JP2002323438A - 液体中の粒子体積の測定方法 - Google Patents
液体中の粒子体積の測定方法Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
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- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/012—Red blood cells
-
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- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 液中に懸濁された個々の赤血球または他の粒
子の体積を測定する装置および方法を開示する。 【解決手段】 サンプルが、顕微鏡分析に適した光学キ
ュベット内に配置される。細胞内に漏入せず、細胞によ
り弱く吸収されるのみの波長で光を吸収することができ
る吸収用染料が加えられる。細胞の体積は、（ｉ）単体
の細胞を備える第１の領域、（ii）該細胞に近い第２の
領域、および（iii）既知の量だけキュベットの厚みを
変えた後の第２の領域において測定された透過光強度を
用いて測定される。
子の体積を測定する装置および方法を開示する。 【解決手段】 サンプルが、顕微鏡分析に適した光学キ
ュベット内に配置される。細胞内に漏入せず、細胞によ
り弱く吸収されるのみの波長で光を吸収することができ
る吸収用染料が加えられる。細胞の体積は、（ｉ）単体
の細胞を備える第１の領域、（ii）該細胞に近い第２の
領域、および（iii）既知の量だけキュベットの厚みを
変えた後の第２の領域において測定された透過光強度を
用いて測定される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、定量的マイクロ分
光学、特に、個々の赤血球の体積を測定する方法に関す
る。
光学、特に、個々の赤血球の体積を測定する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】個々の赤血球の体積を測定し、この測定
に基づいて、平均細胞体積（ＭＣＶ）および赤血球分配
幅（ＲＤＷ）を計算することは臨床的に重要である。通
常、電気インピーダンス測定（Coulter Counter）に基
づく、または光散乱（フロー血球計算機）に基づくシス
テムが用いられている（例えば、フィラデルフィア、W.
B. Saunders CompanyのJ.B. Henry、"Clinical diagnos
is and management by laboratory methods",１９９６
年、pp. 548 ff.または、D.H. Tycko, M.H. Metz,E.P.
Epstein, A. Grinbaum, "Flow-cytometric light scatt
ering measurement of red blood cell volume and hem
oglobin concentration",応用光学２４（１９８５）、
１３５５−１３６５を見よ）。インピーダンスカウンタ
ーは、器械とサンプルパラメータの極めて注意深い調整
と制御を必要とする複雑で高価な器械である。フロー血
球計算機の大きく不利な点は、光散乱のパラメータが細
胞の体積のみならず細胞の形状にも依存するという事実
である。
に基づいて、平均細胞体積（ＭＣＶ）および赤血球分配
幅（ＲＤＷ）を計算することは臨床的に重要である。通
常、電気インピーダンス測定（Coulter Counter）に基
づく、または光散乱（フロー血球計算機）に基づくシス
テムが用いられている（例えば、フィラデルフィア、W.
B. Saunders CompanyのJ.B. Henry、"Clinical diagnos
is and management by laboratory methods",１９９６
年、pp. 548 ff.または、D.H. Tycko, M.H. Metz,E.P.
Epstein, A. Grinbaum, "Flow-cytometric light scatt
ering measurement of red blood cell volume and hem
oglobin concentration",応用光学２４（１９８５）、
１３５５−１３６５を見よ）。インピーダンスカウンタ
ーは、器械とサンプルパラメータの極めて注意深い調整
と制御を必要とする複雑で高価な器械である。フロー血
球計算機の大きく不利な点は、光散乱のパラメータが細
胞の体積のみならず細胞の形状にも依存するという事実
である。
【０００３】１９８３年に、Gray, HoffmanおよびHanse
nが、フロー血球計算機において細胞の体積を測定する
新しい光学的方法を提案した（M.L. Gray, R.A. Hoffma
n, W.P. Hansen, "A new method for cell volume meas
urement based on volume exclusion of a fluorescent
dye", Cytometry 3 (１９８３)、４２８−４３２）。
この方法では、細胞膜を透通できない蛍光性染料内に細
胞が懸濁される。細胞懸濁液の細い流れが合焦レーザビ
ームにより励起されたときに発生される蛍光発光のレベ
ルは、細胞が照射領域に到達するまで一定に留まり、こ
れにより細胞の体積に直接に比例する蛍光発光強度にお
ける減少を生じさせる。フロー血球計算機では、単体細
胞がレーザ照射スポットを約１０μｓ内で通過してい
る。この短かいデータ獲得時間の故に、電子検出バンド
幅が比較的大きくならざるを得ず、結果的に、低ＳＮ比
および低い体積測定精度となっている。
nが、フロー血球計算機において細胞の体積を測定する
新しい光学的方法を提案した（M.L. Gray, R.A. Hoffma
n, W.P. Hansen, "A new method for cell volume meas
urement based on volume exclusion of a fluorescent
dye", Cytometry 3 (１９８３)、４２８−４３２）。
この方法では、細胞膜を透通できない蛍光性染料内に細
胞が懸濁される。細胞懸濁液の細い流れが合焦レーザビ
ームにより励起されたときに発生される蛍光発光のレベ
ルは、細胞が照射領域に到達するまで一定に留まり、こ
れにより細胞の体積に直接に比例する蛍光発光強度にお
ける減少を生じさせる。フロー血球計算機では、単体細
胞がレーザ照射スポットを約１０μｓ内で通過してい
る。この短かいデータ獲得時間の故に、電子検出バンド
幅が比較的大きくならざるを得ず、結果的に、低ＳＮ比
および低い体積測定精度となっている。
【０００４】利用可能なデータ獲得時間は、細胞を静止
サンプル内に懸濁し、デジタル画像形成蛍光顕微鏡法を
用いることにより著しく増大できる（P.L. Becker, F.
S. Fay, "Cell-volume measurement using the digital
imaging fluorescence microscope", Biophysical Jou
rnal 49 （１９８６年）Ａ４６５を見よ）。デジタル蛍
光顕微鏡法のアプローチでは、細胞の体積を決定するた
めに較正手続が必要とされる。Recktenwaldと仲間達
は、較正が細胞と共に懸濁された光学的に透明で非蛍光
性のミクロスフェアにより行われる方法を紹介した（D.
