ES2236739T3 - Dispositivos de manguito a base de silicio para reacciones quimicas. - Google Patents

Abstract

CAMARA DE REACCION QUIMICA (41) DE TIPO CASQUILLO CON BASE DE SILICIO QUE COMBINA CALENTADORES, TALES COMO POLISILICIO DOPADO PARA CALENTAMIENTO, Y SILICIO EN BRUTO PARA ENFRIAMIENTO POR CONVECCION. LA CAMARA DE REACCION COMBINA UNA RELACION CRITICA DE SILICIO Y NITRURO DE SILICIO CON EL VOLUMEN DE MATERIAL A CALENTAR (P. EJ., UN LIQUIDO) CON EL FIN DE PROPORCIONAR UN CALENTAMIENTO UNIFORME PERO CON POCOS REQUISITOS DE POTENCIA. LA CAMARA DE REACCION PERMITE TAMBIEN LA INTRODUCCION DE UN TUBO SECUNDARIO (45) (P. EJ., PLASTICO) EN EL CASQUILLO DE REACCION QUE CONTIENE LA MEZCLA DE REACCION, MITIGANDO, POR TANTO, CUALQUIER PROBLEMA DE INCOMPATIBILIDAD DE MATERIALES. LA CAMARA DE REACCION PUEDE UTILIZARSE EN CUALQUIER SISTEMA DE REACCION QUIMICA PARA LA SINTESIS O PROCESO DE REACCIONES ORGANICAS, INORGANICAS O BIOQUIMICAS, TALES COMO LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y/O OTRAS REACCIONES ADN, TALES COMO LA REACCION EN CADENA DE COORDINADORES, QUE SON EJEMPLOS DE REACCIONES DE SINTESIS CON BASE DE CICLO TERMICO. LA CAMARA DE REACCION PUEDE UTILIZARSE EN INSTRUMENTOS DE SINTESIS, PARTICULARMENTE LOS UTILIZADOS EN AMPLIFICACION Y SINTESIS ADN.

Description

Dispositivos de manguito a base de silicio para reacciones químicas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a instrumentos para el control de reacciones químicas y la detección de los reactivos participantes y de los productos resultantes, en particular, a instrumentos integrados microfabricados para realizar reacciones químicas a microescala que implican un control preciso de los parámetros de las reacciones, y más particularmente, a dispositivos de manguito a base de silicio como cámaras de reacción para reacciones químicas y que pueden utilizarse en grandes matrices de cámaras individuales para una unidad de microreacciones de alto rendimiento.

Los instrumentos actuales para realizar una síntesis química a través del control y el ciclado térmicos son en general muy grandes (de sobremesa) e ineficaces, y a menudo trabajan calentando y enfriando una gran masa térmica (por ejemplo, un bloque de aluminio). En los últimos años, los esfuerzos se han orientado a la miniaturización de estos instrumentos al diseñar y construir cámaras de reacción de silicio y materiales a base de silicio (por ejemplo, el nitruro de silicio, el silicio policristalino) que tienen calentadores integrados y enfriando por convección a través del silicio.

Las tecnologías de microfabricación son ahora ampliamente conocidas e incluyen la pulverización catódica, la electrodeposición, la deposición de vapor a baja presión, la fotolitografía y el ataque químico. Los dispositivos microfabricados normalmente se forman sobre sustratos cristalinos, tales como el silicio y el arseniuro de galio, pero pueden formarse sobre materiales no cristalinos, tales como el vidrio o ciertos polímeros. Las formas de los dispositivos cristalinos pueden controlarse con precisión puesto que las superficies atacadas son generalmente planas y cristalinas y los materiales cristalinos pueden adherirse mediante procesos tales como la fusión a temperaturas elevadas, la adhesión anódica o por métodos asistidos por campos.

La tecnología de microfabricación monolítica permite ahora la producción de dispositivos eléctricos, mecánicos, electromecánicos, ópticos, químicos y térmicos incluyendo bombas, válvulas, calentadores, mezcladores y detectores para cantidades de microlitros a nanolitros de gases, líquidos y sólidos. Además, ahora pueden producirse a microescala sondas guiaondas y sensores ultrasónicos de ondas de flexión. La integración de estos dispositivos microfabricados en un único sistema contempla la producción en serie de instrumentos analíticos basados en reactores a microescala. Tales microinstrumentos integrados pueden aplicarse a reacciones bioquímicas, químicas inorgánicas o químicas orgánicas para realizar diagnósticos biomédicos y medioambientales, así como al tratamiento y a la detección biotecnológicos.

El funcionamiento de tales microinstrumentos integrados se automatiza fácilmente, y puesto que el análisis puede realizarse in situ, la contaminación es muy reducida. Debido a los tamaños intrínsecamente pequeños de tales dispositivos, el calentamiento y el enfriamiento pueden ser extremadamente rápidos. Estos dispositivos tienen requisitos de alimentación muy bajos y pueden alimentarse mediante pilas o por acoplamiento electromagnético, capacitivo, inductivo u óptico.

Los pequeños volúmenes y altas relaciones área superficial / volumen de los instrumentos de reacción microfabricados proporcionan un elevado nivel de control de los parámetros de una reacción. Los calentadores pueden producir ciclos o desniveles de temperatura; mientras que los transductores ultrasónicos pueden producir cambios sonoquímicos y sonofísicos en estructuras conformacionales; y la radiación óptica incidente puede generar polimerizaciones.

Las reacciones de síntesis, y especialmente las reacciones de síntesis en cadena tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), son particularmente adecuadas para los instrumentos de reacción de microfabricación. La PCR puede amplificar selectivamente una molécula individual de ADN (o ARN) de un organismo por un factor de 10^{6} a 10^{9}. Este bien establecido procedimiento requiere la repetición de ciclos de calentamiento (desnaturalización) y de enfriamiento (hibridación) en presencia de una molécula objetivo de ADN original, cebadores del ADN específicos, desoxinucleótidos trifosfato y cofactores y enzimas ADN polimerasa. Cada ciclo produce el plegamiento de la secuencia objetivo de ADN, lo que da lugar a una acumulación exponencial de la secuencia objetivo.

El procedimiento de la PCR implica: 1) el tratamiento de la muestra para liberar moléculas objetivo de ADN en un extracto bruto; 2) la adición de una disolución acuosa que contenga enzimas, tampones, desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) y cebadores oligonucleótidos; 3) el ciclado térmico de la mezcla de la reacción entre dos o tres temperaturas (por ejemplo, 90-96, 72 y 37-55ºC); y 4) la detección del ADN amplificado. En el procedimiento de PCR, pueden incorporarse etapas intermedias, tales como la purificación de los productos de reacción y la incorporación de cebadores que pliegan la superficie, por ejemplo.

Un problema con las técnicas de PCR habituales de laboratorio es que las reacciones de PCR pueden resultar contaminadas o inhibidas por la introducción de una sola molécula contaminante de ADN extraño, tales como las procedentes de experimentos anteriores, u otros contaminantes durante las transferencias de reactivos de un recipiente a otro. Además, los volúmenes de reacción de la PCR utilizados en las técnicas habituales de laboratorio son normalmente del orden de 50 microlitros. Un ciclo térmico consta normalmente de cuatro fases: calentar una muestra hasta una primera temperatura, mantener la muestra a la primera temperatura, enfriar la muestra hasta una segunda temperatura inferior y mantener la temperatura a esa temperatura más baja. Normalmente, cada una de esas cuatro fases de un ciclo térmico requiere un minuto aproximadamente, y por tanto, completar cuarenta ciclos, por ejemplo, lleva aproximadamente tres horas. Por tanto, debido al gran volumen utilizado normalmente en los procedimientos habituales de laboratorio, el tiempo implicado, así como las posibilidades de contaminación durante las transferencias de reactivos de un recipiente a otro, existe claramente una necesidad de microinstrumentos capaces de llevar a cabo el procedimiento de PCR.

Recientemente, se ha reducido el tiempo de ciclado para realizar la reacción de PCR realizando la reacción de PCR en tubos capilares y empleando un calentador de aire forzado para calentar los tubos. Además, recientemente se ha desarrollado un reactor integrado microfabricado para reacciones químicas in situ, el cual resulta especialmente ventajoso para reacciones bioquímicas que requieren un ciclado térmico de alta precisión, particularmente las manipulaciones basadas en el ADN tales como la PCR, puesto que las pequeñas dimensiones de la microinstrumentación fomentan unos tiempos de ciclado rápidos. Este reactor microfabricado se describe y reivindica en la patente estadounidense número 5.639.423, titulada "Microfabricated Reactor", cedida al mismo cesionario. Además, se ha desarrollado para el uso en reactores químicos una cámara de microrreacción calentada ópticamente e integrada ópticamente que puede utilizarse, por ejemplo, en el reactor integrado microfabricado de la patente estadounidense número 5.639.423 a la que se ha hecho referencia anteriormente.

