JP6466193B2 - 赤血球凝集検出装置および検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、赤血球の凝集を検出する装置および検出する方法に関する。
赤血球凝集検出の代表例である血液型オモテ検査では、スライドグラス法、チューブ法といった手技による検査法が広く用いられてきた。
これらの方法では、人間の手によってサンプルが調製され、凝集の有無および強さは目視により判定される。
このことから、対応できるサンプルの量や検査時間には限界がある。
また、判定結果から検査者の主観を完全に排除することは困難である。
このことから、対応できるサンプルの量や検査時間には限界がある。
また、判定結果から検査者の主観を完全に排除することは困難である。
検査のスループットを向上し、また、判定の客観性ならびに精度を向上するため、自動化された血液型判定装置が求められ、研究開発がなされてきた。
そのような自動検査装置として、マイクロプレートを基盤としたもの(特許文献１)、カラム凝集法を基盤としたもの(特許文献２)などが実用化され、血液センターや大病院で現在使用されている。
これらの自動検査装置は高精度であり、高速に大量の検体を扱うことができる。
一方、分注や遠心といった種々の機械操作を装置内で行う必要があることから、装置は大型であり高価である。
したがって、このような自動検査装置は検査室内での使用に限られ、ベッドサイドでの血液型検査、あるいは救急や災害の現場におけるオンサイト血液型検査に用いることはできない。
一方、分注や遠心といった種々の機械操作を装置内で行う必要があることから、装置は大型であり高価である。
したがって、このような自動検査装置は検査室内での使用に限られ、ベッドサイドでの血液型検査、あるいは救急や災害の現場におけるオンサイト血液型検査に用いることはできない。
現在の救急対応では、現場から病院に患者が搬送された後で、血液型をはじめとした検査が行われ、その後、治療が行われる。
したがって、オンサイト検査が実施できれば治療の迅速化に大変有効である。
このようなポータブルな自動検査装置は、これまで実用化されていない。
したがって、オンサイト検査が実施できれば治療の迅速化に大変有効である。
このようなポータブルな自動検査装置は、これまで実用化されていない。
M. Fujimaki, C. Rockstuhl, X. Wang, K. Awazu, J. Tominaga, Y. Koganezawa, Y. Ohki, and T. Komatsubara, Opt. Express 16, pp. 6408-6416(２００８年)
B. Liedberg, C. Nylander, and I. Lunstrom, Sens. Actuators 4, pp. 299-304(１９８３年)
A. Ksendzov and Y. Lin, Opt. Lett. 30, pp. 3344-3346(２００５年)
F. Vollmer, S. Arnold, and D. Keng, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, pp. 20701-20704(２００８年)
T. Takeo and H. Hattori, Jpn. J. Appl. Phys. 21, pp. 1509-1512(１９８２年)
K. Kato, A. Takatsu, N. Matsuda, R. Azumi, M. Matsumoto, Chem. Lett. 24, pp. 437-438(１９９５年)
本発明は、装置に可搬性があり、医療検査の生産性を向上し、赤血球の多様な凝集形態に対応し得る、微量の検体から凝集反応の微小な変化を自動的に検出し得る赤血球凝集検出装置および検出方法を課題とする。
本発明は、検出チップ表面での物質の吸着を検知できる光学式センサにマイクロ流路を結合することで上記の課題を解決した。
本発明で用いられる光学式センサは、主にエバネッセント場を利用した光学式センサであり、例えば、導波モードセンサ(特許文献３、非特許文献１)、表面プラズモン共鳴センサ(非特許文献２)、リング型共振器センサ(非特許文献３)、ウィスパリングギャラリーモードセンサ(非特許文献４)、光ファイバセンサ(非特許文献５)、スラブ導波路センサ(非特許文献６)などが適用可能である。これらのセンサは、検出チップ表面に発生させた光学的共鳴を利用して検出チップ表面近傍の光学特性の変化を高感度に検出するセンサである。
具体的には、次の赤血球凝集検出装置、赤血球凝集検出方法、およびマイクロ流路チップを提供できる。
本発明で用いられる光学式センサは、主にエバネッセント場を利用した光学式センサであり、例えば、導波モードセンサ(特許文献３、非特許文献１)、表面プラズモン共鳴センサ(非特許文献２)、リング型共振器センサ(非特許文献３)、ウィスパリングギャラリーモードセンサ(非特許文献４)、光ファイバセンサ(非特許文献５)、スラブ導波路センサ(非特許文献６)などが適用可能である。これらのセンサは、検出チップ表面に発生させた光学的共鳴を利用して検出チップ表面近傍の光学特性の変化を高感度に検出するセンサである。
具体的には、次の赤血球凝集検出装置、赤血球凝集検出方法、およびマイクロ流路チップを提供できる。
