DE60220815T2 - Nachweis durch serrs in mikrofluidischer umgebung - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches Verfahren zum Erzeugen in situ eines Kolloids zur Verwendung beim Nachweisen eines Analyts unter Verwendung von zum Beispiel SER(R)S ebenso wie ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyts unter Verwendung von SER(R)S in einem mikrofluidischen System. Die Erfindung betrifft auch mikrofluidische Vorrichtungen zur Verwendung beim Nachweisen von Analyten, wie beispielsweise durch SER(R)S-Signale.
  • Oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Streuung (1, 2) ist ein extrem leistungsstarkes analytisches Werkzeug, das nicht nur in Form eines Schwingungsspektrums Information über die molekulare Struktur des Analyts gibt, sondern auch eine Empfindlichkeit erlaubt, die mit der vergleichbar ist, die unter Verwendung von Fluoreszenzspektroskopie (3–5) erreicht wird. Oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) beinhaltet die Adsorption eines Analyts auf einer geeigneten Oberfläche (gewöhnlich aufgerauhtes Silber oder Gold) und die Aufzeichnung der Raman-Streuung von dieser Oberfläche. Die Verwendung von Molekülresonanzverstärkung, wo die Frequenz der Anregungsquelle abgestimmt wird, in Resonanz mit einem Analytchromophor zu sein, ebenso wie Oberflächenverstärkung (SER(R)S) resultiert in einer weiteren Zunahme der Empfindlichkeit und verstärkt außerdem die Selektivität des Systems (6). Dies ermöglicht die Diskriminierung des interessierenden Analyts von allen Kontaminanten, die in dem System vorhanden sein können. Zusätzlich gibt es, verglichen mit dem Nachweis unter Verwendung von Fluoreszenz, eine viel bessere Kennzeichnungschemie und viel bessere Ergebnisse im Multiplexnachweis.
  • Eines der Hauptprobleme, das mit der Verwendung von SERRS als einer quantitativen Analysentechnik verbunden ist, ist die Schwierigkeit, die mit dem Herstellen reproduzierbarer SERRS-Substrate verbunden ist. Variationen in der Morphologie von SERRS-Substraten können umfangreiche Variationen in den erzeugten SERRS-Intensitäten hervorrufen (7). Ein gebräuchliches SERRS-Substrat ist Silberkolloid (8–11). Dieses kann durch Reduktion wässeriger Lösungen von Silbersalzen leicht hergestellt werden (9, 12, 13). Jedoch gibt es, wie bei anderen Substraten, noch ein Problem, das mit der Herstellung stabiler, reproduzierbarer Silberkolloide verbunden ist (10, 14). Es wurde auch gefunden, daß, um die maximale Verstärkung von Silberkolloid zu erreichen, das Kolloid aggregiert sein muß (15–18). Dies ist auf das außerordentlich verstärkte elektromagnetische Feld zwischen aggregierten kolloidalen Teilchen im Vergleich zu dem an der Oberfläche eines einzelnen kolloidalen Teilchens zurückzuführen (19). Aggregation kann unter Verwendung eines breiten Bereichs von Reagenzien induziert werden, dies ist jedoch ein dynamischer Prozeß und wenn verschiedene SERRS-Intensitäten von Aggregaten verschiedener Morphologien akkumuliert werden (20, 21), ist es wünschenswert, imstande zu sein, den Aggregationsprozeß zu steuern, um reproduzierbare SERRS-Signale zu erreichen.
  • Ein Verfahren zum Verbessern der Reproduzierbarkeit von SERRS-Signalen, die bei Verwendung von Silberkolloid als SERRS-Substrat erhalten werden, ist es, eine Makrofließzelle zur Analyse zu verwenden (22–26). In diesem Typ von System werden das Kolloid, der Analyt und das Aggregierungsmittel in eine Zelle gepumpt, wo man sie sich mischen läßt. Das Signal wird dann aus dem fließenden Strom akkumuliert, wenn er den Laserstrahl passiert. Da die Probenlösung während der Signalakkumulationszeit fortwährend am Fließen ist, gibt es eine Mittelung der SERRS-Intensitäten, die von verschiedenen Aggregaten akkumuliert werden, und eine Kontrolle über die Kinetik der Aggregatbildung. Dies resultiert in erhöhter analytischer Präzision und guter Quantifizierung über mehrere Größenordnungen. Dieser Typ von System ergibt auch eine größere Kontrolle über die Geschwindigkeiten der Zugabe von Reagenzien und den Zustand der Aggregation des Kolloids an dem Punkt der Signalakkumulation. Es wurden auch ähnliche Systeme entwickelt, in denen das Kolloid prozeßgekoppelt hergestellt wird (27–29). Dies beseitigt die Notwendigkeit, stabile, reproduzierbare Kolloidchargen herzustellen.
  • Es gibt jedoch eine Anzahl potentieller Nachteile bei der Verwendung von auf Makrofließzellen basierenden Systemen. Wenn zum Beispiel Kolloid in situ hergestellt wird, kann das Kolloid nur für eine kurze Zeitdauer, typischerweise Minuten, stabil bleiben. Dies bedeutet im wesentlichen, daß die Probenahme des Analyts und der SERRS-Nachweis gleichzeitig ausgeführt werden müssen. Es ist deshalb im allgemeinen nicht möglich, eine Probe zu nehmen und den SERRS-Nachweis zu einer späteren Zeit auszuführen.
  • Darüber hinaus ist bei Makrofließzellensystemen eine relativ große Menge von Reagenzien zum Ausfüren der SERRS-Analyse erforderlich, was zu Undurchführbarkeiten der Feldanwendung derartiger Vorrichtiungen führt. Zusätzlich kann die Empfindlichkeit des SERRS-Nachweises bei Verwendung von Makrofließzellen nicht optimal sein, zurückzuführen auf eine effektive Verdünnung eines Analyts mit dem Kolloid. Zu anderen Nachteilen der Verwendung eines Makrofließzellensystems gehören die Fähigkeit, Chemikalien unter nichtzersetzenden Bedingungen aufzubewahren, und die Entsorgung von Abfall.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, mindestens einen der vorstehend erwähnten Nachteile zu beseitigen und/oder zu mildem.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen in situ eines Kolloids zur Verwendung beim Nachweisen eines Analyts unter Verwendung von SER(R)S bereit, wobei das Kolloid durch Inkontaktbringen unter Bedingungen laminarer Strömung eines ersten mikrofluidischen Stroms eines geeigneten Metallsalzes mit einem zweiten mikrofluidischen Strom eines Reduktionsmittels erzeugt wird, wodurch Mischen des ersten und zweiten Stroms im wesentlichen an einer Grenzflächenregion zwischen dem ersten und zweiten Strom erfolgt und wobei Kolloid in der Grenzflächenregion erzeugt wird und wobei die zwei Ströme in einem Kanal von 1 μm bis 500 μm Breite gemischt werden.
  • Das so in situ oder ex situ (das heißt ohne Verwendung eines mikrofluidischen Systems oder eines gesonderten mikrofluidischen Systems) erzeugte Kolloid kann mit einem Analyt in einem mikrofluidischen System mit Kanälen von 1 μm bis 500 μm Breite und unter laminaren Strömungsbedingungen so gemischt werden, daß der Analyt daran haftet und nachher durch SER(R)S nachgewiesen werden kann. Gegebenenfalls kann ein weiteres Reagenz an das Kolloid und den daran anhaftenden Analyt gebunden oder in anderer Weise mit ihm verbunden werden. Typischerweise wird der Analyt durch einen dritten mikrofluidischen Strom bereitgestellt, der angeordnet ist, um mit dem so erzeugten Kolloid in Kontakt zu kommen.
  • Gegebenenfalls kann ein Aggregierungsmittel oder -hilfsmittel ebenfalls zur Kolloiderzeugung erforderlich sein, wo das Reduktionsmittel allein zur Kolloiderzeugung nicht ausreichend ist. Das Aggregierungsmittel kann durch einen weiteren Strom eingeführt oder in einen existierenden Strom eingeschlossen werden, der mit den anderen Strömen vor, während oder nach dem Mischen des Analyts vereinigt wird. Aggregierungshilfsmittel können elektrochemische, elektrische, dielektrische oder magnetische Hilfsmittel einschließen, die gestaltet sind, um das Kolloid zu aggregieren. Derartige Hilfsmittel könnten angrenzend an oder in Kontakt mit dem mikrofluidischen Strom positioniert werden, um so darauf einzuwirken.
  • Man muß sich dessen bewußt sein, daß SER(R)S SERS (oberflächenverstärkte Raman-Streuung) und SERRS (oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Spektroskopie) bezeichnet, wobei SERRS bevorzugt wird. Dies sollte jedoch nicht als begrenzend ausgelegt werden, da andere Streuungs- oder Wellenresonanz-Nachweistechniken einschließlich Raleigh-Streuung und Oberflächenplasmon-Resonanz ebenfalls angewendet werden könnten.
  • Zu Beispielen von Analyten, die nachgewiesen werden können, gehören Nucleinsäuren, Nucleinsäureanaloge, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Enzyme, Prione, Antikörper, Aldehyde, Amine, Ketone, Explosivstoffe, Suchtmittel, therapeutische Mittel, Metabolite und Umweltschadstoffe. Dies ist jedoch nicht erschöpfend, da jeder geeignete Analyt nachgewiesen werden kann. Der Analyt kann aus einer Probe erhalten werden und die Probe kann irgendeine geeignete Zubereitung sein, in der der Zielanalyt wahrscheinlich zu finden ist. Jedoch kann geeigneterweise die Probe in einem Fluid oder in Lösung sein oder vor dem Mischen mit dem Kolloid in eine Lösung überführt werden. So kann zum Beispiel, wenn Explosivstoffe oder Suchtmittel nachgewiesen werden, eine Gasprobe, wie beispielsweise Luft bzw. Atem, genommen werden und irgendein Zielanalyt auf einem geeigneten Substrat absorbiert werden. Danach kann irgendein Zielanalyt durch Waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel von dem Substrat entfernt werden.
  • Für effektive SERRS-Analyse muß, um in Resonanz mit dem gewählten Laser zu sein, ein Chromophor mit einer geeigneten Wellenlänge in dem Analyt vorhanden sein, oder ein Chromophor muß durch Derivatisierung des Analyts vor der Analyse erschaffen werden. Darüber hinaus muß in jedem Fall effektive Adsorption an der Oberfläche der kolloiden Teilchen erreicht werden. So kann der Analyt mit einem Reagenz umgesetzt werden, um den Analyten zu derivatisieren. Das Reagenz, das zum Derivatisieren des Analyts verwendet wird, kann einen Chromophor bereitstellen, kann in Kombination mit dem Analyt einen Chromophor bereitstellen und/oder den Analyten empfänglich machen, an dem SERRS-aktiven Substrat zu haften. Alle Einzelheiten einer derartigen Derivatisierung können zum Beispiel in PCT/GB01/01611 gefunden werden, worauf der fachkundige Leser hingewiesen wird.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten kolloiden Teilchen werden in einer gesteuerten Weise aggregiert, um eine reproduzierbare Größe und Gestalt zu haben und so stabil wie möglich gegen Selbstaggregation zu sein. Verfahren zum Herstellen derartiger unaggregierter Kolloide sind bereits bekannt. Sie beinhalten zum Beispiel die Reduktion eines Metallsalzes (z.B. Silbernitrat) mit einem Reduktionsmittel, wie beispielsweise Citrat, um eine stabile mikrokristalline Suspension zu erzeugen (siehe P.C. Lee & D. Meisel, J. Phys. Chem. (1982), 86, S. 3391). Diese „Stamm"-Suspension wird dann in situ durch Inkontaktbringen mit einem geeigneten Aggregierungsmittel aggregiert. Zu geeigneten Aggregierungsmitteln gehören Sauren (z.B. HNO3 oder Ascorbinsäure), Polyamine (z.B. Polysin, Spermin, Spermidin, 1,4-Diaminopiperazin, Diethylentriamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin) und anorganische aktivierende Ionen wie beispielsweise Cl–, I–, Na+ oder Mg++. Erwärmen kann unter gewissen Umständen erforderlich sein, um Kolloiderzeugung in einem wünschenswerten Zeitmaß zu erreichen. Ein besonders geeignetes Verfahren zum Erzeugen des Kolloids, das bei Raumtemperatur ausgeführt werden kann, ist es, einen ersten Strom, umfassend Natriumborhydrid, mit einem zweiten Strom, umfassend Silbernitrat, zu mischen. Um die Kontrolle über das Verfahren zu vergößern, sollte die gesamte verwendete Ausstattung peinlich sauber sein und die Reagenzien sollten einen hohen Gütegrad haben. Unähnlich Kolloiden, die unter Verwendung existierender Techniken hergestellt werden, tritt das Problem der Fällung nicht auf. SER(R)S-Analyse kann deshalb zum Beispiel 10 Minuten bis 4 Stunden nach der Kolloidaggregation, wie beispielsweise 15 Minuten bis 1 Stunde nach der Aggregation, durchgeführt werden.
