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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Untersuchung der Anheftung oder Ablösung lebender oder
toter Zellen oder zellähnlicher Partikel oder sonstiger
Oberflächenbelegung an Oberflächen mittels Plasmonenresonanz sowie
auf die Verwendung dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung.
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Bei
dem Phänomen der Oberflächenplasmonenresonanz
(SPR – surface plasmon resonance) handelt es sich um eine
kollektive Anregung der Elektronen an der Oberfläche einer
Freielektronen aufweisenden Schicht. Die Resonanzfrequenz der Oberflächenplasmonen
ist sehr empfindlich auf den Brechungsindex des Mediums, das an
die sensitive Oberfläche angrenzt. Dieses wird genutzt,
um dünne Schichten hinsichtlich des Brechungsindexes oder der
Schichtdicke zu vermessen.
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Insbesondere
in der Biosensorik wird dieser Effekt genutzt, um die Anlagerungskinetik
von Biomolekülen aus einer Probenflüssigkeit an
eine funktionalisierte Metalloberfläche zu untersuchen.
Hierzu wird zeitaufgelöst die Resonanzbedingung der Oberflächenplasmonen
detektiert. Die Oberflächenplasmonen der dünnen
Metallschicht werden durch Licht angeregt, das unter einem bestimmten
Winkel oder innerhalb eines Winkelbereichs auf die Metallschicht fällt.
Die Resonanzbedingung ist dann für eine bestimmte Kombination
von Wellenlänge und Einfallswinkel erfüllt. Unter
dieser Resonanzbedingung ist die Intensität des an der
Metallschicht reflektierten Lichtes auf Grund der Erzeugung der
Oberflächenplasmonen deutlich vermindert. Zum Auffinden
der Resonanzbedingung kann entweder der Einfallswinkel (bei konstanter
Wellenlänge) oder die Wellenlänge (bei konstantem
Einfallswinkel) durchgestimmt werden und die Intensität
des reflektierten Lichtes detektiert werden. Im Allgemeinen wird
mit einem Gold beschichteten Glaskörper (Prisma) und mit
Licht von konstanter Wellenlänge gearbeitet, das mit einem
für die Plasmonenresonanz in Betracht kommenden Einfallswinkelspektrum
auf die Goldschicht trifft.
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Aus
WO 02/39095 ist ein Plasmonenresonanzsensor
bekannt, bei dem Licht mit einem für die Plasmonenresonanz
in Betracht kommenden Einfallswinkelspektrum auf einen Meßbereich
an der reflektierenden Innenseite einer auf einen lichtdurchlässigen
Körper aufgebrachten Metallschicht oder Halbleiterschicht
geleitet wird, die außenseitig die Oberfläche
trägt, die mit der die Biomoleküle bzw. Zellen
enthaltenden Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird,
wobei die einzelnen Meßpunkte des Meßbereichs
mit dem gesamten Winkelspektrum angestrahlt werden und die von verschiedenen
Punkten des Meßbereichs reflektierten Strahlen mit jeweils gleichen
Einfallswinkeln zusammengeführt und aufgefangen sowie während
einer Zeitspanne kontinuierlich unter Bestimmung des Lichteinfallswinkels
mit der reflektierten geringsten Lichtintensität ausgewertet
und dabei die auftretende Einfallswinkelverschiebung des Intensitätsminimums
gemessen wird.
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Hierbei
wird nicht nur der Zustand an einem Punkt der Meßfläche
betrachtet und ausgewertet, wie es beispielsweise aus der
EP 305 109 B1 mit
der Fokussierung eines Strahlenfächers auf einen Punkt der
Meßfläche der Fall ist, vielmehr wird eine flächige Lichtquelle
in Form eines Lichtwellenleiters mit einem dicken Kerndurchmesser
für die divergente Anstrahlung der Meßbereichspunkte
jeweils mit dem gesamten Winkelspektrum eingesetzt, wobei gleichzeitig mehrere
Parallelmessungen mit dem in schmale benachbarte Meßkanäle
unterteilten angestrahlten Meßbereich durchgeführt
werden. Die gleichzeitige Erfassung des gesamten Meßflächenbereichs
durch die mit einer Kollimationslinse erfolgende Zusammenführung
der reflektierten Strahlen mit gleichen Einfallswinkeln dient der
Gewinnung von Durchschnittswerten der gewonnenen Signale und soll Meßwertverfälschungen
durch örtliche Inhomogenitäten der Metallschicht
bzw. der Oberläche vorbeugen.
