DE102011016059B4

DE102011016059B4 - Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem

Info

Publication number: DE102011016059B4
Application number: DE102011016059.0A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Popp Jürgen; Anne März; Thomas W. Bocklitz
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2019-02-21
Anticipated expiration: 2031-04-02
Also published as: DE102011016059A1

Abstract

Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem mit einem Trägermedium sowie einer Folge aus Auswertesegmenten und Referenzsegmenten, wobei die Auswertesegmente jeweils aus einem Analysemedium und zumindest einer Testsubstanz sowie die Referenzsegmente jeweils aus einem Analysemedium und zumindest einer Referenzsubstanz bestehen,
- bei dem für Kalibrationszwecke zumindest zu ausgewählten Auswerte- und Referenzsegmenten jeweils ein Raman-Spektrum des Segments als Segmentspektrum sowie zumindest ein zugeordnetes Raman-Spektrum des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden,
- bei dem die Trägerspektren jeweils mit einem Referenz-Trägerspektrum verglichen werden und aus diesem Vergleich jeweils eine Wellenzahldifferenz abgeleitet wird,
- bei dem unter Berücksichtigung der jeweils abgeleiteten Wellenzahldifferenz jeweils eine Korrekturfunktion für das dem analysierten Trägerspektrum jeweils zugeordnete Raman-Spektrum des Auswerte- oder Referenzsegments berechnet wird, mit welcher das Raman-Spektrum des Auswerte- oder Referenzsegments beaufschlagt wird, und
- bei dem zusätzlich zu der durch die Korrekturfunktion erfolgende Wellenzahlkorrektur der Raman-Spektren der Auswerte- oder Referenzsegmente eine Intensitätsnormierung der Raman-Spektren von den Auswertesegmenten vorgenommen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem, beispielsweise im segmentierten Fluss in Mikrofluidiksystemen (SERS-Chip).
Anwendung findet die Erfindung im Bereich der medizinischen und Prozessanalytik sowie in allen analytischen Untersuchungen bei denen Raman-spektroskopische Daten im Mehrphasensystem detektiert werden.
Die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) gewinnt seit ihrer Entdeckung im Jahre 1974 durch Fleischmann et al. (M. Fleischmann, P.J. Hendra, A.J. McQuillan: Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode, Chem.Phys.Lett. 26, 1974, 163-166) mehr und mehr an Bedeutung (M. Schmitt, J. Popp: Raman spectroscopy at the beginning of the twenty-first century, J. Ram. Spec. 37, 2006, 20-28; Z.Q. Tian: Surface-enhanced Raman spectroscopy: advancements and applications, J. Ram. Spec. 36, 2005, 466-470).
Die Anwendung von SERS erfordert die Anwesenheit einer nanostrukturierten Metalloberfläche in der Nähe der Analytmoleküle. Die nanostrukturierte Metalloberfläche kann zum Beispiel durch die Verwendung von kolloidalen Lösungen bereitgestellt werden. Bei der Verwendung von Kolloiden als SERS aktives Substrat kommt es jedoch zu starken Intensitätsschwankungen der Signale auf Grund von Variationen der Nanopartikelgröße und -form sowie auf Grund des schwer zu kontrollierenden Aggregationsverhaltens der Nanopartikel (beispielsweise R.A. Alvarez-Puebla, E. Arceo, P.J.G. Goulet, J.J. Garrido, R.F.N. Aroca: Role of Nanoparticle Surface Charge in Surface-Enhanced Raman Scattering, J.Phys.Chem. B 109, 2005, 3787-3792; J.J. Mock, M. Barbic, D.R. Smith, D.A. Schultz, S.J. Schultz: Shape effects in plasmon resonance of individual colloidal silver nanoparticles, J.Chem.Phys. 2002, 116, 6755-6759). In statistischen Experimenten muss außerdem oft nach so genannten „Hot Spots“, Positionen an denen die Signalintensität drastisch verstärkt ist im Vergleich zum restlichen inhomogenen Probevolumen, gesucht werden.