  • Die kolloiden Teilchen sind in der Beschaffenheit vorzugsweise monodispers und können eine beliebige Größe haben, so lange wie sie einen SERRS-Effekt hervorrufen – im allgemeinen haben sie einen Durchmesser von etwa 4–50 nm, vorzugsweise 25–36 nm, obgleich dies von dem Typ des Metalls abhängt. Jedes geeignete Metall oder eine Metallegierung kann verwendet werden, wie beispielsweise Silber, Kupfer oder Gold. Darüber hinaus können die Teilchen auf eine andere Oberfläche, wie beispielsweise eine Perle oder Kugel, aufgebracht werden, um zum Beispiel die effektive Größe/das Gewicht der Teilchen zu vergrößern und so ihr Fließverhalten zu ändern.
  • Vorzugsweise umfasst die Oberfläche Metall, wie beispielsweise Silberkolloidteilchen, die im wesentlichen hexagonale Gestalt haben und einen maximalen Durchmesser von etwa 20–36 nm haben.
  • Haften des Analyts/derivatisierten Analyts an dem Kolloid erfolgt typischerweise durch Chemisorption des Komplexes auf die Oberfläche der kolloiden Teilchen oder durch chemische Bindung (kovalent, chelatbildend usw.) des Komplexes mit entweder der Oberfläche oder einer Beschichtung auf der Oberfläche, entweder direkt oder durch eine verknüpfende Gruppe. Die Vereinigung wird gewöhnlich durch geeignete funktionelle Gruppen auf dem Analyt oder derivatisierten Analyt erfolgen, wie beispielsweise geladene polare Gruppen (z.B. NH3 + oder CO2 –), angezogen von der Oberfläche oder Oberflächenbeschichtung (z.B. von freien Amingruppen in einer Polyaminbeschichtung). Es ist offensichtlich, daß der Typ von Verbindung in einem gegebenen Fall von der Beschaffenheit der Oberfläche und der Kennzeichnung abhängen wird; verschiedene funktionelle Gruppen werden von einer positiv geladenen Oberfläche angezogen, was zum Beispiel eine negativ geladene betrifft.
  • Zu geeigneten Gruppen, durch welche der Komplex an die aktive Oberfläche gebunden werden kann, gehören komplexbildende Gruppen wie beispielsweise Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphor-Donore; chelatbildende Gruppen; brückenbildende Liganden und polymererzeugende Liganden. Spezielle Einzelheiten bevorzugter Verfahren des Haftens des derivatisierten Analyts an dem SERRS-aktiven Substrat sind zum Beispiel in WO97/05280 beschrieben.
  • Das Verfahren zum Erhalt des SERRS-Spektrums kann, sobald der derivatisierte Analyt an dem Metallsubstrat haftet, herkömmlich sein. Um jedoch ein Beispiel zu geben, könnte das folgende auf die spektroskopischen Messungen angewendet werden:
    Typischerweise werden die Verfahren der Erfindung ausgeführt, indem einfallendes Licht von einem Laser mit einer Frequenz in oder nahe bei dem sichtbaren Spektrum verwendet wird, d.h. 380 nm–850 nm, insbesondere zwischen 400 nm–650 nm (die gewählte genaue Frequenz hängt im allgemeinen in jedem Fall von dem verwendeten Chromophor ab – Frequenzen im roten Bereich des sichtbaren Spektrums neigen insgesamt dazu, bessere Wirkungen bei der Oberflächenverstärkung hervorzurufen, aber die vierte Ramanpotenz bedeutet, daß blau besser ist und viele Chromophore liegen im grienen Bereich, wobei sie dort maximale Resonanzverstärkung ergeben). Es ist jedoch möglich, sich Situationen vorzustellen, in denen andere Frequenzen, zum Beispiel in dem ultravioletten (d.h. 200 nm–400 nm) oder dem nahen infraroten Bereich (700 nm–1100 nm), verwendet werden könnten. So kann der SERRS-Nachweis zwischen etwa 300 nm–1100 nm durchgeführt werden.
  • Die Auswahl und, wenn notwendig, Abstimmung einer geeigneten Lichtquelle mit einer geeigneten Frequenz und Leistung liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns, besonders bei Bezugnahme auf die verfügbare SERRS-Literatur. Um bei Verwendung von SERRS hochempfindlichen Nachweis zu erreichen, wird eine kohärente Lichtquelle mit einer Frequenz bei oder nahe bei dem Absorptionsmaximum für den Chromophor (wie vorstehend beschrieben) oder dem des Oberflächenplasmons benötigt. Wenn niedrigere Empfindlichkeiten erforderlich sind, muß die Lichtquelle nicht kohärent oder von hoher Intensität sein, und so können Lampen in Kombination mit einem Monochromatorgitter oder -prisma verwendet werden, um eine geeignete Anregungsfrequenz auszuwählen; hier besteht keine Notwendigkeit, bei der Resonanzfrequenz des Chromophors oder des Plasmons zu arbeiten.
  • Das Licht kann durch Reflexion in Spiegeln von der Quelle zu der aktiven Oberfläche geleitet werden und kann fokussiert werden, um beim Hindurchtreten durch Linsen einen höheren Lichtfluß zu ergeben. Ein geeigneter Apparat für SERRS-Analysen ist ein Mikroskop mit Signalnachweis bei 180 Grad zudem Anregungsstrahl. Ein Fluoreszenzmikroskop mit konfokaler Optik ist ebenfalls geeignet. Die Verwendung von Mikroskopoptik gestattet, daß die sehr kleinen Kanäle und/oder Volumina einer mikrofluidischen Vorrichtung analysiert werden.
  • Verschiedene Vorrichtungen sind zum Sammeln von SERRS-Signalen geeignet, die Wellenlängen-selektive Spiegel, holographische optische Elemente zum Streulichtnachweis und faseroptische Wellenleiter einschließen. Die Intensität eines SERRS-Signals kann zum Beispiel gemessen werden, indem ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD), eine Siliciumphotodiode, ein integrierter CMOS-Detektor oder Photomultiplierröhren, angeordnet entweder einzeln oder hintereinander zur Kaskadenverstärkung des Signals, verwendet werden. Photonenzählungselektronik kann für empfindlichen Nachweis verwendet werden. Die Wahl des Detektors hängt großenteils von der Empfindlichkeit des Nachweises ab, die erforderlich ist, um einen speziellen Assay auszuführen.
  • Man beachte, daß die Verfahren der Erfindung entweder den Erhalt eines vollen SERRS-Spektrums über einen Bereich von Wellenlängen oder das Auswählen eines Peaks und das Scannen nur bei der Wellenlänge dieses Peaks (d.h. Raman-"Abbildung") beinhalten können.
  • Der Apparat zum Erhalten und/oder Analysieren eines SERRS-Spektrums schließt fast mit Sicherheit eine gewisse Form von Datenverarbeitungsanlage wie beispielsweise einen Computer ein.
  • Raman-Signale bestehen aus einer Serie von diskreten Spektrallinien mit sich verändernder Intensität. Die Frequenzen und die relativen Intensitäten der Linien sind spezifisch für den derivatisierten Analyten, der nachgewiesen wird, und das Raman-Signal ist deshalb ein „Fingerabdruck" des derivatisierten Analyts. Wenn ein SERRS-Analysator verwendet wird, um selektiv einen Analyten aus einem Gemisch nachzuweisen, dann wird es notwendig sein, für Identifizierungszwecke das gesamte „Fingerabdruck”-Spektrum nachzuweisen. Wenn jedoch der Analysator verwendet wird, um den Nachweis eines oder mehrere Analyte zuquantifizieren, von denen jeder eine einzigartige Spektrallinie hat, dann wird es nur notwendig sein, die Signallintensität bei einer gewählten Frequenz oder bei Frequenzen der Spektrallinien nachzuweisen oder die gesamte Raman-Streuung nachzuweisen, wobei ein Filter verwendet wird, um die Raleigh-Streuung auszuschließen.
  • Sobald das SERRS-Signal durch einen geeigneten Detektor eingefangen worden ist, werden seine Frequenz- und Intensitätsdaten typischerweise zur Analyse an einen Computer geleitet. Entweder wird das Fingerabdruck-Raman-Spektrum zur Identifizierung der nachgewiesenen Raman-aktiven Verbindung mit Referenzspektren verglichen, oder die Signalintensität bei den gemessenen Frequenzen wird verwendet, um die Menge von nachgewiesener Raman-aktiver Verbindung zu berechnen.
  • Von einem kommerziellen SERRS-Analysator zur Verwendung beim Ausführen der Erfindung würde erwartet werden, daß er aus den folgenden Komponenten besteht: einer Laser-Lichtquelle, der geeigneten Optik, um das Licht zu der SERRS-aktiven Oberfläche zu tragen, einer Arbeitsbühne zum Befestigen der mikrofluidischen Vorrichtung zur Analyse, der Optik zum Empfangen des Raman-Signals, einem Detektor zum Umwandeln des Raman-Signals in eine Reihe von Intensitäten bei bestimmten Wellenlängen und eine Datenverarbeitungsanlage zum Interpretieren der Wellenlänge/Intensitäts-Daten und Bereitstellen eines analytischen Gesamtergebnisses.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung zur Verwendung beim Nachweisen von Analyten durch SER(R)S bereit, wobei die Vorrichtung ein Substrat mit darin erzeugten Mikrokanälen von 1 μm bis 500 μm Breite und mit den Kanälen verbundene Einlässe zum Einführen eines geeigneten Metallsalzes, eines Reduktionsmittels, einer Probe und gegebenenfalls eines Aggregierungsmittels umfaßt, wobei laminare Strömung innerhalb der Kanäle zum Tragen des geeigneten Metallsalzes und des Reduktionsmittels zusammenläuft, um Mischen des geeigneten Metallsalzes und des Reduktionsmittels und Erzeugung eines Kolloids an einer Grenzfläche zwischen dem Fluß des geeigneten Metallsalzes und dem Fluß des Reduktionsmittels zu erlauben; und die laminare Strömung innerhalb eines Kanals zum Tragen der Probe angeordnet ist, um mit dem so erzeugten Kolloid zusammenzulaufen, derart, daß irgendein in der Probe vorhandener Analyt an dem Kolloid haften kann.
  • Die mikrofluidische Vorrichtung kann die auf dem Fachgebiet bekannte Form einer „Lab-on-a-chip"-Vorrichtung haben und alle notwendigen Reagenzien innerhalb des Chips umfassen. Alternativ können die Reagenzien aus Ausgangsstoffen außerhalb der Vorrichtung bereitgestellt werden.
  • Typischerweise ist das Substrat für Zwecke optischer Qualität aus Glas, wie beispielsweise Sodakalkglas, erzeugt, obwohl optisch andere durchsichtige Materialien verwendet werden können, wie beispielsweise Silicon oder Polymere, und die Mikrokanäle haben Dimensionen in dem Bereich 1 μm bis 500 μm, typischerweise 10 μm–200 μm, aber am häufigsten 50 μm. Die Größe ist jedoch starker davon abhängig, daß sie imstande sind, die geeigneten laminaren Strömungseigenschaften zu erzeugen, von denen beobachtet wurde, daß sie besonders vorteilhaft sind. Die Einlässe zum Einführen der verschiedenartigen Reagenzien sind typischerweise zum Aufrechterhalten einer geeigneten Quantität von Reagenz oder Probe in der Form von Vertiefungen oder Reservoiren.
