DE69634175T2 - Auf silikon basierende mantelvorrichtungen für chemische reaktionen - Google Patents
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Description
- STAND DER TECHNIK
- Die vorliegende Erfindung betrifft Instrumente für Steuerung bzw. Regelung chemischer Reaktionen und die Detektion teilnehmender Reagenzien und resultierender Produkte, im Besonderen integrierte mikrogefertigte Instrumente zur Ausführung mikroskalarer chemischer Reaktionen einschließlich einer präzisen Regelung der Reaktionsparameter, und im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung Muffenbausteine auf Siliziumbasis als Reaktionskammern für chemische Reaktionen, und wobei diese Bausteine für eine Mikroreaktionseinheit mit hohem Durchsatz in großen Anordnungen einzelner Kammern verwendet werden können.
- Aktuelle Instrumente zur Ausführung einer chemischen Synthese durch thermische Regelung und thermische Wechselbeanspruchung sind allgemein sehr groß (Tischgeräte) und Ineffizient, und häufig werden sie durch Erhitzen und Abkühlen einer großen thermisch wirksamen Masse (z.B. eines Aluminiumblocks) betrieben. In den letzten Jahren haben sich die Anstrengungen auf eine Miniaturisierung dieser Instrumente konzentriert, und zwar durch die Entwicklung und Konstruktion von Reaktionskammern aus Silizium oder Werkstoffen auf Siliziumbasis (z.B. Silizium, Nitrid, polykristallines Silzium), die integrierte Heiz- und Kühleinrichtungen durch Konvektion über das Silizium aufweisen.
- Mikrofertigungstechnologien sind im Fach allgemein bekannt. Dazu zählen unter anderem das Besputtern, die galvanische Metallabscheidung, die Niederdruckbedampfung, die Photolithografie und das Ätzen. Mikrogefertigte Bausteine werden für gewöhnlich auf kristallinen Substraten ausgebildet, wie etwa Silizium und Galliumarsenid, wobei sie aber auch aus nichtkristallinen Materialien bzw. Werkstoffen wie etwa Glas oder bestimmten Polymeren gestaltet werden können. Die Formen kristalliner Bausteine lassen sich leicht regeln bzw. kontrollieren, da es sich bei geätzten Oberflächen allgemein um kristalline Flächen bzw. Ebenen handelt, und kristalline Werkstoffe können durch Verfahren gebondet bzw. verbunden werden, wie etwa durch Schmelzen auf erhöhten Temperaturen, durch anodisches Bonding oder durch feldunterstützte Verfahren.
- Die monolithische Mikrofertigungstechnologie ermöglicht heute die Produktion elektrischer, mechanischer, elektrochemischer, optischer, chemischer und thermischer Bausteine bzw. Vorrichtungen, darunter Pumpen, Ventile, Heizeinrichtungen, Mischer und Detektoren für Mikroliter- oder Nanolitermengen von Gasen, Flüssigkeiten und Feststoffen. Ferner können heute im Mikromaßstab Lichtwellenleitersonden und Ultraschall-Biegewellensensoren erzeugt werden. Die Integration dieser mikrogefertigten Bausteine bzw. Vorrichtungen in ein einzelnes System ermöglicht die Chargenfertigung von Analyseinstrumenten auf Reaktorbasis im Mikromaßstab. Derartige integrierte Mikroinstrumente können bei biochemischen, anorganischen oder organischen chemischen Reaktionen eingesetzt werden, um biomedizinische und Umweltdiagnosen vorzunehmen, wie etwa eine biotechnologische Verarbeitung und Detektion.
- Der Betrieb derartiger integrierter Mikroinstrumente lässt sich leicht automatisieren, und da die Analysen in Situ ausgeführt werden, ist die Verunreinigung sehr geringfügig. Aufgrund der inhärent kleinen Größen dieser Vorrichtungen können das Erhitzen und das Abkühlen außerordentlich schnell erfolgen. Diese Vorrichtungen weisen eine sehr niedrige Leistungsaufnahme auf und können über Batterien oder durch elektromagnetische, kapazitive, induktive oder optische Kopplung mit Energie versorgt werden.
- Die geringen Volumina und die großen Oberflächen-Volumen-Verhältnisse mikrogefertigter Reaktionsinstrumente sehen ein hohes Maß der Regelung bzw. der Steuerung der Parameter einer Reaktion vor. Heizeinrichtungen können Temperaturwechsel oder -anstiege erzeugen; während sonochemische und sonophysikalische Veränderungen der Konformationsstrukturen durch Ultraschallmesswandler erzeugt werden können; und wobei Polymerisationen durch einfallende optische Strahlung erzeugt werden können.
- Synthetische Reaktionen und im Besonderen synthetische Kettenreaktionen wie etwa die Polymerase-Kettenreaktion (PCR als englische Abkürzung von Polymerase Chain Reaction) eignen sich besonders gut für Mikrofertigungs-Reaktionsinstrumente. Die PCR kann selektiv ein einzelnes DNA-Molekül (oder RNA-Molekül) eines Organismus um einen Faktor von 106 bis 109 verstärken. Dieses allgemein anerkannte Verfahren erfordert den wiederholten Einsatz von Erhitzungszyklen (Denaturieren) und Abkühlzyklen (Ausglühen) in Gegenwart eines ursprünglichen DNA-Zielmoleküls, spezifischer DNA-Primer, von Deoxynukleotid-Triphosphaten und DNA-Polymeraseenzymen und Cofaktoren. Jeder Zyklus erzeugt eine Verdoppelung der Ziel-DNA-Sequenz, was zu einer exponentiellen Akkumulation der Zielsequenz führt.
- Das PCR-Verfahren umfasst: 1) das Verarbeiten der Probe zur Freisetzung der Ziel-DNA-Moleküle in ein Rohextrakt; 2) den Zusatz einer wässerigen Lösung, die Enzyme Puffer-Deoxyribonukleotid-Trihposphate (dNTPS) und Oligonukleotid-Primer enthält; 3) die Wärmewechselbeanspruchung der Reaktionsmischung zwischen zwei oder drei Temperaturen (z.B. 90–96, 72 und 37–55°C); und 4) das Detektieren von verstärkter DNA. In das PCR-Verfahren können Zwischenschritte integriert werden, wie zum Beispiel das Reinigen der Reaktionsprodukte und das Integrieren von Oberflächen biegenden Primern.
- Ein Problem in Bezug auf Standard-PCR-Labortechniken ist es, dass die PCR-Reaktionen durch das Einfügen eines einzelnen verunreinigenden Moleküls von Fremd-DNA verunreinigt oder inhibiert werden können, wie etwa durch zurückliegende Experimente, oder durch andere Verunreinigungen während der Übertragung der Reagenzien von einem Gefäß in ein anderes. Ferner liegen PCR-Reaktionsvolumina, die in Standard-Labortechniken zum Einsatz kommen, für gewöhnlich im Bereich von 50 Mikrolitern. Ein thermischer Zyklus bzw. ein Wärmezyklus besteht für gewöhnlich aus vier Phasen: dem Erhitzen einer Probe auf eine erste Temperatur; das Halten der Probe auf der ersten Temperatur; das Abkühlen der Probe auf eine zweite Temperatur; und das Aufrechterhalten der Temperatur auf der niedrigeren Temperatur. Für gewöhnlich wird für jede dieser vier Phasen eines thermischen Zyklus ungefähr eine Minute benötigt, und somit sind für insgesamt vierzig Zyklen etwa drei Stunden erforderlich. Aufgrund des in Standard-Laborverfahren verwendeten verhältnismäßig großen Volumens, der involvierten Zeit sowie der Verunreinigungsmöglichkeiten während den Übertragungen von Reagenzien von einem Gefäß in ein anderes, werden eindeutig Mikroinstrumente benötigt, die das PCR-Verfahren ausführen können.
- In letzter Zeit wurde die Zykluszeit bzw. die Durchlaufzeit zur Ausführung der PCR-Reaktion durch die Ausführung der PCR-Reaktion in Kapillarröhren und unter Verwendung einer Umluftheizeinrichtung reduziert. Ferner wurde kürzlich ein integrierter, mikrogefertigter Reaktor für in Situ chemische Reaktionen entwickelt, der für biochemische Reaktionen besonders vorteilhaft ist, die eine thermische Wärmebeanspruchung mit sehr hoher Präzision voraussetzen, im Besonderen DNA-basierte Manipulationen wie etwa PCR, da die kleinen Abmessungen der Mikroinstrumente kurze Zykluszeiten fördern. Dieser mikrogefertigte Reaktor ist beschrieben und beansprucht in dem U.S. Patent US-A-5,639,423 mit dem Titel "Microfabricated Reactor" an den Zessionar der vorliegenden Erfindung. Ferner entwickelt zum Einsatz in chemischen Reaktoren wurde eine optisch erhitzte und optisch abgefragte Mikroreaktionskammer, die zum Beispiel in dem integrierten mikrogefertigten Reaktor aus dem oben genannten U.S. Patent US-A-5,639,423 verwendet werden kann.
