DE69312483T2

DE69312483T2 - Mikrofabrizierte detektoren

Info

Publication number: DE69312483T2
Application number: DE69312483T
Authority: DE
Inventors: Larry Kricka; Peter Wilding; Jay Zemel
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1992-05-01
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2013-04-30
Also published as: WO1993022053A1; JPH07506258A; CA2134477A1; GR3029509T3; HK16897A; DE69303898T3; DE69303483T2; DE69319427D1; DE69303898T2; EP0637997B1; GR3025037T3; EP0639223A1; CA2134476A1; DE69303898D1; EP0637999A1; CA2134478A1; AU677780B2; CA2134474C; CA2134476C; JP3207424B2

Description

Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren und eine Vorrichtung zum Ausführen von Analysen. Genauer betrifft die Erfindung das Design und den Aufbau kleiner, typischer Einwegmodule, die flüssige Proben aufnehmen und an diesen einen bestimmten Testablauf schnell durchführen können.
In den zurückliegenden Jahrzehnten wurde im Stand der Technik eine sehr große Zahl an Testverfahren, -kits und Patronen zum Durchführen von Analysen an biologischen Proben für verschiedenste diagnostische und Überwachungszwecke entwickelt. Dabei sind sowohl Immuntests, Agglutinationstests sowie auf der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) beruhende Analysen, verschiedene Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen als auch die differentielle Migration von Spezies in einer komplexen Probe verwendet worden, um die Anwesenheit oder die Konzentration verschiedener biologischer Verbindungen oder Verunreinigungen oder die Anwesenheit bestimmter Zelltypen zu bestimmen.
Kürzlich wurden kleine, wegwerfbare Vorrichtungen zur Handhabung biologischer Proben sowie zur Durchführung bestimmter klinischer Tests entwickelt. Shoji et al. berichten über die Verwendung eines miniaturisierten Blutgasanalysegeräts, das aus einem Silikonchip hergestellt wurde (Shoji et al., Sensors and Actuators, 15 : 101 - 107 (1988)). Sato et al. berichteten über ein Zellfusionsverfahren unter Verwendung von mikromechanischen Silikonbauteilen (Sato et al., Sensors and Actuators, A21 - A23 : 948 - 953 (1990)). Die Ciba Corning Diagnostics Corp. (USA) hat ein Mikroprozessor-gesteuertes Laserphotometer zum Nachweis der Blutkoagulation hergestellt.
Die Mikromaschinentechnologie stammt aus der Mikroelektronikindustrie (Angell et al., Scientific American, 248 : 44 - 55 (1983)). Die Mikromaschinentechnologie ermöglichte die Herstellung von Mikrobauteilen, die Strukturelemente mit minimalen Dimensionen im Bereich von Zehnteln von Mikrometern (der Dimension biologischer Zellen) bis zu Nanometern (den Dimensionen einiger biologischer Makromoleküle) aufweisen. Diese Größenordnung wird hier als "Mesoscale" bezeichnet. Die meisten, Mesoscale-Strukturen involvierenden Experimente beinhalteten die Untersuchungen der Mikromechanik, d.h. mechanische Bewegungs- und Strömungseigenschaffen. Die potentielle Möglichkeiten von Mesoscale-Strukturen sind in den Biowissenschaften nicht voll ausgenutzt worden.
Brunette (Exper. Cell Res., 167 : 203 - 217 (1986) und 164 : 11 - 26 (1986)) hat das Verhalten von Fibroblasten und Epithelzellen in Kerben in Silikon, in mit Titan beschichteten Polymeren und dergleichen untersucht. McCartney et al. (Cancer Res., 41: 3046 - 3051 (1981)) untersuchten das Verhalten von Tumorzellen in eingekerbten Kunststoffsubstraten. Lacelle (Blood Cells, 12 : 179 - 189 (1986)) untersuchte die Strömung von Leukozyten und Erythrozyten in Mikrokapillaren, um einen Einblick in die Mikrozirkulation zu erhalten. Hung und Weissman berichteten über eine Studie der Flüssigdynamik in mikroerzeugten Kanälen, zeigen jedoch keine Daten, die mit einer analytischen Vorrichtung verbunden waren (Hung et al., Med. and Biol. Engineering, 9 : 237 - 245 (1971)) und Weissman et al., Am. Inst. Chem. Eng. J., 17 : 25-30 (1971)). Columbus et al. verwendeten ein Sandwich aus zwei quer orientierten mit v-förmigen Kerben geprägten Folien zur Steuerung des Kapillarstroms biologischer Fluide an diskrete, ionenselektive Elektroden in einer Mehrkanal- Testexperimentvorrichtung (Columbus et al., Clin. Chem., 33 : 1531 - 1537 (1987)). Masuda et al. und Washizu et al. berichteten über die Verwendung einer Fluidströmungskammer zur Zellmanipulation (z.B. zur Zellfusion) (Masuda et al., Proceedings IEEE/IAS Meeting, S.1549 - 1553 (1987) und Washizu et al., Proceedings IEEE/IAS Meeting, S.1735 - 1740 (1988)). Der Stand der Technik hat das Potential der Verwendung von Mesocsale- Vorrichtungen zur Analyse von biologischen Flüssigkeiten und zum Nachweis von Mikroorganismen noch nicht völlig entdeckt.
Die EP-A-0 483 117 offenbart eine Kapillarströmungsvorrichtung, die die Kapillarwirkung einsetzt, um eine einen Analyten enthaltende Probe in eine Kammer für einen Agglutinationstest einzusaugen.
Gegenwärtige Analyseverfahren, die zum Nachweis von Mikroorganismen verwendet werden, sind selten automatisiert, erfordern üblicherweise die Inkubation in einem geeigneten Medium zur Vermehrung der Organismenzahl und wenden stets visuelle und/oder chemische Verfahren zur Identifizierung des Stammes oder der Subspezies an. Die solchen Vorgehensweisen inhärente Verzögerung erfordert oft ein medizinisches Eingreifen vor der endgültigen Identifizierung der Art einer Infektion. In der Industrie, für die öffentliche Gesundheit oder in der Klinik können derartige Verzögerungen ernste Konsequenzen nach sich ziehen. Es besteht ein Bedarf an bequemen Systemen zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung analytische Systeme mit optimalen Reaktionsumgebungen zur Verfügung, die Mikrovolumen von Proben analysieren, in sehr geringen Konzentrationen vorhandene Substanzen nachweisen und schnell Analysenergebnisse vorlegen können. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung leicht in der Massenproduktion herzustellende, wegwerfbare, kleine (z.B. mit weniger als 1 cm³ Volumen) Vorrichtungen mit mesoscale funktionalen Elementen zur Verfügung, die zur schnellen, automatisierten Analyse vorbestimmter molekularer oder zellulärer Analyten im Bereich biologischer oder anderer Anwendungen in der Lage sind. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Familie solcher Vorrichtungen zur Verfügung, die einzeln zur Implementierung einer Reihe von schnellen klinischen Tests verwendet werden können z.B. für Tests auf bakterielle Verunreinigung, Virusinfektionen, Spermabeweglichkeit, für Blutparameter, auf Verunreinigungen in Nahrungsmitteln, Wasser oder Köperflüssigkeiten und dergleichen mehr.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß den Aspekten der Erfindung werden bereitgestellt Verfahren und Vorrichtungen zur Detektion eines vorbestimmten Analyten in einer flüssigen Probe wie in Anspruch 1 und 11 dargelegt. Die Vorrichtung umfaßt ein festes Substrat, typischerweise in der Größenordnung von einigen Millimetern dick und ungefähr 0,2 bis 2,0 Zentimeter im Quadrat, das mikrofabriziert wurde, um eine Probeneinbringöffnung und ein Mesoscale-Strömungssystem zu definieren. Der Ausdruck "Mesoscale" wird hier verwendet, um Kammern und Strömungspassagen mit Querschnittsdimens ionen in der Größenordnung von 0,1 µm bis 500 µm zu definieren. Die Mesoscale-Strömungskanäle und Flüssigkeitshandhabungsbereiche weisen eine bevorzugte Tiefe von 0,1 µm bis 100 µm, typischerweise 2 - 50 µm auf. Die Kanäle haben vorzugsweise Weiten in der Größenordnung von 2,0 µm bis 500 µm, stärker bevorzugt 3 - 100 µm. Für zahlreiche Anwendungen sind Kanäle mit 5 - 50 µm Weite geeignet. Die Kammern im Substrat werden oftmals größere Dimensionen aufweisen, z.B. einige Millimeter.
Das Mesoscale-Strömungssystem der Vorrichtung schließt einen Probenströmungskanal, der sich von der Einbringöffnung weg erstreckt, und einen Analytendetektionsbereich in Flüssigkeitskommunikation mit dem Strömungskanal ein. Der Analytendetektionsbereich ist mit einer Bindungsgruppe, die gegebenenfalls darin immobilisiert ist, zur spezifischen Bindung des Analyten ausgestattet. Die Mesoscaledimensionen des Detektionsbereiches fördern die Bindung der Bindungsgruppe mit dem Analyten kinetisch. Das bedeutet, daß im Detektionsbereich die Reaktanden in einem abgeschlossenen Raum dicht zueinander gebracht werden, so daß viele molekulare Kollisionen stattfinden. Die Vorrichtungen können zur Implementierung einer Vielzahl von automatisierten, empfindlichen und schnellen klinischen Tests, einschließlich der Analyse von Zellen oder Makromolekülen, oder zur Überwachung von Reaktionen oder des Zellwachstums verwendet werden.
Wie hier offenbart, umfaßt das feste Substrat im allgemeinen einen Chip, der ein Mesoscale-Strömungssystem enthält. Die Chips werden so gestaltet, daß sie eine Kombination funktionaler geometrischer Merkmale mit allgemein bekannten Typen der klinischen Chemie nutzen, um die Detektion von Mikromengen eines Analyten zu implementieren. Das Mesoscale-Strömungssystem kann aus Silikon und anderen festen Substraten unter Anwendung etablierter Mikrofabrikationsverfahren oder durch Formen von Polymermaterialien gestaltet und fabriziert werden. Die Mesoscale-Strömungssysteme in den Vorrichtungen können durch Mikrofabrikation von einem oder mehreren Strömungskanälen und Dektektionsbereichen in die Oberfläche des Substrats hinein und anschließendes Anfügen einer Abdeckung z.B. einer transparenten Glasabdeckung über die Oberfläche konstruiert werden. Im Querschnitt durch die Dicke des Chips können die Kammern und Kanäle dreieckig, trapezförmig, quadratisch, rechteckig, rund oder in jeder anderen Form gestaltet sein. Die Vorrichtungen sind üblicherweise in einer Größe gestaltet, daß sie für die Analyse von Mikrovolumina (< 5 µl) einer Probe geeignet sind, die in das Strömungssystem durch eine z.B. mit Hilfe eines Loches, das mit dem Strömungssystem kommuniziert, durch das Substrat oder die transparente Abdeckungsscheibe hindurch definierten Einlaßöffnung eingebracht wird. In sehr geringen Konzentrationen in Mikrovolumina einer Probenflüssigkeit vorhandene Zellen oder Analyten (z.B. in Nanogrammengen) können schnell analysiert werden (z.B. < 10 Min.).
