DE102009003548A1

DE102009003548A1 - Verfahren zur hochaufgelösten Erfassung von Nanopartikeln auf zweidimensionalen Messflächen

Info

Publication number: DE102009003548A1
Application number: DE102009003548A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dr. Zybin
Original assignee: LEIBNIZ INST fur ANALYTISCHE; Leibniz Institut fuer Analytische Wissenschaften ISAS eV
Current assignee: LEIBNIZ INST fur ANALYTISCHE; Leibniz Institut fuer Analytische Wissenschaften ISAS eV
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2010-09-02
Also published as: US8587786B2; WO2010097369A1; JP2012519271A; EP2401602A1; US20110311962A1

Abstract

Ein Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer, enthaltend eine Strahlungsquelle, welche im Wesentlichen monochromatische Strahlung emittiert, eine Sensorfläche, eine optische Anordnung zur Beleuchtung der Sensorfläche mit der von der Strahlungsquelle emittierten Strahlung, derart, dass in der Sensorfläche Oberflächenplasmonen erzeugbar sind, einen Detektor mit einer Vielzahl von Bildelementen, und eine Beobachtungsoptik zur Abbildung der von der Sensorfläche reflektierten Strahlung auf den Detektor, ist dadurch gekennzeichnet, dass das Auflösungsvermögen der Beobachtungsoptik und des Detektors größer ist als die mit der Strahlungsquelle erreichbare, beugungsbegrenzte Auflösung.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer enthaltend

(a) eine Strahlungsquelle, welche im wesentlichen monochromatische Strahlung emittiert,
(c) eine Sensorfläche,
(b) eine optische Anordnung zur Beleuchtung der Sensorfläche mit der von der Strahlungsquelle emittierten Strahlung, derart, dass in der Sensorfläche Oberflächenplasmonen erzeugbar sind,
(d) einen Detektor mit einer Vielzahl von Bildelementen, und
(e) eine Beobachtungsoptik zur Abbildung der von der Sensorfläche reflektierten Strahlung auf den Detektor.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur optischen Erfassung von einzelnen Nanopartikeln die auf zweidimensionalen Messflächen gebunden sind oder sich im Nahbereich befinden.
Die Messfläche kann selektiv mit Viren von bestimmten Art zusammenwirkenden Rezeptoren, bzw. Antikörper beschichtet werden. Dies gewährleistet die Selektivität der Detektierung.
Die Auflösung optischer Anordnungen, d. h. die Fähigkeit beispielsweise bei der optischen Mikroskopie kleine Objekte zu beobachten, ist durch die Beugung begrenzt. Die kleinsten Partikel, die mit einem Lichtmikroskop detektiert werden können, haben einen Durchmesser im Bereich von 0,2 μm entsprechend 200 nm. Die hierfür erforderlichen Anordnungen sind teuer.
Für die Erfassung von Partikeln mittels Elektronenmikroskopie ist ein Vakuum erforderlich. Auch das ist teuer und begrenzt die Möglichkeiten der detektierbaren Partikel.
Ein markierungsfreies Verfahren, welches es ermöglicht die Bindung von Viren oder Partikel mit einem Durchmesser im Nanometerbereich (Nanopartikel) auf einer Fläche in Wasser- bzw. Puffer-Lösung in-vivo zu beobachten, ist nicht bekannt.
Bei der Lichtmikroskopie wird die Änderung der Lichtintensität an bestimmten Stellen der Abbildung analysiert. Bei der Betrachtung mit dem Auge erfolgt dies an der Netzhaut. Die Detektion mit einem Detektor erfolgt beispielsweise mit einem Charge Coupled Device (CCD). Da diese Änderungen durch die Differenz der optischen Eigenschaften des Objektes, wie Transmission, Brechungsindex oder Farbe und der Umgebung bedingt sind, kann man die Eigenschaften des Objektes dadurch charakterisieren.
Stand der Technik
Die Veröffentlichung „Imaging of Cell/Substrate Contacts of Living Cells with Surface Plasmon Resonance Microskopy" von K. -F. Giebel et al., Biophysical J. Bd. 76, 1999 S. 509–516 offenbart ein Oberflächen Plasmonen Mikroskop.