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine besondere Geometrie von Mikroreaktoren auf Siliziumbasis, die sich in Bezug auf die Leistungs- und Temperatureinheitlichkeit als sehr effizient erwiesen haben. Der Mikroreaktor gemäß der vorliegenden Erfindung, der im weiteren Sinne als Muffenvorrichtung auf Siliziumbasis für chemische Reaktionen gilt, kann effektiv in jedem der Reaktorsysteme der vorstehend genannten gleichzeitig anhängigen Anmeldungen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung werden dotiertes Silizium zum Erhitzen und Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen eingesetzt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht mehrere bzw. verschiedene Parameter, wie das gleichzeitige Anpassen der Detektionsfenstergröße, der Situ-Detektion, der Reaktionsvolumina, der thermischen Einheitlichkeit und der Erhitzungs- und Abkühlraten. Darüber hinaus ermöglicht sie den Einsatz großer Anordnungen einzelner Reaktionskammern für eine Mikroreaktionseinheit mit hohem Durchsatz.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte chemische Reaktionskammer vorzusehen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Muffenvorrichtung auf Siliziumbasis für chemische Reaktoren bereitzustellen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine chemische Reaktionskammer bereitzustellen, die den Einsatz von dotiertem Polysilizium und Bulk-Silizium kombiniert.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, chemische Reaktionskammern bereitzustellen, die den Einsatz von dotiertem Polysilizium und Bulk-Silizium kombinieren, um eine Flexibilität in Bezug auf die thermischen und optischen Eigenschaften vorzusehen, so dass eine Implementierung in kleinen und großen Instrumenten ermöglicht wird.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Reaktionsmuffe auf Siliziumbasis bereitzustellen, welche ein kritisches Verhältnis von Silizium und Siliziumnitrid zu dem Volumen des zu erhitzenden Materials (z.B. Flüssigkeit) kombiniert, um eine einheitliche Erhitzung bei niedriger Leistungsaufnahme vorzusehen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Reaktionsmuffe auf Siliziumbasis bereitzustellen, welche das Einführen einer sekundären Rohrleitung bzw. Röhre (z.B. aus Kunststoff) in die Reaktionsmuffe ermöglicht, welche die Reaktionsmischung enthält, wodurch etwaige potenzielle Materialunverträglichkeitsaspekte abgeschwächt werden.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Anordnung einzelner Reaktionskammern für eine Mikroreaktionseinheit mit hohem Durchsatz bereitzustellen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, ein handgehaltenes Instrument bereitzustellen, das muffenartige Reaktionskammern auf Siliziumbasis mit integrierten Heizeinrichtungen verwendet.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Reaktionskammer mit einer automatisierten Detektion und Regelung bereitzustellen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Reaktionsregelung bzw. Reaktionssteuerung in einer Reaktionskammer durch eine künstliche Intelligenz vorzusehen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine Impulsbreitenmodulation als Regelung für die Reaktionskammer bereitzustellen.
- Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen deutlich. Im Wesentlichen handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um eine Muffe auf Siliziumbasis für chemische Reaktionen. Die Erfindung umfasst eine chemische Reaktionskammer, die den Einsatz von Polysilizium zum Erhitzen und von Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen kombiniert. Die Reaktionsmuffe kombiniert ein kritisches Verhältnis von Silizium und Siliziumnitrid zu dem Volumen des zu erhitzenden Materials, so dass eine einheitliche Erwärmung bzw. Erhitzung bei gleichzeitig geringer Leistungsaufnahme vorgesehen wird. Die Reaktionsmuffe ermöglicht ferner das Einführen einer sekundären Rohrleitung in diese, welche die Reaktionsmischung aufweist, wodurch etwaige potenzielle Inkompatibilitätsaspekte abgeschwächt werden. Die Vorliegende Erfindung ist eine Erweiterung des vorstehend bereits genannten integrierten mikrogefertigten Reaktors aus dem vorstehend genannten U.S. Patent US-A-5,639,423. Die Muffenreaktionskammer auf Siliziumbasis kann in chemischen Reaktionssystemen zur Synthese und Verarbeitung organischer, anorganischer oder biochemischer Reaktionen verwendet werden, wie etwa der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder von DNA-Reaktionen (wie etwa der Ligose-Kettenreaktion) oder von anderen synthetischen Reaktionen auf der Basis von Wärmewechseln.
- KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
- Es zeigen:
-
1 eine Perspektivansicht im teilweisen Aufriss eines mikrogefertigten chemischen Reaktionsinstruments, das in einer Stromversorgungs-/Regelungsvorrichtung angebracht ist; -
2 eine schematische Ansicht des Reaktionsinstruments aus1 ; -
3 eine schematische Ansicht einer Heiz- und Detektionsanordnung für eine mikrogefertigte Reaktionskammer; -
4 ein Ausführungsbeispiel einer mikrogefertigten Muffenreaktionskammer auf Siliziumbasis, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist; -
5 eine Anordnung der Muffenreaktionskammern aus4 , die funktionsfähig mit einer Mikroelektrophoreseanordnung verbunden sind; -
6 eine vergrößerte Endansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels einer Muffenmikroreaktionskammer aus4 ; -
7 ein Querschnittsausführungsbeispiel eines vergrößerten Bereichs aus6 unter Verwendung eines festen Fensters mit isolierter Heizeinrichtungsversion; -
8 eine Querschnittsansicht eines anderen Ausführungsbeispiels des gleichen vergrößerten Bereichs aus6 unter Verwendung eines variablen Fensters mit einer nicht-isolierten Heizeinrichtung; -
9 eine Ansicht eines handgehaltenen Instruments (PCR Man), das die Reaktionskammern aus6 als Einsätze zur Reaktionsveränderung verwendet; - die
10A und10B das Wärmezyklusinstrument unter Verwendung mehrerer hundert einzeln geregelter Mikroreaktionskammern auf Siliziumbasis; -
11 eine schematische Darstellung eines Systems mit hohem Durchsatz zur DNA-Verstärkung, Probenhandhabung und Elektrophorese; -
12 ein Ausführungsbeispiel eines Einsatzes/einer Auskleidung für eine Reaktionskammer mit einem optischen Fenster, wobei die Oberseite/die Abdeckung offen ist; -
13 das externe Füllen eines Einsatzes/einer Auskleidung einer Reaktionskammer; -
14 immobilisierte Reagenzien/Proben zur Detektion spezifischer Produkte direkt an Fenstern oder in einem Reaktionsfluid, die unter Verwendung eines "Teststreifens" optisch in dem handgehaltenen Instrument (PCR Man) aus9 detektiert werden; - die
15 und16 eine schematische Darstellung optischer Detektionssysteme zur Verwendung in Verbindung mit den Mikroreaktionskammern aus6 ; -
17 eine schematische Darstellung des Einsatzes der integrierten Detektion für ein Regelungssystem mit künstlicher Intelligenz; -
18 ein Diagramm der elektrochemischen Oxidations- und chemischen Reduktionsreaktionen für Tris(2,2'bipyridyl)Ruthenium(II)(TBR) und Tripropylamin (TPA); -
19 ein Verfahren zur Etikettierung und Separation von DNA zur Detektion und Quantifizierung durch Elektrochemilumineszenz (ECL); -
20 eine Ansicht der Zellenspannung und der ECL-Intensität versus der Zeit, wobei die Spannung erst ansteigt und danach zurückgeht; -
21 ein Ausführungsbeispiel einer mikrobearbeiteten ECL-Zelle mit einer Dünnfilmanode und einem zugeordneten Photodiodendetektor; -
22 eine vergrößerte Querschnittsansicht der ECL-Zelle aus21 mit elektrischen Zuleitungen; - die
23 bis30 das Fertigungsverfahren zur Erzeugung einer ECL-Zelle, wie dies in der Abbildung aus21 dargestellt ist; und -
31 ein Ausführungsbeispiel unter Verwendung von Al auf ITO auf Glas, wodurch der Widerstand der ITO-Elektrode reduziert wird. - GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
- Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine mikrogefertigte Muffenkammer auf Siliziumbasis für chemische Reaktionen gemäß dem gegenständlichen Anspruch 1, wobei die Kammer Heizeinrichtungen bzw. Heizelemente kombiniert, wie etwa dotiertes Polysilizium zum Erhitzen und Bulk-Silizium zum Kühlen. Die Mikroreaktionskammern können in einer Anordnung für eine Mikroreaktionseinheit mit hohem Durchsatz oder in einer handgehaltenen Einheit verwendet werden. Diese kombiniert ein kritisches Verhältnis von Silizium und Siliziumnitrid zu dem Volumen des zu erhitzenden Materials (z.B. Flüssigkeit), um eine einheitliche Erwärmung bei gleichzeitig geringer Leistungsaufnahme bereitzustellen. Ferner ermöglicht dies die Einführung einer sekundären Rohrleitung (z.B. Kunststoff) in die Reaktionsmuffe, welche die Reaktionsmischung aufweist, wodurch etwaige potenzielle Materialunverträglichkeitsaspekte abgeschwächt werden. Die vorliegende Erfindung verwendet eine spezielle Geometrie von Mikroreaktoren auf Siliziumbasis, die sich in Bezug auf den Leistungsverbrauch und die Einheitlichkeit der Temperatur als sehr effizient erwiesen haben. Das spezielle Ausführungsbeispiel des beschriebenen mikrogefertigten Reaktors wurde experimentell als Wärmezyklusinstrument zur Verwendung in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anderen chemischen Reaktionen eingesetzt, und dabei hat es sich als gegenüber den aktuell im Handel erhältlichen Instrumenten an thermisch gesteuerten chemischen Reaktoren als überlegen erwiesen. Die erfindungsgemäße Muffenreaktionskammer auf Siliziumbasis kann an Stelle der Reaktionskammer des mikrogefertigten Systems aus der oben genannten, gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Anmeldenummer 07/938,106 und in Verbindung mit der integrierten Heizeinrichtungs- und Detektionsanordnung der oben genannten, gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 08/(IL-9121) eingesetzt werden, und sie stellt somit eine Erweiterung der mikrogefertigten chemischen Reaktionssysteme aus diesen gleichzeitig anhängigen Anmeldungen dar.
- Zur Vermittlung eines umfassenden Verständnisses eines mikrogefertigten Instruments für chemische Reaktionen und der integrierten Heiz-/Detektionsanordnung erfolgt vor der Beschreibung des Ausführungsbeispiels der Muffenreaktionskammer gemäß der vorliegenden Erfindung eine Beschreibung eines mikrogefertigten chemischen Reaktors und einer integrierten Heiz-/Detektionsanordnung der beiden vorstehend genannten gleichzeitig anhängigen Anmeldungen.
