DE69319427T2

DE69319427T2 - Analyse bei messung des durchflusswiderstandes

Info

Publication number: DE69319427T2
Application number: DE69319427T
Authority: DE
Inventors: Larry Kricka; Peter Wilding
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1992-05-01
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1998-12-10
Anticipated expiration: 2013-04-30
Also published as: WO1993022053A1; JPH07506258A; CA2134477A1; GR3029509T3; HK16897A; DE69303898T3; DE69303483T2; DE69319427D1; DE69303898T2; EP0637997B1; GR3025037T3; EP0639223A1; CA2134476A1; DE69303898D1; EP0637999A1; CA2134478A1; AU677780B2; CA2134474C; CA2134476C; JP3207424B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von Analysen. Im spezielleren betrifft die Vorrichtung die Gestaltung und Konstruktion kleiner, typischerweise einzeln verwendeter Module, die fähig sind, rasch die Gegenwart eines Analyten in einer Fluidprobe nachzuweisen.
In den letzten Jahrzehnten ist auf dem Gebiet der Erfindung eine große Vielzahl von Vorschriften, Testsets und Kassetten zur Durchführung von Analysen an biologischen Proben für verschiedene Diagnose- und Überwachungszwecke entwickelt worden. Immunassays, Agglutinierungsassays und Analysen auf Basis von Polymerasekettenreaktion, verschiedene Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen und Differentialmigration von Spezies in einer komplexen Probe sind alle eingesetzt worden, um die Gegenwart oder Konzentration verschiedener biologischer Verbindungen oder Verunreinigungen oder das Vorliegen spezieller Zelltypen nachzuweisen.
In letzter Zeit sind kleine Einweg-Vorrichtungen entwickelt worden, um biologische Proben zu bearbeiten und um bestimmte klinische Tests durchzuführen. Shoji et al. haben über die Verwendung miniaturisierter, auf einem Siliziumwafer ausgebildeter Blut-Gas- Analysenvorrichtungen berichtet. Shoji et al., Sensors and Actuators 15, 101-107 (1988). Sato et al. haben über eine Zellfusionstechnik unter Einsatz mikromechanischer Siliziumvorrichtungen berichtet. Sato et al., Sensors and Actuators A21-A23, 948-953 (1990). Die Ciba Corning Diagnostics Corp. (USA) hat ein mit Mikroprozessor gesteuertes Laserphotometer zum Nachweis der Blutgerinnung hergestellt.
Die Technologie der Mikrofabrikation hat ihren Ursprung in der Mikroelektronikindustrie. Angell et al., Scientific American 248, 44-55 (1983). Die Mikrofabrikationstechnologie hat die Herstellung von durch Mikrokonstruktion erzeugten Vorrichtungen ermöglicht, die Strukturelemente mit minimalen Abmessungen im Bereich von einigen Dutzend um (die Dimensionen biologischer Zellen) bis nm (die Dimensionen einiger biologischer Makromoleküle) ermöglicht. Dieser Bereich wird hierin als "Meso-Scale" bezeichnet. Die meisten Versuche im Zusammenhang mit Meso-Scale-Strukturen umfassen Untersuchungen der Mikromechanik, d.h. der mechanischen Bewegungs- und Strömungseigenschaften. Die potentiellen Möglichkeiten von Meso-Scale-Strukturen sind in den Biowissenschaften noch nicht voll ausgenutzt worden.
Brunette (Exper. Cell Res. 167, 203-217 (1986) und 164, 11-26 (1986)) haben das Verhalten von Fibroblasten und Epithelzellen in Rillen in Silizium, titanbeschichteten Polymeren und dergleichen untersucht. Mc Cartney et al. (Cancer Res. 41, 3046-3051 (1981)) haben das Verhalten von Tumorzellen in gerillten Kunsttoffsubstraten untersucht. LaCelle (Blood Cells 12, 179-189(1986)) hat Leukozyten- und Erythrozytenfluß in Mikrokapillaren untersucht, um Einblick in den Mikrokreislauf zu gewinnen. Hung und Weissman haben eine Studie der Fluiddynamik in durch im Mikrobereich maschinell bearbeitete Kanälen berichtet, aber keine Daten hervorgebracht, die mit einer Analysevorrichtung in Verbindung stehen. Hung et al., Med. and Biol. Engineering 9, 237-245 (1971); und Weissman et al., Am. Inst. Chem. Eng. J. 17, 25-30 (1971). Columbus et al. haben eine Sandwichanordnung eingesetzt, die aus zwei orthogonal ausgerichteten, geprägten Platten mit V-Rillen zur Steuerung des Kapillarflusses biologischer Flüsigkeiten zu diskreten onenselektiven Elektroden in einer experimentellen Mehrkanal-Testvorrichtung bestand. Columbus et al., Clin. Chem. 33, 1531-1537 (1987). Masuda et al., und Washizu et al. haben die Verwendung einer Fluidströmungskammer zur Manipulation von Zellen (z.B. Zellfusion) berichtet. Masuda et al., Proceedings IEEE/IAS Meeting, S. 1549-1553 (1987); und Washizu et al., Proceedings IEEE/IAS Meeting, S.1735-1740 (1988). Nach dem Stand der Technik sind die Möglichkeiten der Verwendung von Meso-Scale-Vorrichtungen für die Analysen biologischer Flüssigkeiten und den Nachweis von Mikroorganismen noch nicht voll ausgeschöpft worden.
Die EP-A-0.483.117 offenbart eine Kapillarflußvorrichtung, die eine Kammer, eine Kapillare und ein Reagens, wie z.B. einen markierten Antikörper, umfaßt, das mit einem Analyten umgesetzt wird, so daß ein nachweisbares Signal, wie z.B. Lichtabsorption oder -emission, oder eine Änderung der Strömungsgeschwindigkeit erzeugt wird. Bei der Vorrichtung stellt die Kapillare die alleinige Antriebskraft für die Bewegung von Flüssigkeit durch die Vorrichtung dar, ohne daß Pumpen oder dergleichen eingesetzt werden.
Die heutigen Analysetechniken, die zum Nachweis von Mikroorganismen eingesetzt werden, sind selten automatisiert, erfordern üblicherweise die Inkubation in einem geeigneten Medium, um die Anzahl an Organismen zu erhöhen, und setzen ohne Ausnahme visuelle und/oder chemische Verfahren ein, um den Stamm oder die Subspezies zu identifizieren. Die diesen Verfahren eigene Verzögerung macht häufig medizinische Interventionen notwendig, bevor die Art der Infektion definitiv identifiziert werden kann. In der Industrie, im Gesundheitswesen oder im klinischen Bereich können solche Verzögerungen ernsthafte Konsequenzen haben. Es besteht die Notwendigkeit für geeignete Systeme zum raschen Nachweis von Mikroorganismen.
In einigen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Analysesysteme bereit, die Mikrovolumina von Proben analysieren und rasch Analyseergebnisse hervorbringen können. In anderen Aspekten werden kleine Einweg-Vorrichtungen (z.B. mit einem Volumen von weniger als 1 cm³) bereitgestellt, die sich leicht in Massenproduktion herstellen lassen und funktionelle Meso-Scale-Elemente aufweisen, die zu raschen, automatisierten Analysen vorbestimmter Molekül- oder Zell-Analyten in unterschiedlichen Anwendungsgebieten fähig sind. Gemäß weiterer Aspekte stellt die Erfindung eine Familie solcher Vorrichtungen bereit, die einzeln verwendet werden können, um eine Bandbreite rascher Tests durchzuführen, beispielsweise Tests auf bakterielle oder virale Infektion, Spermien beweglichkeit, Blutparameter, Verunreinigungen in Nahrung, Wasser oder Körperflüssigkeiten und dergleichen. Gemäß weiterer Aspekte stellt die Erfindung eine Familie von Analyse-Assayprotokollen zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten bereit, worin die ein positives Assay anzeigende Information durch direkte oder indirekte Messung der Änderung der Strömungseigenschaften von Fluid erhalten wird, das durch einen verengten Durchgang fließt.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in zwei ihrer Aspekte Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Fluidprobe bereit, wie in den Ansprüchen 1 und 20 dargelegt. Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die ein festes Substrat umfaßt, dessen Dicke typischerweise in der Größenordnung einiger Millimeter liegt und dessen Fläche typischerweise etwa 0,2 bis 2,0 cm² beträgt, und das durch Mikrofabrikation so hergestellt ist, daß eine Probeneinlaßöffnung und ein Meso-Scale-Durchflußsystem definiert ist. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, worin ein Probenfluid durch das Meso-Scale-Durchflußsystem geleitet wird und die durch Analyt herbeigeführte Einschränkung oder Blockierung des Flusses durch das System als positiver Hinweis auf die Gegenwart des Analyten nachgewiesen wird. Das Meso-Scale-Durchflußsystem umfaßt einen primären Probenströmungskanal, der sich von der Einlaßöffnung weg erstreckt, und einen Fraktalbereich, der sich mit dem primären Strömungskanal in Fluidkommunikation befindet und Gabelungen umfaßt, die zu mehreren sekundären Strömungskanälen führen. Der Begriff "Meso-Scale" wird in der vorliegenden Beschreibung verwendet, um Strömungsdurchgänge mit Querschnittsabmessungen in der Größenordnung von etwa 0,1 pm bis 500 um zu definieren, wobei bevorzugte Breiten in der Größenordnung von 2,0 bis 500 um, mehr bevorzugt 3 bis 100 um, liegen. Bei vielen Anwendungen sind Kanäle mit 5 bis 50 um Breite nützlich. Kammern in den Substraten können oft größere Abmessungen aufweisen, z.B. Breiten und Längen von 1 bis 5 mm. Bevorzugte Tiefen liegen in der Größenordnung von 0,1 bis 100 um, typischerweise 2 bis 50 um.