Recktenwald, Phi-Wilson, B. Verwer, "Fluorescence
quantitation using degital microscopy", Journal P
hysical Chemistry 97 （１９９３年）、２８６８−２
８７０）。個々のスフェアの体積は、顕微鏡下でそれら
の突出領域を測定し、理想的な球形状を仮定してこの数
を体積に変換することにより決定される。放出している
蛍光から除かれている、スフェアの体積の結果としての
蛍光発光強度における減少が必要とされる較正パラメー
タとして用いられている。このアプローチの利点は、較
正している粒子がサンプル自体の中に配置されていると
いう事実によって与えられていることである。換言する
と、較正が全く同じサンプル容器で行われ、他の較正サ
ンプルが必要とされないことである。
サンプル内に懸濁し、デジタル画像形成蛍光顕微鏡法を
用いることにより著しく増大できる（P.L. Becker, F.
S. Fay, "Cell-volume measurement using the digital
imaging fluorescence microscope", Biophysical Jou
rnal 49 （１９８６年）Ａ４６５を見よ）。デジタル蛍
光顕微鏡法のアプローチでは、細胞の体積を決定するた
めに較正手続が必要とされる。Recktenwaldと仲間達
は、較正が細胞と共に懸濁された光学的に透明で非蛍光
性のミクロスフェアにより行われる方法を紹介した（D.
Recktenwald, Phi-Wilson, B. Verwer, "Fluorescence
quantitation using degital microscopy", Journal P
hysical Chemistry 97 （１９９３年）、２８６８−２
８７０）。個々のスフェアの体積は、顕微鏡下でそれら
の突出領域を測定し、理想的な球形状を仮定してこの数
を体積に変換することにより決定される。放出している
蛍光から除かれている、スフェアの体積の結果としての
蛍光発光強度における減少が必要とされる較正パラメー
タとして用いられている。このアプローチの利点は、較
正している粒子がサンプル自体の中に配置されていると
いう事実によって与えられていることである。換言する
と、較正が全く同じサンプル容器で行われ、他の較正サ
ンプルが必要とされないことである。
【０００５】細胞懸濁液中に較正スフェアを用いること
は問題がないわけではない。第一に、スフェアの導入は
仕事の流れの中で追加のステップに相当する。高い生産
性用にデザインされているシステムにおいては、この追
加のステップは不都合を意味する。第二に、Recktenwal
dと仲間達は、エラーを生じさせる、蛍光性染料分子が
スフェア表面に付着する傾向を観察していた。第三に、
もしも、スフェアの光学的屈折率が液体の屈折率にうま
く合わないと、測定されている蛍光発光強度において屈
折に基づく間違いの結果がスフェアの縁部において生じ
る。そして最後に、ミクロスフェアを用いることは、例
えば、数ミクロン以下のオーダーの薄いサンプル厚みが
必要とされた場合、問題となり得る。
は問題がないわけではない。第一に、スフェアの導入は
仕事の流れの中で追加のステップに相当する。高い生産
性用にデザインされているシステムにおいては、この追
加のステップは不都合を意味する。第二に、Recktenwal
dと仲間達は、エラーを生じさせる、蛍光性染料分子が
スフェア表面に付着する傾向を観察していた。第三に、
もしも、スフェアの光学的屈折率が液体の屈折率にうま
く合わないと、測定されている蛍光発光強度において屈
折に基づく間違いの結果がスフェアの縁部において生じ
る。そして最後に、ミクロスフェアを用いることは、例
えば、数ミクロン以下のオーダーの薄いサンプル厚みが
必要とされた場合、問題となり得る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、先行技
術における不利な点および問題の故に、液体中に懸濁さ
れた個々の赤血球の体積を測定する簡単且つ信頼性のあ
る方法に対する必要性が存する。
術における不利な点および問題の故に、液体中に懸濁さ
れた個々の赤血球の体積を測定する簡単且つ信頼性のあ
る方法に対する必要性が存する。
【０００７】本発明の目的は、液体中に懸濁された個々
の赤血球または他の粒子の体積を測定する方法を提供す
ることにある。
の赤血球または他の粒子の体積を測定する方法を提供す
ることにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、赤血球
の場合については、上記目的は、懸濁された赤血球を包
含する液体サンプルを入口窓および出口窓を有する光学
キュベット内に配置し、該液体に、赤血球に実質的に漏
入しない吸収用染料であって、赤血球により弱く吸収さ
れるのみの波長で光を吸収することができる吸収用染料
を加えて均一に分配させ、サンプルを、前記染料により
吸収されるが赤血球には弱く吸収されるのみの波長で入
口窓を介して照明し、赤血球を包含しない領域において
出口窓を介して再出現する透過光の強度を測定し、キュ
ベットの厚みを該領域において規定の量だけ変え、そし
て該同じ領域において再出現する光の強度を再度測定
し、赤血球が存在する領域において再出現する光の強度
を測定し、該同じ赤血球に近い領域から再出現する光の
強度を測定し、そしてこれらの光強度値およびキュベッ
トの厚みにおける既知の変更値に基づいて赤血球の体積
を計算する、ことにより達成される。
の場合については、上記目的は、懸濁された赤血球を包
含する液体サンプルを入口窓および出口窓を有する光学
キュベット内に配置し、該液体に、赤血球に実質的に漏
入しない吸収用染料であって、赤血球により弱く吸収さ
れるのみの波長で光を吸収することができる吸収用染料
を加えて均一に分配させ、サンプルを、前記染料により
吸収されるが赤血球には弱く吸収されるのみの波長で入
口窓を介して照明し、赤血球を包含しない領域において
出口窓を介して再出現する透過光の強度を測定し、キュ
ベットの厚みを該領域において規定の量だけ変え、そし
て該同じ領域において再出現する光の強度を再度測定
し、赤血球が存在する領域において再出現する光の強度
を測定し、該同じ赤血球に近い領域から再出現する光の
強度を測定し、そしてこれらの光強度値およびキュベッ
トの厚みにおける既知の変更値に基づいて赤血球の体積