La presente invención se refiere a una geometría particular de microrreactores a base de silicio que han demostrado ser muy eficaces en lo que se refiere a la uniformidad de potencia y de temperatura. El microrreactor de esta invención, que se considera en líneas generales un dispositivo de manguito a base de silicio para reacciones químicas, puede utilizarse eficazmente en cualquiera de los sistemas de reactores de las solicitudes en tramitación junto con la presente a las que se ha hecho referencia anteriormente. La presente invención emplea polisilicio dopado para el calentamiento y silicio en grandes cantidades para el enfriamiento por convección. La presente invención permite el cambio simultáneo de múltiples parámetros del tamaño de la ventana de detección, la detección in situ, los volúmenes de reacción, la uniformidad térmica y las velocidades de calentamiento y de enfriamiento. Además, permite el uso de grandes matrices de las cámaras de reacción individuales para una unidad de microrreacción de alto rendimiento.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una cámara de reacción química mejorada.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un dispositivo de manguito a base de silicio para los reactores químicos.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar una cámara de reacción química que combine el uso de polisilicio dopado y de silicio en grandes cantidades.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar cámaras de reacción química que combinen el uso de polisilicio dopado y de silicio en grandes cantidades para proporcionar una flexibilidad en las propiedades térmicas y ópticas que permita la puesta en práctica en instrumentos grandes y pequeños.

Otro objeto de la invención es proporcionar un dispositivo de manguito a base de silicio que combine una razón crítica de silicio y de nitruro de silicio con respecto al volumen de material que ha de calentarse (por ejemplo, un líquido) a fin de proporcionar un calentamiento uniforme pero un requisito de alimentación reducido.

Otro objeto de la invención es proporcionar un dispositivo de manguito a base de silicio que permita la introducción de un tubo secundario (por ejemplo, de plástico) en el manguito de reacción que contiene la mezcla de reacción, desviando así cualquier problema potencial de incompatibilidad entre materiales.

Otro objeto de la invención es proporcionar una matriz de cámaras de reacción individuales para una unidad de microrreacción de alto rendimiento.

Otro objeto de la invención es proporcionar un instrumento portátil que emplee cámaras de reacción de tipo manguito a base de silicio con calentadores integrados.

Otro objeto de la invención es proporcionar una cámara de reacción con detección automatizada y control por realimentación.

Otro objeto de la invención es proporcionar el control por inteligencia artificial de las reacciones en una cámara de reacción.

Otro objeto de la invención es proporcionar una modulación de anchura de pulso como control por realimentación para la cámara de reacción.

Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción y los dibujos adjuntos. Esencialmente, la invención es un manguito a base de silicio para reacciones químicas. La invención engloba una cámara de reacción química que combina el uso de polisilicio para el calentamiento y el de silicio en grandes cantidades para el enfriamiento por convección. El manguito de reacción combina una razón crítica de silicio y de nitruro de silicio con respecto al volumen de material que ha de calentarse a fin de proporcionar un calentamiento uniforme pero unos requisitos de alimentación reducidos. El manguito de reacción también contempla la introducción en la misma de un tubo secundario que contenga la mezcla de reacción, paliando así cualquier incompatibilidad potencial entre materiales. La presente invención es una prolongación del reactor integrado microfabricado al que se ha hecho referencia anteriormente de la patente estadounidense número 5.639.423 a la que se ha hecho referencia anteriormente. La cámara de reacción de manguito a base de silicio puede utilizarse en sistemas de reacción química para la síntesis o el tratamiento de reacciones orgánicas, inorgánicas o bioquímicas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/u otras reacciones del ADN (tales como la reacción en cadena de la ligasa) u otras reacciones sintéticas basadas en el ciclado térmico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una vista parcial en perspectiva, en corte transversal, de un instrumento microfabricado de reacción química montado en un aparato de control/fuente de alimentación.

La figura 2 es una vista esquemática del instrumento de reacción de la figura 1.

La figura 3 ilustra esquemáticamente una disposición de calentamiento y detección para una cámara de reacción microfabricada.

La figura 4 ilustra una realización de una cámara de reacción microfabricada de manguito a base de silicio realizada según la presente invención.

La figura 5 es una matriz de las cámaras de reacción de manguito de la figura 4 conectada operativamente a una matriz de electroforesis.

La figura 6 es una vista desde un extremo ampliada de otra realización de una cámara de microrreacción de manguito similar a la de la figura 4.

La figura 7 ilustra en corte transversal una realización de una sección ampliada de la figura 6 que utiliza una ventana fija con versión de calentador aislado.

La figura 8 ilustra en corte transversal otra realización de la misma sección ampliada de la figura 6 que utiliza una ventana variable con versión de calentador no aislado.

La figura 9 es una vista de un instrumento portátil (PCRman) que utiliza las cámaras de reacción de la figura 6 como piezas de inserción para cambiar reacciones.

Las figuras 10A y 10B ilustran un instrumento de ciclado térmico que emplea varios cientos de cámaras de microrreacción a base de silicio controladas individualmente.

La figura 11 ilustra una representación esquemática de un sistema de alto rendimiento de amplificación del ADN, manejo de muestras y electroforesis.

La figura 12 es una realización de una pieza de inserción/forro para una cámara de reacción con una ventana óptica, con la parte superior/tapa abierta.

La figura 13 ilustra un llenado desde el exterior de una pieza de inserción/forro de una cámara de reacción.

La figura 14 ilustra unos reactivos/sondas inmovilizados para la detección de productos específicos directamente sobre ventanas o dentro de un fluido de reacción como "tira reactiva" detectada ópticamente en el instrumento portátil (PCRman) de la figura 9.

Las figuras 15 y 16 ilustran esquemáticamente unos sistemas de detección óptica para el uso con las cámaras de microrreacción de la figura 6.

La figura 17 ilustra esquemáticamente el uso de la detección integrada para un sistema de realimentación de inteligencia artificial.

La figura 18 es un diagrama que muestra las reacciones de oxidación electroquímica y de reducción química para el tris(2,2'bipiridil)rutenio (II) (TBR) y la tripropilamina (TPA).

La figura 19 ilustra un método para marcar y separar ADN para la detección y la cuantificación por electroquimioluminiscencia (ECL).

La figura 20 ilustra la tensión de celda y la intensidad de ECL frente al tiempo, incrementándose la tensión y luego reduciéndose.

La figura 21 ilustra una realización de una celda ECL micromecanizada con un ánodo de película delgada y un detector de fotodiodos asociado.

La figura 22 es una vista en corte transversal ampliada de la celda ECL de la figura 21 con los hilos eléctricos.

Las figuras 23 a 30 ilustran el proceso de fabricación para producir una celda ECL, tal como la ilustrada en la figura 21.

La figura 31 ilustra una realización que utiliza A1 sobre ITO sobre vidrio que reduce la resistencia del electrodo no.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención es una cámara de reacción química de manguito a base de silicio, microfabricada, según la reivindicación 1 en la presente memoria, que combina calentadores, tal como polisilicio dopado para el calentamiento y silicio en grandes cantidades para el enfriamiento por convección. Las cámaras de microrreacción pueden utilizarse en una matriz para una unidad de microrreacción de alto rendimiento o en una unidad portátil. Combina una razón crítica de silicio y nitruro de silicio con respecto al volumen de material que ha de calentarse (por ejemplo, un líquido) a fin de proporcionar un calentamiento uniforme pero unos requisitos de alimentación reducidos. También permitirá la introducción de un tubo secundario (por ejemplo, de plástico) en el manguito de reacción que contiene la mezcla de reacción, paliando así cualquier problema potencial de incompatibilidad entre materiales. La presente invención utiliza una geometría particular de microrreactores a base de silicio, los cuales han demostrado ser muy eficaces en lo que se refiere a la uniformidad de potencia y de temperatura. La realización particular descrita del reactor microfabricado descrito se ha empleado experimentalmente como instrumento de ciclado térmico para el uso en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras reacciones químicas, y ha demostrado ser superior a los instrumentos comerciales actuales en reactores químicos accionados térmicamente. La cámara de reacción de manguito a base de silicio de esta invención puede utilizarse en lugar de la cámara de reacción del sistema microfabricado de la solicitud en tramitación con la presente con número de serie 07/938.106 a la que se ha hecho referencia anteriormente; y puede emplearse con la disposición integrada de calentador y detección de la solicitud en tramitación con la presente con número de serie 08/(IL-9121) a la que se ha hecho referencia anteriormente, y constituye por tanto una prolongación de los sistemas microfabricados de reacción química en estas solicitudes en tramitación con la presente.

