DE102013206466B4

DE102013206466B4 - Fluoreszenzmikroskop

Info

Publication number: DE102013206466B4
Application number: DE201310206466
Authority: DE
Inventors: Albrecht Weiss; Michael Ganser
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2014-12-11
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: DE102013206466A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop (13) mit einer Beleuchtungseinrichtung (20, 21, 23, 25, 26) zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine fluoreszierende Probe (15) zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregt, und einer Abbildungseinrichtung (1, 2, 12, 14, 24) umfassend ein Objektiv (14) zur Erzeugung eines Abbildungsstrahlengangs zur Erzeugung eines Bildes zumindest eines Teils der fluoreszierenden Probe (15), wobei die Abbildungseinrichtung ein Emissionsfilter zur Selektion von Wellenlängen aus dem Spektrum des Abbildungsstrahlengangs aufweist, wobei als Emissionsfilter ein abbildungsseitiges Farbverlaufsfilter (8) in einer zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene (6) eingesetzt ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine fluoreszierende Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregt, und mit einer Abbildungseinrichtung umfassend ein Objektiv zur Erzeugung eines Abbildungsstrahlengangs zur Erzeugung eines Bildes zumindest eines Teil der fluoreszierenden Probe, wobei die Abbildungseinrichtung einen Emissionsfilter zur Selektion von Wellenlängen aus dem Spektrum des Abbildungsstrahlengangs aufweist.
Stand der Technik
Fluoreszenzmikroskope dienen zum Betrachten und/oder zum Aufnehmen von Bildern von Objekten mit fluoreszierenden Substanzen. Fluoreszierende Substanzen haben die Eigenschaft, Licht mit einer längeren Wellenlänge auszusenden (Emissionslicht) als diejenige des Lichtes, mit dem sie beleuchtet oder angeregt werden (Anregungslicht). Dieser Effekt wird "Stokes-Verschiebung" (engl. "Stokes Shift") genannt. Diese auftretende Wellenlängendifferenz beträgt typischerweise etwa 40 nm. Die Anregungsbande (Intensitätsverteilung des Anregungslichts aufgetragen gegen die Wellenlänge) und die Emissionsbande sind im Allgemeinen breit und überlappend und um den genannten Wellenlängendifferenzbetrag gegeneinander verschoben. Da die Intensität des Fluoreszenzlichts, also der Emissionsbande, im Allgemeinen viel geringer ist als die des Beleuchtungslichts, also des Anregungsbandes, muss für einen ausreichenden Bildkontrast die Emission durch ein Farbfilter beobachtet werden, das das Beleuchtungs-/Anregungslicht soweit als möglich unterdrückt.
Einen typischen Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Stand der Technik zeigt 1. Mit 13 ist das Fluoreszenzmikroskop im Gesamten bezeichnet. Eine fluoreszierende Probe 15 wird mittels Mikroskopobjektiv 14 und Mikroskoptubus 1 vergrößert abgebildet. Das entsprechende Bild ist mittels einer Kamera 12 oder über ein Okular 24 direkt zu betrachten. Eine Beleuchtungsquelle 23, beispielsweise eine Quecksilberhochdrucklampe, eine LED oder ein Laser, erzeugt mittels einer hier nur schematisch dargestellten Beleuchtungsoptik (Linsen 25, 26) einen Beleuchtungsstrahlengang, der durch seine Ausbreitungsrichtung durch die Pfeile 19 und 17 dargestellt ist. Dieser Beleuchtungsstrahlengang passiert ein Anregungsfilter 20, das so gewählt ist, dass die transmittierten Wellenlängen die Probe anregen können. Der Beleuchtungsstrahlengang breitet sich über den Strahlteiler 21 gemäß Pfeil 17 weiter in Richtung Probe 15 aus. Hierbei kommt die sogenannte Epibeleuchtung zum Einsatz, bei der das Mikroskopobjektiv 14 als optisches System für die Beleuchtung als auch für die Beobachtung eingesetzt wird.
Von der Probe fluoreszierendes Licht gelangt in Richtung des Pfeils 18 über das Hauptobjektiv 14 zum Strahlteiler 21, der für das längerwellige Emissionslicht durchlässig ist. Von dort passiert der Abbildungsstrahlengang einen Emissionsfilter 22. Dieses Filter ist für die von der Probe ausgesandten Fluoreszenzfrequenzen durchlässig und unterdrückt die Frequenzen des Anregungslichts. Dies gewährleistet einen ausreichenden Kontrast im Fluoreszenzbild. Letzteres wird von einer Kamera 12 erzeugt, die über einen Kamera-Adapter 2 an den Tubus 1 des Mikroskops 13 angeschlossen ist. Das Fluoreszenzbild kann auch direkt von einem Betrachter über ein Okular 24 betrachtet werden.