Der Fraktalbereich umfaßt typischerweise weiters Verbindungen in Fluidkommunikation mit den sekundären Strömungskanälen, die zu einem dritten Strömungskanal führen. Der Fraktalbereich kann eine gleiche Anzahl an Gabelungen und Verbindungen aufweisen, die nacheinander in Strömungsrichtung angeordnet sind. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, nimmt die Querschnittsfläche der Verzweigungskanäle im Fraktalbereich an jeder Gabelung allmählich ab und an jeder Verbindung zu. Der Fraktalströmungsbereich ist für die Flußeigenschaften einer Probe sehr empfindlich. In der Vorrichtung können Mittel vorgesehen sein, um Probenfluß durch das Durchflußsystem herbeizuführen. In der Vorrichtung können auch Mittel vorgesehen sein, um Änderungen in den Strömungseigenschaften nachzuweisen, wie z.B. Einschränkung oder Blockierung des Flusses, die durch die Gegenwart eines Analyten herbeigeführt werden. Die Vorrichtungen und Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können eingesetzt werden, um eine Vielzahl automatisierter, empfindlicher und rascher Tests praktisch durchzuführen, einschließlich von Analysen der Gegenwart bestimmter Typen von Zellen oder Makromolekülen, zur Überwachung von Reaktionen oder Zellwachstum oder zur Durchführung von Tests der Spermabeweg ich keit.
Im allgemeinen umfaßt das feste Substrat, wie hierin geoffenbart, einen Chip, der das Meso-Scale-Durchflußsystem enthält. Das Meso-Scale-Durchflußsystem kann unter Einsatz bestehender Verfahren der Mikrofabrikation aus Silizium und anderen festen Substraten konstruiert und hergestellt werden. Die Meso-Scale-Durchflußsysteme in den Vorrichtungen können durch Mikrofabrikation von Strömungskanälen und eines oder mehrerer Fraktalbereiche in die Oberfläche des Substrats und anschließendes Aufkleben einer Abdeckung, z.B. einer transparenten Glasabdeckung, auf die Oberfläche konstruiert werden. Die Vorrichtungen sind typischerweise in einer Größenordnung konstruiert, die sich zum Analysieren von Mikrovolumina (< 5 ul) Probe eignen, die durch eine Einlaßöffnung in das Durchflußsystem eingebracht wird, die z.B. durch ein Loch definiert ist, das durch das Substrat oder die Abdeckung mit dem Durchflußsystem kommuniziert. In sehr geringen Konzentrationen (z.B. im Nanogramm-Bereich) vorhandene Analyten können rasch (< 10 min) nachgewiesen werden. Nachdem ein Assay abgeschlossen ist, können die Vorrichtungen verworfen werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann im Meso-Scale-Durchflußsystem z.B. im Fraktalbereich eine spezifische Bindungsgruppe vorgesehen sein, um die Einschränkung oder Blockierung des Probenflusses durch das Durchflußsystem zu verstärken. Die Bindungsgruppen können Teilchen umfassen, die sich an eine Komponente der Probe binden, um nachweisbare Teilchenagglomeration herbeizuführen. Gegebenenfalls kann die Bindungsgruppe an den Innenflächen des Meso-Scale-Durchflußsystems immobilisiert werden, was Bindung eine Stenose des Durchgangs bewirkt.
Die Chips werden typischerweise mit einem Gerät verwendet, das eine Aufnahmestelle zum Halten des Chips enthält und die eine oder mehrere Eingabeöffnung des Chips mit einer oder mehreren Durchflußleitungen im Gerät paart. Nachdem eine Fluidprobe, z.B. eine biologische Flüssigkeitsprobe, von der vermutet wird, daß sie einen bestimmten Analyten wie eine Zellverunreinigung oder ein Toxin enthält, auf die Einlaßöffnung des Substrats aufgebracht wird, wird der Chip in das Gerät eingebracht, und eine Pumpe, z.B. im Gerät, wird betätigt, um die Probe durch das Durchflußsystem zu drängen. Alternativ dazu kann die Probe vom Gerät in den Chip eingespritzt werden. Die Probe kann in das Durchflußsystem auch einfach durch Kapillarwirkung durch eine Einlaßöffnung eintreten.
Die Gegenwart eines vorbestimmten Analyten in einer Fluidprobe kann durch Detektion von durch Analyt herbeigeführten Änderungen in den Probenfluid-Fließeigenschaifen, wie z.B. Änderungen des Drucks oder der elektrischen Leitfähigkeit, an verschiedenen Punkten im Durchflußsystem nachgewiesen werden. Bei einer Ausführungsform kann die durch den Analyten herbeigeführte Einschränkung oder Blockierung des Flusses im Meso-Scale-Durchflußsystem, z. B. im Fraktal bereich, durch Druckdetektoren, z.B. in dem Gerät, das in Kombination mit der Vorrichtung verwendet wird, detektiert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform können durch den Analyten herbeigeführte Änderungen der Leitfähigkeit in einem Bereich des Durchflußsystems, die durch das Einbringen eines Probenfluids verursacht werden, durch Sensoren für die elektrische Leitfähigkeit, die mit dem Durchflußsystem in Kontakt stehen, leicht nachgewiesen werden. Beispielsweise kann die Gegenwart von Analyt das Verstopfen eines eingeschränkten Strömungsdurchgangs verursachen, und jenseits des Durchgangs kann das Fehlen von Flüssigkeit durch Messen der Leitfähigkeit nachgewiesen werden. Das Gerät kann auch elektrische Kontakte im Aufnahmebereich umfassen, die mit Kontakten übereinstimmen, die in die Struktur des Chips integriert sind, um z.B. elektrische Signale zu empfangen, die z.B. eine Druckablesung, Leitfähigkeit oder dergleichen, die in irgendeinem Bereich des Durchflußsystems gemessen werden, um die Strömungseinschränkung anzuzeigen, als positiver Indikator für die Gegenwart des Analyten anzeigen.
Durch Analyt herbeigeführte Änderungen der Strömungseigenschaften eines Probenfluids können auch optisch nachgewiesen werden, z.B. durch ein transparentes oder lichtdurchlässiges Fenster, wie z.B. eine transparente Abdeckung über dem Durchflußsystem, oder durch einen lichtdurchlässigen Abschnitt des Substrats selbst. Das Gerät kann Meßausrüstung, wie z.B. ein Spektralphotometer, umfassen, das durch Analyt herbeigeführte Änderungen der Strömungseigenschaften einer Probe durch ein optisches Fenster in einem Chip nachweisen kann.
Die Vorrichtungen gemäß vorliegender Erfindung können so ausgebildet sein, daß sie eine große Bandbreite biologischer Tests durchführen können. Einige der Merkmale und Vorteile der Vorrichtungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Eine Vorrichtung kann zwei oder mehr getrennte Durchflußsysteme umfassen, die z.B. von einer gemeinsamen Einlaßöffnung versorgt werden, die jeweils andere Bindungsgruppen in z.B. verschiedenen Fraktaldetektionsbereichen aufweisen, um den gleichzeitigen Nachweis zweier oder mehrerer Analyten zu ermöglichen. Die Vorrichtung kann auch ein Vergleichsdurchflußsystem umfassen, so daß Daten vom Probenreich und Vergleichsbereich detektiert und verglichen werden. Die Vorrichtungen können rasche klinische Tests beispielsweise zum Nachweis pathogener Bakterien oder Viren liefern, oder um beispielsweise die Beweglichkeit von Spermaproben zu testen. Die Erfindung stellt Verfahren und Vorrichtungen zur Verwendung in einem weiten Bereich möglicher Assays bereit. Die Assays können rasch abgeschlossen werden, und nach dem Abschluß des Assays kann der Chip verworfen werden, was Verunreinigung von einer Probe zur anderen vorteilhaft verhindert, potentiell biologisch gefährliches Material abschließt und eine kostengünstige Mikroproben-Analyse ermöglicht. Tabelle 1