Para proporcionar una comprensión de un instrumento microfabricado de reacción química y de la disposición integrada de calentamiento/detección, se expone, antes de la descripción de la realización de la cámara de reacción de manguito de la presente invención, una descripción de una reactor químico microfabricado y de una disposición integrada de calentamiento/detección de las dos solicitudes en tramitación con la presente a las que se ha hecho referencia.

La figura 1 ilustra una realización de un instrumento microfabricado de reacción química, indicado generalmente en 10, mostrado sobre una sección rebajada del mismo, indicada generalmente en 11, en un sistema de control/fuente de alimentación del instrumento microfabricado de reacción, indicado generalmente en 12. Se muestra una aguja 13 hipodérmica que inserta una muestra a través de una ventana 14 de goma de silicona en el instrumento 10 de reacción. La reacción se controla y alimenta mediante: un acoplamiento de inducción, tal como el que se produce entre la bobina L_{CL} en el instrumento 10 y una bobina 15 magnética; por acoplamiento capacitivo, tal como el que se produce entre las placas de un condensador C_{3} y unas placas 16 y 17; y por acoplamiento electromagnético entre un circuito resonante, véase la figura 2, en el instrumento 10 y una antena 18 de radiofrecuencia.

En la figura 2 se ilustra un diagrama esquemático del instrumento 10 de la figura 1, y comprende tres cámaras 19, 20 y 21 de reactivo, las cuales, por ejemplo, pueden contener los cebadores del ADN, la polimerasa y los nucleótidos y cualquier molécula marcadora de detección, tal como perlas magnéticas. La molécula objetivo de ADN se coloca en la cámara 19 de reactivo mediante la inserción de una aguja 13 hipodérmica (figura 1) o similar a través de una ventana 14 de goma de silicona u otro tipo de material. Las cámaras 19, 20 y 21 de reactivo están conectadas respectivamente por unos canales 22, 23 y 24, que tienen unas secciones centrales estrechas, no mostradas, a una cámara 25 de reacción. Normalmente, las cámaras 19-21 y 25 tienen un volumen que oscila desde microlitros hasta nanolitros. Los canales 22-24 están equipados con unas bombas LW_{1}, LW_{2} y LW_{3} de ondas lambda, respectivamente, para bombear reactivos en las cámaras 19-21 por los canales 22-24, en el sentido de las flechas, al interior de la cámara 25. Las bombas de ondas lambda pueden situarse en cualquier pared o en múltiples paredes de los canales 22-24. Las bombas LW_{1}, LW_{2} y LW_{3} de ondas lambda están conectadas respectivamente a unos condensadores C_{1}, C_{2} y C_{3}. La tensión superficial a través de las secciones centrales estrechas de los canales 22-24 evita que los reactivos en las cámaras 19-21 fluyan al interior de la cámara 25 hasta que se inicie el bombeo. Las superficies interiores de los canales 22-24 pueden tratarse para elevar la tensión superficial, inhibiendo adicionalmente así el flujo de los reactivos cuando las bombas de ondas lambda no están activadas.

La cámara 25 de reacción puede equiparse con un transductor LW_{C} de ondas lambda y un calentador H_{C}. El transductor LW_{C} de ondas lambda está conectado a un inductor L_{CL} (también mostrado en la figura 1). El calentador H_{C} está conectado a un circuito resonante que consta de un inductor L_{CH} y un condensador C_{CH}. El transductor LW_{C} de ondas lambda actúa como agitador, mezclador o inductor sonoquímico, tal como se indica mediante las flechas 26 conectadas en la cámara 25.

Un canal 27 conecta la cámara 25 de reacción con una cámara 28 de detección. El canal 27 está equipado con una bomba LW_{DP} de ondas lambda, la cual está conectada a un circuito resonante que consta de un inductor L_{DP} y un condensador C_{DP}. La cámara 28 de detección está equipada con un sensor LW_{D} de ondas lambda, el cual está conectado a un condensador C_{D}.

Los transductores de ondas lambda tienen valor Q mecánicos elevados y por tanto pueden alimentarse mediante tan sólo un estrecho intervalo de frecuencias de tensión alterna. Las bombas de ondas lambda (LW_{1}, LW_{2}, LW_{3}) y el sensor de ondas lambda (LW_{D}) se alimentan capacitivamente generando un campo eléctrico entre las placas (tales como, por ejemplo, las placas 16 y 17 de la figura 1) a las frecuencias resonantes de los transductores de ondas lambda (LW_{1}, LW_{2}, LW_{3}, y LW_{D}). Pero, puesto que los transductores tienen valores Q elevados, el transductor sólo vibra con una magnitud sustancial cuando la frecuencia del campo impuesto está próxima a la frecuencia resonante de un transductor. De manera similar, el transductor LW_{C} de la cámara de mezcla de ondas lambda está proporcionado por un campo magnético de frecuencia alterna generado por la bobina (15 en la figura 1) a la frecuencia resonante mecánica del transductor LW_{C}. El calentador H_{C} y la bomba LW_{DP} de ondas lambda se activan dirigiendo una onda electromagnética desde la antena (18 en la figura 1) hasta el circuito C_{CH} y L_{CH} resonante y el circuito C_{DP} y L_{DP} resonante, respectivamente. Para activar la bomba LW_{DP}, la frecuencia de la radiación electromagnética incidente debe corresponder a la frecuencia resonante mecánica del transductor LW_{DP}. Para activar el calentador H_{C}, la frecuencia de la radiación electromagnética incidente debe corresponder con la frecuencia resonante de los elementos CH, L_{CH} y H_{C} eléctricos.

Una reacción de PCR se inicia, por ejemplo, mediante el bombeo de los reactivos en las cámaras 19, 20 y 21 de reactivo a lo largo de los sentidos de las flechas, a través de los canales 22, 23 y 24 respectivos, hasta la cámara 25, activando las bombas LW_{1}, LW_{2} y LW_{3}. A continuación, se inicia una serie de, por ejemplo, aproximadamente veinte a cuarenta ciclos térmicos, y durante cada ciclo, la temperatura de los reactivos en la cámara 25 de reacción va, por ejemplo, desde 55ºC hasta 96ºC y de vuelta hasta 55ºC. La temperatura de la cámara 25 de reacción viene determinada por la potencia de la señal electromagnética incidente a la frecuencia correspondiente a la frecuencia resonante del circuito compuesto del condensador C_{CH} y el inductor L_{CH} junto con el calentador H_{C}. El dispositivo LW_{C} de ondas lambda de la cámara 25 de reacción actúa como un agitador o mezclador, tal como viene indicado por las flechas 26, para mezclar los reactivos y fomentar la reacción.

Cuando acaba el ciclado térmico, el contenido de la cámara 25 de reacción es bombeado por la bomba LW_{DP} de ondas lambda por el canal 27, en el sentido de la flecha, hasta la cámara 28 de detección, que utiliza un sensor LW_{D} de ondas lambda. Alternativamente, la cámara 28 de detección puede dotarse de una ventana óptica, y las pruebas pueden realizarse por espectroscopia óptica basada en la fluorescencia o basada en la absorción.

La figura 3 ilustra una disposición de calentamiento/detección que puede incorporarse en el reactor microfabricado de las figuras 1 y 2. Tal como se muestra en la figura 3, se ilustra en corte transversal una cámara de reacción química, tal como una cámara de PCR de un instrumento microfabricado, miniaturizado, indicado generalmente por 30, estando una cámara 31 formada en un alojamiento 32, construido en Pirex, por ejemplo, y que tiene unas piezas 33 y 34 de inserción en el misma, con una entrada 35 y una salida 36. La energía procedente de dos fuentes de energía (luz) diferentes se dirige sobre el alojamiento 32, siendo una fuente 37 una fuente de infrarrojos (IR) y siendo la segunda fuente 38 una fuente de ultravioletas (UV). La fuente 17 IR aplica calor de manera más uniforme a través de las grandes cantidades de la solución en la cámara 31. La fuente 18 UV induce una fluorescencia de los productos de reacción en el espectro visible (Vis), la cual puede ser detectada por un detector 39 de luz visible (Vis) situado fuera del alojamiento 32 que define la cámara 31 de reacción. El alojamiento 32 debe construirse de un material transparente a los UV y/o al espectro visible. Al incorporar un sistema integrado de excitación (calentamiento) y detección en la propia cavidad de molde de reacción, puede obtenerse confirmación de la presencia de una muestra en la cámara de reacción y pueden consolidarse las cámaras 25 y 28 duales de reacción y de detección del reactor microfabricado de la figura 2, reduciendo por tanto los costes de fabricación al reducir los componentes.

