgers beaufschlägt. Zudem wird durch den Federdruck die jeweils gegenüberliegende Längskante 14 des Objektträgers 8,10 in einer durch das entsprechende Magazin 7',9' definierten Lage gehalten, welche geeignet ist, eine Referenz für den Ursprung eines Koordinatensystems zu definieren. Desgleichen ist der Probentisch 2 bevorzugt mit beweglichen Anpressteilen 39 in der Form von Rollen ausgestattet (vgl. Fig. 2), welche ebenfalls dieselbe Längskante 14 in einer definierten Lage festhalten, wo- durch wiederum eine Referenz für den Ursprung des Koordinatensystems geschaffen wird.
Zumindest das Probenteil-Magazin 7' umfasst bevorzugt an einer der Einschubseite 15 gegenüber liegenden Ecke eine sich im wesentlichen über die ganze Sta- pelhöhe erstreckende Kontrollöffnung 21 zum Feststellen der An- oder Abwesenheit eines Objektträgers in einer bestimmten Lagerstelle 6. Die An- oder Abwesenheit eines Objektträgers 8,10 in einer bestimmten Lagerstelle 6 kann mit unterschiedlichen Methoden und Vorrichtungen festgestellt werden. So kann z.B. (vgl. Fig. 2) ein sich im Wesentlichen horizontal ausdehnender Lichtstrahl 23 bzw. eine Lichtschranke einer Kontrollvorrichtung 22 schräg durch die Magazine 7',9' gerichtet werden, falls die Kontrollöffnung 21 für diesen Lichtstrahl 23 durchlässig ist. Die Ablenkung, Streuung oder Abschwächung des Lichtstrahls 23 durch einen in einem Lagerplatz 6 anwesenden Objektträger 8,10 kann einfach mit einem lichtempfindlichen Sensor festgestellt werden. Während in Figur 2 eine Kontroll- Öffnung 21 in Form einer „abgeschnittenen Ecke" gezeigt ist, kann der Lichtstrahl 23 auch durch die Einschubseite 15 in die Magazine 7',9' gesendet werden und auf der entgegengesetzten, nicht abgeschnittenen Seite auf einen Sensor auftreffen; eine schräge Ausrichtung gegenüber der Transportrichtung der Objektträger 8,10 und/oder das Anbringen eines Umlenkspiegels (beides nicht gezeigt) ermög- liehen ebenfalls eine Detektion der Objektträger in ihren Magazinen selbst bei angenähertem Probentisch 2. Bevorzugt umfasst die Transportvorrichtung 3 des Laser Scanner-Geräts 1 einen Entladeschieber 31, der im wesentlichen parallel zu der Probenebene 49 durch die der Einschubseite 15 der Magazine 7', 9' gegenüberliegende Seite eingreifend und zum Transportieren eines Proben-Objektträgers 8 oder eines Test-Objekt- trägers 10 aus seiner Lagerstelle 6 und aus der Einschubseite 15 heraus zum Probentisch 2 ausgebildet ist. Diese Transportvorrichtung 3 umfasst vorzugsweise zudem einen Ladeschieber 32, der zum Transportieren eines Proben-Objektträgers 8 oder eines Test-Objektträgers 10 aus dem Probentisch 2 und durch die Einschubseite 15 hinein zu einem Lagerplatz 6 in einem der Magazine 7',9' aus- gebildet ist. Besonders bevorzugt wird, dass Ladeschieber 32 eine schwenkbare Klappe 33 umfasst, welche hochgeschwenkt werden und so über den im Probentisch 2 eingesetzten Objektträger 8,10 wegbewegt werden kann, ohne dass diese Klappe 33, welche um eine Achse 47 kippbar ist, den Objektträger berührt. So kann diese Klappe über den Objektträger 8,10 bewegt und hinter diesem abge- senkt werden, worauf der Objektträger von der Klappe 33 erfasst und aus dem Probentisch 2 gezogen werden kann. Das Hochschwenken der Klappe 33 ermöglicht das Bewegen des Probentisches 2 und des darin eingesetzten Objektträgers 8,10 zum Ort der Scanner-Einrichtung 72. Dieses Hochschwenken der Klappe 33 um die Kippachse 47 ermöglicht somit die freie Bewegung des Probentisches 2, ohne dass die Klappe 33 mit dem eingesetzten Objektträger 8,10 in Kontakt kommen kann.
Bevorzugt ist der Antrieb 44 für die bewegliche Stellplatte 11, der Antrieb 45 für den Entladeschieber 31 und der Antrieb 46 für den Ladeschieber 32 jeweils ein Elektromotor, welcher von der Steuerung 40 gesteuert und überwacht wird.
Der in der Figur 2 gezeigte Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8,10 in im wesentlichen paralleler Richtung zur Oberfläche der Objektträger gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers bewegliche Anpressteile 39, welche die Öffnungsbreite der Aufnahme 34 federnd begrenzen. Dabei sind die gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers beweglichen Anpressteile 39 bevorzugt als Rollen mit je einer im Wesentlichen vertikalen Achse ausgebildet. Bevorzugt überwacht bzw. regelt eine Steuerung 40 einen Motor 87, welche den Spindeltrieb 84 antreibt. Dadurch kontrolliert die Steuerung 40 die Bewegungen des Probentisches 2.
Figur 3 zeigt vertikale Ansichten der Objektträgermagazine mit geöffnetem Testobjekt-Magazin. Die Figur 3A zeigt dabei die Einschubseite der beiden Objektträgermagazine in einer Frontansicht vom Objekttisch her gesehen. Die vertikal bewegliche Stellplatte 11 ist auf der rechten Seite sichtbar und ihre Beweglichkeit mit einem Doppelpfeil markiert. Der Probenteil 7 ist gerade über dem Testteil 9 angeordnet, wobei das Probenteil-Magazin 7' mit hier acht in den Lagerstellen 6 ruhenden Proben-Objektträgern 8 axial über dem Testteil-Magazin 9' mit hier zwei Test-Objektträgem 10 befestigt ist. Die wegschwenkbare Klappe 16 des Probenteil-Magazins 7' ist geschlossen, währenddem die wegschwenkbare Klappe 16 des Testteil-Magazins 9' geöffnet ist und im Wesentlichen die ganze Breite der Einschubseite des Testteil-Magazins 9' frei gibt. Das Wegschwenken der wegschwenkbaren Klappe 16 des Testteil-Magazins 9' wird hier durch die Exzenterwalze 19 bewerkstelligt, welche auf die Winkelplatte 18 dieser Klappe drückt. Die Exzenterwalze 19 wird bevorzugt zumindest nahe der durch den Probentisch 2 definierten Probenebene 49 angeordnet, so dass trotz dem Verschieben der Auf- bewahrungseinheit 4 in der Höhe immer die richtige Klappe 16 weggeschwenkt wird. Die Anpressfedern des Testteil-Magazins 9' sind gut zu sehen, wie sie federnd auf die eine Seitenkante 14 der Test-Objektträger 10 drücken.