Der Chip wird üblicherweise mit einem Gerät verwendet werden, das eine Aufnahmestelle zum Aufnehmen des Chips enthält und die Einbringöffnung auf dem Chip mit einer Strömungsleitung in der Vorrichtung verbindet. Nach Auftragen einer biologischen Flüssigkeit wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Sputum, Speichel oder anderer Flüssigkeiten, von denen man annimmt, daß sie einen bestimmten Analyten, eine zelluläre Verunreinigung oder ein Toxin enthalten, an der Einbringöffnung des Substrats wird der Chip in dem Gerät angeordnet und eine Pumpe betätigt, um die Probe durch das Strömungssystem zu treiben. Alternativ kann die Probe mit Hilfe des Geräts in den Chip injiziert werden, oder die Probe kann in das Mesoscale-Strömungssystem des Chips über die Einbringöffnung aufgrund der Kapillarkräffe eindringen.
In den Vorrichtungen dient die Bindung des Analyten an eine Bindungsgruppe als positives Anzeichen der Anwesenheit des Analyten in der Probe. Der Mesoscale-Detektionsbereich ist mit einer Bindungsgruppe ausgestattet, die spezifisch an den vorbestimmten Analyten binden kann. Die Bindungsgruppe kann an den Detektionsbereich z.B. in einer Lösung übermittelt werden. Alternativ dazu kann die Bindungsgruppe im Detektionsbereich immobilisiert sein. Die Innenoberflächen des Mesoscale-Detektionsbereiches der Vorrichtung können mit einer immobilisierten Bindungsgruppe beschichtet sein, damit die Oberfläche mit einer Flüssigkeitsprobe zum Nachweis oder Abtrennung spezifischer Bestandteile der Flüssigkeitsprobe interagieren kann. Antikörper oder Polynukleotidsonden können auf der Oberfläche der Strömungskanäle immobilisiert sein, was die Verwendung des Mesoscale- Strömungssystems in Immuntests oder Polynukleotidhybridisierungstests ermöglicht. Die Bindungsgruppe kann auch einen Liganden oder Rezeptor aufweisen. Eine zur Bindung von Zellen über Zelloberflächemoleküle befähigte Bindungsgruppe kann eingesetzt werden, um die Isolierung oder Detektion einer Zellpopulation in einer biologischen Mikroprobe zu ermöglichen. Das Mesoscale-Strömungssystem kann auch Vorsprünge oder einen Bereich mit verringerter Querschnittsfläche aufweisen, um so das Sortieren oder die Lyse von Zellen in der Mikroprobe beim Strömen durch das Strömungssystem zu gestatten.
Die Analytbindung an die Bindungsgruppe im Detektionsbereich kann optisch z.B. über ein transparentes oder durchscheinendes Fenster wie eine transparente Abdeckung über dem Detektionsbereich oder über eine durchscheinende Sektion des Substrats selbst nachgewiesen werden. Änderungen von Farbe, Fluoreszenz, Lumineszenz usw. bei Bindung des Analyten an die Bindungsgruppe, die einen positiven Test indizieren, lassen sich entweder visuell oder maschinell detektieren. Das Gerät kann eine Sensorausstattung wie ein Spektrophotometer enthalten, das die Änderungen der optischen Eigenschaften aufgrund der Bindung des Analyten an die Bindungsgruppe im Detektionsbereich durch eine klare Abdeckung über dem Detektionsbereich detektieren kann.
Die Vorrichtung kann darüber hinaus Mittel zum Übermitteln von Reagenzien wie einer markierten Substanz an den Detektionsbereich einschließen, die zur Bereitstellung eines detektierbaren Signais, das die Anwesenheit des Analyten anzeigt, an den Analyten bindet. Wahlweise, je nach dem in der Chipstruktur angewandten Protokoll, kann das Gerät auch auf die Injektion von Reagenzien, die zur Vervollständigung des Tests erforderlich sind, hin ausgelegt sein, z.B. auf die Injektion eines mit einer optisch detektierbaren Gruppe markierten Bindungsproteins, einer Substratlösung zur Reaktion mit einem Enzym oder anderer Reagenzien.
Ein positiver Test kann auch über eine nachweisbare Agglutination oder einen Strömungswiderstand bei Bindung des Analyten angezeigt werden. Die Anwesenheit eines vorbestimmten Analyten in einer Flüssigkeitsprobe kann durch Abtasten von Analyt- induzierten Änderungen der Fluidströmungseigenschaffen der Probe wie Änderungen im Druck oder der elektrischen Leitfähigkeit an verschiedenen Punkten des Strömungssystems detektiert werden. Gemäß einer Ausführungsform läßt sich eine Analyt-induzierte Restriktion oder ein Block der Strömung im Mesoscale-Strömungssystem z.B. im fraktalen Bereich mit Hilfe von Dtuckdetektoren z.B. im in Kombination mit der Vorrichtung verwendeten Gerät detektieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform läßt sich eine Analyt-induzierte Änderung der Leitfähigkeit in einem Bereich des Strömungssystems, die durch die Einführung der Probenflüssigkeit hervorgerufen wird, leicht über Sensoren für elektrische Leitfähigkeit im Kontakt mit dem Strömungssystem detektieren. Beispielsweise kann die Anwesenheit des Analyten ein Verstopfen einer beschränkten Strömungspassage verursachen und hinter dieser Passage kann das Fehlen von Flüssigkeit über die Messung der Leitfähigkeit detektiert werden. Das Gerät kann auch elektrische Kontakte im Aufnahmebereich einschließen, die an in die Chipstruktur integrierte Kontakte anschließen, um z.B. für elektrische Widerstandserwärmung oder -kühlung in einem Bereich des Strömungssystems zu sorgen oder elektrische Signale als Indiz für eine Druckablesung, für die Leitfähigkeit oder dergleichen zu empfangen, die in irgendeinem Bereich des Strömungssystems abgetastet werden, um (die Strömungsbeschränkung als) ein positives Indiz für die Anwesenheit des Analyten anzuzeigen.
Die Mesoscale-Vorrichtungen können an die Durchführung eines weiten Bereichs von biologischen oder anderen Tests angepaßt werden. Eine Vorrichtung kann zwei oder mehr separate Strömungssysteme, die z.B. von einer gemeinsamen Einbringöffnung gespeist werden, mit unterschiedlichen B indungsgruppen in beispielsweise unterschiedlichen Detektionsbereichen einschließen, um so den Nachweis von zwei oder mehr Analyten gleichzeitig zu ermöglichen. Die Vorrichtung kann auch ein Kontrollströmungssystem aufweisen, so daß Daten aus dem Proben- und dem Kontrollbereich detektiert und verglichen werden können. Im wesentlichen kann jeder Test, der die Detektion der Anwesenheit oder Konzentration eines Analyten im molekularen oder atomaren Maßstab involviert, vorteilhaft in solchen Strukturen implementiert werden. Die Mesoscale-Vorrichtungen können für einen schnellen chemischen Test zum Nachweis pathogener Bakterien oder Viren sorgen. Die Vorrichtungen können außerdem einen schnellen Test auf die Anwesenheit oder Konzentration von Blutbestandteilen wie Hormonen bereitstellen. Andere Anwendungen schließen eine Reihe anderer biologischer Tests wie die Blutgruppenuntersuchung ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die hier offenbarten Vorrichtungen sind alle durch einen Mesoscale-Detektionsbereich gekennzeichnet, der eine Bindungsgruppe enthält, die mit der Analytkomponente wie einem molekularen Analyten oder einem Zelltypus reagiert, um die Anwesenheit oder die Konzentration des Analyten zu detektieren. Die Vorrichtung läßt sich vor dem Test leicht sterilisieren. Die Tests können schnell durchgeführt werden und nach Abschluß des Tests kann der Chip entsorgt werden, was vorteilhaft die Kontamination zwischen einzelnen Proben verhindert, potentiell gefährliches Material begräbt, nur Mikrovolumina an zu entsorgender Abfallflüssigkeit erzeugt und eine billige Mikroprobenanalyse bereitstellt. Einige Merkmale und Vorzüge der Vorrichtungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein schematischer Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die ein festes Substrat 14 einschließt, auf dem gefertigte Eingangsöffnungen 16 über einen Mesoscale-Strömungskanal 20 mit einer auf der Oberfläche des Substrats haftenden, transparenten Abdeckung 12 verbunden sind.
Fig.2 ist eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung aus Fig. 1.
Fig.3 ist ein Querschnitt eines Trägerblocks 30 zum Aufnehmen der Vorrichtung 10, der Öffnungen 32 zur Übermittlung oder zum Entfernen von Reagenzien oder Probenflüssigkeit aus der Vorrichtung 10 einschließt.
Fig.4 ist eine schematische Darstellung einer in einem Gerät 50 angeordneten Vorrichtung 10, wobei das Gerät verwendet wird, um die Vorrichtung 10 zu trägern und den Druck der Probenflüssigkeiten in der Vorrichtung 10 zu regulieren und nachzuweisen.
Fig.5 A - D sind schematische Darstellungen eines Querschnitts eines Teils eines Mesoscale-Strömungskanals 20 in einem Substrat 14, auf dem Antikörper 103 immobilisiert sind, und sie veranschaulichen Zustände des Sytems während der Analyse.
Fig.6 A - D sind schematische Darstellungen eines Querschnitts eines Teils eines Mesoscale-Strömungskanals 20 in einem Substrat 14, auf dem DNA-Bindungssonden 110 immobilisiert sind, und sie veranschaulichen Zustände des Sytems wahrend der Analyse.
Fig.7 ist ein perspektivischer Schnitt eines Strömungskanals 20 auf dem inerten Substrat 14 mit Zell- oder Bruchstückfiltervorsprüngen 122, die sich von der Wandung des Strömungskanals aus erstrecken.
Fig.8 ist ein Querschnitt eines Strömungskanals 20 auf dem inerten Substrat 14 mit Zellperforationsvorsprüngen 124, die sich von der Wandung des Kanals aus erstrecken.
Fig.9 ist eine schematische Aufsicht auf eine analytische Vorrichtung, die mit einer Reihe von Mesoscale-Kammern versehen wurde, die für die Implementierung einer Vielzahl von Funktionen einschließlich der Zellsortierung, Zellyse und der PCR-Analyse geeignet sind.
Fig. 10 ist ein schematischer Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die elektrische Kontakte 17 und 18 zum Messen der Leitfähigkeit von Flüssigkeiten in der Vorrichtung umfaßt.
Fig. 11 ist eine schematische Grundansicht eines mit einem Paar sich fraktal spaltender Strömungskanäle versehenen Substrats.
Fig. 12 ist eine schematische Perspektivdarstellung eines Geräts 60, das in Kombination mit der Vorrichtung 10 zum Betrachten des Inhalts der Vorrichtung 10 verwendet wird.
Fig. 13 ist ein schematischer Querschnitt des Geräts 60 aus Fig. 12.
Fig. 14 ist eine schematische Grundansicht der Vorrichtung 10, die mit einem Mikroscale- Strömungssystem versehen wurde, das gewundene Kanäle 22A und 22B umfaßt, die die zeitlich abgestimmte Zugabe und das Mischen von Testkomponenten während des Tests gestatten.
Gleiche Bezugszeichen in den jeweiligen Zeichnungen weisen auf gleiche Teile hin.