  • Sobald irgendein Analyt an dem Kolloid haftet, kann der Nachweis des Analyts durch SER(R)S ausgeführt werden, wie hier zuvor beschrieben ist. Praktischerweise kann ein Mikroskop mit einer geeigneten Linse auf einen Kanal fokussiert werden, der Kolloid mit anhaftendem Analyt trägt.
  • Die Reagenzien und die Probe werden unter Verwendung geeigneter Hilfsmittel durch die Kanäle gezogen, diese können zum Beispiel Pumpen, Spritzenantriebe, Elektrokinetik und/oder Elektrohydrodynamik einschließen (siehe zum Beispiel die US-Patentschrift 6409900 ).
  • Elektroosmotischer Fluß ist ein elektrokinetisches Phänomen, das ausgenutzt werden kann, um Fluide innerhalb komplexer mikrofluidischer Verteiler zumanipulieren. Wenn Silanolgruppen auf der Oberfläche eines Glasmikrokanals deprotoniert werden, werden positive Ionen am der Gesamtlösung angezogen und locker gebunden, wobei insgesamt Ladungsneutralität bereitgestellt wird. Wenn ein hohes Potential über diesen Kanal angelegt wird, werden diese locker gebundenen positiven Ionen von der Kathode angezogen, welche durch viskose Kopplung die Gesamtlösung zieht, was in elektroosmotischem Fluß resultiert. Einer der Hauptvorteile von EOF ist die Eliminierung sich bewegender Teile, wie beispielsweise Ventile/Schalter. Außerdem sind flache Strömungsprofile vorhanden, die das parobolische Strömungsprofil, vorherrschend in druckgetriebenen Systemen, eliminieren, d.h. die Geschwindigkeit ist über den ganzen Kanal die gleiche. Typische Kanaldimensionen, die für erfolgreichen EOF verwendet werden, sind ungefähr 1–100 μm Breite und 5–40 μm Tiefe mit Kanallängen in den Bereichen von einigen Zentimetern, wobei elektrische Feldstärken von 100 V–1 kV/cm angewendet werden. Obwohl elektrophoretische Kräfte noch vorhanden sind, ist der EOF im allgemeinen größer, was erlaubt, daß negative Spezies, wie beispielsweise ein negatives Metallkolloid oder Molekül, in Richtung zu der Kathode getrieben werden.
  • In dem Fall von Kolloiderzeugung können wässerige Silbersalze mit einem geeigneten wässerigen Reduktionsmittel, wie Natriumborhydrid, gemischt werden, um einen Kolloidstrom zuerzeugen. Unter Ausnutzung der laminaren Strömungseigenschaften der Mikrofluidik wird eine stabile und reproduzierbare Grenzfläche zwischen den zwei Reagenzien erzeugt, an der Reaktionen eher durch Diffusionsprozesse dominiert werden als durch konvektive oder mechanische Hilfsmittel, die mit der Erzeugung im Makromaßstab verbunden sind. Als solche ist die Kolloidgröße reproduzierbarer und genauer. Die Verwendung derartiger planarer Fließzellen ist mit Regimen optischer Mikroskopie kompatibel und ist deshalb für den SERRS-Nachweis gut geeignet, wobei die Probleme eliminiert werden, die mit dem Fokussieren auf kreisförmige Kapillaren/Schlauchmaterial gewöhnlich verbunden sind.
  • In mikrofluidischen Systemen ergeben geringe Dimensionen und schneller Fluidfluß niedrige Reynolds-Zahlen und infolgedessen keine Turbulenz. Infolgedessen stören sich, wenn zwei Ströme von Fluid zusammengebracht werden, die Stromlinien der Flüssigkeiten gegenseitig nicht und die einzige Mischung, die erfolgt, ist die, die durch Diffusion zwischen den zwei Strömen bereitgestellt wird. Der Prozeß ist als laminare Strömung bekannt. Die Konsequenz von laminarer Strömung und dem Mangel an Mischung wird oft als Nachteil für mikrofluidiscbe Systeme gesehen. Jedoch wurde in der vorliegenden Erfindung der Mangel an Volumenmischung benutzt, um die Erzeugung von Kolloid in einer gesteuerten Weise bereitzustellen.
  • In dem Zusammenhang mit dem Nachweis durch SER(R)S-Analyse erfolgt die Erzeugung von kolloidalem Metall, wie beispielsweise Silber, in einem mikrofluidischen System durch das Zusammenbringen von zwei Strömen von Reaktanten. In einem derartigen Fall werden Silbernanoteilchen nur an der Grenzfläche zwischen diesen zwei laminaren Stromlinien erzeugt, welche sich selbst nicht mischen.
  • Die Konsequenzen hiervon sind wie folgt:
    • (i) Verbesserte Steuerung von kolloidalem Silber: Die Geschwindigkeit mit welcher das Kolloid erzeugt wird (und deshalb die Gesamtmenge von teilchenförmigem Silber) kann genau gesteuert werden und hängt von dem Querschnitt des Mikrokanals, der Konzentration der Reaktanten und den Diffusionskoeffizienten der Reaktanten ab. Insbesondere wird durch Maximieren der Höhe und Minimieren der Breite des Kanals für eine gegebene Fließgeschwindigkeit Konzentration und Querschnittsfläche eine größere Menge von Kolloid erzeugt. Darüber hinaus kann ein System leicht optimiert werden, in welchem die Menge der Silberkolloidproduktion als Funktion von Reaktionsbedingungen oder Mikrokanalgeometrie vergrößert oder verkleinert werden kann;
    • (ii) Lokalisation des Kolloids: Das Kolloid wird nur an einer gegebenen Stelle erzeugt, d.h. an der Grenzfläche zwischen den laminaren Fluiden. Dies hat die Auswirkung der Maximierung der Konzentration des Kolloids durch Verringerung seiner Ausbreitung. Durch Verringern des analytischen Volumens gibt es das Potential, die Empfindlichkeit einer Messung zu erhöhen. Außerdem gibt es die weitere Möglichkeit, imstande zusein, das Kolloid auf Grund seines speziellen Standortes zu isolieren und weiter zu konzentrieren; und
    • (iii) Zurückhaltung des Kolloids an einer speziellen Stelle: Das Kolloid hat einen viel niedrigeren Diffusionskoeffizienten als die Reaktanten, derart, daß, sobald die kolloiden Teilchen in einer gegebenen Position sind, sie von dieser Position mit einer stark verringerten Geschwindigkeit wegdiffundieren (obgleich die Teilchen noch in der durch die Stromlinien bestimmten Richtung fließen können). Dies kann die Empfindlichkeit verbessern, indem viel größere Akkumulationszeiten ermöglicht werden. Außerdem sind die kolloiden Teilchen genügend groß, daß sie Ladung stabilisieren können, was die elektrostatischen Wechselwirkungen mit dem Substrat des mikrofluidischen Kanals fördert und so die Lokalisation der Teilchen verstärkt. Mikrofluidische Kanäle haben ein hohes Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis und so wird definitionsgemäß das gesamte Kolloid nahe an der Kanalwand sein (eine Wirkung, die auch von der Geometrie des Querschnitts des Kanals abhängt).
  • Früher haben einige der Erfinder die Integration von Mikroelektrodenanordnungen und/oder Wellenleitern oder optischen Fasern in Lab-on-a-Chip-Vorrichtungen demonstriert (30). Unter Verwendung dieser Mikrofabrikationstechniken ist es möglich, die in hohem Maße lokalisierten kolloiden Teilchen der vorliegenden Erfindung weiter auszunutzen und die folgenden analytischen Vorteile zu erreichen:
    • (i) Mikroelektroden. Die Herstellung einer Mikroelektrodenanordnung an einer Position in der Nähe oder innerhalb des Kanals kann leicht erreicht werden, indem Photolithographie, Strukturübertragung, Metallabscheidung und Abheben verwendet werden. Diese Elektrodenanordnungen können verwendet werden, um den Grenzflächenstrom von kolloidalen Teilchen weiter zubeeinflussen, indem der Strom entweder in einen gesonderten analytischen Kanal, eine Kammer oder eine Region gerichtet wird. Drei derartige Verfahren, um dies zu tun, die alle mit elektrischen Feldern verbunden sind, schließen entweder die Verwendung von Elektrophorese oder Dielektrophorese oder die Erzeugung eines elektroosmotischen Flusses ein. Weitere Techniken, die verwendet werden können, um das Kolloid differentiell zu bewegen, können mit der Verwendung von Feldern verbunden sein, die durch optische Felder oder durch Magnetismus erzeugt werden. In allen Fällen wird es möglich sein, entweder das Kolloid von den Reaktanten zu trennen und/oder das Kolloid zu konzentrieren.
    • (ii) Wellenleiter/Fasern: Es wurde früher auch demonstriert, daß die Mikrofabrikation von optischen Schaltungen unter Verwendung von entweder Wellenleitern oder Fasern erreicht werden kann (30). Derartige mikrofabrizierte Vorrichtungen können verwendet werden, um die Anregung oder Sammlung von Licht weiter zu lokalisieren. Dies hat die Wirkung, das Volumen des Fluids, das beprobt wird, zu verringern, während die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens erhöht wird. Derartige Techniken würden sich deshalb zum Nachweis extrem seltener biologischer Ereignisse, einschließlich zum Beispiel des Nachweises eines einzigen Moleküls, eignen.
  • Eine Anwendung, die besonders zum Nachweis unter Verwendung des Verfahrens und/oder der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist der Nachweis extrem kleiner Mengen von DNA für die Analyse von Einzel-Nucleotid-Polymorphismen (SNPs).
  • Die grundlegende Herangehensweise macht Gebrauch von der Tatsache, daß SERRS verschiedene Chromophore, basierend auf der Molekülstruktur, identifizieren kann. So kann durch die Reaktion eines SERRS-Aktivierungsmittels und einer spezifischen Markierung, gebunden an das interessierende Molekül, in situ eine Kennzeichnung erzeugt werden. Jedoch erzeugt die markierte Spezies von selbst keine SERRS und erzeugt daher nur ein SERRS-Signal, wenn sie in Kombination mit dem SERRS-Aktivierungsmittel ist.
  • In einer Ausführungsform kann ein Oligonucleotid modifiziert werden, um die Markierung wie vorstehend beschrieben zuenthalten. Oligonucleotide werden in einer breiten Vielfalt von Analysen verwendet und ein spezielles Beispiel wird nachstehend angegeben. Die Markierung ist eine kleine reaktionsunfähige chemische Einheit, die keine SERRS, d.h. keine Chromophore im sichtbaren Bereich und keine Neigung für die verwendete Metalloberfläche, erzeugt. Um ein spezifisches SERRS-Signal zu erzeugen, wird eine chemische Reaktion verwendet, die spezifisch für die Markierung ist (d.h. nicht durch eine andere chemische Gruppe beeinflußt wird). Diese muß wünschenswerterweise schnell sein und in wässeriger Lösung eintreten. Eine solche Reaktion ist eine Diels-Alder-Cycloaddition, die tatsächlich schneller in Wasser als in organischem Lösungsmittel eintritt. Die Cycloaddition tritt zwischen einem Dien und einem Dienophil ein. So ist es möglich, beide als Markierungseinheit zu verwenden. Der Kürze halber erfolgt weitere Bezugnahme auf die Verwendung eines Diens als Markierung auf einem Oligonucleotid, aber dies soll nicht als begrenzend ausgelegt werden. Die Markierung kann zum Beispiel an dem 5'- oder 3'-Terminus oder an irgendeiner Position innerhalb des Nucleotids angefügt werden. Zum Beispiel kann ein Furanrest, welcher ein Dien ist, an dem 5'-Terminus eines Oligonucleotids und auch an der 5-Position eines Thymidin-Nucleosids angefügt werden. Das Thymidin-Nucleosid kann verwenden werden, um an irgendeiner Position der Sonde Oligonucleotid anzufügen, während es durch Festphasensynthese hergestellt wird.