Bei modernen Fluoreszenzmikroskopen werden Anregungsfilter 20, Strahlteiler 21 und Emissionsfilter 22 meist in einem Halter oder als Fluoreszenzfilterblock 7 zusammengefasst, wobei die Kombination der Filter im Allgemeinen für bestimmte Fluoreszenzfarbstoffe optimiert ist. Das Anregungsfilter 20 kann entfallen, wenn die Lichtquelle selbst bereits die Aussendung nur bestimmter Anregungswellenlängen erlaubt (beispielsweise Laser oder LED). Verschiedene Kombinationen von Emissions- und/oder Anregungsfilter können auch auf einer drehbaren Scheibe oder auf einem Schieber angebracht sein, um zwischen einzelnen diskreten Wellenlängenbereichen schalten zu können. An den in 1 bezeichneten Stellen des optischen Strahlengangs des Mikroskops 13, an denen die Filter 20, 22 typischerweise eingebracht sind, müssen die Filter etwa 25 mm groß sein (wirksamer Durchmesser des Beleuchtungs- bzw. Abbildungsstrahlengangs an diesen Stellen) und über diesen Durchmesser homogene Eigenschaften besitzen, damit im Bildfeld kein Gradient und keine Inhomogenitäten sichtbar sind.
Folgende Filter mit variablen Durchlasskurven sind bekannt:
"Liquid-Crystal-Tunable"-Filter (LCTF) sind spezielle Interferenzfilter, die über eine Steuerspannung variiert werden können. Sie können über einen weiten Wellenlängenbereich (typischerweise 400 nm bis 700 nm als schmal- oder breitbandige durchstimmbare Bandpassfilter eingesetzt werden, wobei innerhalb einiger 10 Millisekunden eine Durchstimmung erfolgen kann.
Akustooptische Filter, AOTF ("Acousto Optical Tunable Filter"), haben im Vergleich zu LCTFs höhere Durchstimmgeschwindigkeiten. Die Selektion von Lichtwellenlängen beruht hier auf dem akustooptischen Effekt.
Bei den genannten Filtern kann zwar eine ausreichende Homogenität der Filtereigenschaften erreicht werden, allerdings ist die Unterdrückung des Anregungslichts für den Einsatz in der Fluoreszenzmikroskopie noch nicht ausreichend. Feste Zusatzfilter sind daher nötig, die der Zielsetzung der Durchstimmbarkeit widersprechen.
Ausreichende Unterdrückung des Anregungslichts kann mit Interferenzfiltern mit vielen Schichten erreicht werden, die zuerst einmal aber nicht variabel sind. Ausgehend von einer normalen Lichteinfallsrichtung kann aber durch Kippung des Filters im Strahlengang der Einfallswinkel erhöht werden. Hierdurch nimmt die durch den Filter transmittierte zentrale Wellenlänge ab. Auf diese Weise kann durch Kippung (typischerweise 20°–60°) eine gewisse Variation oder Durchstimmung der Durchlasskurve (typischerweise über einen Bereich von 50 nm) erzielt werden. Für eine breite Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie ist aber diese Variation unzureichend.
Schließlich gibt es Gradientenfilter in verschiedenen Bauformen seit vielen Jahren. Es sind Filter mit variabler optischer Dichte in Form eines Graukeils, aber auch Farbverlaufsfilter bekannt. Ein Farbverlaufsfilter stellt beispielsweise ein linear variables Bandpassfilter dar, bei dem die zentrale Wellenlänge des Filters über die Länge des Farbverlaufsfilters in einer Richtung zunimmt. Das Gradientenfilter sowie das Farbverlaufsfilter werden zu einem variablen Filter, indem das Filter gegenüber einer Blende verschoben wird. Ein typisches Farbverlaufsfilter besitzt beispielsweise eine Länge von 60 mm, wobei auf dieser Länge Bandpassfilter mit zentralen Wellenlängen zwischen 400 nm bis 700 nm durchlaufen werden können. Innerhalb einer Blendenöffnung (typischerweise einige mm) variiert entlang des Farbverlaufs die zentrale Wellenlänge des Bandpasses. Wenn also ein solches Filter in der Nähe einer konjugierten Feldebene eingesetzt wird, ist der Farbverlauf im Sehfeld (visuell und für eine Kamera) störend sichtbar.
Aus der DE 10 2004 048 846 A1 ist die Verwendung eines Farbverlaufsfilters in einem Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Erkennung von in den Strahlengang des Mikroskops einbringbaren optischen Bauelementen bekannt. Das optische Bauelement ist hierbei insbesondere ein Fluoreszenzfiltersystem mit Anregungsfilter, Teiler und Sperrfilter. Die spektralen Eigenschaften eines solchen optischen Bauelements sollen vorzugsweise außerhalb des Strahlengangs des Mikroskops bestimmt werden. Hierzu wird das optische Element mit einer Weißlichtquelle bestrahlt, wobei mittels einer dem optischen Bauelement nachgeordneten Vorrichtung die resultierende Strahlung räumlich in die verschiedenen Spektralbereiche aufgespalten wird, wozu beispielsweise ein Farbverlaufsfilter eingesetzt wird.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe vorliegender Erfindung ist, die bisher übliche Filteranordnung in einem Fluoreszenzmikroskop, insbesondere in Form eines Fluoreszenzfilterblocks, durch eine alternative Filteranordnung zu ersetzen, um einfacher als bisher Fluoreszenzbilder variabler Spektralanteile erzeugen zu können.
Kurzfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Fluoreszenzmikroskop der eingangs erwähnten Art vorgeschlagen, bei dem als Emissionsfilter ein abbildungsseitiges Farbverlaufsfilter in einer zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene oder in einen (sich in axialer Richtung des Abbildungsstrahlengangs erstreckenden) engen Bereich um diese Ebene eingesetzt ist. Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskops ergeben sich aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Im Rahmen vorliegender Anmeldung soll "abbildungsseitig" eine Position des Farbverlaufsfilters im Abbildungsstrahlengang bedeuten. Das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter ist folglich zwischen Objekt und Okular bzw. Kamera des Fluoreszenzmikroskops im Abbildungsstrahlengang angeordnet. Ein weiter unten erläutertes beleuchtungsseitiges Farbverlaufsfilter ist im Rahmen dieser Anmeldung im Beleuchtungsstrahlengang, also zwischen Beleuchtungsquelle und Objekt angeordnet.
Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erlaubt es, ein Farbverlaufsfilter in einem Fluoreszenzmikroskop zur Erzeugung von Fluoreszenzbildern variabler Spektralanteile beispielsweise auf einer Kamera einzusetzen. Hierzu kann das Farbverlaufsfilter jedoch nicht mit dem bisherigen Emissionsfilter (vgl. obige Ausführungen zu 1) ausgetauscht werden, da dort der Farbverlauf im Sehfeld sichtbar wäre. Erfindungsgemäß ist daher das Farbverlaufsfilter in einer zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene (oder in einem schmalen Bereich um diese Ebene herum) eingesetzt, wobei insbesondere Mittel zum Verschieben des Farbverlaufsfilters in seiner Längsrichtung zur Auswahl eines Transmissionsbereichs für einen bestimmten Wellenlängenbereich vorhanden sind.
Durch entsprechende Auslegung der Abbildungseinrichtung kann die Zwischenpupille in der zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene, in der das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter eingesetzt ist, gegenüber der Objektivpupille verkleinert abgebildet werden. Typische Werte sind Objektivpupillen mit Durchmesser 8mm, die um den Faktor 2–3 verkleinert werden können.
Die Zwischenpupille stellt im Allgemeinen ein sauber begrenztes Bild der Objektivpupille dar, sodass dort das erfindungsgemäße abbildungsseitige Farbverlaufsfilter auch ohne zusätzliche mechanische Blende verwendet werden kann. Es ist jedoch zweckmäßig, insbesondere um Streustrahlung zu eliminieren und/oder um einen definierten Bereich auf dem Farbverlaufsfilter zu selektieren, in der Zwischenpupille eine zusätzliche Blende einzusetzen,. Besonders geeignet ist eine in ihrer Größe variable Blende, insbesondere eine Blende rechteckiger Form, durch deren schmale Längsseite ein bestimmter Wellenlängenbereich auf dem Farbverlaufsfilter auswählbar ist. Vorteilhafterweise erstreckt sich die (zur Längsseite senkrechte) Breitseite des rechteckigen Bereichs über die gesamte Breite der Zwischenpupille, sodass der Verlust an Lichtleistung und Auflösung der Abbildung gering gehalten werden kann.
Allgemein muss ein Kompromiss gefunden werden zwischen dem "freien Durchmesser" der Blende, der Länge des Filters und den Homogenitätsanforderung an das Filter bezogen auf den genutzten Bereich. Eine (geringe) Variation der spektralen Eigenschaften entlang des Gradienten (und damit über den Blendenbereich) ist grundsätzlich nicht zu vermeiden. Seit kurzer Zeit ist an Farbverlaufsfiltern eine Technologie verfügbar, mit der sich auch eine Blockung von OD > 4 erreichen lässt, das heißt der Transmissionsgrad an den auszufilternden Wellenlängen ist 10^–4. Hierbei gilt OD = log₁₀(1/T); mit OD = optische Dichte und T = Transmissionsgrad.
Der Einsatz einer in ihrer Größe variablen Blende ist insbesondere dazu geeignet, schnell einen Kompromiss zwischen Bandbreite der selektierten Wellenlängen, Helligkeit und Auflösung je nach Anwendung und je nach verwendetem Objektiv zu finden. Bei einer rechteckigen Blende, wie oben erwähnt, ist das Verhältnis zwischen Bandbreite und Helligkeit günstiger als bei einer runden Blende.