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine vergrößerte Draufsicht auf eine Vorrichtung 10 gemäß vorliegender Erfindung, die Substrat 14 umfaßt, das durch Mikrofabrikation mit Öffnungen 16, Meso- Scale-Durchflußkanal 20 und einem Fraktalgabelungssystem von Strömungskanälen 40 versehen ist.
Fig. 2 ist eine Längsschnittsansicht der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung.
Fig. 3 ist eine perspektivische Ansicht der Vorrichtung aus Fig. 1.
Fig. 4 ist eine schematische Querschnittsansicht einer Analysevorrichtung 10, die in ein Gerät 50 eingesetzt ist, das dazu dient, die Vorrichtung 10 zu halten und den Druck von Probenfluids in der Vorrichtung 10 zu regulieren und zu detektieren.
Fig. 5 ist eine schematische Draufsicht auf ein Substrat 14, das durch Mikrofabrikation mit einem Fraktalgabelungssystem aus Strömungskanälen 40 versehen ist, die symmetrisch auf dem Substrat angeordnet sind und sich zur Mitte des Fraktalsystems hin zu geringeren Durchmessern verjüngen.
Fig. 6 ist eine schematische Draufsicht auf Vorrichtung 10, die Substrat 14 umfaßt, das durch Mikrofabrikation mit Eingangsöffnungen 16, Meso-Scale-Durchflußsystem 20 und einem Fraktalgabelungssystem aus Strömungskanälen 40 versehen ist, die mit Perlen 42 versehen sind, um die Strömungseinschränkung und Agglomeration im Fraktalbereich zu verstärken.
Fig. 7 ist eine schematische Längsschnittsansicht einer Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung, die elektrische Leiter 17 und 18 zum Messen der Leitfähigkeit von Fluids in der Vorrichtung umfaßt.
Fig. 8 ist eine perspektivische Ansicht der in Fig. 7 gezeigten Vorrichtung.
Fig. 9 ist eine schematische Draufsicht auf eine Multitest-Vorrichtung, die gemäß vorliegender Erfindung konstruiert ist.
Fig. 10 ist eine schematische Draufsicht auf eine Analysevorrichtung, die mit einer Reihe von Meso-Scale-Kammern hergestellt ist, die sich zur Erfüllung einer Vielzahl von Funktionen eignen, einschließlich der Zellklassierung, Zell-Lyse, PCR-Analyse und Nachweis von PCR-Produkten im Fraktalbereich 40.
Fig. 11 ist eine schematische Draufsicht auf Vorrichtung 10 gemäß vorliegender Erfindung, die Substrat 13 umfaßt, das durch Mikrofabrikation mit Öffnungen 16, Meso- Scale-Strömungskanälen 20 und einem Paar Fraktalströmungskanälen 40 ausgebildet ist.
Fig. 12 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer Vorrichtung 60, die in Kombination mit Vorrichtung 10 verwendet wird, um den Inhalt von Vorrichtung 10 zu betrachten.
Fig. 13 ist eine schematische Querschnittsansicht der Vorrichtung 60 aus Fig. 12.
Gleiche Bezugszahlen in den jeweiligen Figuren bezeichnen entsprechende Teile.