Die Figur 3B zeigt die beiden gleichen Objektträgermagazine im Vertikalschnitt mit Blick gegen den Objekttisch hin. Die vertikal bewegliche Stellplatte 11 ist auf der linken Seite sichtbar und ihre Beweglichkeit mit einem Doppelpfeil markiert. Das Probenteil-Magazin 7' ist über den Schwalbenschwanz 43 der Stellplatte 11 geschoben und wird hier vom Testteil-Magazin 9' in einer konstanten Position an der Stellplatte 11 gehalten. Das Testteil-Magazin 9' ist hier mit der Stellplatte 11 fest verschraubt. Die Anpressfedern 13 des Probenteil-Magazins 7' und des Testteil-Magazins 9' sind hier gut auf der rechten Seite der Objektträgerstapel zu sehen. Figur 4 zeigt vertikale Teilschnitte durch den Objekttisch 2 und dessen Querneigevorrichtung bzw. den Kippmechanismus 79, welcher einen motorisch angetriebenen Exzenter 80 und eine einseitige Drehachse 81 umfasst. Dieser Kippmechanismus 79 dient zum Ausrichten einer Probe bzw. eines Objektträgers 8,10 gegenüber einer Fokallinie 101, welche in einer Rasterebene 76 (vgl. Fig. 5) verläuft. Der Fokus des ersten Objektivs 57 und die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 des Laser-Scanner Geräts 1 definieren diese Fokallinie 101. Diese Fokallinie 101 selbst definiert zusammen mit dem optischen Umlenkelement 56 des Scanner-Kopfs 50 die Rasterebene 76. Diese Rasterebene 76 wird somit durch die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 und dessen optisches Umlenkelement 56 definiert. Diese Rasterebene 76 steht dabei im Wesentlichen senkrecht zu der Probenebene 49. Diese Fokallinie 101 ist definiert durch die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfes 50 und den Fokalpunkt 65 des Scannerobjektivs 57 und liegt im richtig justierten Zustand des Geräts in der Pro- benebene 49. Die Drehachse 81 kann als eigentliche Achse ausgebildet sein (nicht gezeigt). Allerdings wird eine virtuelle Drehachse 81 bevorzugt, welche durch eine Stahlfeder 104 gebildet wird. Diese Stahlfeder 104 ist vorzugsweise mittels je eines Jochs 105 an dem Probentisch 2 oder an dem Auflageteil 103 angeschraubt. Diese Stahlfeder 104 bewirkt eine Gegenkraft zum Exzenter 80, so dass ein einfacher, spielfreier Kippmechanismus für das Auflageteil 103 des Pro- bentischs 2 geschaffen wird.
Die Figur 4A zeigt den Objekttisch 2 des Laser-Scanner Geräts 1 mit Blick gegen die Objektträgermagazine 7', 9' und mit einem im geschlossenen Objekttisch 2 doppelt gehaltenen Objektträger 8. Der Probentisch 2 umfasst einen Kippmechanismus 79 mit einem motorisch angetriebenen Exzenter 80 und einer einseitigen Drehachse 81, mit welchem Kippmechanismus 79 ein Objektträger 8,10 oder eine Probe gegenüber einer Fokallinie 101 ausgerichtet werden kann. Diese Fokallinie 101 liegt vorzugsweise in der Probenebene 49 und in einer Rasterebene 76, die der Scanner-Kopf 50 mit seinem optischen Umlenkelement 56 und seiner Bewegungsrichtung 75 definiert. Dabei steht die Rasterebene 76 vorzugsweise senkrecht zu der Probenebene 49 (vgl. auch Fig. 5). Mit dem Exzenter 80, der vorzugsweise motorisch angetrieben ist, kann die Querneigung des Objektträgers 8,10 bzw. des Probentisches 2 korrigiert werden, so dass die Fokallinie 101 der Scanner-Einrichtung 72 exakt in die Probenebene 49 zu liegen kommt.
Vorzugsweise ist die Probenebene 49 im Wesentlichen horizontal angeordnet. Die Aufnahme 34 des Probentisches 2 umfasst zwei einander gegenüber liegende Nuten 35 (vgl. Fig. 4B) zum Aufnehmen der beiden Längskanten 14 des gezeigten Proben-Objektträgers 8 oder eines (nicht gezeigten) Test-Objektträgers 10.
Der Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8,10 in im Wesentlichen senkrechter Richtung zur Oberfläche der Objektträger vorzugsweise ein Auflageteil 103 mit zwei feststehenden Stegen 36. Zudem umfasst der Probentisch 2 einen federnd gegen diese Stege 36 beweglichen Backen 37 mit zwei aufstehenden Seitenwänden 38. Diese Seitenwände 38 definieren zusammen mit den Unterkanten der Stege 36 die Öffnungsweite der Nuten 35. Der bewegliche Backen 37 ist mit Federn 30 elastisch gegenüber dem Auflageteil 103 des Probentisches 2 abgestützt, so dass diese Federn 30 die beiden aufstehenden Seitenwände 38 des beweglichen Backens 37 federnd gegen die Unterseite des Objektträgers 8 drücken. Dadurch wird ein Proben-Objektträger bzw. ein Test- Objektträger 10, der bevorzugt zumindest annähernd die Masse eines Glasob- jektträgers für die Lichtmikroskopie aufweist, in vertikaler Richtung klemmend im Probentisch 2 gehalten.
Der Probentisch 2 umfasst zum klemmenden Festhalten eines Objektträgers 8,10 in im Wesentlichen paralleler Richtung zur Oberfläche der Objektträger gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers 8 bewegliche Anpressteile 39, welche die Öffnungsbreite der Aufnahme 34 federnd begrenzen. Diese gegen zumindest eine der Längskanten 14 des Objektträgers 8 beweglichen Anpressteile 39 sind vorzugsweise als Rollen mit je einer im Wesentlichen vertikalen Achse ausgebildet. Die den Rollen 39 gegenüber liegende Nute 35 definiert einen An- schlag der Proben-Objektträger 8 bzw. Test-Objektträger 10, der sich zur Definition der Achse eines Koordinatensystems des Laser Scanner-Geräts 1 eignet. In eine Aussparung 98 eintauchend ist hier zudem ein Senkdorn 88 dargestellt, der beim Annähern des Probentisches 2 and die Aufbewahrungseinheit 4 in den Probentische eindringt und mit diesem Eindringen den Backen 37 und die Seitenwände 38 von den Stegen 36 des Auflageteils 103 wegzieht.
Die Figur 4B zeigt den Objekttisch 2 mit Blick von den Objektträgermagazinen 7',9' weg, mit geöffnetem Objekttisch 2, nach dem Entfernen bzw. vor dem Einschieben eines Objektträgers 8,10. Weil sich gerade kein Objektträger 8,10 im Probentisch 2 befindet, sind die rollenförmigen Anpressteile 39 in ihrer Extremposition. Aus dieser Extremposition werden die rollenförmigen Anpressteile 39 gegen den Druck von Federelementen verdrängt, sobald ein Objektträger 8,10 in den Probentisch 2 eingeschoben wird. Ebenfalls gut sichtbar ist hier, wie der
Senkdorn 88 an einer Rampe 89 aufläuft, so dass der bewegliche Backen 37 des Probentischs 2 etwas heruntergezogen und so das Einschieben eines Objektträgers 8,10 in die Aufnahme 34 des Probentischs 2 ermöglicht wird.
Figur 5 zeigt einen vertikalen Teilschnitt durch den Objekttisch sowie dessen Höhenverstellung und Längsneigevorrichtung. Die durch den Probentisch 2 definierte Probenebene 49 ist in im wesentlichen der Z-Richtung (hier in der Vertikalen) verstellbar, indem der an einer Aufhängung 83 linear befestigte und linear verschiebbare Probentisch 2 zusammen mit dieser Aufhängung 83 auf einem moto- risch angetriebenen Exzenter 106 aufliegt und schwenkbar an einem Rahmen 82 einseitig befestigt ist. Wird der Exzenter 106 etwas gedreht, so hebt oder senkt sich entsprechend die Aufhängung 83 mit dem Probentisch 2. Mit dieser Bewegung kann die Ebene des Probentischs 2, also die Probenebene 49, mit der Ebene einer Lagerstelle 6 im Probenteil-Magazin 7' oder im Testteil-Magazin 9' der Auf- bewahrungseinheit 4 in Übereinstimmung gebracht werden, so dass ein linearer Transfer zwischen einem dieser Magazine 7',9' und dem Probentische erfolgen kann. Vorzugsweise wird das entsprechende Magazin in der Z-Richtung durch eine Verschiebung der beweglichen Stellplatte 11 bereitgestellt, so dass nur eine allfällige Feinabstimmung mit dem Exzenter 106 der Probentischaufhängung 83 erfolgen muss. Mit dem Exzenter 106, der vorzugsweise motorisch angetrieben ist, kann die Längsneigung des Objektträgers 8,10 bzw. des Probentisches 2 korrigiert werden, so dass die Fokallinie 101 der Scanner-Einrichtung 72 exakt in die Probenebene 49 zu liegen kommt. Tatsächlich findet mit der Korrektur der Längsneigung auch eine Verschiebung in der Höhe, also entlang einer Z-Achse, statt.
