WO2017076776A1 - Mikroskop für die durchlicht- und fluoreszenzmikroskopie - Google Patents

Mikroskop für die durchlicht- und fluoreszenzmikroskopie Download PDF

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WO2017076776A1
WO2017076776A1 PCT/EP2016/076117 EP2016076117W WO2017076776A1 WO 2017076776 A1 WO2017076776 A1 WO 2017076776A1 EP 2016076117 W EP2016076117 W EP 2016076117W WO 2017076776 A1 WO2017076776 A1 WO 2017076776A1
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fluorescence
bright field
beam path
multiband
filter
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PCT/EP2016/076117
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Benjamin DEISSLER
Christian Schumann
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence microscope with a
  • Fluorescence Auflicht illumination unit for generating a Fluoreszenzauflicht- illumination beam path
  • a multiband fluorescence filter system comprising a multiband beam splitter for deflecting the fluorescence Auflicht- illumination beam path or provided for fluorescence excitation illumination light in a lens of the fluorescence microscope and on an object to be examined, the multi-band fluorescence filter system a
  • Fluorescence emission beam path The invention further relates to a method for generating a bright field image of an object using a fluorescence microscope.
  • Fluorescence microscopy plays a major role in many scientific disciplines as a diagnostic tool.
  • Fluorescence microscopy is the irradiation of a sample with short wavelength
  • Excitation radiation wherein the sample itself or a fluorescent dye with which the sample is stained, when excited with the short-wave excitation radiation longer-wavelength fluorescent light emitted (primary or secondary fluorescence).
  • primary or secondary fluorescence the secondary fluorescence is usually used to visualize certain object structures of stained specimens. This can be used, for example, to determine pathogens, to localize genes or to determine genetic changes in a DNA to be examined or to visualize protein formations in cells.
  • a specific examination method with specific fluorescent dyes the so-called fluorochromes, is available.
  • Typical examples are excitations with UV light for the dye "DAPI”, with blue light for the dye "FITC” or with green light for the dyes "Texas red” or "rhodamine”. Typical excitation frequencies are in the
  • Incident light fluorescence microscope which has a high-power LED that emits blue light in a spectral range from 460 to 480 nm.
  • Fluorescence filter systems so far consist of a coordinated combination of an excitation filter, a dichromatic divider and a blocking filter.
  • the dichromatic divider reflects the excitation radiation passing through the excitation filter toward the specimen.
  • the dichromatic divider is however, transparent to the fluorescent light emitted by the specimen.
  • fluorescent radiation has the highest permeability.
  • the various fluorescence filter systems are usually located on a changer, e.g. designed as a slide or carousel.
  • a changer e.g. designed as a slide or carousel.
  • DE 10 2007 007 797 A1 relates to a fluorescence microscope with a
  • the illumination device comprises a plurality of light emitting diodes with upstream collectors for generating a directed light flux, wherein the associated light fluxes are combined by dichromatic dividers to form a common illumination beam path, which in turn strikes a multiband excitation filter of a multi-band fluorescence filter system.
  • the latter includes a multi-band beam splitter and a multi-band notch filter.
  • the multiband excitation filter is permeable to the wavelength ranges of the respective light-emitting diodes, while the multiband rejection filter is as opaque as possible for these wavelength ranges, whereas the corresponding emission bands transmit the fluorescence radiation emitted by the object.
  • the control of the light emitting diodes via a common logic control device to between
  • Bright field imaging uses fluorescence filter changing devices which are elaborately constructed and cost-intensive to manufacture and, moreover, are slow in switching between fluorescence and bright field imaging.
  • Object of the present invention is to provide a compact and for the
  • Specify fluorescence microscope by means of which can be switched in a simple manner between a fluorescence image and a bright field image.
  • the fluorescence microscope according to the invention has a bright field transmitted light illumination unit for generating a bright field transmitted light illumination beam path for transmitted light illumination of the object.
  • the multiband fluorescence filter system of the fluorescence microscope is fixedly or optically effectively arranged in the beam path and remains even when receiving a
  • the digital camera To generate a bright field image from the brightfield transmitted light beam path transmitted by the digital camera of the fluorescence microscope and transmitted through the multiband cutoff filter of the multiband fluorescence filter system, the digital camera has a
  • Fluorescence microscope remains stationary in such a switching in the respective beam paths and therefore can be permanently installed.
  • An elaborate fluorescence filter changing device which also only time-delayed
  • the bright field transmitted light beam emanating from the object passes through the lens of the fluorescence microscope into the multiband fluorescence filter system, where the multiband beam splitter and the multiband blocking filter determine
  • wavelength ranges correspond to the emission bands that are captured by the digital camera to produce a fluorescence image of the object.
  • Bright field transmitted light illumination unit is preferably a white LED used. Immediately in front of the light source or the white LED can
  • the shutter can be made small and thus moved quickly.
  • the purpose of this shutter is to suppress fluorescent light of the conversion layer in the white LED in the fluorescence image.
  • Emission spectrum of this light source includes the aforementioned emission bands, which transmits the multiband cutoff filter.
  • Bright field imaging of the object would result in deviations in color reproduction without further measures. These can be compensated as part of a white balance of the digital camera.
