JPH07506431A - 流動制限に基づく分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 流動制限に基づ（分析 関連出願の相互参照 本発明は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす、以下の関連する同時係 属出願・１９９２年５月１日付は出願の米国特許出願筒０７／８７７．７０２号 ；　１９９２年５月１日付は出願の米国特許出願筒０７／８７７．５３６号；１ ９９２年５月１日付は出願の米国特許出願筒０７／８７７．６６２号、および１ ９９２年５月１日付は出願の米国特許出願筒０７／８７７．６６１号と同時に出 願されている状態である。

発明の背景 本発明は、一般に、分析を行う方法および装置に関する。さらに詳しくは、本発 明は、流体試料中の分析物の存在を迅速に測定できる小さくて、典型的には１回 使用のモジュールの設計および構成に関する。

最近数１０年間、技術分野においては、種々の診断用の生物学的試料につき分析 を行ったり、目的物をモニターするためのプロトコル、テストキット、およびカ ートリッジが開発されてきた。免疫アッセイ、凝集アッセイ、ならびにポリメラ ーゼ鎖反応、種々のりガント−レセプター相互反応、および複合体試料中の種の 分別移動に基づく分析、これらすべては、種々の生物学的化合物または汚染物の 存在または濃度、あるいは特定の細胞タイプの存在を測定するのに使用されてき た。

最近、小さい使い捨ての装置が、生物学的試料を取り扱ったり、ある種の臨床試 験を行うために開発されたきた。ノヨー７（Ｓｈｏｊｉ）らは、シリコンウェハ ー上に作成された小型血液ガス分析器の使用を報告している（ンヨーン（Ｓｈｏ ｊｉ）ら、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ 　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ）、１５・１０１−１０７　（１９８８））。サト−（Ｓ ａｔｏ）らは、ミクロ機械加工したシリコンデバイスを用いる細胞融合技術を報 告している（センサーズ・アンド・アクチュエーターズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎ ｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ）、Ａ２１−Ａ２３　：９４８−９５３（１９９０）） 。チバ・コーニンルダイアグノスティックス・コーポレーション（Ｃｉｂａ　Ｃ ｏｒｎｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｉｃｓ　Ｃａｒｐ、　）　（Ｕ　Ｓ　Ａ）は 、血栓を検出するためのマイクロプロセンサーで制御するレーザーフォトメータ ーを作成している。

ミクロ機械加工技術はマイクロエレクトロニクス工業に端を発している（アンゲ ル（＾ｎｇｅｌｌ）ら、サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）、λ４８　：　４４−５５　（１９８３））。ミクロ 機械加工技術は、数１０ミクロン（生体細胞の寸法）からナノメーター（いくっ がの生体マクロ分子の寸法）までの範囲の最小寸法をもつ構造要素を有する微細 加工デバイスの作成を可能とした。この規模を本明細書中では「メソスケール」 という。メソスケール構造が関与するほとんどの実験は、ミクロメカニックス、 すなわち、機械的運動および流動特性の研究に関連するものであった。メソスケ ール構造の潜在的な可能性はライフサイエンスにおいては十分には開発されてい ない。

プルネット（Ｂｒｕｎｅｔｔｅ）　（エクスベリメンタル・セル・リサーチズ（ Ｅｘｐｅｒ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　）、１旦ユニ２０３−２１７　（１９８６）および１旦４ ：１ｌ−２６（１９８６））は、ケイ素、チタンを被覆したポリマー等の溝中に おける繊維芽細胞および上皮細胞の挙動を研究している。マツカートニー（Ｍｕ Ｃａｒｔｎｅｙ）ら（キャンサー・リサーチズ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）、 ４１：３０４６−３０５１　（１９８１））は、溝をつけたプラッスチック基材 中における腫瘍細胞の挙動を調べている。ラセル（ＬａＣｅｌｌｅ）　（ブラッ ド・セルズ（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ）、１２：１７９−１８９（１９８６）） は、ミクロ循環への知見を得るために毛細血管中における白血球および赤血球の 流動を研究している。ハング（Ｈｕｎｇ）およびワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ ）は、ミクロ機械加工したチャンネル中における流体の動力学の研究を報告して いるが、分析装置に関連したデータをとっていない（ハング（Ｈｕｎｇ）ら、メ ト・アンド・バイオルーエンジニアリング（Ｍｅｄ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ、　Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、９：２３７−２４５　（１９７１）：およびワイズマ ン（ｆｅｉｓｓｍａｎ）ら、アメリカン・インスト・ケム・エング・ツヤ−ナル （Ａｍ、　Ｉｎ５ｔ、　ＣｈｅＩＩｌ、　ＥｎｇＪ、）旦：　２５−３０（１９ ７１））。コロンブス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）らは、実験的マルチチャンネルテス ト装置中のイオン堺択的電極を区別するための、生物学的流体のキャピラリー流 動の制御における２つの直交して配した■溝を刻ったエンボス加工シートから構 成されるサンドインチを利用している（コロンブス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）ら、ク リン・ケム（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｃｍ、）、３３　：１５３１−１５３７　（１９ ８７））ｏマスタ（Ｍａｓｕｄａ）らおよびワツズ（Ｗａｓｈｉｚｕ）らは、細 胞の操作（例えば、細胞融合）のために流体流動チャンバーを使用することを報 告している（マスタ（Ｍａｓｕｄａ）ら、ブロノーディングズ（Ｐｒｏｃｅｅｄ ｉｎｄｓ）　ＩＥＥＥ／ＩＡＳミーティング（Ｍｅｅｔｉｎｇ）　、１５４９− １５５３頁（１９８７）；およびワツズ（Ｗａｓｈｉｚｕ）ら、プロンーディン グズ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｄｓ）ＩＥＥＥ／ＩＡＳミーティング（Ｍｅｅｔｉｎ ｇ）１７３５−１７４０頁（１９８８））。

当該分野では、生物学的流体の分析および微生物の検出のためにメソスケール装 置の可能性を十分には検討していない。

微生物の検出に使用するための現在の分析技術は希にしか自動化されておらず、 通常、微生物の数を増加させるには適当な媒質中てのインキュヘ−ノヨンを必要 とし、株または亜種を同定するためには、目視的および／または化学的方法を不 可避的に使用する。かかる方法における固有の遅延は、しばしば、感染の性質を 明確に確認するに先立って、医学的介在を必要とする。産業、公衆の健康または 臨床的環境において、かかる遅延は深刻な結果を招き兼ねない。微生物の迅速な 検出につき便利な／ステムが望まれていいる。

本発明の目的は、微量体積の試料を分析でき、また迅速に分析結果を得ることが てきる分析システムを提供することにある。もう１つの目的は、適用の範囲にお いて、予め選択した分子または細胞分析物の迅速な自動化分析が可能なメソスケ ール機能要素を有し、容易に大量生産できる使い捨てて小さな（例えば、容量で ｌｃｃ未満）装置を提供することにある。本発明のさらなる目的は、迅速なある 範囲のテスト、例えば、食品、水、または体液等中における細菌もしくはウィル スの感染、精子の運動性、血液パラメーター、汚染物についてのテストを供給す るために個別に使用てきるかかる一連の装置を提供することにある。なおさらな る目的は、陽性アッセイを示す情報が、制限された通路を通って流動する流体の 流動特性の変動を直接的または間接的に測定することによって得られる、分析物 の存在を検出するための一連の分析的アッセイプロトコルを提供することにある 。

