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Spektrofluorimeter
werden dazu eingesetzt, um die Präsenz bestimmter Molekularstrukturen
in einer Probe nachzuweisen, insbesondere in Gegenwart einer Lösung, die
ein Fluorophor enthält,
ist bekannt, dass bestimmte Molekularstrukturen in einer solchen
Weise mit dem Fluorophor zusammenwirken, dass einfallendes Licht
einer bestimmten Wellenlänge
absorbiert und Licht einer anderen Wellenlänge emittiert wird. Die Messung
des Lichts, das wegen Anwesenheit der betreffenden Molekularstruktur an
der Fluorophor Wellenlänge
in der Probe emittiert wird, erlaubt die Bestimmung des Anteils
der betreffenden Molekularstruktur in der Probe.
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Äthidiumbromid
(EtBr) zum Beispiel wird als Fluorophor verwendet, um die Anwesenheit
von Nukleinsäuren
auf Grund von deren Einschiebung in die Nukleinsäurenkette zu bestimmen. Monochromatisches
Licht mit einer Wellenlänge
von 520 Nanometer strahlt auf die Lösung, welche die betreffende
Probe enthält.
Mit der Messung der Lichtmenge, die bei einer Wellenlänge von
600 Nanometer emittiert wird, kann die Nukleinsäurenkonzentration der betreffenden
Probe bestimmt werden.
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Obwohl
die Spektrofluorimetrie seit vielen Jahren bekannt ist, sind Spektrofluorimeter
meist sehr groß und
außerordentlich
teuer. Dafür
gibt es viele Gründe.
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Einer
der Gründe
ist, dass Spektrofluorimeter meist eine sehr große, stationäre Lichtquelle erfordern. Eine
solche Lichtquelle verursacht eine große Hitze, die wiederum eine
recht große
Distanz zwischen Lichtquelle und Probe erforderlich macht. Außerdem benötigen solche
Lichtquellen meist mechanische Gleichstromwandler und komplizierte Lichtausrichtungsmechanismen.
Als Beispiel wird auf die U.S. Patente Nr. 3.832.555 und Nr. 4.531.834
verwiesen.
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Daneben
sollen die Spektrofluorimeter Detektoren für den Einsatz mit leicht erhältlichen
Fluorophor Farbstoffen verwendbar sein, damit eine weitreichende
kommerzielle Anwendung erzielt werden kann. Außerdem sind elektrische Geräusche, die
in Spektrofluorimetern durch die Lichtquelle verursacht werden,
im Allgemeinen laut. Diese Faktoren haben den Einsatz von Festkörper Detektoren
in Spektrofluorimetern verhindert. Die Firma Hofer Scientific hat
in der Vergangenheit ein Festkörper
Detektor Spektrofluorimeter angeboten, mit dem jedoch auf Grund
der Bestimmung, dass Infrarot Wellenlängen zur Erkennung verwendet
werden sollen, lediglich Farbstoffe der Firma Hoechst gemessen werden
konnten. Deshalb konnte das Spektrofluorimeter nicht benutzt werden,
um Wellenlängen
im sichtbaren Spektrum zu erkennen. Zudem wurde bei Verwendung von Hoechst
Farbstoffen die Probe selbst zerstört.
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In
WO-A-8907757 wird eine optische Struktur für ein Fluorimeter offenbart.
Die optische Struktur hat die Form eines Werkstoffkörpers, der
mit Öffnungen
ausgestattet ist, um optische Elemente in einer bestimmten Anordnung
aufzunehmen und festzuhalten, wobei der Körper Folgendes bereitstellt:
Eine Öffnung
zur Einführung
und Aufnahme einer Probe, um die Probe in einer spezifischen Position
festzuhalten, eine Öffnung
für die
Aufnahme einer Strahlenquelle und zur Beibehaltung der Quelle in
einem spezifischen Verhältnis
zur Öffnung,
eine Öffnung
für den Strahlenzugang,
um einen besonderen Pfad zwischen der Strahlenquellenöffnung und
der Probenöffnung
bereitzustellen sowie um eine Detektoröffnung zur Bestimmung einer Öffnung für den Strahlenausgang
von der Probenöffnung
zu den Strahlendetektoren zu gewähren.
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Verfahren
der fluorimetrischen Blitzlichtanalyse einer Probe, von der erwartet
wird, dass sie bei Reizung an einer letzten Stelle eine anfängliche,
besondere, Fluoreszenz Strahlung erzeugt, schließt die Durchführung einer „blinden" Analyse und die
sinngemäße Durchführung einer
Probenanalyse ein. Die Durchführung
einer „blinden" Analyse umfasst:
Ein unterstützendes
Referenzfluorophor an der Testposition, von dem erwartet wird, dass
es bei Reizung eine zweite, besondere Fluoreszenz Strahlung erzeugt; die
Zuführung
eines Reizstrahlungs-Impulses an die Testposition; die Auswertung
der Strahlung, die von der Testposition ausgeht, mit einem entsprechenden Detektor
für die
anfängliche
Strahlung und einem entsprechenden Detektor für die zweite Strahlung; und die
Bestimmung eines „blinden" Wertes für das Verhältnis der
von der Testposition ausgehenden Strahlungsintensitäten bei
Abwesenheit einer Probe anhand des relativen Ansprechverhaltens
der Detektoren. Die sinngemäße Durchführung einer
Probenanalyse schließt
ein: Eine unterstützende
Probe an der Testposition bei konstant bleibender Präsenz des
Referenzfluorophors, von der erwartet wird, dass sie bei Reizung
durch einfallende Strahlung die anfängliche spezifische Strahlung
erzeugt; die Auswertung der von der Testposition ausgehenden Strahlung
mit den entsprechenden Detektoren; und die Bestimmung eines Probenwertes
für das
Verhältnis
der von der Testposition ausgehenden Strahlungsintensitäten bei Anwesenheit
einer Probe anhand des relativen Ansprechverhaltens der Detektoren.
