DE102004033869B3 - Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenplasmonenresonanzen an zweidimensionalen Messflächen - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenplasmonenresonanzen an zweidimensionalen Messflächen, bei welchem die durch einen dünnen Metallfilm gebildete Messfläche, die mit einer zu messenden Probe in Kontakt gebracht wird, beleuchtet und die Intensitätsverteilung im reflektierten Strahl gemessen wird, soll so weiter entwickelt werden, dass es wesentlich (mess-) empfindlicher und gegen Störungen beständiger ist. DOLLAR A Dies wird dadurch erreicht, dass die Messfläche mit zwei kollimierten, monochromatischen Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen, die räumlich in einem Gesamtstrahl vereinigt werden, beleuchtet wird, und die Differenz der reflektierenden Intensitäten zur Charakterisierung der Plasmonenresonanz gemessen wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenplasmonenresonanzen an zweidimensionalen Messflächen, bei welchem die durch einen dünnen Metallfilm gebildete Messfläche, die mit einer zu messenden Probe in Kontakt gebracht wird, beleuchtet und die Intensitätsverteilung im reflektierten Strahl gemessen wird.
• Die Oberflächenplasmonenresonanz ist ein gängiges Verfahren, das für die simultane Charakterisierung von Analyten in zwei dimensionalen Strukturen eingesetzt werden kann. Die Oberflächenplasmonenresonanz ist das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen elektromagnetischen Wellen und dem freien Elektronengas einer leitenden Oberfläche. Die Oberflächenplasmonenresonanz basiert auf der internen Totalreflektion an der Grenzfläche zwischen einem Dielektrikum und einer Metallschicht, d.h. zwischen zwei Medien, deren Dielektrizitätskonstanten unterschiedliche Vorzeichen haben. Eine stark gedämpfte elektromagnetische Oberflächenwelle schreitet entlang der Metallschicht fort. Innerhalb des Volumens der gedämpften elektromagnetischen Welle werden Konzentrationsänderungen, z.B. von Biomolekülen, in Form von Änderungen des Brechungsindexes an der Oberfläche detektiert. Das führt zugleich zu einer Änderung der Resonanzbedingung der an der Metallschicht reflektierten elektromagnetischen Lichtwelle.
• Je nach Art der Detektion kann entweder die Änderung des Reflektionswinkels, bei dem die Intensität des reflektierten Lichtes ein Minimum (Resonanz) ist, oder die Änderung der Resonanzwellenlänge bei festem Einfallswinkel erfasst werden. Die erstgenannte Detektionsart wird üblicherweise in der sogenannten Kretschmann-Anordnung ausgeführt, bei der eine sehr dünne Goldschicht oder dgl. auf der Basisfläche eines Prismas aufgedampft ist, monochromatisches Licht unter verschiedenen Einfallswinkeln auf diese Goldschicht eingestrahlt und die reflektierte Intensität als Funktion des Winkels aufgenommen wird.
• Dabei wird der Einfallswinkel so gewählt, dass die Wellenlänge der Strahlung auf die steile Flanke der Plasmonenresonanz eingestellt wird. Jede Brechungsindexänderung im an der bestrahlten Fläche angrenzenden Medium führt zu einer Verschiebung der Resonanz und folglich zu einer Intensitätsänderung des reflektierten Strahles, die z.B. mittels einer CCD-Kamera oder einer Flächenanordnung von Photodetektoren simultan und ortsaufgelöst gemessen werden kann. Dieses Verfahren ist zwar bereits seit Anfang der 70er Jahre des letzten Jahrhunderts bekannt, es hat aber bisher keine nennenswerte kommerzielle Verwirklichung gefunden, was in erster Linie darauf zurückzuführen ist, dass es gegenüber Störungen verschiedenster Art anfällig ist.
• Das zweidimensionale Plasmonenresonanz-Imaging gewinnt gleich wohl in letzter Zeit immer mehr an Bedeutung. Es ermöglicht simultane Online-Untersuchungen mehrerer Adsorptionsprozesse an einer Oberfläche unter identischen Bedingungen. Es werden damit z.B. biologische Vorgänge, wie DNA/DNA-, DNA-Protein- und Protein-/Protein-Reaktionen untersucht.