Um ein einheitliches Aggregationsverhalten der Nanopartikel und somit eine bessere Reproduzierbarkeit der Signalintensität zu erhalten, wurden SERS-Messungen in Mikrofluidiksytemen integriert.
Zur allgemeinen Anwendung von Raman-Spektroskopie bzw. oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie in fluidischen Systemen ist auch eine Reihe von Schutzrechtsveröffentlichungen bekannt ( DE 11 200 400 1972 T5 , US 2009/0263912 A1 , US 767435 B2 , US 2006/0073035 A1 , US 2010/0210029 A1 ).
Für die ersten in der Literatur beschriebenen Untersuchungen dieser Art wurden Mischkammern einer Detektionszelle vorgeschaltet, um eine einheitliche Vermischung von Kolloid und Analyten zu erreichen (z. B. A. Berthod, J.J. Laserna, J.D. Winefordner: Surface enhanced Raman spectrometry on silver hydrosols studied by flow injection analysis, Appl.Spec. 41, 1987, 1137-1141; F. Ni, R. Sheng, T.M. Cotton: Flow-injection analysis and real-time detection of RNA bases by surface-enhanced Raman spectroscopy, Anal.Chem. 62, 1990, 1958-1963; R. Sheng, F. Ni, T.M. Cotton: Determination of purine bases by reversed-phase high-performance liquid chromatography using real-time surface-enhanced Raman spectroscopy, Anal. Chem. 63, 1991, 437-442).
Aber auch die in-situ Herstellung von kolloidalen SERS-Substraten in mikrofluidischen Systemen zur Verbesserung der Detektionsbedingungen wurde bereits beschrieben (R. Wilson, S.A. Bowden, J. Parnell and J.M. Cooper: Signal Enhancement of Surface Enhanced Raman Scattering and Surface Enhanced Resonance Raman Scattering Using in Situ Colloidal Synthesis in Microfluidics, Analytical Chemistry, 82, 2010, 2119-2123; DE 602 20 815 T2 ).
Für die Anwendung in Mischkammern war ein relativ großes Probenvolumen notwendig und es wurden Lab-on-a-Chip-Systeme mit integrierten Mischfunktionen und Detektionsfenster entworfen (M.S. Anderson: Microfluidics and Chromatography with an Atomic Force Microscope, Anal.Chem. 77, 2005, 2907-2911; G.L. Liu, L.P. Lee: Nanowell surface enhanced Raman scattering arrays fabricated by soft-lithography for label-free biomolecular detections in integrated microfluidics, Appl. Phys. Lett. 87, 2005, 074101/074101-074103; C. McLaughlin, D. MacMillan, C. McCardle, W.E. Smith: Quantitative Analysis of Mitoxantrone by Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering, Anal.Chem. 74, 2002, 3160-3167).
Ein Problem, das bei den Messungen von oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie im mikrofluidischen System auftritt, ist die Ablagerung von Nanopartikeln sowie Analytmolekülen an den Kanalwänden. Um diese Ablagerungen zu vermeiden, wurde der so genannte segmentierte Fluss für SERS-Messungen im Mikrofluidiksystemen eingeführt und angewendet (K.R. Ackermann, T. Henkel, J. Popp: Quantitative Online Detection of Low-Concentrated Drugs via a SERS Microfluidic System, ChemPhysChem 8, 2007, 2665-2670; A. März, K.R. Ackermann, D. Malsch, T. Bocklitz, T. Henkel, J. Popp: Towards a quantitative SERS approach - online monitoring of analytes in a microfluidic system with isotope-edited