を計算する、ことにより達成される。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の方法によれば、懸濁され
た赤血球を包含する液体サンプルが、入口窓および出口
窓を有する光学キュベット内に置かれる。好ましくは、
キュベットは比較的薄く、透過顕微鏡のサンプルステー
ジに位置されるのに適している。例えば、キュベット
は、２５ｍｍ×７５ｍｍの体積の共通の顕微鏡スライド
上にあるスペーサに２４ｍｍ×５０ｍｍの体積の可撓性
＃１カバースリップを置くことにより作られ得る。スペ
ーサの好ましい高さは、約２００μｍである。可撓性カ
バースリップを押すことにより、キュベットの中央領域
の厚みの値が、１μｍ未満から２００μｍの間で得られ
る。光学キュベットは、その内部空間に液体サンプルを
保持でき、透過式測定を許容する、通常両側の、透明な
入口窓および透明な出口窓を有している容器であればよ
い。また、一側に一つの透明な窓、他側に鏡を備えた容
器を用いることも本発明の意図するところである。この
場合、光は前記一つの透明窓を通って入り、液体サンプ
ルを二度横切り、そして同じ窓を通って出るであろう。
この一つの窓が入口窓および出口窓の両者として機能す
る。本発明は顕微鏡分析用の容器に限定されるものでは
なく、顕微鏡以外の光学系で調べられる、より大きなサ
イズの容器にも適用可能である。
た赤血球を包含する液体サンプルが、入口窓および出口
窓を有する光学キュベット内に置かれる。好ましくは、
キュベットは比較的薄く、透過顕微鏡のサンプルステー
ジに位置されるのに適している。例えば、キュベット
は、２５ｍｍ×７５ｍｍの体積の共通の顕微鏡スライド
上にあるスペーサに２４ｍｍ×５０ｍｍの体積の可撓性
＃１カバースリップを置くことにより作られ得る。スペ
ーサの好ましい高さは、約２００μｍである。可撓性カ
バースリップを押すことにより、キュベットの中央領域
の厚みの値が、１μｍ未満から２００μｍの間で得られ
る。光学キュベットは、その内部空間に液体サンプルを
保持でき、透過式測定を許容する、通常両側の、透明な
入口窓および透明な出口窓を有している容器であればよ
い。また、一側に一つの透明な窓、他側に鏡を備えた容
器を用いることも本発明の意図するところである。この
場合、光は前記一つの透明窓を通って入り、液体サンプ
ルを二度横切り、そして同じ窓を通って出るであろう。
この一つの窓が入口窓および出口窓の両者として機能す
る。本発明は顕微鏡分析用の容器に限定されるものでは
なく、顕微鏡以外の光学系で調べられる、より大きなサ
イズの容器にも適用可能である。
【００１０】吸収用染料が加えられ、そして液体サンプ
ル内に均しく分配される。染料は、赤血球内に漏入しな
いものが選ばれる。また、それは、赤血球内での吸収が
弱いのみのスペクトル領域内で励起光を吸収すべきであ
る。ヘモグロビンが赤血球における支配的な吸収体であ
るので、照明波長は６００ｎｍより長くなければならな
い。一つの良好な染料候補はTO-PRO-3（例えば、オレゴ
ン州、EugeneのMolecular Probes, Inc.より販売されて
いる）であり、６４０ｎｍ近傍の波長範囲内で照明さ
れ、ここで、それは１．１４*１０5Ｌ/Ｍｃｍの吸収係
数を有している。他の可能な染料はTO-PRO-５（Molecul
ar Probes, Inc.より販売されている）であり、赤血球
内に漏入せず、７５０ｎｍ近傍で照明され、１．２１*
１０5Ｌ/Ｍｃｍの吸収係数を有している。
ル内に均しく分配される。染料は、赤血球内に漏入しな
いものが選ばれる。また、それは、赤血球内での吸収が
弱いのみのスペクトル領域内で励起光を吸収すべきであ
る。ヘモグロビンが赤血球における支配的な吸収体であ
るので、照明波長は６００ｎｍより長くなければならな
い。一つの良好な染料候補はTO-PRO-3（例えば、オレゴ
ン州、EugeneのMolecular Probes, Inc.より販売されて
いる）であり、６４０ｎｍ近傍の波長範囲内で照明さ
れ、ここで、それは１．１４*１０5Ｌ/Ｍｃｍの吸収係
数を有している。他の可能な染料はTO-PRO-５（Molecul
ar Probes, Inc.より販売されている）であり、赤血球
内に漏入せず、７５０ｎｍ近傍で照明され、１．２１*
１０5Ｌ/Ｍｃｍの吸収係数を有している。
【００１１】本発明は上述の二つの染料に限定されない
ことは当業者には明らかである。赤血球の測定のための
スペクトル条件を満たす他の多くの染料も利用可能であ
り、他の粒子のためのスペクトル条件を満たす多くの染
料でさえも利用可能である。もちろん、サンプルを容器
の中に配置する前に吸収用染料を液体サンプル内に加
え、均しく分配することも本発明の意図するところであ
る。
ことは当業者には明らかである。赤血球の測定のための
スペクトル条件を満たす他の多くの染料も利用可能であ
り、他の粒子のためのスペクトル条件を満たす多くの染
料でさえも利用可能である。もちろん、サンプルを容器
の中に配置する前に吸収用染料を液体サンプル内に加
え、均しく分配することも本発明の意図するところであ
る。
【００１２】図１は、硬い入口窓（１）、可撓性の出口
窓（３）を有し、懸濁された赤血球を含む液体サンプル
（４）を包含する光学キュベット（２０）を備えた測定
装置を示す。キュベットは、可撓性カバースリップ
（３）を保持するスペーサ（２，２’）を支持している
共通の顕微鏡スライド（１）を用いることによって作ら
れている。血液の血漿（４）のような液体内の赤血球の
懸濁が、スライド（１）およびカバースリップ（３）の
間に包含されている。光学キュベットは、交換可能な対
物レンズ（８，９，１０）およびサンプルの照明源
（６）を有する共通の透過顕微鏡（７）のＸＹＺ-ステ
ージ（５）上に位置されている。図２に示されるよう
に、顕微鏡（７）にはＣＣＤカメラ（２１）が備えら
れ、ＣＣＤカメラ（２１）は、データを保管し、画像処
理手順を実行するコンピュータ（２２）に接続されてい
る。コンピュータ（２２）はまた、必要に応じキュベッ
ト（２０）を移動させるためにＸＹＺ-ステージ（５）
にも接続されている。
窓（３）を有し、懸濁された赤血球を含む液体サンプル
（４）を包含する光学キュベット（２０）を備えた測定
装置を示す。キュベットは、可撓性カバースリップ
（３）を保持するスペーサ（２，２’）を支持している
共通の顕微鏡スライド（１）を用いることによって作ら
れている。血液の血漿（４）のような液体内の赤血球の
懸濁が、スライド（１）およびカバースリップ（３）の
間に包含されている。光学キュベットは、交換可能な対
物レンズ（８，９，１０）およびサンプルの照明源