（１）
光学式センサとマイクロ流路を備えた赤血球凝集検出装置であって、
前記光学式センサは、少なくとも、光源、検出チップ、受光素子からなり、これらが前記光源からの出射光の行路順に配置されてなる、エバネッセント場を利用した光学式センサであり、
前記マイクロ流路は、マイクロ流路構造体と前記検出チップとを接合して形成され、
前記マイクロ流路は、検体試料を導入する導入流路と、検査流路と、排出流路から構成され、
少なくとも前記検査流路は、検出の対象となる赤血球凝集塊の大きさに対応して当該赤血球凝集塊の沈降の有無を生じさせる２０μｍ以上２００μｍ以下の流路高さを有し、
この流路高さによって、赤血球凝集塊の重力沈降運動を抑制することによって、前記光学式センサによって測定された信号の時間変化に基づいて、該検体試料中に存在する赤血球の固有の凝集の有無を検出する事を特徴とする赤血球凝集検出装置。
光学式センサとマイクロ流路を備えた赤血球凝集検出装置であって、
前記光学式センサは、少なくとも、光源、検出チップ、受光素子からなり、これらが前記光源からの出射光の行路順に配置されてなる、エバネッセント場を利用した光学式センサであり、
前記マイクロ流路は、マイクロ流路構造体と前記検出チップとを接合して形成され、
前記マイクロ流路は、検体試料を導入する導入流路と、検査流路と、排出流路から構成され、
少なくとも前記検査流路は、検出の対象となる赤血球凝集塊の大きさに対応して当該赤血球凝集塊の沈降の有無を生じさせる２０μｍ以上２００μｍ以下の流路高さを有し、
この流路高さによって、赤血球凝集塊の重力沈降運動を抑制することによって、前記光学式センサによって測定された信号の時間変化に基づいて、該検体試料中に存在する赤血球の固有の凝集の有無を検出する事を特徴とする赤血球凝集検出装置。
（２）
前記光学式センサは導波モードセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサのいずれか一つからなることを特徴とする(１)に記載する赤血球凝集検出装置。
前記光学式センサは導波モードセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサのいずれか一つからなることを特徴とする(１)に記載する赤血球凝集検出装置。
（３）
前記導波モードセンサは、前記検出チップの前記マイクロ流路構造体が形成されている面と反対側の面に前記行路を形成するようにプリズムが配され、前記光源と該プリズムとの間の前記行路に少なくともコリメートレンズ及び偏光板を有し、また、該プリズムと前記受光素子との間の前記行路に少なくとも集光レンズを有することを特徴とする(２)に記載する赤血球凝集検出装置。
（４）
前記検出チップはシリカガラス基板、反射層はシリコン、導波路層は酸化シリコンからなる導波モード検出チップに構成され、該導波路層は前記マイクロ流路構造体と接合されていることを特徴とする(２)または(３)に記載の赤血球凝集検出装置。
前記導波モードセンサは、前記検出チップの前記マイクロ流路構造体が形成されている面と反対側の面に前記行路を形成するようにプリズムが配され、前記光源と該プリズムとの間の前記行路に少なくともコリメートレンズ及び偏光板を有し、また、該プリズムと前記受光素子との間の前記行路に少なくとも集光レンズを有することを特徴とする(２)に記載する赤血球凝集検出装置。
（４）
前記検出チップはシリカガラス基板、反射層はシリコン、導波路層は酸化シリコンからなる導波モード検出チップに構成され、該導波路層は前記マイクロ流路構造体と接合されていることを特徴とする(２)または(３)に記載の赤血球凝集検出装置。
（５）
前記マイクロ流路に接続された送液手段を備え、前記検体試料は前記マイクロ流路に、
圧力送液法、または、毛細管力送液法のいずれかの方法で導入されたことを特徴とする(
１)から(４)のいずれかに記載の赤血球凝集検出装置。
（６）
前記検体試料は前記導入流路に充填した乾燥抗体へ血液検体を通過させて生成されたこ
とを特徴とする(５)に記載の赤血球凝集検出装置。
前記マイクロ流路に接続された送液手段を備え、前記検体試料は前記マイクロ流路に、
圧力送液法、または、毛細管力送液法のいずれかの方法で導入されたことを特徴とする(
１)から(４)のいずれかに記載の赤血球凝集検出装置。
（６）
前記検体試料は前記導入流路に充填した乾燥抗体へ血液検体を通過させて生成されたこ
とを特徴とする(５)に記載の赤血球凝集検出装置。
（７）
光学式センサとマイクロ流路を利用する赤血球凝集検出方法であって、
前記光学式センサは、少なくとも、光源、検出チップ、受光素子からなり、これらが前記光源からの出射光の行路順に配置されてなる、エバネッセント場を利用した光学式センサであり、
前記マイクロ流路はマイクロ流路構造体と前記検出チップとを接合して形成され、
前記マイクロ流路は検体試料を導入する導入流路と、検査流路と、排出流路から構成され、
少なくとも該検査流路は検出の対象となる赤血球凝集塊の大きさに対応して当該赤血球凝集塊の沈降の有無を生じさせる２０μｍ以上２００μｍ以下の流路高さを有し、
赤血球を含有する該検体試料は該導入流路に導入されて該検査流路に輸送され、該検体試料の一部または全部が該検査流路中に留まって静止するように配された後、該光学式センサによって測定された信号の時間変化により赤血球凝集を検出する事を特徴とする赤血球凝集検出方法。