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Auch
hier wird wie bei allen anderen bekannten Plasmonenresonanzsensoren
von einer gleichmäßigen Anlagerung an der Oberfläche
ausgegangen und dementsprechend ein einziges Minimum unterstellt,
das sich mit zunehmender Anheftung (Schichtdicke) einfallswinkelbezogen
verschiebt. Überraschenderweise wurde jedoch nunmehr festgestellt,
dass sich beim Anlagern von Zellen an eine entsprechend sensitivierte
oder funktionalisierte Oberfläche nicht nur eine Verschiebung
des Minimums ergibt sondern dass es bei Messungen mit Zellen während
der über mehrere Stunden oder gar Tage erfolgenden Messungen
zu einer Aufspaltung des gemessenen Signals in zumindest zwei gleichzeitig
auftretende Minima kommen kann, die unterschiedlichen Einfallswinkeln
zugeordnet sind.
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Auf
dieser Feststellung basiert die Erfindung, die dadurch gekennzeichnet
ist, dass die Auswertung des reflektierten Lichts derart durchgeführt
wird, dass auch zwei oder mehr gleichzeitig innerhalb der Zeitspanne
auftretende Intensitätsminima für unterschiedliche
Einfallswinkel zeitabhängig registriert werden, wobei die
registrierten Meßsignale den jeweiligen Stand der Oberflächenbelegung
widerspiegeln.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren bietet damit erstmals
die Möglichkeit, Zellanheftungsvorgänge in einem
kontinuierlichen Verfahren zeitlich unbeschränkt sowie
quantitativ unter Ausschluß des subjektiven Eindrucks des
Beobachters zu verfolgen und Rückschlüsse auf
das Bindungsverhalten von Zellen zu ziehen. Bisher lassen sich Aussagen über
die Zelladhäsion nur durch visuelle Verfahren beispielsweise
durch Verwendung eines Mikroskops oder eines Spektrophotometers
gewinnen, wobei jedoch nur eine direkte Beobachtung und keine automatisierte Auswertung
des Anlagerungsprozesses möglich ist. Erst mit dieser automatisierten
Auswertung lassen sich auch evtl. nur kurzzeitig auftretende Besonderheiten
während eines langen, ggf. während mehrerer Tage
kontinuierlich ablaufenden Untersuchungsprozesses sicher aufspüren
und dokumentieren. Die vorgenannten bisherigen Untersuchungsverfahren können
dabei gezielt ergänzend zum erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt werden, um das Auftreten der Minima richtig
deuten zu können.
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Nach
den Erkenntnissen der Erfinder können beispielsweise das
Auftreten eines Doppelminimums oder dessen Auflösung nach
einer bestimmten Zeit den Beginn oder die Beendigung einer Zelladhäsion anzeigen.
Somit lassen sich auf einfache Weise für verschiedene unbeschichtete
und beschichtete synthetische und natürliche Oberflächen
und für unterschiedliche lebende oder tote Zellen Aussagen über das
jeweilige Adhäsionsverhalten sowie über die zugehörigen
zeitlichen Gegebenheiten gewinnen, was in vielfacher Hinsicht Vorteile
bietet.