Das Farbverlaufsfilter kann auf unterschiedliche Arten realisiert werden:
Das Farbverlaufsfilter umfasst vorzugsweise Langpassfilter mit über die Wellenlänge (linear) variierenden Kanten. Hierbei kann als "Kante" die Tangente an derjenigen Stelle definiert werden, an der die Steigung des Transmissionsverlaufs des Langpassfilters maximal ist. Ein solches Farbverlaufsfilter weist demnach an einer bestimmten Stelle entlang der Länge des Filters einen Transmissionsgrad in Form eines Langpasses auf, wobei die Kante des Langpasses an einer bestimmten Wellenlänge liegt. Betrachtet man einen bestimmten Ausschnitt eines solchen Langpassfilters um seine Kante herum, so ist der Transmissionsgrad auf der einen Seite der Kante sehr gering, während er auf der anderen Seite dieser Kante hoch ist. Ein solcher Ausschnitt wird, wie oben ausgeführt, durch die Zwischenpupille oder durch eine dort befindliche Blende definiert. Oberhalb der der Kante zugeordneten Wellenlänge ist das Langpassfilter im Wesentlichen durchlässig. Durch relative Bewegung des Ausschnitts über die Länge des Filters kann die Wellenlänge, oberhalb derer Durchlässigkeit besteht, variiert werden.
In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform umfasst das Farbverlaufsfilter Bandpassfilter mit über die Wellenlänge (linear) variierenden Zentralwellenlängen. Bezogen auf die Länge des Filters heißt dies, dass an einer bestimmten Stelle das Filter einen Transmissionsgrad in Form eines Bandpasses besitzt, dessen Zentralwellenlänge eine bestimmte dieser Stelle zugeordnete Wellenlänge ist. Durch relative Bewegung eines solchen Farbverlaufsfilters zu einer Blende (bzw. im allgemeinen zu einem Ausschnitt) können daher verschiedene Zentralwellenlängen ausgewählt werden. Dabei kann ein Bandpassfilter auch als Kombination aus einem Langpassfilter und einem Kurzpassfilter ausgebildet sein. Das Langpassfilter und das Kurzpassfilter werden dabei hintereinander geschaltet und ergeben ein resultierendes Bandpassfilter. In einer anderen Ausgestaltung kann ein Bandpassfilter auch als Kombination aus einem Langpassfilter und einem anderen Bandpassfilter ausgebildet sein. Wiederum ergibt die Hintereinanderschaltung der beiden Filter ein resultierendes Bandpassfilter. Durch Verschiebung des Langpassfilters und Kurzpassfilters gegeneinander (über die Länge der Filter) kann ein Bandpass variabler Bandbreite erzeugt werden. Eine Variation eines Bandpasses lässt sich auch durch Verschiebung eines Langpasses und eines anderen Bandpasses zueinander erzielen. Bei dieser Kombination von Lang- und Bandpass verbessert der Langpass die Blockung in Richtung der Anregungswellenlänge.
Es ist vorteilhaft, das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter nur in dem Teil des Abbildungsstrahlengangs einzusetzen, der ausschließlich zu einer Dokumentationseinrichtung, wie einer Mikroskop-Kamera, führt. Eine Zwischenpupille lässt sich nämlich in einem vom Abbildungsstrahlengang, der zum Mikroskopokular führt, ausgekoppelten Dokumentationsstrahlengang aus Platzgründen leichter erzeugen als in dem unmittelbar zum Mikroskopokular führenden Abbildungsstrahlengang. Es sei jedoch angemerkt, dass beispielsweise aufgrund der Bauweise von inversen Mikroskopen die Einbringung eines Farbverlaufsfilters in einer Zwischenpupille in den Abbildungsstrahlengang problemlos möglich ist, wobei dieser von dort aus zum Mikroskopokular und/oder zu einer Dokumentationseinrichtung, wie einer Mikroskop-Kamera, führt.
Bei dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskop ist es zweckmäßig, wenn dem abbildungsseitigen Farbverlaufsfilter im Abbildungsstrahlengang ein Strahlteiler von der Probe aus gesehen vorgeschaltet ist, der den Beleuchtungsstrahlengang in eine optische Achse des Abbildungsstrahlengangs zur Probe hin lenkt. Vorteilhafterweise besitzt der Strahlteiler ein wellenlängenunabhängiges Teilungsverhältnis, sodass das spektrale Verhalten des Mikroskops nur noch durch die variablen Filter bestimmt ist.
Außerdem ist es vorteilhaft, wenn der Strahlteiler ein unsymmetrisches Teilungsverhältnis besitzt, beispielsweise mit einer Transmission von 80% und einer Reflexion von 20%. Auf diese Weise kann das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht besonders gut für die Abbildung genutzt werden, Intensitätsverluste auf der Anregungsseite sind i.A. eher akzeptabel.
Es kann auch vorteilhaft sein, einen Strahlteiler zu verwenden, der eine Mehrzahl diskreter Transmissionswellenlängen besitzt ("multipass"). Damit ist zwar nicht mehr die volle Variabilität gegeben, für die entsprechenden diskreten Wellenlängen ist aber ein solcher Teiler effizienter als ein Neutralteiler.
Das erfindungsgemäße Fluoreszenzmikroskop weist eine Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs auf, der eine fluoreszierende Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregt. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn die Beleuchtungseinrichtung eine Lichtquelle umfasst, die zur Erzeugung von Licht variabler Wellenlänge ausgebildet ist. Auf diese Weise kann bereits die Lichtquelle Aufgaben des Anregungsfilters eines Fluoreszenzmikroskops übernehmen.