Zur Analyse der Proben in Bezug auf einen Kalibrationsschritt schließt die Methode
weiter die Abschätzung
der „blinden" sowie der Proben-Werte
ein.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Detektoranordnung zur Verwendung in einem Spektrofluorimeter
bereitgestellt, welche die Präsenz
von Licht detektiert, das von einer Probe in Lösung mit einem Fluorophor emittiert
wird, wobei die Detektorvorrichtung Folgendes aufweist: Eine Detektoranordnung
zur Verwendung in einem Spektrofluorimeter welche die Präsenz von
Licht detektiert, das von einer Probe in Lösung mit einem Fluorophor emittiert wird,
wobei die Lösung
eine Einrichtung zum Ausstrahlen eines Lichtimpulses auf die Probe
enthält, wobei
die Ausstrahleinrichtung eine getriggerte Blitzlichtquelle aufweist:
Eine Einrichtung zum Detektieren des Lichts, das von der Probe in
Lösung
mit dem Fluorophor emittiert wird, wobei die Detektiereinrichtung
beinhaltet: Eine erste Photodiode, welche ein Emissionslicht-Signal
proportional zu dem emittierten Licht erzeugt; und einen mittels
einer Werkzeugmaschine hergestellten Hohlraum einer optischen Zelle, hergestellt
aus einem Licht absorbierenden Medium, wobei der Hohlraum der optischen
Zelle eine erste maschinell hergestellte Bohrung, die in dem Licht
absorbierenden Medium maschinell hergestellt wurde und einen Probenhaltebereich
enthält,
eine zweite maschinell hergestellte Bohrung, die in dem Licht absorbierenden
Medium maschinell hergestellt wurde und einen Licht aufnehmenden
Pfad enthält,
der zwischen der Ausstrahleinrichtung und dem Probenhaltebereich
angeordnet ist, und eine dritte, maschinell hergestellte Bohrung,
die in dem Licht absorbierenden Medium maschinell hergestellt wurde,
weiche einen Pfad für
das emittierte Licht enthält,
der zwischen dem Probenhaltebereich und der ersten Photodiode angeordnet
ist, bereitstellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoranordnung
weiterhin eine Referenz Photodiode aufweist, welche ein Referenz
Lichtsignal proportional zu dem ausgestrahlten Lichtimpuls erzeugt;
und der Hohlraum der optischen Zelle weiterhin eine vierte maschinell
hergestellte Bohrung bereitstellt, die in dem Licht absorbierenden
Medium maschinell hergestellt wurde, um die direkte Übertragung
von Licht, das von der Xenon Blitzlichtquelle erzeugt wurde, zu
dem Referenz Detektor entlang einem zwischen der Ausstrahleinrichtung
und der Referenz Photodiode angeordneten Referenz Lichtpfad des
Hohlraums der optischen Zelle zu ermöglichen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird weiter eine Methode zur Erkennung einer bestimmten Molekularstruktur
in einer Probe mittels Spektrofluorimeters bereitgestellt, die folgende
Schritte umfasst: Erzeugen einer Lösung, die die Probe und einen
Fluorophor enthält;
Laden eines Kondensators mit elektrischer Energie in Reaktion auf
ein Ladesignal von einem Computer; elektrisches Verbinden des Kondensators
mit einer Lichtquellen Ausstrahleinrichtung in Reaktion auf ein
Triggersignal von einem Computer, wodurch ein Lichtimpuls mit einer
Wellenlänge
im sichtbaren Spektrum erzeugt wird, wobei die Lichtquellen Ausstrahleinrichtung
eine getriggerte Xenon Blitzlichtquelle aufweist; Ausrichten des
emittierten Lichtimpulses, so dass er auf die Lösung strahlt und emittiertes
Licht erzeugt; Ausrichten des emittierten Lichts, so dass es auf
einen ersten Photodioden Festkörper
Detektor strahlt und dadurch ein Emissionslicht Signal proportional
zu dem emittierten Licht erzeugt; und Feststellen der Quantität der Molekularstruktur,
die in der Probe vorhanden ist, mittels des Emissionslicht Signals
und des Fluorophors, wobei die Schritte mittels eines mittels einer
Werkzeugmaschine hergestellten Hohlraums einer optischen Zelle ausgeführt werden,
der aus einem Licht absorbierenden Medium gefertigt ist, wobei der
Hohlraum der optischen Zelle eine erste maschinell hergestellte
Bohrung bereitstellt, die in dem Licht absorbierenden Medium maschinell
gefertigt ist und einen Probenhaltebereich für die Lösung enthält, eine zweite maschinell hergestellte
Bohrung, die in dem Licht absorbierenden Medium maschinell gefertigt
ist und einen Licht aufnehmenden Pfad enthält, welcher zwischen der Strahlungseinrichtung
und dem Probenhaltebereich angeordnet ist, und eine dritte, maschinell
hergestellte Bohrung, die in dem Licht absorbierenden Medium maschinell
hergestellt ist und einen Pfad emittiertes Licht enthält, welcher
zwischen dem Probenhaltebereich und der ersten Photodiode angeordnet
ist; dadurch gekennzeichnet, dass der ausgestrahlte Lichtimpuls
so orientiert ist, dass er auch an einem Referenz Photodioden Festkörper-Detektor
abstrahlt, der ein Referenzlicht-Signal proportional zu dem Lichtimpuls
von der Abstrahlungsvorrichtung erzeugt, indem das abgestrahlte
Licht von der Abstrahlungsvorrichtung zu dem Referenz Detektor durch
direkte, aus der Lichtquelle generierte Lichtübertragung an den Referenz
Detektor weitergegeben wird, wobei der Hohlraum der optischen Zelle
weiterhin eine vierte maschinell hergestellte Bohrung bereitstellt,
die in dem Licht absorbierenden Medium maschinell hergestellt wurde,
um die direkte Übertragung
von Licht, das von der Xenon Blitzlichtquelle erzeugt wurde, zu
dem Referenz Detektor entlang einem zwischen der Ausstrahleinrichtung
und der Referenz Photodiode angeordneten Referenz Lichtpfad des
Hohlraums der optischen Zelle zu ermöglichen.
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Es
ist eine Aufgabe der Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung, ein Festkörper Spektrofluorimeter mit
hoher Unanfälligkeit
auf unerwünschte
Geräusche
bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe der Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Festkörper Spektrofluorimeter bereitzustellen,
welches eine getriggerte Lichtquelle benutzt.
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Eine
weitere Aufgabe des Spektrofluorimeters gemäß der Ausführungsbeispiele der vorliegenden
Erfindung ist es, ein Festkörper
Spektrofluorimeter bereitzustellen, welches eine Lichtquelle mit
niedriger Leistung erfordert.
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Eine
weitere Aufgabe der Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Festkörper Spektrofluorimeter bereitzustellen,
welches imstande ist, mittels kommerziell erhältlicher Fluorophore Licht
im sichtbaren Spektrum zu detektieren.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung ist es, ein kompaktes, leicht zu bedienendes
Spektrofluorimeter bereitzustellen.
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Um
die oben genannten Aufgaben der Erfindung zu erzielen, benutzt die
vorliegende Erfindung unter anderem zweckmäßigerweise eine getriggerte Xenon
Blitzlichtröhre.
Vorzugsweise wird die Blitzlichtröhre durch einen Kondensatorspeicher
angetrieben, die Xenon Blitzlichtröhre wird mit passender ohmscher
Belastung parallel angeschlossen, wobei diese ohmsche Belastung
die Lebensdauer der Xenon Blitzlichtröhre sowie die Dauer des Lichtimpulses selbst
verlängert.
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Außerdem verwendet
ein Spektrofluorimeter gemäß den Ausführungsbeispielen
der vorliegenden Erfindung eine optische Zelle mit einer Konfiguration, in
der die Xenon Blitzlichtröhre
in regelmäßigen Abständen zu
einem Paar Photodioden und einem Referenz Detektor angeordnet ist.