Genaue Beschreibung

Die Erfindung stellt eine Familie kleiner, massenproduzierter, typischerweise einmal verwendeter Vorrichtungen zum Nachweis eines bestimmten Analyten in einer Mikroflüssigkeitsprobe zur Verfügung. Die Vorrichtüng umfaßt ein festes Substrat, typischerweise in der Größenordnung von einigen Millimetern dick und etwa 0,2 bis 2,0 Zentimeter im Quadrat, das mikrofabriziert wurde, um eine Probeneinbringöffnung und ein Mesoscale-Strömungssystem zu definieren. Das Mesoscale-Strömungssystem umfaßt mindestens einen Probenströmungskanal, der sich von der Einbringöffnung aus erstreckt und mindestens einen Analytdetektionsbereich in Flüssigkeitskommunikation mit dem Strömungskanal, der eine Bindungsgruppe für die spezifische Bindung des Analyten enthält. Wahlweise kann die Bindungsgruppe im Detektionsbereich immobilisiert sein. Wie hier offenbart, können Mesoscale-Detektionssysteme in einem weiten Bereich von schnellen Tests einschließlich der Analyse von Zellen oder Makromolekülen oder zur Überwachung von Reaktionen oder des Zellwachstums verwendet werden. Die Vorrichtungen können mit zwei oder mehr Mesoscale-Strömungssystemen hergestellt werden, die zwei oder mehr verschiedene Detektionsbereiche aufweisen, die Bindungsgruppen für verschiedene Analyten enthalten, wodurch zwei oder mehr Tests gleichzeitig ausgeführt werden können. Am Ende des Tests werden die Vorrichtungen typischerweise entsorgt.
Mesoscale-Vorrichtungen mit Strömungskanälen und Kammern mit mindestens einer Mesoscaledimension lassen sich in großen Mengen aus einem festen Substratmaterial gestalten und fabrizieren. Silikon wird aufgrund der enormen Menge an Technologie bevorzugt, die dessen genaue und effiziente Fabrikation gestattet, andere Materialien können jedoch ebenfalls verwendet werden, eingeschlossen Polymere wie Polytetrafluorethylene. Die Probeneinbringöffnung, das Mesoscale-Strömungssystem, das den oder die Probenströmungskanäle sowie den oder die Analytdetektionsbereiche einschließt, sowie andere funktionale Elemente lassen sich so billig in großen Mengen aus einem Silikonsubstrat mit Hilfe jeder einer Vielzahl von Mikroverarbeitungsmethoden herstellen, die dem Fachmann bekannt sind. Die verfügbaren Mikroverarbeitungsmethoden umfassen Filmabscheidungsverfahren wie das Schleuderbeschichten und die chemische Dampfabscheidung, die Laserherstellung oder photolithographische Techniken wie UV- oder Röntgenstrahlverfahren, oder Ätzverfahren, einschließlich chemischer Naßätzverfahren oder Plasmaverfahren (vgl. z.B. Manz et al., Trends in Analytical Chemistry 10 : 144 - 149 (1991)). Strömungskanäle verschiedener Breite und Tiefe können mit Mesoscaledimensionen hergestellt werden, d.h. mit Querschnittsdimensionen in der Größenordnung von 0,1 bis 500 µm.
Das einen fabrizierten Mesoscale-Strömungskanal enthaltende Silikonsubstrat kann mit einer dünnen, anodisch angehefteten Glasbedeckung bedeckt und verschlossen werden. Es können auch andere klare oder opake Abdeckmaterialien verwendet werden. Alternativ dazu können zwei Substrate zu einem Sandwich zusammengefaßt oder ein Silikonsubstrat zwischen zwei Glasabdeckungen angeordnet werden. Die Verwendung einer transparenten Abdeckung führt zu einem Fenster, das die dynamische Betrachtung des Kanalinhalts erleichtert und das optische Testen des Detektionsbereiches entweder maschinell oder visuell gestattet. Andere Herstellungsansätze können angewandt werden. Gemäß einer Ausführungsform können elektronenmikroskopische Aufnahmen biologischer Strukturen wie das Zirkulationsnetz als Masken zur Herstellung eines Mesoscale-Strömungssystems auf dem Substrat benutzt werden. Die Mesoscale-Strömungssysteme können in einer Reihe von Größen und Konformationen erzeugt werden.
Gemäß einer Ausführungsform, die schematisch in den Fig. 1 und 2 dargestellt ist, kann die Vorrichtung 10 ein mit einem Mesoscale-Strömungskanal 20 erzeugtes Silikonsubstrat 14 umfassen, das in diesem Fall auch als Detektionsbereich dient und das mit Bindungsgruppen versehen sein kann, die einen zuvor gewählten Analyten binden können. Proben- oder Reagenzflüssigkeit kann aus dem Strömungskanal 20 über die Öffnungen 16, die an beiden Enden des Strömungskanals 20 vorgesehen sind, zugeführt oder wiedergewonnen werden. Das Substrat 14 ist mit einem Glas- oder Plastikfenster 12 bedeckt. Während der Analyse kann die Vorrichtung 10 in einer Trägerstruktur 30 (Fig.3) angeordnet sein, die mit internen Strömungswegen 32 zur Übermittlung und Wiedergewinnung der Probenflüssigkeit durch die Einbringöffnungen der Vorrichtung 10 versehen ist. Die Dimensionen der Mikrokanäle in den Silikon-Mesoscale-Vorrichtungen können im Bereich von etwa 2,0 µm - 500 µm Breite und etwa 0,1 µm - 500 µm Tiefe variieren, ein Bereich der zellulären oder makromolekularen Dimensionen vergleichbar ist, in dem Flüssigkeitsbewegungen von mehrphasigen Materialien wie Fluiden und Zellkulturmedien noch nicht systematisch untersucht worden sind. Die Einbringöffnungen der Vorrichtungen können in Mesoscale- oder alternativ in größeren Dimensionen gefertigt werden.
Die Kapazität der Vorrichtung ist sehr klein und verringert daher die flir eine Analyse erforderliche Menge an Probenflüssigkeit Beispielsweise beträgt bei einem 1 cm x 1 cm Silikonsubstrat, mit einer Anordnung von 500 Einkerbungen auf der Oberfläche, die je 10 µm breit, 10 µm tief und 1 cm (10&sup4; µm) lang sind, das Volumen jeder Einkerbung 10&supmin;³ µL und das Gesamtvolumen der 500 Einkerbungen 0,5 µL. Das niedrige Volumen der Mesoscale- Strömungssysteme erhöht die Reaktionsgeschwindigkeiten der in den Vorrichtungen durchgeführten Tests. Beispielsweise steigt in einer Mesoscale-Detektionskammer, die eine Oberflächenbeschichtung aus einer immobilisierten Bindungsgruppe enthält, nach dem Massenwirkungsgesetz das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen mit abnehmendem Volumen der Mesoscale-Detektionskammer für die Bindungsgruppe in der Detektionskammer an, was zu einer erhöhten Rate intermolekularer Reaktionen zwischen dem Analyten und der Bindungsgruppe führt. Das gesamte Mesoscale-Strömungssystem der erfindungsgemäßen Vorrichtungen weist typischerweise ein Volumen in der Größenordnung von weniger als 10 µL auf. Die Detektionskammern sind in mindestens einer Dimension klein genug, um schnelle Kinetiken zu favorisieren. Die Mesoscale-Strömungssysteme in den Vorrichtungen können mit Mikrolitervolumina hergestellt werden oder alternativ Nanolitervolumina oder darunter, was in vorteilhafter Weise die für einen Test erforderliche Menge an Probe und/oder Reagenz beschränkt.
Die das Mesoscale-Strömungssystem enthaltenden analytischen Vorrichtungen können in Kombination mit einem Gerät zum Übermitteln und Aufnehmen von Flüssigkeiten an und von den Vorrichtungen verwendet werden, wie dem Gerät 50, das schematisch in Fig.4 dargestellt ist und eine Aufnahmestelle 58 zum Halten der Vorrichtung 10 und zum Anschließen von Öffnungen, z.B. der Öffnungen 16 auf der Vorrichtung 10 an eine Strömungsleitung 56 im Gerät eingebaut hat. Das Gerät kann Mittel wie die in Fig.5 dargestellte Pumpe 52 zum Treiben der Probe durch das Strömungssystem umfassen. Nachdem eine biologische Flüssigkeitsprobe, von der angenommen wird, daß sie einen bestimmten Analyten enthält, in die Einbringöffnung 51 des Geräts eingegeben worden ist, wird die Pumpe 52 in Betrieb gesetzt, um die Probe in die Öffnung 16 der Vorrichtung 10 und den Mesosclale- Strömungskanal 20 zu treiben. Alternativ kann die Probe mit Hilfe des Geräts in den Chip injiziert werden, oder die Probe kann mittels der Kapillarkräfte durch die Einbringöffnung in das Mesoscale-Strömungssystem der Vorrichtung gelangen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Gerät über dem Substrat angeordnet und mit einer Strömungsleitung versehen sein, die mit den Einbringöffnungen in der Vorrichtung kommuniziert, z.B. in Abwesenheit einer Abdeckung über der Vorrichtung, um das Injizieren der Probe über das Gerät in die Vorrichtung zu ermöglichen. Andere Ausführungsformen des Geräts können erfindungsgemäß zur Verwendung in anderen Testverfahren mit anderen Vorrichtungen gefertigt werden. Die Strömungssysteme der Vorrichtungen können bis auf ein hydraulisch volles Volumen gefüllt werden und das Gerät kann zum Dirigieren des Flüssigkeitsstromes durch das Strömungssystem z.B. mit Hilfe von Ventilen in der Vorrichtung oder dem Gerät verwendet werden.