Zur Erzeugung von Licht (diskreter) variabler Wellenlänge können Lichtquellen mit mehreren einzeln ansteuerbaren Lasern oder LEDs eingesetzt werden.
Alternativ kann in einer vorteilhaften Ausführungsform die Lichtquelle eine Lampe mit breitbandigem Wellenlängenspektrum und eine Wellenlängen-Selektionseinrichtung umfassen. Eine Wellenlängen-Selektionseinrichtung umfasst dabei ein Filter oder eine Filterkombination, insbesondere der einleitend genannten Filter. In diesem Zusammenhang hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn die Wellenlängen-Selektionseinrichtung ein gegenüber einer Blende verschiebbares Farbverlaufsfilter umfasst. Dieses beleuchtungsseitige Farbverlaufsfilter ist in der Beleuchtungspupille angeordnet. Sollte diese ausreichend scharf abgegrenzt sein, kann auch hier wiederum auf eine Blende verzichtet werden. Das beleuchtungsseitige Farbverlaufsfilter kann auf diese Weise das bisher bei Fluoreszenzmikroskopen eingesetzte Anregungsfilter ersetzen.
Durch Einsatz eines beleuchtungsseitigen Farbverlaufsfilters in Kombination mit einem abbildungsseitigen Farbverlaufsfilter kann der bisher übliche Fluoreszenzfilterblock vollständig ersetzt werden. Dies ergibt die Möglichkeit, einerseits unterschiedliche Anregungswellenlängen zu selektieren und dazu passend unterschiedliche Fluoreszenzwellenlängen zu selektieren, um Fluoreszenzbilder unterschiedlicher Spektralanteile zu erzeugen. Um die entsprechenden Wellenlängen schnell und präzise selektieren zu können, ist es zweckmäßig, wenn das abbildungsseitige und das beleuchtungsseitige Farbverlaufsfilter jeweils von einem Motor angetrieben und eine Position auf dem jeweiligen Filter angefahren werden kann. Um schnell die richtige Kombination von Anregungswellenlängen und Emissionswellenlängen anfahren zu können, ist es vorteilhaft, über eine Steuereinheit motorisch die Positionen auf den jeweiligen Farbverlaufsfiltern in Abhängigkeit voneinander anzufahren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
Figurenbeschreibung
1 zeigt schematisch einen typischen Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Stand der Technik.
2 zeigt einen Gradientenfilter mit vorgeschalteter Blende.
3 zeigt sehr schematisch Transmissionsgrade eines Farbverlaufsfilters für verschiedene Wellenlängen aufgetragen gegen die Länge des Filters, wobei 3a ein Verlaufsfilter als Langpassfilter mit in Richtung x variierenden Kanten und 3b Bandpassfilter mit in Richtung x variierenden Zentralwellenlängen zeigt. 3c zeigt die Kombination eines Langpassfilters und eines Kurzpassfilters in einer ganz bestimmten Relativposition zueinander.
4 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzmikroskop, bei dem ein abbildungsseitiges Farbverlaufsfilter in einem Teil des Abbildungsstrahlengangs eingesetzt ist, der zu einer Mikroskop-Kamera führt.
5 zeigt sehr schematisch den Aufbau eines inversen Fluoreszenzmikroskops mit einem abbildungsseitigen Farbverlaufsfilter sowie einem beleuchtungsseitigen Farbverlaufsfilter, die jeweils von einer Steuereinheit angesteuert werden.
Der typische Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Stand der Technik ist in 1 dargestellt. Diese Figur wurde bereits in der Beschreibungseinleitung ausführlich erörtert.
2 zeigt ein Gradientenfilter 38 mit einer davor geschalteten Blende 39, wobei diese Blende 39 einen bestimmten Bereich auf dem Gradientenfilter 38 selektiert. Das Gradientenfilter 38 schwächt durchlaufendes Licht abhängig vom Ort x des Durchtritts. In 2 ganz rechts erfolgt vollständige Absorption, während in 2 ganz links die Transmission 100% beträgt. Über die Länge des Filters nimmt folglich die Transmission von 100% kontinuierlich auf 0% ab. Bei der Stellung x = x₁ der Blende 39 in 2 beträgt die Transmission etwa noch 47%, wobei über die Fläche der Blende zu mitteln ist.
Ein Farbverlaufsfilter arbeitet grundsätzlich nach dem gleichen Prinzip wie das Gradientenfilter gemäß 2 mit dem Unterschied, dass abhängig vom Ort x entlang der Länge des Farbverlaufsfilters ein jeweils anderer Wellenlängenbereich selektiert wird. Je nach Filter kann sich der Spektralbereich beispielsweise von 400 bis 700 nm oder aber auch beispielsweise von 400 bis 1000 nm erstrecken. Die Filterlängen können beispielsweise 60 oder 200 mm betragen.