La presente invención, una realización de la cual se ilustra de manera general en las figuras 4 y 5, implica un reactor microfabricado, indicado generalmente en 40, el cual incluye un manguito a base de silicio como cámara de reacción química, indicado generalmente en 41, construido en dos partes de silicio adheridas y que utiliza polisilicio dopado para el calentamiento y silicio en grandes cantidades para un enfriamiento por convección, tal como se describe con más detalle en lo sucesivo. El manguito 41 incluye una ranura o abertura 42 por donde se inserta fluido de reacción, indicado en 43, desde una aguja 44 hipodérmica al interior de la cámara de reacción o en la que puede insertarse un tubo 45 secundario que contiene una mezcla 46 de reacción. El tubo 45 está construido, por ejemplo, en plástico u otro material que sea inerte con respecto a la mezcla de reacción, paliando así cualquier problema potencial de incompatibilidad entre materiales. El manguito está dotado también de una abertura 47 en la que está situada una ventana 48 óptica, hecha, por ejemplo, de nitruro de silicio, dióxido de silicio o polímeros. La cámara 41 de reacción del manguito de silicio incluye polisilicio dopado para el calentamiento y silicio en grandes cantidades para el enfriamiento por convección, y combina una razón crítica de silicio y de nitruro de silicio con respecto al volumen del material que ha de calentarse (por ejemplo, un líquido) a fin de proporcionar un calentamiento uniforme pero unos requisitos de alimentación reducidos.

La figura 6 es una vista ampliada de una cámara de microrreacción similar a la realización de la figura 4, pero que utiliza dos ventanas. La cámara de reacción de la figura 6, indicada generalmente en 50, se compone de dos obleas o sustratos 51 y 52 de silicio adheridos el uno al otro tal como se indica en 53 y configurados para definir una ranura o abertura 54 en su interior. Cada una de las obleas 51 y 52 incluye una capa 51' y 52' de nitruro de silicio que define una ventana, indicada generalmente en 55 y 56, respectivamente. La ventana 55 en la oblea 51, construida en nitruro de silicio, está dotada de un calentador 57 que tiene unos hilos 58 y contactos 59 eléctricos que se extienden a lo largo de los bordes del calentador 57 para proporcionar un calentamiento uniforme. La ventana 56 en la oblea 52 tiene un calentador, no mostrado en la figura 6, pero que está fijado por unos contactos 60 y 61 metálicos tal como se ilustra en cualquiera de las figuras 7 y 8. Las capas 51' y 52' de nitruro de silicio son muy delgadas (aproximadamente, 1 \mum) y se han depositado por vapor sobre las obleas 51 y 52 de silicio en grandes cantidades. El nitruro de silicio se convierte en una ventana, tal como se indica en 55 y 56, sólo cuando las obleas 51 y 52 de silicio en grandes cantidades se atacan químicamente para formar la abertura o ranura 54. El calentador 57 es transparente a la energía que pasa a través de la ventana 55, por ejemplo.

La figura 7 es una vista muy ampliada de una realización de una sección de la oblea 52 de silicio y de la ventana 56, tal como se indica mediante el círculo 62 en la figura 6. Tal como se observa en la figura 7, la sección de la oblea 52 de silicio, indicada en 63, se compone de silicio en grandes cantidades o monocristalino y está en contacto con una membrana o ventana 64 (52' en la figura 6) de nitruro de silicio de baja tensión (100 a 500 MPa) que, a su vez, está en contacto con una calentador 65 de polisilicio dopado y unos contactos 60 y 61 metálicos. La realización de la figura 7 comprende una ventana fija con versión de calentador aislado.

La figura 8 es una vista muy ampliada de otra realización de una sección de la oblea 52 de silicio y de la ventana 56, tal como se indica mediante el círculo 62. Tal como se observa en la figura 8, las secciones del sustrato 52 de silicio, indicado en 66, se componen de silicio en grandes cantidades o monocristalino. Tal como en la realización de la figura 7, un elemento o ventana 69 (52' en la figura 6) de nitruro de silicio de baja tensión (100 a 500 MPa) se encuentra en contacto con la sección 66 de silicio, un calentador 70 de polisilicio dopado se encuentra en contacto con la membrana 69 de ventana y unos contactos 71 metálicos están montados en el calentador 70. La realización de la figura 8 comprende una versión de calentador no aislado. El tamaño de ventana en relación con la cámara puede variarse para garantizar una uniformidad térmica y un acceso óptico a la cámara de reacción.

A título de ejemplo, las obleas o sustratos 51 y 52 de silicio pueden tener una longitud de 5 a 50 mm, una anchura de 2 a 10 mm, un espesor de 0,1 a 1,0 mm, teniendo la ranura 54 una superficie en sección transversal de 5 a 500 mm^{2}. La ranura 54, la cual se muestra que tiene una configuración de seis lados, puede ser de configuración redonda, oblonga, cuadrada, rectangular u otra. Las ventanas 55 y 56 pueden tener una longitud de 0,1 a 1 mm, una anchura de 0,1 a 50 mm, un espesor de 0,1 a 10 \mum y, además de nitruro de silicio, puede componerse de dióxido de silicio, silicio o polímeros. El calentador 65 de polisilicio dopado de la figura 7 puede tener un espesor de 0,05 a 5 \mum, teniendo el calentador 70 de la figura 8 un espesor de 0,05 a 5 \mum. Los contactos metálicos 60-61 y 61' de las figuras 6 y 7 pueden componerse de oro o de aluminio, con un espesor de 0,01 a 5 \mum, teniendo el contacto 71 metálico de la figura un espesor de 0,01 a 5 \mum y componiéndose de oro o de aluminio. El calentador 57 en la oblea o sustrato 51 de silicio se compone de polisilicio dopado que tiene un espesor de 0,05 a 5 \mum, estando los hilos y contactos 58 y 59 eléctricos compuestos de oro y de aluminio.

El uso de silicio en grandes cantidades, polisilicio dopado y nitruro de silicio posibilita la flexibilidad en el diseño de las propiedades térmicas y ópticas de cada cámara. Esto permite que haya cámaras de reacción térmicamente aisladas, controladas individualmente, en un instrumento pequeño (figura 9) o en un instrumento grande (figura 10).

La figura 9 es una realización de un instrumento controlado por realimentación, de baja potencia, portátil, a pilas, de ciclado térmico, para la PCR, que utiliza cámaras de reacción a base de silicio, microfabricadas, tales como las de las figuras 4 y 6, cuyo desarrollo trató la uniformidad térmica y la precisión de las temperaturas de la cámaras de reacción, las velocidades de desnivel de temperatura de las cámaras y la biocompatibilidad de los materiales en contacto con los reactivos.

Tal como se muestra en la figura 9, el instrumento accionado a pilas, portátil, bautizado como "PCRman", indicado generalmente en 75, comprende un soporte controlador de contactos eléctricos ajustados por presión, o alojamiento 76, que, por ejemplo, puede ser de 3 x 5 pulgadas, que tiene una placa 77 frontal de control con varios indicadores en la misma, incluyendo una ventana 78 de "estado". El soporte 76 está dotado de circuitería de control por realimentación de la temperatura basada en termopares, electrónica de calentadores, una interfaz de ordenador y un conector de fuente de alimentación, tal como se describe con más detalle en lo sucesivo. El soporte 76 está dotado de pilas, indicadas en 79, tal como cuatro pilas de nueve voltios, y el exterior superior está dotado de unas ranuras 80 para la inserción de cámaras de reacción dentro del soporte (se muestran tres ranuras) y en las que se insertan unas cámaras 81, 82, 83 y 84 de reacción a base de silicio, con calentadores integrados (tal como se muestra en la figura 6), tal como se indica mediante la flecha 85. Cuando están construidas, las cámaras 81-84 de reacción pueden contener distintos reactivos o compuestos químicos y pueden insertarse selectivamente en el instrumento 75 portátil por las ranuras 80 en el soporte o controlador 76.