Die Anordnung in regelmäßigen Abständen trägt wesentlich
dazu bei, dass die Verwendung von Festkörper Detektoren im Spektrofluorimeter
möglich
ist.
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Ein
Spektrofluorimeter gemäß Ausführungsbeispielen
der vorliegenden Erfindung gewährleistet weiter
die elektrische Isolierung der Detektor Verstärker während der ganzen Zeitdauer
mit Ausnahme der eigentlichen Detektion des Blitzlicht-Ablaufs.
Dadurch wird die Unanfälligkeit
des Spektrofluorimeter Detektor-Systems auf Geräusche verbessert.
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Auch
verwendet ein Festkörper
Spektrofluorimeter gemäß Ausführungsbeispielen
der vorliegenden Erfindung zweckmäßigerweise einen Mikrocontroller,
um die zeitliche Koordination der Blitzlichter der Xenon Blitzlichtröhre sowie
die zeitliche Planung der galvanischen Trennung der Detektor Verstärker-Stromkreise
zu regulieren.
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Deshalb
ermöglichen
die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele
eines Festkörper
Spektrofluorimeters zweckmäßigerweise
die Detektion von Molekularstrukturen in einer Probe mittels eines üblicherweise
erhältliches
Fluorophors, das im sichtbaren Spektrum detektiert werden kann.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung werden nachfolgend anhand von Beispielen mit Verweis
auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
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1 ein
Blockschaltbild eines Spektrofluorimeters zeigt, das in der vorliegenden
Erfindung als Ausführungsbeispiel
dient;
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2 eine
perspektivische Ansicht der optischen Zelle zeigt, die in der vorliegenden
Erfindung als Ausführungsbeispiel
dient;
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3 eine
linke Seitenansicht der optischen Zelle zeigt, die in der vorliegenden
Erfindung als Ausführungsbeispiel
dient;
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4 eine
rechte Seitenansicht der optischen Zelle zeigt, die in der vorliegenden
Erfindung als Ausführungsbeispiel
dient;
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5 eine
Querschnittansicht entlang der Linie A-A der in der 3 dargestellten
optischen Zelle zeigt;
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5A eine
Querschnittansicht eines anderen Ausführungsbeispiels eines Teils
der in der 3 dargestellten optischen Zelle
zeigt;
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6 eine
Querschnittansicht entlang der Linie B-B der in der 3 dargestellten
Zelle zeigt;
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7 eine
Querschnittansicht entlang der Linie C-C der in der 3 dargestellten
Zelle zeigt;
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8 eine
Querschnittansicht entlang der Linie D-D der in der 3 dargestellten
Zelle zeigt;
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9 den
anfänglichen
Verstärkungs-Schaltkreis
zeigt, der mit dem linken Signal Detektor des Spektrofluorimeters,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient, verwendet
wird;
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10 den
anfänglichen
Verstärkungs-Schaltkreis
zeigt, der mit dem rechten Signal Detektor des Spektrofluorimeters,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient, verwendet
wird;
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11 den
anfänglichen
Verstärkungs-Schaltkreis
zeigt, der mit dem Referenz Signal Detektor des Spektrofluorimeters,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient, verwendet
wird;
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12 den
Signal Aufbereitungs-Schaltkreis des Spektrofluorimeters zeigt,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient;
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13 den
Stromversorgungs-Schaltkreis des Spektrofluorimeters zeigt, das
in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient;
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14 den
Schnittstellen-Schaltkreis zeigt, der von dem Spektrofluorimeter,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient, verwendet
wird;
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15 den
Mikrocontroller Schaltkreis zeigt, der mit dem Spektrofluorimeter,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient, verwendet
wird;
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16 ein
Flussdiagramm bereitstellt, das die durch einen Mikrocontroller
gesteuerte Operation des Spektrofluorimeters, das durch den Mikrocontroller
gesteuert wird und in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel
dient, umreißt;
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17 verschiedene
Anzeige-Möglichkeiten
zeigt, die dem Benutzer des Spektrofluorimeters, das in der vorliegenden
Erfindung als Ausführungsbeispiel
dient, zur Verfügung
stehen; und
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18 Stichproben
zeigt, die während
eines einzigen Blitzlicht Ablaufs unter Verwendung des Spektrofluorimeters,
das in der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient, entnommen
wurden.
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1 zeigt
ein Blockschaltbild eines Spektrofluorimeters 10, das in
der vorliegenden Erfindung als Ausführungsbeispiel dient. Wichtige
Komponenten des Spektrofluorimeters 10 schließen eine
optische Zelle 12 ein, die ein Xenon Blitzlicht 14,
einen linken Signal Detektor Schaltkreis 16, einen linken
Signal Detektor 17, einen rechten Signal Detektor Schaltkreis 18,
einen rechten Signal Detektor 19, einen Referenz Detektor
Schaltkreis 20 sowie einen Referenz Signal Detektor 21 beinhaltet.
Die Xenon Blitzlichtröhre
wird durch Energie geladen, die im Speicherkondensator gespeichert
ist, der sich in einem Stromversorgungs-Schaltkreis 22 befindet,
welcher ebenfalls Energie für
den Einsatz eines Kühlungsventilators 24 liefert.
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Ein
Signal Aufbereitungs-Schaltkreis 26 erhält die detektierten Signale
von dem linken Signal Detektor Schaltkreis 16, dem rechten
Signal Detektor Schaltkreis 18 und dem Referenz Detektor
Schaltkreis 20. Der Signal Aufbereitungs-Schaltkreis 26 verstärkt, formt
und addiert die detektierten Signale und übermittelt diese an einen Mikrocontroller
Schaltkreis 28. Ein Schnittstellen Schaltkreis 30 übermittelt Signale
zwischen Stromversorgungs-Schaltkreis 22, Mikrocontroller
Schaltkreis 28 und Signal Aufbereitungs-Schaltkreis 26 wie
im Folgenden beschrieben.
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Die
durch die Operation des Spektrofluorimeters 10 erhaltenen
Analyse Resultate werden auf einer Anzeige 32 angezeigt,
die entweder aus einer Leuchtdioden Anzeige mit numerischen Werten
oder einem Bildschirm mit graphischen Darstellungen bestehen kann.
Eine Tastatur 34 ermöglicht
die Eingabe von Funktionsweise, Anfangsbedingungen sowie verschiedenen
Sensitivitäts-Eigenschaften,
die im Folgenden beschrieben werden. Es können entweder einzelne Funktionstasten
oder Mehrfunktions-Auf-/Ab-Tasten verwendet werden, welche durch wiederholtes
Drücken
auf die gleichen Auf-/Ab-Tasten verschiedene Eingaben ermöglichen
und die Software-programmiert sind.