- Die Abbildung aus
1 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel eines mikrogefertigten Instruments für chemische Reaktionen, das allgemein mit der Bezugsziffer10 bezeichnet ist, wobei darüber ein ausgesparter Bereich, allgemein mit der Bezugsziffer11 bezeichnet, in einem Stromversorungs-/Regelungssystem des mikrogefertigten Reaktionsinstruments, allgemein mit der Bezugsziffer12 bezeichnet, dargestellt ist. Eine hyperdermische Nadel13 ist abgebildet, welche eine Probe durch ein Silikongummifenster14 in das Reaktionsinstrument10 einführt. Die Reaktion wird geregelt und versorgt durch: eine Induktionskopplung bzw. Induktionskupplung, wie etwa zwischen der Spule LCL in dem Instrument10 und einer Magnetspule15 ; durch kapazitive Kopplung, wie etwa zwischen den Platten des Kondensators C3 und den Platten16 und17 ; und durch elektromagnetische Kopplung zwischen einer Resonanzschaltung, siehe2 , in einem Instrument10 und einer Funkfrequenzantenne18 . - Die Abbildung aus
2 zeigt eine schematische Ansicht des Instruments10 aus1 und umfasst drei Reagenzienkammern29 ,20 und21 , die zum Beispiel DNA-Primer, die Polymerase und die Nukleotide und etwaige Detektions-Etikettierungsmoleküle wie etwa Magnetkügelchen aufweisen können. Das Ziel-DNA-Molekül wird in der Reagenzienkammer19 platziert, indem eine hypodermische Nadel13 (1 ) oder dergleichen durch ein Fenster14 aus Silikongummi oder aus einem andersartigen Material eingeführt wird. Die Reagenzienkammern19 ,20 und21 sind entsprechend durch Kanäle22 ,23 und24 mit schmalen bzw. engen Mittelabschnitten, die nicht abgebildet sind, mit einer Reaktionskammer25 verbunden. Für gewöhnlich weisen die Kammern19 bis21 und25 ein Volumen auf, das im Bereich von Mikrolitern bis Nanolitern liegt. Die Kanäle22 bis24 sind mit entsprechenden Lambwellenpumpen LW1, LW2 und LW3 ausgerüstet, die dazu dienen, Reagenzien in den Kammern19 bis21 durch die Kanäle22 bis24 in Richtung der Pfeile in die Reaktionskammer25 zu pumpen. Die Lambwellenpumpen können an jeder Wand oder an mehreren Wänden der Kanäle22 bis24 angeordnet sein. Die Lambwellenpumpen LW1, LW2 und LW3 sind entsprechend mit den Kondensatoren C1, C2 und C3 verbunden. Die Oberflächenspannung an den schmalen bzw. engen Mittelabschnitten der Kanäle22 bis24 verhindert es, dass Reagenzien in den Kammern19 bis21 in die Reaktionskammer25 fließen, bevor das Pumpen eingeleitet wird. Die inneren Oberflächen der Kanäle22 bis24 können so behandelt werden, dass sie die Oberflächenspannung erhöhen, wodurch der Fluss der Reagenzien weiter behindert wird, wenn die Lambwellenpumpen nicht aktiviert sind. - Die Reaktionskammer
25 kann mit einem Lambwellen-Messwandler LWC und einer Heizeinrichtung bzw. einem Heizer HC ausgerüstet sein. Der Lambwellen-Messwandler LWC ist mit einem Induktor LCL (in der Abbildung aus1 ebenfalls abgebildet) verbunden sein. Die Heizeinrichtung HC ist mit einem Resonanzkreis verbunden, der aus einem Induktor LCH und einem Kondensator CCH besteht. Der Lambwellen-Messwandler LWC fungiert als Rührvorrichtung, Mischer oder sonochemischer Induktor, wie dies durch die verbundenen Pfeile26 in der Kammer25 dargestellt ist. - Ein Kanal
27 verbindet die Reaktionskammer25 mit einer Detektionskammer28 . Der Kanal27 ist mit einer Lambwellenpumpe LWDP versehen, die mit einem Resonanzkreis verbunden ist, der aus einem Induktor LDP und einem Kondensator CDP besteht. Die Detektionskammer28 ist mit einem Lambwellensensor LWD ausgestattet, der mit einem Kondensator CD verbunden ist. - Die Lambwellen-Messwandler weisen hohe mechanische Q-Werte auf und können somit nur innerhalb eines eng begrenzten Bereichs von Wechselstromspannungsfrequenzen betrieben werden. Die Lambwellenpumpen (LW1, LW2, LW3) und der Lambwellensensor (LWD) werden kapazitiv betrieben, indem ein elektrisches Feld zwischen den Platten (wie etwa den Platten
16 und17 aus1 ) auf Resonanzfrequenzen der Lambwellen-Messwandler (LW1, LW2, LW3) erzeugt wird. Da die Messwandler jedoch hohe Q-Werte aufweisen, schwingt der Messwandler nur dann mit einer größeren Magnitude, wenn die Frequenz des erzeugten Felds nahe der Resonanzfrequenz eines Messwandlers liegt. In ähnlicher Weise ist der Lambwellen-Mischkammermesswandler LWC mit einem Wechselfrequenz-Magnetfeld versehen, das durch die Spule (in1 mit15 bezeichnet) auf der mechanischen Resonanzfrequenz des Messwandlers LWC erzeugt wird. Die Heizeinrichtung HC und die Lambwellenpumpe LWDP werden aktiviert, indem eine elektromagnetische Welle von der Antenne (in der Abbildung aus1 mit18 bezeichnet) zu dem Resonanzkreis CCH und LCH und entsprechend zu dem Resonanzkreis CDP und LDP geführt wird. Die Frequenz der einfallenden elektromagnetischen Strahlung muss der mechanischen Resonanzfrequenz des Messwandlers LWDP entsprechen, um die Pumpe LWDP zu aktivieren. Die Frequenz der einfallenden elektromagnetischen Strahlung muss der Resonanzfrequenz der elektrischen Elemente CH, LCH und HC entsprechen, um die Heizeinrichtung HC zu aktivieren. - Eine PCR-Reaktion wird zum Beispiel eingeleitet, indem die Reagenzien in der Kammer
19 ,20 und21 in die durch die Pfeile angezeigten Richtungen durch die entsprechenden Kanäle22 ,23 und24 zu der Reaktionskammer25 gepumpt werden, indem die Pumpe LW1, LW2 und LW3 aktiviert wird. Danach wird eine Reihe von zum Beispiel etwa zwanzig bis vierzig Wärmezyklen eingeleitet, und während jedem Zyklus ändert sich die Temperatur der Reagenzien in der Reaktionskammer25 zum Beispiel von 55°C auf 96°C und zurück auf 55°C. Die Temperatur der Reaktionskammer wird durch die Leistung des einfallenden elektromagnetischen Signals auf der Frequenz bestimmt, die der Resonanzfrequenz der Schaltung entspricht, die sich aus dem Kondensator CCH und dem Induktor LCH in Verbindung mit der Heizeinrichtung HC zusammensetzt. Die Lambwellenvorrichung LWC der Reaktionskammer25 fungiert als Rührvorrichtung oder Mischer, wie dies durch die Pfeile26 dargestellt ist, um die Reagenzien zu mischen und die Reaktion zu fördern. - Wenn die Temperaturwechselbeanspruchung abgeschlossen ist, wird der Inhalt der Reaktionskammer
25 durch die Lambwellenpumpe LWDP durch den Kanal27 in die Richtung des Pfeils zu der Detektionskammer28 gepumpt, welche einen Lambwellensensor LWD verwendet. Alternativ kann die Detektionskammer28 mit einem optischen Fenster bzw. einem Sichtfenster versehen sein, und wobei Tests durch optische Fluoreszenz- oder Absorptions-Spektroskopie ausgeführt werden können. - Die Abbildung aus
3 veranschaulicht eine Heiz-/Detektionsanordnung, die in den mikrogefertigten Reaktor aus den Abbildungen der1 und2 integriert werden kann. Wie dies in der Abbildung aus3 dargestellt ist, ist eine chemische Reaktionskammer, wie etwa eine PCR-Kammer eines miniaturisierten, mikrogefertigten Instruments, das allgemein mit der Bezugsziffer30 bezeichnet ist, im Querschnitt dargestellt, wobei die Kammer31 in einem Gehäuse32 ausgebildet ist, das zum Beispiel aus Pyrex besteht, und wobei darin Siliziumeinsätze33 und34 vorgesehen sind, mit einem Einlass35 und einem Auslass36 . Die Energie von zwei unterschiedlichen Energiequellen (Lichtquellen) wird auf das Gehäuse32 gerichtet, wobei es sich bei einer Quelle37 um eine Infrarotquelle (IR-Quelle) und bei der zweiten Quelle38 um eine Ultraviolettquelle (UV-Quelle) handelt. Die IR-Quelle17 führt die Hitze einheitlicher durch die Masse der Lösung in der Kammer31 zu. Die UV-Quelle18 induziert Fluoreszenz der Reaktionsprodukte in dem sichtbaren (Vis) Spektrum, die von einem sichtbaren (Vis) Detektor39 detektiert werden kann, der sich außerhalb des Gehäuses32 befindet, das die Reaktionskammer begrenzt. Das Gehäuse32 muss aus einem für UV-Strahlung und/oder das sichtbare Spektrum transparentem Material bestehen. Durch die Integration eines integrierten Erregungs-(Erhitzungs-) und Detektionssystems direkt in die Reaktionskammer, kann das Vorhandensein einer Problem in der Reaktionskammer bestätigt werden, und die dualen Reaktions- und Detektionskammern25 und28 des mikrogefertigten Reaktors aus2 können konsolidiert werden, wodurch die Fertigungskosten durch eine Reduzierung der Komponenten gesenkt werden können. - Die vorliegende Erfindung, ein Ausführungsbeispiel welcher allgemein in den Abbildungen der