Die analytischen Vorrichtungen können auch in Kombination mit einem Gerät zum Betrachten des Inhalt der Mesoscale-Kanäle in der Vorrichtung verwendet werden. In einer Ausführungsform kann das Gerät ein Mikroskop zum Betrachten des Inhalts der Mesoscale- Kanäle in der Vorrichtung aufweisen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann eine Kamera im Gerät enthalten sein, wie an dem schematisch in Fig. 12 und 13 dargestellten Gerät 60 veranschaulicht. Das Gerät 60 ist mit einem Gehäuse 62, einem Beobachtungsschirm 64 und einem Spalt 66 zum Insertieren eines Chips in das Gerät ausgestattet. Wie im Querschnitt in Fig. 13 dargestellt, schließt das Gerät 60 außerdem eine Videokamera 68, ein optisches System 70 und einen Neigungsmechanismus 72 zum Halten der Vorrichtung 10 ein, der die manuelle Einstellung von Anordnung und Winkel der Vorrichtung 10 gestattet. Das optische System kann ein Linsensystem zur Vergrößerung des Kammerinhalts sowie auch eine Lichtquelle umfassen. Die Videokamera 68 und der Schirm 64 gestatten die visuelle Überwachung von Analyt-induzierten Änderungen der Eigenschaften der Probenflüssigkeit wie den Strömungseigenschaften oder der Farbe, und ggf. deren Aufzeichnung unter Verwendung des Geräts.
Die Bindungsgruppen können in den Mesoscale-Detektionsbereich über eine in Flüssigkeitskommunikation mit dem Detektionsbereich stehende Einbringöffnung in Lösung eingebracht werden. Alternativ können die Bindungsgruppen in dem Mesoscale- Detektionsbereich der analytischen Vorrichtung nach deren Herstellung beispielsweise über physikalische Adsorption oder chemische Anbindung an die Oberfläche des Strömungssystems oder an ein Festphasenreagenz wie eine im Detektionsbereich angeordnete Polymerkugel immobilisiert werden. Die Oberflächen der Mesoscale-Detektionskanäle in den Silikonsubstraten können chemisch aktiviert und mit einem Protein, einem Lipid, Polysaccharid oder anderem Makromolekül umgesetzt werden, um eine beschichtete Oberfläche in den Mesoscale-Strömungskanälen zu erhalten. Verfahren zur chemischen Aktivierung von Silikonoberflächen sind im Stand der Technik verfügbar (vgl. z.B. Haller in: Solid Phase Biochemistry, Hrsg.: W.H. Scouten, John Wiley, New York, S. 535 - 597 (1983); Mandenius et al., Anal. Biochem. 137 : 106 - 114 (1984) und 170 : 68 - 72 (1988) sowie Mandenius et al., Methods in Enzymology 137 : 388 - 394). Es gibt eine Anzahl an Techniken zum Anheften von Biomolekülen an Silikone im Stand der Technik. Beispielsweise können Enzyme auf Silikonvorrichtungen über das Einschließen in einen photovernetzbaren Vinylalkohol immobilisiert werden (Howe et al., IEEE Transactions Electron Devices, ED33 : 499 - 506 (1986)); oder sie können indirekt unter Verwendung vorgeformter Membranen angeheftet werden (Hanazato et al., IEEE Transactions Electron Devices ED33 : 47 - 51 (1986)). Eine hydrophobe Bilayerbeschichtung aus einem Glycerolmonooleat kann auf einem Silikonsubstrat gefertigt werden (Fromherz et al., Biochim. Biophys. Acta 1062 : 103 - 107 (1991)).
Im Stand der Technik bekannte Techniken zum Konjugieren und Immobilisieren von Proteinen können an die Verwendung mit aktivierten Silikonoberflächen angepaßt werden (Kennedy et al., Clin. Chem. Acta 70 : 1 - 31 (1976); Sankolli et al, J. Imm. Methods 104 : 191 - 194 (1987); Kricka et al., Clin. Chem. 26 : 741-744 (1980) und Deluca et al., Arch. Biochem. Biophys. 225 : 285 - 291 (1983)). Die bekannte Chemie kann an die Verwendung bei der Anheftung von Biomolekülen an beschichtete oder unbeschichtete Silikonkanaloberflächen angepaßt werden. Eine Bindungsgruppe wie ein Antigen-bindendes- Protein, eine Polynukleotidsonde oder eines aus dem Ligand/Rezeptor-Paar können an die Silikonkanaloberflächen angeheftet werden. Die oberflächenbeschichteten Mesoscale- Strömungssysteme können in jedem einer Reihe verfügbarer, im Stand der Technik bekannter Bindungstests wie Immuntests, enzymatische Tests, Ligandenbindungstests, Polynukleotidhybridisierungstests und Zelloberflächenbindungstests eingesetzt werden. Die Detektion eines zellulären oder makromolekularen Analyten läßt sich durch Wahl der geeigneten Bindungsgruppe, die auf die Oberfläche des Detektionsbereichs aufgezogen wird, implementieren.
Zusätzlich können in der Vorrichtung Magnetkügelchen eingesetzt werden, die sich unter Verwendung eines extern angelegten Magnetfeldes durch das Mesoscale-Strömungssystem bewegen lassen, z.B. aus einer im in Kombination mit der Vorrichtung verwendeten Gerät gelegenen Magnetquelle. Die Bindungsgruppe oder ein anderes im Tests erforderliches Reagenz kann auf dem Magnetkügelchen immobilisiert werden, um z.B. die Übertragung der Bindungsgruppe in den Detektionsbereich zur Bindung des Analyten zu ermöglichen. Nach der Bindung des Analyten an die an die Magnetkügelchen angeheftete Bindungsgruppe kann der Analyt z.B. weiter aufgereinigt oder über ein externes Magnetfeld in einen anderen Detektionsbereich im Strömungssystem zu weiteren Analysen bewegt werden.
Die Bindung des Analyten an die Bindungsgruppe im Detektionsbereich läßt sich über eine Anzahl von Verfahren nachweisen, eingeschlossen die Überwachung von Druck oder elektrischer Leitfähigkeit von Probenflüssigkeiten in der hier offenbarten Vorrichtung oder über die entweder visuelle oder automatische, optische Detektion durch eine transparente Abdeckung hindurch. Vorrichtungen wie Ventile, Mesoscale-Drucksensoren und andere mechanische Sensoren können direkt auf dem Silikonsubstrat und in der Massenproduktion nach gut etablierten Verfahren gefertigt werden (Agnell et al., Scientific American 248 : 44 - 55 (1983)).
Die Bindung des Analyten an eine Bindungsgruppe im Detektionsbereich kann optisch nachgewiesen werden. Die einfachste Ausführungsform ist diejenige, in der ein positives Ergebnis durch eine Teilchenagglomeration oder -agglutionation bzw. eine Farbänderung angezeigt wird, die mit dem Auge beobachtet werden kann, optimalerweise unter Zuhilfenahme eines Mikroskops. Die optische Detektion der Bindung eines Analyten an die Bindungsgruppe in den Mesoscale-Detektionskammern kann durch Anheften einer detektierbaren Markierung wie eines fluoreszierenden oder lumineszierenden Moleküls oder Trägers wie einem Kügelchen entweder an den Analyten oder die Bindungsgruppe implementiert werden, wobei bekannte Testverfahren eingesetzt werden. Im Detektionsbereich kann die fluoreszierende oder lumineszierende Markierung mit Hilfe der Lichtmikroskopie über ein durchscheinendes Fenster über dem Substrat detektiert werden. Die Analyten können auch mit Hilfe eines Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignals detektiert werden, das die Bindungsgruppe bei der Bindung des Analyten erzeugt. Alternativ kann eine zweite markierte Substanz wie ein fluoreszenzmarkierter Antikörper durch das Strömungssystem übermittelt werden, um an den gebildeten Komplex aus Analyt und Bindungsgruppe im Detektionsbereich zu binden und ein "Sandwich" zu erzeugen, das eine optisch detektierbare Gruppe einschließt, deren Anwesenheit die Anwesenheit des Analyten indiziert. Beispielsweise können die im Stand der Technik beschriebenen Immunogold oder immunofluoreszierenden Label eingesetzt werden (vgl. beispielsweise Rosenberg et al., Clin. Chem. 30 : 1462 - 1466 (1984); 1655 - 1659 (1986)).
Die Bindung des Analyten in einer flüssigen Probe eines biologischen Fluids an eine Bindungsgruppe im Detektionsbereich kann auch über das Abtasten der elektrischen Leitfähigkeit in einem Bereich der Vorrichtung detektiert werden. Die Leitfähigkeit der Flüssigkeit in den Mesoscale-Strömungswegen kann gemessen werden, um Änderungen hinsichtlich der elektrischen Eigenschaften bei der Bindung des Analyten an die Bindungsgruppe im Detektionsbereich zu erfassen. Die Leitfähigkeit kann beispielsweise in der schematisch in Fig. 10A und 10B dargestellten Vorrichtung 10 gemessen werden. Die Vorrichtung 10 umfaßt das Silikonsubstrat 14, auf dem Einbringöffnungen 16 und Strömungskanäle 20 mikrofabriziert sind. Das Substrat ist mit einem durchscheinenden Fenster 12 bedeckt. Messungen der elektrischen Leitfähigkeit erfolgen unter Einsatz der elektrischen Kontakte 18, die auf der Oberseite des Substrats in Kontakt mit dem Mesoscale-Probenströmungskanal 20 gefertigt und mit Kontakten 17 verbunden sind, die sich durch den Boden des Substrats erstrecken. Die Kontakte 17 lassen sich mit Hilfe von bekannten Verfahren des Wärmegradientzonenschmelzens herstellen (vgl. Zemel et al. in: Fundamentals and Applications of Chemical Sensors, Hrsg.: R. Schützle und R. Hammerle, ACS Symposium Series 309, Washington DC, 1986, S.2). Die Vorrichtung 10 kann in einem Gerät wie dem in Fig.4 gezeigten Gerät 50 gehalten sein, in dem Leitfähigkeitsänderungen über die Kontakte 17 nachgewiesen werden können. Die Änderungen der Leitfähigkeit können mit Änderungen der Flüssigkeitseigenschaften wie dem Flüssigkeitsdruck korreliert sein, die durch die Analytbindung im Detektionsvereich hervorgerufen werden.