Zum Zweck eines solchen Objektträgertransfers wird der Probentisch 2 vorzugs- weise möglichst weit der Aufbewahrungseinheit 4 in der im Wesentlichen horizontalen Y-Richtung angenähert. Beim Annähern des Probentischs 2 an die Aufbewahrungseinheit 4 dringt ein Senkdorn 88 in den Probentisch 2 ein und senkt dadurch eine Auflage der Aufnahme 34 des Probentischs 2 zum Aufnehmen eines Objektträgers ab. Dadurch wird der Probentisch 2 zur Aufnahme eines Objektträ- gers 8,10 bereit gestellt. Diese Annäherung geschieht bevorzugt mittels eines an der Aufhängung 83 gelagerten Spindeltriebes 84 und entlang einer Linearführung 85. Der Spindeltrieb 84 ist über eine flexible Kupplung 86 mit dem Motor 87 verbunden, so dass eine exakte Linearführung des Probentischs 2 in im Wesentlichen der Y-Richtung auch dann erfolgen kann, wenn die Probenebene 49 einen geringen Neigungswinkel zur Horizontalen einschliesst. Ziel der Verstellbarkeit des Probentischs 2 mit dem Exzenter 80 ist hauptsächlich das Ausrichten der Probenebene 49 zu einer Fokallinie 101, die durch einen in der X-Richtung (hier senkrecht zur Zeichnungsebene) schwingenden Scanner-Kopf 50 des Laser Scanner-Geräts 1 definiert wird. Dieser Scanner-Kopf 50 bewegt sich sehr schnell in der X-Richtung und auf der Oberseite einer Trennplatte 99. Diese Trennplatte weist eine Rasteröffnung 90 auf. Bevorzugt ist der Scanner-Kopf 50 in diese Rasteröffnung 90 eingesenkt, so dass die von ihm ausgehenden Lichtstrahlen die Probe in geringem Abstand treffen, und dass der Scanner-Kopf 50 die von der Probe kommenden Fluoreszenzemission so effektiv wie möglich aufnehmen und an einen Detektor 61 oder an mehrere Detektoren 61,61' weiter leiten kann.
Die Figur 6 zeigt eine Prinzipskizze mit wesentlichen optischen Elementen des Laser Scanner-Geräts 1 mit einem Scanner-Kopf 50 gemäss einer ersten Ausführungsform. Das Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern befindlichen, mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben umfasst einen motorisch verfahrbaren Probentisch 2 mit einer Aufnahme für einen Proben-Objektträger 10 in einer Probenebene 49. Ein erster Laser 51 und ein zweiter Laser 52 sowie ein erstes optisches System 53 stellen zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu dieser Ebene 49 verlaufenden Laserstrahlen 54,55 unterschiedlicher Wellenlänge bereit. Eine Scanner-Einrichtung 72 umfasst einen parallel zu dieser Ebene 49 hin und her beweglichen Scanner-Kopf 50 mit einem optischen Umlenkelement 56 zum Umlenken der Laserstrahlen 54,55 zu der Probe hin. Ein erstes Objektiv 57 fo- kussiert die Laserstrahlen 54,55 auf der Probe in der Ebene 49. Dieses erste Objektiv 57 weist eine Hauptebene 107 auf, welche vorzugsweise parallel zur Probenebene 49 angeordnet ist.
Ein zweites optisches System 58 leitet die durch die Laserstrahlen 54,55 an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv 57 und das Umlenkelement 56 in eine zur Ebene 49 im Wesentlichen parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel 59,60 zu Detektoren 61,61'. Zwei solche Detektoren 61,61' erfassen die von den Proben kommenden Emissionsstrahlenbündel 59,60 unterschied- licher Wellenlänge. Die Öffnungen der Blenden 48 weisen bevorzugt einen grosseren Durchmesser als die fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59,60 auf, sie können jedoch auch den Dimensionen der fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59,60 im wesentlichen entsprechen, wodurch ein konfokales Laser Scanner-Gerät 1 geschaffen würde.
Das optische Umlenkelement 56 des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 umfasst einen keilförmigen Dichroidspiegel 62 mit in einem Zwischenwinkel ß zueinander angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen 63,64. Dabei ist der keilförmige Dichroidspiegel 62 so eingestellt, dass die beiden Laserstrahlen 54,55 an je einer der Oberflächen 63,64 reflektiert werden. Dabei bewirkt der keilförmige Dichroidspiegel 62 durch den Zwischenwinkel ß eine räumliche Trennung der beiden resultierenden Fokuspunkte 65 und der beiden in Richtung der Detektoren 61,61' gelenkten Emissionsstrahlenbündel 59,60. Die beiden resultierenden Fokuspunkte 65,65' sind in einem Abstand δ zu einander in der Probenebene 49 angeordnet. In dieser in der Figur 6 gezeigten ersten Ausführungsform ist das optische Umlenkelement 56 ein keilförmiger Dichroidspiegel 62. Bevorzugt ist dabei die hintere dichroidische Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vorde- re dichroidische Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 und der beiden Emissionsstrahlenbündel 59,60 ausgebildet.
Das zweite optische System 58 umfasst an sich bekannte Elemente wie ein zwei- tes Objektiv 57', das die eintretenden Emissionsstrahlenbündel 59,60 in je einem Punkt fokussiert. Das zweite optische System 58 umfasst zudem eine Blende 48, deren Öffnungen bevorzugt wesentlich grösser sind als die diese Öffnungen durchtretenden, fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59,60. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform beruht das Laser Scanner-Gerät 1 somit auf einem nicht-konfokalen Abbildungsprinzip. Diese fokussierten Emissionsstrahlenbündel 59,60 treffen danach auf je einem Detektor 61,61' auf, welcher die Intensität der jeweiligen Emissionsstrahlenbündel 59,60 misst. Dieses zweite Objektiv 57' kann als Achromat oder als einfache Linse ausgebildet sein.
Die Figur 7 zeigt Prinzipskizzen des Scanner-Kopfes des erdfindungsgemässen Laser-Scanner Geräts. Dabei zeigt Figur 7A eine zweite Ausführungsform des Scanner-Kopfes 50, bei dem das optische Umlenkelement 56 als Pentaspiegela- nordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist. Wie schon in der ersten Ausführungsform (vgl. Fig. 6) ist die hintere dichroidische Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische O- berfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 und der beiden Emissionsstrahlenbündel 59,60 ausgebildet.