  • Ein geeignetes Dienophil ist Benzotriazolmaleimid (BTM). Das Benzotriazol stellt ausgezeichnete Oberflächenanbindung bereit (siehe die Patentschrift WO 97/05280 ) und das Maleimid ist ein Dienophil, das gewöhnlich in Diels-Alder-Cycloadditionen verwendet wird.
  • Wenn das markierte Oligonucleotid mit dem BTM reagiert, wird ein einzigartiges Signal erzeugt. Eher unerwarteterweise ist die Qualität des Signals besser als die des reinen, isolierten Cycloaddukts ohne das angebundene Oligonucleotid. Ohne zu wünschen, durch eine Theorie gebunden zu sein, wird diese Verbesserung der Anwesenheit des Oligonucleotids zugeschrieben, welches dem System erhöhte Wasserlöslichkeit verleiht.
  • Ein vorgeschlagenes Verfahren der DNA-Analyse unter Verwendung des Verfahrens und/oder der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:
    Eine Aufgabe ist es, die Identifizierung von Einzel-Basen-Polymorphismen innerhalb eines Gens, basierend auf dem Prinzip der Minisequenzierung, zu erlauben. Ein Triphosphat mit einer Dien-Markierung kann entsprechend den nachstehenden Strukturen hergestellt werden.
  • Figure 00100001
  • So wird, da das 3'-OH fehlt (1) oder blockiert ist (2), nur eine Base in einer Runde von enzymatischer Extension hinzugegeben, wobei ein spezifischer Primer verwendet wird, wie es beim Minisequenzieren gebräuchlich ist. Sobald hinzugegeben findet Entwicklung durch Zugabe des Dienophils statt, um ein einzigartiges SERRS-aktives Cycloaddukt bezüglich der hinzugefügten Base herzustellen. In dem Fall von Triphosphat (2) wird das Dien über eine photospaltbare Verknüpfung mit dem Zucker verbunden. Ein Beispiel einer Klasse von photospaltbaren Linkem sind Nitrobenzylgruppen und Derivate davon, siehe (31). Dies erlaubt, daß das Dien entfernt wird, um das 3'-OH wieder freizulegen. Dies stellt einen Primer bereit, der wie normal hybridisiert, und eine zweite Runde der Sequenzierung kann durchgeführt werden, um die nächste Base in der Sequenz zu ergeben. Dies kann zum Beispiel gemacht werden, indem die Mischung in den Kreislauf zurückgeführt wird oder indem man eine Reihe von Reaktionskammern, abhängig von der Anzahl der Basen, die zum Sequenzieren erforderlich sind, hat. Die Tatsache, daß der Kolloidstrom in der Mitte des Kanals bleibt und nicht diffundiert, bedeutet, daß die Markierung photochemisch entfernt werden kann und mit dem entwickelnden Reagenz reagiert, um das SERRS-aktive Cycloaddukt zu ergeben. Dieses bewegt sich aktiv in Richtung auf den kolloidalen Strom und wird auf die Oberfläche des Kolloids adsorbiert und wird so aus weiterer Reaktion entfernt. Die Flüssigkeit, die den Kolloidstrom umgibt, kann dann in den Kreislauf zurückgeführt werden und enthält jetzt einen Primer mit einer hinzugefügten zusätzlichen Base. Dies erlaubt, daß die nächste Base in der Sequenz identifiziert wird, indem der gleichen Verfahrensweise wie für die erste Base gefolgt wird.
  • Die erhöhte Empfindlichkeit von SERRS in einer Mikrofließzelle bedeutet, daß dies auf DNA möglich sein wird, die ohne Amplifikation direkt aus dem Organismus isoliert ist. Die Vorteile sind, daß vier Verbindungen alles sind, was zur Identifizierung einer beliebigen Anzahl von Mutationen oder normalen Basen benötigt wird. Diese Herangehensweise kann nicht durch Fluoreszenz gemacht werden, da Fluorophore an dem 3'-OH verhindern, daß das Enzym das Triphosphat hinzufügt, und Fluoreszenz keinen Fingerabdruck der verwendeten Markierung ergeben würde.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen die Fähigkeit, Teilchen selektiv zu codieren. Zum Beispiel ist es möglich, eine Anzahl verschiedener SER(R)S-reaktiver Farbstoffe an die Oberfläche eines kolloiden Teilchens ebenso wie eines Reagenzes zu binden, wie beispielsweise eines Proteins, Peptids oder Oligonucleotids, das vorgesehen ist, an den Analyten zu binden, der nachgewiesen werden soll. Dies kann entweder vor der Einführung des Teilchens in die Vorrichtung oder in situ in der Vorrichtung gemacht werden. Auf Grund dessen, daß man imstande ist, basierend auf den speziellen verwendeten Farbstoffen, wirksam die Teilchen zu codieren, ist es möglich, basierend auf dem erzeugten speziellen SER(R)S-Signal, den Analyten nachzuweisen. Komplexe Gemische von verschieden codierten Teilchen können bereitgestellt und basierend auf dem erzeugten Signal leicht identifiziert werden.
  • Es können auch Teilchen in einem einzigen System bereitgestellt werden, die mit verschiedenen Farbstoffen funktionalisiert worden sind, wodurch nur ein Typ von Teilchen an einen speziellen Analyten binden kann, wodurch der Nachweis des Analyts erlaubt wird. Ein Beispiel hierfür würde sein, eine Anzahl verschiedener Oligonucleotide bereitzustellen, wobei jedes Oligonucleotid mit einem unterschiedlich gekennzeichneten Teilchen verbunden ist, derart, daß jedes Oligonucleotid imstande ist, spezifisch an eine Form einer polymorphen Nucleotidsequenz zu binden, wodurch die Identifizierung der speziellen Sequenz in einer Probe, die getestet wird, ermöglicht wird. Ein derartiges Verfahren wird oft als Multiplexing bezeichnet.
  • Ein abschließendes Beispiel betrifft die Fähigkeit, das beschriebene Verfahren/System zu verwenden, um kolloide Teilchen in zum Beispiel eine biologische Zelle, wie beispielsweise eine tierische Zelle, einzuführen. Die Zelle kann in eine Vorrichtung eingeführt werden, so daß die Zelle immobilisiert wird oder in anderer Weise die Zelle zurückgehalten wird, so daß sie in dem Fließweg des Kolloids ist. Die Zelle kann dann durch zum Beispiel Elektroporation permeabilisiert werden, derart, daß das Kolloid in und/oder durch die Zelle fließen kann. Die kolloiden Teilchen können durch Anbindung von, zum Beispiel, einem Oligonucleotid, Protein oder Peptid, welches vorgesehen ist, an eine Komponente innerhalb der Zelle zu binden, funktionalisiert werden. Der genaue Standort und/oder die Anwesenheit der Komponente innerhalb der Zelle kann dann durch SER(R)S-Analyse nachgewiesen werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele und mit Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, welche zeigen:
  • 1a zeigt ein schematisches Diagramm einer Chipgestaltung zur Verwendung beim Erzeugen von Kolloid gemäß der vorliegenden Erfindung und Nachweisen eines Analyts unter Verwendung von SERRS;
  • 1b zeigt ein Nebenbild einer Einzelheit eines Kanals in der Vorrichtung, wie sie in 1a gezeigt ist;
  • 1c zeigt ein schematisches Diagramm einer Chipgestaltung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der elektroosmotische Fluß benutzt wird, um Fluide innerhalb der Vorrichtung zu manipulieren;
  • 2 zeigt die Struktur von 5-(2-Methyl-3,5-dinitro-phenylazo)chinolin-8-ol;
  • 3 zeigt ein Bild des Punktes der Kolloiderzeugung innerhalb der Kanäle des Fließsystems des Chips, wie gezeigt in 1a, gesammelt unter Verwendung eines Weißlichtmikroskops im Reflexionsmodus;
  • 4 zeigt ein Bild des Kolloidstroms, wie er durch den Teil des Fließsystems, gezeigt in 1b, enthaltend Säulenstrukturen, hindurchgeht, gesammelt unter Verwendung eines Weißlichtmikroskops im Reflexionsmodus;
  • 5 zeigt Bilder, die die Diffusion des Indikators Bromcresolpurpur (pH 9,0) innerhalb des Fließsystems an dem Punkt veranschaulichen, wo der Indikator auf den Kolloidstrom trifft, a) fließend, b) bis e) mit sich vergrößernden Zeitintervallen, nachdem der Fluß gestoppt worden ist;
  • 6 zeigt Bilder, die die Diffusion des Bromcresolindikators innerhalb des Fließsystems an dem Punkt veranschaulichen, wo es Säulenstrukturen in dem System gibt, a) fließend, b) bis e) mit sich vergrößernden Zeitintervallen, nachdem der Fluß gestoppt worden ist;
  • 7 zeigt Bilder, aufgenommen an dem Punkt der Kolloiderzeugung a) unmittelbar nach der Kolloiderzeugung und b) 70 Minuten, nachdem der Fluß gestoppt worden war. Beide Bilder wurden unter Verwendung eines Weißlichtmikroskops im Transmissionsmodus aufgenommen;
  • 8 zeigt Bilder, aufgenommen an dem Punkt in dem System, wo es säulenförmige Strukturen gibt, a) unmittelbar nach der Kolloiderzeugung und b) 70 Minuten, nachdem der Fluß gestoppt worden war. Beide Bilder wurden unter Verwendung eines Weißlichtmikroskops im Transmissionsmodus aufgenommen;
  • 9 zeigt Bilder, aufgenommen an dem Punkt der Kolloiderzeugung a) nach der Kolloiderzeugung und b) nachdem destilliertes Wasser durch das System geleitet worden ist, c) nach dem Reinigen mit Salpetersäure und destilliertem Wasser;
  • 10 zeigt SERRS-Spektren von 5-(2-Methyl-3,5-dinitro-phenylazo)chinolin-8-ol, akkumuliert unter Verwendung des Fließsystems. Die Konzentration des Farbstoffs innerhalb des Fließsystems ist a) 10 Picomol, b) 1 Picomol, c) 0,1 Picomol und d) 10 Femtomol;
  • 11 zeigt eine graphische Darstellung der SERRS-Intensität gegen die Zeit für ein Signal, akkumuliert von dem gleichem Punkt unter den Bedingungen des gestoppten Flusses; und
  • 12 ist ein schematisches Diagramm eines Fließzellensystems zur Verwendung in multipler Minisequenzierung unter Anwendung von SERRS;
  • 13 zeigt die gesonderten und vereinigten Spektren von einem gekennzeichneten Oligonucleotid und 3 zusätzlichen Farbstoffen; und die 14a und b zeigen SER(R)S-Spektren, erhalten von 2 bzw. 3 gekennzeichneten Oligonucleotiden.
  • ABSCHNITT DER BEISPIELE
  • BEISPIEL 1: Herstellung der Vorrichtung
  • Der Fluidkanal wurde durch eine standardmäßige photolithographische Technik hergestellt. S1818-Photolack (Shipley Europe, Coventry, UK) wurde auf ein säuregereinigtes 1,5 mm dickes Sodakalkglas (Soda Lime glass, Nanofilm, USA) mit 4000 U/min für 30 Sekunden spinnaufgebracht. Das Glas wurde auf einer 90°C heißen Platte für 3 Minuten gebacken, nachfolgend durch eine Lithographiemaske mit Acetatfolie für 8 Sekunden UV ausgesetzt, um die Kanalstruktur zu definieren. Der Photolack wurde in einer gemischten Lösung von 1 Teil Microposit Developer Concentrate (Shipley Europe) und 1 Teil RO-Wasser für 35 Sekunden entwickelt und mit Stickstoff getrocknet. Das Substrat wurde dann auf einer 90°C heißen Platte für 15 Minuten gebacken, um sicherzustellen, daß das gesamte Lösungsmittel verdampft worden war, und um den Photolack zu härten. Schließlich wurde das Glas in einer gemischten Lösung von 1 Teil Fluorwasserstoffsäure und 4 Teilen RO-Wasser für 15 Minuten feucht geätzt, was zu einem 30 μm tiefen und 250 zubreiten Kanal führte. Nach der Ätzprozedur wurde das Glas in Aceton ultraschallbehandelt, um den Photolack zu entfernen.