Este instrumento puede utilizarse para proporcionar rápida y repetitivamente ciclos térmicos controlados a la mezcla de reacción. Las propiedades de conductividad térmica del silicio o de un sustrato semiconductor similar ayudan a acelerar los tiempos de subida y bajada térmicas y permiten un funcionamiento a baja potencia. Aunque el silicio es único en sus propiedades térmicas, es decir, una elevada conductividad térmica, una combinación de silicio, nitruro de silicio, dióxido de silicio, polímeros y otros materiales proporcionaría una combinación de conductividad y aislamiento térmicos que permitirían una uniformidad térmica y un funcionamiento a baja potencia.

La realización particular, tal como la de la figura 6, de un reactor microfabricado descrito puede emplearse como una instrumentación de ciclado térmico para el uso en la PCR y otras reacciones químicas, proceso bioquímicos, procesos microbiológicos e incubadoras. Tal como se muestra de aquí en adelante, la cámara de reacción de esta invención es superior a los instrumentos comerciales actuales empleados en las reacciones químicas estimuladas térmicamente.

Durante la verificación experimental del instrumento de la figura 9 y de las cámaras de microrreacción para usar dentro del mismo, tal como se ilustra en las figuras 4 y 6, se fabricaron varios tamaños diferentes de diseños de cámara de reacción de PCR utilizando etapas de tratamiento de silicio del tipo para circuitos integrados (CI). El proceso de fabricación generalizado fue el siguiente: se trataron obleas de silicio monocristalino (SCS - Single Crystal Silicon) de 0,5 mm de espesor, de tres pulgadas de circunferencia, de la siguiente manera: se depositó químicamente con vapor a baja presión (LPCVD - Low Pressure Chemical Vapor Deposition) nitruro de silicio (Si_{x}N_{y}) de baja tensión (200-300 MPa) sobre toda una oblea (1,0-2,0 \mum de espesor). Se realizaron pautas fotolitográficas para una cámara de reacción y unas etapas de tratamiento posteriores en el siguiente orden: 1) el nitruro de silicio se atacó con iones reactivos (RIE - Reactive Ion Etching) en toda la zona de la cámara de reacción, 2) el SCS se atacó en la parte posterior del nitruro de silicio, definiendo el volumen de la cámara de reacción, 3) se realizaron pautas en la oblea y el nitruro de silicio se atacó químicamente en todas partes excepto sobre la membrana de nitruro o se dejó en toda la superficie, dependiendo del diseño de la cámara de reacción, 4) sobre la membrana de nitruro de silicio restante (el lado opuesto a la cámara) se depositó por LDCVD silicio policristalino (polisilicio) hasta un espesor de 3000 \ring{A}, 5) a continuación, el polisilicio se dopó a alta temperatura con boro hasta una resistividad de 50-200 Ohm por cuadrado, y 6) se depositaron contactos metálicos de película delgada de aluminio o de oro, definiendo la geometría de calentador.

Potencialmente, cada oblea contiene muchas cámaras de reacción, dependiendo de la geometría y el volumen deseados. La depresión atacada en cada oblea constituye la mitad de una cámara de reacción de doble calentador. Posteriormente, las obleas tratadas se adhieren la una a la otra formando una cámara cerrada con calentadores en ambos lados.

Las cámaras de reacción pueden adherirse la una a la otra depositando una película delgada de poliimida de endurecimiento a baja temperatura directamente entre las dos obleas o mediante otras técnicas de adhesión tales como la adhesión eutéctica de metales. En cada diseño, se utilizó una sierra de silicio controlada por ordenador, de alta precisión, para cortar cada cámara de doble calentador. A continuación, las cámaras se enjuagaron repetidamente con agua desionizada y se secaron antes del tratamiento con silano.

Las cámaras de reacción se insertaron en un soporte de contactos eléctricos ajustados a presión que formaba parte de la placa trasera de plexiglás de los componentes electrónicos que componen el controlador. La electrónica del controlador podría ser o analógica o digital y podría usar procesos tales como la modulación de anchura de pulso como mecanismo de control por realimentación. La placa trasera era de 3 pulgadas por 5 pulgadas y estaba compuesta de la circuitería de control por realimentación de la temperatura, la electrónica de calentadores, la interfaz de ordenador y el conector de fuente de alimentación. La circuitería se diseñó para trabajar con desde 8 hasta 32 voltios. Correlacionando la temperatura del fluido con la del termopar de tipo K de medición del silicio, se logró una calibración térmica. Una vez calibrado, el instrumento fue capaz de funcionar automatizadamente en ciclado térmico controlado por realimentación sin medición directa del fluido de reacción. La salida del termociclador es a un ordenador Apple Centris 650 que visualiza el tiempo real de ciclado térmico y almacena los perfiles acumulados. Cuatro pilas de nueve voltios fueron capaces de hacer funcionar a todo el instrumento de manera continua durante más de 2,5 horas.

Se establecieron PCR típicas como mezclas maestras ampliadas a escala para garantizar la uniformidad entre las alícuotas termocicladas bajo condiciones diferentes. Las cantidades de reactivo se basaron en las ideales para reacciones de 50 \mul. En general, las mezclas maestras contuvieron: 50 nM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 1,5-3,0 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de cada desoxinucleótido, u 800 \muM de dNTP en total, 0,5 \muM de cada uno de los dos cebadores oligonucleótidos, 25 unidades/ml de ADN polimerasa AmpliTaq® y un molde objetivo a un número de copia especificado por 50 \mul de reacción. Se añadió un molde para algunas de las PCR de \beta-globina como ADN monocatenario procedente de un clon del bacteriófago M13 de una parte del gen de la \beta-globina humana. El molde CF fue ADN bicatenario del genoma humano, obtenido de una línea celular cultivada, HL60, GM07480 o GM08345. Cada mezcla de reacción se tomó como una alícuota de la misma mezcla maestra y se termocicló en el instrumento de la presente invención y en un termociclador Perkin-Elmer GeneAmp® 9600. Se fraccionaron reacciones termocicladas de ambos termocicladores en agarosa, 3% de NuSeive, 1% de Seakem (FMC Corp.) utilizando el tampón tris-borato. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron bajo iluminación con luz UV de 302 nm.

Aunque concebida inicialmente para ser una cámara de reacción desechable de un solo uso, la naturaleza robusta y las propiedades estables permitieron un uso repetido de las cámaras de reacción.

El instrumento de ciclado térmico basado en MEMS (sistemas microelectromecánicos) de esta invención se ha probado con una variedad de sistemas de PCR, que incluyen moldes víricos, bacterianos y humanos. Asimismo, se han puesto en práctica y evaluado varios cambios tanto en el diseño de cámara de reacción como en la instrumentación del controlador. Se ha preparado una visualización en tiempo real de salida del controlador de un ciclado térmico de un termociclador microfabricado, y se ha demostrado que, con una entrada de 15 voltios (1,2 vatios de media), se obtienen velocidades de calentamiento de más de 5ºC/s. El enfriamiento es un poco más lento (2,5ºC/s), debido principalmente al hecho de que la cámara de reacción está contenida dentro de un panel de instrumentos de plexiglás. A las temperaturas objetivo, se mantiene una precisión de +/-0,5ºC. Se han conseguido velocidades de calentamiento y de enfriamiento más altas.

Se han realizado experimentos que demuestran la naturaleza cuantitativa del proceso de PCR tanto en el instrumento de la figura 9 como en los comerciales. Estos experimentos consistieron en tomar alícuotas de 5 \mul de 105 copias iniciales, PCR de la \beta-globina a partir de los dos instrumentos a 23, 25, 27, 29 y 31 ciclos. Estas alícuotas se introdujeron posteriormente en un gel de electroforesis de agarosa. Los resultados de ambos instrumentos son prácticamente idénticos. Se obtuvieron los mismos resultados cuantitativos de la serie de electroforesis en gel por la amplificación del objetivo de 268 pares de bases de la \beta-globina directamente a partir de ADN del genoma humano (HL60).

La PCR múltiple se considera una de las técnicas de amplificación del ADN más recientes y analíticamente potentes. Requiere un control preciso y uniforme de la temperatura dentro de la cámara de reacción. Se ha conseguido esto con el instrumento de esta invención.

