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Die
Erfindung bezieht sich auf einen Plasmonenresonanzsensor, insbesondere
für die
Biosensorik, mit einem lichtdurchlässigen Körper, einer auf eine Fläche des
Körpers
aufgebrachten reflektierenden Metallschicht oder Halbleiterschicht
mit einer für nachzuweisende
Moleküle
sensitivierbaren Oberfläche,
die nebeneinander in einer Reihe angeordnete Teilflächen zur
Bildung jeweils einer von mehreren Meßzellen umfaßt, mit
einer flächigen
Lichtquelle zur Erzeugung eines durch den Körper auf die Innenseite der
Schicht einfallenden Strahlengangs und mit einem Detektor, der den
reflektierten ausfallenden Strahlengang auffängt und zeitabhängig den
sich durch Molekülanlagerungen
an die sensitive Oberfläche ändernden
Einfallswinkel des Lichts feststellt, bei dem resonanzbedingt ein
Intensitätsminimum
an ausfallendem Licht auftritt, wobei im ausfallenden Strahlengang
eine Fourierlinse angeordnet ist und der Detektor im Brennpunktabstand
zur Fourierlinse angeordnet ist.
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Beim
Phänomen
der Oberflächenplasmonenresonanz
(SPR – surface
plasmon resonance) handelt es sich um eine kollektive Anregung der
Elektronen an der Oberfläche
einer Freielektronen aufweisenden Schicht. Die Resonanzfrequenz
der Oberflächenplasmonen
ist sehr empfindlich auf den Brechungsindex des Mediums, das an
die sensitive Oberfläche
angrenzt. Dieses kann genutzt werden, um dünne Schichten hinsichtlich
des Brechungsindexes oder der Schichtdicke (bis zu etwa einer Lichtwellenlänge) zu
vermessen. Insbesondere in der Biosensorik wird dieser Effekt genutzt,
um die Anlagerungskinetik von Biomolekülen aus einer Probenflüssigkeit
an eine funktionalisierte Metalloberfläche zu untersuchen. Hierzu
wird zeitaufge löst
die Resonanzbedingung der Oberflächenplasmonen
detektiert. Die Oberflächenplasmonen
der dünnen
Metallschicht werden durch Licht angeregt, das unter einem bestimmten
Winkel oder Winkelbereich auf die Metallschicht fällt. Die
Resonanzbedingung ist dann für
eine bestimmte Kombination von Wellenlänge und Einfallswinkel erfüllt. Unter
dieser Resonanzbedingung ist die Intensität des an der Metallschicht
reflektierten Lichtes auf Grund der Erzeugung der Oberflächenplasmonen
deutlich vermindert. Zum Auffinden der Resonanzbedingung kann entweder
der Einfallswinkel (bei konstanter Wellenlänge) oder die Wellenlänge (bei
konstantem Einfallswinkel) durchgestimmt werden und die Intensität des reflektierten
Lichtes detektiert werden. Im allgemeinen wird mit einem goldbeschichteten
Glaskörper
(Prisma) und mit Licht von konstanter Wellenlänge gearbeitet, das mit unterschiedlichen
Einfallswinkeln auf die Goldschicht trifft.
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Aus
EP 305 109 B1 ist
es bei winkelaufgelöster
Messung bekannt, den entsprechenden Winkelbereich optisch durch
einen Strahlenfächer
zu erzeugen, der mittels einer halbkugelförmigen Glaslinse auf die Metallschicht
fokussiert wird. Die Fokussierung ermöglicht nur eine einzige Messung,
nach der die für
Moleküle
sensitive Schicht wieder regeneriert werden muss, bevor eine weitere
Messung möglich wird.
Außerdem
besteht infolge der Fokussierung die Gefahr einer örtlichen
Erwärmung
der Metallschicht und dadurch bedingt die Möglichkeit einer Verfälschung
der Messwerte.