  • Um die Kanäle zu verschließen, wurde eine Deckplatte angefertigt. Löcher für die Einlaß- und Auslaßreservoire wurden mit dem geätzten Substrat ausgerichtet und unter Verwendung eines Gravierbohrers mit einem 1,5-mm-Diamanten (RS, Corby, Northants, UK) gebohrt. Das geätzte Substrat und die Deckplatte wurden dann zum Bonden vorbereitet. Erfolgreiches Bonden beruht auf ultrasauberen Oberflächen, was durch Reinigen des Glases in einer Piranha-Lösung (H2SO4:H2O2 = 1:7) für mindestens 10 Minuten und nachfolgende Ultraschallbehandlung in Aceton für 5 Minuten ausgeführt wurde. Sie wurden dann in RO-Wasser gespült und sorgfältig mit Stickstoff getrocknet. Das geätzte Substrat wurde dann mit den Zugangslöchern in der Deckplatte ausgerichtet und in einer Stahlklammer (Engineering Workshop, University of Glasgow) zwischen zwei Stücken von Macor-Platten (RS, Corby, Northants, UK) plaziert. Die Klammer wurde dann in einem Ofen, eingestellt auf 60°C, plaziert, der über 60 Minuten auf 500°C ansteigen gelassen und für 1 Stunde gehalten wurde. Die Temperatur wurde dann bis auf 570°C ansteigen gelassen und für weitere 5 Stunden gehalten. Schließlich wurde der Ofen auf 60°C heruntergebracht und über Nacht abkühlen gelassen. Die Strategie des thermischen Bondens führte zu permanenter Bondverbindung zwischen dem geätzten Substrat und der Deckplatte.
  • Ein Diagramm des verwendeten Fließsystems wird in 1a gezeigt. 1a zeigt eine Gestaltung von Chip 1, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Der Chip 1 hat die Einlässe 3, 5 zum Einführen der Reagenzien, die zum Erzeugen des Kolloids notwendig sind, und einen Einlaß 7 zum Einführen einer Probe, in welcher der nachzuweisende Analyt vorhanden sein kann. Alle Lösungen können durch die Kanäle 9, 11, 13 gezogen werden, indem eine Spritze am Auslaß 15 angebracht wird. SERRS kann durch Fokussieren eines geeigneten Lasers irgendwo entlang Kanal 13, d.h. nach dem Mischen von Kolloid und Analyt, nachgewiesen werden.
  • 1b ist ein Diagramm eines Fließsystems, gestaltet, um elektroosmotischen Fluß zu verwenden. Vorrichtungen zur Kolloiderzeugung wurden aus Sodakalkglasobjektträgern angefertigt. Diese Vorrichtungen wurden unter Verwendung von standardmäßigen photolithographischen Verfahren und nachfolgendem Ätzen mit Fluorwasserstoffsäure und thermischem Bonden einer leeren Glasdeckplatte angefertigt. Die Dimensionen C waren 60 μm Breite, 10 μm Tiefe mit einer Vielzahl von Längen. Die Anlage des Kanals und die Arbeitsweise sind in 1b gezeigt. Kolloid erzeugende Reagenzien werden in die Vertiefungen 50, 52 und der Analyt wird in die Vertiefung 54 eingeführt. Hohe Spannungen werden über Platindrahtelektroden, die mit einer Reihe von einzelnen Computer-kontrollierten Hochspannungsstromversorgungen (nicht gezeigt) verbunden sind, bis zu einem Maximum von 4 kV an die Vorrichtung angelegt, während ein Abfallauslaß 56 an der Erde gehalten wird. Die Kolloiderzeugung und nachfolgende Bindung des Analyten kann stromabwärts durch SERRS überwacht werden.
  • BEISPIEL 2: Verwendung der Vorrichtung und SERRS-Nachweis
  • Natriumborhydrid (99%), Silbernitrat (99,9999%) und Natriumhydroxid (97%) wurden von Aldrich (Dorset, England) gekauft. Eine wässerige Lösung von Silbernitrat (2,6 × 10–3 M) und eine Lösung von Natriumborhydrid (1,1 × 10–3 M) in Natriumhydroxidlösung (0,1 M) wurden unter Verwendung einer Mikropipette in die Einlässe 3 bzw. 5 eingeführt. Die Azofarbstofflösung, welche in Methanol hergestellt wurde, wurde in den Einlaß 7 eingeführt. Der gewählte Analyt war ein Azofarbstoff 5-(2-Methyl)-3,5- dinitro-phenylazo)chinolin-8-ol, synthetisiert als Teil eines Programms zum Nachweis von Trinitrotoluol (TNT) durch Derivatisierungsverfahren. Er wurde durch NMR und C,H- und N-Analyse analysiert und es wurde gefunden, daß er rein war (C war innerhalb 0,4%). Die Struktur des Farbstoffs wird in 2 gezeigt.
  • Die Lösungen wurden unter Vakuum unter Verwendung einer Spritze, angebracht am Auslaß 15, durch das System gezogen. Die Spektren wurden durch Fokussieren des Lasen auf den Kolloidstrom unter Verwendung einer x10-Objektivlinse akkumuliert. Die Akkumulierungszeiten waren 10 s. In den Experimenten, die Vormischen der Farbstofflösung mit der Borhydridlösung beinhalten, wurde ein Gemisch von 1:1 Natriumborhydrid und Farbstofflösung (1 × 10 M) in den Einlaß 5 eingeführt, Silbernitrat wurde in den Einlaß 3 eingeführt und destilliertes Wasser wurde in den Einlaß 7 eingeführt. Die Lösungen wurden dann unter Verwendung einer Spritze durch das System gezogen und die Spektren wurden unter Verwendung eines Systems Renishaw Mark I 2000 (Gloucs, England) mit einem Argonionenlaser Spectra Physics 361C 15 mW, arbeitend bei 514 nm, als Anregungsquelle akkumuliert.
  • BILDER
  • Bilder des Fließsystems wurden unter Verwendung eines Weißlichtmikroskops (Olympus) mit einer Farb-CCD-Kamera (Polnex) erhalten. Die Bilder wurden unter Verwendung eines x5-Mikroskopobjektivs gesammelt. Die Bromcresolpurpurlösung (pH 9,0) wurde von Micronics Inc. erhalten.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • FLIESSVERHALTEN
  • Die Einführung von Silbernitrat- und Natriumborhydridlösung in die Einlässe 3 und 5 führte zu der Bildung einer dünnen Linie von Kolloid innerhalb der Kanüle des Fließsystems. Der Kolloidlinie konnte durch das System unter Verwendung eines Weißlichtmikroskops im entweder Transmissions- oder Reflexionsmodus gefolgt werden. Ein Bild des Punktes der Kolloiderzeugung innerhalb des Kanals wird in 3 gezeigt Der Durchmesser der Kolloidlinie betragt ungefähr 30 μm, was mit der Verwendung eines Raman-Mikroskopsystems verträglich ist, welches bis zu einem Punkt von 1–2 μm herab fokussieren kann, wenn eine x50-Objektivlinse verwendet wird. Dies führt zueinem SERRS-System, wo ein großer Anteil des Stromes durch das Instrument abgefragt wird, wenn er an dem Abfragungspunkt vorüberfließt
  • Um zu versuchen, das Mischen innerhalb der Kanüle zu fördern, wurden die Säulen 20 in das Fließsystem eingeführt. Dies wird schematisch in 1b als einem Nebenbild des Kanals, wie er in 1a gezeigt wird, veranschaulicht. Durch Verfolgen des Kolloidflusses durch das System konnte gesehen werden, daß diese Merkmale keine Auswirkung auf das Mischen der kolloidalen Teilchen hatten. Dies wird in 4 gezeigt, welche ein Bild des Kolloidstroms zeigt, wenn er durch den Säulenstrukturen enthaltenden Teil der Fließzelle hindurchgeht.
  • Um die relativen Geschwindigkeiten des Mischen und der Diffusion der kolloidalen Teilchen und der Farbstoffmoleküle innerhalb des Fließsystems zu veranschaulichen, wurde eine Lösung von Indikator, Bromcresolpurpur (pH 9,0), in den Einlaß 7 eingeführt. Wenn sich diese Lösung mit Natriumborhydridlösung, welche in 0,1 M Natriumhydroxidlösung ist, mischte, verursachte die pH-Änderung, daß sich die Indikatorfarbe von orange nach Purpur änderte. Es war daher möglich, die Diffusion der Indikatormoleküle innerhalb der Zelle durch Aufzeichnen der Farbänderung zu überwachen. Wieder wurden Bilder unter Verwendung des Weißlichtmikroskops, dieses Mal im Transmissionsmodus, aufgenommen. Silbernitrat-, Natriumborhydrid- und Bromcresolblaulösungen wurden in die Einlässe 3, 5 bzw. 7 eingeführt und diese Lösungen wurden unter Verwendung einer Spritze durch das System gezogen. Der Fluß wurde dann gestoppt und die Lösungen wurden innerhalb der Kanäle diffundieren gelassen. Ein Bild wurde aufgenommen, während die Lösungen am Fließen waren, und in Intervallen über einen Zeitraum von ungefähr zwei Sekunden, nachdem der Fluß gestoppt worden war. Diese Bilder werden in 5 gezeigt. Es kann gesehen werden, daß es kein Mischen der Indikatorlösung mit der Natriumhydroxidlösung gibt, während die Lösungen am Fließen sind. Nachdem der Fluß gestoppt worden war, mischten sich die Lösungen und erzeugten eine purpurne Linie in der Mitte des Kanals an dem Punkt, wo die Lösungen sich treffen. Innerhalb von ungefähr zwei Sekunden war der Indikator durch den gesamten Kanal diffundiert. Ähnliche Bilder wurden auch an dem Punkt gesammelt, wo es Säulenstrukturen in dem System gab. Diese Bilder werden in 6 gezeigt. Hier kann gesehen werden, daß es eine feine purpurne Linie, vorhanden in der Mitte des Kanals, gibt, wenn die Lösungen am Fließen sind, was vielleicht anzeigt, daß die Säulenstrukturen das Mischen von Farbstoffmolekülen innerhalb der Kanäle unterstützen. Jedoch könnte das Erscheinen der purpurnen Linie während des Fließen auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß sich die Säulen weiterhin entlang der Kanäle befinden, daher die Lösungen mehr Zeit gehabt haben würden, um an diesem Punkt zu diffundieren. Außerdem führt Ziehen der Lösungen durch das System unter Verwendung einer Spritze zu unreproduzierbaren Fließgeschwindigkeiten und alle Veränderungen in der Menge der Diffusion an verschiedenen Punkten in dem System können auf Veränderungen in der Fließgeschwindigkeit zurückzuführen sein. Wiederum kann gesehen werden, daß innerhalb von ungefähr zwei Sekunden der Indikator durch den Kanal diffundiert war. Jedoch kann an beiden Punkten in dem System gesehen werden, daß das Kolloid innerhalb der Zeit, die der Indikator zum Diffundieren braucht, nicht durch den Kanal diffundierte. Es gibt jedoch in den Abfolgen in den 5 und 6 Unterschiede in der Dicke der Kolloidlinie von einem Bild zum nächsten. Man nimmt an, daß dies auf einen Aufbau von Silber auf der Glasoberfläche des Fließsystems zurückzuführen sein kann, zurückzuführen auf fortwährendes Stoppen und Starten des Flusses, während die Bilder gesammelt wurden.