光学式センサとマイクロ流路を利用する赤血球凝集検出方法であって、
前記光学式センサは、少なくとも、光源、検出チップ、受光素子からなり、これらが前記光源からの出射光の行路順に配置されてなる、エバネッセント場を利用した光学式センサであり、
前記マイクロ流路はマイクロ流路構造体と前記検出チップとを接合して形成され、
前記マイクロ流路は検体試料を導入する導入流路と、検査流路と、排出流路から構成され、
少なくとも該検査流路は検出の対象となる赤血球凝集塊の大きさに対応して当該赤血球凝集塊の沈降の有無を生じさせる２０μｍ以上２００μｍ以下の流路高さを有し、
赤血球を含有する該検体試料は該導入流路に導入されて該検査流路に輸送され、該検体試料の一部または全部が該検査流路中に留まって静止するように配された後、該光学式センサによって測定された信号の時間変化により赤血球凝集を検出する事を特徴とする赤血球凝集検出方法。
（８）
前記光学式センサは導波モードセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサのいずれか一つからなることを特徴とする(７)に記載する赤血球凝集検出方法。
前記光学式センサは導波モードセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサのいずれか一つからなることを特徴とする(７)に記載する赤血球凝集検出方法。
（９）
前記導波モードセンサは、前記検出チップの前記マイクロ流路構造体が形成されている面と反対側の面に前記行路を形成するようにプリズムが配され、前記光源と該プリズムとの間の前記行路に少なくともコリメートレンズ及び偏光板を有し、また、該プリズムと前記受光素子との間の前記行路に少なくとも集光レンズを有することを特徴とする(８)に記載する赤血球凝集検出方法。
前記導波モードセンサは、前記検出チップの前記マイクロ流路構造体が形成されている面と反対側の面に前記行路を形成するようにプリズムが配され、前記光源と該プリズムとの間の前記行路に少なくともコリメートレンズ及び偏光板を有し、また、該プリズムと前記受光素子との間の前記行路に少なくとも集光レンズを有することを特徴とする(８)に記載する赤血球凝集検出方法。
（１０）
さらに前記マイクロ流路に接続された送液手段を備え、前記検体試料は前記マイクロ流路に、圧力送液法、または、毛細管力送液法のいずれかの方法で導入されたことを特徴とする(７)から(９)のいずれかに記載の赤血球凝集検出方法。
（１１）
前記検体試料は前記導入流路に充填した乾燥抗体へ血液検体を通過させて生成されたことを特徴とする(１０)に記載の赤血球凝集検出方法。
さらに前記マイクロ流路に接続された送液手段を備え、前記検体試料は前記マイクロ流路に、圧力送液法、または、毛細管力送液法のいずれかの方法で導入されたことを特徴とする(７)から(９)のいずれかに記載の赤血球凝集検出方法。
（１１）
前記検体試料は前記導入流路に充填した乾燥抗体へ血液検体を通過させて生成されたことを特徴とする(１０)に記載の赤血球凝集検出方法。
本発明により、微量の検体からマイクロ流路チップを用いて赤血球凝集塊の大きさに依存した沈降の有無を生じさせ、光センサ信号の時間変化を基に固有の凝集の有無情報が検出できるようになった。
また、マイクロ流路チップを用いることにより凝集を短時間で判定し、振動などの外乱に対しても影響を受け難い赤血球凝集検査装置が可能となった。
さらに、導波モードセンサとマイクロ流路チップの組み合わせにより小型の筐体に収まる、可搬性のある赤血球凝集検査装置が可能となった。
また、マイクロ流路チップを用いることにより凝集を短時間で判定し、振動などの外乱に対しても影響を受け難い赤血球凝集検査装置が可能となった。
さらに、導波モードセンサとマイクロ流路チップの組み合わせにより小型の筐体に収まる、可搬性のある赤血球凝集検査装置が可能となった。
光学式センサとマイクロ流路チップを備えた装置全体の概要図を図１(ａ)に、写真を図１(ｂ)に、マイクロ流路チップの見取り図を図１(ｃ)に示し、図を用いて説明する。
マイクロ流路チップは、マイクロ流路構造体と検出チップを接合して形成される。
マイクロ流路構造体は、図１(ａ)および(ｃ)に示すように、外形断面は四角形状(一部円形状でもよい)であり長手方向に直線、曲線、または折れ線形状をしており、内側の凹部断面形状はマイクロ流路を構成する四角形状(一部円形状でもよい)で少なくとも凹部の縦横比は垂直方向に短く、所定のマイクロ流路高さを有し、少なくとも沈滞した試料を測定するセンサの検出チップと向かい合って接合する底面部は検出チップと平行に形成される。
マイクロ流路構造体と検出チップを接合することで、マイクロ流路構造体凹部および検出チップ表面により構成される送液空間としてのマイクロ流路が形成される。
実施例では、直線状で外形断面・凹部断面とも四角形状で外形寸法の縦横比は約１：３のポリジメチルシロキサンからなるマイクロ流路構造体を作製した。
また、実施例では、図１(ａ)ＢＢ’断面図に示すように、マイクロ流路両端部を折り曲げてマイクロ流路導入流路部・排出流路部は上面に露出させたが、マイクロ流路をそのまま側面に露出させて接続してもよい。