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Aus
DE 100 23 363 C1 ist
es bereits bekannt, unterschiedliche Einfallswinkel des Lichts dadurch
zu realisieren, dass die Metallschicht mit einem divergenten Lichtbündel angestrahlt
wird, das von einer punktförmigen
Lichtquelle in Form einer Laserdiode ausgeht. Dabei werden gleichzeitige
Mehrfachmessungen verschiedener Proben dadurch ermöglicht, dass
das einfallenden Licht nur in einer Richtung (in der Einfallsebene)
divergent zugeführt
wird, während es
in der dazu senkrechten Richtung mittels einer Zylinderlinse kollimiert
wird, wobei mehrere Meßzellen in
einer Reihe quer zur Einfallsebene auf der Metallschicht angeordnet
werden. Infolge der divergenten Anstrahlung wird einer schädlichen
Erwärmung
der Metallschicht vorgebeugt. Innerhalb der Einfallsebene oder Divergenzebene
sind unterschiedliche Einfallswinkel jeweils an einer anderen Stelle
der Metallschicht vorhanden. Das führt zu einer Beeinflussung der
Meßwerte
infolge von Inhomogenitäten
der Metallschicht. Ferner wird der weiterhin divergent ausfallende
Strahlengang direkt detektiert, was große Detektoren erforderlich
macht, die jeweils einer einzigen Meßzelle zugeordnet sind. Das
führt zu
einer aufwendigen und räumlich
ausgedehnten Vorrichtung, die nur wenige Meßzellen und damit gleichzeitige
Messungen ermöglicht.
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Aus
DE 100 55 655 C2 ist
der eingangs beschriebene Plasmonenresonanzsensor mit mehreren Meßzellen
bekannt. Dabei ist jeder Meßzelle
bzw. Teilfläche
der Metallschicht eine eigene Lichtquelle zugeordnet, die von einem
Lichtwellenleiter mit einer ausgedehnten, nicht punktförmigen Abstrahlfläche gebildet
ist, wobei die Lichtwellenleiter direkt an den lichtdurchlässigen Körper angeschlossen
sind und wobei im ausfallenden Strahlengang eine Fourierlinse und
eine Zylinderlinse angeordnet sind, was einen gemeinsamen Detektor
ermöglicht.
Die flächigen Lichtquellen,
die jeweils einer Vielzahl benachbarter punktförmiger Lichtquellen vergleichbar
sind, haben zur Folge, dass der Bereich unterschiedlicher Einfallswinkel
an allen Stellen der Metallschicht vorhanden ist. Die Fourierlinse
ist im Sinne einer Fourier-Abbildung in einer 2f-Anordnung zwischen
den Abstrahlflächen
der Lichtquellen und dem Detektor angeordnet, wobei die Ausfalloptik
dafür sorgt,
dass gleiche Einfallswinkel auf dem Detektor zusammengeführt werden
und dort von auf anderen Einfallswinkeln beruhendem Licht getrennt
sind. Somit lassen sich exakte gemittelte Meßergebnisse erzielen, die frei
sind von ungünstigen
Einflüssen
durch Erwärmung
oder Inhomogenitäten
der Metallschicht.
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Von
Nachteil ist bei diesem bekannten Plasmonenresonanzsensor jedoch,
dass jeder Meßzelle bzw.
Teilfläche
der Metallschicht eine eigene flächige Lichtquelle
zugeordnet ist, was die mögliche
Anzahl der Meßzellen
stark begrenzt. Außerdem
ist es nicht einfach, ein den gesamten zu vermessenden Winkelbereich
umfassendes Winkelspektrum zu erzielen, das vom Abstand der Lichtfaser
zur Metalloberfläche, der
numerischen Apertur der Faser und dem Faserdurchmesser abhängig ist.
Auch fordert die divergente Abstrahlung der Metallschicht eine vergleichsweise
ausgedehnte Optik mit einer großen
Fourierlinse, die den ausfallenden Strahlengang einfängt. Auch das
ist einer kompakten und unaufwändigen
Bauweise abträglich.
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Dementsprechend
liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, diesen Plasmonenresonanzsensor
so zu verbessern, dass er unter Beibehaltung der geschilderten Vorteile
einfacher und kompakter sowie leistungsfähiger ist.
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Diese
Aufgabe wird ausgehend vom eingangs beschriebenen Sensor erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
dass zwischen der Lichtquelle und der Schicht eine Einfallsoptik
vorgesehen ist, die den einfallenden Strahlengang in Reihenrichtung
der Teilflächen
kollimiert und in der senkrecht zur Reihenrichtung der Teilflächen verlaufenden
Einfallsebene konvergent auf die Schicht leitet, so dass die einzige
flächige
Lichtquelle auf jeder Teilfläche
der Schicht in Form einer Leuchtlinie abgebildet wird.
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Die
konvergente Anstrahlung der Metallschicht ermöglicht eine kompakte Bauweise
mit kleinen Bauteilen bzw. optischen Elementen sowohl auf der Lichteinfallseite
wie auf der Lichtausfallseite, wobei im Interesse einer Vielzahl
von Meßzellen
auch mit sehr schmalen und einander eng benachbarten Teilflächen gearbeitet
werden kann.