発明の概要 本発明は、流体試料中の分析物の存在を検出するための方法および装置を提供す る。１の具体例において、本発明は、試料流入ポートおよびメソスケール流動シ ステムを形成するように微細加工された、典型的には、数ミリメーターの厚さで あって、はぼ０．２ないし２，０平方センチメーターのオーダーの固体基材より なる装置を提供する。本発明は、試料流体をメソスケール流動システムに通し、 該システムを通っての流動の分析物誘導制限もしくは阻止が該分析物の存在の陽 性指標として検出される方法を提供する。１の具体例において、該メソスケール 流動システムは、流入ポートから伸びる第１の試料流動チャンネル、および複数 の第２の流動チャンネルに至る分岐部からなる、該第１の流動チャンネルと流体 連絡したフラクタル（ｆｒａｃｔａｌ）領域からなる。「メソスケール」なる語 は、はぼ０．１μｍないし５００μｍのオーダーの断面寸法、好ましくは２．０ ないし５００μｍのオーダーの幅、より好ましくは３〜１００μｍの幅を有する 流動通路を定義するのに用いる。多くの適用については、５〜５０μｍの幅のチ ャンネルが有用であろう。該基材中のチャンバーは、しばしば、より大きな寸法 、例えば、１〜５ｍｍの幅および長さを有するものであってもよい。好ましい深 さは０．１ないし１００μｍ、典型的には、２〜５０μｍのオーダーである。

該フラクタル領域は、典型的には、さらに、第３の流動チャンネルに至る、該第 ２の流動チャンネルに流体連絡した合流部よりなる。該フラクタル領域は、流動 の方向に沿って順次に配された同数の分岐部および合流部よりなるものであって もよい。好ましくは、また必ずしも必要ではないが、該フラクタル領域１こおけ る分岐チャンネルは、各分岐部において徐々に断面積が減少し、各合流部におい て増加する。該フラクタル流動領域は試料の流動特性に対し非常に感受性である 。

流動システムを通っての試料の流動を誘導するための手段を当該装置に設けるこ ともできる。また、分析物の存在によって誘導される制限または阻止のごとき流 動特性の変化を検出ためにの手段を当該装置に設けることもできる。本発明の装 置および方法は、反応または細胞増殖をモニターするために、あるいは精子の運 動性のテストを行うために、特定の）ｙ、ｆプの細胞またはマク１コ分子の存在 に一ついての分析を含めた、種々の自動化され、感度がよくかつ迅速なテストを 供するために使用できる。

一般に、本明細書に開示するごとく、固体基材は、メソスケール流動システムを 含もするチップよりなる５、該メソスケール流動／ステムは、確立されたミクロ 機械加工法を用い、シリコンおよび他の固体基ヰ４から加工することができる。

当該装置における該メソスケール流動／ステムは、流動チャンネルおよび１また はこれを超えるフラクタル領域を基材の表面にミクロ加工し、次いて、カバー、 例えば輸送ガラスカバーを該表面に接着することによって組み立てることができ る。

該装置は、典型的には、流入ポートを通って、例えば、該基材またはカバーを通 って該流動システムに連絡した孔によって、該流動／ステムに導入された試料の 微小容１１（＜５μ■７）を分析するのに適した大きさに設計される。非常に低 濃度で存在する分析物（例えば、ナノグラム量）は迅速に検出できる（〈１０分 ）。アツセイが完了した後、該装置は捨てることができる。

１の具体例において、流動システムを通っての試料の流動の制限または阻止を促 進するために、メソスケール流動／ステムに、例えば、該フラクタル領域に特異 的結合部位を設けることもてきる。該結合部位は、試料の成分と結合して検出可 能な粒子の凝集を誘導するための該粒子よりなるものであってもよい。所望によ り、該結合部位は、結合が通路の狭窄を誘導するように、メソスケール流動／ス テムの内部表面に固定化することもてきる。

該チ２ブは、典型的には、該チップを保持するための収容部位を含有し、カリ器 具中の１またはそれを超える流動ラインを持つ該チップ上の１またはそれを超え る投入ポートに対合する当該器具と共に使用する。細胞汚染物またはトキノンの ごとき特定の分析物を含有することが疑われる流体試料、例えば、生物学的流体 試料を基材の流入ポートに適用した後、該チップを該器具中に入れ、例えば該器 具中のポンプを作動させて試料を流動システムに通す。別法として、試料は該器 具によってチップに注入することもできる。また、流入ポートを通じる毛細管の 作用によって試料を流動システムに侵入させることもてきる。

流体試料中の予め選択１．た分析物の存在は、流動／ステム中の異なる地点にお いて、圧力または電気伝導度の変化のごとき試料流体の流動特性の分析物に誘導 される変化を乾知することによって検出することができる。１−の具体側番ごお いて、メソス）７−−ル流動システムにおける、例えば、フラクタル領域におけ る流体の分析物誘導制限もり１．（は四重は、例えば、当該装置と組み合わせて 使用する器具中の子方検出器によって検出することができる。もう１つの具体例 において、試料流体の導入によって引き起こされた流動システムのある領域にお ける電導度の分析物誘導変化は、流動システムとの比較によって電気伝導度セン サーにより容易に検出てきる。例えば、分析物の存在は、通路を超えて、制限さ れた流動通路の詰まりを引き起こし、液体の不存在は電導度を測定することによ って検出できる。

また、該器具には、例えば、分析物の存在の陽性指標としての流動制限を示すた めの流動システムのいくつかの領域において感知された、圧力の読み、電導度等 を示す電気信号を受け取るために、該チップの構造への一体的な接触により当接 された該収容領域における電気的接触を含まさせることもてきる。

また、試料流体の流動特性における分析物誘導変化は光学的に、例えば、流動／ ステム土の透明カバーのごとき透明もしくは半透明ウィンドウを通して、あるい は基材それ自体の半透明セクションを通し２て検出できる。該器具は、チップ中 の光学的ウィンドウを通じての試料の流動特性の分析物誘導変化を検出できる分 光計のごときセンサー機器を含ませることができる。

本発明の装置は、広範囲な生物学的テストを行うのに適している。該装置のいく つかの特徴および利屯を表１にまとめる。当該装置には、２またはそれを超える 分析物を同時に検出するのを可能にするために、例えば異なるフラクタル検出領 域に、例えば、各々が異なる結合部位を持つ通常の流入ポートによって供給され る２またはそれを超える別々の流動システムを包含させることもできる。また、 該装置は、試料領域および制御領域からのデータを検出し、比較できるように、 制御流動システムからなるようにすることもてきる。該装置は、例えば、病原菌 もしくはウィルスを検出するための、あるいは例えば精子試料の運動性をテスト するための、迅速なテストを供することができる。本発明は、広範囲の可能なア ッセイにおいて用いる方法および装置を提供する。アッセイは迅速に完了させる ことができ、また、アッセイの結論時には該チップを捨てることができ、これは 、有利には、試料間の汚染を防止し、可能な生物学的有害物質を封じ込め、安価 で試料が微量て済む分析を供する。

表１ 特徴　利点 柔軟性　利用可能なチップのデザインおよび適用の数に制限なし。

再現性　チップの信頼でき、標準化された大量生産を可能とする。

低生産費　現存システムとの競合価格を可能とする。１回使用につき使い捨て可 能な性質 小サイズ　ハルキイな装備不要。通常でない実験室環境で使用するのにデザイン されたポータプルなユニットおよびシステムに役立つ。最小の貯蔵および輸送の コスト。