マイクロ流路チップは、マイクロ流路構造体と検出チップを接合して形成される。
マイクロ流路構造体は、図１(ａ)および(ｃ)に示すように、外形断面は四角形状(一部円形状でもよい)であり長手方向に直線、曲線、または折れ線形状をしており、内側の凹部断面形状はマイクロ流路を構成する四角形状(一部円形状でもよい)で少なくとも凹部の縦横比は垂直方向に短く、所定のマイクロ流路高さを有し、少なくとも沈滞した試料を測定するセンサの検出チップと向かい合って接合する底面部は検出チップと平行に形成される。
マイクロ流路構造体と検出チップを接合することで、マイクロ流路構造体凹部および検出チップ表面により構成される送液空間としてのマイクロ流路が形成される。
実施例では、直線状で外形断面・凹部断面とも四角形状で外形寸法の縦横比は約１：３のポリジメチルシロキサンからなるマイクロ流路構造体を作製した。
また、実施例では、図１(ａ)ＢＢ’断面図に示すように、マイクロ流路両端部を折り曲げてマイクロ流路導入流路部・排出流路部は上面に露出させたが、マイクロ流路をそのまま側面に露出させて接続してもよい。
図１(ａ)に示した装置は、可視光白色光源、光ファイバ、プリズム、分光器、レンズ系、および検出チップからなる導波モードセンサの測定システムをもとに、検出チップ上にマイクロ流路構造体を接合しマイクロ流路を構成し、さらに、その露出部をマイクロ流路構造体の上面に形成し導入および排出流路系を接続して構築したものである。
図１(ａ)に示した導波モードセンサでは、光源１には、白色ランプやＬＥＤなどを用いることができる。
光ファイバ２は、光源１からの光をプリズムに対して最適な入射方向から入射できるように光を導くためのものであり、光源１が光ファイバ２を用いることなく、プリズム６に対して最適位置に設置可能であれば、光ファイバ２は特に用いなくともよい。
この時、光源からの光の大きさを適当な大きさにするための絞り(ピンホールやアイリスなど)を設置しても良い。
コリメートレンズ３は、光ファイバ２の出口から放射状に放出される光をコリメート光に変換して、効率よくプリズムに導くために設置されている。
光源から平行性の高い光が得られる場合には、コリメートレンズ３も省くことができる。
偏光板４は、導波モードセンサにおいてより高い検出感度が得られるＳ偏光のみを選択するために用いられる。
光ファイバ２は、光源１からの光をプリズムに対して最適な入射方向から入射できるように光を導くためのものであり、光源１が光ファイバ２を用いることなく、プリズム６に対して最適位置に設置可能であれば、光ファイバ２は特に用いなくともよい。
この時、光源からの光の大きさを適当な大きさにするための絞り(ピンホールやアイリスなど)を設置しても良い。
コリメートレンズ３は、光ファイバ２の出口から放射状に放出される光をコリメート光に変換して、効率よくプリズムに導くために設置されている。
光源から平行性の高い光が得られる場合には、コリメートレンズ３も省くことができる。
偏光板４は、導波モードセンサにおいてより高い検出感度が得られるＳ偏光のみを選択するために用いられる。
図１(ａ)では、光源１と光ファイバ２とコリメートレンズ３と偏光板４とを別々の光学素子として記載しているが、これら４つの要素は一体として、平行なＳ偏光を得るための光源として扱ってもよい。
プリズム６は、光を所望の入射角度で検出チップ１１に導入するためのものである。
図中では台形のプリズムが記載されているが、これは三角形プリズム、半円柱プリズム、半球プリズムなどであってもよい。
検出チップ１１とプリズム６の界面における光の散乱を防ぐため、検出チップ１１とプリズム６の間には、屈折率調節液(オイル)や、屈折率が光学プリズムと同じになるように調整された樹脂、または接着剤を与えることが好ましい。
また、プリズム６は検出チップ１１と一体であってもよい。
また、光の進路を変更する点において、回折格子を用いてもよい。
図中では台形のプリズムが記載されているが、これは三角形プリズム、半円柱プリズム、半球プリズムなどであってもよい。
検出チップ１１とプリズム６の界面における光の散乱を防ぐため、検出チップ１１とプリズム６の間には、屈折率調節液(オイル)や、屈折率が光学プリズムと同じになるように調整された樹脂、または接着剤を与えることが好ましい。
また、プリズム６は検出チップ１１と一体であってもよい。
また、光の進路を変更する点において、回折格子を用いてもよい。
検出チップ１１の表面で反射した光は、反射光７となってプリズムから放出される。
その後、集光レンズ８によって、効率よく光ファイバ９に入射され、分光器に導かれる。分光器が備える受光素子から得た測定データは、パーソナルコンピュータを用いて処理し、結果図を表示装置に表示した。
ここで、集光レンズ８及び光ファイバ９は、反射光７を効率良く分光器に導くために用いているが、反射光強度が十分強ければ、これらの光学素子は使用せず、直接分光器にて反射スペクトルを観測することも可能である。
その後、集光レンズ８によって、効率よく光ファイバ９に入射され、分光器に導かれる。分光器が備える受光素子から得た測定データは、パーソナルコンピュータを用いて処理し、結果図を表示装置に表示した。
ここで、集光レンズ８及び光ファイバ９は、反射光７を効率良く分光器に導くために用いているが、反射光強度が十分強ければ、これらの光学素子は使用せず、直接分光器にて反射スペクトルを観測することも可能である。