4 und5 veranschaulicht ist, umfasst einen mikrogefertigten Reaktor, der allgemein mit der Bezugsziffer40 bezeichnet ist, der eine Muffe auf Siliziumbasis als eine chemische Reaktionskammer aufweist, die allgemein mit der Bezugsziffer41 bezeichnet ist, bestehend aus zwei verbundenen Siliziumteilen, und wobei dotiertes Polysilizium zur Erhitzung und Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen verwendet werden, wie dies nachstehend im Text näher beschrieben ist. Die Muffe41 weist einen Schlitz oder eine Öffnung42 auf, in den bzw. in die Reaktionsfluid, das mit der Bezugsziffer43 bezeichnet ist, über eine hypodermische Nadel44 in die Reaktionskammer eingeführt wird, oder in den bzw. die eine sekundäre Rohrleitung45 , die eine Reaktionsmischung46 aufweist, eingeführt werden kann. Die Rohrleitung wird zum Beispiel aus Kunststoff oder einem anderen Material hergestellt, das in Bezug auf die Reaktionsmischung inert ist, wodurch etwaige potenzielle Materialunverträglichkeitsprobleme abgeschwächt werden. Die Muffe ist ferner mit einer Öffnung47 versehen, die sich an einem optischen Fenster48 befindet, das zum Beispiel aus Siliziumnitrid, Siliziumdioxid oder Polymeren besteht. Die Siliziummuffenreaktionskammer41 weist dotiertes Silizium zum Erhitzen und Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen auf und kombiniert ein kritisches Verhältnis von Silizium und Siliziumnitrid mit dem Volumen des zu erhitzenden Materials (z.B. Flüssigkeit), um eine einheitliche Erwärmung bzw. Erhitzung vorzusehen, bei gleichzeitig niedriger Leistungsaufnahme. - Die Abbildung aus
6 zeigt eine vergrößerte Ansicht einer Mikroreaktionskammer, ähnlich dem Ausführungsbeispiel aus4 , wobei jedoch zwei Fenster verwendet werden. Die Reaktionskammer aus6 , die allgemein mit der Bezugsziffern50 bezeichnet ist, besteht aus zwei Silizium-Halbleiterscheiben bzw. Wafern oder Substraten51 und52 , die miteinander verbunden sind, wie dies unter53 dargestellt ist, und mit einer Konfiguration, so dass darin ein Schlitz oder eine Öffnung54 definiert wird. Jeder der Wafer51 und52 weist eine Schicht aus Siliziumnitrid51' und52' auf, die ein Fenster definieren, die allgemein unter55 und56 entsprechend abgebildet sind. Das Fenster55 in dem Wafer51 aus Siliziumnitrid ist mit einer Heizeinrichtung57 versehen, die elektrische Zuleitungen58 und Kontakte59 Aufweist, die sich entlang der Kanten der Heizeinrichtung57 erstrecken, um eine einheitliche Erhitzung vorzusehen. Das Fenster56 in dem Wafer52 weist eine in der Abbildung aus6 nicht abgebildete Heizeinrichtung auf, die jedoch durch die Metallkontakte60 und61 gesichert ist, wie dies entsprechend in den Abbildungen der7 und8 dargestellt ist. Die Siliziumnitridschichten51' und52' sind sehr dünn (etwa 1 μm) und werden auf die Wafer51 und52 aus Bulk-Silizium aufgedampft. Das Siliziumnitrid wird nur dann zu einem Fenster gemäß der Darstellung unter55 und56 , wenn die Bulk-Siliziumwafer51 und52 zur Gestaltung der Öffnung oder des Schlitzes54 weggeätzt werden. Die Heizeinrichtung57 ist transparent zum Beispiel in Bezug auf durch das Fenster55 tretende Energie. - Die Abbildung aus
7 zeigt eine stark vergrößerte Ansicht eines Ausführungsbeispiels eines Abschnitts des Siliziumwafers52 und des Fensters56 , wie dies durch den Kreis62 aus6 dargestellt ist. Wie dies aus der Abbildung aus7 ersichtlich ist, umfasst der Abschnitt des Siliziumwafers52 , der unter63 dargestellt ist, Bulk- oder einkristalliges Silizium und befindet sich in Kontakt mit einer Niederbelastungs-Siliziumnitridmembran (100 bis 500 MPa) oder dem Fenster64 (52' in6 ), das sich wiederum in Kontakt mit einer dotierten Polysilizium-Heizeinrichtung65 und dem Metallkontakt60 und61 steht. Das Ausführungsbeispiel aus7 umfasst ein festes Fenster in der Version mit isolierter Heizeinrichtung. - Die Abbildung aus
8 zeigt eine stark vergrößerte Ansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels eines Abschnitts des Siliziumwafers52 und des Fensters56 , wie dies durch den Kreis62 dargestellt ist. Wie dies in der Abbildung aus8 ersichtlich ist, bestehen die Abschnitte des Siliziumsubstrats52 , wie dies unter66 dargestellt ist, aus Bulk- oder Einkristall-Silizium. Wie in dem Ausführungsbeispiel aus7 befindet sich ein Niederbelastungs-Siliziumnitridelement (100 bis 500 MPa) oder Fenster69 (52' in6 ) in Kontakt mit dem Siliziumabschnitt66 , wobei sich eine dotierte Polysilizium- Heizeinrichtung70 in Kontakt mit der Fenstermembran69 befindet, und wobei Metallkontakte71 an der Heizeinrichtung70 angebracht sind. Das Ausführungsbeispiel aus8 umfasst eine nicht-isolierte Heizeinrichtungsausführung. Die Fenstergröße im Verhältnis zu der Kammer kann verändert werden, um eine thermische Einheitlichkeit bzw. Gleichmäßigkeit und einen optischen Zugang in die Reaktionskammer zu gewährleisten. - Zum Beispiel können die Siliziumwafer oder Substrate
51 und52 eine Länge von 5 bis 50 mm, eine Breite von 2 bis 10 mm, eine Dicke von 0,1 bis 1,0 mm aufweisen, wobei der Schlitz54 eine Querschnittsfläche von 5 bis 500 mm2 aufweisen kann. Der Schlitz54 , der mit einer sechsseitigen Konfiguration dargestellt ist, kann rund, länglich, quadratisch, rechteckig sein oder eine andere Konfiguration aufweisen. Die Fenster55 und56 können eine Länge von 0,1 bis 1 mm, eine Breite von 0,1 bis 50 mm, eine Dicke von 0,1 bis 10 μm aufweisen und zusätzlich zu dem Siliziumnitrid können sich aus Siliziumdioxid, Silizium oder Polymeren bestehen. Die dotierte Polysilizium-Heizeinrichtung65 aus7 kann eine Dicke zwischen 0,05 bis 5 μm aufweisen, wobei die Heizeinrichtung70 aus8 eine Dicke zwischen 0,05 bis 5 μm aufweisen kann. Die Metallkontakte60 –61 und61' aus den Abbildungen der6 und7 können aus Gold oder Aluminium bestehen, mit einer Dicke von 0,01 bis 5 μm, wobei der Metallkontakt71 aus der Abbildung eine Dicke zwischen 0,01 bis 5 μm aufweisen und aus Gold oder Aluminium bestehen kann. Die Heizeinrichtung57 in dem Siliziumwafer oder Substrat51 besteht aus dotiertem Polysilizium mit einer Dicke zwischen 0,05 bis 5 μm, wobei die elektrischen Zuleitungen und die Kontakte58 und59 aus Gold oder Aluminium bestehen. - Der Einsatz von Bulk-Silizium, Polysilizium und Siliziumnitrid ermöglicht eine Flexibilität im Design in Bezug auf die thermischen und optischen Eigenschaften jeder Kammer. Dies ermöglicht einzeln geregelte, thermisch isolierte Reaktionskammern in einem kleinen Instrument (
9 ) oder in einem großen Instrument (10 ). - Die Abbildung aus
9 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines miniaturisierten, thermischen Zyklen unterliegenden, batteriebetriebenen, handgehaltenen, geregelten Instruments für PCR mit geringer Leistungsaufnahme, das mikrogefertigte Reaktionskammern auf Siliziumbasis verwendet, wie diese etwa in den Abbildungen der4 und6 dargestellt sind, wobei deren Entwicklung die thermische Einheitlichkeit und Temperaturpräzision der Reaktionskammern, Temperaturanstiegsraten der Kammern und die Bioverträglichkeit der sich mit den Reagenzien in Kontakt befindenden Materialien berücksichtigt. - Wie dies in der Abbildung aus
9 dargestellt ist, umfasst das handgehaltene, batteriebetriebene Instrument mit der Bezeichnung "PCR Man", das allgemein unter der Bezugsziffer75 dargestellt ist, eine einschnappende, den elektrischen Kontakt regelnde Halteeinrichtung bzw. ein entsprechendes Gehäuse76 , das zum Beispiel die Abmessungen 3 × 5 Zoll aufweisen kann, mit einer Bedienfeldplatte77 mit verschiedenen Indikatoren, einschließlich einem "Status"-Fenster78 . Die Halteeinrichtung76 ist mit einem thermoelektrischen Regelkreis, einer Heizeinrichungselektronik, einer Computerschnittstelle und einem Stromversorungssteckverbinder versehen, wie dies nachstehend im Text näher beschrieben ist. Die Halteeinrichtung76 ist mit Batterien versehen, wie dies unter79 dargestellt ist, wie etwa mit vier 9-Volt-Batterien, und das obere Ende ist mit Schlitzen80 zur Einführung der Reaktionskammern in der Halteeinrichtung versehen (abgebildet sind drei Schlitze), und in welche Reaktionskammern81 ,82 ,83 und84 auf Siliziumbasis mit integrierten Heizeinrichtungen (gemäß der Abbildung aus6 ) eingefügt werden, wie dies durch den Pfeil85 dargestellt ist. Die Reaktionskammern81 bis84 können im konstruierten Zustand verschiedene Reagenzien oder Chemikalien aufweisen, und sie können selektiv über Schlitze80 in der Halteeinrichtung80 oder dem Regler76 in das handgehaltene Instrument75 eingeführt werden. - Das Instrument kann dazu verwendet werden, schnell und wiederholt geregelte Wärmezyklen für die Reaktionsmischung vorzusehen. Die thermischen Leitfähigkeitseigenschaften des Siliziums oder eines ähnlichen Halbleitersubstrats unterstützen die Beschleunigung der Wärmeanstiegs- und -abfallszeiten und ermöglichen einen Betrieb mit geringer Leistungsaufnahme. Während Silizium in Bezug auf dessen thermische Eigenschaften, d.h. die hohe thermische Leitfähigkeit einzigartig ist, würde eine Kombination aus Silizium, Siliziumnitrid, Siliziumdioxid, Polymeren und anderen Materialien eine Kombination aus thermischer Leitfähigkeit und Isolierung vorsehen, die eine thermische Einheitlichkeit und einen Betrieb mit geringer Leistungsaufnahme bereitstellen würde.