• Es gibt ein eingeführtes und etabliertes Gerät zur Plasmonenresonanz-Messung von der Firma BIACORE auf dem Markt. Die Oberfläche wird dabei mit einem konvergenten monochromatischen Strahl beleuchtet, wobei die Intensitätsverteilung im divergenten reflektierten Strahl die Plasmonenresonanz charakterisiert. Die unterschiedlichen Bereiche der bestrahlten Oberfläche werden dabei sequentiell vermessen.
• Die für 2-D-Messungen der Oberflächenplasmonenresonanz geeigneten Verfahren nutzen normalerweise die Beleuchtung der Fläche mit einem auf geweiteten parallelen und monochromatischen Strahl. Die Intensitätsverteilung wird dabei mittels CCD-Kamera gemessen. Die Winkelabhängigkeit der Reflektion wird bei mechanischer Drehung der Oberfläche (des Prismas) aufgenommen.
• Bei einem weiteren Verfahren, das keine mechanische Drehung während der Messung benötigt, wird die Oberfläche ebenfalls mit einem aufgeweiteten parallen und monochromatischen Strahl beleuchtet. Hier wird der Einfallswinkel so eingestellt, dass sich die Wellenlänge auf der steilen Flanke einer Plasmonenresonanz befindet. Jede Brechungsindexänderung an der beleuchte ten Fläche führt zu Verschiebungen der Resonanzen und zu Intensitätsänderungen im reflektierten Strahl, die mittels einer CCD-Kamera gemessen werden können. Dieses Verfahren ist allerdings gegenüber nicht-spezifische Intensitätsabnahme, z.B. durch Absorption der Strahlung durch ein sich veränderndes Medium an den Oberflächen anfällig. Dieses Verfahren hat bisher keine kommerzielle Verwirklichung gefunden.
• Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren dieser Art so weiter zu entwickeln, dass es wesentlich (mess-)empfindlicher und gegen Störungen beständiger ist.
• Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die Messfläche mit zwei kollimierten, monochromatischen Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen, die räumlich zu einem Gesamtstrahl vereinigt werden, beleuchtet wird, und die Differenz der bei den beiden Wellenlängen reflektierten Intensitäten zur Charakterisierung der Plasmonenresonanz gemessen wird.
• Erfindungsgemäß wird somit die Oberfläche mit zwei monochromatischen Strahlen bestrahlt, die räumlich in einem Strahl vereinigt sind. Gemessen wird die Differenz der reflektierten Intensitäten beider Wellenlängen. Ändert sich die Dichte des Mediums an der Oberfläche, kommt es dabei zu einer Verschiebung der Oberflächenplasmonenresonanzkurve. Dabei wächst die reflektierte Intensität für die eine Wellenlänge an, während sie für die andere fällt, es entsteht somit ein Differenzsignal. Die Differenz kann beispielsweise mittels einer triggerbaren CCD-Kamera oder einer Matrix aus mehreren Fotodioden ortsausgelöst gemessen werden. Es ist somit eine simultane Messung mit einer Vielzahl von Punkten möglich, sequentielle Messungen oder eine mechanische Drehung der Oberfläche des Prismas sind nicht erforderlich.
• Das Verfahren kann für die simultane Charakterisierung von physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften und Prozessen benutzt werden. Es erlaubt es, zeitlich sich ändernde Prozesse mit hoher Nachweisstärke und Robustheit zu verfolgen, wie sie z.B. bei DNA-/DNA-, DNA-/Protein-, Protein/Protein-Bindungsreaktionen oder zur Charakterisierung von Immuno-Essay-Reaktionen bei Arzneimittelentwicklung in der Pharmakologie von Interesse sind.
• In besonders bevorzugter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die Wellenlängen der beiden Laserstrahlen so auf die gegenüberliegenden Flanken der Resonanzkurve eingestellt werden, dass die Reflektion für beide Wellenlängen wenigstens annähernd gleich ist. Auf diese Weise läßt sich eine besonders hohe Messgenauigkeit erreichen.
• Die Messung der Differenz der Intensitäten wird vorzugsweise mittels einer triggerbaren CCD-Kamera oder einer Matrix aus mehreren Fotodioden in einer Vielzahl von Messpunkten der Messfläche durchgeführt.
• Besonders bevorzugt ist weiterhin vorgesehen, dass wenigstens ein Bereich der gesamten Messfläche als Referenzfläche zur kontinuierlichen Normierung der Messung verwendet wird. Bei diesen ortsausgelösten Messungen können somit ein bzw. mehrere Bereiche der gesamten Fläche als Referenzflächen benutzt werden. Dadurch kann der Einfluss von Temperaturfluktuationen, Brechungsindexänderungen und nicht-spezifischer Änderung der reflektierten Intensität, z.B. durch Absorption während der Messung durch Normierung reduziert werden.
• Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese zeigt in
• 1 in schematischer Darstellung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und in
• 2 ein Messdiagramm, in welchem die gemessenen Intensitätssignale reflektierter Strahlen über der Temperatur aufgetragen sind.
• Eine Vorrichtung zur Bestimmung von Oberflächenplasmonenresonanzen an zweidimensionalen Messflächen weist einen ersten Diodenlaser 1 mit Linse 1a und einen dazu im rechten Winkel angeordneten zweiten Diodenlaser 2 mit Linse 2a auf. Beide Diodenlaser 1, 2 erzeugen kollimierte monochromatische Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge, welche über einen Strahlteiler 3 räumlich in einen Gesamtstrahl vereinigt werden, der über eine Linse 4 gebündelt in ein Glasfaserkabel 5 eingeleitet wird. Über eine weitere Linse 6 wird dieser räumlich vereinigte Gesamtstrahl parallel auf ein Prisma 7 in Kretschmann-Anordnung gelenkt. Dieses Prisma 7 ist zur Bildung der Messfläche mit einer Metallschicht 8 (z.B. Gold) versehen, an deren Rückseite beim Ausführungsbeispiel eine Flusszelle 9 angeordnet ist. Selbstverständlich können z.B. für stationäre Flüssigkeiten auch andere Zellen vorgesehen sein. In diese Flusszelle 9 wird über eine Pumpe 10 aus einem Probengefäß 11 eine zu analysierende Probe eingeleitet, welche nach Durchtritt durch die Flusszelle 9 in ein Abfallbehältnis 12 gelangt.
• Die vom Prisma reflektierten Strahlen werden von einer Fotodetektormatrix 13 aufgenommen. Die entsprechenden Signale werden über ein Framegribber-Interface 14 zur Auswertung an den Rechner 15 geleitet.
• Die Wellenlängen der beiden von den Diodenlasern 1 und 2 stammenden Laserstrahlen sind so auf die gegenüberliegenden Flanken der Resonanzkurve eingestellt, dass die Reflektion für beide Wellenlängen vorzugsweise gleich ist.
• Zur Bestimmung der Oberflächenplasmonenresonanzen an der zwei dimensionalen Messfläche (Goldschicht 8) werden nicht die einzelnen reflektierten Strahlen als solche ausgewertet, sondern die Differenz der reflektierten Intensitäten.
• Ein typisches Messergebnis ist in 2 dargestellt, und zwar temperaturabhängig. Dabei ist zunächst ein Referenzsignal zu erkennen, welches kontinuierlich bei der Messung selbst aufgenommen wird, indem wenigstens ein Bereich der gesamten Messfläche (Goldschicht 8) als Referenzfläche zur kontinuierlichen Normierung der Messung verwendet wird.
• Das eigentliche Messsignal an einer beliebigen Stelle ist in 2 mit Signal bezeichnet. Das erfindungsgemäß zur Charakterisierung der Plasmonenresonanz ermittelte Differenzsignal der reflektierten Intensitäten ist mit Differenz bezeichnet.

Claims (4)

1. Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenplasmonenresonanzen an zweidimensionalen Messflächen, bei welchem die durch einen dünnen Metallfilm gebildete Messfläche, die mit einer zu messenden Probe in Kontakt gebracht wird, beleuchtet und die Intensitätsverteilung im reflektierten Strahl gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Messfläche mit zwei kollimierten, monochromatischen Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen, die räumlich zu einem Gesamtstrahl vereinigt werden, beleuchtet wird, und die Differenz der bei den beiden Wellenlängen reflektierten Intensitäten zur Charakterisierung der Plasmonenresonanz gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlängen der beiden Laserstrahlen so auf die gegenüberliegenden Flanken der Resonanzkurve eingestellt werden, dass die Reflektion für beide Wellenlängen wenigstens annähernd gleich ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Differenz der Intensitäten mittels einer triggerbaren CCD-Kamera oder einer Matrix aus mehreren Fotodioden in einer Vielzahl von Messpunkten der Messfläche durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Bereich der gesamten Messfläche als Referenzfläche zur kontinuierlichen Normierung der Messung verwendet wird.