  • a sample area without absorption should be available. This can be done either by removing the object from the beam path
  • the white balance data can of course also be stored or supplied as a manufacturer's calibration. So basically the white balance can be done once and the white balance data can be saved. Subsequently, only the stored data must be applied to the recorded image. So it is not mandatory, after each switching to the
  • Bright field transmitted light beam path to perform a new white balance
  • the multiband fluorescence filter system such that a broad selection of fluorescent dyes can be used.
  • electronically switchable wavelength-limited solid-state light sources it is possible to quickly switch between different excitation bands and, accordingly, between different emission bands. You can also use several excitation bands at the same time. Also allow
  • Solid-state light sources with sharply defined wavelength ranges dispenses with the mechanical switching of excitation filters.
  • solid-state light sources come in the first line light emitting diodes (LEDs) or semiconductor lasers in question.
  • the emission filter Prevent fluorescence channels.
  • the emission filter is arranged in the vicinity of an intermediate image of the object and / or directly in front of the digital camera.
  • digital cameras have an adapter for connecting filters, whereby the aforementioned emission filter can also be used here.
  • such an emission filter should be placed in a location of small beam diameter.
  • crosstalk of the fluorescence channels can also be avoided by means of linear demixing algorithms on the basis of the recorded digital images. This method is termed "linear unmixing" and is well known in the art.
  • Solid-state light sources in the fluorescence incident illumination unit of a fluorescence microscope according to the invention are expressly made to the already mentioned DE 10 2007 007 797 AI the applicant.
  • control unit which on the one hand with the
  • control unit communicates with the digital camera electronically in such a way that at a Switching on or activating the bright field transmitted illumination, the white balance function of the digital camera is activated to perform a white balance before generating the bright field image of the object.
  • the invention further relates to a method for producing a
  • Bright field imaging of an object using a fluorescence microscope in which case in particular a fluorescence microscope according to the invention as described above is used.
  • the fluorescence microscope used has a bright field illumination unit for generating a bright field transmitted light illumination beam path for transmitted light illumination of the object.
  • a multiband fluorescence filter system of the fluorescence microscope remains in a bright field transmitted light beam path emanating from the object, so that it initially passes the objective of the fluorescence microscope and then the multiband fluorescence filter system.
  • a digital camera of the fluorescence microscope first performs a white balance before a camera from this
  • Bright field image of the object is generated.
  • transmitted by the multiband fluorescence filter system Hellfell monétique path is recorded and processed by the digital camera of the fluorescence microscope, wherein a tube lens of the fluorescence microscope in the usual way for the appropriate focus on the receiving array of the camera.
  • FIG. 1 shows a fluorescence microscope according to the invention, which is denoted overall by 100.
  • This fluorescence microscope 100 has a conventional manner
  • Fluorescence incident illumination unit 101 for generating a
  • Lighting unit 101 is shown here only very schematically. Actually, the lighting unit 101 includes one or more
  • Solid state light sources such as LEDs, which can be switched back and forth between several light sources by means of a known control between these light sources or multiple light sources can be operated simultaneously.
  • Solid-state light source passes excitation light in the form of Fluoreszenzauflicht- illumination beam path 201 in a multi-band fluorescence filter system 105th
  • a multi-band excitation filter may be provided, but at Use of solid-state light sources with sufficient severely limited emission spectrum can be omitted.
  • the fluorescence incident light illumination beam path 201 then passes to a multiband beam splitter 109 for deflecting the illumination beam path 201 into an objective 104 of the fluorescence microscope 100.
  • the illumination beam path 201 is focused by the objective 104 into the plane of the object 103.
  • Fluorescence emission radiation generated by the object 103 passes in the form of the fluorescence emission beam path 202 through the objective 104 back into the multiband fluorescence filter system 105. There it passes the multiband fluorescence filter system 105.
  • the emission band thus transmitted is then available for generating a fluorescence image of the object 103.
  • the fluorescence emission beam path 202 via the tube lens 106 of the fluorescence microscope 100 and (not shown here, optional) camera lenses on the photosensitive
  • the fluorescence microscope 100 has in the illustrated embodiment of Figure 1 also has a bright field transmitted light illumination unit (102) for transmitted illumination of the object 103.
  • the Object 103 carrying microscope stage designed accordingly for transmitted light illumination.
  • the bright field transmitted light illumination beam path 204 generated by this illumination unit 102 illuminates the object 103.
  • the bright field transmitted light illumination unit 102 is shown only very schematically.
  • a light source for example, a white LED can be used here.
  • the bright field transmitted light beam path 203 originating from the object 103 passes through the objective 104 as well as the permanently installed multiband fluorescence filter system of the fluorescence microscope 100. Consequently, the emission bands which generate the multiband Fluorescence filter system 105 transmits, provided that these emission bands are also originally emitted by the bright field transmitted light illumination unit.
  • the digital camera 107 can receive and process the bright field transmitted light beam path to the
  • Bright field image of the object 103 to produce Due to the limitation to the mentioned emission bands, a white balance of the digital camera 107 is carried out to compensate for deviations in the color reproduction prior to the generation of the bright field image. In this way it is possible to use a fluorescence microscope next to it
  • Fluorescence images also bright field images of an object 103 to produce. This is desirable in many cases.
  • the switching between fluorescence and bright field imaging can be carried out in a purely electronic way without mechanical changing devices.
  • a control unit 300 which is in operative connection with the fluorescence illumination unit 101 and with the bright field transmission illumination unit 102, i. the respective lighting unit electronically activates to activate the respective type of lighting.