Detaillierte Beschreibung

Die Erfindung stellt Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Fluidprobe bereit. Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die ein festes Substrat, typischerweise in der Größenordnung einer Dicke von wenigen Millimeter und einer Fläche von 0,2 bis 2,0 cm² umfaßt, das durch Mikrofabrikation so ausgebildet ist, daß es eine Probeneinlaßöffnung und ein Meso-Scale-Durchflußsystem umfaßt. Ein Probenfluid wird durch das Meso-Scale-Durchflußsystem geleitet, und die durch Analyt herbeigeführte Einschränkung oder Blockierung des Flusses durch das System wird als positiver Indikator für die Gegenwart des Analyten detektiert.
Analysevorrichtungen, die Meso-Scale-Durchflußkanäle und Fraktalbereiche aufweisen, können aus einem festen Substratmaterial in großen Mengen konstruiert und hergestellt werden. Sie können leicht sterilisiert werden. Aufgrund der gut entwickelten Technologie, die präzise und effiziente Fabrikation ermöglicht, ist Silizium ein bevorzugtes Substratmaterial, aber es können auch andere Materialien eingesetzt werden, einschließlich von Polymeren wie Polytetrafluoethylenen. Die Probeneinlaß- und andere Öffnungen, das Meso-Scale-Durchflußsystem, das den bzw. die Probenströmungskanäle, den bzw. die Fraktalbereiche und andere funktionelle Elemente umfaßt, können nach einer Vielzahl von Bearbeitungsverfahren im Mikrobereich, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, kostengünstig in großen Mengen aus einem Siliziumsubstrat hergestellt werden. Die verfügbaren Verfahren zur Bearbeitung im Mikrobereich umfassen Filmablagerungsverfahren, wie z.B. Spinbeschichtung und chemisches Aufdampfen, Laserfabrikation oder Photolithographietechniken, wie UV- oder Röntgenstrahlenverfahren, oder Ätzverfahren, die entweder durch chemische Naßverfahren oder Plasmaverfahren durchgeführt werden können. (Siehe z.B. Manz et al., Trends in Analytical Chemistry 10, 144-149 (1991)).
Strömungskanäle mit unterschiedlichen Breiten und Tiefen können mit Meso-Scale- Abmessungen hergestellt werden. Das einen hergestellten Meso-Scale-Durchflußkanal enthaltende Siliziumsubstrat kann mit einer dünnen anodisch verbundenen Glasabdeckung abgedeckt und abgedichtet sein. Es können auch andere durchsichtige oder undurchsichtige Abdeckmaterialien verwendet werden. Alternativ dazu können zwei Siliziumsubstrate in Sandwichanordnung angeordnet werden, oder eine Siliziumsubstrat kann in Sandwichanordnung zwischen zwei Glasabdeckungen angeordnet werden. Die Verwendung einer transparenten Abdeckung führt zu einem Fenster, das die dynamische Betrachtung des Kanalinhalts erleichtert, und ermöglicht die optische Sondierung des Meso-Scale-Durchflußsystems entweder visuell oder maschinell. Es können auch andere Fabrikationsansätze eingesetzt werden. Bei einer Ausführungsform können Elektronenmikroskop-Aufnahmen biologischer Strukturen, wie z.B. Kreislaufnetzwerke, als Masken für die Fabrikation von Meso-Scale-Durchflußsystemen auf dem Substrat verwendet werden. Meso-Scale-Durchflußsysteme können mit einer Bandbreite von Größen und Konfigurationen fabriziert werden. Das Durchflußsystem umfaßt einen Fraktalbereich, der Gabelungen umfaßt, die zu mehreren sekundären Kanälen führen. Bei den Vorrichtungen dient Flußeinschränkung im Meso-Scale- Durchflußsystem als positiver Indikator für die Gegenwart eines Analyten.
Die Kapazität der Vorrichtungen ist sehr gering, und daher ist die Menge an für eine Analyse erforderlichem Probenfluid sehr gering. Beispielsweise beträgt bei einem Siliziumsubstrat mit 1 cm x 1 cm, das an seiner Oberfläche eine Anordnung aus 500 Rillen mit einer Breite von 10 um x einer Tiefe von 10 mm x einer Länge von 1 cm (10&sup4; um) aufweist, das Volumen einer jeden Rille 10&supmin;³ ul und das Gesamtvolumen der 500 Rillen 0,5 ul. Das geringe Volumen der Meso-Scale-Durchflußsysteme ermöglicht es, die Assays anhand von sehr kleinen Mengen einer flüssigen Probe (< 10 ul) durchzuführen. Das Volumen des Durchflußsystems beträgt typischerweise < 5 ul, und das Volumen einzelner Kanäle, Kammern oder anderer funktioneller Elemente ist oft geringer als 1 ul, und liegt z.B. im Nanoliter- oder Picoliterbereich. Die Meso-Scale-Durchflußsysteme der Vorrichtung können durch Mikrofabrikation mit ul-Volumina oder alternativ dazu Nanoliter- oder noch kleineren Volumina hergestellt werden, das die für das Assay erforderliche Menge an Proben- und/oder Reagensfluids vorteilhaft begrenzt.
Eine wichtige Folge und ein wichtiger Vorteil des Einsatzes von Strömungskanälen mit Meso-Scale-Abmessungen besteht darin, daß Änderungen in den Fließeigenschaften von Makromolekülen, Teilchen und Zellen, die in wäßrigen Flüssigkeit mitgeführt werden oder gelöst sind, durch Stenose, d.h. Verengung der Strömungskanäle, leicht beeinflußt und leicht nachgewiesen werden. Das Vorsehen des Fraktalbereichs dient dazu, die Flußänderung zu vereinfachen. Daher kann beispielsweise eine Probe, von der vermutet wird, daß sie mit Bakterien verunreinigt ist, in der Vorrichtung kultiviert werden, und das Vorhandensein einer Vielzahl der Organismen kann nachgewiesen werden, indem bestimmt wird, ob Fluid mit einem bestimmten Druck durch das System gedrängt werden kann. Wenn keine Bakterien vorhanden sind, fließt das Fluid leicht; eine große Anzahl an Zellen würde das teilweise oder vollständige Versperren des Fraktalbereichs bewirken. Als weiteres Beispiel reicht das Anwachsen von Makromolekülen an spezifischen Bindeproteinen, die an den Wänden des Strömungskanals immobilisiert sind, dazu aus, den Flüssigkeitsstrom durch den Kanal zu hemmen, vorausgesetzt, seine Abmessungen sind klein genug. Bei wieder einem anderen Beispiel kann die Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids in einer Polynukleotidprobe durch das Fließen des Inhalts einer Kammer nach einer geeigneten Anzahl von PCR-Zyklen durch einen Fraktalbereich angezeigt werden, da die Viskosität einer mit einer großen Menge an Polynukleotiden beladenen Lösung höher ist als jene einer Lösung von Nukleotiden.
In einer Ausführungsform, die schematisch in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt ist, kann die Vorrichtung 10 ein Siliziumsubstrat 14 umfassen, daß durch Mikrofabrikation so hergestellt ist, daß es Öffnungen 16, einen primären Probenströmungskanal 20A und ein Fraktalsystem aus Strömungsdurchgängen 40 umfaßt. Die Öffnungen können durch Mikrofabrikation mit Meso-Scale- oder größeren Abmessungen ausgebildeten sein. Der Fraktalbereich 40 umfaßt in diesem Fall eine gleiche Anzahl von Gabelungen und Verbindungen, die nacheinander in Strömungsrichtung durch den Fraktalbereich hindurch angeordnet sind und zu einem dritten Strömungskanal 20B führen. Das Substrat 14 ist mit einem klaren Glas- oder Kunststoff-Fenster 12 bedeckt, um die Kanäle abzuschließen. In Betrieb tritt eine Fluidprobe durch Einlaßöffnung 16A und Strömungskanal 20A in die Vorrichtung ein und fließt dann durch den Fraktalbereich 40 zum Strömungskanal 20B und Öffnung 16B. Der Fraktalbereich 40 ist für die Fließeigenschaften einer Probe sehr empfindlich. Die Einschränkung oder Blockierung des Flusses einer Probe durch den Fraktalbereich 40 kann als Indikator für das Vorhandensein eines Analyten in der Probe dienen und kann beispielsweise optisch durch das Fenster 12 detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Fraktalsystem 40 auf einem Siliziumsubstrat mit verkleinerten Abmessungen an jeder Gabelung ausgebildet sein, wodurch nacheinander engere Strömungskanäle bereitgestellt werden, wie schematisch in Fig. 5 dargestellt. Fig. 5 zeigt Vorrichtung 10, die Substrat 14 umfaßt, das durch Mikrofabrikation mit Fraktalströmungskanälen 40 versehen ist, die relativ zum primären Strömungskanal 20A und zum dritten Strömungskanal 20B verringerte Querschnittsfläche aufweisen. Beim Betrieb tritt ein Probenfluid in die Vorrichtung 10 durch Einlaßöffnung 16A und Kanal 20A ein und fließt dann durch den Fraktalbereich 40 zu Strömungskanal 20B und Öffnung 16B. Fluidströmung durch diesen Fraktalbereich 40 ist sehr empfindlich für Veränderungen in der Fluidviskosität und in der Entwicklung von Strömungseinschränkungen, die beispielsweise durch die Vermehrung von Zellen oder die Agglomeration von Zellen, Teilchen oder makromolekularen Komplexen, die in einer Probe vorhanden sein können, verursacht wird. Das Fraktalsystem kann durch Mikrofabrikation mit einer komplexen Serie von Gabelungen versehen sein, wie schematisch in Fig. 11 dargestellt, um die Empfindlichkeit für Flußeinschränkung zu erhöhen. Vorrichtung 10 in Fig. 11 umfaßt ein Paar von Fraktalgabelungsströmungskanälen 40A und 40B. Der Fraktalströmungskanal 40A ist mit nacheinander engeren Strömungskanälen zur Mittel des Fraktalbereichs hin konstruiert, um dadurch die Empfindlichkeit für Flußeinschränkung zu erhöhen.