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2 zeigt
die optische Zelle 12. Die optische Zelle 12 enthält einen
mittels einer Werkzeugmaschine hergestellten Zell-Hohlraum 36,
der vorzugsweise aus einem schwarzen Phenolharz oder einem matt-schwarzen
eloxierten Aluminium hergestellt ist. Die Außendimensionen des Zell-Hohlraums 36 betragen
etwa 4 cm3 und er ist auf einer schwarzen
eloxierten Aluminium-Platte 38 befestigt, welche die Xenon
Blitzlichtröhre
von dem Zell-Hohlraum 36 abschirmt, außer wie im folgenden beschrieben.
Der Zell-Hohlraum 36 ist weiterhin mit einer Öffnung ausgestattet,
welche die Einführung
einer Küvette 40 ermöglicht,
die die betreffende Probe in der Fluorophor Lösung enthält. Der Zell-Hohlraum 36 enthält weiter Öffnungen
für den
linken Signal-Detektor 17, den rechten Signal Detektor 19,
den Referenz Signal Detektor 21 sowie ein Licht absorbierendes
Medium 42.
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Ein
Blitzlicht-Halter 44 aus Corian, einer Acryl-/Aluminium-Hydroxid
Verbindung, dient als Haltevorrichtung für das Xenon Blitzlicht 14.
Jeder der Detektoren 17, 19 und 21, die
in der optischen Zelle 12 bereitstehen, ist elektrisch
an dem linken Signal Detektor Schaltkreis 16, dem rechen
Signal Detektor Schaltkreis 18 bzw. dem Referenz Detektor
Schaltkreis 20 angeschlossen. Jeder der Detektor Schaltkreise 16, 18 und 20 ist
direkt über
den in der optischen Zelle 12 vorhandenen Detektoren angebracht. Diese
Anordnung minimiert die Länge
des elektrischen Pfades den die detektierten Signale vor der ersten
Versärkung
zurücklegen
müssen,
wie nachstehend beschrieben.
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3–8 zeigen
die verschiedenen Querschnittansichten der optischen Zelle 12.
Wie aus Abbildung ersichtlich, deuten die gestrichelten Linien Öffnungen
in der optischen Zelle 12 an für die Einführung der Detektoren 17, 19 und 21 sowie
der Küvette 40.
Außerdem
stellen diese Öffnungen
Lichtpfade für
die benötigten
optischen Übertragungspfade
bereit.
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Wie
aus 5, die eine A-A Querschnittansicht der 3 ist,
deutlich ersichtlich wird, besteht die Öffnung zwischen dem Xenon Blitzlicht 14 und der
Küvette 40 aus
einem rechteckigen Schlitz 46 von 3 mm Breite und 7 mm
Höhe.
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Eine
Alternative zu dem rechteckigen Schlitz 46 ist eine Mehrzahl
von etwa 10 Löchern 47 mit
einem Durchmesser von etwa 0,7 mm, die wie in der 5A dargestellt
in der Form eines rechteckigen Schlitzes 46 angeordnet
sind. Obwohl es schwieriger ist, mittels Werkzeugmaschinen ein solches
Lochmuster 47 herzustellen, kann dieses Muster das Licht,
das aus dem Xenon Blitzlicht 14 ausstrahlt, besser auf
die Probe in der Küvette 40 fokussiert
werden.
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Die
Distanz zwischen dem Xenon Blitzlicht 14 und der Küvette 40 beträgt 10 mm.
Der optische Pfad stellt einen Interferenzfilter 54 bereit,
der sich zwischen dem Xenon Blitzlicht 14 und der Küvette 40 befindet.
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Eine Öffnung 48 wird
bereitgestellt, welche die direkte Übertragung des von dem Xenon
Blitzlicht 14 generierten Lichts auf den Referenz Detektor 21 ermöglicht. Öffnung 48 hat
einen Durchmesser von 0,35 mm, welcher für etwa drei Viertel der 35
mm langen Distanz zwischen dem Xenon Blitzlicht 14 und dem
Referenz Detektor 20 gleich bleibt. Der im Verhältnis zu Öffnung 46 kleine
Durchmesser der Öffnung 48 hilft,
die Menge des von dem Xenon Blitzlicht 14 auf den Detektor 21 übertragenen
Lichts zu reduzieren. Dadurch wird die Menge des Lichts, welches tatsächlich jeden
der Detektoren 17, 19 und 21 erreicht,
auszugleichen.
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7 zeigt
im Detail das Licht absorbierende Medium 42 welches sich
direkt hinter der Küvette 40 befindet.
Dies dient dazu, dass das Licht das aus der Xenon Blitzlichtröhre durch
die Küvette 40 fließt, nicht
reflektiert wird, um anschließend
von den Detektoren 17 und 19 detektiert werden
zu können.
Dies stellt sicher, dass nur fluoreszierendes Licht von den Detektoren 17 und 19 detektiert
wird. 3 zeigt weiter den in der Umgebung des Referenz
Detektors 21 größeren Durchmesser
der Öffnung 48,
der benötigt
wird um den Referenz Detektor 21 genau zu positionieren. 3 zeigt
auch, dass ein neutraler Dichte-Referenz-Filter 52 zwischen
Xenon Blitzlicht 14 und Detektor 21, direkt vor
dem Detektor 21, platziert ist. Dies hilft weiter, die
Lichtmenge, welche tatsächlich
jeden der Detektoren 17, 19 und 21 erreicht, auszugleichen.
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Die 7 und 8 dienen
zur Beschreibung der optischen Eigenschaften der optischen Zelle 12.
In 7 wird die Küvette 40 gezeigt,
welche die zu analysierende Probe in Lösung enthält, und die sich auf halbem
Weg zwischen den Detektoren 17 und 19 befindet.
Die Küvette 40 hat
vorzugsweise einen Außendurchmesser
von etwa 10 mm, obwohl selbstverständlich auch eine Küvette 40 von
anderer Größe bzw.
Form verwendet werden kann. Die bevorzugte Distanz zwischen Außendurchmesser
der Küvette 40 und
jedem der Detektoren 17 und 19 beträgt 10 mm.
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Vor
jedem der Detektoren 17 und 19 befinden sich Hochbandpass-Emissionsfilter 56 und 58. Diese
Filter eliminieren die Wellenlängen
unterhalb der betreffenden Wellenlänge. Wenn Äthidiumbromid (EtBr) als ein
Fluorophor eingesetzt wird, ist jeder der Filter vorzugsweise ein
OR 570 Filter, der Licht von über
590 nm durchlässt,
während
nahezu alles Licht mit einer Wellenlänge von unter 550 nm blockiert wird.
Jeder der Hochbandpass-Emissionsfilter 56 und 58 wird
mittels eines O-Ringes 60 und 62 in lichtdichter
Konfiguration gehalten. Jedes Paar der O-Ringe 60 und 62 wird
zusammengedrückt
nachdem die Detektoren 17 und 19 in die optische
Zelle 12 eingeführt
worden sind.