internal standards, Journal Of Biophotonics 2009, 2, 232-242; K.R. Strehle, D. Cialla, P. Roesch, T. Henkel, M. Koehler, J. Popp: A Reproducible Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Approach. Online SERS Measurements in a Segmented Microfluidic System, J. Anal. Chem. 79, 2007, 1542-1547; G. Wang, C. Lim, L. Chen, H. Chon, J. Choo, J. Hong, A.J. deMello: Surface-enhanced Raman scattering in nanoliter droplets: towards high-sensitivity detection of mercury (II) ions, Analytical and Bioanalytical Chemistry 394, 2009, 1827-1832). Dabei handelt es sich um ein ZweiPhasen-System aus einem Trägermedium, z. B. ein Öl (Tetradekan, Mineralöl) und ein Medium mit einer anderen Dichte, in dem das Kolloid und Analyte (meist wässrige Phase) transportiert werden. Auf Grund des Dichteunterschiedes bildet die Kolloid/Analyt-Phase Tropfen im Trägermedium, welche die Kanalwände nicht berühren und von Trägermedium auf Grund einer hydrophoben Funktionalisierung der Kanalwände komplett umhüllt sind (K.R. Ackermann, T. Henkel, J. Popp: Quantitative Online Detection of Low-Concentrated Drugs via a SERS Microfluidic System, ChemPhysChem 8, 2007, 2665-2670;A. März, K.R. Ackermann, D. Malsch, T. Bocklitz, T. Henkel, J. Popp: Towards a quantitative SERS approach - online monitoring of analytes in a microfluidic system with isotope-edited internal standards, Journal Of Biophotonics 2009, 2, 232-242; K.R. Strehle, D. Cialla, P. Roesch, T. Henkel, M. Koehler, J. Popp: A Reproducible Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Approach. Online SERS Measurements in a Segmented Microfluidic System, J. Anal. Chem. 79, 2007, 1542-1547; T. Henkel, T. Bermig, M. Kielpinski, A. Grodrian, J. Metze, J.M. Kohler: Chip modules for generation and manipulation of fluid segments for micro serial flow processes, Chemical Engineering Journal 101, 2004, 439-445). Diese Anwendung eines 2-Phasensystems in mikrofluidischen Systemen für SERS-Messungen führt zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit der SERS-Spektren. Auch diese Anwendungen bzw. die Erzeugung von Segmenten und Tropfen in Mikrofluidiksystemen für Raman-spektroskopische Untersuchungen ist nicht nur in der Literatur sondern auch in einigen Schutzrechtsveröffentlichungen ausführlich beschrieben ( US 2010/0075436 A1 , US 2010/0058845 A1 , US 2010/0055677 A1 , DE 10 2006 045 618 A1 ).
Im Bereich der Spektroskopie ist es von großer Bedeutung, dass Daten vergleichbar sind. Oft wird im diagnostischen Bereich bei der Analyse von Proben auf Datenbanken zurückgegriffen, um eine Aussage treffen zu können, oder es wird bei quantitativen Untersuchungen vor jeder Messung eine Kalibrationskurve für unterschiedliche Konzentrationen erstellt (für Raman-spektroskopische Untersuchungen in Mikrofluidiksystemen: US 6,846,638 B2 , US 7,507,579 B2 , US 7,515,269 B1 ). Die Analyse anhand von Datenbanken ist jedoch nur möglich, wenn die untersuchten Proben mit einem bekannten und kalibrierten Messgerät untersucht wurden und die erhaltenen Daten mit den Datenbankeinträgen vergleichbar sind.