Ein Farbverlaufsfilter kann als Langpassfilter 41 mit entlang der Filterlänge bezüglich der Wellenlänge variierenden Kanten, wie es schematisch in 3a dargestellt ist, ausgebildet sein. Dargestellt ist der Transmissionsverlauf für drei Wellenlängen λ₁, λ₂ und λ₃. Die Einheiten der 3a und 3b sind relativer Transmissionsgrad (T) und Filterlänge (x). Wie aus 3a ersichtlich, ist an der Position x = x₁ der Transmissionsgrad für die Wellenlänge λ₁ relativ hoch, während er für die Wellenlängen λ₂ und λ₃ im Verhältnis hierzu stärker abnimmt. Mittels einer in 3a schematisch eingezeichneten Blende 39 auf dem Farbverlaufsfilter kann folglich ein enger Wellenlängenbereich (um die Wellenlänge λ₁ herum) ausgeschnitten werden. Der ausgeschnittene Wellenlängenbereich kann durch Bewegung des Filters 8 relativ zu der Blende 39 entlang der x-Achse variiert werden.
Eine andere Möglichkeit zur Realisierung eines Farbverlaufsfilters zeigt 3b. Hier ist das Farbverlaufsfilter als Bandpassfilter 42 mit entlang des Filters variierenden Zentralwellenlängen ausgestaltet. An der Stelle x = x₁ ist die Transmission für die Wellenlänge λ₁ maximal, für die Wellenlänge λ₂ schon stark verringert und für die Wellenlänge λ₃ kaum noch vorhanden. Der Effekt einer vorgeschalteten Blende 39 ist in 3b wiederum angedeutet. Durch Verschiebung des Farbverlaufsfilters gegenüber der Blende 39 entlang der x-Achse lassen sich somit Wellenlängenbereiche hoher Transmission selektieren.
3c zeigt schematische die Ausbildung eines Bandpassfilters 42 als Kombination aus einem Langpassfilter 41 und einem Kurzpassfilter 43. Hier ist der Transmissionsgrad T gegen die Wellenlänge λ aufgetragen. Langpassfilter 41 und Kurzpassfilter 43 befinden sich in einer ganz bestimmten Relativposition zueinander. Für diese Relativposition ist der resultierende Transmissionsgrad in Abhängigkeit von der Wellenlänge dargestellt. Es resultiert ein Bandpassverhalten mit maximalem Transmissionsgrad für die Wellenlänge λ₁. Durch relative Verschiebung des Langpassfilters 41 zum Kurzpassfilter 43 kann die Bandbreite des resultierenden Bandpassfilters 42 variiert werden.
4 zeigt schematisch ein Fluoreszenzmikroskop 4 in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung. Lediglich schematisch dargestellt, da für diese Ausführungsform weniger relevant, sind die Bestandteile des Mikroskops 13, nämlich Tubus 1, Objektiv 14 und Okular 24. Durch das Mikroskop 13 wird dem Betrachter des Okulars 24 ein vergrößertes Fluoreszenzbild der Probe 15 dargeboten. Die Richtung des Abbildungsstrahlengangs ist mit 18 bezeichnet. Durch geeignete optische Elemente (nicht dargestellt) wird ein Teil des Abbildungsstrahlengangs in das Okular 24 gelenkt, während ein anderer Teil in eine Dokumentationseinrichtung, hier eine Mikroskop-Kamera 12 gelenkt wird.
Als Emissionsfilter wird ein abbildungsseitiges Farbverlaufsfilter 8, hier der Einfachheit halber als Gradientenfilter (vgl. 2) dargestellt, in einer zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene 6 oder in einem schmalen Bereich um diese Ebene eingesetzt. Da die Zwischenpupille in der Ebene 6 in der Regel ausreichend scharf begrenzt ist, kann häufig auf eine Blende 39 an dieser Stelle (vgl. 2) verzichtet werden. Um jedoch eine definierte Selektion über einen schmalen Wellenlängenbereich zu erzielen, ist es zweckmäßig, eine Blende 39 dem Farbverlaufsfilter 8 in der Zwischenpupillenebene 6 vorzuschalten (oder nachzuschalten). In 4 wurde die Blende 39 der Einfachheit halber nicht dargestellt. Die Blende 39 ist insbesondere in ihrer Größe (hier Länge und Breite), bei kreisförmigen Blenden im Durchmesser, variabel gestaltet, um für die jeweilige Anwendung die beste Größe einstellen zu können.
Die Ebene 6 der Zwischenpupille befindet sich in einem Kamera-Adapter 2, der die Mikroskop-Kamera 12 an das Mikroskop 13 koppelt. Im Kamera-Adapter 2 befindet sich als abbildende Optik eine erste Linse 3 und eine zweite Linse 4. Im Abbildungsstrahlengang liegt eine Zwischenbildebene 5 und die erwähnte Pupillenebene 6. Auf diese Weise kann ein Bild der Probe 15 auf die Bildebene 11 der Kamera 12 abgebildet werden. Eine ähnliche Konstruktion eines Kamera-Adapters ist aus der DE 10 2006 022 276 A1 bekannt, die von der Aufgabe ausgeht, einen kompakten Kamera-Adapter mit integriertem Filterwechsler anzugeben.