Die Analysevorrichtun gen, die das Meso-Scale-Durchflußsystem enthalten, können in Kombination mit einem Gerät zum Abgeben und Aufnehmen von Fluids an und von den Vorrichtungen verwendet werden, wie dem schematisch in Fig. 4 gezeigten Gerät 50, das eine Aufnahmestelle 58 zum Halten der Vorrichtung 10 und zum Ausrichten von Öffnungen, z.B. Öffnungen 16 auf der Vorrichtung 10, mit einer Strömungsleitung 56 im Gerät umfaßt, Nachdem eine Fluidprobe, von der vermutet wird, daß sie einen bestimmten Analyten enthält, auf die Einlaßöffnung 51 der Vorrichtung aufgebracht wurde, wird Pumpe 52 betätigt, um die Probe in die Öffnung 16A von Vorrichtung 10, Strömungskanal 20A und den Fraktalbereich 40 zu drängen. Alternativ dazu kann die Probe in die Vorrichtung eingespritzt werden oder kann in das Durchflußsystem einfach durch Kapillarwirkung eintreten. Bei einer Ausführungsform können die Durchflußsysteme der Vorrichtungen bis zu einem hydraulisch vollen Volumen gefüllt werden, und das Gerät kann eingesetzt werden, um den Fluidstrom beispielsweise über Ventile, die sich in der Vorrichtung oder dem Gerät befinden, in das Meso-Scale-Durchflußsystem zu lenken.
Die Analysevorrichtungen können auch in Kombination mit einem Gerät zum Betrachten des Inhalts der Meso-Scale-Kanäle in den Vorrichtungen eingesetzt werden. Das Gerät kann bei einer Ausführungsform ein Mikroskop zum Betrachten des Inhalts der Meso-Scale-Kanäle in den Vorrichtungen umfassen. Bei einer anderen Ausführungsform kann im Gerät eine Kamera enthalten sein, wie in Gerät 60 dargestellt, das schematisch in den Fig. 12 und 13 gezeigt wird. Das Gerät 60 ist mit einem Gehäuse 62, einem Bildschirm 64 und einem Schlitz 66 zum Einstecken eines Chips in das Gerät versehen. Wie im Querschnitt in Fig. 13 gezeigt, umfaßt das Gerät 60 auch eine Videokamera 68, ein optisches System 70 und einen Kippmechanismus 72 zum Halten der Vorrichtung 10, der es ermöglicht, daß die Position und der Winkel von Vorrichtung 10 manuell eingestellt werden. Das optische System 70 kann ein Linsensystem zur Vergrößerung des Kanalinhalts sowie eine Lichtquelle umfassen. Die Videokamera 68 und der Bildschirm 64 ermöglicht es, daß durch Analyt hervorgerufene Änderungen in den Probenfluideigenschaften, wie Fließeigenschaften und Farbe, visuell überwacht und gegebenenfalls unter Verwendung des Geräts aufgezeichnet werden.
Änderungen in den Probenflußeigenschaften im Durchflußsystem, die durch die Gegenwart eines Analyten in der Probe herbeigeführt werden, können nach einem einer Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden, einschließlich des Überwachens des Drucks oder der elektrischen Leitfähigkeit von Probenfluids in ausgewählten Bereichen des Durchflußsystems in der Vorrichtung, wie hierin geoffenbart. Durch Analyt hervorgerufene Änderungen in den Strömungseigenschaften können auch durch optischen Nachweis durch eine transparente Abdeckung oder einen lichtdurchlässigen Abschnitt des Substrats selbst entweder visuell oder maschinell nachgewiesen werden. Vorrichtungen, wie z.B. Ventile, Meso-Scale-Drucksensoren und andere mechanische Sensoren können direkt auf dem Siliziumsubstrat hergestellt und nach wohlbekannten bestehenden Techniken in Massenproduktion produziert werden. Angell et al., Scientific American 248, 44-55 (1983). Drucksensoren und andere Detektionsmittel können in einem in Kombination mit der Vorrichtung eingesetzten Gerät ebenfalls vorgesehen sein.
In einer Ausführungsform kann durch Analyt hervorgerufene Flußeinschränkung durch Überwachen des Drucks von Probenfluids nachgewiesen werden, die in das Meso- Scale-Durchflußsystem eintreten und dieses wieder verlassen. Fig. 4 zeigt schematisch als Beispiel eine Vorrichtung 10, die in Gerät 50 aufgenommen ist, das zwei Druckdetektoren 54 zum Ermitteln des Strömungsdrucks von Fluids umfaßt, die durch Öffnung 16 in die Vorrichtung 10 eintreten und diese verlassen. Alternativ dazu kann ein Meso-Scale-Drucksensor direkt auf dem Siliziumsubstrat ausgebildet und über elektrische Kontakte an das Gerät angeschlossen werden. Angell et al., Scientific American 248, 44-55 (1983). Durch Analyt herbeigeführte Änderungen der Flußeigenschaften im Durchflußsystem, wie z.B. Flußeinschränkung, können so als Druckveränderung nachgewiesen werden, die ein positives Ergebnis anzeigt. Es können auch andere Detektoren eingesetzt werden, wie etwa herkömmliche Strömungsdetektoren. Die Bewegung magnetischer Perlen, die im Fluid mitgeführt werden, kann leicht als Indikator für die Flußeinschränkung ermittelt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können elektrische Leiter im Substrat der Vorrichtungen ausgebildet sein, um die Übertragung von Signalen zu ermöglichen, die auf Änderungen der Fließeigenschaften des Fluids hinweisen, die durch das Vorhandensein des Analyten herbeigeführt werden, und in verschiedenen Bereichen des Durchflußsystems gemessen werden. Elektrische Leiter im Substrat können durch Kontakte mit den elektrischen Leitern in einem Gerät gepaart werden, das in Kombination mit der Vorrichtung verwendet wird. Die elektrischen Leiter in der Vorrichtung übertragen Signale von Sensoren für Druck oder elektrische Leitfähigkeit, die das Ermitteln der Leitfähigkeit oder des Drucks von Fluid in den Durchflußsystemen ermöglichen.
Beispielsweise kann in der schematisch in Fig. 5 dargestellten Vorrichtung 10 das durch Analyt hervorgerufene Verstopfen des Fraktalbereichs 40, das den Fluß von der Einlaßöffnung 16A zur Auslaßöffnung 16B blockiert, durch die herkömmliche Leitfähigkeitssonde 17 nachgewiesen werden, deren Ausgangsgröße ein Indikator für die Gegenwart oder Abwesenheit von wäßrigem Fluid im Ausflußkanal ist. Die Leitfähigkeits oder anderweitige Sonde könnte auch innerhalb des Fraktalbereichs 40 ausgebildet sein. Das Substrat kann durch Mikrofabrikation mit einem Vergleichsbereich ausgebildet sein, so daß die Augangsgrößen vom Probenströmungsbereich und dem Vergleichsbereich ermittelt und verglichen werden können, wodurch die Genauigkeit des Assays erhöht wird.
In einer weiteren Ausführungsform können die Flußeigenschaften zwischen Probenfluid, das in das Durchflußsystem eintritt und dieses verläßt, ermittelt und verglichen werden, um durch Analyt herbeigeführte Änderungen in den Fließeigenschaften einer Probe nachzuweisen. Bei einer Ausführungsform kann die Leitfähigkeit in der schematisch in den Fig. 7 und 8 gezeigten Vorrichtung 10 gemessen werden. Vorrichtung 10 umfaßt ein Siliziumsubstrat 14, auf dem Einlaßöffnungen 16 und Strömungskanal 20 durch Mikrofabrikation ausgebildet sind. Das Substrat ist mit einem lichtdurchlässigen Fenster 12 bedeckt.