（６）を有する共通の透過顕微鏡（７）のＸＹＺ-ステ
ージ（５）上に位置されている。図２に示されるよう
に、顕微鏡（７）にはＣＣＤカメラ（２１）が備えら
れ、ＣＣＤカメラ（２１）は、データを保管し、画像処
理手順を実行するコンピュータ（２２）に接続されてい
る。コンピュータ（２２）はまた、必要に応じキュベッ
ト（２０）を移動させるためにＸＹＺ-ステージ（５）
にも接続されている。
【００１３】図３は、弱吸収性の赤血球を包含する領域
および細胞を包含しない領域を備えた光学キュベットを
概略的に示している。矢印はサンプルを横断する光子の
流れを示し、幅の減少は吸収の結果として減少している
光強度の指示として意味されている。図３に示されるよ
うに、赤血球内の光学的吸収は弱いので、強度における
低下は生じない。
および細胞を包含しない領域を備えた光学キュベットを
概略的に示している。矢印はサンプルを横断する光子の
流れを示し、幅の減少は吸収の結果として減少している
光強度の指示として意味されている。図３に示されるよ
うに、赤血球内の光学的吸収は弱いので、強度における
低下は生じない。
【００１４】作動時には、図１および２を再度参照する
に、可撓性窓（３）が対物レンズ（１０）に取付けられ
た固定プランジャ（１１）に物理的に接触するまで、キ
ュベット（２０）がステージ（５）により上方に移動さ
れる。顕微鏡（７）の焦平面は、可撓性窓（３）がプラ
ンジャ（１１）に触れているなら、液体サンプル（４）
内に存するようにされている。必要であれば、赤血球を
包含しないサンプル領域が視野内に入るまで、キュベッ
ト（２０）はＸおよびＹ方向に移動される。もしも、サ
ンプルが全血液であれば、赤血球を包含しない領域を容
易に利用可能とするために、２μｍから３０μｍの範囲
のキュベット厚さを用いるのが適切である。希釈された
血液サンプルに対しては、より厚いキュベットが用いら
れ得る。
に、可撓性窓（３）が対物レンズ（１０）に取付けられ
た固定プランジャ（１１）に物理的に接触するまで、キ
ュベット（２０）がステージ（５）により上方に移動さ
れる。顕微鏡（７）の焦平面は、可撓性窓（３）がプラ
ンジャ（１１）に触れているなら、液体サンプル（４）
内に存するようにされている。必要であれば、赤血球を
包含しないサンプル領域が視野内に入るまで、キュベッ
ト（２０）はＸおよびＹ方向に移動される。もしも、サ
ンプルが全血液であれば、赤血球を包含しない領域を容
易に利用可能とするために、２μｍから３０μｍの範囲
のキュベット厚さを用いるのが適切である。希釈された
血液サンプルに対しては、より厚いキュベットが用いら
れ得る。
【００１５】一旦、赤血球を包含しない領域が見出され
ると、サンプルは適切な波長の光で照明源（６）により
照射され、その領域において再出現している透過光の強
度Ｉ 1がＣＣＤカメラ（２１）により測定され、その結
果がコンピュータ（２２）に保管される。これは図４に
図解されている。次のステップでは、キュベット（２
０）がステージ（５）により、小さく、しかし正確に知
られた距離Δｈだけさらに上方に移動される。キュベッ
ト（２０）を固定プランジャ（１１）に対して上方に移
動させると、Δｈと同じ量のキュベット内の光路長の減
少になる。キュベット（２０）が移動されたとき、同じ
領域における新たな再出現光強度Ｉ2が測定され、その
結果がコンピュータ（２２）に保管される。新たな光強
度Ｉ2は最初の強度Ｉ1より高い値を有する。何故なら、
より小さなサンプル厚みは、サンプル内での光吸収が少
ないからである。
ると、サンプルは適切な波長の光で照明源（６）により
照射され、その領域において再出現している透過光の強
度Ｉ 1がＣＣＤカメラ（２１）により測定され、その結
果がコンピュータ（２２）に保管される。これは図４に
図解されている。次のステップでは、キュベット（２
０）がステージ（５）により、小さく、しかし正確に知
られた距離Δｈだけさらに上方に移動される。キュベッ
ト（２０）を固定プランジャ（１１）に対して上方に移
動させると、Δｈと同じ量のキュベット内の光路長の減
少になる。キュベット（２０）が移動されたとき、同じ
領域における新たな再出現光強度Ｉ2が測定され、その
結果がコンピュータ（２２）に保管される。新たな光強
度Ｉ2は最初の強度Ｉ1より高い値を有する。何故なら、
より小さなサンプル厚みは、サンプル内での光吸収が少
ないからである。
【００１６】光路長における変化Δｈと共に二つの再出
現光強度値Ｉ1およびＩ2は、「再出現光強度における変
化/サンプル厚みにおける変化」の比を計算することに
より、装置を較正するために用いられ得る。図４を参照
して、この較正は以下のように説明され得る。
現光強度値Ｉ1およびＩ2は、「再出現光強度における変
化/サンプル厚みにおける変化」の比を計算することに
より、装置を較正するために用いられ得る。図４を参照
して、この較正は以下のように説明され得る。
【００１７】液体サンプルが励起光により均等に照射さ
れていると仮定すると、第１の再出現光強度Ｉ1は次式
（１）で与えられる。
れていると仮定すると、第１の再出現光強度Ｉ1は次式
（１）で与えられる。
【００１８】
【数１】
【００１９】ここで、Ｉ0は照明強度、aは光吸収染料の
吸収係数、ｃは染料の濃度である。量ｈ1は、測定され
ている領域におけるキュベット（２０）の光路長（すな
わち厚み）である。
吸収係数、ｃは染料の濃度である。量ｈ1は、測定され
ている領域におけるキュベット（２０）の光路長（すな
わち厚み）である。
【００２０】キュベットの厚さを、Δｈの量だけ変えた
後に測定される第２の光強度Ｉ2は次式（２）で与えら
れる。
後に測定される第２の光強度Ｉ2は次式（２）で与えら
れる。
【００２１】
【数２】
【００２２】式（２）を式（１）で除算し、そして対数
を取ることにより、我々は、我々の較正量を表している
積a*cについての表現を得る。
を取ることにより、我々は、我々の較正量を表している
積a*cについての表現を得る。
【００２３】
【数３】
【００２４】式（３）は、絶対的なキュベットの厚さｈ
1を知ること、または照明強度Ｉ0を測定する必要がない
ことを示している。何故ならば、これらの２つの量は相
殺されるからである。
1を知ること、または照明強度Ｉ0を測定する必要がない
ことを示している。何故ならば、これらの２つの量は相
殺されるからである。
【００２５】上に概略述べたような較正を実行した後、
本発明による方法では、単体の赤血球の体積が以下の方
法で測定される。
本発明による方法では、単体の赤血球の体積が以下の方
法で測定される。