La detección tras la PCR de las mutaciones específicas asociadas con la enfermedad de la fibrosis cística (CF), por ejemplo, pueden identificarse con sencillas tiras reactivas a base de nylon empleando la tecnología reverse-dot-blot (transferencia por puntos inversa). La tira reactiva tiene sondas de ADN inmovilizadas específicas que contienen la secuencia de mutación de interés. Los productos de la amplificación por PCR múltiple se colocan en un receptor de reactivo sencillo junto con el ensayo. Si se produce la unión y se retiene el ADN tras una etapa de lavado, el complejo enzimático ADN-biotina-estreptavidina cambiará de color tras el tratamiento con el sustrato. Se obtuvieron los resultados amplificados por el instrumento comercial y el de la figura 9 de la PCR seguida por el ensayo reverse-dot-blot para la CF.

A partir de los resultados de los experimentos y los resultados anteriores anteriormente mencionados con respecto a las solicitudes en tramitación junto con la presente anteriormente identificadas, con calentadores de un solo lado, las cámaras de reacción a base de silicio de varios tamaños y configuraciones son capaces de llevar a cabo reacciones químicas, tal como la PCR, con requisitos de potencia bajos.

La importancia de los resultados experimentales a los que se ha hecho referencia anteriormente es que, por primera vez, puede realizarse una amplificación por PCR manual, a pilas; y una sencilla detección dirigida, basada en reactivos, de compuestos biológicos y enfermedades complejos en un instrumento tal como el ilustrado en la figura 9.

El rápido ciclado térmico y la uniformidad térmica posibles ahora con una cámara de microrreacción a base de silicio, compatible, de tipo PCR, pueden proporcionar un discernimiento sobre las cinéticas enzimática y de hibridación. Por ejemplo, la importancia del control de la temperatura es primordial en el proceso de PCP, especialmente cuando hay que amplificar sistemas complejos (por ejemplo, el ADN del genoma humano, amplificaciones múltiples). El control preciso de la temperatura, así como la uniformidad térmica, deben equilibrarse. Para miniaturizar realmente el instrumento o aprovechar las cámaras de reacción microfabricadas a fin de construir instrumentación de alto rendimiento, tal como la ilustrada en las figuras 10A, 10B y 11, los elementos de control deben integrarse en una escala de unidad a unidad. Las propiedades térmicas de los diversos materiales usados también deben equilibrarse para combinar un control eficaz con una sensibilidad térmica. Los materiales a base de silicio ofrecen las propiedades térmicas necesarias y la capacidad para integrar calentadores y el control por realimentación, y su fabricación aprovecha un tratamiento extremadamente paralelo, automatizado y en serie.

Las figuras 10A-10B y 11 ilustran un enfoque sistémico que combina el instrumento termociclador de alta eficacia y rendimiento elevado, la manipulación de muestras y el módulo de electroforesis. El módulo de electroforesis podría también micromecanizarse en vidrio o silicio. El instrumento podría ser de naturaleza híbrida, es decir, una cámara de reacción a base de silicio y un minimódulo de electroforesis de vidrio, que aprovecha ambos sustratos o elementos, tal como en la realización de la figura 5. La ventaja de tener una detección en tiempo real de la producción de ADN es que permite al operador conocer la eficacia de la PCR durante la reacción en vez de esperar a ver los resultados en un gel. Esto mejorará significativamente la productividad de secuenciación del ADN eliminando el tiempo perdido al utilizar geles de electroforesis con muestras que no se han amplificado.

Las figuras 10A y 10B ilustran un instrumento de ciclado térmico, indicado generalmente en 90, que tiene un alojamiento 91 con una placa 92 frontal con varios indicadores en la misma, incluyendo una ventana 93 de "estado" similar a la placa frontal del instrumento portátil de la figura 9. El alojamiento incluye una tapa 94 articulada, debajo de la cual está situada una matriz 95 (véase la figura 10B) de cámaras 96 de microrreacción a base de silicio individualmente controladas, las cuales pueden ser, por ejemplo, del tipo ilustrado en las figuras 4 y 6. El instrumento 90 está diseñado para 384 cámaras 95 de microrreacción, aunque la matriz 95, tal como se muestra en la figura 10B, sólo incluye 100 cámaras para simplificar la ilustración.

La figura 11 es una representación esquemática de una aplicación de ADN de alto rendimiento, manipulación de muestras y sistema electrónico que utilizan el instrumento de las figuras 10A-10B, y los correspondientes números de referencia indican componentes correspondientes. Una matriz 95' de 384 cámaras 96' de reacción para PCR individualmente controladas (sólo se muestran cinco) está conectada operativamente a una unidad de entrada/salida automatizada de muestras, indicada generalmente en 97, que utiliza dos conjuntos de microinyectores, indicados generalmente en 98 y 99. la función de entrada/salida de muestras entre el conjunto 98 de microinyectores de la unidad 97 y la matriz 95 está indicada por una doble flecha 100, mientras que la función entre los conjuntos 98 y 99 de microinyectores está indicada por una doble flecha 101. El conjunto 99 de microinyectores está conectado operativamente a una matriz 102 de canales 103 individuales de electroforesis. Este sistema de entrada/salida de inyectores cargará muestras de reactivo procedentes de las cámaras 96 de reacción con energía electrocinética o vacío; las moverá automática o robóticamente a unos canales 103 de electroforesis; y descargará los reactivos por presión o inyección electrocinética de campo inverso en esos canales para la separación electroforética. El módulo de electroforesis podría también micromecanizarse. El silicio es bueno para las cámaras de reacción, y el vidrio para el módulo de electroforesis.

Los canales 103 de electroforesis formados en un sustrato de vidrio están conectados cada uno a una cámara de reacción de silicio del tipo mostrado en la figura 4 para producir una matriz 95 de cámaras 96' de reacción directamente conectada a la matriz 102 de canales 103 de electroforesis, tal como se muestra en la figura 5.

Las líneas/piezas de inserción desmontables/per-
manentes para las cámaras de reacción de un material que se sepa que es compatible con las reacciones apropiadas, tal como se muestra en la figura 12, reducirán en algunas aplicaciones los costes globales, ya que estos forros/piezas de inserción pueden ser desechables. Además, se consideran agentes de deriva para las superficies de la cámara de reacción a base de silicio a fin de mejorar el enlace covalente y/o de otro tipo a los forros. Algunos ejemplos son los silanos, las poliimidas, los teflones, el polietileno y otros polímeros orgánicos/reactivos.

La figura 12 ilustra una realización de una pieza de inserción/forro, generalmente indicado en 105, para una cámara de reacción con una ventana 106 óptica dentro de la misma. La pieza de inserción/forro 105 incluye un alojamiento 107 de seis lados y una tapa 108 superior. El alojamiento 107 de seis lados está configurado para, por ejemplo, insertarse en una abertura 54 de la cámara 50 de reacción de la realización de la figura 6, de manera que la ventana 106 se alinee con una de las ventanas 55 ó 56 de la figura 6. El alojamiento 107 puede construirse en plástico u otro material compatible expuesto anteriormente. La ventana 106 de la pieza de inserción/forro 105 incluye una tira 109 reactiva, descrita de aquí en adelante con respecto a la figura 14.

La figura 13 ilustra un llenado desde el exterior de la pieza de inserción/forro 105 de cámara de reacción de la figura 12 a través de una conexión exterior entre fluidos, indicada generalmente en 110. Ejemplos de conexiones fluídicas incluyen: agujas de jeringuilla, puntas de pipeta y capilares de sílice fundida o tubos de vidrio o polímero.

La inmovilización superficial de las ventanas (o de la tira reactiva) con sondas para la detección óptica o diferente (otras detecciones basadas en microtratamiento) de la producción y especificidad de productos puede proporcionarse tal como se muestra en la figura 14, la cual es una vista ampliada de la tira 109 reactiva de la figura 12. En las ventanas de las cámaras de reacción de las figuras 4 y 6 puede incluirse una tira reactiva así. Mediante el uso de la tira 109 reactiva, pueden detectarse ópticamente en el instrumento portátil PCRman de la figura 9 reactivos/sondas inmovilizados para la detección de productos específicos directamente sobre la ventana, tal como la 106 de la figura 12, o dentro del fluido de reacción en la pieza de inserción/forro 105 de cámara de reacción de la figura 12. La superficie interna real de la ventana podría utilizarse como superficie de inmovilización para sondas de detección de productos u objetivos específicos, o podría utilizarse la ventana para observar una superficie de inmovilización/detección dentro de la cámara.

Las figuras 15 y 16 ilustran esquemáticamente dos disposiciones para la detección óptica. La disposición de la figura 15 es una versión láser/ccd, mientras que la disposición de la figura 16 permitirá un funcionamiento a baja potencia para la puesta en práctica en el PCRman (instrumento portátil) de la figura 9.