Auch unter Anwendung der Raman-Spektroskopie ist es wichtig, vergleichbare Daten zu erhalten. So wird zum Beispiel die Identifizierung von Bakterien mittels Raman-Spektroskopie anhand von Datenbanken ausgeführt (P. Rösch M. Harz, M. Schmitt, K.D. Peschke, O. Ronneberger, H. Burkhardt, H. W. Motzkus, M. Lankers, S. Hofer, H. Thiele, J. Popp, Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations Applied And Environmental Microbiology, 2005, 71, 1626-1637.). Um vergleichbare Daten zu erhalten wird ein Messgerät in der Regel vor einer Messung kalibriert. Dafür wird im Falle der Raman-Spektroskopie ein Spektrum einer Referenzsubstanz aufgenommen, von der die exakten Bandenpositionen im Spektrum unter bestimmten Parametern (Temperatur, Anregungswellenlänge, etc.) bekannt sind. Anhand dieser ist es nun möglich eine Wellenzahlkalibration und Intensitätsnormierung durchzuführen. Das grundlegende Vorgehen bei der Kalibration von Raman-Spektren ist bereits in der Literatur beschrieben (K. J. Frost and R. L. McCreery: Calibration of Raman spectrometer instrument response function with luminescence standards: An update, Applied Spectroscopy, 52, 1998, 1614-1618; M. Fryling, C.J. Frank and R.L. McCreery: Intensity Calibration And Sensitivity Comparisons For Ccd Raman Spectrometers, Applied Spectroscopy, 47, 1993, 1965-1974; D. Hutsebaut, P. Vandenabeele and L. Moens: Evaluation of an accurate calibration and spectral standardization procedure for Raman spectroscopy, Analyst, 130, 2005, 1204-1214; K. G. Ray and R. L. McCreery: Simplified calibration of instrument response function for Raman spectrometers based on luminescent intensity standards, Applied Spectroscopy, 51, 1997, 108-116; T. Dörfer, T. Bocklitz, N. Tarcea, M. Schmitt, J. Popp: Checking and Improving Calibration of Raman Spectra using Chemometric Approaches, Zeitschrift für physikalische Chemie, 2011, accepted).
Die häufigsten Vorgehensweisen für die Kalibration eines Raman-Spektrometers ist zum einen das Messen einer bekannten Probe am Beginn des Messtages oder die Kalibration auf die verwendete Laserlinie. Jedoch kann es besonders auf Grund von Temperaturschwankungen zu Veränderungen der Laserintensität und der Linienposition des Lasers kommen. Gerade bei Langzeitmessungen kann eine Schwankung der Laserintensität und der Linienposition dazuführen, dass die gemessenen Daten nicht mehr vergleichbar sind und somit unbrauchbar werden.
Betrachtet man Kalibrationsverfahren für Raman- und oberflächenverstärkte Raman-spektroskopische Untersuchungen in Mikrofluidiksystemen, sind ebenfalls schon einige Beispiele beschrieben. So sind Fluidiksysteme beschrieben, welche die Zugabe eines Kalibrationsstandards gewährleisten ( US 2010/0173398 A1 ). Bezüglich der Beobachtung von Parameteränderungen und deren Auswirkung auf die Analyseergebnisse hat die Gruppe von Ferstl et al. (W. Ferstl, T. Klahn, W. Schweikert, G. Billeb, M. Schwarzer, S. Loebbecke, Chem.Eng.Technol. 30, 2007, 3, 370-378) ein Kalibrationsmodell entwickelt, welches in einem Mikroreaktor Konzentration bei variierenden Parametern vorhersagen kann. Dieses Kalibrationsverfahren ist jedoch an komplexe statistische Auswertung gekoppelt und berücksichtigt nicht Temperaturänderungen, die Einfluss auf den Anregungslaser haben, sondern nur Änderung in der Analyselösung. Weitere Beschreibungen von Kalibrationsverfahren, die sich mit der Veränderung der Temperatur auseinandersetzen ( US 2009/0233810 A1 , WO 2006/087127 A1 , DE 10 2005 007 872 B3 , US 2011/0001963 A1 ), berücksichtigen Energieunterschiede, die Kalibration des Detektors oder vergleichen Stokes und Anti-Stokesbanden in Raman-Spektren. Hierbei wird jedoch nur eine Intensitätskalibration durchgeführt und der Einfluss von Bandenshifts in Spektren, die auf Grund vom Shiften der Anregungswellenlänge verursacht werden, wird nicht berücksichtigt. Es ist kein Kalibrationsverfahren bekannt, welches sowohl die Einflüsse von veränderlichen Umgebungsparametern (z. B. Temperatur etc.) auf das Messgerät und somit die Raman- bzw. SERS-Spektren berücksichtigt, sowie die Substrateinflüsse bei SERS-Messungen auf die zugehörigen Spektren.