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Großen
Nutzen verspricht die Erfindung auf einer ganzen Reihe unterschiedlicher
Gebiete, nämlich
- – auf dem
Gebiet der Biologie bzw. Medizin zur Messung der Zelloberflächeninteraktion,
z. B. Entzündungszellen, an der Wundheilung beteiligte Zellen,
an der Embryonalentwicklung beteiligte Zellen, am Gewebeumbau beteiligte
Zellen und an einer malignen Situation beteiligte Zellen;
- – in der Lebensmitteltechnologie z. B. zur Messung
des Einflusses von Substanzen, die durch die Nahrung aufgenommen
und metabolisiert werden, auf die Körperzellen im lebenden
Organismus, z. B. Anbindung von Keimen an Körperzellen;
- – in der Bakteriologie zur Untersuchung der Virulenz
von Pilzen, Bakterien, Viren, Einzellern (Amöben) sowie
Parasiten (Würmern);
- – Messung bei synthetischen Zellen wie Liposomen, die
für den Transport von Pharmaka und therapeutischer DNA
verwendet werden;
- – Anbinden nicht biologischer kompakter Partikel an
Zellen z. B. bei Messung der Interaktion von Abrieb aus Implantaten
mit körpereigenen Zellen oder der Partikel von Kontrastmittel
mit körpereigenen Zellen (Magnetofektion);
- – Messung der Anbindung von Steinen und kristallinen
Strukturen von Zellen, z. B. Nierensteine oder Gallensteine.
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Damit
dient das erfindungsgemäße Verfahren der Überprüfung
der Effektivität von Zelladhärenz fördernden
oder erniedrigenden Substanzen (Pharmakodynamik) oder auch dem Verhalten
von biologischen bzw. nicht biologischen Substanzen im physiologisch
oder partophysiologisch veränderten Organismus.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung mit einem Plasmonenresonanzsensor
mit einem lichtdurchlässigen Körper, einer auf
eine Fläche des Körpers aufgebrachten reflektierenden
Metallschicht oder Halbleiterschicht mit einer für Zellenanlagerungen
sensitivierbaren Oberfläche, einer Lichtquelle zur Erzeugung
eines durch den Körper auf einen Meßbereich der
Innenseite der Schicht einfallen den Strahlengangs mit einem auf
alle Punkte des Meßbereichs fallenden Winkelspektrum, mit
einer Sammeloptik für die Zusammenführung ausfallender Strahlen
mit gleichen Einfallswinkeln und mit einem Detektor, der den reflektierten
ausfallenden Strahlengang auffängt und zeitabhängig
den sich durch Anlagerungen an die sensitive Oberfläche ändernden Einfallswinkel
des Lichts feststellt, bei dem resonanzbedingt ein Intensitätsminimum
an ausfallendem Licht auftritt, wobei dem Detektor eine Auswerteeinrichtung
mit einer Software zur zeit- und winkelabhängigen kontinuierlichen
Registrierung des Intensitätsminimums zugeordnet ist. Eine
solche Vorrichtung ist ebenfalls aus
WO
02/39095 bekannt.
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Erfindungsgemäß sind
bei dieser Vorrichtung die Auswerteeinrichtung und die Software
so beschaffen, dass sie auch zwei oder mehr gleichzeitig auftretende
Intensitätsminima feststellen und zeitabhängig
registrieren.
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Auch
bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in vorteilhafter
Weise der Meßbereich in zwei oder mehr schmale parallele
Meßkanäle unterteilt, denen separate Detektorbereiche
mit jeweils eigener Signalregistrierung zugeordnet sind.
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Schließlich
betrifft die Erfindung auch die Verwendung des Verfahrens und der
Vorrichtung zur Untersuchung der Anheftung oder Ablösung
von Zellen oder zellähnlichen Partikeln auf dem Gebiet
der Biologie/Medizin zur Messung der Zelloberflächeninteraktion,
auf dem Gebiet der Lebensmitteltechnologie zur Messung des Verhaltens
von Nahrungsmittelsubstanzen und Keimen gegenüber Körperzellen,
in der Bakteriologie zur Untersuchung der Virulenz von Pilzen, Bakterien,
Viren, Einzellern oder Parasiten, zur Messung des Anbindungsverhaltens
von synthetischen Zellen wie Liposomen an Körperzellen,
zur Messung der Anbindung nicht biologischer Partikel an körpereigene
Zellen oder zur Untersuchung der Anbindung von Steinen oder kristallinen
Strukturen von Zellen an körpereigene Zellen. Ergänzende
Erläuterungen zu diesen Anwendungsmöglichkeiten finden
sich in den vorangehenden Ausführungen.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels
der Vorrichtung erläutert.