  • the digital camera 107 is actuated in parallel by the control unit 300, in which the white balance function of the camera 107 is activated by appropriate electronic signals before the camera 107 subsequently generates bright-field images of the object 103.
  • an emission filter 108 may be provided in the fluorescence emission beam path 202, which may in particular be an emission filter wheel with a plurality of emission filters.
  • This emission filter wheel serves for the clean separation of the fluorescence channels, in that an emission filter cuts off a transmitted emission band defined on both sides.
  • Such an emission filter 108 or emission filter wheel would have to generate a
  • Bright field image of the object 103 are removed from the beam path. Therefore It may also be expedient to prevent the possible crosstalk of the fluorescence channels in an electronic or software-based manner. Linear demixing algorithms for the recorded digital images are available for this purpose.
  • Fluorescence incident light illumination unit 101 Fluorescence incident light illumination unit 102 Bright field transmitted light illumination unit
  • Multiband blocking filter 201 Fluorescence incident light illumination beam path

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop (100) mit einer Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit (101) zur Erzeugung eines Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungsstrahlengangs (201), einem Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) umfassend einen Multiband-Strahlenteiler (109) zur Umlenkung des Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungsstrahlengangs (201) in ein Objektiv (104) des Fluoreszenzmikroskops (100) und auf ein zu untersuchendes Objekt (103), wobei das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) ein Multiband-Sperrfilter (110) aufweist, das einen von dem Objekt (103) ausgehenden Fluoreszenzemissionsstrahlengang (202) zumindest zum Teil transmittiert, und einer digitalen Kamera (107) zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung des Objekts (103) aus dem aufgenommenen Fluoreszenzemissionsstrahlengang (202), wobei das Fluoreszenzmikroskop (100) eine Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit (102) zur Erzeugung eines Hellfelddurchlicht-Beleuchtungsstrahlengangs (204) zur Durchlichtbeleuchtung des Objekts (103) aufweist, wobei das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) fest angeordnet ist, so dass es bei Aufnahme einer Hellfeldabbildung des Objekts (103) in einem vom Objekt (103) ausgehenden Hellfelddurchlicht-Strahlengang (203) verbleibt, und wobei die digitale Kamera (107) zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung aus dem aufgenommenen, durch das Multiband-Sperrfilter (110) des Multiband-Fluoreszenzfiltersystems (105) transmittierten Hellfelddurchlicht-Strahlengang (203) über eine Weißabgleichsfunktion verfügt, die vor der Erzeugung der Hellfeldabbildung ausgeführt wird. Dieses Fluoreszenzmikroskop (100) ermöglicht eine einfache Umschaltung zwischen Fluoreszenzabbildung und Hellfeldlichtabbildung eines Objekts.

Description

Mikroskop für die Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einer
Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit zur Erzeugung eines Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungsstrahlengangs, einem Multiband-Fluoreszenzfiltersystem umfassend einen Multiband-Strahlenteiler zur Umlenkung des Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungsstrahlengangs bzw. des zur Fluoreszenzanregung vorgesehenen Beleuchtungslichts in ein Objektiv des Fluoreszenzmikroskops und auf ein zu untersuchendes Objekt, wobei das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem ein
Multiband-Sperrfilter aufweist, das einen von dem Objekt ausgehenden
Fluoreszenzemissionsstrahlengang bzw. vom Objekt ausgehendes Fluoreszenzlicht zumindest zum Teil transmittiert, und mit einer digitalen Kamera zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung des Objekts aus dem aufgenommenen
Fluoreszenzemissionsstrahlengang. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung eines Objekts unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops.
Die Fluoreszenzmikroskopie spielt in vielen naturwissenschaftlichen Disziplinen als diagnostisches Werkzeug eine große Rolle. Grundprinzip der
Fluoreszenzmikroskopie ist die Bestrahlung einer Probe mit kurzwelliger
Erregerstrahlung, wobei die Probe selbst oder ein fluoreszierender Farbstoff, mit dem die Probe angefärbt ist, bei Anregung mit der kurzwelligen Erregerstrahlung längerwelliges Fluoreszenzlicht emittiert (Primär- bzw. Sekundär-Fluoreszenz). Für die Fluoreszenzmikroskopie wird in der Regel die Sekundär-Fluoreszenz ausgenutzt, um bestimmte Objektstrukturen von angefärbten Präparaten sichtbar zu machen. Hiermit lassen sich beispielsweise Krankheitserreger bestimmen, Gene lokalisieren oder genetische Veränderungen einer zu untersuchenden DNA bestimmen oder auch Proteinbildungen in Zellen visualisieren. Je nach Anwendung steht eine bestimmte Untersuchungsmethode mit spezifischen fluoreszierenden Farbstoffen, den sogenannten Fluorochromen zur Verfügung. Typisch sind beispielsweise Anregungen mit UV-Licht für den Farbstoff "DAPI", mit blauem Licht für den Farbstoff "FITC" oder mit grünem Licht für die Farbstoffe "Texas red" oder "Rhodamin". Typische Anregungsfrequenzen liegen im
ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich.
Herkömmlicherweise wurden als Lichtquellen üblicherweise Kurzbogenlampen mit Hg- oder Xe-Füllung oder Halogenlampen eingesetzt. Mittels verschiedener (wechselbarer) dielektrischer Filter, den sogenannten Anregungsfiltern, kann aus dem Spektralbereich der Lichtquelle der für die Anregung eines Fluorochroms passende Spektralbereich ausgewählt werden. Die genannten Lampen werden heutzutage durch Leuchtdioden oder LEDs ("light emitting diode") als Lichtquellen für Fluoreszenzmikroskope verdrängt.