Die Verstellung des Farbverlaufsfilters 8 erfolgt über einen Motor 10, wobei durch Drehung der Motorwelle eine lineare Verschiebung des Farbverlaufsfilters 8 entlang seiner Länge erfolgt. Auf diese Weise können, wie im Zusammenhang mit den 3a bis c besprochen, verschiedene Wellenlängen(bereiche) selektiert werden, für die eine hohe Transmission des Filters vorliegt. Auf diese Weise ist es also möglich, Fluoreszenzbilder variabler Spektralanteile in der Bildebene 11 zu erzeugen.
Durch entsprechende optische Auslegung der Abbildungseinrichtung, hier insbesondere der Linsen 3 und 4, kann erreicht werden, dass die Zwischenpupille in der Ebene 6 gegenüber der Objektivpupille verkleinert abgebildet wird, sodass man dadurch einen sehr kompakten Aufbau des Kamera-Adapters erhält.
5 zeigt schematisch ein inverses Mikroskop gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung. Wiederum sind nur die für die Erfindung wesentlichen Teile des inversen Fluoreszenzmikroskops 40 dargestellt. Lediglich schematisch sind die üblichen Komponenten, Objektiv 14, Tubuslinse 44 und Okular 24 mit vorgeschaltetem Umlenkprisma 45 dargestellt.
In dem hier dargestellten Fall wird ein vergrößertes Mikroskop-Bild einer fluoreszierenden Probe 15 visuell beim Betrachter des Okulars 24 erzeugt. Anstelle eines Fluoreszenzfilterblocks sind hier jedoch ein abbildungsseitiges Farbverlaufsfilter 8 sowie ein beleuchtungsseitiges Farbverlaufsfilter 28 vorgesehen. Zur Beleuchtung ist in diesem Ausführungsbeispiel eine Lampe 27 mit breitbandigem Wellenlängenspektrum vorgesehen, die sich in einer nicht näher bezeichneten Beleuchtungseinrichtung mit vorgeschalteter Linse befindet. Durch weitere Linsen 25 und 26, die eine Beleuchtungsoptik darstellen sollen, wird eine Ebene mit einer Beleuchtungspupille erzeugt, in der das Farbverlaufsfilter 28 und die davor geschaltete Blende 29 angeordnet sind. Mittels des Strahlteilers 21 gelangt das Anregungslicht über das Objektiv 14 auf die Probe 15. Diese Probe 15 kann durch eine Durchlichtbeleuchtungseinrichtung 50 zusätzlich beleuchtet werden.
Die zur Fluoreszenzemission angeregten Teile der Probe 15 emittieren Fluoreszenzlicht, das vom Objektiv 14 durch den Teilerspiegel 21 zum Okular 24 geleitet wird. Zu diesbezüglichen Erläuterungen sei auf die Ausführungen im Zusammenhang mit 1 verwiesen. Mittels der Linsen 46–49 wird die konjugiert zur Objektivpupillenebene liegende Ebene 6 erzeugt. Hier ist das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter 8 angeordnet. Mit dem Filter zusammen ist eine Blende 39 in der Ebene 6 angeordnet. Entsprechend dem Ausführungsbeispiel gemäß 4 ist sowohl das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter 8 von einem Motor 10 und das beleuchtungsseitige Farbverlaufsfilter 28 von einem Motor 30 angetrieben, sodass bestimmte Positionen entlang der Länge eines jeden Filters und somit bestimmte Wellenlängen exakt angefahren werden können.
Ist beispielsweise das Präparat 15 mit einem bestimmten fluoreszierenden Farbstoff eingefärbt, kann die zur Fluoreszenzemission notwendige Anregungswellenlänge gezielt aus dem Spektrum der Lampe 27 mittels des Farbverlaufsfilters 28 selektiert werden. In analoger Weise kann das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter 8 in eine Position gebracht werden, in der es die vom Präparat 15 emittierte Fluoreszenzwellenlänge durchlässt und andere Wellenlängen blockiert, um höchstmöglichen Bildkontrast zu gewährleisten. Abhängig vom verwendeten Fluoreszenzfarbstoff kann die Steuereinheit 31 die Motoren 30 und 10 entsprechend ansteuern, um das Farbverlaufsfilter 28 bzw. das Farbverlaufsfilter 8 an die jeweils entsprechende Position zu fahren. Ist auf der Probe 15 ein weiterer fluoreszierender Farbstoff vorhanden, kann durch schnelles Anfahren der zu diesem Farbstoff passenden Positionen der Farbverlaufsfilter 28 und 8 ein weiteres Bild der Probe 15 in einem anderen Spektralbereich aufgenommen werden. Gleiches gilt für den Fall, dass die Probe 15 durch eine andere Probe ausgetauscht wird, die mit einem anderen Farbstoff gefärbt ist. Die Erfindung ermöglicht somit ohne Austausch von Fluoreszenzfilterblöcken die schnelle Aufnahme von Fluoreszenzbildern unterschiedlicher Spektralbereiche mit nur minimalen Verzögerungen.