Die Figur 7B zeigt eine dritte Ausführungsform des Scanner-Kopfes 50, bei dem das optische Umlenkelement 56 ebenfalls als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist. Im Unterschied zu der zweiten Ausführungsform (vgl. Fig. 7A) ist die Anordnung des Dichroidspiegels 62 und des einfachen Spiegels 67 vertauscht. Dabei ist die hintere dichroidische Oberfläche 64 des keilförmigen Dichroidspiegels 62 zum Spiegeln eines ersten Laserstrahls 54 und dessen vordere dichroidische Oberfläche 63 zum Spiegeln eines zweiten Laserstrahls 55 sowie der ersten und zweiten Emissionsstrahlenbündel 59,60 ausgebildet. Es versteht sich von selbst, dass die eben beschriebenen Ausführungsformen und weitere Kombinationen beliebig vertauscht werden können. Allerdings wird die erste Ausführungsform gemäss der Figur 6, bei der das optische Umlenkelement 56 als keilförmiger Dichroidspiegel 62 ausgebildet ist oder die zweite Ausbil- dungsform gemäss der Figur 7A, bei der das optische Umlenkelement 56 als Pen- taspiegelanordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildet ist, bevorzugt. Für alle Pentaspiegelanordnungen 66 gilt, dass die vordere Oberfläche 63 und der einfache Spiegel 67 bevorzugt einen Winkel von 22.5° einschliessen.
Die Figur 8 zeigt einen horizontalen Teilschnitt durch ein Laser Scanner-Gerät 1 mit wesentlichen optischen Elementen eines ersten optischen Systems 53 zum Bereistellen von Anregungslicht und eines zweiten optischen Systems 58 zum Erfassen der ausgelösten Fluoreszenzemission der Proben, einer Scanner-Einrich- tung 72 mit Scanner-Kopf 50 und einem Objekttisch 2 mit einer Objektträgermagazine 7', 9' umfassenden Aufbewahrungseinheit 4. Bevorzugt sind alle wesentlichen optischen Elemente und die Scanner-Einrichtung 72 auf einer gemeinsamen Trennplatte 99 und der Probentisch 2 unterhalb dieser Trennplatte 99 (vgl. Fig. 5) angeordnet.
Die wesentlichen optischen Elemente des ersten optischen Systems 53 sind in einem Gehäuse 5 angeordnet und umfassen zumindest einen ersten Laser 51 und optional einen zweiten Laser 52, Filterräder 97 für die von dem oder den Lasern 51,52 ausgehenden Laserstrahlen 54,55 sowie eine Anzahl Dichroidspiegel 62 und einfacher Spiegel 67 zum Umlenken der Laserstrahlen 54,55 aus den Lasern 51,52 in eine zur X-Richtung parallelen Richtung.
Die wesentlichen optischen Elemente des zweiten optischen Systems 58 sind im gleichen Gehäuse 5 angeordnet und umfassen einen oder mehrere Detektoren 61,61' diesen vorgeordnete Filterräder 97 und Blenden 48 für die von den Proben ausgehenden Emissionsstrahlenbündel 59,60 sowie eine Anzahl Dichroidspiegel 62 und einfacher Spiegel 67 zum Umlenken der Emissionsstrahlenbündel 59,60 aus einer zur X-Richtung parallelen Richtung in Richtung der Detektoren 61,61'. Die Scanner-Einrichtung 72 umfasst einen Antrieb 71, den Scanner-Kopf 50 und vorzugsweise einen Gegenschwinger 73 mit einer dem Scanner-Kopf 50 gleichen oder zumindest äquivalenten Masse zur Impulskompensation. Scanner-Kopf und Gegenschwinger sind mittels Pleuelstangen 70,70' mit dem Antrieb 71 verbunden und an je einer präzisen Linearführung (nicht gezeigt) befestigt. Durch den Antrieb 71 wird der Scanner-Kopf 50 in eine schnelle hin und her Bewegung in einer Bewegungsrichtung 75 (vgl. ausgefüllte Doppelpfeile) gebracht, welche gleichzeitig die Scan-Achse 75 definiert. Dabei führt der Gegenschwinger 73 immer eine entgegengesetzte Bewegung aus, wodurch es gelingt, die Trennplatte 99 und damit das ganze Laser Scanner-Gerät 1 trotz der bevorzugt hohen Rastergeschwindigkeit des Scanner-Kopfes 50 ruhig zu halten. Die Scan-Achse 75 ist parallel zur X-Achse oder fällt gerade mit dieser zusammen. Der Scanner-Kopf 50 umfasst ein optisches Umlenkelement 56, welches z.B. als Dichroidspiegel 62 ausgebildet ist. Dieses Umlenkelement 56 kann als Vollspiegel, Prisma, Penta- prisma, Pentaspiegel-Konfiguration oder als Kombination aus diesen hier aufgeführten Elementen ausgebildet sein. Dieses Umlenkelement 56 lenkt einerseits die Laserstrahlen 54,55 des ersten optischen Systems 53 auf die Proben auf dem Probentisch 2 und andererseits die von den Proben ausgesandten Emissionsstrahlenbündel 59,60 in Richtung des zweiten optischen Systems 58.
Senkrecht zur X-Achse und Scan-Achse 75 verläuft die Bewegungsrichtung des unterhalb der Trennplatte 99 angeordneten Probentischs 2 in Richtung der Y- Achse. Vorzugsweise in einem Bereich ausserhalb der Trennplatte 99 ist die Aufbewahrungseinheit 4 mit den in einem Probenteil-Magazin 7' gelagerten Proben- Objektträgern 8 und den in einem Testteil-Magazin 9' gelagerten Test-Objektträgern 10 angeordnet. Die Anwesenheit eines Objektträgers 8,10 in einer bestimmten Lagerstelle 6 dieser Magazine 7',9' wird bevorzugt mittels einer Kontrollvorrichtung 22 überprüft. Diese Kontrollvorrichtung umfasst vorzugsweise einen Lichtstrahl 23, der zu diesen Kontrollzwecken eine Kontrollöffnung 21 durch- dringt.
Besonders bevorzugt wird, dass ein Service Fachmann einen oder mehrere Test- Objektträger 10 individuell in ein Probenteil-Magazin 7' einschiebt und dieses Probenteil-Magazin 7' auf dem ordentlichen Wege in das Laser Scanner-Gerät 1 einsetzt. Eine entsprechend programmierte Firmware in der Steuerung 40 des Laser Scanner-Geräts 1 wird dann vorzugsweise per Eingabe einer persönlichen Identifikationsnummer (PIN) des Service Fachmanns bzw. per Eingabe eines Co- des für die Service-Fachleute aktiviert. Die so aktivierte Firmware befähigt die Steuerung 40 des Laser Scanner-Geräts 1, den automatischen Transport jedes dieser Test-Objektträger 10 aus dem Probenteil-Magazin 7' auf den Probentisch 2 und weiter in eine Lagerstelle 6 des Teststeil-Magazins 9' zu steuern. Gemäss diesem besonders bevorzugten Verfahren wird jeder manuelle Eingriff in das Testteil-Magazin 9' verunmöglicht. Nur in besonderen Notfällen könnte ein Service-Fachmann mit geeigneten Werkzeugen die vorzugsweise in dem zusätzlichen Gehäuse 29 eingeschlossenen Test-Objektträger 10 herausholen. Vorzugsweise ist die Steuerung 40 des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 zum Steuern einer automatisierten, internen und an Hand von Test-Objektträgern 10 aus- geführten Instrumentprüfung ausgebildet.
Vorzugsweise ist der Probentisch 2 zum Verfahren bis unmittelbar vor die Aufbewahrungseinheit 4 motorisch angetrieben ausgebildet und dessen Lage und Bewegung durch die Steuerung 40 kontrolliert. Dasselbe gilt auch für die Stellplatte 11 der Aufbewahrungseinheit 4 zum Auswählen des zu untersuchenden Objektträgers 8,10 und für die drehbare Exzenterwalze 19 zum Wegschwenken der Klappen 16. Zudem wird bevorzugt, dass auch der Entladeschieber 31 zum Transportieren eines Objektträgers 8,10 zu dem Probentisch 2 für das automatisierte Auswählen und Bereitstellen eines Proben-Objektträgers 8 oder Test- Objektträgers 10 auf dem Probentisch 2 motorisch angetrieben ausgebildet und dessen Lage und Bewegung durch die Steuerung 40 kontrolliert sind. Dasselbe gilt auch für den Ladeschieber 32 zum Transportieren eines Objektträgers 8,10 zu der Aufbewahrungseinheit 4 beim Zurücklegen derselben in eine Lagerstelle 6 des Probenteil-Magazins 7' oder des Testteil-Magazins 9'.