Die Veröffentlichung „Differential Surface Plasmon Resonance Imaging for High-Throughput Bioanalyses" von Boecker et al., Anal. Chem. 2007. Bd. 79, S. 702–709 offenbart ein Oberflächen Plasmonen Mikroskop.
DE 10 2004 033 869 B3 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenplasmonenresonanzen an zweidimensionalen Messflächen.
DE 40 24 476 C1 beschreibt eine Kretschmann-Anordnung, welche zur Bestimmung von Analyten in einer fluiden Probe verwendet wird.
Offenbarung der Erfindung
Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Anordnung und ein Verfahren der eingangs genannten Art zur optischen Erfassung von einzelnen Nanopartikeln zu schaffen, insbesondere von Viren mit höherer Auflösung. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass das Auflösungsvermögen der Beobachtungsoptik und des Detektors größer ist als die mit der Strahlungsquelle unter klassischen Bedingungen erreichbare, beugungsbegrenzte Auflösung. Unter die Auflösung wird die Fähigkeit verstanden, das Signal (Partikel) auf dem Untergrund aufzulösen. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass die Beobachtung von Nanopartikeln auch mit Wellenlängen möglich ist, welche wesentlich größer als der Partikeldurchmesser sind. Beispielsweise ist die Beobachtung von Partikeln mit einem Durchmesser von 80 nm auch bei einer Wellenlänge oberhalb von 600 nm möglich. Zur Vermeidung einer Situation, bei der das Signal im Schrotrauschen verschwindet, wird vorzugsweise ein Referenzsignal gebildet, mit dem das Signal normalisiert wird. Das Referenzsignal kann durch Mittelwertbildung der Signale erzeugt werden, die vor der Anlagerung eines Partikels an die Sensorfläche erfasst werden.
Die Erfassung der Plasmonenresonanz kann mit einer sogenannten Kretschmann-Anordnung erfolgen. Eine lokale Änderung der Reflektivität wird durch die Zusammenwirkung der Nanopartikel mit dem evanescenten Feld hervorgerufen. Bei dieser Anordnung können Partikel detektiert werden, die kleiner als 80 nm sind. Zudem können Flächen mit mehreren Quadratmillimetern gleichzeitig erfasst werden. Wichtig ist es bei der Anordnung, dass die Partikel sich sehr nahe mit einem Abstand unterhalb von 200 nm an der Sensorfläche befinden oder diese berühren. Die Anordnung eignet sich für die Verwendung in der virologischen Forschung und bei der Erfassung von gefährlichen Viren an öffentlichen Flächen. Auch für die hochempfindliche, klinische Diagnostik kann das Verfahren eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird die Änderung der Reflektivität der Sensorfläche beobachtet, welche durch ein Partikel hervorgerufen wird. Als Sensor wird eine Fläche benutzt, welche eine möglichst starke Reflektivitätsänderung durch Änderung des Brechungsindexes gewährleistet.
Eine solche Fläche mit starker Reflektivitätsänderung kann mittels einer Goldfläche in Kretschmann-Anordnung verwirklicht werden. Bei einer Kretschmann-Anordnung ist die Reflektivität bei einem Einfallswinkel nahe dem Resonanzwinkel sehr stark von dem Brechungsindex des Mediums abhängig, dass mit der Goldschicht in Kontakt ist. Wenn sich ein Partikel an die Fläche anlagert, ändert sich die Reflektivität in der Umgebung des Partikels. Diese Änderung zeigt sich als Änderung der Helligkeit an der entsprechender Stelle der Abbildung. Da die Reflektivitätsänderungen durch die Größe und den Brechungsindex des Partikels bedingt sind, können sie zur Charakterisierung des Partikels benutzt werden.