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8 zeigt
den Pfad 64, den das Licht aus dem Xenon Blitzlicht 14 zurücklegt,
um die in der Küvette 40 enthaltene
Probe in Lösung
genau zu treffen. Pfade 66 und 68 zeigen den Weg,
den das von den Detektoren 17 und 19 detektierte
fluoreszente Licht zurücklegt;
wobei diese Pfade jeweils vorzugsweise in einem Winkel von 90° zu Pfad 64 verlaufen.
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9 zeigt
den linken Signal Detektor Schaltkreis 16, der in der Form
eines Blockschaltbildes in der 1, sowie
als Schaltkreistafel in der 2 vorhanden
ist. Der Detektor 17 ist vorzugsweise eine Siemens BPX 61 Photodiode,
und wird wegen der sehr hohen Sensitivität der Photodiode ohne Vorspannung
verwendet.
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Ein
Operationsverstärker 80 stellt
die Eingangs-Verstärkung
des von dem Detektor 17 detektierten Signals bereit. Die
verschiedenen in der 9 dargestellten Kondensatoren
und Widerstände
sorgen für
angemessenen Schrägverzug
und angemessene Wellen-Umformung.
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10 zeigt
den rechten Signal Detektor Schaltkreis 18, welcher mit
einer linken Sensorplatte 16, die vorangehend unter 9 beschrieben
wurde, identisch ist. Detektor 19 ist wieder eine Siemens BPX 61 Photodiode,
die ebenfalls ohne Vorspannung verwendet wird. Es ist darauf zu
achten, dass Detektoren 17 und 19 mit abgestimmten
elektrischen Eigenschaften besorgt werden.
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11 zeigt
den Referenz Detektor Schaltkreis 20, der ebenfalls eine
Siemens BPX 61 Photodiode als Detektor 21 benutzt
und die auch ohne Vorspannung verwendet wird. Das detektierte Signal wird
durch einen Operationsverstärker 84 verstärkt. Der
dem Wellen formenden und Geräusch
reduzierenden Schaltkreis angehörende
Operationsverstärker 84 ist
identisch mit einem Schaltkreis, der mit den Detektoren 17 bzw. 19 verwendet
wird um eine maximale Leistung erzielen zu können.
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11 zeigt
auch, dass alle einmal verstärkten,
von den Detektoren 17 bzw. 19 detektierten Signale
sowie das einmal von Detektor 21 verstärkte Signal an den Signal Aufbereitungs-Schaltkreis 26 abgegeben
werden, wie in der 12 dargestellt.
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Jedes
der detektierten Signale fließt
wie nachfolgend beschrieben während
einer durch das SPERR Signal zu bestimmenden Zeit durch einen getriggerten
Schalter 86. Die detektierten und einmal verstärkten Signale
von dem linken Signal Detektor 17 und von dem rechten Signal
Detektor 19 werden an einem Knotenpunkt 88 addiert
und anschließend durch
die Operationsverstärker 90 und 92 doppelt verstärkt. Wieder
sorgen die zugehörigen
Widerstände
und Kondensatoren für
Geräusch-Immunität und angemessene
Wellen-Umformung.
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Sinngemäß wird auch
das Referenz Detektor Signal durch Operationsverstärker 94 und 96 doppelt verstärkt. Identische
Geräuschreduktions-
und Wellen-Umformungs-Schaltkreise sind mit den Operationsverstärkern 94 und 96 verbunden.
Die detektierte Signal-Abgabe 100 aus Operationsverstärker 92 und die
Referenz-Signal Abgabe 102 aus Operationsverstärker 96 werden
jeweils in den Mikrocontroller Schaltkreis 28 eingegeben
wie in der 15 nachfolgend beschrieben.
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13 zeigt
die Stromversorgung 22, die benutzt wird, um das Xenon
Blitzlicht 14 und den in der 1 gezeigten
Kühlungsventilator 24 anzutreiben.
Die Stromversorgung 22 treibt das Xenon Blitzlicht 14 mittels
in einem Kondensator 104 gespeicherter Ladung an. Ein Widerstand 106 wird
benutzt, um die Dauer des Xenon Blitzlichtröhren-Impulses zu verlängern, der
durch die Reduktion der Spannung, die durch die Anschlüsse des
Xenon Blitzlichts selbst fließt,
ebenfalls die Lebensdauer der Xenon Blitzlichtröhre verlängert. Im Betrieb wird der
Kondensator 104 in Gegenwart des Widerstandes 106 mit
240 Volt getriggert, wobei ein 600 nm Impuls von 30 000 Watt erhalten
wird, wenn er während
der Dauer des Impulses integriert wird.
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Ein
LADE Signal, das in einen Kondensator Lade-Schaltkreis 108 eingegeben
wird, leitet das Laden des Kondensators 104 ein. Es wird
festgehalten, dass eine abgestimmte Gruppe von Zenerdioden mit einer
nominalen Spannung von 15 Volt Zenerspannung benutzt wird, um das
Laden des Kondensators 104 zu stabilisieren.
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Wenn
voll aufgeladen, entwickelt der Kondensator 104 ein kapazitives
Spannungssignal auf Leitung 110, welches dann in den Mikrocontroller Schaltkreis 28 eingegeben
und wie im Folgenden beschrieben verwendet wird.
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Wenn
der Kondensator 104 voll aufgeladen ist, ist das Xenon
Blitzlicht 14 bereit, ausgelöst zu werden. Nach Erhalt eines Übertragungs-AUSLÖSE Signals
entlang einer Leitung 112, beginnt ein Silikon gesteuerter
Stromrichter 114 zu leiten. Dies bewirkt, dass ein Übertragungswandler 116 das
Xenon Blitzlicht 14 einschaltet. Auf diese Weise lädt die im
Kondensator 104 gespeicherte Ladung das Xenon Blitzlicht 14 auf,
welches dabei die Probenlösung
in Küvette 40 und
den Referenz Detektor 21 beleuchtet, wie in der 2 dargestellt.
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13 zeigt
ebenfalls eine Überspannungsschutz-Einrichtung,
im speziellen einen Varistor 118, der Stromstöße in der
Spannung, die zum Laden des Kondensators 104 benutzt wird,
eliminiert.
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Der
Stromversorgungs-Schaltkreis 22 bezieht Gleichstrom mittels
einer abgestuften Stromversorgungs-Konfiguration. Die Wechselstrom-Eingabe aus
einer Leitung 120 entwickelt positiv geladenen 24 Volt
Gleichstrom an einem Knotenpunkt 122 und negativ geladenen
24 Volt Gleichstrom an einem Knotenpunkt 124 unter Verwendung
von Dioden und Glättungskondensatoren.
Positiv geladener 12 Volt Gleichstrom wird mit Verwendung eines
dreipoligen Positiv-Spannungsreglers 126 erhalten, so dass
auf Leitung 128 positiver 12 Volt Gleichstrom erzeugt wird.