【００２６】第１のステップにおいて赤血球が存在する
領域ARBCにおいて再出現している光強度Ｉ4が測定され
る。この瞬間のために、我々は、赤血球が面積ＡRBCで
高さｈ RBCの円柱形状を有していると仮定する（図５を
見よ）。我々はまた、液体サンプル層の高さをｈ2（ｈ1
とは等しくあるべきでない）および照明強度をＩ0’
（Ｉ0とは同じであるべきでない）と仮定する。これら
の条件の下に、我々は、再出現している光強度について
次式を得る。
領域ARBCにおいて再出現している光強度Ｉ4が測定され
る。この瞬間のために、我々は、赤血球が面積ＡRBCで
高さｈ RBCの円柱形状を有していると仮定する（図５を
見よ）。我々はまた、液体サンプル層の高さをｈ2（ｈ1
とは等しくあるべきでない）および照明強度をＩ0’
（Ｉ0とは同じであるべきでない）と仮定する。これら
の条件の下に、我々は、再出現している光強度について
次式を得る。
【００２７】
【数４】
【００２８】第２のステップにおいて、同じ赤血球の近
くの同じ体積の領域ＡRBCにおいて再出現している光強
度Ｉ3が測定される。Ｉ4に対するのと同じ条件の下に、
我々は、次式を得る。
くの同じ体積の領域ＡRBCにおいて再出現している光強
度Ｉ3が測定される。Ｉ4に対するのと同じ条件の下に、
我々は、次式を得る。
【００２９】
【数５】
【００３０】式（４）を式（５）で除算して、我々は、
次式を得る。
次式を得る。
【００３１】
【数６】
【００３２】
【数７】
【００３３】面積ＡRBCの円柱状細胞については、細胞
の体積が、細胞面積と式（７）に与えられたような細胞
高さを乗算することにより計算され得、次式の結果とな
る。
の体積が、細胞面積と式（７）に与えられたような細胞
高さを乗算することにより計算され得、次式の結果とな
る。
【００３４】
【数８】
【００３５】または、積a*cについての式（３）と共
に、次式の結果となる。
に、次式の結果となる。
【００３６】
【数９】
【００３７】式（９）は、本発明による方法がキュベッ
トの厚みに関する異なる測定および再出現する光強度に
関するレシオメトリックな測定に基づいていることを示
している。換言すると、キュベットの絶対的厚みを知る
必要がないことである。さらに、キュベットに導入され
る励起強度を知る必要がないことである。
トの厚みに関する異なる測定および再出現する光強度に
関するレシオメトリックな測定に基づいていることを示
している。換言すると、キュベットの絶対的厚みを知る
必要がないことである。さらに、キュベットに導入され
る励起強度を知る必要がないことである。
【００３８】式（９）はまた、器械のパラメータにおけ
る全ての長期間のドリフトが相殺されることを示してい
る。これは、赤血球の体積ＶRBCが光電流の比から計算
されるという事実に帰している。換言すると、較正手順
が測定と時間的に近くで行われるならば、本発明による
方法は極めて頑健である。この条件は、較正手順は測定
されている同じサンプルに対して行われるので、常に満
たされるであろう。
る全ての長期間のドリフトが相殺されることを示してい
る。これは、赤血球の体積ＶRBCが光電流の比から計算
されるという事実に帰している。換言すると、較正手順
が測定と時間的に近くで行われるならば、本発明による
方法は極めて頑健である。この条件は、較正手順は測定
されている同じサンプルに対して行われるので、常に満
たされるであろう。
【００３９】今まで、赤血球は円柱形状を有していると
仮定されていた。赤血球の形状は不規則であり得、且
つ、キュベット内の細胞のＺ位置は、較正された細胞の
体積には影響しないということが示され得る。細胞の体
積ＶRBCは、次式によって空間に依存する細胞高さｈRBC
（ξ、η）に関係される。
仮定されていた。赤血球の形状は不規則であり得、且
つ、キュベット内の細胞のＺ位置は、較正された細胞の
体積には影響しないということが示され得る。細胞の体
積ＶRBCは、次式によって空間に依存する細胞高さｈRBC
（ξ、η）に関係される。
【００４０】
【数１０】
【００４１】式(１０）において、ここで、量ξおよび
ηは、赤血球内で独立のＸおよびＹ変数を表す。必要と
される積分は、ＣＣＤカメラの光感ターゲット上で赤血
球により占められている面積ＡRBC内のピクセル強度Ｉ4
（ξ、η）を加算することにより容易に実行される。
ηは、赤血球内で独立のＸおよびＹ変数を表す。必要と
される積分は、ＣＣＤカメラの光感ターゲット上で赤血
球により占められている面積ＡRBC内のピクセル強度Ｉ4
（ξ、η）を加算することにより容易に実行される。
【００４２】
【数１１】
【００４３】式（７）および（１０）を組合せると、本
発明により測定されるような赤血球体積についての最終
表現を表すものとなる。
発明により測定されるような赤血球体積についての最終
表現を表すものとなる。
【００４４】式（１１）に示されている積分手順は、赤
血球によって占められている正に領域上は実行されるべ
きでない。替りに、細胞を含んでいる幾らか大きめの領
域上で実行されてもよい。細胞の外では、Ｉ4（ξ、
η）はＩ3と同じであり、よって、ｌｇ[Ｉ4（ξ、η）/
Ｉ3]＝０となる。換言すると、細胞の周囲を越えるより
大きな領域上に積分を拡大しても、較正された細胞の体
積に対する追加の貢献とはならない。本発明のこの形態
は、検査されている個々の細胞全てに対して単純な一寸
法、一形状の積分領域の使用を許容する。結果として、
必要とされる計算がより短時間内に実行され得ることに
なる。式（１１）が意味するとき、細胞の近くの強度Ｉ
3は一定であるということが仮定されていることに注意
すべきである。Ｉ4（ξ、η）は実際には単一のＣＣＤ
ピクセルの強度として測定されるが、Ｉ3は、ピクセル
数により除された、領域上の全てのピクセルの強度の合
計として最大の精度で測定され得る。換言すると、Ｉ3
は、細胞の近くの平均ピクセル強度である。
血球によって占められている正に領域上は実行されるべ
きでない。替りに、細胞を含んでいる幾らか大きめの領
域上で実行されてもよい。細胞の外では、Ｉ4（ξ、
η）はＩ3と同じであり、よって、ｌｇ[Ｉ4（ξ、η）/
Ｉ3]＝０となる。換言すると、細胞の周囲を越えるより
大きな領域上に積分を拡大しても、較正された細胞の体
積に対する追加の貢献とはならない。本発明のこの形態
は、検査されている個々の細胞全てに対して単純な一寸
法、一形状の積分領域の使用を許容する。結果として、
必要とされる計算がより短時間内に実行され得ることに
なる。式（１１）が意味するとき、細胞の近くの強度Ｉ