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1 zeigt
in schematischer Darstellung einen erfindungsgemäßen
Plasmonenresonanzsensor;
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2 zeigt
das in 1 angedeutete Diagramm in vergrößerter
Darstellung;
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3 zeigt
für den Zeitpunkt t1 (2)
die Intensität des ausfallenden Lichts für verschiedene Einfallswinkel.
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4 zeigt
ein der Darstellung in 2 entsprechend ausgewertetes
Versuchs ergebnis für eine Adhäsion von Osteoplasten.
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In 1 ist
eine ausgedehnte monochromatische Lichtquelle 1 vorgesehen,
die einem Glasprisma 2 zugeordnet ist, das an seiner Oberseite
eine Goldschicht 3 trägt. Im von der Lichtquelle 1 ausgehenden
und durch die Goldschicht 3 reflektierten Strahlengang
ist eine Kollimationslinse 4 angeordnet, welche die Strahlen
auf einen Detektor 5 leitet, an den eine Auswerteeinrichtung 6 angeschlossen
ist.
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Die
Goldschicht 3 weist an ihrer Oberseite einen durch Grenzflächen 7 abgegrenzten
Meßbereich auf, mit dem die Probenflüssigkeit
(Lösung) mit den Zellen in Kontakt steht. Diese ist zur
Verdeutlichung in ein Medium 8 (Brechungsindex n1) und ein Medium 9 (Brechungsindex
n2) unterteilt. Diese Zweiteilung entspricht
der Vorstellung von zwei unterschiedlichen Zellenzuständen
während eines Anlagerungsprozesses, die gleichzeitig auftretende
Minima des SPR-Signals an verschiedenen Positionen zur Folge haben.
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Eingezeichnet
sind die von den Rändern der ausgedehnten Lichtquelle 1 ausgehenden
Grenzstrahlen, die ein einfallendes Strahlenbündel 10 mit minimalem
Einfallswinkel und ein Strahlenbündel 11 mit maximalem
Einfallswinkel darstellen und damit die Anstrahlung verschiedener
Punkte der Goldschicht 3 mit gleichen Einfallswinkeln zeigen.
Dabei veranschaulicht 1, wie die Kollimationsoptik 4 die
Strahlen mit gleichen Einfallswinkeln auf dem Detektor 5 in
den Sammelpunkten 14 bzw. 17 zusammenführt.
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Vom
ausfallenden Strahlengang sind zusätzlich zwischenliegende
Lichtstrahlen 12 mit jeweils gleichen Einfallswinkeln und
Lichtstrahlen 13 mit einem anderen ebenfalls einheitlichen
Einfallswinkel eingezeichnet, die am Detektor 5 in den
Punkten 16 bzw. 15 zusammenführt werden.
Hierbei handelt es sich um die Einfallswinkel, die den unterschiedlichen Medien 8 und 9 bzw.
den beiden Brechungsindex n1 und n2 zuzuordnen sind, bei dem resonanzbedingt eine
intensive Schwächung der Strahlenintensität auftritt.
Die Punkte 15 und 16 und damit die zugeordneten
Einfallswinkel verschieben sich zeitabhängig während
des Anlagerungsvorgangs zwischen den Punkten 14 und 17.
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Die
mit einer entsprechenden Software ausgestattete Auswerteeinrichtung 6 erfasst
die vom Detektor 5, einer CCD-Kamera, festgestellten Minima und
registriert diese fortlaufend während des gesamten Versuchszeitraums.
Wie angedeutet umfasst die Auswerteeinrichtung 6 eine optische
Anzeige (Bildschirm), auf dem sich der Verlauf der beiden Minima darstellen
lässt. Das geschieht in einem Diagramm, bei dem der Brechungsindex
n über der Zeitachse t aufgetragen ist.