Die Figur 9 zeigt einen horizontalen Teilschnitt durch den Scanner-Kopf 50 des Laser Scanner-Geräts 1 mit dem zugeordneten Weggeber 91. An einem Rahmen 82 ist eine Linearführung 68 befestigt, an welcher der Scanner-Kopf 50 in der X- Richtung und in eine Rasteröffnung 90 eintauchend, beweglich angeordnet ist. In diesem Fall fällt die X-Achse mit der Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfes 50 zusammen, wobei diese Bewegungsrichtung 75 gemeinsam mit den zur unter dem Scanner-Kopf 50 angeordneten Probe (nicht gezeigt) hin umgelenkten ers- ten und zweiten Laserstrahlen 54,55 eine Rasterebene 76 definiert. Diese Rasterebene 76 steht bevorzugt senkrecht zu der Probenebene 49. Der Scanner- Kopf 50 umfasst einen Massstab 77, der in einem Abstand zu einem fixierten, linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 und in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Der Probentisch 2 ist vorzugsweise in einer rechtwinklig zur X- Achse 75 angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahrbar ausgebildet und motorisch angetrieben.
Der Scanner-Kopf mit allen seinen optischen Elementen, Befestigungsmitteln, dem Massstab 77 und einem Teil der Linearführung weist einen Massenschwer- punkt 74 auf. Dieser Massenschwerpunkt 74 ist in der Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 auf einer Linie mit einem Pleuelangriffspunkt 69 angeordnet, welche die Pleuelstange 70 des Scanner-Kopfes 50 mit dem Antrieb 71 verbindet. Dieser Pleuelangriffspunkt 69 kann z.B. als Achse ausgebildet sein; es wird jedoch bevorzugt, den Pleuelangriffspunkt als Kreuzfedergelenk auszubilden.
Die Figur 10 zeigt eine Prinzipskizze des Weggebers 91 für den Scanner-Kopf 50 und dessen nichtlineare Bewegung beim Scannen als X/t - Diagramm. Dieses X/t - Diagramm weist auf die unterschiedliche Zeitdauer (Δtj.; Δt2) für die Erfassung eines Pixels (Δx) je nach der Position auf der X-Achse hin. Das Weggeber-Signal 92 entspricht in etwa einer Sinuskurve, welche ihre Maxima an den Extrempunkten (Endpunkten) einer Scan-Linie des Laser-Kopfes 50 aufweist. Wegen der Umkehr der Scan-Richtung in diesen Endpunkten und der dadurch verlangsamten Bewegung braucht der Scanner-Kopf in der Nähe dieser Wendepunkte eine länger Zeit (Δt2) für die selbe Wegstrecke (Δx), als mit der erreichbaren Höchstge- schwindigkeit des Scanner-Kopfes in einer Mittelstellung zwischen den Wendepunkten, bei der dieselbe Wegstrecke (Δx) in einer viel kürzeren Zeit (Δti) durchlaufen wird. Das Pixel (Δx) sowie der entsprechende Ort und Zeitpunkt wird miteinander korreliert und der zu diesem Zeitpunkt gemessenen Intensität zugeord- net. Die Summe aller gemessenen Pixel ergibt dann ein zweidimensionales Bild. Die Korrelation des Ortes dieser Pixel in der Probenebene 49 mit der Intensität der an diesem Ort gemessenen Fluoreszenzintensität bestimmt in Kombination mit der Pixelgrösse letztendlich die Auflösung des Laser-Scanner Geräts 1.
Die Figuren 11 bis 15 zeigen Diagramme von Lösungsvorschlägen, in denen die Signalintegration (I) in Funktion der Zeit (t) dargestellt ist.
Die Figur 11 zeigt einen ersten Lösungs-Vorschlag, bei welchem der Weggeber die Datenerfassung mit einem passiven Integrator (RC Glied) triggert. Dieser Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts beinhaltet aber noch einige mögliche Nachteile. So ist die gemessene Intensität am Rand des Scanbereichs höher, da hier pro Pixel länger integriert wird. Zudem wird die Auflösung des Laser Scanner-Geräts wegen der Abklingcharakteristik des RC Glieds reduziert.
Die Figur 12 zeigt einen zweiten Lösungs-Vorschlag, bei welchem der Weggeber die Datenerfassung mit einem schaltbaren Integrator bei konstanter Integrationszeit triggert. Dieser Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts beinhaltet aber noch einige, nicht akzeptable Nachteile. So reduziert die Löschzeit für den Integrator die Empfindlichkeit, da diese Zeit nicht für die Signalerfassung zur Verfügung steht. Diese Löschzeit besetzt insbesondere bei kleinen Auflösungen, d.h. sehr kleinen , Pixelzeiten' (pixel dwell time) einen signifikanten Anteil der Messzeit. Zudem wird durch den Löschvorgang selbst zusätzliches Rauschen erzeugt. Es ergibt sich überdies ein sogenanntes „Undersampling" am Rand des Scanbereichs. Auch können ungleiche Bedingungen der Datenerfassung (kürzere oder längere Abstände zwischen zwei Triggerpulsen) zu Inhomogenitäten zwischen Zentral- und Randbereichen führen.
Die Figur 13 zeigt einen dritten Lösungs-Vorschlag, bei welchem das Weggeber- Signal als Ereignis zeitlich erfasst und jedem Signal über eine Zeitbasis der Zeitpunkt seines Auftretens zugeordnet wird, wobei die Signal-Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis getriggert wird. Dem Vorteil gegenüber dem zwei- ten Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner- Geräts, gemäss welchem nun über den ganzen Scanbereich gleiche „elektronische Bedingungen" herrschen, stehen die aus dem Lösungs-Vorschlag 2 bekannten Nachteile gegenüber. Diese Nachteile ergeben sich dadurch, dass das zusätz- liehe Rauschen, das durch den Löschvorgang erzeugt wird, dass die Löschzeit die Empfindlichkeit reduziert.
Die Figur 14 zeigt einen vierten Lösungs-Vorschlag entsprechend dem dritten Lösungs-Vorschlag, wobei jedoch ein passives RC-Glied zur Integration verwendet wird. Der Vorteil gegenüber dem dritten Lösungs-Vorschlag zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Laser Scanner-Geräts liegt hier darin, dass nun keine Einbus- sen bei der Empfindlichkeit mehr in Kauf genommen werden müssen, da die Löschzeit und das zusätzliche Rauschen durch den Löschvorgang entfallen. Hingegen besteht noch der klare Nachteil wegen der durch die Abklingcharakteristik des RC Glieds bedingte reduzierte Auflösung. Es wird hier angemerkt, dass die Verkleinerung der Zeitkonstante des RC Glieds zwar die Auflösungsproblematik lösen würde; dies würde jedoch Einbussen bei der Empfindlichkeit mit sich bringen. Die Zeitkonstante des RC Glieds muss mindestens in der Grössenordnung eines Pixels liegen bevorzugt aber in der Grössenordnung eines Datenerfassungs- intervalls, da ansonsten kurze Signale (typischerweise von einzelnen Photonen) evtl. übersehen, d.h. nicht detektiert würden. Als Datenerfassungsintervall wird die Zeit zwischen zwei Wandlungspunkten des A/D Wandlers bezeichnet.