マクロスケール　最小の試料および試薬容量を要するのみ。特に高価で特別なテ スト法において試薬のコストを低減化させる。簡便な装置化スキームが可能。

滅菌　チップは、クリーンな環境を必要とする微生物学的アッセイおよび他の手 法で使用するために滅菌できる。

密封系　生物災害を最小化。プロセスの一体化を保証。

多重的　単一のチップについての多重プロセスまたは分析を実行すサーキ・ノド 性能　ることか可能。パネルアッセイが可能。

多重検出器性能　実質的にいずれのシステムに対するアッセイおよびプロセスの モニタリングについても性能を拡大できる。広範囲の適用が可能。

再使用チップ　使用者にとっである種の適用につきプロセス当たりのコストが減 少。

図面の簡単な説明 図１は、ポート１６、メソスケール流動チャンネル２０、および流動チャンネル のフラクタル分岐システム４０を微細加工した基材１４よりなる本発明の装置の 拡大平面図である。

図２は、図１に示した装置の長手方向断面図である。

図３は、図１の装置の斜視図である。

図４は、装置１０を支持し、装置１０中で試料流体の圧力を調節し検出するのに 用いる、器具５０内に収容された分析装置１０の横式的文面図である。

図５は、該基材に対称的に配され、フラクタルシステムの中心に向がって径が狭 くなるようにテーパーをつけた、流動チャンネル４ｏのフラクタル分岐システム を微細加工した基材１４の模式的平面図である。

図６は、侵入ポート１６、メソスケール流動チャンネル２０、およびフラクタル 領域における流動制限および凝集を促進するためのビーズ４２を設けた、流動チ ャンネル４０のフラクタル分岐システム４０を微細加工した基材１４を包含する 装置１０の模式的平面図である。

図７は、装置中の流体の電導度を測定するための電気的導体１７および１８を包 含する本発明の装置の模式的長手方向断面図である。

図８は、図７に示した装置の斜視図である。

図９は、本発明に従って組み立てた多重テスト装置の模式的平面図である。

図１０は、細胞分別、細胞溶解、ＰＣＲ分析、およびフラクタル領域４ｏにおけ るＰＣＲ生成物の検出を含めた種々の機能を具備させるのに適した一連のメソス ケールチャンバーを加工した分析装置の模式的平面図である。

図１１は、ポート１６、メソスケール流動チャンネル２ｏ、およびフラクタル流 動チャンネル４０の対を包含する本発明の装置１ｏの模式的平面図である。

図１２は、装置１０の内容物を見るための装ｆｆ１ｌＯと組み合わせて用いる装 置６０の模式的斜視図である。

図１３は、図１２の装置６０の模式的断面図である。

各図面における同様の参照記号は対応する部品を示す。

詳細な記載 本発明は、流体試料中の分析物の存在を検出するための方法および装置を提供す る。１の具体例において、本発明は、試料流入ポートおよびメソスケール流動シ ステムを形成するように微細加工された、典型的には、数ミリメーターの厚みで あって、０．２ないし２．０平方センチメーターのオーダーの固体基材よりなる 装置を提供する。流体試料は該メソスケール流体システムを通過し、該システム を通っての流動の分析物誘導制限または阻止を該分析物の存在の陽性指標として 検出する。

メソスケール流動チャンネルおよびフラクタル領域を有する分析装置は、固体基 材材料から大量に設計し、加工できる。それらは、容易に滅菌できる。十分に開 発された技術であって、その正確で十分な加工のため、ノリコンが好ましい基材 材料であるが、ポリテトラフルオロエチレンのごときポリマーを含め、他の材料 を使用することもてきる。試料流入ポートおよび他のポート、試料流動チャンネ ルを含めたメソスケール流動システム、フラクタル領域、および池の機能的要素 は、当業者に知られた多数のミクロ機械加工法のうちいずれによっても、シリコ ン基材から大量に安価に加工できる。利用できるミクロ機械加工法は、スピンコ ーティングおよび化学蒸着のごときフィルム蒸着法、レーザー加工またはＵＶも しくはＸ線プロセスのごときホトリソグラフィー技術、あるいは湿式化学プロセ スもしくはプラズマプロセスいずれかによって達成できるエツチング方法を包含 する（例えば、マンズ（Ｍａｎｚ）ら、トレンズ・イン・アナリテイカル・ケミ ストリー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｃｍｊｓｔｒ３つ 、１旦　１４４−１４９　（１９９１）参照）。

変更できる幅および深さの流動チャンネルは、メソスケール寸法に加工できる。

加工したメソスケール流動チャンネルを含有するシリコン基材は、薄いアノード 結合がラスカバーて被覆し密封できる。池の透明または不透明なカバー材料を使 用することもてきる。別法として、２つのシリコン基材をサンドインチとし、あ るいはノリコン基材を２つのカバーグラスの間にサンドイッチとできる。透明カ バーを使用する結果、チャンネルの内容物を動的に見るのが容易となり、メンス ケール流動システムを目視的にまたは機械によって光学的にプローブできるウィ ンドウが得られる。他の加工アプローチを使用することもできる。１の具体例に おいて、循環ネットワークのごとき生物学的構造の電子顕微鏡写真を、基材上に メソスケール流動システムを加工するためのマスクとして使用することもできる 。

メソスケール流動システムは、ある範囲のサイズおよび立体配置にて加工できる 。

流動システムは非分岐システムよりなるか、あるいは別法として、好ましい具体 例においては、流動システムは、複数の第２のチャンネルに至る分岐部を含めた フラクタル領域よりなるようにすることもできる。該装置において、メソスケー ル領域システムにおける流動制限は分析物の存在の陽性指標として働く。

装置のキャパシティーは非常に小さく、従って、分析に要する試料流体の量は少 ない。例えば、１０ミクロンの幅Ｘ１０ミクロンの深さｘｌｃｍ（１０’ミクロ ン）の長さである５００個の溝のアレイを表面に有する、１ｃｍｘ１ｃｍノリコ ン基材において、谷溝の容量は１０−３μしてあって、５００個の溝の合計容量 は０．５μＬである。メソスケール流動システムの低容量は、非常に少量の（く １０μＬ）液体試料で行うことができるアッセイを可能とする。流動システムの 容量は、典型的には、〈５μしてあって、個々のチャンネル、チャンバー、また は他の機能的要素の容量は、しばしば、１μＬ未満、例えば、ナノリットルまた はピコリットルの範囲である。装置のメソスケール流動システムはマイクロリッ トル、あるいは別法としてナノリットルもしくはそれ未満の容量で微細加工でき 、これは、有利には、アッセイに要する試料および／または試薬流体の量を減少 させる。

メソスケール寸法を有する流動チャンネルを使用することの重要な結果および利 点は、チャンネル内の水性流体に補足されあるいは溶解されたマクロ分子、粒子 、および細胞の流動特性の変化が、狭窄、すなわち、流動チャンネルの狭化によ って容易に影響され、容易に検出されることである。フラクタル領域を設けるこ とは、流動における変化を簡素化するために働（。かくして、例えば、細菌で汚 染したことが疑われる試料を装置中で培養でき、多数の該生物の存在を、流体が 所与の圧力において／ステムを通すことができるか否かを測定することによって 検出できる。細菌が存在しない場合、流体は容易に流動し；多数の細胞はフラク タル領域を部分的にまたは全体的に閉塞するのに働く。もう１つの例として、流 動チャンネルの壁に固定化された特異的結合蛋白へのマクロ分子の付着増大は、 該チャンネルを通る流体流動を阻害するのに十分であるが、その寸法は十分に小 さいものとする。なおさらにもう１つの例において、ポリヌクレオチド試料中の 標的ポリヌクレオチドの存在は、大量のポリヌクレオチドを負荷した溶液の粘度 がヌクレオチドの溶液よりも太き（なるので、フラクタル領域を通る適当数のＰ ＣＲサイクルの後にチャンバーの内容物を流動させることによって示すことがで きる。