Tal como se muestra en la figura 15, esta disposición de detección óptica para una cámara 120 de reacción con una ventana 121 y una electrónica 122 de control incluye un filtro 123 óptico, tal como un filtro de interferencia o un filtro pasabanda para dejar pasar la longitud de onda de detección de interés, un CCD 124, una imagen digitalizada, indicada generalmente en 125, una óptica 126 de enfoque, un reflector/divisor 127 y un láser 128 de iones de argón. El funcionamiento es el siguiente: El láser excita el colorante indicador fluorescente asociado con la detección de productos. La señal fluorescente es monitorizada por el CCD 124. De manera similar, podría emplearse la espectroscopia de absorción.

La figura 16 es un sistema óptico de detección miniaturizado para una cámara 120' de reacción que tiene una ventana 121' y una electrónica 122' de control, se compone de dos filtros 130 y 131, un detector 132 de estado sólido y un LED 133 azul. Los filtros 130 y 131 son, o bien pasabanda, o bien paso alto, para seleccionar la emisión (es decir, 600 nm de paso alto), y pasabanda para seleccionar la longitud de onda de excitación de interés, tal como 488 nm \pm 10 nm. El paso de banda de excitación puede utilizarse para seleccionar a partir de la emisión normalmente ancha de un LED, por ejemplo. El funcionamiento del sistema de detección de la figura 16 es el siguiente: El LED se filtra hasta 488 \pm 10 nm como fuente de excitación (o de absorción) para la tinta indicadora fluorescente. El detector de estado sólido también se filtra para recibir únicamente las longitudes de onda de detección (> 600 nm), o como detector de absorción.

La inteligencia artificial es una manera de producir ADN y determinar cuántos ciclos realizar, cuándo han finalizado, si funcionó, la regulación de parámetros para mejorar la producción, etc. Mediante el uso de sistemas de detección en tiempo real, tal como el ilustrado esquemáticamente en la figura 17, puede proporcionarse un sistema de realimentación por inteligencia artificial que utiliza una detección integrada. El sistema de la figura 17 comprende una cámara 135 de reacción que tiene una ventana 136, un detector 137 para la detección in situ de la producción de ADN, un control 138 de instrumentos para la cámara 135 de reacción, y un sistema 139 de lectura de datos que recibe datos procedentes del detector 137, tal como se indica mediante una flecha 140, y suministra datos de control a un controlador 138, tal como se indica mediante una flecha 141. El sistema 139 de lectura de datos proporciona información tal como cuánto ADN está produciéndose, el número inicial de copias, que ha finalizado la reacción, etc. Al cuantificar la producción de ADN a través del sistema óptico de monitorización, el cual es bien conocido, el sistema podría regular su tiempo de ciclado y su número de ciclos para producir el número mínimo de ciclos requeridos para la detección, acelerando así el proceso. Además, mediante la determinación del número de ciclos requerido para detectar una señal fluorescente dada, o concentración producto, el sistema sería capaz de calcular todo el número inicial de copias o la concentración de la muestra inicial. Esto permitiría unos cálculos automatizados de la concentración. La información cuantitativa en tiempo real puede permitir a los sistemas ajustar los parámetros de reacción tales como las temperaturas objetivo, los tiempos de retención y las velocidades de desnivel.

Una célula microfabricada de electroluminiscencia para la detección de ADN amplificado se describe de aquí en adelante con respecto a las figuras 18-31, y las cuales exponen el diseño, fabricación y comprobación de la misma. La microcélula está diseñada para ser la unidad de detección en un microinstrumento de PCR, tal como el descrito anteriormente e ilustrado en la figura 9. La célula es una unidad vertical de silicio y vidrio micromecanizados y contiene unos electrodos de película delgada, tal como se muestra en las figuras.

La detección de ADN por medio de electroluminiscencia comienza con una amplificación del ADN por PCR para aumentar la concentración hasta niveles detectables. A continuación, se marca con tris(2,2'bipiridil)rutenio (II) (TBR). El TBR oxidado emite luz (naranja) al reducirse. La oxidación tiene lugar electroquímicamente en una superficie de electrodo, de ahí que la emisión de luz se denomine electroquimioluminiscencia (ECL). El TBR requiere un potencial de oxidación relativamente bajo (unos pocos voltios) y presenta una alta eficacia de ECL en el campo visible (620 nm). Esto hace que sea atractivo para aplicaciones de microsensores, puesto que la emisión visible se detecta fácilmente con fotodiodos de silicio, los cuales podrían integrarse en una célula micromecanizada de silicio. La reducción puede producirse electroquímica o químicamente; en cualquiera de los casos, se emite luz. Por ejemplo, la tripropilamina (TPA) oxidada transfiere fácilmente un electrón al TBR oxidado, con lo cual, el TBR emite luz químicamente. Dado que ambas oxidaciones pueden tener lugar en el mismo electrodo, pueden producirse muy próximas concentraciones relativamente grandes de ambas especies, lo que da como resultado una intensidad más alta para una cierta concentración de TBR que si sólo se encontrase presente en disolución el TBR. Las reacciones de oxidación electroquímica y de reducción química para el TBR que se producen en el ánodo se ilustran esquemáticamente en la figura 18. La reducción electroquímica también tiene lugar en el cátodo. A fin de sólo oxidar el ADN marcado con TBR y no el TBR libre, se requiere una separación entre los dos. Una manera de lograr esto es empleando la unión muy específica de inmunoproteínas (anticuerpo-antígeno).

En la figura 19 se muestra un ejemplo, en el que se forma un cebador de biotina en un extremo 5' de una cadena de un ADN objetivo, y el TBR se marca en el extremo 5' de la cadena complementaria. Durante el proceso PCR, se producen dobles cadenas de ADN con biotina y TBR marcados en cualquiera de los extremos. El ADN marcado con biotina puede entonces introducirse en una célula electroquímica con un ánodo cuya superficie está recubierta de avidina, el anticuerpo para la biotina. Se producirá un enlace selectivo, tras el cual, la disolución en la célula se vacía para eliminar cualquier TBR "libre". A continuación, el TBR unido al ADN, que a su vez está unido al ánodo a través del enlace anticuerpo-antígeno, puede oxidarse junto con la TPA añadida, y la subsiguiente intensidad de la luminiscencia dependerá de la cantidad de ADN que halle presente.

La microcélula ECL, tal como se describe más detalladamente en lo sucesivo con respecto a las figuras 21-31, es una unidad multicapa de silicio y vidrio micromecanizados. Se han diseñado y fabricado en silicio celdas con capacidad de disolución que oscila desde 35 \mul hasta 85 \mul. Una película delgada de oro, depositada mediante un haz de electrones, forma el cátodo de la célula. El ánodo es también una película delgada. Se han realizado experimentos con óxido de indio y estaño (ITO - indium tin oxide) y platino. El ITO es transparente a la luz visible, de manera que cuando se deposite sobre vidrio, pueda formar la capa superior de la unidad a través de la cual la luz emitida pueda ser captada por un fotodetector (véase la figura 21). La unidad también contiene unos orificios micromecanizados de llenado de fluido (véase la figura 22). Las capas se ensamblaron y adhirieron (véanse las figuras 29-30) utilizando una poliimida de endurecimiento a baja temperatura, tal como Epotek 400.

Se han realizado experimentos de ECL en la microcélula con TBR libre, es decir, sin ADN. Las células se llenaron con una solución de TPA + TBR, y se colocó un tubo fotomultiplicador (PMT - photomultiplier tube) muy próximo a la capa superior de vidrio de la célula para detectar la emisión. La quimioluminiscencia producida por la reacción de la TPA y el TBR oxidados depende de la concentración de ambos compuestos químicos. En estos experimentos, la concentración de TPA se mantuvo constante (50 mM) y la de TBR se varió. Las disoluciones se prepararon tal como sigue: Se disolvió 1 g de cloruro de TBR hexahidratado en TPA 50 mM para formar 5 mM de TBR, que luego se diluyó con TPA 50 nM adicional para producir un conjunto de soluciones de ensayo cuyas concentraciones de TBR oscilan desde 0,1 nM hasta 5 mM. Se empleó un potenciostato EG&G, modelo PARC 273, para producir voltamogramas de la disolución TBR + TPA, tanto en la microcélula con electrodos de película delgada de ITO y de oro como en una célula electroquímica más convencional con electrodos de hilo de platino. A partir del voltamograma, se determinó el potencial de oxidación en el que se produce la ECL y luego se aplicó como una polarización de c.c. entre el cátodo y el ánodo de película delgada. La luz emitida se midió con un Hamamatsu MT, modelo R928, polarizado a 600 voltios. La figura 20 muestra la relación entre la intensidad de la luz y la tensión de electrodo medidas para una concentración de TBR de /mM, donde se representa la tensión de célula y la intensidad de ECL frente al tiempo. La tensión, tal como se indica mediante la línea de punto-línea-punto, se incrementa y luego se reduce. La tensión pasa por el potencial de oxidación del TBR en ambos sentidos, donde la intensidad de la ECL es un máximo. En las pruebas realizadas hasta ahora, la concentración más baja de TBR que se ha medido utilizando la microcélula con una película de ITO como material del ánodo fue de 1 \muM. Con un ánodo de platino, las concentraciones de TBP medidas fueron tan bajas como 1 nM. Se cree que la resistencia relativamente alta de la película de ITO limita la corriente de oxidación para la TPA y por tanto que reduce la sensibilidad. Se ha determinado que puede mejorarse la sensibilidad depositando una película delgada de un material, tal como aluminio, sobre la película de ITO, tal como se describe en lo sucesivo con respecto a la figura 31. Además, están realizándose esfuerzos para integrar el fotodiodo de silicio en la microcélula en vez de estar separado de la misma, tal como en la realización de la figura 21.