  • Um zu zeigen, ob es irgendeine Kolloiddiffusion innerhalb der Kanäle gibt, während der Fluß gestoppt wird, wurden Silbernitrat, Natriumborhydrid und destilliertes Wasser in die Einlässe 3, 5 bzw. 7 eingeführt und diese Lösungen wurden einmal durch das Fließsystem gesaugt. Bilder wurden dann an dem Punkt der Kolloiderzeugung aufgenommen, unmittelbar nach der Kolloiderzeugung und mit verschiedenen Zeitintervallen über einen 70-Minuten-Zeitraum. Die Bilder, aufgenommen unmittelbar nach der Kolloiderzeugung und nach 70 Minuten, werden in 7 gezeigt. Hier kann gesehen werden, daß es über den Zeitraum von 70 Minuten eine leichte Verdunkelung des Kolloidstromes gibt, was darauf hinweist, daß es Diffusion des Silbernitrats und des Natriumborhydrids in Richtung zu der Mitte des Kanals gibt, wo mehr Kolloid erzeugt wird. Jedoch dispergiert der Kolloidstrom selbst nicht und jenseits des Treffpunkts der zwei Lösungen wird kein Kolloid erzeugt. Der Mangel an Diffusion der kolloidalen Teilchen kann auf die Teilchen, klebend an den Wänden des Fließsystems, zurückzuführen sein. Das gleiche Experiment wurde an dem Punkt in dem Fließsystem ausgeführt, wo es säulenförmige Strukturen gibt. Die Bilder, aufgenommen unmittelbar nach der Kolloiderzeugung und nach 70 Minuten, werden in 8 gezeigt. Hier kann gesehen werden, daß es über den Zeitraum von 70 Minuten keine Veränderung im Aussehen des Kolloidstroms gab. Die Abwesenheit jeglicher Verdunkelung mit der Zeit wies darauf hin, daß das gesamte Kolloid zu der Zeit erzeugt worden war, als der Strom diesen Teil des Systems erreicht hatte. Wiederum gab es keine weitere Diffusion der kolloiden Teilchen, sobald der Fluß gestoppt worden war. Der Mangel an Diffusion kann durch die geladenen kolloidalen Teilchen verursacht werden, die sich an die Glasoberfläche binden. Um das Ausmaß dieser Anbindung zu bestimmen, wurde in dem System auf dem gewöhnlichen Wege Kolloid erzeugt und ein Bild wurde nach der Kolloiderzeugung aufgenommen. Destilliertes Wasser wurde dann durch das System gezogen und ein anderes Bild wurde aufgenommen. Diese Bilder werden in den 9a, b, c gezeigt. Es kann gesehen werden, daß etwas von dem Kolloid durch das destillierte Wasser durch das System gewaschen wird, jedoch bleibt etwas an die Glasoberfläche gebunden, was teilweise für den Mangel an Diffusion der kolloidalen Teilchen verantwortlich ist. Weiteres Waschen mit destilliertem Wasser entfernte kein weiteres Kolloid von der Glasoberfläche. Das verbleibende Silber kann durch Waschen mit Salpetersäure und nachfolgend destilliertem Wasser leicht aus dem System entfernt werden. Ein Bild des Fließsystems nach dem Reinigen mit Salpetersäure kann in 9c gesehen werden.
  • SERRS-Spektren eines Farbstoffes, 5-(2-Methyl-3,5-dinitro-phenylazo)chinolin-8-ol, wurden unter Verwendung dieses Systems durch Einführen von Silbernitrat-, Natriumborhydrid- und Farbstofflösung in die Einlässe 3, 5 bzw. 7 akkumuliert. Um den Probenahmepunkt zu bestimmen, von welchem die maximale Signalintensität erreicht werden konnte, wurden Spektren von verschiedenen Punkten überall in dem System akkumuliert Allgemein gesprochen nahmen die Intensitäten der akkumulierten Spektren nach dem Punkt der Kolloiderzeugung ab. Dies kann auf schnelle Kolloiderzeugung innerhalb der ersten Hälfte des Systems und einen Mangel an Diffusion der kolloidalen Teilchen überall in dem Rest des Systems zurückzuführen sein. Die höhere Konzentration von Silber in diesen Teilen des Systems ruft eine Zunahme in der Menge der Silberoberfläche, verfügbar für Farbstoffanbindung, hervor, was daher zu einer Zunahme in der Signalintensität in diesen Gebieten führt.
  • Da gefunden wurde, daß es eine Zunahme in der Signalintensität in der Richtung zu dem Start des Chips gab, wurde angenommen, daß Vormischen des Farbstoffs mit entweder der Natriumborhydrid- oder der Silbernitratlösung zu einer Zunahme in der Signalintensität führen kann, da der Farbstoff an dem Punkt in dem System, wo das Kolloid erzeugt wird, vorhanden sein würde. In allen Fällen, wenn der Farbstoff mit Silbernitrat vorgemischt wurde, führte dies zu keiner Kolloiderzeugung. Dies war auf die Komplexbindung des Farbstoffs mit dem Silber vor dem Mischen mit Natriumborhydridlösung, daher Verhindern der Kolloiderzeugung, zurückzuführen. Die Spektren wurden überall in dem System durch Einführen von Silbernitrat in Einlaß 3 und von einem Gemisch von Natriumborhydrid und Farbstofflösung in Einlaß 5 akkumuliert. Die Akkumulierung der Spektren von den verschiedenen Punkten wurde randomisiert, um alle potentiellen Auswirkungen der Zeit der Signalakkumulierung zu eliminieren. Wie erwartet wurden die intensivsten Signale von der Nähe des Punktes der Kolloiderzeugung akkumuliert. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Signalintensitäten, erreicht von dem Punkt der Kolloiderzeugung nach dem Vormischen des Farbstoffes mit Natriumborhydridlösung, und denjenigen, akkumuliert später in dem System nach Einführen des Farbstoffes durch Einlaß 7.
  • Die Abwesenheit jeglicher Diffusion der Kolloidlinie, sobald der Fluß gestoppt worden ist, macht dieses System geeignet für Analyse unter Verwendung eines gestoppten Fließsystems. Dieses würde Akkumulierung des SERRS-Signals über einen ausgedehnten Zeitraum, daher Herabsetzen der unter Verwendung dieses Systems erreichbaren Nachweisgrenzen ermöglichen. Um das Potential für Signalakkumulierung über einen ausgedehnten Zeitraum zu beurteilen, wurden SERRS-Spektren des Farbstoffs jede Minute für eine Stunde von dem gleichen Punkt in dem System akkumuliert. Eine graphische Darstellung der Signalintensität gegen die Zeit wird in 10 gezeigt. Es kann gesehen werden, daß die Signalintensität für die ersten sieben Minuten vor dem schnellen Zunehmen konstant bleibt. Ohne zu wünschen, durch eine Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, daß diese schnelle Zunahme in der Signalintensität auf die Aggregation des kolloidalen Stroms, zurückzuführen auf die fortwährende Einwirkung des Lasen auf die Probe, zurückzuführen ist. Es konnte gesehen werden, daß der Teil des kolloidalen Stroms, von wo das Signal akkumuliert war, sich aggregiert hatte, wobei Cluster von Kolloid erzeugt wurden. Nach dieser Zunahme im Signal verringert sich das Signal, bis bei 50 Minuten kein Signal gesehen werden kann, zurückzuführen auf Brennen der Probe. Obwohl das Signal während des 60-Minuten-Zeitraums nicht konstant bleibt, kann ein Farbstoffsignal über einen 50-Minuten-Zeitraum wenn notwendig akkumuliert werden, um die potentielle Nachweisgrenze zu verringern.
  • Um die Nachweisgrenze des Farbstoffs unter Verwendung dieses Systems zu bestimmen, wurden Farbstofflösungen mit Konzentrationen, die von 10–6 M bis 10–9 M reichten, durch den Einlaß 3 in das System eingeführt. Das Kolloid wurde in dem System wie vorstehend beschrieben erzeugt und 10 μl von jeder der Farbstofflösungen wurden in das System eingeführt, was zu Farbstoffkonzentrationen führte, die von 10 Picomol bis 10 Femtomol reichten. Die Spektren wurden durch Fokussieren des Lasers auf den Kolloidstrom an dem Punkt akkumuliert, wo die Farbstofflösung auf das Kolloid traf. Die akkumulierten Spektren werden in 11 gezeigt. Hier kann gesehen werden, daß es möglich ist, unter Verwendung dieses Systems bis herab zu 10 Femtomol des Farbstoffs nachzuweisen. Dies stellt eine zwanzigfache Zunahme in der Empfindlichkeit gegenüber derjenigen dar, die unter Verwendung einer Makrofließzelle erreicht wird.
  • 12 zeigt eine schematische Darstellung eines Fließzellensystems gemäß der vorliegenden Erfindung, welches beim Minisequenzieren zum Nachweis von SNPs in einer Probe von DNA verwendet werden kann.
  • Eine Probe von DNA 50 wird in das System 52 eingeführt und danach mit passenden Primern, markierten Triphosphaten und DNA-Polymerase 54 mischen gelassen. Die Triphosphate werden wie früher beschrieben mit einem geeigneten Dien markiert. Jedes Triphosphat, d.h. ATP, CTP, GTP oder TTP, wird mit einem unterschiedlichen Dien markiert, so daß bei SERRS-Nachweis ein Signal entsprechend jedem speziellen Dien erzeugt wird, welches mit einem speziellen Nucleotidtriphosphat gleichgesetzt werden kann. Extension des Primers durch Hinzufügung eines markierten Triphosphats wird erreicht, indem das Gemisch, umfassend die Probe von DNA 50, die Primer, markierte Triphosphate und DNA-Polymerase 54, über einen Peltier-Block 56 geführt wird, dessen Temperatur gesteuert wird, um zuerst die DNA zu denaturieren und danach Annalen des Primers und Primerextension durch enzymatische Hinzufügung eines markierten Triphosphats zu erlauben. Der markierte extendierte Primer wird dann mit dem SERRS-Entwicklungsmittel 58, wie beispielsweise Benzotriazolmaleimid, umgesetzt. Danach werden das markierte Dien und das SERRS-Entwicklungsmittel 58 durch Verwendung von UV-Licht gespalten, wobei der extendierte Primer, bereit für weitere Reaktion/Extension, hinterlassen wird, bevor mit Kolloid 58, erzeugt aus AgNO3 und NaBH4 und dem speziellen Dien/SERRS-Entwicklungsmittel, nachgewiesen durch Raman-Spektroskopie, umgesetzt wird. In dieser Weise kann die Identität des hinzugefügten Nucleotidtriphosphats bestimmt werden. Der extendierte Primer kann für weitere Reaktion/Extension recyclisiert und der Abfall entfernt werden.
  • BEISPIEL 3: CODIERTE NANOTEILCHEN ZUM NACHWEIS VON DNA DURCH SERRS
  • Hier wird gezeigt, daß ein gekennzeichnetes Oligonucleotid mit drei anderen Farbstoffen in einer Suspension von Nanoteilchen nachgewiesen werden kann, was die Fähigkeit anzeigt, ein codiertes Nanoteilchen zur Identifizierung einer speziellen Sequenz in einem Gemisch von DNA-Fragmenten bereitzustellen.
  • Das untersuchte Oligonucleotid enthielt eine basische Priming-Sequenz von 5' GTG CTG CAG GTG TAA ACT TGT ACC AG 3'. Der verwendete sichtbare Chromophor war der Fluorophor 2,5,2',4',5',7'-Hexachlor-6-carboxyfluorescein (HEX), welcher an dem 5'-Terminus gebunden wurde. HEX ist negativ geladen und stößt daher die negativ geladene Metalloberfläche ab. Oberflächenanbindung wurde durch die Einbringung positiv geladener modifizierter Nucleobasen an dem 5'-Terminus am nächsten zu der HEX-Kennzeichnung erreicht. Die drei verwendeten Farbstoffe waren Azos, die die Benzothiazolgruppe zur Oberflächenanbindung enthielten.
  • Alle Spektren wurden in einer Renishaw 2000 Raman Microprobe (Raman-Mikrosonde Renishaw 2000) mit einem Spektrometer mit ladungsgekoppelter Schaltung (CCD) erfaßt. Die Anregung wurde durch einen Argonionenlaser Spectra-Physics Model 2020 mit einer Wellenlänge von 514,5 nm und 2 mW Leistung an der Quelle bereitgestellt. Proben wurden in einer Kunststoffmikrotiterplatte unter Verwendung eines X50-Objektivs analysiert. Die Erfassungszeit für alle Spektren betrug 10 s und das Gitter wurde bei 1350 cm–1 zentriert.