１の具体例において、図１．２および３に模式的に示すごとく、装置１０には、 ポート１６、第１の試料流動チャンネル２ＯＡ、および流動チャンネル４０のフ ラクタルシステムを微細加工したノリコン基材１４を包含させることがてきる。

該ポー）−はメソスケールまたはそれよりも大きな寸法で微細加工できる。この 場合のフラクタル領域４０は、該フラクタル領域を通り、第３の流動チャンネル ２０Ｂに至る方向に沿って順次に配された同数の分岐部および合流部よりなる。

基材１４を透明なガラスまたはプラスチックのウィンドウ１２て被覆してチャン ネル２ＯＡを通って装置に侵入して、次いて、フラクタル領域４０を通って流動 してチャンネル２０Ｂおよびポート１６Ｂを流動する。フラクタル領域４０は、 試料の流動特性に非常に敏感である。フラクタル領域４０を通る試料の流動の制 限または阻止は、試料中の分析物の存在の指標として働き、例えば、ウィンドウ １２を通して光学的に検出てきる。

もう１つの具体例において、図５に模式的に示すごとく、フラクタル／ステム４ ０は各分岐部において減少した寸法にてシリコン基村上に加工でき、連続的に狭 くなる流動チャンネルを供する。図５は装置１０を示し、これは、フラグタル流 動チャンネル４０を微細加工した基材１４よりなり、これは、第１の流動チャン ネル２ＯＡおよび第３の流動チャンネル２０Ｂに対して減少した断面積を有する 。操作において、試料流体は流入ポート１６Ａおよびチャンネル２ＯＡを通りて 装置１０に侵入し、次いで、フラクタル領域４０を通って流動して流動チャンネ ル２０Ｂおよびポート１６Ｂを流動する。このフラクタル領域４０を通っての流 体流動は、例えば、細胞の増殖、あるいは細胞、粒子、または試料中に存在し得 るマクロ分子の凝集によって引き起こされた、流体粘度の変化および流動制限の 発生に非常に鋭敏である。フラクタル／ステムは、図１１に模式的に示すごとく 、分岐部の複合シリーズを微細加工したものでよくて、流動制限に対する感度を 増大化する。図１１における装置１０は、一対のフラクタル分岐流動チャンネル ４０Ａおよび４０Ｂを包含する。フラクタル流動チャンネル４０Ａには、フラク タルの中心に向けて連続的に狭くなる流動チャンネルを設け、それにより、流動 制限に対する感度を増大化させる。

メソスケール流動システムを含有する分析装置は、図４に模式的に示した器具５ ０のごとき、流体を装置へ送り、また装置から液体を受容するための器具と組み 合わせることができ、これは、装置１０を保持し、該器具中の流動ライン５６を 持つ、ポート、例えばポート１６を該装置１０に設けるための収容部位５８を一 体化させる。特定の分析物を含有することが疑われる流体試料を該器具の流入ポ ート５１に適用した後、ポンプ５２を作動させて試料を装置１０のポート１６Ａ に送り込み、チャンネル２ＯＡおよびフラクタル領域４０を流動させる。別法と して、試料は装置に注入できるか、あるいは単に毛細管作用によって流動システ ムに侵入させることができる。１の具体例において、装置の流動システムを水力 学的に十分な容量に満たし、該器具を用いて、例えば、該装置または該器具に位 置させたバルブ手段によって、流体の流動をメソスケール流動システムに向ける ことができる。

また、分析装置は、該装置中のメソスケールチャンネルの内容物を観察するため の付属と組み合わせて使用することもできる。１の具体例における該付属は、該 装置中のメソスケールチャンネルの内容物を観察するための顕微鏡よりなるもの とすることができる。もう１つの具体例において、図１２および１３に模式的に 示した付属６０に示したごとく、カメラを該付属に含ませることができる。該付 属６０にはハウジング６２、観察スクリーン６４およびチップを該付属に挿入す るためのス「ｊノ１−６６を設置する１、図１，３の断面図に示したごとく、該 器す６０には、ヒｆオカメラ６８、光学系７０、および装置を保持するだめの傾 斜機構７２を包含させ、手で調節すべき装置１０を置いたり、その角度をつ（Ｊ たり−Ｃきる。光学系７０には、チャンネル内容物を拡大するだめのレンズシス テム、ならびにア、を源を包含させることができる。ピデオノＪメラ６８および スクリーン６４は、流動特性または色彩のごとき、試料流体の６性の分析物誘導 変化が、可視的にモニターされ、所望により該器具を用いて記録できるようにす る。

試料中の分析物の存在によって誘導された、流動システムにおける試料流動特性 の変化は、本明細書中に開示する装置における流動システムの選択された領域に おける試料流体の圧力または電気伝導度をモニターすることを含み、いずれの多 数の方法によっても検出できる。流動特性の分析物誘導変化は、基材自体の透明 なカバーもしくは半透明のセクションを通っての光学的検出によって、目視的も しくは機械によって検出てきる。バルブ、メソスケール圧力センサー、その他の 機械的センサーのごとき装置は直接ノリコン基村上に加工でき、十分に確立され た技術によって大量生産できる（アンケル（Ａｎｇｅｌｌ）ら、サイエンティフ ィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）、２４８　： 　＝４４−５５　（１９８３））。

また、圧力センサーおよび他の検出手段を当該装置と組み合わせて利用する器具 に設けることができる。

１の具体例において、分析物誘導流動制限は、メソスケール流動システムに侵入 しそこて存在する試料流体の圧力をモニターすることによって検出できる。図４ は、例として、装置１０を模式的に示すが、これは、器具５０内に収容され、こ れは、ポート１６を通って装置１０に浸入しそこに存在する流体の流動圧力を検 出するだめの２つの圧力検出器５４を包含する。別法として、メソスケール圧力 センサーをシリコン基材に直接加工し、電気的接触を介して該付属に連結させる ことができる（アンケル（Ａｎｇｅｌｌ）ら、サイエンティフィック・アメリカ ン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）、λ４８　：　４４−５５　（ １９８３））。流動制限のことき流動システムにおける流動特性の分析物誘導変 化は、かくして、陽性結果を示す圧力変化として検出できる。通常の流動検出器 のごとき他の検出器を用いることもてきる。流体中に補足された磁性ビーズの運 動は、流はｊ１制御覗の指標として容易に検出てきる。

もう１つの具体例において、分析物の存在によって誘導され、かつ流動ソスデー ムの異なる領域で感知された、流体流動特性における変化を表示するング光ルの 伝達を可能とするために、当該装置の基材に電気的導体を加工する。二とができ る。

基材中の電気的導体は、装置と組み合わせて用いる、器具中の電気的導体に対す る接触を通じて対合させることができる。装置中の電気的導体は、流動システム 中の流体の電導度または圧力の検出を可能とする圧力もＩバは電気型導度センザ ーからの信号を当該装置中に担持する。

例えば、装置１０において、図５に模式的に示すごとく、流入ポート１６Ａから 流出ポート１６Ｂへの流動を四重するフラクタル領域４０の分析物誘導詰まりは 、その出力が流出チャンネル中の圧力または水性流体の存在もしくは不存在を示 すものである通常の電導度プローブ１７によって検出てきる。電導度または他の プローブはフラクタル領域４０内に設けることもできる。基材には、対照領域を 微細加工でき、従って、試料流動領域および対照領域からの出力が検出・比較で き、それにより、アッセイの精度を上げることができる。