- Das spezielle beschriebene Ausführungsbeispiel, wie etwa aus
6 , eines mikrogefertigten Reaktors kann als Wärmezyklusinstrument zur Verwendung bei der PCR und anderen chemischen Reaktionen, biochemischen Prozessen, mikrobiologischen Verfahren und Inkubatoren eingesetzt werden. Wie dies nachstehend dargestellt ist, ist die erfindungsgemäße Reaktionskammer aktuellen handelsüblichen Instrumenten überlegen, die in thermisch gesteuerten chemischen Reaktionen eingesetzt werden. - Während der experimentellen Verifizierung des Instruments aus
9 und der Mikroreaktionskammern zur Verwendung darin, wie diese etwa in den Abbildungen der4 und6 dargstellt ist, wurden verschiedene Größen von PCR-Reaktionskammerkonfigurationen unter Verwendung von Siliziumverarbeitungsschritten des Typs für integrierte Schaltungen (IS) hergestellt. Das allgemeine Fertigungsverfahren war wie folgt gegeben: Runde Einkristall-Siliziumwafer (SCS-Wafer) mit einem Durchmesser von drei zoll und einer Dicke von 0,5 mm wurden wie folgt verarbeitet: Siliziumnitrid (SixNy) mit geringer Beanspruchung (200 bis 300 MPa) wurde mit niedrigem Druck chemisch aufgedampft (LPCVD) auf den gesamten Wafer (mit einer Dicke von 1,0 bis 2,0 μm). Photolithographische Muster für die Reaktionskammer und folgende Verfahrensschritte wurden in der folgenden Reihenfolge ausgeführt: 1) das Siliziumnitrid wurde über die Fläche der Reaktionskammer reaktiv Ionen geätzt (RIE); 2) Das SCS wurde auf die Rückseite des Siliziumnitrids geätzt, welche das Kammervolumen definiert; 3) der Wafer wurde mit Muster versehen und das Siliziumnitrid chemisch an allen Stellen weggeätzt, mit Ausnahme über der Nitridmembran oder über der gesamten Oberfläche belassen, abhängig von dem Design der Reaktionskammer; 4) die verbleibende Siliziumnitridmembran (die der Kammer gegenüberliegende Seite) wurde LPCVD abgeschieden mit polykristallinem Silizium (Polysilizium) auf eine Dicke von 3000 Å); 5) das Polysilizium wurde danach bei hoher Temperatur mit Bor auf ein Widerstandsvermögen von 50 bis 200 Ohm je Quadrat dotiert; und 6) Dünnfilmmetallkontakte aus Aluminium oder Gold wurden abgeschieden, wobei die Heizeinrichtungsgeometrie definiert wurde. - Jeder Wafer weist potenziell viele Reaktionskammern auf, abhängig von der gewünschten Geometrie und dem gewünschten Volumen. Die geätzte Vertiefung in jedem Wafer bildet eine Hälfte einer dualen Heizeinrichtungs-Reaktionskammer. Die verarbeiteten Wafer werden nacheinander miteinander verbunden, so dass eine eingeschlossene Kammer mit Heizeinrichtungen auf beiden Seien gebildet wird.
- Die Reaktionskammern können miteinander verbunden werden durch das Abscheiden eines dünnen Films eines bei niedriger Temperatur aushärtenden Polyimids direkt zwischen den beiden Wafern oder durch andere Verbindungs- bzw. Bonding-Techniken wie etwa eutektische Metallverbindung. Eine computergesteuerte Siliziumsäge mit hoher Präzision wurde für jedes Design verwendet, um jede duale Heizeinrichtungskammer auszuschneiden. Die Kammern wurden danach wiederholt mit vollentsalztem Wasser gespült und vor der Behandlung mit Silan getrocknet.
- Die Reaktionskammern wurden in eine einschnappende, den elektrischen Kontakt regelnde Halteeinrichtung eingeführt, die Bestandteil der Rückwand der Elektronikkomponenten aus Plexiglas gewesen ist, welche die Steuereinheit bilden. Die Steuerelektronik kann entweder analog oder digital sein und Verfahren wie etwa die Impulsbreitenmodulation als Regelungsmechanismus verwenden. Die Rückwand maß 3 mal 5 Zoll und bestand aus einem thermoelektrischen Temperaturregelkreis, einer Heizeinrichtungselektronik, einer Computerschnittstelle und einem Stromversorgungssteckverbinder. Die Schaltung war für eine Funktionsfähigkeit zwischen 8 und 32 Volt ausgelegt. Eine thermische Kalibrierung wurde durch eine Korrelation der Temperatur des Fluids mit der des das Silizium messenden Thermoelements vom Typ K erreicht. Nach der Kalibrierung eignete sich das Instrument für einen automatisierten, geregelten Wärmezyklusbetrieb ohne direkte Messung des Reaktionsfluids. Die Ausgabe der Wärmezykluseinrichtung geht an einen Apple Centris 650 Computer, der den Wärmezyklus in Echtzeit anzeigt, in Verbindung mit einer Speicherung der akkumulierten Profile. Vier 9-Volt-Batterien waren in der Lage, das Instrument über 2,5 Stunden lang zu betreiben.
- Typische PCRs wurden als vergrößerte Master-Mischungen vorbereitet, um eine Einheitlichkeit unter allen Proben mit Wärmewechselbeanspruchung unter verschiedenen Bedingungen zu gewährleisten. Die Mengen der Reagenzien basierten auf den idealen Werten für 50 μl Reaktionen. Die Master-Mischungen enthielten allgemein folgendes: 50 ml KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5–3,0 mM MgCl2, 200 μM jedes Deoxynukleotids oder 800 μM dNTP insgesamt, 0,5 μM von jeweils zwei Oligonukleotid-Primern, 25 Einheiten/ml AmpliTaq® DNA Polymerase und Ziel-Template in einer spezifizierten Anzahl von Kopien je 50 μl Reaktion. Das Template für einige β-Globin PCRs wurde einem einzelnen DNA-Strang eines M13-Bakteriophag-Klons eines Teils des menschlichen β-Globin-Gens hinzugegeben. Bei dem CF-Template handelte es sich um Doppelstrang-DNA des menschlichen Genoms, abgeleitet aus in Kultur angelegten Zellenreihen HL60, GM07460 oder GM08345. Jede Reaktionsmischung wurde zu gleichen Teilen aus dem Master-Mix aufgeteilt und in dem Instrument gemäß der vorliegenden Erfindung und in einem Perkin-Elmer GeneAmp® 9600 Thermal Cycler Temperaturwechseln unterzogen. Die den Temperaturwechseln unterzogenen Reaktionen aus beiden Temperaturwechselvorrichtungen wurden unter Verwendung eines Tris-Borat-Puffers mit 3% NuSeive, 1% Seakem-Agarose (FMC Corp.) aufgeteilt. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid kontrastiert und unter Bestrahlung mit 302 nm UV-Licht fotografiert.
- Obwohl die Reaktionskammer ursprünglich zur einmaligen Verwendung und Entsorgung vorgesehen war, ermöglichten die solide Beschaffenheit und die stabilen Eigenschaften eine wiederholte Verwendung der Reaktionskammern.
- Das Temperaturwechselinstrument (auf MEMS Basis) gemäß der vorliegenden Erfindung wurde mit einer Vielzahl von PCR-Systemen getestet, einschließlich viralen, bakteriellen und Templates des menschlichen Genoms. Ferner wurden verschiedene Änderungen sowohl in Bezug auf das Design der Reaktionskammer als auch die Steuer- bzw. Regelungsinstrumente implementiert und bewertet. Eine Echtzeitausgabe-Anzeigeeinheit der Steuereinheit eines Temperaturzyklus der mikrogefertigten Temperaturwechselvorrichtung wurde vorbereitet, und es hat sich gezeigt, dass bei einer Eingabe von 15 Volt (durchschnittlich 1,2 Watt) Heizraten von über 5°C/Sek. erreicht werden. Die Abkühlung erfolgt etwas langsamer (2,5°C/Sek.), und zwar großteils aufgrund der Tatsache, dass die Reaktionskammer in einer Instrumententafel aus Plexiglas gehalten wird. Auf den Zieltemperaturen wird eine Präzision der Temperatur von +/– 0,5°C aufrechterhalten. Es wurden auch höhere Heiz- und Kühlraten erreicht.
- Wir haben Experimente ausgeführt, die die quantitative Beschaffenheit des PCR-Verfahrens in der Abbildung aus
9 sowie in handelsüblichen Instrumenten zeigen. Diese Experimente umfassten den Entzug von 5 μL Aliquoten aus 105 Ausgangskopien, β-Globin-PCR aus beiden Instrumenten bei 23, 25, 27, 29 und 31 Zyklen. Diese Aliquote wurden folglich auf einem Agarose-Elektrophoresegel ausgeführt. Die Instrumente beider Instrumente sind praktisch identisch. Die gleiche quantitative Gelelektrophoreseserie ergibt sich aus der Verstärkung des 268-bp-Ziels von β-Globin direkt aus der DNA des menschlichen Genoms (HL60), sofern durchgeführt. - Multiplex-PCR gilt als eine der aktuellsten und analytisch leistungsfähigsten DNA-Amplifikationstechniken. Sie erfordert eine präzise und einheitliche Temperaturregelung in der Reaktionskammer. Wir haben dies mit dem Instrument gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht.
- Die Post-PCR-Detektion bestimmter Mutationen, die zum Beispiel der Erkrankung der zystischen Fibrose (CF) zugeordnet sind, kann mit einfachen Teststreifen auf Nylonbasis unter Verwendung der Reverse Dot Blot-Technologie identifiziert werden kann. Der Teststreifen weist bestimmte, immobilisierte DNA-Sonden auf, welche die relevante Mutationssequenz aufweisen. Die Multiplex-PCR-Amplifikationsprodukte werden gemeinsam mit der Probe in einen einfachen Reagenztrog gegeben. Wenn eine Bindung erfolgt und die DNA nach einem Spülungsschritt erhalten wird, wechselt der DNA-Biotin-Streptavidin-Enzym-Komplex nach der Behandlung mit dem Substrat seine Farbe. Die kommerziellen und gemäß der Abbildung aus
9 instrumental amplifizierten Ergebnisse der PCR waren gefolgt von einer Reverse Dot Plot-Analyse, vorbereitet für eine CF. - Aus den Ergebnissen der vorstehend aufgeführten Experimente und der vorstehenden Ergebnisse in Bezug auf die vorsehend genannten gleichzeitig anhängigen Anmeldungen mit einseitigen Heizeinrichtungen können Reaktionskammern auf Siliziumbasis verschiedener Größen und Konfigurationen chemische Reaktionen wie etwa eine PCR mit geringerer Leistungsaufnahme ausführen.