Beispielsweise ist aus der DE 20 2004 010 121 Ul eine Lichtquelle für ein
Auflichtfluoreszenzmikroskop bekannt, die eine Hochleistungs-LED aufweist, die blaues Licht in einem Spektralbereich von 460 bis 480 nm aussendet.
Aus der EP 1 593 996 A2 ist ein System mit zwei Leuchtdioden bekannt, deren Beleuchtungsstrahlengänge über einen dichromatischen Teiler zusammengeführt und auf ein Fluoreszenzfilter-System geleitet werden. Typischerweise wird mit verschiedenen Fluoreszenzfilter-Systemen, auch als Filterblocks oder Filterwürfel bezeichnet, gearbeitet, um verschiedene
Einfärbungen eines Präparates sichtbar machen zu können. Diese
Fluoreszenzfilter-Systeme bestehen bisher aus einer aufeinander abgestimmten Kombination eines Anregungsfilters, eines dichromatischen Teilers und eines Sperrfilters. Der dichromatische Teiler reflektiert die Anregungsstrahlung, die das Anregungsfilter passieren lässt, zum Präparat hin. Der dichromatische Teiler ist jedoch transparent für das vom Präparat emittierte Fluoreszenzlicht. Das
Sperrfilter hält vom Präparat gestreutes und in das Objektiv eingetretenes
Anregungslicht zurück. Für die spezifische vom Objekt abgegebene
Fluoreszenzstrahlung besitzt es jedoch höchste Durchlässigkeit.
Die verschiedenen Fluoreszenzfilter-Systeme befinden sich üblicherweise auf einer Wechseleinrichtung, die z.B. als Schieber oder Karussell ausgeführt ist. Die
Bedienung erfolgt hierbei manuell und/oder motorisch. Die DE 10 2007 007 797 AI betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einer
Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinrichtung. Die Beleuchtungseinrichtung umfasst mehrere Leuchtdioden mit vorgeschalteten Kollektoren zur Erzeugung eines gerichteten Lichtflusses, wobei die zugehörigen Lichtflüsse mittels dichromatischer Teiler zu einem gemeinsamen Beleuchtungsstrahlengang zusammengeführt werden, der seinerseits auf ein Multiband-Anregungsfilter eines Multiband-Fluoreszenzfiltersystems trifft. Letzteres umfasst einen Multiband- Strahlteiler sowie ein Multiband-Sperrfilter. Das Multiband-Anregungsfilter ist für die Wellenlängenbereiche der jeweiligen Leuchtdioden durchlässig, während das Multiband-Sperrfilter für diese Wellenlängenbereiche möglichst undurchlässig ist, hingegen die entsprechenden Emissionsbänder der vom Objekt abgegebenen Fluoreszenzstrahlung transmittiert. Die Ansteuerung der Leuchtdioden erfolgt über eine gemeinsame logische Steuereinrichtung, um zwischen
Anregungswellenlängen schnell umschalten zu können. Eine
Hellfelddurchlichtbeobachtung des Objekts ist bei dem dort beschriebenen
Fluoreszenzmikroskop nicht vorgesehen.
Neben der Fluoreszenzauflichtmikroskopie ist es häufig wünschenswert, die Objektstrukturen auch mittels Hellfelddurchlichtmikroskopie zu untersuchen bzw. zu betrachten. Zur Umschaltung zwischen Fluoreszenzabbildung und
Hellfeldabbildung werden Fluoreszenzfilterwechselvorrichtungen genutzt, die aufwendig konstruiert und kostenintensiv herzustellen sind und überdies langsam in der Umschaltung zwischen Fluoreszenz- und Hellfeldabbildung sind.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es, eine kompakt bauende und für den
Anwender in einfacher Weise bedienbare Anordnung zur
fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von Objekten mit einem
Fluoreszenzmikroskop anzugeben, mittels derer in ebenso einfacher Weise zwischen einer Fluoreszenzabbildung und einer Hellfeldabbildung umgeschaltet werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Fluoreszenzmikroskop gemäß Anspruch 1 sowie ein Verfahren zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung eines Objekts unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Anspruch 8 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen
Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Das erfindungsgemäße Fluoreszenzmikroskop weist eine Hellfelddurchlicht- Beleuchtungseinheit zur Erzeugung eines Hellfelddurchlicht- Beleuchtungsstrahlengangs zur Durchlichtbeleuchtung des Objekts auf.