本装置のマイクロ流路に、検査試薬と混合した赤血球を含有する検体試料、具体的には血液型抗体と混合した血液などを導入する。
この時、導波モードセンサで測定された反射スペクトル上には、検出チップ表面近傍に励起された光学的共鳴および試料中の赤血球の光吸収に起因したディップが生じる(図２(ｂ)、図２(ｄ))。
このディップの底の位置における反射率を、ディップ反射率と呼ぶ。
本発明における導波モードセンサでは、このディップ反射率がセンサによって測定された信号となる。
検出チップ表面に物質が付着すると、この信号、つまりディップ反射率が変化する。
経時的に付着物の量が変化すると、ディップ反射率もその付着量に応じて変化する。
この時、導波モードセンサで測定された反射スペクトル上には、検出チップ表面近傍に励起された光学的共鳴および試料中の赤血球の光吸収に起因したディップが生じる(図２(ｂ)、図２(ｄ))。
このディップの底の位置における反射率を、ディップ反射率と呼ぶ。
本発明における導波モードセンサでは、このディップ反射率がセンサによって測定された信号となる。
検出チップ表面に物質が付着すると、この信号、つまりディップ反射率が変化する。
経時的に付着物の量が変化すると、ディップ反射率もその付着量に応じて変化する。
試料を導入した後は、導入を停止し、検体試料をマイクロ流路内で静止させる。
凝集が生じない場合、流路に導入された試料中の赤血球は時間の経過とともに重力沈降し、検出チップ表面に堆積していく(図２(ａ))。
すると、導波モードセンサの検出領域(検出チップ表面から数百ｎｍ程度の範囲)(検査部)に存在する赤血球が増加することになり、ディップ反射率は時間の経過とともに変化する(図２(ｂ))。
すると、導波モードセンサの検出領域(検出チップ表面から数百ｎｍ程度の範囲)(検査部)に存在する赤血球が増加することになり、ディップ反射率は時間の経過とともに変化する(図２(ｂ))。
ディップ反射率の変化は、検出チップ表面が完全に赤血球に覆われた時点で飽和する。一方、強い凝集が生じる場合、赤血球凝集塊のサイズは一般にマイクロ流路より大きいことから、試料がマイクロ流路に導入された状態から重力沈降は生じない(図２(ｃ))。
つまり、マイクロ流路が重力沈降運動を抑制する。
つまり、マイクロ流路が重力沈降運動を抑制する。
このため、ディップ反射率も時間変化を生じず、一定値を取る(図２(ｄ))。
凝集試料と非凝集試料の測定結果例を図２(ｅ)に示す。
このように、マイクロ流路内の試料のディップ反射率の時間変化を計測することで、赤血球の凝集を明確に判別することができる。
一般的に、抗体をはじめとした検査試薬内の赤血球凝集素は、赤血球の光吸収波長における光吸収には寄与しないため、試験への影響はほとんどない。また、血液型抗体試薬には着色されているものもあるが、これら色素成分は赤血球に比べて小さく、重力沈降しないため、反射率の時間変化への影響はない。
このように、マイクロ流路内の試料のディップ反射率の時間変化を計測することで、赤血球の凝集を明確に判別することができる。
一般的に、抗体をはじめとした検査試薬内の赤血球凝集素は、赤血球の光吸収波長における光吸収には寄与しないため、試験への影響はほとんどない。また、血液型抗体試薬には着色されているものもあるが、これら色素成分は赤血球に比べて小さく、重力沈降しないため、反射率の時間変化への影響はない。
さらに、凝集の強さが小さく、マイクロ流路よりも小さい大きさの凝集塊を生じる場合(図２(ｆ))、凝集の強さに応じて非凝集時と強い凝集時の中間程度の時間変化を示すものと考えられる。
したがって、本発明によれば、凝集の有無のみならず、赤血球表面の血液型抗原または抗体をはじめとした検査試薬内の赤血球凝集素に起因する、赤血球凝集の強度を評価することが可能である。
したがって、本発明によれば、凝集の有無のみならず、赤血球表面の血液型抗原または抗体をはじめとした検査試薬内の赤血球凝集素に起因する、赤血球凝集の強度を評価することが可能である。
また、図１(ｂ)に示すように、本発明の大きさは、マイクロ流路チップはおよそ１.５×２×０.５ｃｍ以下、光学式センサ(図では導波モードセンサ。)はおよそ３０×２０×１５ｃｍ程度で容易に持ち運び可能なサイズで試作した。また、試作に交流電源を使用したがバッテリー駆動に代えても動作可能であった。
したがって、本発明は、小型独立電源と、検体導入系・送液系と、検査済検体排出系、分光器からのデータ処理手段、結果図表示装置等を適宜小型化して小型の筐体に配置することにより、ポータブルな赤血球凝集検出装置・自動検査装置とすることができる。
したがって、本発明は、小型独立電源と、検体導入系・送液系と、検査済検体排出系、分光器からのデータ処理手段、結果図表示装置等を適宜小型化して小型の筐体に配置することにより、ポータブルな赤血球凝集検出装置・自動検査装置とすることができる。
個々の赤血球は、大きさが直径約８μｍおよび厚さ約２μｍで、中央部が凹んだ円盤状をしている。
したがって、本発明にかかる赤血球凝集塊検出においては赤血球凝集塊の大きさに対応した、適切なマイクロ流路高さを設定することが重要となる。