3は一定であるということが仮定されていることに注意
すべきである。Ｉ4（ξ、η）は実際には単一のＣＣＤ
ピクセルの強度として測定されるが、Ｉ3は、ピクセル
数により除された、領域上の全てのピクセルの強度の合
計として最大の精度で測定され得る。換言すると、Ｉ3
は、細胞の近くの平均ピクセル強度である。
【００４５】較正精度を上げるためには、キュベットの
厚みにおいて一つ以上の変化を利用することが可能であ
る。図６は、約１８μｍのキュベットの厚みが０．２μ
ｍ毎の１０ステップで約２０μｍまで増大された場合、
任意のユニットにおける再出現している光強度の計算さ
れたプロットを示す。この例では、濃度ｃ＝１ｍＭ/Ｌ
のTO-PRO-3（波長６４０ｎｍにおいて吸収係数a＝１．
１４４*１０5Ｌ/Ｍｃｍを有している）が吸収用染料と
して採用された。図６から分かるように、厚みの変化の
比較的小さな範囲内では、光強度が厚みの関数として直
線関係で表され得る。最良の適合度を表している、図６
に破線によって示されている強度における最大５．４％
の変化を用いて、我々は、a*c＝ｌｇ（０．６２２３/
０．５９０３）/（２．０*１０-4ｃｍ）＝１１４．６３
ｃｍ-1の値を計算し、これは、もちろん、期待された値
１１４．４４ｃｍ-1に充分に一致する。
厚みにおいて一つ以上の変化を利用することが可能であ
る。図６は、約１８μｍのキュベットの厚みが０．２μ
ｍ毎の１０ステップで約２０μｍまで増大された場合、
任意のユニットにおける再出現している光強度の計算さ
れたプロットを示す。この例では、濃度ｃ＝１ｍＭ/Ｌ
のTO-PRO-3（波長６４０ｎｍにおいて吸収係数a＝１．
１４４*１０5Ｌ/Ｍｃｍを有している）が吸収用染料と
して採用された。図６から分かるように、厚みの変化の
比較的小さな範囲内では、光強度が厚みの関数として直
線関係で表され得る。最良の適合度を表している、図６
に破線によって示されている強度における最大５．４％
の変化を用いて、我々は、a*c＝ｌｇ（０．６２２３/
０．５９０３）/（２．０*１０-4ｃｍ）＝１１４．６３
ｃｍ-1の値を計算し、これは、もちろん、期待された値
１１４．４４ｃｍ-1に充分に一致する。
【００４６】本発明による単体赤血球の体積を測定する
方法は、全血液または希釈血液サンプルにも適用され得
る。本発明はまた、個々の粒子または細胞だけでなく赤
血球の全クラスターまたは他の懸濁液内の粒子にも適用
できる。また、この方法を、ビードまたは他の粒子また
は細胞、例えば、原核生物、細菌、真核生物、哺乳綱、
組織培養または人細胞のような液中に懸濁された他の粒
子に適用することも本発明の意図するところである。本
発明はまた、他の懸濁液やサンプルもしくはそれらの希
釈液中の粒子や細胞にも適用され得ることは当業者には
明らかであり、かかる医学または生物学的サンプルは、
細菌培養や血液、尿、痰、唾液およびリンパ液のような
他の体液を含む、組織培養または他の培養内の細胞を含
んでいる。
方法は、全血液または希釈血液サンプルにも適用され得
る。本発明はまた、個々の粒子または細胞だけでなく赤
血球の全クラスターまたは他の懸濁液内の粒子にも適用
できる。また、この方法を、ビードまたは他の粒子また
は細胞、例えば、原核生物、細菌、真核生物、哺乳綱、
組織培養または人細胞のような液中に懸濁された他の粒
子に適用することも本発明の意図するところである。本
発明はまた、他の懸濁液やサンプルもしくはそれらの希
釈液中の粒子や細胞にも適用され得ることは当業者には
明らかであり、かかる医学または生物学的サンプルは、
細菌培養や血液、尿、痰、唾液およびリンパ液のような
他の体液を含む、組織培養または他の培養内の細胞を含
んでいる。
【００４７】液体サンプルの光学的性質に依存して、本
方法はより高い厚みのキュベットにも適用され得る。可
撓性の窓を用いることは、キュベットの厚みの変更を達
成する唯一つの例である。硬い窓とゴムのような可撓性
材料から作られたスペーサを用いることも可能であろ
う。局部的なスペーサの替りに可撓性のキュベット壁を
利用することによるさらに他の実施形態も可能であろ
う。また、キュベット厚みの変更は、キュベットの主要
部を固定したまま、窓が動くように窓に正または負圧を
作用させることでも達成され得る。かかる正または負圧
は、圧力または真空の使用を含んでもよい。
方法はより高い厚みのキュベットにも適用され得る。可
撓性の窓を用いることは、キュベットの厚みの変更を達
成する唯一つの例である。硬い窓とゴムのような可撓性
材料から作られたスペーサを用いることも可能であろ
う。局部的なスペーサの替りに可撓性のキュベット壁を
利用することによるさらに他の実施形態も可能であろ
う。また、キュベット厚みの変更は、キュベットの主要
部を固定したまま、窓が動くように窓に正または負圧を
作用させることでも達成され得る。かかる正または負圧
は、圧力または真空の使用を含んでもよい。
【００４８】既に上述したように、本発明は光学顕微鏡
に限定されない。粒子を包含する領域および粒子を包含
しない領域における透過光強度の測定を許容する全ての
画像形成システムが本発明を実施するのに適している。
画像形成システムはレンズを包含してもよいが、いわゆ
る近接配置の光ファイバ要素を用いてもよい。この場
合、可干渉性の光ファイバ束がキュベット窓と画像形成
光検知器との間に配列される。最後に、キュベット窓を
横切る光のビームを走査し、キュベットの厚みを変えつ
つ非画像形成光検知器で再出現された透過光をモニター
することもさらに本発明の意図内にある。
に限定されない。粒子を包含する領域および粒子を包含
しない領域における透過光強度の測定を許容する全ての
画像形成システムが本発明を実施するのに適している。
画像形成システムはレンズを包含してもよいが、いわゆ
る近接配置の光ファイバ要素を用いてもよい。この場
合、可干渉性の光ファイバ束がキュベット窓と画像形成
光検知器との間に配列される。最後に、キュベット窓を
横切る光のビームを走査し、キュベットの厚みを変えつ
つ非画像形成光検知器で再出現された透過光をモニター
することもさらに本発明の意図内にある。
【００４９】較正のステップ、すなわち、式（３）によ
る量「再出現光の変化/サンプル厚みの変化」を測定す
るステップは、検査下にある粒子にごく接近して実行さ
れ得る。この場合、図４を参照するに、単一の粒子の近
隣における再出現光強度を最初に測定するであろう。次
のステップで、光学キュベットのこの領域における厚み
がΔｈの量だけ変えられ、そして新たな再出現光強度が
測定される。第３のステップで、粒子により占められて