Die Figur 15 zeigt einen fünften Lösungs-Vorschlag, welcher dem vierten Lö- sungs-Vorschlag entspricht, wobei aber mehrere Messungen pro Pixel ausgeführt werden. Vorzugsweise wird dabei die Intensität eines Pixels als Mittelwert aller Datenpunkte die innerhalb der Zeitmarken für dieses Pixel liegen berechnet (und gegebenenfalls durch Interpolation noch verfeinert). Der letzte noch bestehende Nachteil gegenüber dem vierten Vorschlag wird hier eliminiert, weil sich durch die geringere Abklingzeit des RC Glieds keine verringerte Auflösung mehr ergibt. Die Erkenntnisse aus den gezeigten, unterschiedlichen Lösungs-Vorschlägen führen zu bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens:
Vorzugsweise wird jedes von einem Detektor (61) erzeugte Detektorsignal (93) von einem Integrator der Steuerung (40) integriert, wobei jedem Teil eines integrierten Detektorsignals (93) über die Zeitbasis (94) der Zeitpunkt des entsprechenden Weggeber-Signals (92) zugeordnet wird, und wobei jede Signal- Integration konstant fortlaufend von der Zeitbasis (94) getriggert und von der Steuerung (40) mit konstanter Integrationszeit durchgeführt wird.
Besonders bevorzugt wird, dass die Signal-Integration mit einem passiven RC- Glied ausgeführt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte Zeitkonstante mindestens in der Grössenordnung eines Datenerfassungsintervalls Δd liegt. Ein Da- tenerfassungsintervall ist eine in der Zeit konstant durchlaufende Erfassung der integrierten Detektorsignale 93 zwischen zwei Detektorsignalmaxima (vgl. Δd in Fig. 15).
Speziell bevorzugt wird, dass die Intensität eines Pixels 95 als Mittelwert aller Da- tenpunkte berechnet wird, die innerhalb von Zeitmarken 96 für dieses Pixel 95 liegen. Zur weiteren Verfeinerung kann auch ein Interpolationsverfahren, das unvollständig zwischen den Zeitmarken eines Pixels liegende Datenerfassungsintervalle Δd berücksichtigt und deren zugehörige Messwerte anteilig interpoliert, zum Einsatz kommen.
Die Figur 16 zeigt einen bevorzugten Test-Objektträger 10, der das Format eines Standardobjektträgers für die Lichtmikroskopie aufweist und der ausschliesslich im Wesentlichen lichtstabile Teststrukturen 41 umfasst. Als „im wesentlichen lichtstabil" wird eine Teststruktur bezeichnet, wenn diese bei normaler Benut- zung, d.h. bei der während Testverfahren üblicherweise auftretenden Strahlenbelastung keinen messbaren Schaden erleidet. Eine minutenlange oder gar stundenlange Bestrahlung eines Test-Objektträgers 10 mit einem Laserstrahl 54,55, bzw. das Liegelassen eines Test-Objektträgers 10 an einem ungeschützten Ort für längere Zeit (beispielsweise gegenüber dem Umgebungslicht exponiert) wird nicht als „normale Benutzung" bezeichnet.
Die folgende Tabelle 1 gibt einen Überblick über die gebräuchlichsten Glasobjektträger für die Lichtmikroskopie:
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Der in der Figur 16 abgebildete, beispielhafte Test-Objektträger 10 weist eine Fläche mit einer Länge A von 75 mm einer Breite B von 25 mm sowie eine Dicke C von 1 mm auf. Die eine Hälfte der Fläche A/2 ist (beispielsweise mittels Schleifen) mattiert. Die andere Hälfte weist ein bevorzugtes Linien-Muster mit einer Breite D von 20 mm auf.
Dieses Linienmuster besteht bevorzugt aus einer mittels Maske erstellten, aufgedampften Chromschicht. Die Grossbuchstaben E, F, G bezeichnen eine bestimmte Anzahl Linienpaare pro Millimeter (Ip/mm) und die Kleinbuchstaben I, m, n, o bezeichnen bestimmte Masse wie folgt: E = 50 Ip/mm; F = 100 Ip/mm; G = 10 Ip/mm; I = 0.5 mm; m = 2 mm; n = 1 mm; o = 7 mm. Alle diese Teststrukturen 41 sind bevorzugt ausschliesslich im Wesentlichen licht- stabil und nicht fluoreszierend. Das erfiπduπgsgemässe Laser Scanner-Gerät 1 ist zur Abbildung und Vermessung von zweidimensionalen Objekten ausgelegt. Dementsprechend muss eine Empfindlichkeitskalibrierung genau für diese „flachen" Objekte gültig sein. Zweidimensionale Fluoreszenzproben, die sowohl lichtstabil als auch chemisch über lange Zeiträume beständig sind, sind jedoch nicht oder nur sehr schwer herzustellen.
Dagegen können Objekte, die eine dreidimensionale Ausdehnung haben, vermessen werden. Weil die an solchen dreidimensionalen Objekten gemessenen Inten- sitäten aber stark von der Tiefenschärfe des Laser Scanner-Geräts und von der jeweiligen Positionierung im Fokus (d.h. in der Z-Richtung) abhängen, sind solche dreidimensionalen Objekte nicht direkt zur Kalibrierung von Signalintenätät oder Empfindlichkeit geeignet. Als sogenanntes „Bulk-Material" existieren jedoch Materialien 102, wie beispielsweise in Kunststoff eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe oder dotierte Gläser, die weitestgehend lichtstabil und chemisch beständig sind.
Die Ausrichtung des Probentischs 2 und der Aufbewahrungseinheit des Laser Scanner-Geräts 1 im Raum ist eigentlich beliebig. Dasselbe gilt für die gut ausgewuchtete bzw. mittels Gegenschwinger 73 impulskompensierte Scanner-Ein- richtung 72. Auch kann die Probenebene 49 des Probentisches 2 im Wesentlichen horizontal aber kopfüber hängend angeordnet sein. Allerdings wird eine stehende Anordnung des Probentischs gemäss den Figuren 1 und 2 bzw. 4 bis 7 bevorzugt.
Gleiche Merkmale oder Elemente des erfindungsgemässen Laser Scanner-Geräts 1 sind jeweils mit gleichen Bezugszeichen versehen, auch wenn diese Elemente nicht in allen Fällen im Detail beschrieben sind.
Bestandteil des erfindungsgemässen Datenerfassungsverfahrens mit einem Laser Scanner-Gerät 1 zum Abbilden und/oder Vermessen von auf Objektträgern be- findlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben bilden auch folgende Merkmale, gemäss welchen:
Die Probenebene 49 im Wesentlichen horizontal angeordnet ist und die Bewegungsrichtung 75 des Scanner-Kopfs 50 vorzugweise eine X-Achse oder Scan-Achse definiert, wobei der Probentisch 2 in einer dazu rechtwinklig angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahren wird.
Zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu der Probenebene 49 verlaufende Laserstrahlen 54,55 unterschiedlicher Wellenlänge mit dem mindestens einen Laser 51,52 und dem ersten optischen System 53 bereitgestellt und mit einem optischen Umlenkelement 56 einer Scanner- Einrichtung 72 zu der Probe hin umgelenkt werden. Bevorzugt werden diese Laserstrahlen 54,55 mit dem ersten Objektiv 57 auf der Probe in der Ebene 49 fokussiert, wonach die durch die Laserstrahlen 54,55 an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv 57 und das Umlenkelement 56 in eine zur Ebene 49 im wesentlichen parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel 59,60 unterschiedlicher Wellenlänge mit dem zweiten optischen System 58 zu zwei Detektoren 61,61' geleitet und von diesen Detek- toren 61,61' erfasst werden. Besonders bevorzugt wird die Verwendung eines keilförmigen Dichroidspiegels 62 mit in einem Zwischenwinkel ß zueinander angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen 63,64 als Teil des optischen Umlenkelements 56. Dabei ist der keilförmige Dichroidspiegel 62 vorzugsweise so eingestellt, dass die beiden Laserstrah- len 54,55 an je einer der Oberflächen 63,64 reflektiert werden, so dass der keilförmige Dichroidspiegel 62 durch den Zwischenwinkel ß eine räumliche Trennung von beiden resultierenden Fokuspunkten 65 und von beiden in Richtung der Detektoren 61,61' gelenkten Emissionsstrahlenbündeln 59,60 bewirkt. Ein als Pentaspiegelanordnung 66 mit einem keilförmigen Dichroidspiegel 62 und einem einfachen Spiegel 67 ausgebildetes, optisches Umlenkelement 56 verwendet wird, wobei diese Pentaspiegelanordnung 66 Verkippungen des Scanner- Kopfes 50 um eine zur Scan-Achse 75 rechtwinklig verlaufende Y- Achse so korrigiert, dass die resultierenden Fokuspunkte 65 ihre aktuelle Position in der Probenebene 49 nicht verändern.