もう１つの具体例において、試料の流動特性における分析物誘導変化を検出する ために、流動システムに侵入しそこに存在する試料流体間の流動特性を検ｔ＋貝 ッ比較てきる。］の具体例において、図７および８に模式的に示す具体例におい て電導度を測定することもできる。装置１０はシリコン基材１４を包含し、それ に、流入ポート１６および流動チャンネル２０を微細加工する。基材は半透明の ウィンドウ１２によって被覆する。

操作において、試料流体はポート１６Ａおよび試料チャンネル２ＯＡを通って装 置］０に侵入し、次いで、フラクタル領域４０を通ってチャンネル２０Ｂおよび ポート１６Ｂに流動する。フラクタル領域４ｏに侵入する流体の電導度を測定す るために、流体チャンネル２ＯＡと電気的に接触した電気的導体を装置１０に微 細加工する。また、装置には、フラクタル領域４０に存在する流体の電導度を検 出するために、流動チャンネル２０Ｂと電気的に接触した電気的導体１８　Ｂを 包含させる。導体１８は、基材の底部まて伸びる接触部１７に結合する。該接触 部は、公知の技術によって、例えば、熱勾配ゾーンメルティングによって加工て きる（ゼメル（Ｚｅｍｅｌ）ら、化学センサーの基礎および応用（Ｆｕｎｄａｍ ｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ＾ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ ｅｎｓｏｒｓ）　、ディ―ノユーエツレ（Ｄ、　５ｃｈｕｃｔｚｌｅ）およびア ール・ハメルレ（Ｒ，ＨａｌＩｌｍｅｒｌｅ）編、ＡＣＳンンポンウムシリーズ （＾ＣＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｕ　５ｅｒｉｅｓ）、ワシントン・ディ・ノイー、 １９８６、第２頁参照）。

装置Ｗ１０は、図４に示した器具のごとき器具に収容でき、接触部１７を通じて 電導量変化を検出できる。７４導度変化は、流体試料中の分析物の存在によって 誘導される流体圧力のごとき流体特性の変化で補正できる。フラクタルおける阻 止は、流体がチャンネル２０Ｂに到着するのを妨げ、導体１８Ｂ中のキャップを 横切っての電導度は低いであろう。

流動制限のごとき、流動／ステム中の試料の流動特性における分析物誘導変化は 、光学的に、例えば、流動システム上方の透明カバーを通じて、あるいは基材そ れ自体の透明領域を通じて検出てきる。分析物の存在による流動特性の変化の光 学的検出を助けるために、スペクトル分光計のごとき感知器具を該器具に包含さ せることができる。

１の具体例において、メソスケール流動システム、例えば、フラクタル領域は、 分析物に結合しそれにより流動制限を促進できる結合部位よりなるものとするこ とがてきる。所望により、結合部位は流動チャンネルの表面、あるいはビーズの ごとき固相反応体上に固定化することができる。結合部位は、例えば、抗原結合 蛋白、ＤＮＡプローブ、またはりカント／レセプター対のうちの一方からなるも のとすることができる。また、結合部位は、特異的細胞並集団を架橋できる化学 試薬または蛋白のごとき架橋剤からなるものとすることもてきる。

結合部位は、例えば、チャンネル表面への物理的吸収、あるいは表面の化学活性 化次いでの活性化表面への生体分子の引き続いての付着によって、メソスケール 流動チャンネルの表面に固定化できる。／レイジャス（ｓｉｌａｃｅｏｕｓ）チ ャンネル表面の化学的活性化のために、および結合部位の表面への引き続いての 付着のために、当該分野で利用できる技術を用いることができる（例えば、ポー ラ−（Ｈａｌｌｅｒ）　：固相生物化学（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　ＢｉｏＣｈ ｅｍｉＳｔｒｙ）、ダブリュー・エイチ・スクート：／　（Ｗ、　＋１．５ｃｏ ｕｔｅｎ）編、ジョン・ウィリー（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク、５ ３３−５９７頁（１９８３）；およびマンデニウス（Ｍａｎｄｅｎｉｕｓ）ら、 アナル・ハイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１３７　：１０６　 １１．４　（１９８４）　、およびアナル＋／＜イオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｃｍ、）、１７０：６８−７２　（１９８８）参昭）。その開示をここに引 用して本明細書の一部とみなす同時継続関連米国特許出願［代理）＼書類番号Ｕ ＰＡＯＯＩ　（８２６１／２）］　、メソスケール・ディテクノ−ａン・ストラ クチ＋　−（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ） に開示されているごとく、メソスケール流動システム内に結合部位を設けること ができる。細胞もしくは化学分析物の検出は、適当な結合部位を選択することに よって設けることができる。流動制限は、メソスケール流動システムの表面に固 定化した結合部位に分析物を結合させることによって、すなわち、流動システム の表面にマクロ分子表面層を形成させることによって促進することができる。

１の具体例において、結合部位はメソスケール流動システム中の分析物の検出可 能な凝集を誘導できる粒子よりなるようにすることができる。図６に模式的に示 した、装置１０に示すごとく、所与の分析物に特異的な結合蛋白で被覆した粒子 ４２を、フラクタル領域中の分析物誘導凝集を促進するためにフラクタル領域１ ０に設けることがてきる。例えば、抗体のごとき結合部位を不活性ビーズに固定 化させることができ、凝集を誘導するのに利用できる。フラクタル領域における 凝集は、例えば、フラクタル領域の上方に設けたウィンドウを通じて、光学的に 検出てきる。また、凝集は、例えば、後記する試料流体の圧力または電導度の変 化を検出することによって検出できる。

アッセイの精度を促進するために、基材を加工して、流動システム中に対照領域 、例えば、テスト領域に幾何学的に同一であるが結合部位を含まない領域を包含 させることができる。検出および対照両領域に向けられた試料は、検出し比較で きる異なる流動特性を示す。

１の具体例において、装置はメソスケールフラクタル流動システムを提供し５、 これは、流体粘度の変化による、流動制限の基礎に基づいてモニターされるべき 培養中の微生物の増殖を容易にすることができる。該フラクタル領域は、図１１ に模式的に示すごとく、該領域を通っての試料の流動の方向に沿って順次に配さ れた同数の分岐部および合流部の多くのシリーズを包含し得る。流動制限は、例 えば、所望により、短時間のインキュベーションの後に検出することもてきる。

試料中の微生物の存在および増殖は、該フラクタル内の流動特性に影響する。圧 力または電導度センサーのごとき１またはそれを超えるセンサーを利用して、フ ラクタル領域中の流体特性の生物の存在によって引き起こされた変化による圧力 変化を検出てきる。

もう１つの具体例において、装置のメソスケール流動システム中、例えば、フラ グタル領域中の精子の移動は、精子の運動性の指標として供し得る。基材は、例 えば、水平面に対して直角にて、器具中に配することができて、精子試料の移動 を曲げ、さらに運動性の検出を促進する。精子に結合できる試薬を流動システム に設けることができる。該装置を用いて、例えば、殺精子試薬、精子試料の結合 特性を評価し、あるいは精子カウントを行うことができる。

該装置は、細胞またはマクロ分子の分析を含めた流動制限に基づいた種々の自動 化した感度良好で迅速な分析を確立するのに、あるいは細胞培養の増殖をモニタ ーするのに用いることができる。該装置には、例えば、異なる分析物のための結 合部位を含有して、１またはそれを超えるアッセイを同時に行うのを可能とする ２またはそれを超える異なるフラクタル領域よりなる２またはそれを超えるメソ スケール流動システムを設けることができる。アッセイの終わりにおいて、当該 装置は、典型的には、捨てる。使い捨て可能な装置の使用は試料間の汚染を排除 する。該試料は常時安全廃棄され、低容量は無駄な使い捨てを少なくする。