Die Bindung eines Analyten an eine Bindungsgruppe im Detektionsbereich kann auch durch Überwachung des Drucks der Probenflüssigkeiten in bestimmten, speziell gestalteten Bereichen der Mesoscale-Strömungspassagen detektiert werden. Beispielsweise gestattet ein mit der in das Mesoscale-Strömungssystem eintretenden bzw. dieses verlassenden Probenflüssigkeit verbundener Druckdetektor den Nachweis eines Druckabfalls, der von der Analytbindung und der daraus resultierenden Verstopfung oder Strömungsbehinderung verursacht wird. Fig.4 zeigt schematisch als ein Beispiel die Vorrichtung 10, die in einem Gerät 50 angeordnet ist, das zwei Druckdetektoren 54 zum Nachweis des Strömungsdrucks der in die Vorrichtung 10 über die Öffnungen 16 einströmenden bzw diese verlassenden Flüssigkeiten. Agglomerieren während des Tests Teilchen oder wechselwirken Moleküle zur Ausbildung eines Netzes, das die Strömungspassage verstopft oder die Viskosität der Flüssigkeit erhöht, läßt sich diese Änderung als eine für ein positives Ergebnis indizielle Druckänderung detektieren. Ein Mesoscale-Drucksensor kann ebenfalls direkt auf dem Silikonsubstrat fabriziert werden (Angell et al., Scientific American 248 : 44 - 55 (1983)).
Diese Form der Detektion der Analytbindung an eine Bindungsgruppe im Detektionsbereich läßt sich mit Geometrien verstärken, die gegenüber Strömungsbeschränkungen im Strömungssystem empfindlich sind. Gemäß einer Ausführungsform können die Mesoscale-Strömungskanäle in der Vorrichtung mit einem "fraktalen" Muster aufgebaut werden, d.h. aus einem Muster sich nacheinander verzweigender Strömungskanäle. Fig. 11 veranschaulicht schematisch eine Ausführungsform einer Vorrichtung 10, die ein Substrat 14 umfaßt, das mit zwei fraktalen Strömungssystemen 40 mikrofabriziert ist. Die sich fraktal verzweigenden Kanäle können auf einem Silikonsubstrat mit sich an jeder Verzweigung verringernden Dimensionen erzeugt werden, wodurch nacheinander engere Strömungskanäle bereitgestellt werden. Der Flüssigkeitsstrom in diesen fraktal konstruierten Strömungssystemen ist sehr empfindlich gegenüber der Flüssigkeitsviskosität und der Entwicklung einer Strömungsbeschränkung, die beispielsweise durch eine Zellproliferation oder die Agglomeration von Zellen, Teilchen oder makromolekularen Komplexen verursacht werden, die in einer Probe vorhanden sein können. Die Detektion der Anwesenheit eines Analyten auf Basis der Strömungsbeschränkung ist in der WO-A-93/22 054, veröffentlicht am 11. November 1993, beschrieben.
Die fraktal gestalteten Mikrokanäle gestatten auf einfache Weise z.B. die Überwachung des Wachstums von Organismen in einer Kultur auf Basis des Strömungswiderstands aufgrund von Änderungen der Fluidviskosität, der z.B. optisch durch eine transparente Abdeckung über dem Substrat detektiert werden kann. Die Anwesenheit und das Wachstum eines Organismus in einer Probe beeinflußt die Strömungscharakteristika innerhalb des Fraktals. Einer oder mehrere Drucksensoren können zum Nachweis von Druckänderungen aufgrund von Änderungen hinsichtlich der Flüssigkeitseigenschaften verwendt werden, die vom Vorhandensein eines Analyten in oder hinter den fraktalen Strömungswegen verursacht werden. Veränderungen der Leitfähigkeit bei der Analytbindung können ebenfalls einfach über Sensoren der elektrischen Leitfähigkeit in Kontakt mit der Strömungsregion detektiert werden. Beispielsweise läßt sich das Verstopfen des Fraktalbereichs 40 der Vorrichtung 10, das den Strom des Analyten von der Einbringöffnung 16A zum Auslaß 16B blockiert, mit Hilfe einer herkömmlichen Leitfähigkeitssonde 17 detektieren, deren Ausgabe die An- oder Abwesenheit einer wäßrigen Flüssigkeit im Ausstromkanal anzeigt. Im Fraktalbereich können Bindungsgruppen z.B. immobilisiert auf der Oberfläche des fraktalen Strömungsweges oder auf Festphasenreaktanden wie einem Kügelchen zur Bindung des Analyten und Verstärkung der Strömungsbeschränkung im fraktalen Strömungsweg bereitgestellt werden.
Eine große Zahl von im Stand der Technik bekannten Bindungstestverfähren kann in den erfindungsgemäßen Mesoscale-Detektionssystemen ausgenutzt werden.
Die Reaktion eines Analyten mit einer Bindungsgruppe im Detektionsbereich kann mit Hilfe der Agglutination nachgewiesen werden. Ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Molekül oder Kügelchen, das an den Analyten oder den Komplex aus Analyt und Bindungsgruppe im Detektionsbereich binden kann, kann eingesetzt werden, um den Nachweis der Agglutination von Bindungsgruppe und Analyt mit Hilfe der Lichtmikroskopie durch eine durchscheinende Abdeckung über dem Detektionsbereich hindurch zu ermöglichen. Beispielsweise kann die Agglutination von Blutzellen in einer Mesoscale-Detektionkammer als positiver Test für die Blutgruppe einer Probe dienen. Antikörper können entweder chemisch oder mittels Absorption auf die Oberfläche des Detektionsbereichs aufgezogen werden zur Induktion der Agglutination, was einen positiven Test auf die Blutgruppe ergibt. Die Blutprobe kann mit einem fluoreszierenden Farbstoff gemischt werden, um die Blutzellen zu markieren und den optischen Nachweis der Agglutination zu ermöglichen. An fluoreszierende Kügelchen gebundene Antikörper können ebenfalls verwendet werden. Eine Vielzahl von verschiedene Antikörper beherbergenden Detektionsbereichen kann in den Mesoscale Strömungswegen gefertigt werden, um den gleichzeitigen Test auf z.B. die Blutgruppe A, B und Rh in einer Vorrichtung zu erlauben.
Im Stand der Technik bekannte immunchemische Testverfahren wie Antikörper-Sandwich- Tests und Enzym-vermittelte Immuntests können im Detektionsbereich der Vorrichtungen zur Detektion eines vorgewählten Analyten ausgenutzt werden (vgl. Bolton et al., Handbook of Experimental Immunology, Hrsg.: D.M. Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986, Bd. 1, Kap. 26, hinsichtlich einer allgemeinen Diskussion von Immuntests). Gemäß einer Ausführungsform kann es sich bei dem Analyten um ein Antigen handeln und die Bindungsgruppe kann ein markiertes, Antigen-bindendes Protein sein, z.B. ein fluoreszenzmarkierter Antikörper. Alternativ kann ein Sandwich-Immuntest durchgeführt werden, bei dem ein markiertes Bindungsmolekül wie ein fluoreszenzmarkierter Antikörper zur detektierbaren Bindung an einen Komplex aus Analyt und Bindungsgruppe, der im Detektionsbereich gebildet wird, eingesetzt wird. Ein Beispiel für einen Sandwich-Test ist schematisch in Fig.5 A - D dargestellt, worin die Oberfläche des Mesoscale-Strömungskanals 20 im Substrat 14 mit einem Antikörper 103 beschichtet ist, der den Analyten 104 binden kann. Die Fig.5 B und C veranschaulichen die Bindung des Analyten 104 an den Antikörper 103 im Strömungskanal. Der gebundene Analyt wird anschließend über die folgende Zugabe eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers 105 detektiert, der mit dem gebundenen Analyten, wie in Fig.5 D dargestellt, einen Komplex bildet. Der fluoreszenzmarkierte Komplex kann durch ein durchscheinendes Fenster über dem Detektionsbereich unter Verwendung eines Fluorometers detektiert werden.
Beispielsweise von einer Fluorescein markierten Bindungsgruppe emittierte Lumineszenz läßt sich auf einfache Weise in den Mesoscale-Strömungssystemen der Vorrichtungen nachweisen. Gemäß einer Ausführungsform läßt sich die Lumineszenzemission in einem Mesoscale-Strömungssystem leicht detektieren z.B. unter Verwendung eines Mikroplattenablesegeräts, das einen Photomultiplyer oder eine Luminometerkamera einschließt. Gemäß einer Ausführungsform läßt sich der Analyt mit Hilfe des Einsatzes einer Bindungsgruppe detektieren, die zwei zur Bindung an den Analyten befähigte Antikörper aufweist, wobei ein Antikorper mit Fluorescein, das Licht emittiert, und der zweite Antikörper mit Rhodamin markiert ist, das Licht absorbiert. Binden sowohl der rhodamin- als auch der fluoresceinmarkierte Antikörper an den Analyten, ist ein Quenchen des Fluoresceins zu beobachten, was die Anwesenheit des Analyten anzeigt (Nakamura et al. (Hrsg.), Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s, American Society of Mikrobiology, Washington DC, S. 205 - 215). Gemäß einer Ausführungsform ist der fluoreszenzmarkierte Antikörper im Detektionsbereich immobilisiert. Der Analyt und der rhodaminmarkierte Antikörper werden anschließend dem Detektionsbereich übermittelt und es wird ein Quenchen des Fluoresceins beobachtet, was die Anwesenheit des Analyten anzeigt. Bei einer weiteren Ausführungsform können fluoresceinmarkierte Antikörper, die an bakterielle, magnetische Teilchen konjugiert und auf diese aufgezogen sind, in einem Immuntest verwendet werden, wobei der Antikörper den Analyten binden kann (Nakamura et al., Anal. Chem. 63: 268 - 272 (1991)). Gemäß dieser Ausführungsform verursacht die Agglutination der an die fluoresceinmarkierten Antikörper konjugierten, bakteriellen, magnetischen Teilchen ein Quenchen der Fluoreszenz, das einen auf den Analyten positiven Test indiziert. Die Agglutination und der daraus resultierende Quench können durch Anlegen eines Magnetfelds an den Mesoscale-Detektionsbereich z.B. mittels einer in einem in Kombination mit der Vorrichtung verwendeten Gerät befindlichen Magnetquelle verstärkt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können im Stand der Technik bekannte Polynukleotidhybridisierungstests durchgeführt werden (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, 2.Aufl., Cold Spring Habor Press, 1989). Wie schematisch in Fig.6 dargestellt kann die Oberfläche des Strömungskanals 20 im Substrat 14 mit einer Polynukleotidsonde 110 beschichtet sein. Nach Bindung des komplementären Polynukleotids als Analyten 104 an die immobilisierte Polynukleotidsonde 110, kann eine zweite detektierbare z.B. fluoreszenzmarkierte, makromolekulare Sonde 105 zur Bindung an das Proben-Polynukleotid zugesetzt werden. Die Detektion der Fluoreszenz zeigt einen positiven Test an.