  • 13 zeigt die Spektren, erfaßt von jedem der individuellen Farbstoffe, einschließlich desjenigen mit dem angebundenen Oligonucleotid. Für jede Probe wurden 250 μl Kolloid, 250 μl destilliertes Wasser, 30 μl Analyt und 10 μl 0,067 M Spermin miteinander gemischt und die SERRS wurde unmittelbar erfaßt. Spermin ist ein wirksames Aggregierungsmittel für Silberchlorid. Es ist auch ein bekanntes Ladungsneutralisierungsmittel für das negativ geladene Phosphatgrundgerüst von DNA, was die Adsorption der Probe an der Metalloberfläche unterstützt Diese Figur zeigt auch das Spektrum, aufgenommen von dem Gemisch aller Farbstoffe. Alle Spektren sind normiert worden, um die gleiche maximale Intensität in dem höchsten Peak in jedem Spektrum zu haben.
  • Beispiel 4: Gleichzeitiger Nachweis von Oligonucleotiden ohne Abtrennung
  • 20 μl Rhodamin-gekennzeichnetes Oligonucleotid (17 mer), 20 μl Hex-gekennzeichnetes Oligonucleotid und 10 μl 0,067 M Spermin wurden vorgemischt und als kontinuierlicher Fluß in eine Mikrofließzelle, wie beschrieben in Beispiel 1, gegeben. Die Zelle wurde gestaltet, um zu ermöglichen, daß das Kolloid in situ erzeugt wird, und der Kolloid- und der Oligonucleotidstrom wurden gemischt. Das Raman-Spektrum wurde kurz nach dem Punkt des Mischen in der Zelle für 5 Sekunden gesammelt. Die Zeit zwischen Mischen und Messung betrug 20 Sekunden. 14a zeigt deutlich, daß Signale von beiden Oligonucleotiden leicht unterscheidbar sind (01 Rhodamin-Kennzeichnung, 02 Hex-Kennzeichnung).
  • Die Erweiterung dieser Herangehenweise auf drei Oligonucleotide wird in 14b gezeigt. In diesem Fall waren die verwendeten Oligonucleotide die Rhodamin- und die Hex-Kennzeichnung und eine dritte Sequenz, gekennzeichnet mit einem Azofarbstoff.
  • Beispiel 5: Elektropermeabilisierung/Elektroporation von Zellen zum Einschluß von SERRS-reaktiven Teilchen
  • Die Motivation war, einen Zugang mit geringem Widerstand zum intrazellulären Raum herzustellen, um eine reversible Pore innerhalb der Zelle herzustellen und um SERRS-Teilchen einzufahren. Dies ist erreicht worden, indem Teilchen mit sowohl Mikron- als auch Submikrongröße (Sensorperlen) verwendet wurden, die ermöglichen, daß sich Abtasten innerhalb des intrazellulären Raums ereignet.
  • Mikroelektroden für Elektroporation wurden unter Verwendung standardmäßiger photolithographischer Verfahren hergestellt. Geometrien wurden erschaffen, um ein gleichmäßiges Feld über der Zelle oder den Zellen zu ergeben. Metallmehrfachschichten aus Ti/Pd/Au (10/10/1000 nm) wurden gegen eine photostrukturierte Photolackschicht auf einem Glassubstrat abgelagert und die Geometrie wurde durch Abziehen realisiert. Eine fluidische Oberschicht wurde in geformtem PDMA definiert und wurde gegen das Glassubstrat verschlossen. Trockenes Ätzen des Glases vor dem Verschließen ergab einen guten fluidischen Verschluß, der das Auslaufen verhindert. Der Bereich für Elektroporation der Zelle wurde durch entweder Adsorption oder Anbindung eines Anbindungsmotivs oder durch Polylysin 5 mg/ml, getrocknet auf der Oberfläche, präfunktionalisiert. Diese Funktionalisierung förderte die Zellhaftung, wenn unter Verwendung einer gezogenen Mikropipette eingeführt, zwischen den Geometrien der Mikroelektrode. Die verwendete Zelle war eine Kaninchen-Kardiomyozyte, hergestellt entsprechend Standardtechniken.
  • Kolloid wurde in dem Chip wie bereits beschrieben unter Druck-getriebenem Fluß erzeugt, wobei zwei Pumpen verwendet wurden, und das Kolloid floß in Richtung zu der Zelle und rund um sie herum. Zwei Paare von Mikroelektroden wurden verwendet, ein Paar, um die Zelle zu elektropermeabilisieren, das zweite, um Veränderungen in der lokalen Leitfähigkeit zu überwachen, derart, daß es möglich war, zu wissen, daß das Zellkompartiment zugänglich gewesen war. Das erstere Paar von Elektroden lieferte einen Spannungsimpulszug von >200 mV für den Zusammenbruch der dielektrischen Membran. Zum Beispiel ermöglichen ultrakurze Impulse (5 Millisekunden) mit 5–10 V Gleichstrom reversible Elektropermeabilisierung. Impulse mit niedriger Spannung können fortwährend an ein zweites orthogonales Paar von Elektroden angelegt werden, um die Leitfähigkeit der Zelle und daher das Ausmaß der Permeabilisierung zu überwachen. Es wurde durch visuelle Beobachtung der Zelle unter einem umgekehrten Mikroskop gesehen, daß Gruppen von kolloidalen Teilchen in die Zelle eingetreten sind.
  • In dem bevorzugten Format wurden Au-Teilchen verwendet, da gefunden wurde, daß sie weniger toxisch sind.
  • REFERENZEN
    • (1) Moskovits, M., J. Chem. Phys. 1978, 69, 4159–4161.
    • (2) Fleischmann, M.; Hendra, P.J.; McQuillan, A.J., J. Chem. Phys. Lett., 26, 163–166.
    • (3) Nie, S.M.; Emery, S.R., Science 1997, 275, 1102–1106.
    • (4) Kneipp, K.; Wang, Y.; Dasari, R.R.; Feld, M.S., Applied Spectroscopy 1995, 49, 780–784.
    • (5) Rodger, C.; Smith, W.E.; Dent, G.; Edmondson, M., Journal of the Chemical Society – Dalton Transactions 1996, 791–799.
    • (6) Hildebrandt, P.; Stockburger, M., Journal of Physical Chemistra 1984, 88, 5935–5944.
    • (7) Yang, X.M.; Ajito, K.; Tryk, D.A.; Hashimoto, K.; Fujishima, A., Journal of Physical Chemistra 1996, 100, 7293–7297.
    • (8) Laserna, 3.3.; Tones, E.L.; Winefordner, J.D., Analytica Chimica Acta 1987, 200, 469–480.
    • (9) Cermakova, K.; Sestak, O.; Matejka, P.; Baumruk, V.; Vlckova, B., Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1993, 58, 2682–2694.
    • (10) Schneider, S.; Halbig, P.; Grau, H.; Nicekl, U., Photochemistry and Photobiology 1994, 60, 605–610.
    • (11) Vlckova, B., Soleckacermakova, K.; Matejka, P.; Baumruk, V., Journal of Molecular Structure 1997, 408, 149–154.
    • (12) Lee, P.C.; Meisel, D., Journal of Physical Chemistra 1982, 86, 3391–3395.
    • (13) Munro, C.H.; Smith, W.E.; Garner, M.; Clarkson, J.; White, P.C., Langmuir 1995, 11, 3712–3720.
    • (14) Shirtcliffe, N.; Nickel, U.; Schneider, S., Journal of Colloid and Interface Science 1999, 211, 122–129.
    • (15) Campbell, M.; Lecomte, S.; Smith, W.E., Journal of Raman Spectroscopy 1999, 30, 37–44.
    • (16) Sanchezcortes, S.; Garciaramos, J.V.; Morcillo, G.; Tinti, A., Journal of Colloid and Interface Science 1995, 175, 358–368.
    • (17) Blatchford, C.G.; Campbell, J.R.; Creighton, J.A., Surface Science 1982, 120, 435–455.
    • (18) Jones, J.C.; McLaughlin, C.; Littlejohn, D.; Sadler, D.A.; Graham, D.; Smith, W.E., Analytical Chemistry 1999, 71, 596–601.
    • (19) Xu, H.X.; Aizpurua, J.; Kall, M.; Apell, P. Physical Review E 2000, 62, 4318–4324.
    • (20) Stockman, M.I.; Shalaev, V.M.; Moskovits, M.; Botet, R.; George, T.F., Physical Review B 1992, 46, 2821–2830.
    • (21) Vlckova, B.; Gu, X.J.; Moskovits, M., Journal of Physical Chemistry B 1997, 101, 1588–1593.
    • (22) Laserna, J.J.; Berthod, A.; Winefordner, J.D., Microchemical Journal 1988, 38, 125–136.
    • (23) Cabalin, L.M.; Ruperez, A.,; Laserna, J.J., Analytica Chimica Acta 1996, 318, 203–210.
    • (24) Sheng, R.S.; Ni, F.; Cotton, T.M., Analytical Chemistry 1991, 63, 437–442.
    • (25) Freeman, R.D.; Hamaker, R.M.; Meloan, C.E.; Fately, W.G., Applied Spectroscopy 1988, 42,456–460.
    • (26) Taylor, G.T.; Sharma, S.K.; Mohanan, K., Applied Spectroscopy 1990, 44, 635–640.
    • (27) Lasern, J.J.; Berthod, A.; Winefordner, J.D., Talanta 1987, 34, 745–747.
    • (28) Laserna, J.J.; Berthod, A.; Winefordner, J.D., Microchemical Journal 1988, 38, 125–136.
    • (29) Berthod, A.; Laserna, J.J.; Winefordner, J.D., Applied Spectroscopy 1987, 41, 1137–1141.
    • (30) Ruano, J.M.; Benoit, V.; Aitchison, J.S. und Cooper, J.M., Flame Hydrolysis Deposition of Glass an Silicon for the Integration of Optical and Microfluidic Devices (Ablagerung von Glas durch Flammenhydrolyse auf Silicium für die Integration von optischen und mikrofluidischen Vorrichtungen), Analytical Chemistry, 2000, 72, 1093–1097.
    • (31) Pillai, V.N.R.; Synthesis 1980, 1–26.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00220001

Claims (42)

  1. Verfahren zum Erzeugen in situ eines Kolloids zur Verwendung beim Nachweisen eines Analyts unter Verwendung von SER(R)S, wobei das Kolloid durch Inkontaktbringen unter Bedingungen laminarer Strömung eines ersten mikrofluidischen Stroms eines geeigneten Metallsalzes mit einem zweiten mikrofluidischen Strom eines Reduktionsmittels erzeugt wird, wodurch Mischen des ersten und zweiten Stromes im wesentlichen an einer Grenzflächenregion zwischen dem ersten und zweiten Strom erfolgt und wobei in der Grenzflächenregion Kolloid erzeugt wird und wobei die zwei Ströme in einem Kanal von 1 μm bis 500 μm Breite gemischt werden.
  2. Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Analyts in einer Probe, umfassend die Schritte: 1) Erzeugen des Kolloids nach Anspruch 1 in situ oder ex situ: 2) Mischen der Probe mit dem Kolloid in einem mikrofluidischen System mit Kanälen von 1 μm bis 500 μm Breite unter laminaren Strömungsbedingungen, geeignet, einem von dem Analyt, vorhanden in der Probe, zuerlauben, an dem Kolloid zu haften; und 3) Nachweisen der Anwesenheit von einem von dem Analyt in der Probe durch SER(R)S.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe oder die Proben durch einen weiteren mikrofluidischen Strom (weitere mikrofluidische Ströme), angeordnet, um mit dem so erzeugten Kolloid in Kontakt zu kommen, bereitgestellt werden.
  4. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend die Zugabe eines Aggregierungsmittels zur Kolloiderzeugung, wobei das Aggregierungsmittel durch einen weiteren mikrofluidischen Strom eingeführt oder in den ersten oder zweiten mikrofluidischen Strom eingeschlossen wird, welcher mit den anderen Strömen vor, während oder nach dem Mischen der Probe vereinigt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der nachzuweisende Analyt aus Nucleinsäuren, Nucleinsäureanalogen, Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, Enzymen, Prionen, Antikörpern, Aldehyden, Aminen, Ketonen, Explosivstoffen, Suchtmitteln, therapeutischen Mitteln, Metaboliten und Umweltschadstoffen ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Probe eine Probe von Gas oder Flüssigkeit ist. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der Analyt in einem Fluid ist oder vor dem Mischen mit dem Kolloid in situ oder ex situ in ein Fluid überführt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei eine anfängliche Probe aus einem Ausgangsstoff erhalten wird und ein Zielanalyt, vorhanden in der anfänglichen Probe, auf ein geeignetes Substrat absorbiert wird und danach ein Zielanalyt durch Waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel von dem Substrat entfernt wird, um die zu testende Probe zuerzeugen.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei ein Chromophor einer geeigneten Wellenlänge, um in Resonanz mit einem Laser, ausgewählt zur Verwendung in dem SER(R)S-Nachweis, zu sein, in dem Analyt vorhanden ist oder durch Derivatisierung des Analyts vor der Analyse ein Chromophor erzeugt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei der Analyt mit einem Reagenz umgesetzt wird, um den Analyten zu derivatisieren, und wobei das Reagenz, welches verwendet wird, um den Analyten zu derivatisieren, einen Chromophor bereitstellt, in Kombination mit dem Analyten einen Chromophor bereitstellt und/oder den Analyten zum Haften an dem SER(R)S-aktiven Substrat zugänglich macht.