März et al. (A. März, K.R. Ackermann, D. Malsch, T. Bocklitz, T. Henkel, J. Popp: Towards a quantitative SERS approach - online monitoring of analytes in a microfluidic system with isotope-edited internal standards, Journal Of Biophotonics, 2, 2009, 232-242) haben die Methode des internen Standards für die Kalibration von Substrateinflüssen bei SERS-Messungen vorgestellt, jedoch bringt diese Variante den Nachteil mit sich, dass bei SERS-Untersuchungen die Signale des internen Standards von den Molekülen der zu untersuchenden Proben beeinflusst werden und es dadurch zu Störeffekten bei der Kalibration kommen kann. Ohne eine geeignete Wellenzahlkalibration und Intensitätsnormierung ist die Vergleichbarkeit von Raman- und oberflächenverstärkten Raman-spektroskopischen Daten nicht gegeben und erschwert die Anwendung dieser Methoden als Standardanalysemethode auf Grund von schlechter Reproduzierbarkeit und hoher Ungenauigkeit.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Auswertung zu erhöhen und eine bessere Vergleichbarkeit der Messdaten zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem mit einem Trägermedium sowie einer Folge aus Auswertesegmenten und Referenzsegmenten, wobei die Auswertesegmente jeweils aus einem Analysemedium und zumindest einer Testsubstanz sowie die Referenzsegmente jeweils aus einem Analysemedium und zumindest einer Referenzsubstanz bestehen,

- bei dem für Kalibrationszwecke zumindest zu ausgewählten Auswerte- und Referenzsegmenten jeweils ein Raman-Spektrum des Segments als Segmentspektrum sowie zumindest ein zugeordnetes Raman-Spektrum des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden,
- bei dem die Trägerspektren jeweils mit einem Referenz-Trägerspektrum verglichen werden und aus diesem Vergleich jeweils eine Wellenzahldifferenz abgeleitet wird,
- bei dem unter Berücksichtigung der jeweils abgeleiteten Wellenzahldifferenz jeweils eine Korrekturfunktion für das dem analysierten Trägerspektrum jeweils zugeordnete Raman-Spektrum des Auswerte- oder Referenzsegments berechnet wird, mit welcher das Raman-Spektrum des Auswerte- oder Referenzsegments beaufschlagt wird, und
- bei dem zusätzlich zu der durch die Korrekturfunktion erfolgende Wellenzahlkorrektur der Raman-Spektren der Auswerte- oder Referenzsegmente eine Intensitätsnormierung der Raman-Spektren von den Auswertesegmenten vorgenommen wird.

Vorteilhaft wäre dabei, wenn zu allen Auswerte- und Referenzsegmenten jeweils ein Raman-Spektrum des Segments als Segmentspektrum sowie zumindest ein zugeordnetes Raman-Spektrum des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden.
Zweckmäßig ist auch, wenn zu jedem Segmentspektrum jeweils zwei zugeordnete Raman-Spektren des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden, wobei in einem segmentierten Fluss jeweils ein Raman-Spektrum des Trägers vor dem Segment und ein Raman-Spektrum des Trägers hinter dem Segment gemessen werden.