- Die Signifikanz der oben genannten experimentellen Ergebnisse ist es, dass zum ersten Mal in einem Instrument gemäß der Abbildung aus
9 zum ersten Mal eine batteriebetriebene, handgehaltene PCR-Amplifikation und eine einfache, auf Reagenzien basierte Zieldetektion komplexer Biologika und Erkrankungen ausgeführt werden können. - Die schnellen Temperaturwechsel und die thermische Einheitlichkeit, die jetzt in einer PCR-kompatiblen Mikroreaktionskammer auf Siliziumbasis möglich sind, können Einblicke in die Hybridisierung und die Enzymkinetik geben. Zum Beispiel ist die Bedeutung der Temperaturregelung in dem PCP-Verfahren von höchster Bedeutung, im Besonderen dann, wenn komplexe Systeme verstärkt werden sollen (z.B. die DNA des menschlichen Genoms, Multiplex-Amplifikationen). Die präzise Temperaturregelung und die thermische Einheitlichkeit müssen ausgeglichen sein. Für eine echte Miniaturisierung des Instruments oder die Nutzung mikrogefertigter Reaktionskammern zur Gestaltung eines Instruments mit hohem Durchsatz gemäß den Abbildungen der
10A ,10B und11 müssen die Regelungs- bzw. Steuerungselemente Einheit für Einheit integriert werden. Die thermischen Eigenschaften der verschiedenen verwendeten Materialien müssen ebenfalls ausgeglichen werden, um eine effiziente Regelung mit thermischer Zuverlässigkeit zu kombinieren. Materialien auf Siliziumbasis sehen die erforderlichen thermischen Eigenschaften vor, die Möglichkeit zur Integration von Heizeinrichtungen und einer Regelung, und deren Fertigung nutzt den Vorteil der in hohem Maße parallelen, automatisierten und in Chargen zusammengefassten Verarbeitung. - Die Abbildungen der
10A –10B und11 veranschaulichen einen Systemansatz, der eine Kombination aus einem Wärmezyklusinstrument mit hohem Durchsatz und hoher Effizienz mit einem Probenhandhabungs- und Elektrophoresemodul vorsieht. Das Elektrophoresemodul kann auch in Glas oder Silizium mikrobearbeitet werden. Das Instrument kann hybrid sein, d.h. eine Reaktionskammer auf Siliziumbasis und ein Miniglas-Elektrophoresemodul, das beide Substrate oder Elemente nutzt, wie dies in dem Ausführungsbeispiel aus5 der Fall ist. Der Vorteil einer Detektion der DNA-Produktion in Echtzeit ist es, dass die Bedienungsperson während der Reaktion Kenntnis über die PCR-Effizienz hat und nicht darauf warten muss, die Ergebnisse auf einem Gel zu sehen. Dies unterstützt die DNA-Klassifizierungsproduktivität, indem keine Zeit verschwendet wird für den Verlauf von Elektrophoresegels auf nicht verstärkten Proben. - Die Abbildungen der
10A und10B veranschaulichen ein Wärmezyklusinstrument, das allgemein mit der Bezugsziffer90 bezeichnet ist, mit einem Gehäuse91 mit einer Frontplatte92 mit verschiedenen darauf vorgesehenen Indikatoren bzw. Anzeigen, einschließlich eines "Status"-Fensters93 , wobei die Frontplatte bzw. das Bedienfeld dem Bedienfeld des handgehaltenen Instruments aus9 ähnlich ist. Das Gehäuse weist eine Oberseite94 mit Scharnier auf, unter der sich eine Anordnung95 (siehe10B ) einzeln geregelter Mikroreaktionskammern96 auf Siliziumbasis befindet, die zum Beispiel dem in den Abbildungen der4 und6 veranschaulichten Typ entsprechen. Das Instrument90 ist für 384 Mikroreaktionskammern95 ausgelegt, obwohl die Anordnung95 gemäß der Abbildung aus10B zur Vereinfachung der Darstellung nur 100 Kammern aufweist. - Die Abbildung aus
11 zeigt eine schematische Darstellung einer DNA-Anwendung mit hohem Durchsatz, der Probenbehandlung und eines Elektrosystems unter Verwendung des Instruments aus den Abbildungen der10A –10B , wobei die entsprechenden Komponenten mit entsprechenden Bezugszeichen bezeichnet sind. Eine Anordnung95' von 384 einzeln geregelten PCR-Reaktionskammern96' (von denen nur fünf abgebildet sind) ist funktionsfähig mit einer automatisierten Probenein- und Ausgabeeinheit verbunden, die allgemein mit der Bezugsziffer97 bezeichnet ist, unter Verwendung von zwei Mikroinjektoren, die allgemein mit98 und99 bezeichnet sind. Die Probenein- und Ausgabefunktion zwischen der Mikroinjektoranordnung98 der Einheit97 und der Anordnung95 ist durch den Doppelpfeil100 dargestellt, während die Funktion zwischen den Anordnungen98 und99 der Mikroinjektoren durch den Doppelpfeil101 angezeigt wird. Die Mikroinjektoranordnung99 ist funktionsfähig mit einer Anordnung102 einzelner Mikroelektrophoresekanäle103 verbunden. Dieses Injektor-Eingabe-Ausgabe-System lädt Reagenzienproben aus den Reaktionskammern96 mit Vakuum oder elektrokinetischer Leistung; die automatisch oder unter Robotereinsatz zu den Elektrophoresekanälen103 befördert wird; und wobei die Reagenzien über Druck oder elektrokinetische Injektion mit umgekehrtem Feld in die Kanäle für eine elektrophoretische Abscheidung entladen werden. Das Elektrophoresemodul kann ebenfalls mikrobearbeitet werden. Silizium eignet sich gut für Reaktionskammern, Glas ist gut geeignet für Elektrophorese. - Die in einem Glassubstrat ausgebildeten Elektrophoresekanäle
103 sind jeweils direkt mit einer Siliziumreaktionskammer der in der Abbildung aus4 dargestellten Art verbunden, so dass eine Anordnung95 von Reaktionskammern96' erzeugt wird, die direkt mit der Anordnung102 der Elektrophoresekanäle103 verbunden sind, wie dies in der Abbildung aus5 dargestellt ist. - Entfernbare/dauerhafte Auskleidungen/Einsätze für die Reaktionskammern aus einem bekannter Maßen mit den entsprechenden Reaktionen kompatiblem Material, wie dies etwa in der Abbildung aus
12 dargestellt ist, reduzieren in bestimmen Anwendungen die Kosten insgesamt, da diese Auskleidungen/Einsätze entsorgt werden können. Ebenfalls berücksichtigt werden Derivatisierungsmittel für die Oberflächen der Reaktionskammer auf Siliziumbasis, um die kovalente und/oder sonstige Bindung mit den Auskleidungen zu verbessern. Beispiele dafür sind organische/reaktive Silane, Polyimide, Teflonarten, Polyethylen und sonstige Polymere. - Die Abbildung aus
12 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel eines Einsatzes/einer Auskleidung, allgemein durch die Bezugsziffer105 dargestellt, für eine Reaktionskammer mit einem darin vorgesehenen optischen Fenster106 . Der Einsatz/die Auskleidung105 weist ein sechsseitiges Gehäuse107 und eine Oberseite/Abdeckung108 auf. Das sechsseitige Gehäuse107 ist zum Beispiel so konfiguriert, dass es in die Öffnung54 der Reaktionskammer50 des Ausführungsbeispiels aus6 eingeführt werden kann, so dass das Fenster106 mit einem der Fenster55 oder56 aus6 ausgerichtet ist. Das Gehäuse107 kann aus Kunststoff oder einem anderen vorstehend ausgeführten kompatiblen Material gestaltet sein. Das Fenster106 des Einsatzes/der Auskleidung105 weist einen Teststreifen109 auf, wie dies nachstehend in Bezug auf die Abbildung aus14 beschrieben wird. - Die Abbildung aus
13 veranschaulicht die externe Befüllung des Einsatzes/der Auskleidung105 der Reaktionskammer aus12 über eine externe interfluide Verbindung, wie dies allgemein unter110 dargestellt ist. - Beispiele für fluide Verbindungen sind: Spritzennadeln, Pipettenspitzen und Quarzglaskapillare oder Glas- oder Polymerschläuche bzw. -rohrleitungen.