Gemäß weiterer Ausführungsformen kann das Mesoscale-Strömungssystem eine Kammer zur Abtrennung einer bestimmten Zellpopulation aus einer Probe einer biologischen Flüssigkeit in einer Präparation zur Downstreamanalyse eines Makromoleküls entweder auf oder in den Zellen oder einer Komponente in der Extrazellulärflüssigkeit einschließen. Dieser Mesoscale-Abtrennbereich umfaßt immobilisierte Bindungsgruppen, die zur reversiblen Bindung einer Zielzelle über ein charakteristisches Zelloberflächenmolekül wie ein Protein befähigt sind. Die Mesoscale-Dimensionen des Abtrennbereiches verstärken kinetisch die Bindung der Zelle an die Bindungsgruppe. Gemäß einer Ausführungsform bleiben die Zellen immobilisiert, während die extrazelluläre Flüssigkeit weiter strömt und unterhalb analysiert wird. Bei einer anderen kann das Strömen fortgesetzt werden, um die Zellen zu waschen z.B. über einen Pufferstrom. Bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten und Drücken, werden die gewaschenen Zellen aus dem Abtrennbereich freigesetzt und bewegen sich zur Analyse nach unten/hinten.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können auch Zellysevorrichtungen in Flüssigkeitskommunikation mit dem Mesoscale-Strömungskanal einschließen, um vor der Analyse auf ein intrazelluläres Molekül wie eine mRNA die Lyse der Zellen zu gestatten. Wie in Fig. 8 dargestellt, kann die Zellysevorrichtung die Zellmembran perforierende Vorsprünge 124 aufweisen, die sich von einer Oberfläche des Strömungskanals 20 aus erstreckt. Wird der Flüssigkeitsstrom durch die perforierenden Vorsprünge 124 gepreßt, werden die Zellen aufgebrochen. Die Zelltrümmer können abfiltriert und die intrazellulären Analyten anschließend analysiert werden. Scharfkantige Stücke eines Materials wie Silikon, die im Mesoscale-Strömungssystem gefangen sind, können ebenfalls verwendet werden, um die Zellyse beim Aufbringen eines ausreichenden Strömungsdruckes zu implementieren. Gemäß einer anderen Ausführungsform, kann der Strömungskanal einfach einen Bereich mit verringerten Querschnittsdimensionen aufweisen, durch den die Zellyse beim Aufbringen eines ausreichenden Strömungsdruckes implementiert wird. Diese Vorrichtungen werden typischerweise im Zusammenhang mit einem Gerät eingesetzt, das ein Hilfsmittel wie eine Pumpe zum Durchtreiben der zellhaltigen Probe durch die Zellysevorrichtung einschließt, um die Zellyse bei Aufbringen eines ausreichenden Strömungsdruckes zu implementieren. Zusätzlich kann die Zellysevorrichtung ein Mittel zur Zellyse umfassen. Es können im Stand der Technik bekannte, Zellen lysierende Mittel verwendet werden.
Wie in Fig.7 veranschaulicht, kann die Oberfläche eines Strömungskanals 20 außerdem Vorsprünge 122 aufweisen, die ein zelluläres Sieb zum Abtrennen von Zellen über ihre Größe darstellen. Wenn die Zellproben typischerweise unter geringem Druck durch den Strömungskanal strömen, wird nur Zellen, die zwischen den Vorsprüngen 122 hindurchpassen, das Strömen durch den Strömungskanal gestattet.
Die Mesoscale-Vorrichtungen können auch zur Implementierung enzymatischer Reaktionen verwendet werden. Im Substrat gefertigte Mesoscale-Kammern für enzymatische Reaktionen können temperaturgesteuert sein, um optimale Temperaturen für die Enzymreaktionen zu bieten. Es können Einbringöffnungen vorgesehen sein, die in Flüssigkeitskommunikation mit der Enzymreaktionskammer stehen und die Zugabe oder Entfernung von Reagenzien und anderen erforderlichen Bestandteilen des Enzymtests gestatten. Die solche Kammern aufweisenden Testvorrichtungen können in einem Gerät wie dem schematisch in Fig.4 dargestellten Gerät 50 angeordnet sein, das Mittel zum Einstellen der Temperatur der Enzymreaktionskammer und zum Übermitteln oder Wiedergewinnen von Testkomponenten über die Strömungskanäle 56 im Gerät 50 und die Öffnungen 16 in der Vorrichtung 10 aufweist. Das Gerät kann zur zeitgenauen Zugabe der Probe oder von Reagenzflüssigkeiten in die Vorrichtung eingesetzt werden. Um die Temperatur der Reaktionskammern zu regulieren, können die Vorrichtungen in einer Aufnahmestelle in einem in Kombination mit der Vorrichtung angewandten Gerät eingesetzt werden. In der Aufnahmestelle kann ein elektrisches Heiz- oder Kühlelement zum Heizen oder Kühlen der Reaktionskammer in der Vorrichtung vorgesehen sein. Alternativ können im Subtstrat elektrische Kontakte vorgesehen sein; diese können an elektrische Kontakte im Gerät angeschlossen werden, um eine e[ektrische Widerstandsheizung oder -kühlung der Reaktionskammer bereitzustellen.
Um den Nachweis eines Polynukleotids in einer Probe zu ermöglichen, kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) in einer Mesoscale-Reaktionskammer ausgeführt werden. Die Einbringöffnungen in Flüssigkeitskontakt mit den Reaktionskammern gestatten die Zugabe der erforderlichen Reagenzien wie Nukleinsäuren, Primern und der Taq-Polymerase. Die PCR kann gemäß der im Stand der Technik etablierten Verfahren erfolgen (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). Vorrichtungen und Verfahren für Mesoscale-PCR-Analysen sind in der WO-A-93/22 058, veröffentlicht am 11. November 1993, beschrieben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die Vorrichtungen zur Durchführung einer Enzymreaktion verwendet werden, bei der das Mischen und die Zugabe von Probe und Reagenzkomponenten zeitlich aufeinander abgestimmt ist, wie in der in Fig.21 schematisch dargestellten Vorrichtung 10. Das Substrat 14 der Vorrichtung 10 ist mit Einbringöffnungen 16, Strömungskanälen 20, den Reaktionskammern 22A und 22B und der Detektionskammer 22C mikrofabriziert. Die Reaktionskammern 22A und 22B weisen jeweils einen gewundenen Mesoscale-Strömungskanal auf. Die Weglänge des gewundenen Kanals kann so gestaltet werden, daß er ein zeitgenaues Mischen und Zugeben von Probe und Reagenzkomponenten gestattet. Die Vorrichtung kann in Kombination mit einem Gerät mit Öffnungen verwendet werden, die an die Öffnungen in der Vorrichtung anschließen, das Flüssigkeiten übermitteln und aufnehmen und wahlweise ein positives Ergebnis in der Detektionskammer optisch nachweisen kann. Gemäß einer Ausführungsform kann der Cholesteringehalt in einer Probe bestimmt werden. Cholesterolesterase wird über die Einbringöffnung 16A aufgetragen und Puffer und Probe über die Einbringöffnungen 16B und 16C zugefügt. Die Mischung strömt anschließend durch den Kanal 20D zum gewundenen Misch-/Reaktionskanal 22A. Die Dauer des Mischens und der Umsetzung kann durch Mikrofabrikation des gewundenen Kanals in geeigneter Länge vorbestimmt werden. Cholesteroloxidase wird über die Öffnung 16D zugesetzt und strömt durch Kanal 20G zum gewundenen Kanal 22B, wo ein zeitgenaues Mischen und die Umsetzung der Oxidase mit der Flüssigkeit aus Kanal 22A erfolgt. Ein positives Ergebnis läßt sich optisch detektieren mittels Beobachtung der Detektionskammer 22C durch ein über dem Substrat angeordnetes, optisches Fenster. Die Detektionskammer 22C kann mit einer Bindungsgruppe ausgestattet sein, die nachweisbar mit dem Produkt der Enzymreaktion reagieren kann. Die Vorrichtung kann für eine Reihe von klinischen Enzymoder anderen Reaktionen angewandt werden.
Je nach dem in der Chipstruktur genutzten Verfahren kann das Gerät wahlweise auch auf die Injektion der zur Vervollständigung des Tests notwendigen Reagenzien ausgelegt sein, z.B. auf die Injektion eines mit einer optisch detektierbaren Gruppe markierten Bindungsproteins, einer Substratlösung oder anderer Reagenzien. Der Druck des Flüssigkeitsstroms im Mesoscale-Strömungskanal 20 in der Vorrichtung 10 kann über im Gerät 50 vorgesehene Druckdetektoren 54 detektiert werden. Im Gerät kann ein Mikroprozessor enthalten sein, um beim Sammeln der Daten für einen oder eine Serie von Tests zu helfen. Um die Genauigkeit des Tests zu erhöhen, kann das Substrat so gefertigt sein, das es einen Kontrollbereich im Strömungssystem hat z.B. einen Bereich, der keine Bindungsgruppen enthält, so daß die Probe sowohl zum Kontroll- als auch zum Detektionsbereich geführt wird. Die von der durch den Kontrollbereich strömenden Probe erhaltenen Daten können detektiert und mit Daten aus dem Probendeketionsbereich verglichen werden, um die Genauigkeit des Tests zu steigern.