Beim Betrieb tritt ein Probenfluid durch Öffnung 16A und Probenkanal 20A in Vorrichtung 10 ein und fließt dann durch den Fraktalbereich 40 zu Kanal 20B und Öffnung 168. Vorrichtung 10 ist durch Mikrofabrikation mit dem elektrischen Leiter 18A versehen, der sich in elektrischem Kontakt mit Fluidkanal 20A befindet, um die Leit fähigkeit von Fluid in der Mitte des Fraktalbereichs 40 zu ermitteln. Die Vorrichtung umfaßt auch den elektrischen Leiter 18B in elektrischem Kontakt mit Strömungskanal 20B zum Ermitteln der Leitfähigkeit von Fluid, das den Fraktalbereich 40 verläßt. Die Leiter 18 sind an Kontakte 17 angeschlossen, die sich durchgehend bis zum Boden des Substrats erstrecken. Die Kontakte 17 können nach bekannten Techniken hergestellt sein, z.B. durch Zonenschmelzen mit Thermogradienten (siehe Zemel et al., in: Fundamentals and Applications of Chemicals Sensors, D. Schuetzle und R. Hammerle (Hrsg.), ACS Symposium Series 309, Washington, DC, 1986, S.2). Vorrichtung 10 kann in einem Gerät wie etwa dem in Fig. 4 gezeigten Gerät 50 aufgenommen sein, das zum Nachweisen von Änderungen der Leitfähigkeit durch die Kontakte 17 fähig ist. Änderungen der Leitfähigkeit können mit Änderungen deß Fluideigenschaften, wie z.B. Fluiddruck, in Korrelation gebracht werden, die durch die Gegenwart eines Analyten in der Fluidprobe herbeigeführt werden. Die Blockierung im Fraktalbereich verhindert, daß Flüssigkeit Kanal 20B erreicht, und die Leitfähigkeit über den Spalt in Leiter 18B ist gering.
Durch Analyt herbeigeführte Änderungen in den Strömungseigenschaften einer Probe in den Durchflußsystemen, wie z.B. Flußeinschränkung, können auch optisch, z.B. mit einem Mikroskop, durch eine transparente Abdeckung über dem Durchflußsystem oder durch einen transparenten Bereich des Substrats selbst hindurch, detektiert werden. Das Gerät kann eine Meßausrüstung, wie z.B. ein Spektralphotometer, umfassen, um den optischen Nachweis von Veränderungen in den Strömungseigenschaften aufgrund des Vorhandenseins des Analyten zu unterstützen.
In einer Ausführungsform kann das Meso-Scale-Durchflußsystem, z.B. der Fraktalbereich, eine Bindungsgruppe umfassen, die zur Bindung des Analyten fähig ist, wodurch die Flußeinschränkung verstärkt wird. Gegebenenfalls kann die Bindungsgruppe auf der Oberfläche des Strömungskanals oder auf einem Festphasenreaktanden, wie z.B. Perlen, immobilisiert sein. Die Bindungsgruppe kann beispielsweise ein Antigen-Bindeprotein, eine DNA-Sonde oder einen Teil eines Ligand/Rezeptor-Paares umfassen. Die Bindungsgruppe kann auch einen Vernetzer umfassen, wie z.B. ein chemisches Reagens oder ein Protein, das zur Vernetzung einer spezifischen Zellsubpopulation in der Lage ist.
Die Bindungsgruppe kann auf der Oberfläche der Meso-Scale-Strömungskanäle beispielsweise durch physikalische Absorption auf den Kanaloberflächen oder durch chemische Aktivierung der Oberfläche und darauffolgendes Binden von Biomolekülen an die aktivierte Oberfläche immobilisiert sein. Zur chemischen Aktivierung von siliziumhältigen Kanaloberflächen und das darauffolgende Binden einer Bindungsgruppe an die Oberfläche können nach dem Stand der Technik bekannte Techniken eingesetzt werden. (Siehe z.B. Haller in: Solid Phase Biochemistry, W.H. Scouten (Hrsg.), John Wiley, New York, S. 535-597 (1983); und Mandenius et al., Anal. Biochem. 137, 106-114 (1984), und Anal. Biochem. 170, 68-72 (1988)). Der Nachweis eines Zell- oder chemischen Analyten kann durch Auswahl der geeigneten Bindungsgruppe durchgeführt werden. Die Flußeinschränkung kann durch die Bindung des Analyten an die Bindungsgruppe, die auf der Oberfläche des Meso-Scale-Durchflußsystems immobilisiert ist, d.h. durch den Aufbau einer makromolekularen Oberflächenschicht auf der Oberfläche des Durchflußsystems, erhöht werden.
In einer Ausführungsform kann die Bindungsgruppe ein Teilchen umfassen, das zum Herbeiführen nachweisbarer Agglomeration eines Analyten im Meso-Scale-Durchflußsystem fähig ist. Wie in Vorrichtung 10 dargestellt, die schematisch in Fig. 6 gezeigt wird, können Teilchen 42, die mit für einen bestimmten Analyten spezifischem Bindeprotein beschichtet sind, im Fraktalbereich 40 vorgesehen sein, um durch Analyt herbeigeführte Agglomeration von Fluid im Fraktalbereich zu fördern. Beispielsweise kann eine Bindungsgruppe, wie z.B. ein Antikörper, auf einer inerten Perle immobilisiert sein und eingesetzt werden, um Agglomeration herbeizuführen. Agglomeration im Fraktalbereich kann optisch durch ein Fenster nachgewiesen werden, das z.B. über dem Fraktalbereich angeordnet ist. Die Agglomeration kann auch beispielsweise durch Ermitteln von Änderungen des Drucks oder der Leitfähigkeit des Probenfluids nachgewiesen werden, wie nachstehend erörtert.
Um die Präzision eines Assays zu erhöhen, kann das Substrat so hergestellt werden, daß es einen Vergleichsbereich im Durchflußsystem umfaßt, z.B. einen Bereich, dessen Geometrie mit jener des Testbereichs identisch ist, der aber keine Bindungsgruppen enthält. Probe, die sowohl zum Nachweis- als auch zum Vergleichsbereich geleitet wird, weist unterschiedliche Fließeigenschaften auf, die ermittelt und verglichen werden können.
In einer Ausführungsform stellen die Vorrichtung ein Meso-Scale-Fraktaldurchflußsystem bereit, mit dem es problemlos möglich ist, das Wachstum von Organismen in einer Kultur aufgrund von Änderungen der Fluidviskosität auf Basis der Flußeinschränkung zu überwachen. Der Fraktalbereich kann eine umfassende Serie einer gleichen Anzahl von Gabelungen und Verbindungen umfassen, die nacheinander in Strömungsrichtung der Probe durch den Bereich hindurch angeordnet sind, wie schematisch in Fig. 11 dargestellt. Die Flußeinschränkung kann beispielsweise optisch nach einer kurzen Inkubation nachgewiesen werden. Die Gegenwart und das Wachstum eines Organismus in einer Probe beeinflußt die Fließeigenschaften innerhalb des Fraktalbereichs. Ein oder mehrere Sensoren, wie z.B. Sensoren für den Druck oder die Leitfähigkeit, kann/können eingesetzt werden, um Druckänderungen aufgrund von Änderungen der Fluideigenschaften nachzuweisen, die durch die Gegenwart eines Organismus im Fraktalbereich verursacht werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Migration von Spermien in den Meso- Scale-Durchflußsystemen der Vorrichtungen, z.B. in einem Fraktalbereich, als Indikator für die Spermienbeweglichkeit dienen. Das Substrat kann beispielsweise in einem Gerät in einem bestimmten Winkel zu einer horizontalen Ebene angeordnet sein, um eine Neigung für die Wanderung einer Spermienprobe zu liefern, um den Nachweis der Beweglichkeit weiter zu verstärken. Reagenzien, die zur Bindung an Spermien fähig sind, können im Durchflußsystem vorgesehen sein. Die Vorrichtungen können eingesetzt werden, um beispielsweise ein Spermizid oder die Bindungseigenschaften einer Spermienprobe zu beurteilen oder Spermienzählungen vorzunehmen.
Die Vorrichtungen können eingesetzt werden, um eine Vielzahl automatisierter, empfindlicher und rascher Analysen auf Basis von Flußeinschränkung durchzuführen, einschließlich von Analysen von Zellen oder Makromolekülen, oder um das Zellkulturwachstum zu überwachen. Die Vorrichtung können mit zwei oder mehr Meso-Scale- Durchflußsystemen hergestellt werden, die z.B. zwei. oder mehrere verschiedene Fraktalbereiche umfassen, die z.B. Bindungsgruppen für verschiedene Analyten enthalten, was ermöglicht, zwei oder mehr Assays gleichzeitig durchzuführen. Nach dem Abschluß des Assays werden die Vorrichtungen typischerweise verworfen. Die Verwendung von Wegwerf-Vorrichtungen schaltet die Verunreinigung der Proben untereinander aus. Die Probe kann jedesmal eingeschlossen bleiben, und das geringe Volumen vereinfacht die Abfallbeseitigung.
Die Erfindung ist anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele besser zu verstehen.