いる領域における再出現光強度が測定される。最初の二
つのステップは必要とされる較正を与え、第２および第
３のステップは実際の体積測定のために必要な２つの再
出現光強度値を与える。本発明によるこの第２の手順
は、４つのステップに換えて３つが必要とされるという
利点を有する。本発明による第１の手順は、増大された
厚みのキュベット領域内での較正を許容し、増大された
再出現光強度レベルの故に、より精確な較正値を許容す
る。実際には、使用者が手近な優先度に基づいて決定し
なければならない。
る量「再出現光の変化/サンプル厚みの変化」を測定す
るステップは、検査下にある粒子にごく接近して実行さ
れ得る。この場合、図４を参照するに、単一の粒子の近
隣における再出現光強度を最初に測定するであろう。次
のステップで、光学キュベットのこの領域における厚み
がΔｈの量だけ変えられ、そして新たな再出現光強度が
測定される。第３のステップで、粒子により占められて
いる領域における再出現光強度が測定される。最初の二
つのステップは必要とされる較正を与え、第２および第
３のステップは実際の体積測定のために必要な２つの再
出現光強度値を与える。本発明によるこの第２の手順
は、４つのステップに換えて３つが必要とされるという
利点を有する。本発明による第１の手順は、増大された
厚みのキュベット領域内での較正を許容し、増大された
再出現光強度レベルの故に、より精確な較正値を許容す
る。実際には、使用者が手近な優先度に基づいて決定し
なければならない。
【００５０】本発明がいくつかの好ましい実施の形態に
関して説明されたが、当業者は本発明の範囲から逸脱す
ることなく本発明の種々の変更および改良がなされ得る
ことを理解するであろう。さらに、一つの実施形態の個
々の特徴は他の実施形態のものではないが、一つの実施
形態の個々の特徴は他の実施形態の一つ以上の特徴また
は複数の実施形態からの特徴と組合されてもよいことは
明かであろう。
関して説明されたが、当業者は本発明の範囲から逸脱す
ることなく本発明の種々の変更および改良がなされ得る
ことを理解するであろう。さらに、一つの実施形態の個
々の特徴は他の実施形態のものではないが、一つの実施
形態の個々の特徴は他の実施形態の一つ以上の特徴また
は複数の実施形態からの特徴と組合されてもよいことは
明かであろう。
【図１】硬い入口窓と可撓性出口窓を有し、懸濁された
赤血球を含む液体サンプルを包含する光学キュベットを
備える測定装置を示す。
赤血球を含む液体サンプルを包含する光学キュベットを
備える測定装置を示す。
【図２】サンプル容器、ＸＹＺステージ、透過式顕微
鏡、ＣＣＤカメラおよびコンピュータが完備した装置を
示す。
鏡、ＣＣＤカメラおよびコンピュータが完備した装置を
示す。
【図３】弱吸収赤血球を包含する領域と細胞を包含しな
い他の領域を備える光学キュベットを概略的に示す。矢
印はサンプルを横断する光子の流れを示し、幅の減少は
吸収の結果として減少している光強度の指示として意味
されている。
い他の領域を備える光学キュベットを概略的に示す。矢
印はサンプルを横断する光子の流れを示し、幅の減少は
吸収の結果として減少している光強度の指示として意味
されている。
【図４】較正手順を示し、ここで、赤血球を包含しない
領域におけるキュベットの厚みが規定された量Δｈだけ
変えられ、再出現している光強度Ｉ1およびＩ2が厚みを
変える前後において測定される。この例では、キュベッ
トの厚みは減少されている。
領域におけるキュベットの厚みが規定された量Δｈだけ
変えられ、再出現している光強度Ｉ1およびＩ2が厚みを
変える前後において測定される。この例では、キュベッ
トの厚みは減少されている。
【図５】測定手順を示し、ここで、再出現している光強
度Ｉ3およびＩ4が赤血球が存在する領域および同じ細胞
に近い領域において測定される。図５において、我々
は、高さｈRBCの円柱状細胞と仮定した。
度Ｉ3およびＩ4が赤血球が存在する領域および同じ細胞
に近い領域において測定される。図５において、我々
は、高さｈRBCの円柱状細胞と仮定した。
【図６】約１８μｍのキュベットの厚みが０．２μｍ毎
の１０ステップで約２０μｍまで増大された場合、任意
のユニットにおける再出現している光強度の計算された
プロットを示す。この例では、濃度ｃ＝１ｍＭ/ＬのTO-
PRO-3（波長６４０ｎｍにおいて吸収係数a＝１．１４４
*１０5Ｌ/Ｍｃｍを有している）が吸収用染料として採
用された。
の１０ステップで約２０μｍまで増大された場合、任意
のユニットにおける再出現している光強度の計算された
プロットを示す。この例では、濃度ｃ＝１ｍＭ/ＬのTO-
PRO-3（波長６４０ｎｍにおいて吸収係数a＝１．１４４
*１０5Ｌ/Ｍｃｍを有している）が吸収用染料として採
用された。
１ 顕微鏡スライド ２、２’ スペーサ ３ カバースリップ（可撓性窓） ４ 液体サンプル ５ ＸＹＺ-ステージ ６ 照明源 ７ 顕微鏡 ８、９，１０ 対物レンズ １１ 固定プランジャ ２０ 光学キュベット ２１ ＣＣＤカメラ ２２ コンピュータ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 クラウス ダブリュ．バーント アメリカ合衆国 21093 メリーランド州 ティモニウム ロックビュー テラス 305 Ｆターム(参考） 2G045 AA02 BA11 BB24 CA02 FA11 FA16 GA07 GA10 GC08 2G059 AA03 BB09 BB13 CC16 DD01 DD13 EE01 FF01 FF03 FF12 HH02 HH06 JJ11 JJ17 KK04 LL01 MM14
Claims (10)
- 【請求項１】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液を容器であって、透過測定を実行する
に適した容器内に配置し、 （c）前記容器内の前記懸濁液に、前記粒子に実質的に
漏入しない吸収用染料であって、前記粒子により弱く吸
収されるのみの波長で励起光を吸収することができる吸
収用染料を加え、 （d）前記懸濁液を、前記染料により吸収されるが前記
粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選択され
た波長の光で照明し、 （e）前記懸濁液の第１の領域であって、粒子を包含し
ない第１の領域において前記懸濁液から再出現する透過
光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記懸濁液