Beispiel 1

Eine Multitestvorrichtung 10 mit einem Substrat 14, die in Fig. 16 schematisch dargestellt ist, wird zum Nachweis der Anwesenheit eines intrazellulären Polynukelotids in einer biologischen, zellhaltigen Flüssigkeitsprobe verwendet. Die Vorrichtung wird in Kombination mit einem Gerät wie dem in Fig.5 gezeigten Gerät 50 eingesetzt. Das Gerät umfaßt Flüssigkeitskanäle mit Öffnungen, die Ventile enthalten, die reversibel geöffnet und verschlossen werden können, an die Öffnungen in der Vorrichtung 10 anschließen und das mechanische Öffnen und Schließen der Öffnungen in der Vorrichtung während des Tests erlauben. Das Gerät umfaßt außerdem Mittel wie elektrische Kontakte, die an in das Substrat 14 eingebettete Kontakte anschließen, zum Einstellen der Temperatur der Reaktionskammern 164 und 166. Das Gerät umfaßt weiterhin eine Pumpe zur Steuerung des Flüssigkeitsstroms durch die Vörrichtung 10.
Anfänglich werden die Ventile im Gerät zum Verschließen der Öffnungen 16C und 16D verwendet, während die Öffnungen 16A und 16B offen bleiben. Die Probe wird mit Hilfe einer Pumpe im Gerät zur Probeneinlaßöffnung 16A geführt und strömt durch den Mesoscale- Strömungspfad 20A zur Kammer 22A, die auf der Wandung der Kammern immobilisierte Bindungsgruppen zur selektiven Bindung an ein Oberflächenmolekül auf einer gewünschten Zellpopulation enthält. Nach der Bindung der gewünschten Zellpopulation in der Kammer 22A wird der Strom mit Puffer fortgesetzt, der durch die Öffnung 16B austritt, um die Zellpopulation zu reinigen und isolieren. Anschließend wird die Öffnung 16B geschlossen und die Öffnung 16C geöffnet. Anschließend wird die Strömung ausreichend zum Versetzen der isolierten Zellen von der Oberfläche der Kammer 22A in die Kammer 22B erhöht, wo die Membran perforierende Vorsprünge 124 in der Kammer 22B die Zellen aufreißen und so intrazelluläres Material freisetzen.
Der Probenstrom verläuft weiter über den Filter 168, der große Zellmembranen und andere Trümmer herausfiltriert, zu den Mesoscale-PCR-Kammern 164 und 166. Die Ventile im Gerät werden zum Öffnen der Öffnung 16B und Schließen der Öffnung 16A eingesetzt. Die Taq-Polymerase, Primer und andere für den PCR-Test erforderliche Reagenzien werden durch die Öffnung 16C in die Kammern 164 und 166 gegeben, die an eine Öffnung und eine Leitung im Gerät angeschlossen ist. Eine über die Öffnung 16B angeschlossene Pumpe im Gerät wird zum Umwälzen der PCR-Probe und Reagenzien zwischen den Kammern 164 und 168 verwendet, die bei 94 ºC bzw. 65 ºC gehalten werden, um einen Polynukleotiddehybridisierungs und Polymerisationszyklus zu implementieren, der die Produktion und Isolierung eines Polynukleotids als Produkt gestattet. Die Ventile werden zum Schließen der Öffnung 16C und Öffenen der Öffnung 16D eingesetzt. Die an die Öffnung 16B angeschlossene Pumpe im Gerät wird zum Führen des aus der Zellpopulation isolierten und polymerisierten Polynukleotids in den fraktalen Detektionsbereich 40 verwendet, der immobilisierte Bindungsgruppen wie eine komplementäre Polynukleotidsonde enthält. Strömungsbeschränkungen im fraktalen Bereich 40 weisen auf einen für das intrazelluläre Polynukleotid positiven Test hin.

Beispiel 2

Eine Chemilumineszenzreaktion mit einem Peroxyoxylat in organischer Phase wurde in einem Mesoscale-Strömungskanal durchgeführt. Ein Cyalume -Lichtstab (Aldrich, Milwaukee, WI) wurde geöffnet und die Mischung aus Peroxyoxylat und Fluorophor (Komponente A) in ein Teströhrchen geleert. Das das Oxidationsmittel enthaltende Glasgefäß wurde entfernt und mit Alkohol gewaschen. Der Inhalt des Gefäßes (Komponente B) wurde in ein Teströhrchen überführt. Eine 100 µL-Probe der Komponente A und 50 µL der Komponente B wurden zum Ingangsetzen der Chemilumineszenzreaktion zusammengemischt.
Eine Probe der fluoreszierenden Lösung wurde in die zentrale Einbringöffnung des Chips #6 eingegeben, der mit einer Kammer der Dimensionen von 812 µm Breite, 400 µm Tiefe und 5,2 mm Länge, die an zwei 20 µm tiefe, 100 µm breite und 3,25 mm lange Kanäle angeschlossen war, ausgestattet ist. Jeglicher Überschuß der Probe wurde von der Oberfläche des Chips abgewischt und dieser in eine modifizierte Vorrichtung zum Halten von Mikrowellenstreifen eingespannt. Die Lichtemission vom Mesoscale-Strömungskanal wurde unter Verwendung eines Amerlite Mikroplattenablesegeräts (Amersham Diagnostics Ltd., Amersham, UK) gemessen. Ein vergleichbares Experiment wurde unter Verwendung eines 300 µm weiten, 20 µm tiefen Mesoscale-Strömungskanals (Volumen: 70,2 pL) in Chip #5 durchgeführt. Die Lichtemission (Peroxyoxylatchemilumineszenz) wurde in RLU-Einheiten (relative Lichteinheiten) an den Mesoscale-Strömungskanälen in den unterschiedlichen Chips detektiert und gemessen, wobei das Lumineszenz-Mikroplattenablesegerät verwendet wurde (Tabelle 1). Tabelle 1

Beispiel 3

In einer Reaktion in wäßriger Phase wurde die chemilumineszente, von der Meerrettichperoxidase katalysierte Oxidation von Isoluminol untersucht. Das Luminol- Wasserstoffperoxid-Reagenz wurde wie folgt hergestellt: Natriumluminol (12,5 mg) wurde in 50 mL Tris-Puffer (0,1 mol/l, pH 8,6) gelöst. 15,5 µL Wasserstoffperoxid (30 % Gew./Vol.) wurden mit 0,5 mL Tris-Puffer gemischt (0,1 mol/L, pH 8,6). Diese beiden Lösungen wurden vereinigt und vor Licht geschützt. Das Luminol-Peroxid-Reagenz (100 µL), 5 µL 4-Iodphenol ((Aldrich) (1 mg/ml in 0,1 mol/l Tris-Puffer, pH 8,6)) und 10 µL einer Meerrettichperoxidaseverdünnung (Typ VIA, 1 mg/mL) in Tris-Puffer (0,1 mol/l, pH 8,6) wurden vermischt. Eine Probe dieser Lösung wurde in die Zentralkammer des Chips #6 oder den 300 µm-Kanal des Chips #5 eingegeben. Anschließend wurde die Lichtemission unter Verwendung des Amerlite-Mikroplattenablesegeräts gemessen.
Die Chemilumineszenzemission der von der Meerrrettichperoxidase katalysierten Luminoloxidation in den verschiedenen Mesoscale-Kanälen wurde unter Verwendung des Lumineszenz-Mikroplattenablesegeräts detektiert. Ein Peroxidasetest unter Verwendung von Verdünnungen des Stammperoxidase ergab eine dosisabhängige Beziehung (Tabelle 2). Tabelle 2
* geringes Licht aufgrund von Substraterschöpfung