La figura 21 ilustra una realización de una célula ECL micromecanizada con un ánodo de película delgada, indicado generalmente en 140, y un fotodiodo 141 de silicio (Si) situado adyacente a la célula 140 ECL. La célula 140 ECL se muestra en la figura 22 en corte transversal ampliado. La célula 140 comprende un par de elementos 142 y 143 de silicio entre los cuales está colocado un electrodo 144, el cual puede construirse de oro (Au), platino (Pt) o plata (Ag), una capa 145 de ITO y una capa o portaobjetos 146 de vidrio. El elemento 142 de silicio incluye una cámara 147 de reacción, y el elemento 143 incluye un par de orificios 148 de llenado (véase la figura 22) a través de los cuales un analito, tal como se indica mediante la leyenda, se dirige al interior de la cámara 147 y se saca de la misma a través de unos tubos o conductos 149 y 150, tal como se indica mediante unas flechas 151 y 152. Tal como se observa en la figura 22, una sección 153 central del elemento 143 de silicio situada entre los orificios 148 de llenado, define, junto con la capa 145 de ITO y el portaobjetos 146 de vidrio, una ventana mediante la que pueden detectarse reacciones dentro de la cámara 147, tal como se indica mediante unos fotones 154 que pasan a través de la misma sobre el fotodiodo 141. Unos conectores 155 y 156 eléctricos están conectados desde una fuente de alimentación hasta el electrodo 144 y la capa 145 de ITO, respectivamente, mientras que el fotodiodo 141 está conectado eléctricamente a una fuente de alimentación a través de unos conectores 157 y 158.

Las figuras 23-30 ilustran la fabricación de una realización de una célula ECL similar a la de las figuras 21 y 22. El proceso de fabricación se lleva a cabo de la siguiente manera:

1. Se recubre un bloque 160 de silicio para formar una capa 161 de nitruro de silicio (véase la figura 23).

2. Se deposita una capa 162 de líquido fotorresistente sobre la capa 161 (véase la figura 24).

3. La capa 162 se configura y se realiza un proceso fotolitográfico para formar una abertura 163 en la misma (véase la figura 25).

4. La sección 161' de la capa 161 de nitruro de silicio debajo de la abertura 163 se elimina mediante ataque RIE (véase la figura 26).

5. Se elimina una sección del bloque 160 de silicio mediante ataque con KOH para formar una cámara 164 de reacción, y se elimina el líquido 162 fotorresistente restante (véase la figura 27).

6. Se deposita una capa de, por ejemplo, oro mediante evaporación de capa delgada sobre la superficie superior del bloque 160 y la cámara 164 para formar un electrodo 165 (véase la figura 28).

7. Se recubre un segundo bloque 166 de silicio con una capa 167 de nitruro de silicio y se forman en la misma unas aberturas 168 y 169 mediante ataque RIE, y se forma un par de orificios 170 y 171 de llenado, tal como mediante micromecanizado, en el bloque 166, y el bloque 166 recubierto de nitruro de silicio se adhiere al electrodo 165 (véase la figura 29).

8. Se deposita una capa de ITO, que forma un electrodo 172, sobre una capa o portaobjetos 173 de vidrio y se adhiere luego a la capa 167 de nitruro de silicio (véase la figura 29).

9. Se fijan unos conectores 174 y 175 eléctricos al electrodo 165 de oro y al electrodo 172 de ITO, se adhiere un detector 176, tal como el fotodiodo de la figura 21, que tiene unos conectores 177 y 178 eléctricos, a la capa 173 de vidrio, y el bloque 160 de silicio recubierto de nitruro de silicio se coloca en un imán 179 que tiene unos conectores 180 y 181 eléctricos (véase la figura 30).

Para reducir la resistencia del electrodo 172 de ITO, puede depositarse una película delgada 182 de aluminio (véase la figura 31) sobre la capa ITO del electrodo 172 antes de que el mismo se adhiera al bloque 166 de silicio recubierto de nitruro de silicio.

Por tanto, se ha demostrado que la presente invención proporciona una cámara de microrreacción a base de silicio que puede emplearse en un instrumento portátil o en un instrumento grande de alto rendimiento.

Claims (14)

1. Reactor químico microfabricado que comprende una cámara (41) de reacción a base de silicio, caracterizado porque dicha cámara de reacción tiene la forma de un manguito que comprende una ranura (42), en el que dicha ranura se utiliza para la inserción de un fluido de reacción directamente o a través de un tubo.

2. Reactor químico según la reivindicación 1, en el que dicha cámara (41) de reacción de manguito está dotada de al menos una ventana (48) óptica.

3. Reactor químico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha cámara (41) de reacción de manguito se compone de una pluralidad de elementos (51, 52) de silicio adheridos, estando construidos dichos elementos (51, 52) de silicio adheridos de polisilicio y silicio en grandes cantidades, en el que se utiliza polisilicio dopado para el calentamiento y silicio en grandes cantidades para el enfriamiento por convección.

4. Reactor químico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha cámara (41) de reacción de manguito incluye un par de ventanas (55, 56) y unos medios (57, 65) de calentamiento situados adyacentes a cada una de dichas ventanas (55, 56).

5. Reactor químico según la reivindicación 4, en el que dichas ventanas (55, 56) se construyen de nitruro de silicio y dichos medios (57, 65) de calentamiento comprenden un calentador de polisilicio dopado.

6. Reactor químico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha ranura (42) en dicha cámara (41) de reacción es de configuración de múltiples lados.

7. Reactor químico según la reivindicación 2, que incluye adicionalmente una pieza (105) de inserción adaptada para insertarse en dicha ranura (42), incluyendo dicha pieza (105) de inserción al menos una ventana (106).

8. Reactor químico según la reivindicación 7, en el que dicha al menos una ventana (106) de dicha pieza (105) de inserción está dotada de al menos una tira (109) reactiva.

9. Reactor químico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha cámara (41) de reacción de manguito a base de silicio se construye para insertarse en un instrumento (75) portátil a pilas y/o en un instrumento construido para contener una matriz (95) de tal cámara (96) de reacción, estando conectada operativamente dicha matriz (95) de cámaras (96) de reacción, a través de una matriz de microinyectores (98, 99), a una matriz (102) de electroforesis o estando conectada directamente a la matriz (102) de electroforesis.

10. Reactor químico según la reivindicación 9, en el que dicha matriz (95) de cámaras (96) de reacción se construye de silicio y en el que dicha matriz de electroforesis se construye de vidrio.

11. Reactor químico según la reivindicación 2, que incluye adicionalmente un detector óptico colocado adyacente a dicha ventana (106) óptica.

12. Reactor químico según la reivindicación 11, que incluye adicionalmente un sistema (139) de lectura de datos conectado operativamente a dicho detector óptico, y un controlador (138) de instrumento conectado operativamente a dicho sistema (139) de lectura de datos y dicha cámara (135) de reacción.

13. Reactor químico según la reivindicación 1, que incluye adicionalmente un forro (105) adaptado para insertarse en dicha ranura (42) y en el que dicha cámara (41) de reacción a base de silicio está dotada de al menos una ventana (55, 56) adyacente a dicha ranura (42) y de un calentador (57, 65) colocado adyacente a dicha ventana.

14. Reactor químico según la reivindicación 1, en el que dicho tubo se dispone deslizantemente en dicha ranura para la inserción del fluido de reacción.