より具体的には、凝集していない血球は重力沈降運動をすることができるが、凝集した血球は、その高さによって重力沈降運動が抑制され、殆ど沈降できなくなるような高さに、マイクロ流路高さを設定することが好ましい。
より具体的には、凝集していない血球は重力沈降運動をすることができるが、凝集した血球は、その高さによって重力沈降運動が抑制され、殆ど沈降できなくなるような高さに、マイクロ流路高さを設定することが好ましい。
そこで、高さ１７.４μｍ、４８.５μｍ、８７.４μｍのマイクロ流路を有するマイクロ流路チップを作製し、赤血球凝集検出試験を行った。
用いた光学式センサは、導波モードセンサである。
用いた検出チップは、反射層としてシリコン層(厚さ４５ｎｍ)、導波路層として酸化シリコン層(厚さ３６０ｎｍ)とし、赤血球の光吸収ピークのひとつである波長５４０ｎｍにディップを生じるように作製したものである。
用いた光学式センサは、導波モードセンサである。
用いた検出チップは、反射層としてシリコン層(厚さ４５ｎｍ)、導波路層として酸化シリコン層(厚さ３６０ｎｍ)とし、赤血球の光吸収ピークのひとつである波長５４０ｎｍにディップを生じるように作製したものである。
本試験では、赤血球濃度５％となるよう希釈した血液検体と、血液型抗体試薬とを事前に混合したのちにマイクロ流路に導入した。
分光器より得られたスペクトルデータは、ノート型パーソナルコンピュータで処理され、出力信号はノート型パーソナルコンピュータのディスプレイに表示された。
本試験で測定した試料導入から、一定時間後のディップ反射率変化量を図３に示す。
分光器より得られたスペクトルデータは、ノート型パーソナルコンピュータで処理され、出力信号はノート型パーソナルコンピュータのディスプレイに表示された。
本試験で測定した試料導入から、一定時間後のディップ反射率変化量を図３に示す。
図３(ａ)は、送液手段が図１(ａ)に示したシリンジによる圧力送液でマイクロ流路に試料導入したもの、図３(ｂ)はピペットで試料をマイクロ流路チップ入口に滴下し、送液手段が毛細管力送液でマイクロ流路に試料導入したものの測定結果である。
測定結果より、高さ１７.４μｍのマイクロ流路では凝集と非凝集の差異が小さかった。
これは、流路高さが小さすぎたため、凝集していない血球においても、重力沈降が抑制されてしまい、重力沈降によって信号変化が得られるはずの非凝集試料においても信号変化が得られなかったためと考えられる。
これは、流路高さが小さすぎたため、凝集していない血球においても、重力沈降が抑制されてしまい、重力沈降によって信号変化が得られるはずの非凝集試料においても信号変化が得られなかったためと考えられる。
また、高さ８７.４μｍのマイクロ流路では、毛細管力送液の結果では凝集した試料も反射率の時間変化が大きくなった。
これは、凝集塊の大きさに比べて流路高さが大きくなり、沈降する空間的余裕が生じたためと考えられる。
ただし、圧力送液の結果では凝集試料の時間変化は、ほとんど見られない。
マイクロ流路を用いた試験結果を裏付けるため、顕微鏡観察により赤血球凝集塊の代表的な大きさを調べた。赤血球濃度５％に希釈した血液試料１０μＬと血液型抗体１０μＬをスライドグラス上で混合し、１分後の凝集状態を光学顕微鏡で観察した。抗Ａ抗体と混合したＡ型血液および抗Ｂ抗体と混合したＢ型血液を観察した結果、凝集塊の代表的な大きさは５０μｍから２００μｍであった。
ただし、圧力送液の結果では凝集試料の時間変化は、ほとんど見られない。
マイクロ流路を用いた試験結果を裏付けるため、顕微鏡観察により赤血球凝集塊の代表的な大きさを調べた。赤血球濃度５％に希釈した血液試料１０μＬと血液型抗体１０μＬをスライドグラス上で混合し、１分後の凝集状態を光学顕微鏡で観察した。抗Ａ抗体と混合したＡ型血液および抗Ｂ抗体と混合したＢ型血液を観察した結果、凝集塊の代表的な大きさは５０μｍから２００μｍであった。
以上より、採用する送液方式にも依存するが、本センサで採用すべきマイクロ流路の高さは、毛細管力送液法では、２０〜１００μｍ、圧力送液法では、その上限が２００μｍの設定が好適である。
図４に、一定時間後の反射率変化の微分について評価した結果を示す。
本グラフは、圧力送液、流路高さ４８.５μｍの測定データについて、時間に対する微分値を求めたものである。
本グラフから明らかなように、測定初期の微分値を用いることによっても明確に凝集と非凝集を判別することができる。
また、図３のような一定時間後の反射率の評価に比べ、より短時間で凝集の評価することができる。
本グラフは、圧力送液、流路高さ４８.５μｍの測定データについて、時間に対する微分値を求めたものである。
本グラフから明らかなように、測定初期の微分値を用いることによっても明確に凝集と非凝集を判別することができる。
また、図３のような一定時間後の反射率の評価に比べ、より短時間で凝集の評価することができる。
血液検体と抗体試薬との混合を、乾燥状態にして流路内に導入された抗体を用いて測定した例を示す。
抗体を乾燥状態にする方法には、減圧乾燥法や凍結乾燥法が含まれる。
抗体を乾燥状態にする方法には、減圧乾燥法や凍結乾燥法が含まれる。
本例では、図５(ａ)に示すように、検査部手前に穴状の抗体混合部を設け、その中に減圧乾燥によって乾燥状態とした抗体を導入した。
赤血球濃度５％に希釈された血液検体が混合部を通過する際に抗体と混合されて検査部に導入された。マイクロ流路は、高さ４８.５μｍのものを用いた。