Entsprechend ist dafür zu sorgen, dass der das Objekt tragende Mikroskoptisch eine Durchlichtbeleuchtung des Objekts erlaubt. Das Multiband- Fluoreszenzfiltersystem des Fluoreszenzmikroskops ist fest bzw. optisch wirksam im Strahlengang angeordnet und verbleibt auch bei Aufnahme einer
Hellfeldabbildung des Objekts in einem vom Objekt ausgehenden
Hellfelddurchlicht-Strahlengang. Zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung aus dem von der digitalen Kamera des Fluoreszenzmikroskops aufgenommenen, durch das Multiband-Sperrfilter des Multiband-Fluoreszenzfiltersystems transmittierten Hellfelddurchlicht-Strahlengang verfügt die digitale Kamera über eine
Weißabgleichsfunktion, die vor der Erzeugung der Hellfeldabbildung ausgeführt wird. Durch dieses erfindungsgemäß ausgestaltete Fluoreszenzmikroskop ist es möglich, zwischen Hellfeldabbildungen und Fluoreszenzabbildungen eines Objekts hin und her zu schalten, wobei hierzu lediglich die Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungseinheit und die Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit entsprechend angesteuert werden müssen. Das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem des
Fluoreszenzmikroskops verbleibt bei einer solchen Umschaltung ortsfest in den jeweiligen Strahlengängen und kann daher fest verbaut sein. Eine aufwändige Fluoreszenzfilterwechselvorrichtung, die zudem nur zeitverzögerte
Umschaltungen zulässt, kann erfindungsgemäß entfallen.
Der vom Objekt ausgehende Hellfelddurchlicht-Strahlengang gelangt über das Objektiv des Fluoreszenzmikroskops in das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem, wo der Multiband-Strahlteiler und das Multiband-Sperrfilter bestimmte
Wellenlängenbereiche transmittieren. Diese Wellenlängenbereiche entsprechen den Emissionsbändern, die zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung des Objekts von der digitalen Kamera aufgenommen werden. Als Lichtquelle der
Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit wird vorzugsweise eine weiße LED eingesetzt. Unmittelbar vor der Lichtquelle bzw. der weißen LED kann ein
Verschluss vorsehen sein. Da eine weiße LED kleine Ausmaße aufweist, kann auch der Verschluss klein ausgebildet sein und somit schnell bewegt werden. Aufgabe dieses Verschlusses ist es, Fluoreszenzlicht der Konversionsschicht in der weißen LED in der Fluoreszenzabbildung zu unterdrücken. Das breitbandige
Emissionsspektrum dieser Lichtquelle umfasst die genannten Emissionsbänder, die das Multiband-Sperrfilter transmittiert. Bei der Erzeugung einer
Hellfeldabbildung des Objekts würden sich ohne weitere Maßnahmen deshalb Abweichungen in der Farbwiedergabe ergeben. Diese können im Rahmen eines Weißabgleichs der digitalen Kamera kompensiert werden. Für den Weißabgleich sollte vorzugsweise ein Probenbereich ohne Absorption zur Verfügung stehen. Dies kann entweder durch Entfernen des Objekts aus dem Strahlengang
geschehen, oder durch Aufsuchen eines transparenten Bereichs auf dem
Objektträger. Durch den festen Verbau des Multibandfiltersystems und die konstante Farbtemperatur weißer LEDs können die Weißabgleichdaten natürlich auch abgespeichert werden bzw. als Herstellerkalibration geliefert werden. So kann grundsätzlich der Weißabgleich einmal durchgeführt werden und die Weißabgleichdaten können gespeichert werden. Anschließend müssen nur noch die abgespeicherten Daten auf das aufgenommene Bild angewandt werden. Es ist also nicht zwingend erforderlich, nach jedem Umschalten auf den
Hellfelddurchlicht-Strahlengang einen erneuten Weißabgleich durchzuführen.
Prinzipiell gilt, je mehr vom Multiband-Sperrfilter transmittierte Emissionsbänder zur Erzeugung der Hellfeldabbildung zur Verfügung stehen, desto besser die
Qualität der Hellfeldabbildung. Es ist besonders vorteilhaft, wenn mindestens drei Emissionsbänder durch das Multiband-Sperrfilter (und somit auch durch den Multiband-Strahlteiler) des Multiband-Fluoreszenzfiltersystems transmittiert werden.
Für die Erzeugung von Fluoreszenzabbildungen ist es vorteilhaft, das Multiband- Fluoreszenzfiltersystem geeignet so zu wählen, dass eine breite Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen genutzt werden kann. Durch die Nutzung von elektronisch schaltbaren wellenlängenbegrenzten Festkörperlichtquellen kann schnell zwischen verschiedenen Anregungsbändern und dementsprechend zwischen verschiedenen Emissionsbändern umgeschaltet werden. Es lassen sich auch mehrere Anregungsbänder gleichzeitig nutzen. Außerdem erlauben
Festkörperlichtquellen mit scharf definierten Wellenlängenbereichen den Verzicht auf eine mechanische Schaltung von Anregungsfiltern. Als Festkörperlichtquellen kommen in ersten Linie Leuchtdioden (LEDs) oder Halbleiterlaser in Frage.
Da das erfindungsgemäße Fluoreszenzmikroskop, wie oben erläutert, auf eine mechanische Wechselung zwischen der Abbildung der einzelnen
Fluoreszenzkanäle verzichten kann, wird die Umschaltzeit nur noch durch elektronische Vorgänge bei der Ansteuerung der Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungseinheit begrenzt. Ein eventuelles Übersprechen der Fuoreszenzkanäle, die den jeweils transmittierten Emissionsbändern entsprechen, lässt sich durch zusätzliche Nutzung eines Emissionsfilters begrenzen. Ein solcher Emissionsfilter schneidet ein transmittiertes Emissionsband zu beiden Seiten des Emissionsmaximums definiert ab und kann damit ein Übersprechen der
Fluoreszenzkanäle verhindern. In diesem Fall ist es vorteilhaft, das Emissionsfilter als Teil eines mechanisch bewegten Emissionsfilterrades auszubilden. Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn das Emissionsfilter in der Nähe eines Zwischenbildes des Objekts und/oder unmittelbar vor der digitalen Kamera angeordnet ist. Häufig besitzen digitale Kameras einen Adapter für das Zuschalten von Filtern, wobei hier auch das genannte Emissionsfilter eingesetzt werden kann. Generell sollte ein solches Emissionsfilter an einem Ort eines kleinen Strahldurchmessers angeordnet werden.