以下の非限定的実施例により本発明はさらに理解されるであろう。

実施例１ 図５に模式的に示すチップ１０にて精子の運動性をテストする。精子試料（〈２ μＬ）をガラス製顕微鏡スライド上に置き、チップ１０を、ポート１６Ａが精液 試料上に位置するように、精液試料の頂部に置く。チャンネル２ＯＡおよびフラ クタル領域４０を通っての、個々の精子のポート１６Ａへの進行を、顕微鏡を用 いてモニターする。実験の結果を、健康な精子試料で従前に確立された結果と比 較して、精子運動性のテストが提供される。

実施例２ 図５に模式的に示すごとく、生物の増殖を該装置中でモニターする。基材１４中 のメソスケール流動経路４０のフラクタルパターンを、流入ポート１６Ａを介し て、テスト検体の試料を接種しである増殖培地の混合物２μして満たす。装置を 密閉し、３７℃で６０分間インキュベートする。顕微鏡を用いる肉眼での観察に よって、あるいは、例えば、電気型導度プローブ１７を介して、チャンネルシス テムの流動特性を測定することによって増殖を検出する。流動の不存在は、増殖 およびその結果としてのフラグタルシステムの阻止を示す。

実施例３ 図９に示す微細加工固体基材１４で精子の機能をテストする。精子試料を流入ポ ート１６Ａに添加し、次いで、メソスケール流動チャンネル２０を通って検出チ ャンバー４０Ａ、４０Ｂおよび４０Ｄへと流動させる。フラクタル検出チャンバ ー４０Ａは白血球についてのテストを供し、それは通常の白血球抗原に対する固 定化抗体よりなる。フラクタル検出チャンバー４０Ｂは精子抗体についてのテス トを供し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭに対する固定化抗体を供する。フラ クタル検出チャンバー４０Ｃは、光体反応についてのテストを供し、それはフル オレセイン標識レクチンを含有する。チャンバー中における凝集による流動制限 は、例えば、基材上方に設けられたガラスカバーを通じる光学的検出によって検 出てきる。アッセイが終了した後、装置を捨てる。

実施例４ 図１０は、生物学的流体試料中の混合物中の細胞の亜集団内の標的核酸の存在を 検出するために使用する基材１４を包含する装置１０を模式的に示す。装置１０ にはメソスケール流動経路２０が微細加工されており、それは、細胞分離チャン バー２２Ａ、細胞溶解チャンバー２２Ｂ１フイルター領域２８、セクション２２ Ｃおよび２２Ｄからなるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）チャンバー、およびフラ クタル検出領域４．０を包含する。また、メソスケール流動システム２０には流 体侵入／出口ポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄを設けている。該装置 は、図４に示した器具５０のごとき器具と組み合わせて用いる。該器具には、装 置中のポート１６に対合する流体経路、およびポート１６が機械的に閉鎖され、 開口されるのを可能とするバルブが設けられている。また、該器具は、該装置を 通じて試料流体の流動を調節するためのポンプ５２を包含する。さらに、該器具 は、該装置中でＰＣＲ反応反応チャンバーセクション２２Ｃび２２Ｄを加熱する ための手段を包含する。

最初に、該器具中のバルブを用いて、ポート１６Ａおよび１６Ｂが開口している 間に、ポート１６Ｃおよび１６Ｄを閉じる。細胞の混合物を含有する試料を、該 器具中のポンプによって試料流入ポート１６Ａに向け、メソスケール流動経路２ ０を通って分離チャンバー２２Ａに流動させる。チャンバー２２Ａは、試料中の 所望のタイプの細胞上の表面分子に選択的に結合するチャンバーの壁に固定化し た結合部位を含有する。残りの細胞成分はポート１６Ｂを介して基材から出る。

チャンバー２２Ａ中の所望の細胞集団の結合の後、緩衝液での流動を継続して、 細胞集団を洗浄し、その単離を確実とする。次にポート１６Ｂを閉じ、１６Ｃを 開く。次いて、流動を十分に増大させて固定化細胞を除去する。流動を継続し、 チャンバー２２Ｂ中の突起２・４を貫く膜に細胞を通し、これにより細胞を破裂 させて、細胞内物質を放出させる。

試料の流動は、大量の細胞膜成分および他の夾雑物を濾去するフィルター２８を 過ぎ、流動チャンネル２０ＢによってＰＣＲチャンバーセクション２２Ｄに結合 しているメソスケールＰＣＲチャンバーセクション２２Ｃに至る。次のＰＣＲア ッセイに必要なＴａｑポリメラーゼ、プライマーおよび他の試薬を、該器具中の 対合ポートおよび流動経路からポート１６Ｃを通ってセクション２２Ｄに添加し 、細胞の分離された亜集団からの細胞内可溶性成分とＰＣＲ試薬とを混合させる 。ポート１６Ａを閉じて、ポート１６Ｂを介して結合した器具中のポンプを用い て、各々、９４℃および６５℃に設定したセクション２２Ｃおよび２２Ｄ間の流 動チャンネル２０Ｂを通って、ＰＣＲ試料および試薬をサイクルさせて、複数が 増幅される。

ここに引用して本明細書の一部とみなす関連する同時継続米国特許出願［代理人 書類番号ＵＰＡＯＯ４（８２６１１５）］　、メソスケール・ポリヌクレオチド 増幅分析ｆｌｅｓｏｓｃａｌｅ　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ａｍｐｌｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）、に開示されている方法によりメソスケー ルＰＣＲ分析を行う。

次に器具中のバルブを用いてポート１６Ｃを閉じ、ポート１６Ｄを開ける。次い で、ポート１６Ｂに結合した器具中のポンプを用いて、細胞集団から単離した増 幅ポリヌクレオチドをフラクタル検出領域４０に向ける。増幅されたポリヌクレ オチド生成物の存在によって引き起こされた、フラクタル領域４０中の流動制限 は、細胞中の標的ＤＮＡまたはＲＮへの存在の陽性指標として供され、検出領域 の上方に設けられたガラスカバーを通じて光学的に検出される。

実施例５ ヒト精液試料の精子の運動性をテストする実験を、メソスケール流動チャンネル 中で行った。精子運動性テストにおいて、ガラス−シリコンチップ中のミクロチ ャンネル（６０，８０μｍ幅、２０μｍ深さ、および１００ｍｍ長）を、０．５ ％ＢＳＡ　（ＨＴＦ−ＢＳＡ）を含有するヒト卵管液（ＨＴＦ）媒質（イルビン ・サンエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、サンタ・ア ナ（Ｓａｎｔａ　Ａｎａ）、カリフォルニア州）で満たした。精液試料（く２μ Ｌ）をガラス製の顕微鏡スライドに置き、チャンネルへの侵入が精液試料上に位 置するように、該チップを精液試料の頂部に置いた。個々の精子のチャンネルへ の進行、およびその長さに沿っての出口孔への進行を、顕微鏡を用いてモニター し、ＴＶカメラおよびビデオレコーダーを用いて記録した。精子は該チャンネル の全長を横切るのが観察され、出口孔に蓄積されるのが見られた。また、以下の 深さ＝４０．１００および１２０μｍのチャンネルに精子の移動が示された。