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Zweckmäßige Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen. Dabei
trägt insbesondere
die Verwendung eines Chips aus einem lichtdurchlässigen polymeren Kunststoff
als lichtdurchlässiger
Körper
zur Vereinfachung und Leistungssteigerung bei, da dieser preiswert
und gleichzeitig durch entsprechende Formgebung auch mit optischen
Funktionen für
die ausfallseitige und gegebenenfalls auch einfallseitige Lichtführung im
Wege des Spritzgießens
hergestellt werden kann, wie es aus
DE 103 24 973 B4 im Grunde bekannt ist. Das
bietet die Möglichkeit,
den Chip als auswechselbaren Einwegartikel zu konzipieren, so dass
Regenerationsmaßnahmen überflüssig werden
und nicht nur gleichzeitig mehrere Messungen durchgeführt sondern
die Mehrfachmessungen auch in schneller Folge vorgenommen werden
können. Durch
die Integration der Kollimationslinse in den Chip entfällt ein
vergleichsweise teures optisches Bauteil. Ferner ergibt sich durch
das Einlegen des Chips in den Plasmonenresonanzsensor eine optische
Kopplung zwischen der Beleuchtungsoptik und der Nachweisoptik ohne
eine störanfällige Kopplung mittels
Imersionsmedien.
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Ein
Ausführungsbeispiel
der Erfindung wird nachfolgend anhand einer schematischen Zeichnung näher erläutert. Es
zeigen:
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1 die
für die
Erfindung wesentlichen Teile des Plasmonenresonanzsensors in einer
Seitenansicht;
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2 die
Anordnung nach 1 in Draufsicht, jedoch mit
in koaxiale Ausrichtung hochgeschwenkter und der Seitenansichtsbreite
angepaßter Lichteinfall-
und Lichtausfallseite;
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3 den
rechten Teil nach 1 in einer etwas vergrößerten und
insgesamt geschwenkten Darstellung;
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4 ein
auf dem Detektor erzeugtes Bild der angestrahlten Teilflächen;
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5 die
gemessene winkelabhängige
Intensitätsverteilung
entlang einer Teilfläche;
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6 die
zeitliche Entwicklung der Lage des Minimums der Resonanz für eine Probenmessung und
eine Referenzmessung; und
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7 den
zeitabhängigen
Verlauf des aus den beiden Kurven nach 6 gewonnenen
Differenzsignals.
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Der
in 1 und 2 mit seinen wesentlichen Teilen
dargestellte Plasmonenresonanzsensor 1 weist einen lichtdurchlässigen Körper 2 auf,
der ein durch Spritzgießen
hergestellter Chip aus einem polymeren Kunststoff ist. Dieser Chip 2 trägt an seiner Oberseite 6 eine
lichtreflektierende dünne
Metallschicht 3, die vorzugsweise aus Gold besteht. Durch eine
chemische Modifikation der Goldoberfläche erhält diese eine Struktur, bei
der einzelne schmale Teilflächen 4,
die eng benachbart angeordnet und durch Zwischenstreifen 5 distanziert
sind, in einer Reihe nebeneinander angeordnet sind (2).
Der Chip 2 weist eine ebene Oberseite 6 und eine
dazu parallele ebene Unterseite 7 auf, die durch gleichfalls ebene
Stirnseiten 8 und 9 miteinander verbunden sind.
Dagegen sind die Seitenflächen 10 und 11 wie aus 1 und 3 zu
ersehen, zylindrisch gekrümmt.
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Dem
Chip 2 sind eine Lichtquelle 12 und eine Einfallsoptik 13 zugeordnet,
wodurch ein einfallender Strahlengang 14 mit optischer
Einfallachse 15 erzeugt wird, der durch die Seitenfläche 10 in
den Chip 2 eindringt und auf die Innenseite der reflektierenden Metallschicht 3 fällt.
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Bei
der Lichtquelle 12 handelt es sich wie in der Darstellung
angedeutet um eine flächige
oder ausgedehnte Lichtquelle, deren Abstrahlfläche sozusagen eine Vielzahl
benachbarter punktförmiger Lichtquellen
umfasst, die jeweils innerhalb eines bestimmten Winkelbereichs abstrahlen.
Als derartige Lichtquelle wird z.B. die Stirnfläche einer sogenannten Multimode-Faser
oder LED eingesetzt.