Diese Kalibrations- und Normierungsmethode hat den Vorteil, dass man online (während des laufenden Messprozesses) eine Kalibration und Normierung durchführen kann. Die Messung der Referenzprobe erfolgt unter denselben Parametern wie die Messung des Analyten. Es werden keine anderen optischen Wege für die Referenzmessungen zurückgelegt, wie es zum Beispiel bei Referenzmessungen bei UV-VIS der Fall ist (unterschiedliche Küvetten). Die Referenzmessungen in diesem Fall erfolgen sowohl vor als auch nach Detektion der Probe und im maximalen zeitlichen Abstand von beispielsweise ca. 8s für die Wellenzahlkalibration und beispielsweise ca. 12s für die Intensitäts- und Kolloideinflussnormierung bei den SERS-Messungen. Durch die Wellenzahlkalibration werden Einflüsse von äußeren Parametern (z. B. Temperatur, etc) auf die Spektren korrigiert. Durch die Einführungen von Referenztropfen werden Schwankungen der Signalintensität, hervorgerufen durch Schwankungen in der Laserleistung, sowie Einflüsse auf die Signalintensität, hervorgerufen durch veränderliche SERS-Substrateeigenschaften, detektiert und anschließend durch Intensitätsnormierung eliminiert. Diese Kalibrations- und Normierungsmaßnahmen machen die Analytspektren vergleichbar und führen zu einer reproduzierbaren und genauen Auswertung der Analyseergebnisse.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:

1: Schematische Darstellung des segmentierten Flusses in einem Zweiphasensystem
2: Schematische Darstellung des Messprinzips zu verschiedenen Messzeitpunkten t₁ und t₂ im kontinuierlich fließenden segmentierten Fluss; Raman-Spektrum vom Trägermedium Mineralöl (t₁ ) gemessen außerhalb des Tropfens und das zehnfache eines SERS-Spektrum von Analyt gemessen im Tropfen (t₂ )
3: Bandenposition von zwei Ölbanden vor und nach der Kalibration
4: Schematische Darstellung des segmentierten Flusses im Zweiphasensystem (vgl. 1) mit dem Unterschied, dass jeder zweite Tropfen mit einer Referenzsubstanz für eine Intensitätsnormierung anstatt mit Analyt beaufschlagt ist.

In 1 ist der segmentierte Fluss in einem Zweiphasensystem dargestellt, bei welchem sich wässrige Tropfen 1 mit Analyt, Kolloid, Aktivierungsreagenz und anderen Reagenzien in einem Trägermedium 2 eines Mikrofluidikkanals 3 bewegen. Das Trägermedium 2 weist dabei für den segmentierten Fluss eine geringere Dichte auf als die Tropfen 1.
Der kontinuierliche segmentierte Fluss (ständige Bewegung der Tropfen 1) im Mikrofluidikkanal 3 ist durch einen horizontalen Pfeil 4 symbolisiert. An einem Messpunkt 5 des Mikrofluidikkanals 3 wird für Raman-spektroskopische Untersuchungen ein Laserstrahl (angedeutet durch vertikale Pfeildarstellung) in den Mikrofluidikkanal 3 fokussiert, welcher auf den mittleren von den drei dargestellten wässrigen Tropfen 1 trifft, so dass von diesem Tropfen gegenwärtig das SERS- bzw. Raman-Spektrum aufgenommen werden kann.
Spektroskopische Messungen, die unter Verwendung des segmentierten Flusses in einem Mikrofluidiksystem erfolgen und nach dem Messprinzip, welches bereits in der Literatur (A. März, K.R. Ackermann, D. Malsch, T. Bocklitz, T. Henkel, J. Popp: „Towards a quantitative SERS approach - online monitoring of analytes in a microfluidic system with isotope-edited internal Standards", Journal Of Biophotonics, 2, 2009, 232-242) beschrieben wurde, durchgeführt werden, resultieren in der Aufnahme von verschiedenen Spektren.
Erfindungsgemäß werden die Messungen kontinuierlich durchgeführt, und es werden sowohl von den Tropfen 1 wie auch von der Phase des Trägermediums 2 laserstrahlangeregte Spektren detektiert. Der segmentierte Fluss ist, wie beschrieben, kontinuierlich in Bewegung, während die Aufnahme von Spektren an dem festgelegten Messpunkt 5 fortlaufend erfolgt.
Damit erfolgt jeweils sowohl eine Aufnahme von Spektren innerhalb sowie außerhalb des jeweiligen Tropfens 1. Die Spektren innerhalb des Tropfens 1 enthalten die analytisch relevante Information. Die Spektren des Trägermediums 2 dienen als Referenzmessungen. Das Trägermedium 2 stellt eine Referenzsubstanz dar, von dem die spektroskopischen Informationen unter festgelegten Messparametern bekannt sind. Diese Informationen werden für jede Phase zwischen den Tropfen 1 auf Abweichungen überprüft, welche beispielsweise durch Temperaturschwankungen und/oder andere Einflüsse auftreten können.