Alternativ kann die Fläche mit starker Reflektivitätsänderung durch periodische Strukturen verwirklicht werden, die Plasmonenanregung zulassen. Auch entspiegelte Glass- oder Kristall-Flächen sind geeignet. Die Entspiegelung wird durch die Partikel gebrochen und die Reflektivität in der Umgebung steigt. In einer weiteren, alternativen Ausgestaltung der Erfindung wird die Fläche mit starker Reflektivitätsänderung von einer Fläche mit metallischen Nanopartikeln verwirklicht, die bei ausgewählten Wellenlängen die Anregung von lokalisierter Plasmonenresonanz zulassen. Diese metallischen Nanopartikel dienen als Sensorpartikel. Nahe der Resonanz ist die Streuung an einem Partikel abhängig vom Brechungsindex. Wenn sich ein anderer Partikel an einen Sensorpartikel anlagert, ändert sich die Reflektivität der Sensorfläche an dieser Stelle. Schließlich kann die Fläche mit starker Reflektivitätsänderung durch eine optische Mehrschichtstruktur verwirklicht werden, in der auch eine Oberflächenplasmonresonanz angeregt werden kann.
Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Ein Ausführungsbeispiel ist nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung einer Kretschmann-Anordnung zur Erfassung von Nanopartikeln und Viren.
2 zeigt den Verlauf eines Reflexionssignals in der Nähe der Resonanzwellenlänge mit und ohne Partikel.
3 zeigt den Zeitverlauf eines Signals über einen Zeitraum, in dem sich ein Teilchen anlagert.
4 zeigt die Abhängigkeit des Signals vom Partikeldurchmesser.
5 zeigt das Bild einer beobachteten Fläche nach verschiedenen Beobachtungszeiträumen für Polystyrolteilchen mit einem Durchmesser von 0,08 μm.
6 ist eine schematische Darstellung einer Anordnung mit regelmäßigen Strukturen in Form von Goldschicht-Inseln zur Erfassung von Nanopartikeln und Viren.
Beschreibung des Ausführungsbeispiels
1 zeigt eine Kretschmann-Anordnung in abbildender Konfiguration, die allgemein mit 10 bezeichnet ist. Eine solche Anordnung 10 ist bereits bekannt. Die Funktionsweise des Oberflächenplasmonenspektrometers braucht hier daher nicht näher beschrieben werden. Eine Glasscheibe 12 ist mit einer 50 nm dicken Goldschicht 14 beschichtet. Mit der der Goldschicht 14 abgewandten Seite 16 ist die Glasscheibe 12 an einem Prisma 18 befestigt. Zur Befestigung wird Immersionsöl verwendet.
Die Goldschicht 14 wird mit Strahlung 20 aus einer Superlumineszenzdiode 22 beleuchtet. Ein Beispiel für eine geeignete Diode 22 ist eine QSDM-680-9 von Qphotonix, die bei einer Wellenlänge von 670 nm im sichtbaren Bereich abstrahlt. Die Beleuchtung erfolgt durch das Prisma 18 bei festem Einfallswinkel 24. Anders als ein Laser als Strahlungsquelle hat eine Superlumineszenzdiode keine Unregelmäßigkeiten im Strahlungsprofil (Specles). Der Einfallswinkel 24 ist so gewählt, dass die Wellenlänge der Diode auf der linken Seite des Resonanzminimums, also bei kleinerem Winkel, erscheint.
Zur Erzeugung eines parallelen Strahlungsbündels wird eine Linse 26 eingesetzt. Es versteht sich, dass hier auch ein gekrümmter Spiegel vorgesehen kann.
An der Goldschicht ist ein Probenraum für Flüssigkeiten in Form einer Flusszelle 28 angebracht. Die Flusszelle 28 wird von einer 1 mm dicken, S-förmigen PDMS-Dichtung gebildet. Der rückwärtige Teil der Flusszelle 32 besteht aus Plexiglas. Ferner sind ein Einlass und ein Auslass in Form von Schläuchen an der Flusszelle 28 vorgesehen. Das Zellvolumen der Flusszelle 28 ist etwa 300 μL.