- Die Oberflächenimmobilisierung der Fenster (oder Teststreifen) mit Sonden für die optische oder sonstige Detektion (andere mikrobasierte Detektionen) der Produktherstellung und Spezifikation kann gemäß der Abbildung aus
14 vorgesehen werden, die eine vergrößerte Ansicht des Teststreifens109 aus12 darstellt. Ein derartiger Teststreifen kann in den Fenstern der Reaktionskammern aus den Abbildungen der4 oder6 enthalten sein. Immobilisierte Reagenzien/Sonden bzw. Proben für die Detektion spezifischer Produkte direkt an dem Fenster wie etwa106 aus12 oder in dem Reaktionsfluid in dem Einsatz/der Auskleidung105 der Auskleidung aus12 können optisch in dem handgehaltenen Instrument PCR Man aus9 unter Verwendung des Teststreifens109 detektiert werden. Die tatsächliche innere Oberfläche des Fensters kann als eine Immobilisierungsoberfläche für spezielle Ziel- oder Produktdetektionssonden verwendet werden, oder das Fenster kann zur Ansicht der Immobilisierungs-/Detektionsoberfläche in der Kammer verwendet werden. - Die Abbildungen der
15 und16 veranschaulichen schematisch zwei Einrichtungen für die optische Detektion. Die Einrichtung aus15 ist eine Laser-/CCD-Version, während die Einrichtung aus16 einen Niederleistungsbetrieb zur Implementierung in dem PCR Man (handgehaltenes Instrument) aus9 ermöglicht. - Wie dies in der Abbildung aus
15 dargestellt ist, weist diese optische Detektionsanordnung für eine Reaktionskammer120 mit einem Fenster121 und einer Steuerelektronik122 einen optischen Filter123 auf, wie etwa einen Interferenzfilter oder einen Bandpassfilter zum Weiterleiten der relevanten Detektionswellenlänge, eine CCD124 , ein digitalisiertes Bild, das allgemein unter der Bezugsziffer125 dargestellt ist, eine Fokussierungsoptik126 , einen Reflektor/Splitter127 und einen Argon-Ionenlaser128 . Der Betrieb ist wie folgt gegeben: Der Laser erregt den fluoreszierenden Indikatorfarbstoff, der der Produktdetektion zugeordnet ist. Das fluoreszierende Signal wird durch die CCD124 überwacht. Die Absorptionsspektroskopie kann ebenso verwendet werden. - Die Abbildung aus
16 zeigt ein miniaturisiertes optisches Detektorsystem für die Reaktionskammer120' mit einem Fenster121' und einer Steuerelektronik122' , welche aus zwei Filtern130 und131 besteht, mit einem Festkörperdetektor bzw. einem monolithischen Detektor132 und eine blauen LED133 . Die Filter130 und131 entsprechen entweder einer Bandpass- oder Langpassversion für die Auswahl der Emission (d.h. 600 nm Langpass) und Bandpass für die Auswahl der relevanten Erregungswellenlänge wie etwa 488 nm +/– 10 n. Der Erregungsbandpass kann zum Beispiel zur Auswahl aus der kennzeichnenden breiten Emission einer LED verwendet werden. Der Betrieb des Detektionssystems aus16 ist wie folgt gegeben: Die LED wird auf 488 +/– 10 nm gefiltert, als Erregungsquelle (oder Absorption) für den Fluoreszenz anzeigenden Farbstoff. Der Festkörperdetektor wird ebenfalls gefiltert, um nur die Wellenlängen der Detektion (> 600 nm) zu empfangen oder als Absorptionsdetektor. - Künstliche Intelligenz ist eine Möglichkeit zur Erzeugung von DNA und um zu bestimmen, wie viele Zyklen noch ausstehen, wenn die Erzeugung abgeschlossen ist, ob sie funktioniert hat, welche Parameter angepasst werden müssen, um die Produktion zu verbessern, etc. Unter Verwendung eines Echtzeit-Detektionssystems, wie dies in der Abbildung aus
17 schematisch dargestellt ist, kann ein Rückkopplungssystem mit künstlicher Intelligenz unter Verwendung einer integrierten Detektierung bereitgestellt werden. Das System aus17 umfasst eine Reaktionskammer135 mit einem Fenster136 , einen Detektor137 für die in Situ Detektierung einer DNA-Produktion, eine Instrumentenregelung138 für die Reaktionskammer135 und ein Datenauslesesystem139 , das Daten von dem Detektor137 empfängt, wie dies durch den Pfeil140 angezeigt ist, und Steuerdaten an die Steuereinheit138 vorsieht, wie dies durch den Pfeil141 dargestellt ist. Das Datenauslesesystem139 liefert Information, wie etwa wie viel DNA hergestellt wird, die Ausgangskopienanzahl, dass die Reaktion abgeschlossen ist, etc. Durch Quantifizierung der DNA-Produktion über das optische Überwachungssystem, das allgemein bekannt ist, kann das System seine Zyklus- bzw. Durchlaufzeit und die Zyklusanzahl anpassen, um die erforderliche Mindestanzahl von Zyklen für die Detektion zu erzeugen, wodurch das Verfahren beschleunigt wird. Durch das Bestimmen der erforderlichen Anzahl von Zyklen zum Detektieren eines bestimmten fluoreszierenden Signals oder einer Produktkonzentration wäre das System ferner in der Lage, alles zu berechnen, die Ausgangskopienanzahl oder die Konzentration der unbekannten Ausgangsprobe. Dies würde automatisierte Konzentrationsberechnungen ermöglichen. Quantitative Echtzeitinformationen können es ermöglichen, dass das System die Reaktionsparameter anpasst, wie etwa die Zieltemperaturen, die Haltezeiten und die Anstiegsraten. - Eine mikrogefertigte Elektrochemilumineszenzzelle für die Detektion von amplifizierter DNA ist nachstehend im Text in Bezug auf die Abbildungen der
18 bis31 beschrieben, und wobei darin das Design, die Fertigung und das Testen ausgeführt sind. Die Mikrozelle ist als Detektionseinheit in einem PCR-Mikroinstrument gestaltet, wie dies vorstehend beschrieben und in der Abbildung aus9 dargestellt ist. Die Zelle ist eine vertikale Einheit aus mikrobearbeitetem Silizium und Glas und weist Dünnfilmelektroden auf, wie dies in den Abbildungen der Figuren dargestellt ist. - Die Detektion von DNA durch Elektrochemilumineszenz beginnt mit der DNA-Amplifikation durch PCR, um die Konzentration auf detektierbare Werte zu erhöhen. Danach erfolgt eine Etikettierung mit Tris(2,2'Bipyridyl)Ruthenium(II)(TBR). Oxidiertes TBR luminesziert bzw. leuchtet (Orange) bei Reduktion. Die Oxidation erfolgt elektrochemisch an einer Elektrodenoberfläche, wobei die Lichtemission als Elektrochemilumineszenz (ECL) bezeichnet wird. TBR erfordert ein verhältnismäßig niedriges Oxidationspotenzial (wenige Volt) und weist eine hohe ECL-Effizienz im sichtbaren Bereich auf (620 nm). Dies macht es für Mikrosensoranwendungen attraktiv, da sichtbare Emissionen leicht mit Siliziumfotodioden detektierbar sind, die in eine mikrobearbeitete Siliziumzelle integriert werden können. Die Reduktion kann elektrochemisch oder chemisch erfolgen; in beiden Fällen wird Licht emittiert. Zum Beispiel überträgt oxidiertes Tripropylamin (TPA) leicht ein Elektron in oxdidiertes TBR, woraufhin das TBR eine Chemilumineszenz aufweist. Da beide Oxidationen an der gleichen Elektrode auftreten, können verhältnismäßig große Konzentrationen beider Spezies dicht aneinander erzeugt werden, was zu einer höheren Lichtintensität für eine bestimmte TBR-Konzentration führt, als wenn nur TBR alleine in der Lösung vorhanden ist. Die Reaktionen der elektrochemischen Oxidation und der chemischen Reduzierung für TBR, die an der Anode erfolgen, sind in der Abbildung aus
18 schematisch dargestellt. Die elektrochemische Reduzierung von TBR erfolgt ebenfalls an der Kathode. Zur Oxidation nur der mit TBR etikettierten DNA und nicht des freien TBR ist eine Separierung dieser beiden erforderlich. Eine Möglichkeit dies zu erreichen erfolgt unter Verwendung einer hoch spezifischen Bindung von Immunoproteinen (Antikörper-Antigen). - Ein Beispiel ist in der Abbildung aus
19 dargestellt, wobei ein Biotin-Primer an dem 5' Ende eines Strangs von Ziel-DNA erzeugt wird, und wobei das TBR an dem 5' Ende des komplementären Strangs etikettiert ist. Während dem PCR-Verfahren werden DNA-Doppelstränge mit Biotin und an einem der Enden etikettiertem TBR erzeugt. Die mit Biotin markierte bzw. etikettierte DNA kann danach in eine elektrochemische Zelle mit einer Anode eingeführt werden, deren Oberfläche mit Avidin überzogen ist, dem Antikörper für Biotin. Eine selektive Bindung erfolgt, woraufhin die Lösung in der Zelle gespült wird, um etwaiges "freies" TBR zu entziehen. Jetzt kann das TBR, das an die DNA gebunden ist, die wiederum über die Antikörper-Antigen-Bindung an der Anode angebracht ist, gemeinsam mit zugesetztem PA oxidiert werden, und die folgende Lumineszenzintensität ist von der Menge der vorhandenen DNA abhängig. - Die ECL-Mikrozelle, die nachstehend in Bezug auf die Abbildungen der
21 bis31 näher beschrieben ist, ist eine mehrlagige Einheit aus mikrobearbeitetem Silizium und Glas. Zellen mit einer Lösungskapazität zwischen 35 μL und 85 μL wurden in Silizium gestaltet und hergestellt. Ein durch einen E-Strahl abgeschiedener Dünnfilm aus Gold bildet die Zellenkathode. Die Anode ist ebenfalls ein Dünnfilm. Es wurden Experimente sowohl mit Indiumzinnoxid (ITO) als auch mit Platin ausgeführt. ITO ist transparent für sichtbares Licht, so dass es bei einer Abscheidung auf Glas die obere Schicht der Einheit bilden kann, durch welche das emittierte Licht von einem Fotodetektor aufgenommen werden kann (siehe21 ). Die Einheit weist ferner mikrobearbeitete Fluidfüllanschlüsse auf (siehe22 ). Die Schichten wurden unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur härtenden Polyimids wie etwa Epotek 400 montiert und verbunden (siehe29 –30 ). - ECL-Experimene wurden in der Mikrozelle mit freiem TBR, d.h. keiner DNA ausgeführt. Die Zellen wurden mit einer TPA + TBR Lösung gefüllt, und eine Fotoelektronenvervielfacherröhre (PMT) wurde dicht an der oberen Glasschicht der Zelle platziert, um die Emission zu detektieren. Die durch die Reaktion von oxidiertem TPA und TBR erzeugte Chemilumineszenz ist von der Konzentration beider Chemikalien abhängig. In diesen Experimenten wurde die Konzentration von TPA konstant gehalten (50 mM) und TBR wurde verändert. Die Lösungen wurden wie folgt vorbereitet: 1 Gramm TBR-Hexahydratchlorid wurde in 50 mM TPA aufgelöst, um 5 mM TBR herzustellen, das danach mit zusätzlichen 50 mM TPA verdünnt wurde, um eine Reihe von Testlösungen zu erzeugen, deren TBR-Konzentrationen zwischen 0,1 nM und 5 mM liegen. Ein Potentiostat von EG&G, Modell PARC 273, wurde zur Erzeugung von Voltammogrammen der TBR + TPA Lösung verwendet, beide in der Mikrozelle mit ITO und Dünnfilm-Goldelektroden und in einer herkömmlicheren elektrochemischen Zelle mit Platindrahtelektroden. Aus dem Voltammogramm wurde das Oxidationspotenzial bestimmt, das dort gegeben ist, wo ECL auftritt, und wobei dieses dann als eine Gleichstromvorspannung zwischen der Dünnfilmkathode und -anode angelegt wurde. Das emittierte Licht wurde mit einem Hamamatsu MT, Modell R928 mit einer Vorspannung von 600 Volt gemessen. Die Abbildung aus