フラクタルチャンネルにおける精子の運動性も調べた。ＨＴＦ−ＢＳＡ媒質を満 たしたフラクタルチャンネル（４０μｍ幅、２０μｍ深さ）を用いて前記実験を 反復した。精子は該チャンネルの中心部への侵入からの曲がりくねったフラクタ ル経路（合計９回の直角の方向転換、例えば、図１１の装置）を通って移動する のが観察された。２０Ｉ１ｍの深さであったが、各分岐部において幅を減少させ （４０，３０，２５，２０、および１０μｍ）、次いて幅を増大させた（２０１ ２５．３０．４０７１ｍ）フラクタルチャンネルを用いて実験を反復した。再度 、精子はフラクタルチャンネルの中心部へ移動した。

精子試料の二方向移動性も調べた。チャンネル（６０および８０μｍ幅、２０μ ｎ〕深さ）およびフラクタルチャンネルをＨＴＦ−ＢＳＡＷ質で満たし、該チャ ンネルの各端部の孔を介して精子を同時に導入した。精子は、該チャンネルの向 側端部の孔に向かって移動するにつれ、該チャンネル（またはフラクタルチャン ネル）の中心部に向かって移動し、最後は通過するのが観察された。

また、傾いたチャンネル実験を精子試料について行った。チャンネル（６０μｍ 幅、２０Ｉ１ｍ深さ）にＨＴＦ−ＢＳＡ媒質を満たし、精子試料を流入孔に適用 した。流入および流出孔を接着テープで／−ルした。チップを異なる時間の間１ ．１５°に傾け、次いて、精子のチャンネルを上がる進行を目視的に調査した。

精子は傾いたチャンネルを十分に上ってゆくことが判明し、チャンネルの頂部の 出口孔に見ることができた。

害章咋← メソスケール流動、／ステムを用いる異なる殺精子剤をテストする実験を行った 。

各々がチャンネル（３，２５ｍｍ長さ、１００７１ｍ幅、２０μｍ深さ）によっ て各端部において（ｌ入孔に連結しｆ−２つの千ヤンハー（５，２ｍｍ長さ、７ ８０／７ｍ幅、１．５ｍｍｆｌさ）よりなるチップを、ノノキシノール（ｎｏｎ ｏｘｙｎｏｌ）　９およびＣｌ５−Ｇ（ハイす、ス　インコーホ１／イテソド（ Ｂｉｏｓｙｎ、　Ｉｎｃ、　）、ペンンルへニア化）の殺精子活性の同時丑スト に用いた。４つのチャンネルに、各々、）−１Ｆ１′−Ｂ　Ｓ　Ａ溶液（チャン ネル＃１、対照）、０．００５％（チャンネル＃２）、０、０１２５％（チャン ネル＃３）および０．０５％（チャンネル＃４）のノノギ２・ノール−９（また はＣ１３−Ｇ）を満たした。精液試料を谷チャンバーに入れ、精子の隣接する千 ヤンネル・＼の進行を顕微鏡を用いてモニターした。チャンネルに観察された精 子の数は、以下の精子のカウントの減少順であった（チャンネル＃　１　＞　＃ 　２　＞　＃　：３　＞　＃　４　）。はとんどの精子は対照チャンネルに見ら れ、殺精子作用についての最適濃度にてノノキシノール−９またはＣｌ５Ｇを含 有するチャンネル＃４には何も見られなかった。

衷旋豊Ｊ 自動精子の形態学的調査をメンスケール流動システムで行った。各々がチャンネ ル（３，２５ｍｍ長さ、１００μｍ幅、２０μｍ深さ）によって各端部において 侵入孔に連結した２つのチャンバー（５，２ｍｍ長さ、７５０μｍ幅、１．５ｍ ｍ深さ）よりなるチップを用いた。チャンネルをＨＴＦ−８ＢＡ溶液で満たし、 精液試料を中心チャンバーに適用した。チップを湿潤環境に１Ｇ分間置いた。チ ップの各端部の孔からの表面溶液を除去し、（予めエタノールで洗浄した）ガラ ス製顕微鏡スライドに置いた。該スライドを４０”Ｃて乾燥し、ライト（ｆｒｉ ｇｈｔ）のキムサ染色液（クルナイン・マテソン・サイエンティフィック、イン コーホレイテッド（Ｃｕｒｔｉｎ　Ｍａｔｈｅｓｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 　Ｉｎｃ、　）、ヒコースＩ・ン、テキサス州）を用いて染色した。中心チャン バーからチャンネルの端部に、次いで孔に移動した精子は通常の微生物学的外観 を有していた。

！奥賦旦 各々がチャンネル（３，２５ｍｍ長さ、１００μｍ幅、２０μｍ深さ）によって 各端部において侵入孔に連結した２つのチャンバー（５，２ｍｍ長さ、７５０Ｊ ｉｍ幅、１．５ｍｍ深さ）よりなるチップにて、メソスケール流動システムにお ける精子試料と頚部粘液との相互作用をテストした。チャンネルをＨＴＦ−ＢＳ Ａ溶液で満たし、（患者の月経周期の約１４日目に採集した）頚部粘液試料を各 中心チャンバーに入れた。頚部粘液は月経周期の間の時点においては精子を拒絶 することは公知であるので予測されたように（モキソン（Ｍｏｇｈｉｓｓｉ　） ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステト・ンネコル（八ｍ、　Ｊ、　０ ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、）、±１１・４０５　（１９７２））　、精子 は頚部粘液へは移動せず、侵入したものはヒアルロン酸と精子試料との相互作用 のテストを行って、精子試料の頚部相互作用を評価した。各々が、メソスケール 流動チャンネル＃１、＃２、＃３および＃４　（３，２５ｍｍ長さ、１００μｍ 幅、２０μｍｌ？′さ）によって各端部において侵入孔に連結している２つのチ ャンバー（５，２ｍｍ長さ、７５０１１ｍ幅、１．５ｍｍ深さ）よりなる千７ブ にて千ストを行った。チャンネル＃１は対照チャンネルてあった。チャンネルに ＨＴＦ−ＢＳＡ溶液およびＨＴ　Ｆ　−Ｂ　Ｓ　Ａ中のヒアル口〉酸（ノグマ（ Ｓｉｇｍａ）’）　（各々、チャンネル＃２、＃３、＃４．５ｍｇ／′ｒｎ　Ｌ 、２．５ｍｇ／ｍｌ−、および１．３ｍｇ／ｍＬ）を満たした。精液試料を各中 心チャンバーに入れた。精子は５ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸を含有するチャンネル ＃２に移動しなかったが、ヒアルロンの濃度がチャンネル＃３および＃４て減少 するにつれた、移動度は増加しまた、−、ム誇−例−Ｉ　Ｑ 精子試料中のＩｇＧ抗体の存在についての免疫ヒースのテストを行った。免疫ピ ース（・＼イオラＦ’　（ＢｉｏＲＡＤ）、リノチモント、カリフォルニア州） 、ヒｌｉｇＧに対−４−る抗体て被７′！ｙｌ−，たミクロヒースを、ＨＴ　Ｆ −Ｂ　Ｓ　Ａ溶液（イルヒン・づイエノテイフイ戸り（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ）、サンタ・アナ（Ｓａｎｔａ　Ａｎａ）、ブＪす７ｔルニア州） 中、１ｍｇ／”ｍｌ−に希釈した。ガラス−ノリコンチップ中のミクロ千ヤンネ ル（２５Ｑ７１ｍ幅、２０μＩＴＩ深さ、および１０ｍｍ長さ）を免疫ヒース溶 液の試料で満たし、精液試料（約１　２１１Ｉ−’）をチャンネル侵入に適用し ７た。精子試料中の抗体の存在による免疫ヒースによっての精子の凝集がチャン ネルで観察された。対照と１．で、大容量の免疫ヒース試薬および精液試料を用 いてカラス製顕微鏡スラ伺・にて実験を１１い、これもまた陽性であったく凝集 が観察された）。