Dieser positive 12 Volt Gleichstrom wird anschließend in
zwei verschiedene dreipolige 5 Volt Niedrigspannungs-Positiv-Gleichspannungsregler 130 und 132 eingegeben,
um VCC Gleichstromspannung und positiv geladenen 5 Volt Gleichstrom
zu erhalten. Ähnlich
werden die negativ geladenen 24 Volt aus Knotenpunkt 124 in
einen dreipoligen 5 Volt Niedrigspannungs-Negativ-Gleichspannungsregler 134 eingegeben,
um negativ geladenen 5 Volt Gleichstrom zu erhalten.
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14 zeigt
einen Schaltstellen-Schaltkreis 30 zwischen dem in der 13 dargestellten Stromversorgungs-Schaltkreis 22 und
dem in der 15 dargestellten Mikrocontroller-Schaltkreis 28.
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Kapazitives
Spannungssignal und Wechselstromsignal werden direkt von dem Stromversorgungs-Schaltkreis 22 zu
dem Mikrocontroller-Schaltkreis 28 weitergeleitet. Das
AUSLÖSE
Signal, welches von dem Mikrocontroller-Schaltkreis 28 erhalten wird,
wird jedoch zuerst durch Auslösen
des Verstärkers 140 verstärkt. Anschließend wird
das AUSLÖSE Signal
an den Stromversorgungs-Schaltkreis 22 weitergegeben, um
das Xenon Blitzlicht 14 wie vorangehend beschrieben, auszulösen. Das
LADE Signal wird vom Mikrocontroller-Schaltkreis 28 auf ein Flipflop 142 eingegeben.
Das Flipflop 142 erhält
an seinem Ausgang ein Signal, das dem Pegel des LADE Signals entspricht,
solange aufrecht, bis der Mikrocontroller-Schaltkreis 28 ein
weiteres LADE Signal in Reaktion auf die Eingabe eines vorangehend
beschriebenen kapazitiven Spannungssignals entwickelt. Dies stellt
sicher, dass der Kondensator 104 der 13 vor
dem Auslösen
des Xenon Blitzlichtes 14 voll geladen ist.
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Wie
ebenfalls in der 14 gezeigt, wird das AUSLÖSE Signal,
ebenso durch den Operationsverstärker 140 verstärkt, alsdann
auch als SPERR Signal Eingabe für
den Signal Aufbereitungs-Schaltkreis 26 benutzt. Wie vorangehend
beschreiben, verbindet das SPERR Signal in wirksamer Weise die Detektoren 17, 19 und 21 mit
dem Signal-Aufbereitungs-Schaltkreis 26,
wenn sich die Schalter 86 der 12 in
normaler offener Position befinden. Dies schützt den optischen Detektor 17, 19 und 21 und
die damit verbundenen des Kondensators und zu Beginn der Blitzlicht-Zündung.
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Das
Xenon Blitzlicht 14 liefert etwa 30'000 Watt wenn es während der Dauer des Impulses
zum Erhalten von Detektor Proben integriert wird. Obschon der Xenon
Impuls eine Anzahl ausgeprägter Spitzen
und Täler
aufweist, hat das Xenon Emissions-Spektrum eine breite Basis mit
beträchtlicher
Abgabe im sichtbaren Lichtspektrum. Mit dem auf diese Weise getriggerten
Kondensator 104 und Verwendung der durch den Widerstand 106 angepassten ohmschen
Belastung, ist es möglich,
das Xenon Blitzlicht 14 zu laden und mit einer gewünschten
Frequenz von wenigstens 0,5 Hertz auszulösen.
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15 zeigt
den Mikrocontroller-Schaltkreis 28, der vorzugsweise einen
Mikrocontroller 150 der Marke Motorola 68HC11 einschließt. Selbstverständlich können aber
auch andere Mikrocontroller oder Mikroprozessoren mit selbständigem Speicher verwendet
werden. Eingangs-Signale zu dem Mikrocontroller 150 schließen ein
NULLDURCHGANGS Signal an Leitung 152 ein, welches vom Wechselstrom
abgeleitet wird und durch den dargestellten Widerstand an der Basis
des zweipoligen Flächentransistors
eingegeben wird. Das NULLDURCHGANGS Signal stellt eine Nulldurchgangs-Referenz
zur Verfügung,
die von dem Mikrocontroller 150 benutzt wird, um das Auslösen des
Xenon Blitzlichts 14 mit der Leitungsfrequenz des Wechselstromtaktes
zu synchronisieren. Die Synchronisation des Auslösens der Xenon Blitzlichtröhre in Bezug
auf die Leitungsfrequenz des Wechselstromtaktes eliminiert Geräusche des
60 Hertz Taktes wirkungsvoll, weil sie die Schaltkreise bei jedem
Auslösen
des Xenon Blitzlichts 14 auf die genau gleiche Weise beeinflusst.
Auch an dem Mikrocontroller 150 das kapazitive Signal sowie
das detektierte Referenz-Signal 102 und das detektierte
Signal 100 eingegeben. Von dem Mikrocontroller 150 abgehende
Leitungen 156 sind mit der in der 1 dargestellten
Anzeige-Einrichtung 32 verbunden.
In ähnlicher
Weise werden Leitungen 158 dazu verwendet, um die Tastatur 34 am
Mikrocontroller zu befestigen.
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Auch
wird vom Mikrocontroller 150 ein VENTILATOR-GESCHWINDIGKEITS
Signal abgegeben, welches die Geschwindigkeit eines Mehrgeschwindigkeits-Ventilators
gemäß der von
dem Xenon Blitzlicht 14 generierten Hitze sowie dem dazugehörigen Schaltkreis,
regelt. Es wird angenommen, dass diese Hitze beim Auslösen des
Xenon Blitzlichts 14 vom Mikrocontroller 150 generiert
wird. Demnach kann der Mehrgeschwindigkeits-Ventilator nach dem
ersten Blitzlicht auf eine hohe Geschwindigkeit eingestellt werden,
die bis nach Ablauf einiger Zeit nach dem letzten Blitzlicht so
bleiben kann.
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Die
Handhabung des Spektrofluorimeters 10, das als Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung dient und die oben beschriebene bevorzugte Struktur
verwendet, wird nun mittels Flussdiagramm der 16 weiter
ausgeführt,
welches die notwendigen Ablaufschritte zum Programmieren des Mikrocontrollers 150 bereitstellt,
mit Programmanleitungen für
die einzelnen Schritte, welche die Bedienung des Spektrofluorimeters
wie vorangehend bzw. nachfolgend beschrieben, steuern.
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Während des
ersten Bedienungsschrittes 200, wird der Benutzer das Spektrofluorimeter 10 auf die
gewünschte
Betriebsart, die gewünschte
Anzeigeart sowie die gewünschten
Sensibilitätsfühlenden Eigenschaften
einstellen.