  10. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Reagenz an das Kolloid gebunden wird.
  11. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Kolloid auf der Oberfläche eines Teilchens oder von Teilchen aufgebracht wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das (die) Teilchen aus Siliciumdioxid oder einem Polymer wie beispielsweise Polystyrol erzeugt ist/sind.
  13. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Teilchen des Kolloids weiter modifiziert werden, um ein SER(R)S-reaktives Mittel, haftend an dem Teilchen, zu umfassen.
  14. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das SER(R)S-reaktive Mittel ein Farbstoff ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei mehr als ein SER(R)S-reaktives Mittel und/oder Farbstoff an dem Teilchen haftet.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das SER(R)S-reaktive Mittel (die SER(R)S-reaktiven Mittel) und/oder der Farbstoff durch einen zusätzlichen mikrofluidischen Strom oder Ströme, zusammenlaufend mit dem Kolloidstrom, bereitgestellt und mit dem Kolloid gemischt wird/werden.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei geeignete Auswahl des SER(R)S-aktiven Mittels (der SER(R)S-aktiven) Mittel) und/oder des Farbstoffs (der Farbstoffe) dem (den) kolloiden Teilchen erlaubt, ein spezifisches SER(R)S-Signal zu erzeugen, derart, daß in einem Gemisch von unterschiedlich gekennzeichneten kolloiden Teilchen mehr als ein SER(R)S-Signal gleichzeitig analysiert werden kann und die identifizierten kolloiden Teilchen, basierend auf einem kombinierten SER(R)S-Signal oder individuellen Signalen innerhalb eines kolloiden Gemisches, umfassend unterschiedlich gekennzeichnete kolloide Teilchen, wahrgenommen werden können.
  18. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die hergestellten kolloiden Teilchen in einer gesteuerten Weise aggregiert werden, um eine reproduzierbare Größe und Gestalt zuhaben und so stabil wie möglich gegen Selbstaggregation zu sein.
  19. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die kolloiden Teilchen in situ durch Inkontaktbringen mit einem geeigneten Aggregierungsmittel, wie beispielsweise Säuren (z.B. HNO3 oder Ascorbinsäure), Polyamine (z.B. Polylysin, Spermin, Spermidin, 1,4-Diaminopiperazin, Diethylentriamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin) und anorganische aktivierende Ionen, wie beispielsweise Cl–, T, Na+ oder Mg2 +, oder Aggregierungsmittel, umfassend elektrochemische, elektrische, dielektrische oder magnetische Mittel, aggregiert werden.
  20. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der erste Strom Natriumborhydrid umfaßt und der zweite Strom Silbernitrat umfaßt.
  21. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der nachzuweisende Analyt innerhalb einer biologischen Zelle ist und wobei das Verfahren weiterhin die Schritte umfaßt a) Immobilisieren oder Zurückhalten der Zelle; b) Permeabilisieren der Zelle, um dem Kolloid zu erlauben, in und/oder durch die Zelle zu fließen, derart, daß kolloide Teilchen imstande sind, an den Analyten innerhalb der Zelle zu binden; und c) Nachweisen der Bindung der kolloiden Teilchen an den Analyten durch SER(R)S.
  22. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Zelle eine tierische Zelle ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 oder 23, wobei die Zelle durch Elektroporation permeabilisiert wird.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 24, wobei das SER(R)S-Signal unter Verwendung von Wellenlängen-selektiven Spiegeln und/oder Gittern, holographischen optischen Elementen zum Streulichtnachweis, Linsen, integrierten Wellenleitern oder faseroptischen Wellenleitern gesammelt wird.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 25, wobei die Intensität eines SER(R)S-Signals unter Verwendung eines ladungsgekoppelten Bauelements (CCD), einer Siliciumphotodiode, eines integrierten CMOS-Detektors (von integrierten CMOS-Detektoren), von Photomultiplierröhren, angeordnet entweder einzeln oder hintereinander zur Kaskadenverstärkung des Signals oder zur Photonenzählungselektronik, gemessen wird.
  26. Mikrofluidische Vorrichtung zur Verwendung beim Nachweisen von Analyten durch SER(R)S, wobei die Vorrichtung ein Substrat mit darin erzeugten Mikrokanälen von 1 μm bis 500 μm Breite und mit den Kanälen verbundene Einlässe zum Einführen eines geeigneten Metallsalzes, eines Reduktionsmittels, einer Probe und gegebenenfalls eines Aggregierungsmittels umfaßt, wobei die laminare Strömung innerhalb der Kanäle zum Tragen des geeigneten Metallsalzes und des Reduktionsmittels zusammenlauft, um Mischen des geeigneten Metallsalzes und des Reduktionsmittels und Erzeugung eines Kolloids an einer Grenzfläche zwischen dem geeigneten Metallsalz und dem Reduktionsmittel zu erlauben; und wobei die laminare Strömung innerhalb eines Kanals zum Tragen der Probe angeordnet wird, um mit dem so hergestellten Kolloid zusammenzulaufen, derart, daß ein in der Probe vorhandener Analyt imstande ist, an dem Kolloid zu haften, wodurch erlaubt wird, daß der Nachweis durch SER(R)S ausgeführt wird.
  27. Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei das Substrat aus Silikon, Glas oder Polymer erzeugt wird.
  28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei die Mikrokanäle Dimensionen in dem Bereich 10 μm–200 μm Breite haben.
  29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 29, wobei die Einlässe zum Einführen der verschiedenartigen Reagenzien in der Form von Vertiefungen oder Reservoiren zum Aufrechterhalten einer geeigneten Quantität von Reagenz oder Analyt/Probe sind.
  30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 30, weiterhin umfassend einen Kanal zum Tragen des Kolloids mit anhaftendem Analyt, derart, daß SER(R)S-Nachweismittel imstande sind, auf den Kanal fokussiert zu werden, um zu ermöglichen, daß SER(R)S-Nachweis ausgeführt wird.
  31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei die Kolloid erzeugenden Reagenzien und die Probe mit einer Pumpe, einen Spritzenantrieb, Elektrokinetik und/oder Elektrodynamik durch die Kanäle gezogen werden.
  32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 32, weiterhin umfassend eine Mikroelektrode oder Mikroelektroden in Kommunikation mit dem Substrat und/oder Fluid.
  33. Vorrichtung nach Anspruch 33, wobei die Mikroelektroden in der Form einer Anordnung sind.
  34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 33 oder 34, wobei die Mikroelektrode(n) verwendet werden kann (können), um den Grenzflächenstrom kolloidaler Teilchen durch Richten des Stromes in einen gesonderten analytischen Kanal, eine Kammer oder eine Region durch Verwendung von Elektrophorese, Dielektrophorese oder die Erzeugung eines elektroosmotischen Flusses weiter zu beeinflussen.
  35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 35, wobei Steuerung des Flusses des Kolloids weiterhin oder alternativ durch optische Felder oder durch Magnetismus gesteuert wird.
  36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 36, weiterhin umfassend Wellenleiter oder Fasern zum Lokalisieren der Anregung oder Sammlung von Licht.
  37. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten nach dem Verfahren der Ansprüche 2–26, wobei der Analyt modifiziert worden ist, um eine Markierung zu enthalten, wobei der markierte Analyt im wesentlichen nicht imstande ist, ein SER(R)S-Signal zu erzeugen, oder ein schlecht unterscheidbares SER(R)S-Signal erzeugt, aber imstande ist, ein ausreichend unterscheidbares SER(R)S-Signal zu erzeugen, wenn in Kombination oder nach Reaktion mit einem SER(R)S-Aktivierungsmittel, umfassend die Schritte: a) Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 26, wobei die Probe den markierten Analyten umfaßt und der markierte Analyt vor dem Mischen oder nach dem Mischen des Kolloids mit dem markierten Analyten mit dem SER(R)S-Aktivierungsmittel umgesetzt oder vereinigt wird.
  38. Verfahren nach Anspruch 38, wobei der zu markierende Analyt ein Oligonucleotid, Protein, Peptid oder Biomolekül ist.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 oder 39, wobei die Markierung ein Dien oder Dienophil ist und das SER(R)S-Aktivierungsmittel ein Dienophil bzw. Dien ist.
  40. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Dien ein Furan- oder Butadienrest ist.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Dienophil ein Maleimid ist.
  42. Verfahren nach Anspruch 42, wobei das Maleimid zur Oberflächenabsorption imstande ist, wie beispielsweise Benzotriazol-Maleimid oder Benzotriazol-Azofarbstoff-Maleimid.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011016059A1 (de) 2011-04-01 2012-10-04 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem
DE102021107229A1 (de) 2021-03-23 2022-09-29 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Online- oder In-situ-Messeinrichtung für eine Konzentrationsmessung eines Gases

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100516212C (zh) * 2004-05-07 2009-07-22 柯尼卡美能达医疗印刷器材株式会社 检测用微型反应器、基因检测装置和基因检测方法
US7764374B2 (en) 2004-07-26 2010-07-27 Serstech Ab On-chip spectroscopy
US20090142846A1 (en) * 2005-08-11 2009-06-04 Eksigent Technologies, Llc Methods for measuring biochemical reactions
WO2008043041A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 University Of Washington Method and device for rapid parallel microfluidic molecular affinity assays
GB0621050D0 (en) 2006-10-23 2006-11-29 Univ Strathclyde Functionalised polymers for labelling metal surfaces
JP5551355B2 (ja) * 2008-12-04 2014-07-16 川崎重工業株式会社 細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法
JP6410290B2 (ja) * 2014-04-24 2018-10-24 公立大学法人兵庫県立大学 表面増強ラマン測定方法および表面増強ラマン測定装置
JP6536931B2 (ja) * 2014-11-18 2019-07-03 公立大学法人兵庫県立大学 表面増強ラマン測定方法および表面増強ラマン測定装置
WO2016095961A1 (en) * 2014-12-16 2016-06-23 Medcom Advance, S.A Analysis device, analysis apparatus for identification of analytes in fluids and use of the analysis device
KR20220032094A (ko) 2019-07-15 2022-03-15 시크파 홀딩 에스에이 표면 강화 라만 분광법 태그의 제조 방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6025202A (en) * 1995-02-09 2000-02-15 The Penn State Research Foundation Self-assembled metal colloid monolayers and detection methods therewith
US6103537A (en) * 1997-10-02 2000-08-15 Aclara Biosciences, Inc. Capillary assays involving separation of free and bound species
GB9810865D0 (en) * 1998-05-20 1998-07-22 Zeneca Ltd Nucleic acid sequence identification
WO2001031322A1 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Caliper Technologies Corp. Pressure induced reagent introduction and electrophoretic separation
JP3316485B2 (ja) * 1999-11-17 2002-08-19 三菱重工業株式会社 ダイオキシン類分析方法及び装置
GB0008618D0 (en) * 2000-04-08 2000-05-31 Univ Strathclyde Analyte detection & apparatus therefor

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011016059A1 (de) 2011-04-01 2012-10-04 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem
DE102011016059B4 (de) 2011-04-01 2019-02-21 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verfahren zur Korrektur von Raman-spektroskopischen Daten in einem Mehrphasensystem
DE102021107229A1 (de) 2021-03-23 2022-09-29 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Online- oder In-situ-Messeinrichtung für eine Konzentrationsmessung eines Gases

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