Die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 gemessen wird, welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Alternativ wird bevorzugt, die Auslenkung des Scanner-Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 zu messen, welcher zumindest in der Nähe der Hauptebene 107 des ersten Objektivs 57 angeordnet ist.
Speziell bevorzugt wird, dass der Scanner-Kopf 50 mit seinem optischen Umlenkelement 56 und seiner Bewegungsrichtung 75 eine Rasterebene 76 definiert, welche senkrecht zu der Probenebene 49 steht, wobei die Auslenkung des Scanner- Kopfs 50 in der X-Achse 75 mit einem Massstab 77 gemessen wird, welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem 78 des Laser Scanner-Geräts 1 und in dieser Rasterebene 76 angeordnet ist. Dieser Massstab 77 ist bevorzugt in der Rasterebene 76 oder zumindest in der unmittelbaren Nähe dieser Rasterebene 76 angeordnet. Dieser Massstab 77 ist bevorzugt zudem in der Hauptebene 107 des ersten Objektivs 57 (vgl. Fig. 6 und 7) oder zumindest in der unmittelbaren Nähe dieser Hauptebene 107 angeordnet.
An der Stelle eines normalen Scans bzw. eines normalen abgerasterten Feldes in XY-Richtung und damit parallel zur Probenebene 49 wird ein Scan in XZ-Richtung (Z-Profil) durchgeführt, indem ein Feld abgerastert wird, welches zumindest im wesentlichen senkrecht auf der Probenebene 49 steht. Das direkt gemessene Z- Profil stellt die gemessene Intensität in Abhängigkeit von der Z-Koordinate dar (I=I(Z)). An der Stelle dieses Z-Profils wird nun vorzugsweise die erste Ableitung der entsprechenden Intensitäten (dl=dl(z)/dz) berechnet, womit wieder eine zweidimensionale Intensitätsverteilung vorliegt. Das Maximum der ersten AbIa- tung ist somit ein Mass für die vom Laser Scanner-Gerät 1 an der Oberfläche der Probe gemessenen Intensität.
Die für dieses Kalibrierverfahren geeigneten Materialien 102 können zusammen mit den aufgedampften Linienmustern auf dem gleichen Test-Objektträger 10 oder auf einem separaten Test-Objektträger angeordnet werden. Diese flachen, dreidimensionalen Materialien 102 weisen bevorzugt eine zur Probenebene 49 parallele Ausdehnung von 2 x 2 mm bis 10 x 10 mm auf und haben eine Dicke von etwa 0.1 bis 2 mm, bevorzugt eine Dicke von ca. lmm (vgl. Fig. 16). Ein Fachmann kennt die Funktion eines Dichroidspiegels als optisches Element, das für einen Teil des Wellenlängenspektrums durchlässig ist und einen anderen Teil dieses Wellenlängenspektrums spiegelt. Der Fachmann spricht hier deshalb von einer wellenlängenselektiven Transmission und Reflektion. Sich für einen Fachmann aus der vorliegenden Beschreibung ergebende Kombinationen bzw. Varianten der beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören zu deren Umfang.
Bezugszeichen :
J
1 Laser Scanner-Gerät 29 Zusätzliches Gehäuse
2 Probentisch 30 Feder
3 Transportvorrichtung 31 Entladeschieber
4 Aufbewahrungseinheit 32 Ladeschieber
15 5 Gehäuse 33 schwenkbare Klappe
6 Lagerstelle 34 Aufnahme
7 Probenteil 35 gegenüber liegende Nuten
7' Probenteil-Magazin 36 feststehende Stege
8 Proben-Objektträger 37 beweglicher Backen
20 9 Testteil 38 aufstehende Seitenwände
9' Testteil-Magazin 39 bewegliche Anpressteile
10 Test-Objektträger 40 Steuerung
11 bewegliche Stellplatte 41 lichtstabile Teststrukturen
12 Lagerstege 42 Handgriff
25 13 Anpressfeder 43 Schwalbenschwanz
14 Längskante Objektträger 44 Antrieb zu 11
15 Einschubseite 45 Antrieb zu 31
16 wegschwenkbare Klappe 46 Antrieb zu 32
18 Winkelplatte 47 Kippachse von 33
30 19 Exzenterwalze 48 Blende
21 Kontrollöffnung 49 Ebene, Probenebene
22 Kontrollvorrichtung 50 Scanner-Kopf
23 Lichtstrahl 51 erster Laser 52 zweiter Laser 78 lineares Messsystem
53 erstes optisches System 79 Kippmechanismus
54 erster Laserstrahl 80 Exzenter,
55 zweiter Laserstrahl Exzentervorrichtung
5 56 optisches Umlenkelement 81 Drehachse
57 erstes Objektiv 82 Rahmen
57' zweites Objektiv 83 Aufhängung
58 zweites optisches System 84 Spindeltrieb
59 erstes 85 Linearführung
10 Emissionsstrahlenbündel 86 Kupplung
60 zweites 87 Motor
Emissionsstrahlenbündel 88 Senkdorn
61 erster Detektor 89 Rampe
61' zweiter Detektor 90 Rasteröffnung
15 62 Dichroidspiegel 91 Weggeber
63 vordere Oberfläche 92 Weggeber-Signal
64 hintere Oberfläche 93 Detektor-Signal
65 resultierende 94 Zeitbasis
Fokuspunkte 95 Pixel
20 66 Pentaspiegelanordnung 96 Zeitmarken
67 einfacher Spiegel 97 Filterrad
68 Linearführung 98 Aussparung
69,69' Pleuelangriffspunkt 99 Trenn platte
70,70' Pleuel, Pleuelstange 101 Fokallinie
25 71 Antrieb 102 flache Materialien
72 Scanner-Einrichtung 103 Auflageteil von 2
73 Gegenschwinger 104 Stahlfeder
74 Massenschwerpunkt 105 Joch
75 Bewegungsrichtung 106 Exzenter,
30 X-Achse, Scan-Achse Exzentervorrichtung
76 Rasterebene 107 Hauptebene des Objektivs 57
77 Massstab

Claims

Patentansprüche
1. Datenerfassungsverfahren mit einem Laser Scanner-Gerät (1) zum pixelge- nauen Abbilden von auf Objektträgern (8) befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben, wobei dieses Laser Scanner- Gerät (1) umfasst: (a) einen Probentisch (2) mit einer Aufnahme (34) für Objektträger (8) in einer Probenebene (49); (b) mindestens einen Laser (51,52) und ein erstes optisches System (53) zum Bereitstellen mindestens eines Laserstrahls (54,55) zur Anregung der fluoreszierenden Proben;
(c) einen motorgetriebenen, sich nicht-linear im Raum bewegenden Scanner-Kopf (50) mit einem optischen Umlenkelement (56) zum Umlenken der Laserstrahlen (54,55) zu der Probe hin und zum Abrastern dieser
Probe in mindestens einer Bewegungsrichtung (75);
(d) ein erstes Objektiv (57) zum Fokussieren der Laserstrahlen (54,55) auf der Probe in der Ebene (49);
(e) ein zweites optisches System (58) zum Weiterleiten von durch die La- serstrahlen (54,55) an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv (57) und das Umlenkelement (56) umgelenkten Emissionsstrahlenbündeln (59,60) zu mindestens einem Detektor (61);
(f) einen Weggeber (91), der Weggeber-Signale (92) aussendet, die den momentanen Aufenthaltsort des Scanner-Kopfs (50) in Bezug auf ei- nen Nullpunkt anzeigen;
(g) ein elektronisches Element zur Filterung von Detektor-Signalen (93) des Detektors (61) mit einer definierten Zeitkonstante; und
(h) einen A/D-Wandler zur Digitalisierung der gefilterten Detektor-Signale
(93), dadurch gekennzeichnet, dass die gefilterten Detektor-Signale (93) des
A/D-Wandlers und die Weggeber-Signale (92) unabhängig, parallel und kontinuierlich von einer Rechnereinheit bzw. einer Steuerung (40) erfasst und auf eine gemeinsame Zeitbasis (94) bezogen werden, wobei die A/D- Wandlung so häufig erfolgt, dass jedem Pixel (95) eines Bildes stets mehr als ein Datenpunkt des A/D-Wandlers zugeordnet wird.
2. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das von einem Detektor (61) erzeugte Detektorsignal (93) von dem
A/D-Wandler dieser Steuerung (40) digitalisiert wird, wobei jedem Wandlungspunkt des A/D Wandlers über die Zeitbasis (94) der Zeitpunkt des entsprechenden Weggeber-Signals (92) zugeordnet wird, und wobei jede Digitalisierung konstant fortlaufend von der Zeitbasis (94) getriggert und von der Steuerung (40) mit einer konstanten und gleichen Zeit für alle Datenerfassungsintervalle (Δd) durchgeführt wird.
3. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Signal-Filterung mit einem passiven RC-Glied ausge- führt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte Zeitkonstante in der Grös- senordnung eines Datenerfassungsintervalls (Δd) liegt.
4. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Signal-Filterung mit einem passiven RC-Glied ausge- führt wird, wobei die für das RC-Glied gewählte Zeitkonstante einen Teil der
Grössenordnung eines Pixels (95) beträgt.
5. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines Pixels (95) als Mittelwert aller Daten- punkte berechnet wird, die innerhalb von Zeitmarken (96) für dieses Pixel
(95) liegen.
6. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Messwerte von unvollständig zwischen den Zeitmarken eines Pixels liegenden Datenerfassungsintervallen anteilig interpoliert werden.
7. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Laser Scanner-Gerät ( 1) beim Abbilden von auf Objektträgern (8) befindlichen, mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten, fluoreszierenden Proben eine Pixelauflösung erreicht wird, die 2.0 μm oder besser ist.
8. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Laser Scanner-Gerät (1) Pixel (95) mit einer Grosse von 2 μm mit mindestens zwei individuellen Detektor-Signalen (93) abgebildet werden.
9. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) an einer Linearführung (68), welche die Bewegungsrichtung (75) des Scanner-Kopfs (50) de- finiert, verschoben wird und einen Pleuelangriffspunkt (69) aufweist, die ü- ber einen Pleuel (70) mit einem Antrieb (71) einer Scanner-Einrichtung (72) verbunden ist, welche diesen Scanner-Kopf (50) umfasst.
10. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Pleuelangriffspunkt (69) des Scanner-Kopfs (50) in der Bewegungsrichtung (75) auf einer Linie mit einem Massenschwerpunkt (74) des Scanner-Kopfs (50) angeordnet ist.
11. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) mit seinem optischen
Umlenkelement (56) und seiner Bewegungsrichtung (75) eine Rasterebene (76) definiert, wobei der Scanner-Kopf (50) einen Massstab (77) umfasst, der in einem Abstand zu einem linearen Messsystem (78) des Laser Scanner-Geräts (1) und in dieser Rasterebene (76) angeordnet ist.
12. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Scanner-Kopf (50) einen Massstab (77) umfasst, der zumindest in der Nähe einer Hauptebene (107) des ersten Objektivs (57) angeordnet ist.
13. Datenerfassungsverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Scanner-Einrichtung (72) einen Gegenschwinger (73) umfasst, der an einer Linearführung verschiebbar befestigt ist und einen Pleuelangriffspunkt (69') aufweist, die über einen Pleuel (70') mit dem Antrieb (71) der Scanner-Einrichtung (72) verbunden ist.
14. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenebene (49) im Wesentlichen horizontal angeordnet ist.
15. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass die Bewegungsrichtung (75) des Scanner-
Kopfs (50) eine X-Achse oder Scan-Achse definiert und der Probentisch (2) in einer dazu rechtwinklig angeordneten Y-Richtung eines Kartesischen Koordinatensystems linear verfahren wird.
16. Datenerfassungsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwei parallel zueinander ausgerichtete und parallel zu der Probenebene (49) verlaufende Laserstrahlen (54,55) unterschiedlicher Wellenlänge mit dem mindestens einen Laser (51,52) und dem ersten optischen System (53) bereitgestellt und mit einem optischen Um- lenkelement (56) einer Scanner-Einrichtung (72) zu der Probe hin umgelenkt werden.
17. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass diese Laserstrahlen (54,55) mit dem ersten Objektiv (57) auf der Pro- be in der Ebene (49) fokussiert werden, wonach die durch die Laserstrahlen
(54,55) an der Probe ausgelösten und durch das erste Objektiv (57) und das Umlenkelement (56) in eine zur Ebene (49) im wesentlichen parallelen Richtung umgelenkten Emissionsstrahlenbündel (59,60) unterschiedlicher Wellenlänge mit dem zweiten optischen System (58) zu zwei Detektoren (61,61') geleitet und von diesen Detektoren (61,61') erfasst werden.
18. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein keilförmiger Dichroidspiegel (62) mit in einem Zwischenwinkel (ß) zueinander angeordneten vorderen und hinteren dichroidischen Oberflächen (63,64) als Teil des optischen Umlenkelements (56) verwendet wird, wobei der keilförmige Dichroidspiegel (62) so eingestellt ist, dass die beiden Laserstrahlen (54,55) an je einer der Oberflächen (63,64) reflektiert werden, und wobei der keilförmige Dichroidspiegel (62) durch den Zwischenwinkel (ß) eine räumliche Trennung von beiden resultierenden Fokuspunkten (65) und von beiden in Richtung der Detektoren (61,61') gelenkten Emissionsstrahlenbündeln (59,60) bewirkt.
19. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein als Pentaspiegelanordnung (66) mit einem keilförmigen Dichroidspiegel (62) und einem einfachen Spiegel (67) ausgebildetes, optisches Umlenkelement (56) verwendet wird, wobei diese Pentaspiegelanordnung (66) Verkippungen des Scanner-Kopfes (50) um eine zur Scan-Achse (75) rechtwinklig verlaufende Y-Achse so korrigiert, dass die resultierenden
Fokuspunkte (65) ihre aktuelle Position in der Probenebene (49) nicht verändern.
20. Datenerfassungsverfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Auslenkung des Scanner-Kopfs (50) in der X-Achse (75) mit einem Massstab (77) gemessen wird, welcher in einem Abstand zu einem linearen Messsystem (78) des Laser Scanner-Geräts (1) in dieser Rasterebene (76) angeordnet ist.
21. Datenerfassungsverfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslenkung des Scanner-Kopfs (50) in der X- Achse (75) mit einem Massstab (77) gemessen wird, welcher zumindest in der Nähe der Hauptebene (107) des ersten Objektivs (57) angeordnet ist.
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