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In
Bezug auf die Betriebsart sei auf die 17 verwiesen.
Damit das Spektrofluorimeter 10 ordnungsgemäß aufgestellt
werden kann, ist es notwendig, zuerst die für die Aufnahme der Probe vorgesehene
Lösung
zu untersuchen. Auf diese Weise wird ein Null-Pegel erreicht. Durch
Drücken
auf Verstärkungs-Schaltkreise 16, 18, 20 und 26 während des
Ladens eine der „Einfügen von
null Mikrogramm pro Milliliter" Taste
wird das Spektrofluorimeter so konfiguriert, dass die Lösung ohne
Probe untersucht wird und die Resultate für nachfolgend beschriebene Kalibrationen
benutzt werden können.
Die Resultate dieser Nullpegel-Untersuchung werden anschließend im
Zwischenspeicher des Mikrocontrollers 150 wie in der 15 dargestellt,
gespeichert.
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Während der
Ersteinstellung des Spektrofluorimeters 10, das als Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung dient, ist sinngemäß auch eine zweite Untersuchung
für die
zweite Betriebsart notwendig. In diesem Untersuchungsverfahren wird
eine reine Probe der Molekularstruktur, die in der zu untersuchenden
Probe gesucht wird, in der Lösung
verdünnt
und anschließend
ausgewertet. Die Untersuchung wird eingeleitet sobald die „Einfügen von
50 μg/ml
std" Taste gedrückt wird,
wie in der 17 dargestellt. Sobald diese
Untersuchung zu Ende ist, wird damit eine Anzahl reiner Kalibrations-Resultate erzielt.
Die Null- bzw. Rein-Kalibrations-Resultate werden dazu verwendet,
ein lineares Verhältnis
zwischen der Konzentration der betreffenden Molekularstruktur und
der Intensität
der von den Detektoren 17 und 19 detektierten
Abgabe von fluoreszentem Licht, festzulegen.
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Sobald
diese beiden Eingangs-Untersuchungen beendet sind, ist es möglich, die
betreffende Probe zu untersuchen, um die Menge der Molekularstruktur
in einer Probe mit unbekannter Menge der Molekularstruktur zu bestimmen.
Dieses dritte Untersuchungsverfahren wird durch Drücken der „Einfügen von
unbekannt" Taste
eingeleitet, wie in der 17 dargestellt.
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Es
ist festzuhalten werden, dass die beiden ersten Untersuchungsverfahren,
die zur ordnungsgemäßen Initialisierung
des Spektrofluorimeters 10 benötigt werden, bis zu dem Zeitpunkt
wo die Anfangsbedingungen zurückgesetzt
werden sollen, nur einmal durchgeführt werden brauchen. Der Controller 150 speichert
diese Kalibrationswerte im Zwischenspeicher und verwendet sie bei
jeder folgenden Analyse einer unbekannten Probe.
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Die
zweite Anfangsbedingung, die vom Benutzer in Schritt 200 der 16 eingestellt
wurde, bezieht sich auf die gewünschte
Anzeige-Ausgabenart. Es wird wieder auf die 17 verwiesen.
Jede der drei senkrechten Spalten stellt eine gewünschte Ausgabenart
dar. Die linke Spalte zeigt an, dass eine Ausgabe gewünscht wird,
die die Konzentration der betreffenden Molekularstruktur bereitstellt.
Die mittlere Spalte zeigt an, dass ein Zell-Zähl-Verfahren gewünscht wird.
Die rechte Spalte zeigt an, dass der rohe Fluoreszenzwert gewünscht wird.
Dieser Wert kann für
die Berechnungen von vom Benutzer gewünschten Rohdaten verwendet
werden.
-
Die
dritte Anfangsbedingung, die im Schritt 200 eingestellt
wurde, bezieht sich auf die Sensitivität der nachfolgenden Detektionen,
die vorgenommen werden sollen. Insbesondere wegen Abweichungen in
der Intensität
der Xenon Blitzlicht-Abgabe, ist es in bestimmten Fällen wünschenswert,
nur solche detektierten Werte zu verwenden, die erhalten werden, wenn
Xenon Blitzlicht-Impulse von außerordentlich ähnlichen
Intensitäten
erhalten werden.
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Demnach
stellt der Benutzer einen „Y" Wert ein, welcher
eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 ist, entsprechend einer zulässigen Drift
im rohen Fluoreszenz WERT, der nachfolgend beschrieben wird. Dieser „Y" Wert stellt die
durch Variationen in der Intensität des Xenon Blitzlichts verursachte
zulässige Drift,
Veränderungen
in der Schlüpfrigkeit
der Probe sowie elektrische und optische Geräusche dar. Weiterhin wird ein „X" Wert eingestellt,
der die Anzahl der Xenon Blitzlicht-Impulse angibt, und damit die
Detektionen, von denen der Benutzer hofft, dass sie stattfinden
werden, und die gemittelt werden, um einen Durchschnitt des rohen
Fluoreszenz-Wertes zu erhalten. Dieser rohe Fluoreszenz-Wert wird
anschließend
in nachfolgenden Operationen verwendet, um je nach ausgewählter Ausgaben-Anzeigeart
entweder die Konzentration der Molekularstruktur oder die Anzahl
Zellen in dieser Probe bestimmen zu können.
-
Sobald
diese drei ersten Anfangsbedingungen eingestellt sind, wird die
Operation des Spektrofluorimeters 10 durch Drücken auf
die Start-Taste in Schritt 202 eingeleitet. Die folgenden
Schritte finden nun statt:
-
In
Schritt 204 gibt der Mikrocontroller 150 in der 15 ein
LADE Signal aus, welches von dem in der 13 dargestellten
Kondensator-Lade-Schaltkreises 108 für das Laden des Kondensators 104 verwendet
wird. Es folgt Schritt 206, und Mikrocontroller 150 wartet
darauf, dass ein kapazitives Signal entlang Leitung 110 generiert
wird, das anzeigt, dass Kondensator 104 voll geladen ist.
Nach der völligen
Ladung generiert der Mikrocontroller 150 ein weiteres LADE
Signal, um den Zustand des Flipflop 142 der 14 zu
verändern,
womit das Laden des Kondensators 104 beendet wird.
-
Es
folgt Schritt 208, und der Mikrocontroller 150 wartet
darauf, ein NULLDURCHGANGS Signal zu detektieren, das entlang der
in der 15 dargestellten Leitung 152 entsteht.