測定されたディップ反射率の時間変化を図５(ｂ)に示す。
赤血球濃度５％に希釈された血液検体が混合部を通過する際に抗体と混合されて検査部に導入された。マイクロ流路は、高さ４８.５μｍのものを用いた。
測定されたディップ反射率の時間変化を図５(ｂ)に示す。
事前混合してからマイクロ流路に検体を導入した図２および図３の測定結果と同様、乾燥状態とした抗体と流路内で混合して行った測定でもディップ反射率から赤血球の凝集と非凝集が明確に区別された。
一般的に、マイクロ流路内の流れは層流となり、液と液との混合が難しいことが知られている。
抗体を乾燥状態とすることで、マイクロ流路内での混合および検出を容易に行うことができる。
抗体を乾燥状態とすることで、マイクロ流路内での混合および検出を容易に行うことができる。
本発明の光学式センサは、導波モードセンサに限定されず、検出チップ表面近傍における光学特性の変化を検出するエバネッセント場を利用したセンサによれば実施可能である。
これらエバネッセント場を利用したセンサには、導波モードセンサに加えて表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサなどが含まれる。
それぞれのセンサにおいて、好適な光源、検出チップ、受光素子は、それぞれ公知のものが使用可能である。
これらエバネッセント場を利用したセンサは、検出チップ上の検出表面近傍の光学特性変化についてエバネッセント場を利用して検出するという意味において等価である。
以下では、表面プラズモン共鳴センサを例としてその実施形態を示す。
それぞれのセンサにおいて、好適な光源、検出チップ、受光素子は、それぞれ公知のものが使用可能である。
これらエバネッセント場を利用したセンサは、検出チップ上の検出表面近傍の光学特性変化についてエバネッセント場を利用して検出するという意味において等価である。
以下では、表面プラズモン共鳴センサを例としてその実施形態を示す。
図６に示すように、本装置はレーザー光源、プリズム、受光素子、レンズ系、および検出チップからなる表面プラズモン共鳴センサの測定システムをもとに、検出チップ上にマイクロ流路構造体を接合し、さらに、その上面に導入および排出流路系を接続して構築される。
検出チップは、シリカガラス基板上に表面プラズモン励起層であるアルミニウム薄膜を備えたものである。アルミニウムの膜厚は２２ｎｍとした。
Transfer Matrix法による光学シミュレーションにより、血液試料測定時の表面プラズモン共鳴センサの反射スペクトルを計算した。
本計算では、厚さ２２ｎｍのアルミニウム膜の上に厚さ５ｎｍの自然酸化膜を仮定し、その上に厚さ１００ｎｍの血液試料の層を配置した計算モデルを用いた。
血液試料層の厚さは、プラズモン減衰長と同等の距離として選んだ。
血液試料層の厚さは、プラズモン減衰長と同等の距離として選んだ。
血液試料層における、血漿に対する赤血球の体積分率を変化させて計算した反射スペクトルを図７に示す。
赤血球の体積分率の増加は、赤血球の重力沈降により、検出チップ表面に接触する赤血球数が増加することを表す。
赤血球の体積分率の増加により、反射スペクトルのディップ反射率、つまりセンサによって得られる信号の変化が見られた。
赤血球の体積分率の増加は、赤血球の重力沈降により、検出チップ表面に接触する赤血球数が増加することを表す。
赤血球の体積分率の増加により、反射スペクトルのディップ反射率、つまりセンサによって得られる信号の変化が見られた。
すなわち、表面プラズモン共鳴センサにおいても、赤血球の沈降によって信号の時間変化が生じることが分かる。
つまり、所定の高さのマイクロ流路を用いることによって、凝集した赤血球の重力沈降運動を抑制すれば、赤血球凝集検出を行うことが可能である。
つまり、所定の高さのマイクロ流路を用いることによって、凝集した赤血球の重力沈降運動を抑制すれば、赤血球凝集検出を行うことが可能である。
なお、図７に示されたように、表面プラズモン共鳴センサでは、赤血球の体積分率の増加により光吸収が強くなると、表面プラズモンの共鳴状態が弱まり、ディップ反射率は増加の方向に変化する。
これは、図２(ｂ)や(ｅ)などに示されたような導波モードセンサで観測される変化とは逆方向の変化であるが、変化の方向に関わらず、信号変化が観測されれば本発明による凝集の検出が可能である。
これは、図２(ｂ)や(ｅ)などに示されたような導波モードセンサで観測される変化とは逆方向の変化であるが、変化の方向に関わらず、信号変化が観測されれば本発明による凝集の検出が可能である。
このように本発明の光学式センサは、各種エバネッセント場を利用したセンサで置き換え可能であり、いずれのセンサでも同様の効果が得られる。
本発明は、血液型判定におけるオモテ試験およびウラ試験、輸血前の交差適合試験、あるいは、インフルエンザなどのウイルス測定におけるヘマグルチニン試験などに応用することができる。
１ 光源
２ 光ファイバ
３ コリメートレンズ
４ 偏光板
５ 入射光
６ プリズム
７ 反射光
８ 集光レンズ
９ 光ファイバ
１０ 分光器
１１ 検出チップ
１２ マイクロ流路構造体
１３ シリカガラス基板
１４ シリコン層
１５ 酸化シリコン層
１６ 導入流路系
１７ 排出流路系