から再出現する透過光の第２の強度を測定し、 （g）前記懸濁液の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記懸濁液から
再出現する透過光の第３の強度を測定し、 （h）前記第２の領域の前記少なくとも一つの粒子に近
い前記懸濁液の第３の領域から再出現する透過光の第４
の強度を測定し、そして （i）前記透過光強度値および前記容器の厚みにおける
既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の体
積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液に、前記粒子に実質的に漏入しない吸
収用染料であって、前記粒子により弱く吸収されるのみ
の波長で励起光を吸収することができる吸収用染料を加
え、混合物を形成し、 （c）前記混合物を容器であって、透過測定を実行する
に適した容器内に配置し、 （d）前記混合物を、前記染料により吸収されるが前記
粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選択され
た波長の光で照明し、 （e）前記混合物の第１の領域であって、粒子を包含し
ない第１の領域において前記混合物から再出現する透過
光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記混合物
から再出現する透過光の第２の強度を測定し、 （g）前記混合物の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記混合物から
再出現する透過光の第３の強度を測定し、 （h）前記第２の領域の前記少なくとも一つの粒子に近
い前記混合物の第３の領域から再出現する透過光の第４
の強度を測定し、そして （i）前記透過光強度値および前記容器の厚みにおける
既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の体
積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３】 粒子は、人細胞または赤血球であること
を特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 液体は、体液、組織培養細胞または細菌
細胞を含む生物学的または医学的サンプルであることを
特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 容器は、光学キュベットであり、染料は
TO-PRO-3およびTO-PRO-5から成る群から選ばれたもので
あることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項６】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液を容器であって、透過測定を実行する
に適した容器内に配置し、 （c）前記容器内の前記懸濁液に、前記粒子に実質的に
漏入しない吸収用染料であって、前記粒子により弱く吸
収されるのみの波長で励起光を吸収することができる吸
収用染料を加え、 （d）前記懸濁液を、前記染料により吸収されるが前記
粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選択され
た波長の光で照明し、 （e）前記懸濁液の第１の領域であって、粒子の近くに
位置された第１の領域において前記懸濁液から再出現す
る透過光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記懸濁液
から再出現する透過光の第２の強度を測定し、 （g）前記懸濁液の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記懸濁液から
再出現する透過光の第３の強度を測定し、そして （h） 前記透過光強度値および前記容器の厚みにおけ
る既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の
体積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項７】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液に、前記粒子に実質的に漏入しない吸
収用染料であって、前記粒子により弱く吸収されるのみ
の波長で励起光を吸収することができる吸収用染料を加
え、混合物を形成し、 （c）前記混合物を容器であって、透過測定を実行する
に適した容器内に配置し、 （d）前記混合物を、前記染料により吸収されるが前記
粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選択され
た波長の光で照明し、 （e）前記混合物の第１の領域であって、粒子の近くに
位置された第１の領域において前記混合物から再出現す
る透過光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記混合物
から再出現する透過光の第２の強度を測定し、 （g）前記混合物の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記混合物から
再出現する透過光の第３の強度を測定し、そして （h）前記透過光強度値および前記容器の厚みにおける
既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の体
積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項８】 粒子は、人細胞または赤血球であること
を特徴とする請求項６または７に記載の方法。 - 【請求項９】 液体は、体液、組織培養細胞または細菌
細胞を含む生物学的または医学的サンプルであることを
特徴とする請求項６または７に記載の方法。 - 【請求項１０】 容器は、光学キュベットであり、染料
はTO-PRO-3およびTO-PRO-5から成る群から選ばれたもの
であることを特徴とする請求項６または７に記載の方
法。
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-
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2002
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