Zur Überprüfung werden auf festgelegte Markerbanden im Spektrum der Referenzsubstanz ein Least-Square-Fit eines Gaussprofils angewendet und die aktuellen Bandenpositionen bestimmt. Diese erhaltenen Bandenpositionen werden mit tabellierten bzw. festgelegten Referenzwerten verglichen.
Bei Abweichungen wird jeweils die Wellenzahlachse des gemessenen Spektrums der Referenzsubstanz unter Berücksichtigung der ermittelten Bandenpositionen und der bekannten bzw. festgelegten Bandenpositionen mit Hilfe eines Polynoms modifiziert. Die für die Modifizierung angewendete Funktion kann nun auf die Spektren, die innerhalb der Tropfen detektiert wurden, angewandt werden. Dadurch wird eine Korrektur der durch umgebungsbedingte Schwankung auftretenden Änderungen im Spektrum durchgeführt und die Vergleichbarkeit der Spektren wieder hergestellt.
2 zeigt als Beispiel ein Ölspektrum 6 von Mineralöl als Trägermedium 2 und ein SERS-Spektrum 7, welches in einem Tropfen 1 gemessen wurde. Die Aufnahme erfolgte jeweils zu unterschiedlichen Messzeitpunkten t₁ , t₂ , da sich die Tropfen des segmentierten Flusses während der Messung kontinuierlich bewegen (angedeutet durch die Darstellungen des Mikrofluidikkanals 3 in 2 links oben).
Vier im Mineralölspektrum auftretende Banden werden als Markerbanden für die Kalibration verwendet. Diese Banden werden, wie bereits beschrieben, gefittet und die tatsächliche Bandenposition bestimmt. Für eine Messung über 40000s wurde die tatsächliche Bandenposition von zwei (die in 2 durch A und B gekennzeichnet sind) der vier Ölbanden in 3 (obere dunkle Punkte, jeweils A und B im Bezug auf die in 2 gekennzeichneten Banden) dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Bandenposition über die Messzeit stark schwankt. Diese Schwankungen sind auf leichte Temperaturänderung im Labor zurückzuführen. Zur Kalibration wurden die tatsächlichen Bandenpositionen mit den tabellierten bzw. festgelegten Positionen verglichen und, wie bereits erwähnt, die Wellenzahldifferenz durch die Anwendung eines Polynoms minimiert. Die Bandenpositionen nach der Kalibration sind in 3 durch die unteren helleren Punkte (jeweils A und B im Bezug auf die in 2 gekennzeichneten Banden) dargestellt. Nach der Kalibration befinden sich die Banden an der richtigen Wellzahlposition. Für die Kalibration von SERS-Spektren 7 innerhalb eines Tropfens 1 werden jeweils die Ölspektren 6 vor und nach einem Tropfen 1 betrachtet. Für das Mittelwertspektrum der Ölspektren 6 vor und nach einem Tropfen 1 werden die tatsächlichen Bandenpositionen mit den tabellierten verglichen und ein Polynom berechnet, welches die Wellenzahldifferenz minimiert. Genau dieses Polynom wird dann auf die spektralen Daten des zugehörigen Tropfens 1 angewendet. Diese Prozedur wird für jeden Tropfen 1 der Messung und den dazugehörigen SERS-Spektren 7 durchgeführt um eine Wellenzahlkalibration für alle SERS-Spektren 7 zu erreichen.
Um eine Intensitätsnormierung für SERS-Spektren in einem segmentierten Fluss durchzuführen, wird eine Referenzmessung unter Berücksichtung der Kolloideigenschaften durchgeführt, da Schwankungen der Laserleistung und damit der Signalintensität im SERS-Spektrum 7 nicht direkt mit einem Raman-Referenzspektrum korreliert werden können. Um eine solche Referenzmessung durchzuführen, ist es möglich, jeden zweiten Tropfen (vgl. Tropfen 8 in 4) im Mikrofluidikkanal 3 mit einer Referenzsubstanz zu beladen, die es ermöglicht, die Kolloideinflüsse zu überwachen.