Die Glasoberfläche der Scheibe 12 bildet eine Sensoroberfläche. Die Sensoroberfläche wird mittels eines Standard Minolta Photoobjektivs 34 auf einen Charge Coupled Device Detektor (CCD) 36. abgebildet. Die Apertur des Objektivs 34 ist 1/1.7. Der CCD-Detektor war ein Cappa-100 CCD mit einer Pixelgröße von 6,45 × 6,45 μm. Die Sättigungskapazität des Detektors liegt bei 40000 Elektronen. Der Detektor 36 hat eine Fläche von 1 000 × 1000 Pixel. Bei einer 7-fachen Vergrößerung entspricht ein Pixel einer Sensorfläche von etwa ~1 μm. In horizontaler Ebene (p-Ebene) ist das Bild aufgrund der Steigung der Sensoroberfläche relativ zur optischen Achse komprimiert. Hier entspricht ein Pixel einer Sensoroberfläche von etwa ~1,5 μm. Die Steigung verursacht zusätzlich eine signifikante Begrenzung des Bereiches an der Sensorfläche, der scharf abgebildet werden kann.
Zur Beobachtung von Partikeln werden die Bilder mit einer Rate von 16 Bildern/Sekunde ausgelesen. Bei kleineren Ausleseabschnitten ist auch eine Rate von 100 Bildern/Sekunde möglich. Die Bilder werden gespeichert und ausgewertet.
In einem gut arbeitenden Ausführungsbeispiel wird mit einer Ausleserate von 40 Bildern/Sekunde ausgelesen. Jeweils 10 Bilder werden gemittelt. Der Mittelwert der Intensität wird hierzu für jedes Pixel gebildet und zur Weiterverarbeitung gespeichert.
Die Intensitätsverteilung des ursprünglichen Bildes ist sehr inhomogen. Dies liegt an der hohen Empfindlichkeit der Sensorfläche gegenüber kleinen Unregelmäßigkeiten auf der Oberfläche. Es sind gewöhnlich viele Punkte zu sehen, die eine Abweichung von einem mittleren Wert von bis zu 70% haben. Die lokale Inhomogenität von ±10% innerhalb eines 20 μm Fleckens auf der Sensorfläche ist typisch für das übrige Bild. Diese Intensitätsverteilung ist zeitlich relativ stabil. Zur Verringerung der Inhomogenität wird eine Normalisierung angewendet. Ein Referenzbild wird erzeugt, indem die Bilder über den Zeitraum 38 (3) gemittelt werden, in dem keine Partikelsuspension kommt. Die Intensität in jedem Pixel in den darauffolgenden Bildern 40 wurde auf diesen Mittelwert im Referenzbild für jedes Pixel normalisiert. Dadurch wird eine lokale Inhomogenität erreicht, die ±1% nicht überschreitet.
Die Bindung eines Partikels 42 (1) an der Sensorfläche 12 bewirkt eine stufenförmige Intensitätsänderung 44 (3) auf den zugehörigen Pixeln. Diese Stufe 40 wird über alle Pixel integriert, die durch die Bindung des Partikels berührt werden. Dies bildet das Signal, welches in 4 dargestellt ist. Der Wert für die Stufe 40 kennzeichnet den gebundenen Partikel 38.
Das Schrotrauschen ist der im wesentlichen begrenzende Faktor für die minimale, erfassbare Intensitätsstufe. Zur Minimierung des Schrotrauschens wird vorzugsweise das maximale Produkt aus der Pixelkapazität C und der Auslesefrequenz F verwendet. Bei einer Pixelkapazität von 40 000 Elektronen können lediglich 10 000 auflaufen. Anderfalls erfolgt eine Sättigung einiger Pixel wegen der signifikanten Inhomogenitäten des Bildes.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird mit einem Mittelwert über 40 Bilder/Sekunde über 10 Pixel integriert. Damit werden 2 × 10⁶ Elektronen in der zum gebundenen Partikel zugehörigen Fläche akkumuliert. Dies entspricht einem Schrotrauschen von 7 × 10^–4. Mit dem vorliegenden Verfahren können Schritte in der Größenordnung von 10^–3 erfasst werden. Dies bedeutet, dass das Schrotrauschen der begrenzende Faktor ist.
Die Bilder in 5 wurden mit der CCD-Kamera 36 aufgenommen. Auf nacheinander folgenden Aufnahmen kann man die Bindung von Partikeln direkt beobachten. Die Partikel wurden in der 140. Sekunde injiziert.