Alternativ kann ein Übersprechen der Fluoreszenzkanäle auch durch lineare Entmischungsalgorithmen anhand der aufgenommenen Digitalbilder vermieden werden. Diese Methode wird als "linear unmixing" bezeichnet und ist im Stand der Technik allgemein bekannt.
Bezüglich der Möglichkeiten der elektronischen Schaltung der
Festkörperlichtquellen in der Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskops sei ausdrücklich auf die bereits erwähnte DE 10 2007 007 797 AI der Anmelderin verwiesen.
Zur Umschaltung zwischen Hellfeldabbildung und Fluoreszenzabbildung ist es zweckmäßig, eine Steuereinheit einzusetzen, die zum einen mit der
Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit und zum anderen mit der
Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit derart elektronisch in Verbindung steht, dass durch entsprechende Steuersignale entweder die
Fluoreszenzauflichtbeleuchtung oder die Hellfelddurchlichtbeleuchtung der jeweiligen Beleuchtungseinheiten aktiviert wird. Zusätzlich steht die Steuereinheit mit der digitalen Kamera elektronisch derart in Verbindung, dass bei einem Umschalten auf die bzw. einem Aktivieren der Hellfelddurchlichtbeleuchtung die Weißabgleichsfunktion der digitalen Kamera aktiviert wird, um vor Erzeugung der Hellfeldabbildung des Objekts einen Weißabgleich auszuführen. Erfindungsgemäß kann somit auf mechanische Wechselvorrichtungen bei der
Umschaltung zwischen den genannten Beleuchtungsarten ganz verzichtet werden. Dies spart Kosten und Bauteile und minimiert die zur Umschaltung zwischen den Beleuchtungsarten erforderliche Zeit. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung einer
Hellfeldabbildung eines Objekts unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, wobei hier insbesondere ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzmikroskop wie es oben geschildert wurde, eingesetzt wird. Das eingesetzte Fluoreszenzmikroskop weist eine Hellfeld-Beleuchtungseinheit zur Erzeugung eines Hellfelddurchlicht- Beleuchtungsstrahlengangs zur Durchlichtbeleuchtung des Objekts auf. Zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung verbleibt ein Multiband- Fluoreszenzfiltersystem des Fluoreszenzmikroskops in einem vom Objekt ausgehenden Hellfelddurchlicht-Strahlengang, sodass dieser zunächst das Objektiv des Fluoreszenzmikroskops und anschließend das Multiband- Fluoreszenzfiltersystem passiert. Eine digitale Kamera des Fluoreszenzmikroskops führt zunächst einen Weißabgleich durch, bevor von dieser Kamera eine
Hellfeldabbildung des Objekts erzeugt wird. Hierzu wird der vom Multiband- Fluoreszenzfiltersystem transmittierte Hellfelldurchlicht-Strahlengang von der digitalen Kamera des Fluoreszenzmikroskops aufgenommen und verarbeitet, wobei eine Tubuslinse des Fluoreszenzmikroskops in üblicher Weise für die entsprechende Fokussierung auf das Aufnahmearray der Kamera sorgt.
Bezüglich Einzelheiten und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie bezüglich weiterer Ausgestaltungen dieses Verfahrens sei auf die Erläuterungen zum erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskop verwiesen, die in analoger Weise auf das erfindungsgemäße Verfahren übertragen werden können. Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der
Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzmikroskop, das insgesamt mit 100 bezeichnet ist.
Dieses Fluoreszenzmikroskop 100 weist in üblicher Weise eine
Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit 101 zur Erzeugung eines
Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungsstrahlengangs 201 auf. Diese
Beleuchtungseinheit 101 ist hier lediglich sehr schematisch dargestellt. Tatsächlich beinhaltet die Beleuchtungseinheit 101 einen oder mehrere
Festkörperlichtquellen, wie LEDs, wobei bei mehreren Lichtquellen mittels einer an sich bekannten Ansteuerung zwischen diesen Lichtquellen hin und her geschaltet werden kann oder mehrere Lichtquellen gleichzeitig betrieben werden können. Diesbezüglich sei nochmals explizit auf die schon genannte
DE 10 2007 007 797 AI verwiesen. Entsprechend der aktivierten
Festkörperlichtquelle gelangt Anregungslicht in Form des Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungsstrahlengangs 201 in ein Multiband-Fluoreszenzfiltersystem 105.
Hier kann zunächst ein Multiband-Anregungsfilter vorgesehen sein, der jedoch bei Verwendung von Festkörperlichtquellen mit ausreichen stark abgegrenztem Emissionsspektrum entfallen kann. Der Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungsstrahlengang 201 gelangt dann auf einen Multiband-Strahlenteiler 109 zur Umlenkung des Beleuchtungsstrahlengangs 201 in ein Objektiv 104 des Fluoreszenzmikroskops 100. Der Beleuchtungsstrahlengang 201 wird durch das Objektiv 104 in die Ebene des Objekts 103 fokussiert.