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Die
Einfallsoptik 13 umfasst in der Einfallsrichtung gesehen
eine sphärische
Linse 16, die den einfallenden Strahlengang 14 zunächst kollimiert, also
die Lichtstrahlen parallelisiert, sowie einen Wellenlängenfilter 17,
einen Polarisationsfilter 18 und eine zylindrische Linse 19,
die den einfallenden Strahlengang 14 in ein in der Einfallsebene
konvergentes Strahlenbündel überführt (1),
in der dazu senkrechten Richtung, also in Reihenrichtung der Teilflächen 4,
jedoch in der parallelen Ausrichtung beläßt (2). Mit
der gekrümmten
Seitenfläche 10 des Chips 2 kann
ggf. auch ein Teil der Einfallsoptik 13 in den Chip 2 integriert
sein. Die beschriebene Einfallsoptik 13 bewirkt, dass die
Lichtquelle in Richtung der Einfallsebene auf den Teilflächen 4 abgebildet
wird, während
in Richtung senkrecht zur Einfallsebene die nebeneinander angeordneten
Teilflächen
gleichartig (kollimiert) beleuchtet werden.
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Durch
die Reflektion des einfallenden Strahlengangs 14 an der
Metallschicht 3 bzw. ihren Teilflächen 4 entsteht ein
ausfallender Strahlengang 20 mit der optischen Ausfallachse 21,
der durch die Seitenfläche 11 des
Chips 2 austritt und mittels einer Ausfallsoptik 22 auf
einen Detektor 23 geleitet wird. Der Detektor 23 kann
ein CCD-Sensor (CCD-Chip)
nach Art einer 2D-Kamera sein und misst für jede Teilfläche 4 getrennt
fortlaufend die einfallswinkelspezifische Intensität des reflektierten
Lichts.
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Zur
Ausfallsoptik 22 gehören
eine durch die zylindrisch gekrümmte
Seitenfläche 11 des
Chips 2 gebildete und somit in den Chip integrierte zylinderförmige Fourierlinse 24 sowie
eine größere Zylinderlinse 25 und
eine kleinere Zylinderlinse 26, die eine Abbildung der
Teilflächen 4 bzw.
der auf diesen vorhandenen Leuchtlinien auf dem Detektor 23 bewirken.
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In 3 ist
deutlich gemacht, dass der Krümmungsradius
R der Seitenfläche 11 bzw.
der integrierten Fourierlinse 24 deren Abstand zu den Teilflächen 4 deutlich übersteigt.
Beispielsweise beträgt bei
einem Abstand von 5 mm zur Goldschicht 3 der Krümmungsradius
R 28 mm, also den fünf-
bis sechsfachen Abstand. Der Detek tor 23 ist im Brennpunktabstand
F zur integrierten Fourierlinse 24 angeordnet, so dass
auf ihm eine sogenannte „Fourier-Abbildung" entsteht und für jede beleuchtete
Teilfläche 4 die
auf ihr verteilt mit gleichem Winkel einfallenden Strahlen auf dem
Detektor 23 in einem Punkt zusammengeführt werden, wie es in 1 und 3 für zwei Punkte
dargestellt ist.
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Die
für eine
Fourier-Abbildung klassische 2f-Anordnung, bei der auch das abzubildende
Objekt im Brennpunktabstand zur Linse angeordnet ist, läßt sich
mit der integrierten Linse 24 zwar nicht verwirklichen,
jedoch würde
eine separate Fourier-Linse
eine erhebliche Größe haben
müssen
und entsprechend voluminös,
schwer und teuer sein. Der Krümmungsradius
R der integrierten Fourierlinse 24 bestimmt somit den Abstand
zum Detektor 23, in dem das Bild des Winkelspektrums entsteht
(Bildweite), sowie die Größe des Bildes.
Durch die im ausfallenden Strahlengang vorgesehenen Zylinderlinsen 25 und 26 wird Verwischungen
der Abbildung der Teilflächen 4 auf dem
Detektor 23 entgegengewirkt. Solche Verwischungen resultieren
aus der Flächenausdehnung der
Lichtquelle 12 und einer Divergenz des ausfallenden Lichtbündels in
Reihenrichtung sowie aus Beugungseffekten an den Kanten der Teilflächen 4.