Bezugszeichenliste

1: Tubus
2: Kamera-Adapter
3: Linse
4: Linse
5: Zwischenbildebene
6: konjugierte Pupillenebene
7: Fluoreszenzfilterblock
8: Farbverlaufsfilter (abbildungsseitig)
10: Motor
11: Bildebene (Kamera)
12: Kamera, Dokumentationseinrichtung
13: Mikroskop
14: Objektiv
15: Probe
16: optische Hauptachse
17: Richtung des Beleuchtungsstrahlengangs
18: Richtung des Abbildungsstrahlengangs
19: Richtung des Beleuchtungsstrahlengangs
20: Anregungsfilter
21: Strahlteiler
22: Emissionsfilter
23: Beleuchtungsquelle
24: Okular
25: Linse
26: Linse
27: Lampe
28: Farbverlaufsfilter (beleuchtungsseitig)
29: Blende
30: Motor
31: Steuereinheit
32: Umlenkspiegel
33: Umlenkspiegel
38: Gradientenfilter
39: Blende
40: inverses Mikroskop
41: Langpassfilter
42: Bandpassfilter
43: Kurzpassfilter
44: Tubuslinse
45: Umlenkprisma
46: Linse
47: Linse
48: Linse
49: Linse
50: Durchlichtbeleuchtungseinrichtung
T: Transmissionsgrad
λ: Wellenlänge
x: Längsrichtung des Filters
x₁, x₂: Positionen auf dem Filter
λ₁, λ₂, λ₃: Wellenlängen

Claims

Fluoreszenzmikroskop (13) mit: einer Beleuchtungseinrichtung (20, 21, 23, 25, 26) zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine fluoreszierende Probe (15) zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregt, und einer Abbildungseinrichtung (1, 2, 12, 14, 24) umfassend ein Objektiv (14) zur Erzeugung eines Abbildungsstrahlengangs zur Erzeugung eines Bildes zumindest eines Teils der fluoreszierenden Probe (15), wobei die Abbildungseinrichtung ein Emissionsfilter zur Selektion von Wellenlängen aus dem Spektrum des Abbildungsstrahlengangs aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass als Emissionsfilter ein abbildungsseitiges Farbverlaufsfilter (8) in einer zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene (6) eingesetzt ist.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (10) zum Verschieben des Farbverlaufsfilters in seiner Längsrichtung angeordnet sind.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter (8) Langpassfilter (41) mit über die Wellenlänge variierenden Kanten umfasst.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennezeichnet, dass das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter (8) ein Bandpassfilter (42) mit über die Wellenlänge variierenden Zentralwellenlängen umfasst.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bandpassfilter (42) als Kombination aus einem Langpassfilter (41) und einem Kurzpassfilter (43) ausgebildet ist.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bandpassfilter als Kombination aus einem Langpassfilter und einem anderen Bandpassfilter ausgebildet ist.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungseinrichtung derart ausgebildet ist, dass die Zwischenpupille in der zur Pupillenebene des Abbildungsstrahlengangs konjugierten Ebene (6), in der das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter (8) eingesetzt ist, gegenüber der Objektivpupille verkleinert abgebildet wird.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich in der Zwischenpupille in der zur Pupillenebene konjugierten Ebene (6), in der das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter (8) eingesetzt ist, eine Blende (39) befindet.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Blende (39) in ihrer Größe variabel ist.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter (8) in dem Teil des Abbildungsstrahlengangs eingesetzt ist, der zu einer Dokumentationseinrichtung (12) führt.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem abbildungsseitigen Farbverlaufsfilter (8) im Abbildungsstrahlengang ein Strahlteiler (21) von der Probe (15) aus gesehen vorgeschaltet ist, der den Beleuchtungsstrahlengang in eine optische Achse (16) des Abbildungsstrahlengangs zur Probe (15) hin lenkt.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (21) ein unsymmetrisches Teilungsverhältnis besitzt.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (21) ein wellenlängenunabhängiges Teilungsverhältnis besitzt.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 11 oder 12, dass der Strahlteiler (21) eine Mehrzahl diskreter Transmissionswellenlängen besitzt.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung eine Lichtquelle umfasst, die zur Erzeugung von Licht variabler Wellenlänge ausgebildet ist.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine Lampe (27) mit breitbandigem Wellenlängenspektrum und eine Wellenlängen-Selektionseinrichtung umfasst.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektionseinrichtung ein beleuchtungsseitiges Farbverlaufsfilter (28) umfasst.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektionseinrichtung eine Blende (29) umfasst, und dass das beleuchtungsseitige Farbverlaufsfilter (28) zu dieser Blende (29) verschiebbar angeordnet ist.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das abbildungsseitige Farbverlaufsfilter (8) von einem Motor (10) angetrieben und eine Position auf dem Farbverlaufsfilter (8) anfahrbar ist.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das beleuchtungsseitige Farbverlaufsfilter (28) von einem Motor (30) angetrieben und eine Position auf dem Farbverlaufsfilter (28) anfahrbar ist.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuereinheit (31) vorhanden ist, die mit den jeweiligen Motoren (10, 30) derart in Wirkverbindung steht, dass Positionen auf den jeweiligen Farbverlaufsfiltern (8, 28) in Abhängigkeit voneinander angefahren werden.