20 zeigt das Verhältnis zwischen der gemessenen Lichtintensität und der Elektrodenspannung für eine TBR-Konzentration von/mM, mit einer Darstellung der Zellenspannung und der ECL-Intensität im Vergleich zur Zeit. Die Spannung wird erhöht und reduziert, wie dies durch die strichpunktierte Linie dargestellt ist. In beide Richtungen verläuft die Spannung durch das Oxidationspotenzial von TBR, wo die Intensität von ECL maximal ist. In bislang durchgeführten Tests betrug die niedrigste gemessene Konzentration von TBR unter Verwendung der Mikrozelle mit einem ITΟ-Film als Anodenmaterial 1 μM. In Verbindung mit einer Platinanode betrugen die gemessenen TBP-Konzentrationen gerade einmal 1 nM. Der verhältnismäßig hohe Widerstand des ITΟ-Films beschränkt scheinbar den Oxidationsstrom für TPA und reduziert somit die Empfindlichkeit. Es konnte bestimmt werden, dass die Empfindlichkeit durch das Abscheiden eines Dünnfilms eines Materials verbessert werden kann, wie etwa von Aluminium auf den ITO-Film, wie dies nachstehend in Bezug auf die Abbildung aus31 beschrieben ist. Ferner werden Versuche unternommen, die Siliziumfotodiode in die Mikrozelle zu integrieren anstatt sie von dieser getrennt vorzusehen, wie dies in dem Ausführungsbeispiel aus21 dargestellt ist. - Die Abbildung aus
21 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel einer mikrobearbeiteten ECL-Zelle mit einer Dünnfilmanode, die unter140 dargestellt ist, und mit einer Silizium(Si)-Fotodiode141 , die angrenzend an die ECL-Zelle140 positioniert ist. Die ECL-Zelle140 ist in der Abbildung aus22 im vergrößerten Querschnitt dargestellt. Die Zelle140 umfasst ein Paar von Siliziumelementen142 und143 , zwischen denen eine Elektrode144 positioniert ist, die aus Gold (Au), Platin (Pt) oder Silber (Ag) gestaltet sein kann, eine ITΟ-Schicht145 und eine Glasschicht oder ein Dia146 . Das Siliziumelement142 weist eine Reaktionskammer147 auf, und das Element143 weist ein Paar von Füllanschlüssen148 auf (siehe22 ), über welche ein Analyt, wie dies durch die Legende angezeigt ist, in die Kammer147 geführt und aus dieser entzogen wird, und zwar über Rohr- bzw. Schlauchleitungen oder Leitungen149 und150 , wie dies durch die Pfeile151 und152 angezeigt wird. Wie dies in der Abbildung aus22 dargestellt ist, ist ein zentraler Abschnitt153 des Siliziumelements143 zwischen den Füllabschnitten148 angeordnet, wobei in Verbindung mit der ITO-Schicht145 und dem Glasdia146 ein Fenster definiert wird, über welches Reaktionen in der Kammer147 detektiert werden können, wie dies durch die Photonen154 angezeigt wird, die dort hindurch au die Fotodiode141 verlaufen. Elektrische Zuleitungen155 und156 sind von einer Stromversorgung entsprechend mit der Elektrode144 und der ITO-Schicht145 verbunden, während die Fotodiode141 über Zuleitungen157 und158 elektrisch mit einer Stromversorgung verbunden ist. - Die Abbildungen der
23 bis30 veranschaulichen die Erzeugung eines Ausführungsbeispiels einer ECL-Zelle ähnlich dem Ausführungsbeispiel aus den Abbildungen der21 und22 . Das Fertigungsverfahren wird wie folgt ausgeführt: - 1.
Ein Block
160 Silizium wird überzogen, so dass eine Schicht161 Siliziumnitrid (siehe23 ) gebildet wird. - 2. Eine Schicht
162 Photoresist wird auf die Schicht161 abgeschieden (siehe24 ). - 3. Die Schicht
162 wird mit einem Muster versehen und es wird ein fotolithografisches Verfahren zur Gestaltung einer Öffnung163 darin ausgeführt (siehe25 ). - 4. Der Abschnitt
161' der Siliziumnitridschicht161 unterhalb der Öffnung163 wird durch RIE-Ätzen entfernt (siehe26 ). - 5. Ein Abschnitt des Siliziumblocks
160 wird durch KOH-Ätzen entfernt, um eine Reaktionskammer164 zu bilden, und das verbleibende Photoresist162 wird entfernt (siehe27 ). - 6. Eine Schicht, die zum Beispiel aus Gold besteht, wird durch
Dünnfilmevaporation über die obere
Oberfläche
des Blocks
160 und die Kammer164 abgeschieden, so dass eine Elektrode165 gebildet wird (siehe28 ). - 7. Ein zweiter Block Silizium
166 wird mit einer Schicht167 Siliziumnitrid überzogen, und darin werden Öffnungen168 und169 durch RIE-Ätzen entfernt, und es wird ein Paar von Füllanschlüssen170 und171 gebildet, wie etwa durch Mikrobearbeitung in dem Block166 , und der mit Siliziumnitrid überzogene Block166 wird mit der Elektrode165 verbunden (siehe29 ). - 8. Eine ITO-Schicht, die eine Elektrode
172 bildet, wird auf einer Schicht oder einem Dia173 aus Glas abgeschieden und danach mit der Siliziumnitridschicht167 verbunden (siehe29 ). - 9. Die elektrischen Zuleitungen
174 und175 werden an der Goldelektrode165 und der ITO-Elektrode172 angebracht, wobei ein Detektor176 , wie etwa die Fotodiode aus21 , welche die Zuleitungen177 und178 aufweist, mit einer Glasschicht173 verbunden wird, und wobei der mit Siliziumnitrid überzogene Siliziumblock160 an einem Magneten179 positioniert ist, der elektrische Zuleitungen180 und181 aufweist (siehe30 ). - Zur Reduzierung des Widerstands der ITΟ-Elektrode
172 kann ein dünner Film aus Aluminium182 (siehe31 ) auf die ITO-Schicht der Elektrode172 abgeschieden werden, bevor diese mit dem mit Siliziumnitrid überzogenen Siliziumblock166 verbunden wird. - Somit wurde gezeigt, dass die vorliegende Erfindung eine Mikroreaktionskammer auf Siliziumbasis bereitstellt, die in einem handgehaltenen Instrument oder in einem großen Instrument mit hohem Durchsatz eingesetzt werden kann.
Claims (14)
- Mikrogefertiger chemischer Reaktor, der eine Reaktionskammer (
41 ) auf Siliziumbasis umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Reaktionskammer die Form einer Muffe aufweist, die einen Schlitz (42 ) umfasst, wobei der genannte Schlitz zum Einführen eines Reaktionsfluids direkt oder über eine Rohrleitung verwendet wird. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 1, wobei die Muffenreaktionskammer (
41 ) mit mindestens einem Sichtfenster (48 ) versehen ist. - Chemischer Reaktor nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei sich die genannte Muffenreaktionskammer (
41 ) aus einer Mehrzahl verbundener Siliziumelemente (51 ,52 ) zusammensetzt, wobei die genannten verbundenen Siliziumelemente (51 ,52 ) aus Polysilizium und Bulk-Silizium bestehen, wobei dotiertes Polysilizium zur Erhitzung verwendet wird, und wobei Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen eingesetzt wird. - Chemischer Reaktor nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die genannte Muffenreaktionskammer (
41 ) ein Paar von Fenstern (55 ,56 ) und Heizeinrichtungen (57 ,65 ) aufweist, die angrenzend an jedes der genannten Fenster (55 ,56 ) angeordnet sind. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 4, wobei die genannten Fenster (
55 ,56 ) aus Siliziumnitrid gestaltet sind, und wobei die genannte Heizeinrichtung (57 ,65 ) eine dotierte Polysilizium-Heizeinrichtung umfasst. - Chemischer Reaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der genannte Schlitz (
42 ) in der genannten Reaktionskammer (41 ) eine mehrseitige Konfiguration aufweist. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 2, wobei der Reaktor zusätzlich einen Einsatz (
105 ) aufweist, der in den genannten Schlitz (42 ) eingeführt werden kann, wobei der genannte Einsatz (105 ) mindestens ein Fenster (106 ) aufweist. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 7, wobei das genannte mindestens eine Fenster (
106 ) des genannten Einsatzes (105 ) mit einem Teststreifen (109 ) versehen ist. - Chemischer Reaktor nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die genannte Reaktionskammer (
41 ) auf Siliziumbasis so gestaltet ist, dass sie in ein handgehaltenes, batteriebetriebenes Instrument (75 ) und/oder in ein Instrument eingeführt werden kann, das so gestaltet ist, dass es eine Anordnung (95 ) derartiger Reaktionskammern (96 ) aufweist, wobei die genannte Anordnung (95 ) von Reaktionskammern (96 ) über eine Anordnung von Mikroinjektoren (98 ,99 ) funktionsfähig mit einer Mikroelektrophoreseanordnung (102 ) oder direkt mit der Mikroelektrophoreseanordnung (102 ) verbunden ist. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 9, wobei die genannte Anordnung (
95 ) von Reaktionskammern (96 ) aus Silizium besteht, und wobei die genannte Mikroelektrophoreseanordnung aus Glas besteht. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 2, wobei der Reaktor ferner einen optischen Detektor aufweist, der angrenzend an das genannte Sichtfenster (
106 ) angeordnet ist. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 11, wobei der Reaktor zusätzlich ein Datenauslesesystem (
139 ) aufweist, das funktionsfähig mit dem genannten optischen Detektor verbunden ist, und mit einer Instrumentensteuereinheit (138 ), die funktionsfähig mit dem genannten Datenauslesesystem (139 ) und der genannten Reaktionskammer (135 ) verbunden ist. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 1, wobei der Reaktor zusätzlich eine Auskleidung (
105 ) aufweist, die in den genannten Schlitz (42 ) eingeführt werden kann, und wobei die genannte Reaktionskammer (41 ) auf Siliziumbasis mit mindestens einem Fenster (55 ,56 ) angrenzend an den genannten Schlitz (42 ) versehen ist, und wobei eine Heizeinrichtung (57 ,65 ) angrenzend an das genannte Fenster positioniert ist. - Chemischer Reaktor nach Anspruch 1, wobei die genannte Rohrleitung verschiebbar in dem genannten Schlitz zum Einführen von Reaktionsfluid angeordnet ist.
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