Beispiel 4

Die Chemilumineszenzreaktionen in den Mesoscale-Strömungskanälen wurden photographisch detektiert. Die Mesoscale-Kanäle des Chips #6 wurden mit dem Peroxyoxylat oder dem Meerrettichperoxidase (10 µg/ml) Luminol-Peroxid-Reaktionsgemisch, wie in Beispiel 2 und 3 beschrieben, gefüllt. Die Lichtemission wurde detektiert, indem man den Chip mit einem vorgefertigten photographischen Film (Polaroid, Typ 612) in einem Kameraluminometer (Wolfson Applied Technology, Birmingham, UK) in Kontakt brachte. Die Lichtemissionen der verschiedenen Chemilumineszenzreaktionen in den Mesoscäle- Strömungskanälen wurde unter Verwendung eines vorgefertigten Hochgeschwindigkeitsphotofilms detektiert (Tabelle 3). Die geringere Lichtintensität der Peroxidasereaktion erforderte längere Expositionszeiten. Tabelle 3
* nach 2 Tagen Inkubation bei Raumtemperatur
... in den Kanälen beobachteter Spermien, war in der folgenden Reihenfolge abnehmenderspermienzahlen: Kanal #1 > #2 > #3 > #4. Die meisten Spermien wurden im Kontrollkanal gesehen; in Kanal #4 wurden keine beobachtet, der das Nonoxynol-9 oder C13- G in für die spermizide Wirkung optimaler Konzentration enthielt.

Beispiel 15

Die Wechselwirkungen einer Spermaprobe mit Zervixschleim in einem Mesoscale- Strömungssystem wurde in einem zwei Kammern (5,2 mm lang, 750 µm breit und 1,5 mm tief) aufweisenden Chip getestet, die an jedem Ende über einen Kanal (3,25 mm lang, 100 µm breit und 20 µm tief) mit einem Eintrittsloch verbunden waren. Die Kanäle wurden mit HFT-BSA-Lösung geflillt und eine Zervixschleimprobe (entnommen ca. am 14. Tag des Menstruationszyklus' der Patientin) in jede der Zentralkammern gegeben. Das Sperma wanderte nicht in den Zervixschleim ein, und diejenigen Spermien, die dies taten, starben wie vorhergesehen ab, da der Zervixschleim in diesem Teil des Menstruationszyklus' für seine Spermienfeindlichkeit bekannt ist (Moghissi et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 114 : 405 (1972)).

Beispiel 16

Ein Test auf die Wechselwirkungen von Hyaluronsäure mit einer Spermaprobe wurde durchgeführt, um die zervikalen Interaktionseigenschaften einer Spermaprobe zu untersuchen. Der Test wurde in einem zwei Kammern (5,2 mm lang, 750 µm breit und 1,5 mm tief) aufweisenden Chip getestet, die an jedem Ende über die Mesoscale-Strömungskanäle #1, #2, #3 und #4 (3,25 mm lang, 100 µm breit und 20 µm tief) mit einem Eintrittsloch verbunden waren. Kanal #1 war ein Kontrollkanal. Die Kanäle wurden mit HTF-BSA-Lösungen bzw. Hyaluronsäurelösungen (Sigma) in HFT-BSA (Kanäle #2, #3 und #4: 5 mg/ml, 2,5 mg/ml bzw. 1,3 mg/ml) beschickt. Eine Samenprobe wurde in jede der Zentralkammern gegeben. Das Sperma wanderte in Kanal #2, der 5 mg/ml Hyaluronsäure enthielt, nicht ein, das Ausmaß der Migration stieg jedoch mit fallender Hyaluronsäurekonzentration in den Kanälen #3 und #4 an.

Beispiel 17

Es wurde ein Immunkügelchentest auf die Anwesenheit von IgG-Antikörpern in einer Spermaprobe durchgeführt. Immunkügelchen (BIORAD, Richmond, CA), mit einem gegen Human-IgG gerichteten Antikörper beschichtete Mikrokügelchen, wurden in HFT-BSA- Lösung (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) auf 1 mg/mL verdünnt. Ein Mikrokanal (250 µm breit, 20 µm tief und 10 mm lang) in einem Glas-Silikon-Chip wurde mit einer Probe der Immunkügeichen-Lösung gefüllt und eine Samenprobe (ca. 1,2 µL) am Kanaleingang aufgetragen. Im Kanal wurde die Agglutination der Spermien mittels der Immunkügeichen aufgrund der Anwesenheit der Antikörper in der Spermaprobe beobachtet. Als Kontrolle, wurde das Experiment auf einem Glas-Mikroskop-Objektträger unter Verwendung größerer Volumina des Immunkügelchen-Reagenz' und der Samenprobe durchgeführt; diese war ebenfalls positiv (Agglutination wurde beobachtet).

Claims

1. Vorrichtung (10) zum Detektieren eines Analyten in einer zellhaltigen Flüssigkeitsprobe, wobei der Analyt fähig ist, sich spezifisch an eine analytenspezifische Bindegruppe zu binden und wobei die Vorrichtung folgendes umfasst:

ein festes Substrat (14), das ausgebildet ist, folgendes zu definieren:

eine Probeneinbringöffnung (16); und

ein Mesoscale-Strömungssystem (40), umiassend:

einen Probenströmkanal (20), der sich von der Einbringöffnung weg erstreckt; und

einen Analytendetektionsbereich t22) in Fiüssigkeitskommunikation mit dem Strömkanal (20), umfassend die analytenspezifische Bindegruppe zur spezifischen Bindung des Analyten und zumindest einen Abschnitt des Detektionsbereichs (22), der eine Tiefe in der Größenordnung von 0,1 bis 500 µm aufweist;

einen Zellenabtrennbereich (22A, 22B) stromaufwärts vom Detektionsbereich (22), umfassend eine zellspezifische Bindegruppe zur Bindung eines Zelloberflächenmoleküls einer Zellpopufation in der Flüssigkeitsprobe, welche Bindegruppe im Abtrennbereich immobilisiert ist;

ein Mittel, das das Strömen der Probe zum Abtrennbereich bewirkt und

ein Mittel zum Detektieren der Bindung des Analyten an die analytenspezitische Gruppe, um dadurch das Vorhandensein des Analyten zu bestimmen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die analytenspezifische Bindegruppe im Detektionsbereich (22) immobilisiert ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, weiters umfassend:

einen Steuerbereich in Flüssigkeitskommunikation mit der Probeneinbringöffnung (16), worin das Detektionsmittel folgendes umfasst:

ein Fenster zum optischen Sondieren des Detektionsbereichs, das über dem Detektionsbereich (22) auf dem Substrat (14) angeordnet ist; und

ein Steuerbereichsfenster, das über dem Steuerbereich auf dem Substrat angeordnet ist, um den Steuerbereich optisch zu sondieren.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3. worin der Analyt eine intrazelluläre molekulare Komponente in einer zellhaltigen, flüssigen, biologischen Probe ist, wobei die Vorrichtung weiters umfasst:

ein Zelllysemittel (124) im Mesoscale-Strömungssystem (40) in Flüssigkeitskommunikation mit dem Strömkanal (20); und

ein Mittel zum Zusammenbringen der Zellen in der zellhaltigen Probe innerhalb des das Zelllysemittel enthaltenden Substrats, um dadurch die intrazelluläre molekulare Komponente freizusetzen.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiters umfassend:

ein Gerät zur Verwendung in Kombination mit dem Substrat, wobei das Gerät folgendes umfasst:

ein Mittel zum Halten des Substrats; und

ein optisches Mittel zum Beobachten des Inhalts des Mesoscale- Strömungssystems im Substrat.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, worin das optische Mittel eine Vergrößerungsoptik und eine Videokamera umfasst und das Gerät weiters folgendes umfasst:

einen Neigungsmechanismus zum händischen Einstellen des Winkels und Standorts der Vorrichtung; und

einen Bildschirm zum Beobachten des Inhalts des Strömungssystems.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiters umfassend:

ein Gerät zur Verwendung mit der analytischen Vorrichtung, umfassend:

ein Mittel zum Halten des Substrats;

ein Flüssigkeitszufuhrmittel, das mit einer Einbringöffnung auf dem Substrat zusammenpasst; und

ein Pumpenmittel, um Flüssigkeit durch das Strömungssystem des Substrats hindurchzuschicken, wenn es im Halterungsmittel gehalten wird.

8. Vorrichtung nach Auspruch 7, worin das Gerät weiters folgendes umfasst:

einen Speicherbehälter, der eine markierte Bindegruppe enthält, die Analyten in der Probe binden kann; und

ein Mittel zur Zufuhr der markierten Bindegruppe zum Strömungssystem.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Detektionsbereich (22) weiters einen gewundenen Mesoscale-Strömkanal umfasst, der mit einer Länge mikrofabriziert ist, die das zeitlich abgestimmte Vermischen der durch den gewundenen Kanal strömenden Flüssigkeit ermöglicht.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die analytenspezifische Bindegruppe markiert ist.

11. Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins eines Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen der Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche;

(ii) Zuführen einer Probe zur Einbringoffnung (16) und durch das Strömungssystem (40) zum Detektionsbereich (22) in der Vorrichtung; und

(iii) Detektieren der Bindung eines Analyten an die analytenspezifische Bindegruppe im Detektionsbereich mit dem Detektiermittel im Gerät, um dadurch das Vorhandensein des Analyten zu bestimmen.