4 beschreibt schematisch den somit erhaltenen segmentierten Fluss. Tropfen 1 (Originaltropfen) und Tropfen 8 (mit Referenzsubstanz beladener Tropfen) treten immer im Wechsel auf, wobei die Tropfen 1 die zu untersuchende Probe plus ein Kolloid als SERS aktive Substanz sowie die Tropfen 8 dasselbe Kolloid und eine bekannte Konzentration einer Standardsubstanz enthalten. Somit werden im Wechsel Spektren des Analyten und eines Standards detektiert. Diese Methode hat den Vorteil, dass als Standard eine isotopenmarkierte Verbindung verwendet werden kann, aber nicht muss, da man sich in einem anderen Tropfen befindet. Man kann somit für die Referenzmessungen im Tropfen 8 den zu untersuchenden Analyten mit bekannter Konzentration und/oder z. B. Umgebungsmatrix verwenden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Einflüsse, die von der Probenmatrix in Tropfen 1 kommen, keinen Einfluss auf die Messung und Signalintensität des Standards haben und somit die reinen Kolloideinflüsse, welche die SERS-Spektren beeinflussen, wie Alterungserscheinungen etc. kontrolliert und korrigiert werden können. Mit dieser Standardmessung werden ebenfalls Intensitätsschwankungen, die von der Laserleistung beeinflusst werden, normiert. Zur Intensitätsnormierung werden die Analytspektren aus Tropfen 1 auf eine Markerbande im Referenzspektrum, gemessen im Tropfen 8, oder auf das komplette Referenzspektrum, gemessen im Tropfen 8, normiert. Für diese Normierung kann der Tropfen 8 vor oder nach einem Tropfen 1 bzw. sowohl der vorausgehende und der nachfolgende Referenztropfen 8 berücksichtigt werden.
Bezugszeichenliste

1,8 -: Tropfen
2 -: Trägermedium
3 -: Mikrofluidikkanal
4 -: Pfeil
5 -: Messpunkt
6 -: Ölspektrum (Ramanspektrum des Trägermediums 2)
7 -: SERS-Spektrum (Spektrum des Tropfens 1)
t₁, t₂ -: Zeitpunkt

Claims

Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem mit einem Trägermedium sowie einer Folge aus Auswertesegmenten und Referenzsegmenten, wobei die Auswertesegmente jeweils aus einem Analysemedium und zumindest einer Testsubstanz sowie die Referenzsegmente jeweils aus einem Analysemedium und zumindest einer Referenzsubstanz bestehen, - bei dem für Kalibrationszwecke zumindest zu ausgewählten Auswerte- und Referenzsegmenten jeweils ein Raman-Spektrum des Segments als Segmentspektrum sowie zumindest ein zugeordnetes Raman-Spektrum des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden, - bei dem die Trägerspektren jeweils mit einem Referenz-Trägerspektrum verglichen werden und aus diesem Vergleich jeweils eine Wellenzahldifferenz abgeleitet wird, - bei dem unter Berücksichtigung der jeweils abgeleiteten Wellenzahldifferenz jeweils eine Korrekturfunktion für das dem analysierten Trägerspektrum jeweils zugeordnete Raman-Spektrum des Auswerte- oder Referenzsegments berechnet wird, mit welcher das Raman-Spektrum des Auswerte- oder Referenzsegments beaufschlagt wird, und - bei dem zusätzlich zu der durch die Korrekturfunktion erfolgende Wellenzahlkorrektur der Raman-Spektren der Auswerte- oder Referenzsegmente eine Intensitätsnormierung der Raman-Spektren von den Auswertesegmenten vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu allen Auswerte- und Referenzsegmenten jeweils ein Raman-Spektrum des Segments als Segmentspektrum sowie zumindest ein zugeordnetes Raman-Spektrum des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zu jedem Segmentspektrum jeweils zwei zugeordnete Raman-Spektren des das Segment umgebenden Trägers als Trägerspektrum gemessen werden, wobei in einem segmentierten Fluss jeweils ein Raman-Spektrum des Trägers vor dem Segment und ein Raman-Spektrum des Trägers hinter dem Segment gemessen werden.