Von dem Objekt 103 erzeugte Fluoreszenzemissionsstrahlung gelangt in Form des Fluoreszenzemissionsstrahlengangs 202 durch das Objektiv 104 zurück in das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem 105. Dort passiert es den Multiband-
Strahlteiler 109 und das Multiband-Sperrfilter 110. Das derart transmittierte Emissionsband steht anschließend zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung des Objekts 103 zur Verfügung. Hierzu wird der Fluoreszenzemissionsstrahlengang 202 über die Tubuslinse 106 des Fluoreszenzmikroskops 100 und (hier nicht weiter dargestellte, optionale) Kameralinsen auf das lichtempfindliche
Aufnahmearray der digitalen Kamera 107 des Fluoreszenzmikroskops 100 fokussiert. Aufnahme und Verarbeitung des auftreffenden Lichts führt in an sich bekannter Weise zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung des Objekts 103. Das Fluoreszenzmikroskop 100 verfügt in dem dargestellten Ausführungsbeispiel gemäß Figur 1 außerdem über eine Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit (102) zur Durchlichtbeleuchtung des Objekts 103. Hierzu ist der das Objekt 103 tragende Mikroskoptisch entsprechend für eine Durchlichtbeleuchtung ausgelegt. Der von dieser Beleuchtungseinheit 102 erzeugte Hellfelddurchlicht- Beleuchtungsstrahlengang 204 durchleuchtet das Objekt 103. Wiederrum ist die Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit 102 nur sehr schematisch dargestellt. Als Lichtquelle kann hier beispielsweise eine weiße LED verwendet werden. Der vom Objekt 103 ausgehende Hellfelddurchlicht-Strahlengang 203 durchläuft das Objektiv 104 sowie das fest verbaute Multiband-Fluoreszenzfiltersystem des Fluoreszenzmikroskops 100. Folglich stehen zur Erzeugung der Hellfeldabbildung diejenigen Emissionsbänder zur Verfügung, die das Multiband- Fluoreszenzfiltersystem 105 transmittiert, sofern diese Emissionsbänder auch ursprünglich von der Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit abgestrahlt werden. Über Tubuslinse 106 und etwaige Kameralinsen kann die digitale Kamera 107 den Hellfelddurchlicht-Strahlengang aufnehmen und verarbeiten, um die
Hellfeldabbildung des Objekts 103 zu erzeugen. Aufgrund der Beschränkung auf die genannten Emissionsbänder wird zur Kompensation von Abweichungen in der Farbwiedergabe vor Erzeugung der Hellfeldabbildung ein Weißabgleich der digitalen Kamera 107 ausgeführt. Auf diese Weise ist es möglich, mit einem Fluoreszenzmikroskop neben
Fluoreszenzabbildungen auch Hellfeldabbildungen eines Objekts 103 zu erzeugen. Dies ist in vielen Fällen wünschenswert. Insbesondere kann die Umschaltung zwischen Fluoreszenz- und Hellfeldabbildung auf rein elektronischem Weg ohne mechanische Wechselvorrichtungen vorgenommen werden. Hierzu ist es zweckmäßig, eine Steuereinheit 300 vorzusehen, die mit der Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungseinheit 101 sowie mit der Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit 102 in Wirkverbindung steht, d.h. die jeweilige Beleuchtungseinheit elektronisch ansteuert um die jeweilige Beleuchtungsart zu aktivieren. Bei einer Aktivierung der Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit 102 wird parallel die digitale Kamera 107 von der Steuereinheit 300 angesteuert, in dem durch entsprechende elektronische Signale zunächst die Weißabgleichsfunktion der Kamera 107 aktiviert wird, bevor die Kamera 107 anschließend Hellfeldabbildungen des Objekts 103 erzeugt. Optional kann im Fluoreszenzemissionsstrahlengang 202 ein Emissionsfilter 108 vorgesehen sein, wobei es sich hier insbesondere um ein Emissionsfilterrad mit mehreren Emissionsfiltern handeln kann. Dieses Emissionsfilterrad dient der sauberen Trennung der Fluoreszenzkanäle, indem ein Emissionsfilter ein transmittiertes Emissionsband zu beiden Seiten definiert abschneidet. Eine solches Emissionsfilter 108 bzw. Emissionsfilterrad müsste vor der Erzeugung einer
Hellfeldabbildung des Objekts 103 aus dem Strahlengang entfernt werden. Deshalb kann es auch zweckmäßig sein, das mögliche Übersprechen der Fluoreszenzkanäle auf elektronische bzw. softwarebasierte Art zu verhindern. Hierfür stehen lineare Entmischungsalgorithmen für die aufgenommenen Digitalbilder zur Verfügung.