前記記載は例示のためになされたものであって、本発明は本明細書に記載した構 成および方法の精神を逸脱することのない他の形態を採ることが理解されるであ ろう。、当業音には変形および変法が明らかであり、すべてのががる変形および 変法は、請求の範囲に記載したごとく、本発明の一部であるとみなされる。

ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ＩＱ フロントページの続き （３１）優先権主張番号　８７７．６６２（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）！先権主張番号　８７７．７０１（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　８７７．７０２（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ）

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．流体試料中の分析物の存在を検出するための装置であって、試料流入ポート ；および 該流人ポートから伸びる第１の試料流動チャンネル；および複数の第２の流動チ ャンネルに至る分岐部からなる、該第１の流動チャンネルと流体連絡したフラク タル領域からなるメソスケール流動システムを微細加工した固体基材よりなる該 装置。
2. ２．該フラクタル領域か、さらに、該メソスケール流動システム中の第３の流動 チャンネルに至る該第２の流動チャンネルと流体連絡した合流部よりなる請求の 範囲第１項記載の装置。
3. ３．さらに、該メソスケール流動システムを通っての該試料の流動を誘導するた めの手段よりなる請求の範囲第１項記載の装置。
4. ４．該フラクタル領域が、該領域を通っての試料の流動の方向に沿って順次に設 けられた同数の分岐部および合流部よりなる請求の範囲第３項記載の装置。
5. ５．該フラクタル領域が、該第１の流動チャンネルおよび該第３の流動チャンネ ルに対して減少した断面積を有する請求の範囲第４項記載の装置。
6. ６．さらに、該流動システムを通っての流動を検出するための手段よりなる請求 の範囲第３項記載の装置。
7. ７．検出するための該手段が、該第３の流動チャンネルにおけるパラメーターを 検出するための手段からなる請求の範囲第６項記載の装置。
8. ８．検出するための該手段が、該第１の試料流動チャンネルにおけるパラメータ ーを検出し、それを該第３の流動チャンネルにおけるパーラメーターと比較する ための手段からなる請求の範囲第６項記載の装置。
9. ９．検出するための該手段が電気的検出手段である請求の範囲第７項または第８ 項記載の装置。
10. １０．流体圧力を検出する請求の範囲第７項記載の装置。
11. １１．流体の電導度を検出する請求の範囲第７項の装置。
12. １２．検出するための該手段が該フラクタル領域におけるパラメーターを検出す るための手段である請求の範囲第６項記載の装置。
13. １３．該検出手段が、該フラクタル領域への光学的経路を形成する手段である請 求の範囲第１２項記載の装置。
14. １４．さらに、該試料の成分に結合するための該フラクタル領域内に設けられた 結合部位よりなる請求の範囲第１項記載の装置。
15. １５．該結合部位が、該試料の成分に結合して粒子の凝集を誘導する粒子からな る請求の範囲第１４項記載の装置。
16. １６．該手段が磁気的検出手段である請求の範囲第６項記載の装置。
17. １７．該基材が複数の該流動システムからなる請求の範囲第１項記載の装置。
18. １８．生物の複製を検出するのに適した請求の範囲第１項記載の装置。
19. １９．該試料が精子試料であって、フラクタル領域を通っての精子の流動が精子 の運動性の指標を提供する請求の範囲第１項記載の装置。
20. ２０．該基材中のチャンネルが水平面に対して直角に設けられた請求の範囲第１ ９項記載の装置。
21. ２１．該固体基材が微細加工されたシリコンよりなる請求の範囲第１項記載の装 置。
22. ２２．さらに、該基材と組み合わせて用いる器具よりなり、該器具が、該基材を 保持するための手段； 該基材上で流入ポートと相互適合する流体投入手段；およびそれを該保持手段に 保持する場合に該基材の流動システムを通って流体を通過させるためのポンプ手 段よりなる請求の範囲第１項記載の装置。
23. ２３．さらに、該基材と組み合わせて使用するための器具よりなり、該器具が、 該基材を保持するための手段；および 該基材中の該メソスケール流動システムの中心部を観察するための光学的手段か らなる請求の範囲第１項記載の装置。
24. ２４．該光学的手段が拡大用オプティックスおよびビデオカメラよりなり、該器 具が、さらに、 該装置の角度および位置を手動で調整するための傾斜機構；および該流動システ ムの中心部を観察するためのビデオスクリーンよりなる請求の範囲第２３項記載 の装置。
25. ２５．該流動システムが、該フラクタル領域および該対照領域中の該試料の流動 の比較を可能とする対照フラクタル領域を包含する請求の範囲第６項記載の装置 。
26. ２６．流体試料中の分析物の存在を検出するための方法であって、（ｉ）試料流 入ポート；および 該流入ポートから伸びる第１の試料流動チャンネルからなるメソスケール流動シ ステムからなる装置を供し； （ｉｉ）該試料を該メソスケール流動システムを通って通過させ；次いで、（ｉ ｉｉ）該システムを通っての流動の制限または阻止を該分析物の存在の陽性指標 として検出することを特徴とする該方法。
27. ２７．該流動システムが、該試料の成分に結合できて、該システムを通っての流 動の制限または阻止を誘導または促進できる結合部位よりなる請求の範囲第２６ 項記載の方法。
28. ２８．該結合部位が、該試料の成分と結合して粒子の凝集を誘導し、それにより 、流動の制限または阻止を促進または誘導する粒子上に設けられた請求の範囲第 ２７項記載の方法。
29. ２９．該分析物が該試料中の細胞集団であり；該結合部位が該集団中の細胞の架 橋剤よりなり；かつ、流動の該制限が架橋剤誘導細胞凝集によって引き起こされ る請求の範囲第２７項記載の方法。
30. ３０．該結合部位が該流動システム内に固定化された請求の範囲第２７項記載の 方法。
31. ３１．該流動システムの表面上のマクロ分子表面層の形成によって流動が制限さ れる請求の範囲第３０項記載の方法。
32. ３２．該メソスケール流動システムが、さらに、該基材内においての該流動シス テムの閉塞または粘度の増大の効果を増幅するための複数の第２の流動チャンネ ルに至る分岐部よりなる、該流動チャンネルと流体連結している、フラクタル領 域からなる請求の範囲第２６項記載の方法。
33. ３３．工程（ｉｉｉ）において、制限または阻止が電気的に検出される請求の範 囲第２６項記載の方法。
34. ３４．工程（ｉｉｉ）において、制限または阻止が光学的に検出される請求の範 囲第２６項記載の方法。
35. ３５．該フラクタル領域が、さらに、該試料の成分に結合する結合部位よりなる 請求の範囲第３２項記載の方法。
36. ３６．該フラクタル領域が、該試料の成分と結合して粒子の凝集を誘導する粒子 を含有する請求の範囲第３５項記載の方法。
37. ３７．工程（ｉ）において供される該基材が、さらに、該試料流入ポートに流体 連絡した対照領域からなり；および 工程（ｉｉｉ）において、該フラクタル領域および該対照領域における該試料の 流動を検出し比較する請求の範囲第２６項記載の方法。
38. ３８．該分析物が複製可能な原核生物よりなり、工程（ｉｉｉ）において、該流 動システムを通じての該生物の流動の制限または阻止を該生物の存在の指標とし て供する請求の範囲第１６項記載の方法。