Um das Signal eines Partikels zu quantifizieren, wurde der zeitliche Verlauf der Intensität im Bereich der Abbildung des Partikels gemessen, wie in der 3 dargestellt. Die Abhängigkeit des Signals von der Partikelgröße ist in 4 zu sehen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 102004033869 B3 [0010]
- DE 4024476 C1 [0011]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- „Imaging of Cell/Substrate Contacts of Living Cells with Surface Plasmon Resonance Microskopy” von K. -F. Giebel et al., Biophysical J. Bd. 76, 1999 S. 509–516 [0008]
- „Differential Surface Plasmon Resonance Imaging for High-Throughput Bioanalyses” von Boecker et al., Anal. Chem. 2007. Bd. 79, S. 702–709 [0009]

Claims

Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer enthaltend (a) eine Strahlungsquelle, welche im wesentlichen monochromatische Strahlung emittiert, (b) eine Sensorfläche, (c) eine optische Anordnung zur Beleuchtung der Sensorfläche mit der von der Strahlungsquelle emittierten Strahlung, derart, dass in der Sensorfläche Oberflächenplasmonen erzeugbar sind, (d) einen Detektor mit einer Vielzahl von Bildelementen, und (e) eine Beobachtungsoptik zur Abbildung der von der Sensorfläche reflektierten Strahlung auf den Detektor, dadurch gekennzeichnet, dass (f) das Auflösungsvermögen der Beobachtungsoptik und des Detektors größer ist als die mit der Strahlungsquelle unter klassischen Bedingungen erreichbare, beugungsbegrenzte Auflösung.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Sensorfläche in Kretschmann-Anordnung.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungsquelle eine Superlumineszenzdiode ist.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorfläche eine Goldbeschichtung aufweist.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach einem der vorgehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Herstellung des Kontakts von zu beobachtenden Partikeln mit der Sensorfläche.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorfläche eine Fläche mit starker Reflektivitätsänderung ist, welche durch periodische Strukturen erzeugbar ist, die eine Plasmonenanregung zulassen.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorfläche eine entspiegelte Glass- oder Kristall-Fläche mit starker Reflektivitätsänderung bei Anlagerung von Partikeln ist.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorfläche eine Fläche mit metallischen Nanopartikeln mit starker Reflektivitätsänderung bei Anlagerung von Partikeln ist, die bei der Wellenlänge der Strahlungsquelle die Anregung von lokalisierter Plasmonenresonanz zulassen.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorfläche eine optische Mehrschichtstruktur ist, in der auch eine Oberflächenplasmonresonanz angeregt werden kann.
Oberflächenplasmonenresonanzspektrometer nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Charge Coupled Device zur Aufnahme einer Vielzahl von zeitlich aufeinanderfolgenden Intensitätssignalen für jedes Pixel ist und Auswertemittel vorgesehen sind, mit denen zeitliche Mittelwerte zur Verringerung von Schrotrauschen erzeugbar sind.
Verwendung eines Oberflächenplasmonenresonanzspektrometers nach einem der vorgehenden Ansprüche in der virologischen Forschung, bei der Erfassung von Viren an öffentlichen Flächen oder bei hochempfindlicher, klinischer Diagnostik.
Verfahren zur optischen Erfassung von einzelnen Nanopartikeln auf zweidimensionalen Messflächen mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, mit den Schritten (a) Beleuchten einer Sensorfläche mit Strahlung aus einer monochromatischen Strahlungsquelle derart, dass in der Sensorfläche Oberflächenplasmonen erzeugbar sind, (b) Einbringen von zu beobachtenden Partikeln auf die Sensorfläche oder in den unmittelbaren Nahbereich der Sensorfläche, und (c) Detektieren der von der Sensorfläche reflektierten Strahlung mit einem Detektor mit einer Vielzahl von Bildelementen, dadurch gekennzeichnet, dass (d) die Partikel mit einem Auflösungsvermögen beobachtet werden, welches größer ist als die mit der Strahlungsquelle erreichbare, beugungsbegrenzte Auflösung.