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Zur
Verdeutlichung der optischen Gegebenheiten des Plasmonenresonanzsensors 1 sind
in den 1 bis 3 der Verlauf mehrerer Strahlen
von der Lichtquelle 12 bis zum Detektor 23 eingezeichnet,
und zwar – aus
einfallseitiger Sicht – der
obere Grenzstrahl 27, der untere Grenzstrahl 28,
der linke Grenzstrahl 29 und der rechte Grenzstrahl 30 sowie ein
mittlerer Strahl 31. Dazu sei angemerkt, daß die entsprechenden
Strahlwinkel wegen der besonderen Lichtquelle 12 mit flächiger Abstrahlfläche innerhalb des
einfallenden Strahlengangs 14 sowie des Chips 2 über den
gesamten Lichtbündelquerschnitt
vorhanden sind. Die 1 und 3 zeigen
die nur in der Einfallsebene auftretende Strahlbrechung durch die in
den Chip 2 integrierte Fourierlinse 24 mit einer nicht
telezentrischen – also
zur optischen Ausfallachse 21 nicht parallelen – Bündelung
der Strahlen gleichen Einfallswinkels.
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4 zeigt
die Intensitätsverteilung
auf dem Detektor 23. Die dunklen Streifen A und die hellen Streifen
B entstehen dadurch, dass die Schicht 3 auf dem Chip 2 mit
Wasser benetzt wurde. In den unbeschichteten Zwischenstreifen 5 wird
das von der Lichtquelle 12 kommende Licht vollständig reflektiert (Totalreflexion),
wodurch die hellen Streifen B entstehen. In den von den metallbeschichteten
Teilflächen 4 gebildeten
Bereichen beobachtet man dagegen den Plasmonenresonanzeffekt, den
die dunklen Streifen A widerspiegeln.
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Die
zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessene Intensitätsverteilung entlang eines
solchen Streifens A ist aus 5 zu ersehen.
Dabei ist durch die gestrichelte Linie die Position des Intensitätsminimums
entsprechend einem spezifischen Einfallswinkel hervorgehoben. Diese
sich mit zunehmender Anlagerung von Molekülen zeitabhängig verlagernde Minimumposition
wird genau bestimmt.
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6 zeigt
die zeitliche Entwicklung der Lage des Minimums der Resonanz für zwei unterschiedliche
Teilflächen 4 auf
dem Chip. Die eine Referenz-Teilfläche besteht im wesentlichen
nur aus der Goldbeschichtung, während
die andere Proben-Teilfläche mit
Protein A immobilisiert wurde. Im Experiment wurden abwechselnd
Antikörperlösungen und Wasser über die
Teilflächen 4 geleitet,
wobei die Konzentration der Antikörperlösung von Schritt zu Schritt gesteigert
wurde. Die spezifische Bindung der Antikörper an die Proben-Teilfläche führt zu der
beobachteten Assoziation (Benetzung mit AK-Lösung) bzw. Dissoziation (Benetzung
mit Wasser) der Antikörper an
der bindenden Oberfläche.
An der Referenz-Teilfläche
wird nur im Bereich hoher Antikörperkonzentration
ein Signal beobachtet, das auf den erhöhten Brechungsindex dieser
Lösung
zurückzuführen ist.
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Die
Messungen gemäß 6 wurden gleichzeitig
und bei relativ inhomogener Beleuchtung mit die Resonanzkurven überlagernder
Intensitätsverteilung
durchgeführt. 7 zeigt
den sich aus den beiden Kurven in 6 ergebenden
Verlauf des Differenzsignals. Dabei wird die irreguläre Form
der Bindungskurve bei der höchsten
Antikörperkonzentration
korrigiert. Zusätzlich
kann Rauschen, das beide Teilflächen 4 in
gleichem Maße
betrifft, durch die Differenzbildung reduziert werden. Ein weiterer
Vorteil der Referenzmessung liegt darin, dass der Einfluss unspezifischer
Bindungen korrigiert werden kann.
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Der
gleichzeitigen Messung von Probenwerten und zugeordnetem Referenzwert
entsprechend sind die Teilflächen 4 in
Meßflächen für die Proben und
in wenigstens eine Referenzfläche
aufgeteilt. Es kann auch jeder Meßfläche eine eigene Referenzfläche zugeordnet
sein.
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Die
Ausbildung der Teilflächen
kann durch eine entsprechende Strukturierung der Schicht 3 oder
auch durch eine chemische Modifikation ihrer Oberfläche erhalten
werden. Dabei kann es von Vorteil sein, zunächst gleichartige Teilflächen auszubilden
und diese dann durch eine chemische Oberflächenmodifikation in Meßflächen und
in Referenzflächen
zu unterteilen.