Beispiel 1

Die Spermienbeweglichkeit wird im schematisch in Fig. 5 gezeigten Chip 10 getestet. Eine Samenprobe (< 2 ul) wird auf ein Glas-Mikroskopplättchen aufgebracht, und der Chip 10 wird auf die Samen probe gelegt, so daß die Öffnung 16A auf der Samen probe angeordnet ist. Das Fortschreiten einzelner Spermatozoen in Öffnung 16A durch Kanal 20A und Fraktalbereich 40 wird unter Einsatz eines Mikroskops überwacht. Die Versuchsergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die zuvor für eine gesunde Spermienprobe ermittelt wurden, um einen Test für die Spermienbeweglichkeit bereitzustellen.

Beispiel 2

Das Wachstum eines Organismus wird in der schematisch in Fig. 5 gezeigten Vorrichtung überwacht. Das Fraktalmuster der Meso-Scale-Durchflußwege 40 im Substrat 14 wird über Einlaßöffnung 16A mit 2 ul eines Wachstumsmediumgemisches gefüllt, das mit einer Probe einer Testprobe geimpft worden ist. Die Vorrichtung wird dicht abgeschlossen und 60 min lang bei 37ºC inkubiert. Das Wachstum wird durch visuelle Untersuchung unter Einsatz eines Mikroskops oder durch Bestimmen der Fließeigenschaften des Kanalsystems beispielsweise über die Sonde 17 für elektrische Leitfähigkeit, nachgewiesen. Das Fehlen von Fluß ist ein Indikator für Wachstum und daraus folgende Blockierung des Fraktalsystems.

Beispiel 3

Spermienfunktionen werden an dem in Fig. 9 gezeigten durch Mikrofabrikation hergestellten festen Substrat 14 getestet. Eine Spermienprobe wird der Einlaßöffnung 16A zugeführt und fließt dann durch den Meso-Scale-Durchflußkanal 20 zu den Detektionskammern 40A, 40B und 40C. Fraktaldetektionskammer 40A liefert einen Test für Leukozyten und umfaßt immobilisierten Antikörper gegen gemeines Leukozytenantigen. Die Fraktaldetektionskammer 40B liefert einen Test für Spermienantikörper und enthält immobilisierten Antikörper gegen menschliches IgG, IgA oder IgM. Die Fraktaldetektionskammer 40C liefert einen Test für Acrosomreaktion und enthält mit Fluorescein markiertes Lectin. Flußeinschränkung aufgrund von Agglutination in den Kammern kann beispielsweise durch optische Detektion durch eine Glasabdeckung hindurch nachgewiesen werden, die über dem Substrat angeordnet ist. Nachdem das Assay abgeschlossen ist, wird die Vorrichtung verworfen.

Beispiel 4

Fig. 10 zeigt schematisch eine Vorrichtung 10, die Substrat 14 umfaßt, das verwendet wird, um die Gegenwart einer Ziel-Nukleinsäure innerhalb einer Subpopulation von Zellen in einem Gemisch in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit nachzuweisen. Auf Vorrichtung 10 ist durch Mikrofabrikation ein Meso-Scale-Durchflußweg 20 ausgebildet, der eine Zelltrennkammer 22A, eine Zellenlysekammer 22B, einen Filterbereich 28, eine Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Kammer, die die Abschnitte 2C und 22D umfaßt, und einen Fraktaldetketionsbereich 40 enthält. Das Meso-Scale-Durchflußsystem 20 ist auch mit Fluideingangs-/-ausgangs-Öffnungen 16A, 16B, 16C und 16D versehen. Die Vorrichtung wird in Kombination mit einem Gerät verwendet, wie z.B. dem in Fig. 4 gezeigten Gerät 50. Das Gerät ist mit Fluidwegen versehen, die Öffnungen 16 in der Vorrichtung entsprechen, sowie Ventilen, die es ermöglichen, die Öffnungen 16 mechanisch zu öffnen und zu schließen. Das Gerät umfaßt auch eine Pumpe 52 zum Regulieren des Flusses von Probenfluid durch die Vorrichtung. Das Gerät umfaßt weiters Mittel zum Beheizen der PCR-Reaktionskammerabschnitte 22C und 22D in der Vorrichtung.
Zunächst werden Ventile im Gerät verwendet, um die Öffnungen 16C und 16D zu schließen, während die Öffnungen 16A und 16B offen sind. Eine Probe, die ein Gemisch von Zeilen enthält, wird durch die Pumpe 52 im Gerät in die Probeneinlaßöffnung 16A gelenkt und fließt durch den Meso-Scale-Durchflußweg 20 zur Trennkammer 22A. Kammer 22A enthält an der Wand der Kammer immobilisierte Bindungsgruppen, die sich selektiv an ein Oberflächenmolekül auf einem gewünschten Zelltyp in der Probe binden. Verbleibende Zell-Komponenten treten durch Öffnung 168 aus dem Substrat aus. Nach der Bindung der gewünschten Zellpopulation in Kammer 22A wird der Fluß mit Puffer fortgesetzt, um Waschen durchzuführen und das Isolieren der Zellpopulation zu gewährleisten. Als nächstes wird Öffnung 16B geschlossen, und 16C wird geöffnet. Der Fluß wird dann ausreichend verstärkt, um die immobilisierten Zeilen freizusetzen. Der Fluß wird fortgesetzt, wodurch die Zellen durch membrandurchdringende Vorsprünge 24 in Kammer 22B gedrängt werden, die die Zellen aufreißen, um intrazelluläres Material freizusetzen.
Der Probenfluß geht weiter, an Filter 28 vorbei, der große Zellmembrankomponenten und andere Bruchstücke abfiltriert, zu Meso-Scale-PCR-Kammerabschnitt 22C, der durch Strömungskanal 20B mit PCR-Kammerabschnitt 22D verbunden ist. Taq-Polymerase, Primer und andere Reagenzien, die für das PCR-Assay erforderlich sind, werden dann Abschnitt 22D durch Öffnung 16C von einem Paar aus Öffnung und Strömungsweg im Gerät zugeführt, wodurch das Mischen der intrazellularen löslichen Komponenten aus der getrennten Subpopulation von Zellen und den PCR-Reagenzien ermöglicht wird. Wenn Öffnung 16A geschlossen ist, dient eine Pumpe im Gerät, die über Öffnung 16B angeschlossen ist, dazu, die PCR-Probe und Reagenzien durch Strömungskanal 20B zwischen den Abschnitten 22C und 22D zirkulieren zu lassen, die auf 94 ºC bzw. 65 ºC eingestellt sind, um mehrere Polynukleotidschmelz- und Polymerisationszyklen durchzuführen, was die Vermehrung des Polynukleotidproduktes ermöglicht.
Die Ventile im Gerät dienen als nächstes dazu, um Öffnung 16C zu schließen und Öffnung 16D zu öffnen. Die Pumpe im Gerät, die an Öffnung 168 angeschlossen ist, dient dann dazu, um das vermehrte, von der Zellpopulation isolierte Polynukleotid zum Fraktaldetektionsbereich 40 zu lenken. Die Flußeinschränkung im Fraktalbereich 40, die durch die Gegenwart von vermehrtem Polynukleotidprodukt verursacht wird, dient als positiver Indikator für die Gegenwart der Ziel-DNA oder -RNA in den Zellen und wird optisch durch eine Glasabdeckung hindurch detektiert, die über dem Detektionsbereich angeordnet ist.

Beispiel 5

In Meso-Scale-Durchflußkanälen wurden Versuche durchgeführt, um die Spermienbeweglichkeit von menschlichen Samenproben zu testen. Bei einem Spermienbeweglichkeitstest wurde ein Fraktalkanal (40 um breit, 20 um tief) in einem Glas- Silizium-Chip mit Human Tubal Fluid (HTF)-Medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) gefüllt, das 0,5 % BSA enthielt (HTF-BSA). Die Samenprobe (< 2 ul) wurde auf ein Glas-Mikroskopplättchen gegeben, und der Chip so auf die Samenperobe gelegt, daß der Eingang zum Kanal auf der Samenprobe angeordnet war. Die Bewegung einzelner Spermatozoen in den Kanal und diesen entlang zur Ausgangsöffnung wurde unter Einsatz eines Mikroskops überwacht und unter Verwendung einer TV-Kamera und eines Videorecorders aufgezeichnet. Es wurde beobachtet, daß Spermien durch den gewundenen Fraktalweg (insgesamt 9 rechtwinkelige Biegungen, z.B. die Vorrichtung aus Fig. 11) vom Eingang zur Mitte des Kanals wanderten. Der Versuch wurde unter Verwendung eines Fraktalkanals wiederholt, der 20 um tief war, dessen Breite sich aber an jeder Gabelung verringerte (40, 30, 25, 20 und 10 um) und dann wieder verbreiterte (20, 25, 30, 40 um). Wieder wanderten Spermien zur Mitte des Fraktalkanals.
Die Beweglichkeit einer Spermienprobe in zwei Richtungen wurde ebenfalls untersucht. Ein Fraktalkanal wurde mit HTF-BSA-Medium gefüllt, und Samen wurde gleichzeitig über die Öffnungen an jedem Ende des Kanals eingebracht. Es wurde beobachtet, daß die Spermien zur Mitte des Kanals (oder Fraktalkanals) wanderten und schließlich austraten, als sie zur Öffnung am gegenüberliegenden Ende des Kanals wanderten.