Bezugszeichenliste
100 Fluoreszenzmikroskop
101 Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit 102 Hellfelddurchlicht- Beleuchtungseinheit
103 Objekt
104 Objektiv
105 Multiband-Fluoreszenzfiltersystem
106 Tubuslinse
107 Kamera
108 Emissionsfilter
109 Multiband-Strahlteiler
110 Multiband-Sperrfilter 201 Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungsstrahlengang
202 Fluoreszenzemissionsstrahlengang
203 Hellfelddurchlichtstrahlengang
204 Hellfelddurchlicht-Beleuchtungsstrahlengang 300 Steuereinheit

Claims

Patentansprüche
1. Fluoreszenzmikroskop (100) mit
einer Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit (101) zur Erzeugung eines Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungsstrahlengangs (201),
einem Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) umfassend einen Multiband- Strahlenteiler (109) zur Umlenkung des Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungsstrahlengangs (201) in ein Objektiv (104) des
Fluoreszenzmikroskops (100) und auf ein zu untersuchendes Objekt (103), wobei das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) ein Multiband-Sperrfilter (110) aufweist, das einen von dem Objekt (103) ausgehenden
Fluoreszenzemissionsstrahlengang (202) zumindest zum Teil transmittiert, und einer digitalen Kamera (107) zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung des
Objekts (103) aus dem aufgenommenen Fluoreszenzemissionsstrahlengang (202) dadurch gekennzeichnet, dass
das Fluoreszenzmikroskop (100) eine Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit
(102) zur Erzeugung eines Hellfelddurchlicht-Beleuchtungsstrahlengangs (204) zur Durchlichtbeleuchtung des Objekts (103) aufweist,
wobei das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) fest angeordnet ist, so dass es bei Aufnahme einer Hellfeldabbildung des Objekts (103) in einem vom Objekt
(103) ausgehenden Hellfelddurchlicht-Strahlengang (203) verbleibt, und wobei die digitale Kamera (107) zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung aus dem aufgenommenen, durch das Multiband-Sperrfilter (110) des Multiband-
Fluoreszenzfiltersystems (105) transmittierten Hellfelddurchlicht-Strahlengang (203) über eine Weißabgleichsfunktion verfügt, die vor der Erzeugung der Hellfeldabbildung ausgeführt wird.
2. Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Multiband-Sperrfilter (110) des Multiband-Fluoreszenzfiltersystems (105) mindestens drei Emissionsbänder transmittiert.
3. Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Emissionsfilter (108) vorgesehen ist, das die vom
Multiband-Sperrfilter (110) transmittierte Strahlung zusätzlich filtert.
4. Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Emissionsfilter (108) als Teil eines Emissionsfilterrades ausgebildet ist.
5. Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 3 oder 4, dadurch
gekennzeichnet, dass das Emissionsfilter (108) in der Nähe eines Zwischenbildes des Objekts (103) und/oder unmittelbar vor der digitalen Kamera (107) angeordnet ist.
6. Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit (101) mindestens eine Festkörperlichtquelle aufweist.
7. Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Multiband-Fluoreszenzfiltersystem (105) keinen Anregungsfilter aufweist.
8. Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzmikroskop (100) eine Steuereinheit (300) aufweist, wobei die Steuereinheit (300) mit der Fluoreszenzauflicht- Beleuchtungseinheit (101) und mit der Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit (102) derart elektronisch in Verbindung steht, dass abhängig von entsprechenden Steuersignalen eine Umschaltung zwischen der Fluoreszenzauflichtbeleuchtung und der Hellfelddurchlichtbeleuchtung vorgenommen wird, wobei die
Steuereinheit (300) mit der digitalen Kamera (107) derart elektronisch in
Verbindung steht, dass bei einer Umschaltung auf die
Hellfelddurchlichtbeleuchtung mittels entsprechender Steuersignale in der digitalen Kamera (107) die Weißabgleichsfunktion aktiviert wird.
9. Verfahren zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung eines Objekts (103) unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (100), das eine Hellfelddurchlicht- Beleuchtungseinheit (102) zur Erzeugung eines Hellfelddurchlicht-
Beleuchtungsstrahlengangs (204) zur Durchlichtbeleuchtung des Objekts (103) aufweist, wobei zur Erzeugung einer Hellfeldabbildung ein Multiband- Fluoreszenzfiltersystem (105) des Fluoreszenzmikroskops (100) in einem vom Objekt (103) ausgehenden Hellfelddurchlicht-Strahlengang (203) verbleibt und eine digitale Kamera (107) des Fluoreszenzmikroskops (100) zunächst einen Weißabgleich durchführt, bevor sie eine Hellfeldabbildung des Objekts erzeugt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei zur Erzeugung einer
Fluoreszenzabbildung des Objekts (103) unter Verwendung des
Fluoreszenzmikroskops (100) eine Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit (101) einen Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungsstrahlengang (201) erzeugt, der von einem Multiband-Strahlenteiler (109) des Multiband-Fluoreszenzfiltersystems (105) in ein Objektiv (104) des Fluoreszenzmikroskops (100) und auf das abzubildende Objekt (103) umgelenkt wird, wobei ein Multiband-Sperrfilter (110) des
Multiband-Fluoreszenzfiltersystems (105) einen von dem Objekt (103)
ausgehenden Fluoreszenzemissionsstrahlengang (202) zumindest zum Teil transmittiert, der zur Erzeugung einer Fluoreszenzabbildung von der digitalen Kamera (107) aufgenommen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 und 10, wobei zwischen der Erzeugung einer Hellfeldabbildung des Objekts (103) und der Erzeugung einer
Fluoreszenzabbildung des Objekts (103) dadurch umgeschaltet wird, dass durch elektronische Ansteuerung der Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit (102) und der Fluoreszenzauflicht-Beleuchtungseinheit (101) zwischen diesen umgeschaltet wird, wobei bei Umschaltung auf die Hellfelddurchlicht-Beleuchtungseinheit (102) die digitale Kamera (107) derart elektronisch angesteuert wird, dass sie vor Erzeugung der Hellfeldabbildung einen Weißabgleich durchführt.
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