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2 zeigt
das Brechungsindex-Diagramm aus 1 in vergrößerter
Darstellung. Das Diagramm enthält zwei völlig
getrennte Kurven für n1 und n2, also zwei Minima während der
gesamten registrieren Untersuchungsdauer.
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Abweichend
davon können jedoch – bei Verwendung einer anderen
Probenflüssigkeit mit andersartigen Zellen und bei unterschiedlich
präparierten Oberflächen – auch die Minimalwerte
n1 und n2 zeitweise
zusammenfallen, was der Detektion von nur einem einzigen Intensitätsminimum
entspricht, oder für einen begrenzten Zeitraum gleichzeitig
erscheinen oder nach einer gewissen Zeitspanne auseinander laufen
und ggf. nach einer weiteren Zeitspanne wieder miteinander verschmelzen.
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In 3 ist
eine ebenfalls mit der Auswerteeinrichtung 6 erfasste und
darstellbare Momentaufnahme zum Zeitpunkt t1 in 2 wiedergegeben,
bei der über den Einfallwinkeln α des Lichts (gemessen in
den Einfallswinkeln entsprechenden Pixeln) die Lichtintensität
I des reflektierten Lichts dargestellt ist. Entsprechend den Doppelminima
n1 und n2 in 2 ergeben
sich zwei Kurven mit jeweils einem Minimum, das jeweils einem ganz
bestimmten Einfallswinkel zugeordnet ist.
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4 mit
einem 2 entsprechenden Diagramm basiert auf folgender
Versuchsdurchführung: Die gereinigte Goldschicht 3 gemäß 1 wurde
im Bereich eines ersten Meßkanals mit Fibronektin, einem
extrazellulären Glykoprotein, in einer Konzentration von
1 mg/ml beschichtet. Als Negativkontrolle wurde ein zweiter paralleler
Meßkanal auf der Goldschicht 3 mit Rinderserumalbumin
in einer Konzentration von 1 mg/ml beschichtet. Nach dieser Vorbereitung
wurden in beide Meßkanäle Osteoplasten (lebende
Endothelzellen) in einer Konzentration von 225.000 bis 300.000/ml
zugegeben. Diese Lösung (Pufferlösung) wurde durch
die Meßkanäle umgewälzt, so dass eine
ständige Durchmischung stattfand und lose Ablagerungen
auf der Oberfläche weggeschwemmt wurden. Daraufhin konnte
für den ersten Meßkanal ein sich zeitlich verschiebender
Brechungsindex n als Folge eines Intensitätsminimums an
reflektierem Licht festgestellt werden, der in 4 über
der Zeit t aufgetragen ist.
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Das
zum Zeitpunkt t0 einsetzende Brechungsindex-Signal
ist als Meßkurve n1 in 4 dargestellt.
Nach etwa 20 Minuten (t1) wurde das plötzliche
Auftreten eines als Meßkurve n2 in 4 eingezeichneten
zweiten Brechungsindex festgestellt, was dem gleichzeitigen Auftreten
von zwei Intensitätsminima entspricht. Dieser Zustand blieb
ca. 12 Minuten bis zum Zeitpunkt t2 erhalten,
worauf für n1 plötzlich kein
Signal mehr registriert wurde und sich nur noch das zeitlich fortlaufende
Signal für n2 ergab.
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Im
zweiten Meßkanal für die Negativkontrolle konnten
dagegen keine zwei gleichzeitigen Minima wie im in 4 hervorgehobenen
Zeitfenster t1 bis t2 festgestellt
werden. Damit muß das Auftreten des Doppelminimums im Zeitfenster
t1 bis t2 als adhäsionstypisch
gewertet werden und kann dem nur im Meßkanal 1 stattfindenden
Adhäsionsvorgang zeitlich zugeordnet werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 02/39095 [0004, 0012]
- - EP 305109 B1 [0005]