Claims

1. Vorrichtung zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Fluidprobe, wobei die Vorrichtung umfaßt:

ein festes Substrat, das durch Mikrofabrikation so hergestellt ist, daß es definiert:

eine Probeneinlaßöffnung; und

ein Meso-Scale-Durchflußsystem, umfassend:

einen primären Probenströmungskanal, der sich von der Einlaßöffnung weg erstreckt; und

einen Fraktalbereich in Fluidkommunikation mit dem primären Strömungskanal; und

Mittel zur Bestimmung einer Flußeigenschaft einer Fluidprobe im Durchflußsystem als Indikator für die Gegenwart eines Analyten in der Fluidprobe; dadurch gekennzeichnet, daß der Fraktalbereich mehrere Gabelungen umfaßt, wobei jede Gabelung zu mehreren unterschiedlichen sekundären Strömungskanälen führt, um die Verschlußwirkung des Durchflußsystems zu verstärken oder die Viskosität innerhalb des Substrats zu erhöhen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der Fraktal bereich weiters Verbindungen in Fluidkommunikation mit den sekundären Strömungskanälen umfaßt, die zu einem dritten Strömungskanal im Meso-Scale-Durchflußsystem führen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, die weiters Pumpmittel umfaßt, um ein Fließen der Probe durch das Meso-Scale-Durchflußsystem herbeizuführen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, worin der Fraktalbereich die gleiche Anzahl an Gabelungen und Verbindungen umfaßt, die in Strömungsrichtung einer Probe durch den Bereich hindurch seriell angeordnet sind.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin jeder sekundäre Kanal im Fraktalbereich relativ zum primären Strömungskanal und dem dritten Strömungskanal eine verringerte Querschnittsffläche aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Detektionsmittel Mittel zum Bestimmen einer Flußeigenschaft des Fluids im dritten Strömungskanal umfaßt.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Detektionsmittel Mittel umfaßt, um eine Flußeigenschaft des Fluids im primären Probenströmungskanal zu bestimmen und mit einer Flußeigenschaft des Fluids im dritten Strömungskanal zu vergleichen.

8. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Detektionsmittel umfaßt:

(a) eine elektrisches Detektionsmittel; oder

(b) ein magnetisches Detektionsmittel; oder

(c) Mittel, die einen Lichtweg zum Fraktalbereich hin definieren; oder

(d) Mittel zur Bestimmung des Wachstums eines Organismus im Strömungssystem.

9. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Fluiddruck oder die Fluidleitfähigkeit bestimmt wird.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiters eine innerhalb des Fraktalbereichs angeordnete Bindungsgruppe zur Bindung einer Komponente der Probe umfaßt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, worin die Bindungsgruppe Teilchen umfaßt, die sich mit einer Komponente der Probe verbinden, sodaß Teilchenagglomeration herbeigeführt wird.

12. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Substrat mehrere Strömungssysteme definiert.

13. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Probe eine Spermaprobe ist und worin das Fließen von Sperma durch den Fraktalbereich hindurch einen Indikator für die Spermienbeweglichkeit darstellt.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, worin das Substrat in einem bestimmten Winkel zu einer horizontalen Ebene angeordnet ist.

15. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das feste Substrat durch Mikrofabrikation hergestelltes Silizium umfaßt.

16. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die weiters ein Gerät zur Verwendung in Kombination mit dem Substrat umfaßt, wobei das Gerät umfaßt:

Mittel zum Halten des Substrats;

Fluidzufuhrmittel, die mit der Einlaßöffnung des Substrats ineinanderpassen; und

Pumpmittel, um Fluid durch das Strömungssystem des Substrats, wenn dieses im Haltemittel gehalten wird, hindurchzuleiten.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 9 bis 16, worin das Detektionsmittel ein Gerät zur Verwendung in Kombination mit dem Substrat umfaßt, wobei das Gerät umfaßt:

Mittel zum Halten des Substrats; und

optische Mittel zum Betrachten des Inhalts des Meso-Scale-Strömungssystems im Substrat.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, worin das optische Mittel eine Vergrößerungsoptik und eine Videokamera umfaßt und worin das Gerät weiters umfaßt:

einen Kippmechanismus zum manuellen Einstellen des Winkels und der Position der Vorrichtung; und

einen Bildschirm zum Betrachten des Inhalts des Strömungssystems.

19. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Strömungssystem einen Vergleichsfraktalbereich umfaßt, der einen Vergleich des Probenflusses im Fraktalbereich und im Vergleichsbereich ermöglicht.

20. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Fluidprobe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(i) Bereitstellen einer Vorrichtung, umfassend:

eine Probeneinlaßöffnung; und

ein Meso-Scale-Durchflußsystem, umfassend:

einen Fraktalbereich in Fluidkommunikation mit dem primären Strämungskanal, der mehrere Gabelungen umfaßt, wobei jede Gabelung zu mehreren unterschiedlichen sekundären Strömungskanälen führt, um die Verschlußwirkung des Strömungssystems zu verstärken oder die Viskosität innerhalb des Substrats zu erhöhen,

(ii) Hindurchleiten einer Fluidprobe, von der vermutet wird, daß sie einen Analyten enthält, durch den Fraktalbereich im Meso-Scale-Strömungssystem;

(iii) Bestimmung der Einschränkung oder Blockierung des Flusses der Fluidprobe durch das System hindurch; und

(iv) Korrelieren der nachgewiesenen Strömungseinschränkung oder -blockierung, oder des Fehlens derselben, mit der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Analyten in der Probe.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Strömungssystem eine Bindungsgruppe umfaßt, die zur Bindung des Analyten in der Probe fähig ist, um die Einschränkung oder Blockierung des Flusses durch das System hindurch zu fördern.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Bindungsgruppe auf Teilchen angeordnet ist, die sich mit dem Analyten in der Probe verbinden, um Teilchenagglomeration herbeizuführen, wodurch die Strömungseinschränkung oder -blockierung gefördert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, worin der Analyt eine Zellpopulation in der Probe ist;

die Bindungsgruppe einen Vernetzer für Zellen in der Population umfaßt; und

die Strömungseinschränkung durch mittels Vernetzer herbeigeführte Zellaggregation verursacht wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin die Bindungsgruppe innerhalb des Strömungssystems immobilisiert wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, worin die Strömung durch den Aufbau einer makromolekularen Oberflächenschicht auf einer Oberfläche des Strömungssystems eingeschränkt wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 25, worin der Fraktalbereich bei der in Schritt (i) vorgesehenen Vorrichtung weiters Verbindungen in Fluidkommunikation mit den sekundären Strömungskanälen umfaßt, die zu einem dritten Kanal im Strömungssystem führen.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 26, worin in Schritt (iii) die Einschränkung oder Blockierung elektrisch oder optisch bestimmt wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 27, worin der Fraktalbereich weiters eine Bindungsgruppe zur Bindung einer Komponente der Probe umfaßt.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 28, worin der Fraktalbereich Teilchen enthält, die sich mit einer Komponente der Probe verbinden, um Teilchenagglomeration herbeizuführen.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 29, worin das in Schritt (i) bereitgestellte Substrat weiters einen Vergleichsbereich in Fluidkommunikation mit der Probeneinlaßöffnung umfaßt; und

worin in Schritt (iii) das Strömen der Probe im Fraktalbereich und im Vergleichsbereich bestimmt und miteinander verglichen wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 30, worin der Analyt einen replizierbaren prokaryotischen Organismus umfaßt; und

worin in Schritt (iii) die Einschränkung oder Blockierung des Strömens des Organismus durch das Strömungssystem hindurch als Indikator für die Gegenwart des Organismus dient.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 31, worin in Schritt (ii) eine Pumpe eingesetzt wird, um die Probe durch das Strömungssystem hindurch zu befördern.