１８ 血液試料
１９ 検査部
２０ 乾燥状態の抗体試薬
２１ 赤血球と抗体試薬または凝集塊
２２ マイクロ流路
２３ マイクロ流路チップ
２４ アルミ層
２５ 受光素子
２ 光ファイバ
３ コリメートレンズ
４ 偏光板
５ 入射光
６ プリズム
７ 反射光
８ 集光レンズ
９ 光ファイバ
１０ 分光器
１１ 検出チップ
１２ マイクロ流路構造体
１３ シリカガラス基板
１４ シリコン層
１５ 酸化シリコン層
１６ 導入流路系
１７ 排出流路系
１８ 血液試料
１９ 検査部
２０ 乾燥状態の抗体試薬
２１ 赤血球と抗体試薬または凝集塊
２２ マイクロ流路
２３ マイクロ流路チップ
２４ アルミ層
２５ 受光素子
Claims (11)
- 光学式センサとマイクロ流路を備えた赤血球凝集検出装置であって、
前記光学式センサは、少なくとも、光源、検出チップ、受光素子からなり、これらが前記光源からの出射光の行路順に配置されてなる、エバネッセント場を利用した光学式センサであり、
前記マイクロ流路は、マイクロ流路構造体と前記検出チップとを接合して形成され、
前記マイクロ流路は、検体試料を導入する導入流路と、検査流路と、排出流路から構成され、
少なくとも前記検査流路は、検出の対象となる赤血球凝集塊の大きさに対応して当該赤血球凝集塊の沈降の有無を生じさせる２０μｍ以上２００μｍ以下の流路高さを有し、
この流路高さによって、赤血球凝集塊の重力沈降運動を抑制することによって、前記光学式センサによって測定された信号の時間変化に基づいて、該検体試料中に存在する赤血球の固有の凝集の有無を検出する事を特徴とする赤血球凝集検出装置。 - 前記光学式センサは、導波モードセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサのいずれか一つからなることを特徴とする請求項１に記載する赤血球凝集検出装置。
- 前記導波モードセンサは、前記検出チップの前記マイクロ流路構造体が形成されている面と反対側の面に前記行路を形成するようにプリズムが配され、前記光源と該プリズムとの間の前記行路に少なくともコリメートレンズ及び偏光板を有し、また、該プリズムと前記受光素子との間の前記行路に少なくとも集光レンズを有することを特徴とする請求項２に記載する赤血球凝集検出装置。
- 前記検出チップは、シリカガラス基板、反射層はシリコン、導波路層は酸化シリコンからなる導波モード検出チップに構成され、該導波路層は前記マイクロ流路構造体と接合されていることを特徴とする請求項２または請求項３のいずれか１項に記載の赤血球凝集検出装置。
- 前記マイクロ流路に接続された送液手段を備え、前記検体試料は前記マイクロ流路に、圧力送液法、または、毛細管力送液法のいずれかの方法で導入されたことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の赤血球凝集検出装置。
- 前記検体試料は、前記導入流路に充填した乾燥抗体へ血液検体を通過させて生成されたことを特徴とする請求項５に記載の赤血球凝集検出装置。
- 光学式センサとマイクロ流路を利用する赤血球凝集検出方法であって、
前記光学式センサは、少なくとも、光源、検出チップ、受光素子からなり、これらが前記光源からの出射光の行路順に配置されてなる、エバネッセント場を利用した光学式センサであり、
前記マイクロ流路はマイクロ流路構造体と前記検出チップとを接合して形成され、
前記マイクロ流路は検体試料を導入する導入流路と、検査流路と、排出流路から構成され、
少なくとも該検査流路は検出の対象となる赤血球凝集塊の大きさに対応して当該赤血球凝集塊の沈降の有無を生じさせる２０μｍ以上２００μｍ以下の流路高さを有し、
赤血球を含有する該検体試料は該導入流路に導入されて該検査流路に輸送され、該検体試料の一部または全部が該検査流路中に留まって静止するように配された後、該光学式センサによって測定された信号の時間変化により赤血球凝集を検出する事を特徴とする赤血球凝集検出方法。 - 前記光学式センサは、導波モードセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、リング型共振器センサ、ウィスパリングギャラリーモードセンサ、光ファイバセンサ、スラブ導波路センサのいずれか一つからなることを特徴とする請求項７に記載する赤血球凝集検出方法。
- 前記導波モードセンサは、前記検出チップの前記マイクロ流路構造体が形成されている面と反対側の面に前記行路を形成するようにプリズムが配され、前記光源と該プリズムとの間の前記行路に少なくともコリメートレンズ及び偏光板を有し、また、該プリズムと前記受光素子との間の前記行路に少なくとも集光レンズを有することを特徴とする請求項８に記載する赤血球凝集検出方法。
- さらに前記マイクロ流路に接続された送液手段を備え、前記検体試料は前記マイクロ流路に、圧力送液法、または、毛細管力送液法のいずれかの方法で導入されたことを特徴とする請求項７から請求項９のいずれか１項に記載の赤血球凝集検出方法。
- 前記検体試料は、前記導入流路に充填した乾燥抗体へ血液検体を通過させて生成されたことを特徴とする請求項１０に記載の赤血球凝集検出方法。
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