Sobald das NULLDURCHGANGS Signal vom Mikrocontroller 150 detektiert
wird, generiert der Mikrocontroller 150 das AUSLÖSE Signal,
welches dann abgegeben wird und zum Auslösen des in der 13 dargestellten Silikon
gesteuerten Stromrichters 114 benutzt wird. Dies bewirkt
die Auslösung
des Xenon Blitzlichtes 14 und die Initiation des Licht-Impulses. Vor dem
eigentlichen Auslösen
des Xenon Blitzlichts, bewirkt das AUSLÖSE Signal, das gemäß der vorhergehend
mit Bezug auf die 14 beschriebenen Verstärkung auch
SPERR Signal genannt wird, eine Verbindung eines jeden in den 9, 10 bzw. 11 dargestellten
Detektor-Schaltkreises 16, 18 bzw. 20 mit dem
in der 12 dargestellten Signal-Aufbereitungs-Schaltkreis 26.
Die Verbindung dieser Detektor Schaltkreise erlaubt den Beginn der
Probenahme der Detektor-Werte vor dem Erhalt der Blitzlicht-Impuls-Resultate,
was es ermöglicht,
einen Impulsboden festzulegen, der wie im folgenden beschrieben, verwendet
wird.
-
Demnach
entsteht in Schritt 214 ein analoges Signal, das das verstärkte, addierte
und weiter verstärkte
Fluoreszenz-Signal entlang der Linie 800 darstellt und
sinngemäß entsteht
ein analoges Referenz Signal entlang der Linie 102. Der
Mikrocontroller 150 gibt diese analogen Signale ein, um
16 verschiedene Proben von jedem Signal zu erhalten. Es wurde festgestellt,
dass mit einem Xenon Blitzlicht wie vorangehend beschrieben, ein
244 Mikrosekunden-Fenster
die besten Resultate bereitstellt.
-
Sobald
dieses 244 Mikrosekunden-Fenster abgelaufen ist, während dem
Probenahmen ausgeführt
werden, folgt Schritt 216 und Mikrocontroller 150 stellt
die Generierung des AUSLÖSE
Signals ein. Dadurch wird in wirksamer Weise jeder der Detektor
Schaltkreise 16, 18 und 20 von dem in
der 1 dargestellten Signal Aufbereitungs-Schaltkreis 26 freigeschaltet.
-
Es
folgt nun Schritt 218, in dem der Mikrocontroller 150 eine
Subtraktions-Operation ausführt, und
die den Impulsboden betreffenden Daten von dem Signal und den Referenzproben
subtrahiert, um normierte Proben-Signalwerte und normierte Referenzwerte
zu erhalten. Jeder dieser normierten Probenwerte wird alsdann gemittelt,
um einen einzigen normierten Signalwert und einen einzigen normierten Referenzwert
zu erhalten.
-
Sobald
diese normierten Werte bestimmt sind, findet Schritt 220 statt
und der zuletzt erhaltene normierte Referenzwert wird mit den vorher
erhaltenen normierten Referenzwerten verglichen. Wenn der Unterschied
zwischen dem zuletzt erhaltenen normierten Referenzwert und den
vorher erhaltenen normierten Referenzwerten größer als die in Schritt 200 vorangehend
beschriebene „Y" Sensitivitätsgrenze
ist, werden sowohl die normierten Referenzwerte als auch die damit
verbundenen normierten Signalwerte im folgenden Additions-Schritt 222 nicht verwendet.
Im folgenden Schritt wird die Gesamtzahl der normierten Referenzwerte
innerhalb der „Y" Sensitivitätsgrenze,
die eine ganze Zahl ist, mit dem „X" Wert der Anfangsbedingung verglichen,
um zu bestimmen, ob die benötigte
Anzahl „X" an normierten Werten
innerhalb der vorbestimmten Sensitivitäts-Grenze vorhanden ist.
-
Falls
in Schritt 222 festgestellt wird, dass nicht genügend Proben
vorhanden sind, kehrt der Mikroprozessor 150 zu Schritt 204 zurück und lädt den Kondensator 104 so,
dass eine weitere Anzahl Messungen erhalten werden kann. Selbstverständlich muss
Schritt 204 mindestens „X" Mal wiederholt werden. Dabei wurde
festgestellt, dass X = 6, was sechs Blitzen des Xenon Blitzlichtes 14 entspricht
und einen sehr wirkungsvollen normierten Endwert bereitstellt.
-
Falls
in Schritt 222 die Zahl des normierten Wertes dem X-Wert
entspricht, werden alle normierten Signal-Werte gemittelt, um in
Schritt 224 einen in der unten folgenden Tabelle 1 dargestellten „WERT" zu erhalten. Während des
Schrittes 226 wird dieser EndWERT dann wie in der 1 dargestellt
in einer beliebigen Form auf der Anzeige 32 angezeigt.
Mathematische Operationen werden benötigt, um den EndWERT entweder
in eine Konzentration oder eine Zellzahlnummer umzurechnen, je nach
gewünschten Ausgabeeigenschaften.
Die für
eine geeignete Ausgabeanzeige benötigten mathematischen Operationen
werden in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:
-
TABELLE
-
FLUORESZENZ
-
-
KONZENTRATION
-
- niedrig = Wert für
0 μg/ml
- hoch = Wert für
50 μg/ml
- b = 0 – m*niedrig
- Probe in ng = m*Wert + b
-
ZELLZÄHLUNG
-
- niedrig = Wert für
0 μg/ml
- hoch = Wert für
50 μg/ml
- b = 0 – m*niedrig
- Probe in ng = m*Wert + b
- denaturierte DNA = Probe in ng*2
-
TABELLE
(Fortsetzung)
ZELLZÄHLUNG
-
Obwohl
die vorliegende Erfindung vorzugsweise auf ein Spektrofluorimeter
wie oben beschrieben ausgerichtet ist, können mit bestimmten Änderungen
viele der vorteilhaften Eigenschaften auch mit einem Photometer
erzielt werden. Mit Bezug auf die 3, könnte ein
Photometer mit Breitspektrum Detektor anstelle des Licht absorbierenden
Mediums 42 eingesetzt werden. Dieser Breitspektrum Detektor würde aus
mehreren Einzeldetektoren bestehen, die alle jeweils eine andere
der betreffenden Frequenzen detektieren könnten. Jedes der detektierten
Signale würde
verstärkt
und in den Mikrocontroller 150 eingegeben, der dann jede
Probe digitalisieren, und nach Normierung und Sensitivitäts-Vergleichen
für jede der
betreffenden Wellenlängen
wie oben beschrieben, den Wert für
jede der betreffenden detektierten Wellenlängen abgeben und anzeigen würde. Wenn als
Photometer konfiguriert, ersetzen die mehreren Einzeldetektoren
die mit Bezug auf das Spektrofluorimeter 10 oben beschriebenen
Detektoren 17 und 19.
-
Während Beispiele
der Erfindung beschrieben worden sind, die in Verbindung mit dem
gegenwärtig
als am zweckmäßigsten
und bevorzugtesten betrachtetes Anwendungsbeispiel stehen, wird
vorausgesetzt, dass die Erfindung nicht auf das offenbarte Anwendungsbeispiel
begrenzt ist, sondern vielmehr beabsichtigt ist, dass sie durch
die angefügten Patentansprüche definiert
wird.
