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Verweis auf verwandte Anmeldung
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Diese
Anmeldung beansprucht Priorität
gegenüber
der US-Patentanmeldung
Nr. 10/763 652 mit dem Titel "System
and Method for Multiple Laser Triggering", eingereicht am 23. Januar 2004.
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Hintergrund
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Durchflußzytometrie und insbesondere
auf ein System und Verfahren zur Verwendung mehrerer Laser in der
Durchflußzytometrie.
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In
einem typischen Durchflußzytometer 10, wie
in 1 gezeigt, ist eine Probenlösung aus Partikeln 12 mit
einer Hüllflüssigkeit 14 kombiniert.
Die Partikel können
fluoreszent markiert werden und können Zellen oder aus Polystyrol
oder einem anderen Material gefertigte Mikrokügelchen sein. Die Hüllflüssigkeit 14 strömt in einer
derartigen Weise, daß die
partikelenthaltende Probenlösung 12 für die Analyse
hydrodynamisch konzentriert wird. Die partikelenthaltende Probenlösung 12 und
die Füllflüssigkeit 14 strömen entlang
einem Strömungsweg 16.
Eine Anregungslichtquelle 18, typischerweise ein Laser, wird
auf die Partikel 12 fokussiert, während sie entlang des Strömungswegs 16 strömen, um
eine Fluoreszenz jeglichen in oder auf den Partikeln vorhandenen
Reporterfarbstoffs zu induzieren. Jegliche Fluoreszenz von den Partikeln
wird über
ein optisches Erfassungssystem 20 eingefangen, das orthogonal
zu dem Weg des Laserstahls positioniert ist, und unter Verwendung
einer Photovervielfacherröhre 22 detektiert.
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Ein
Vorwärtswinkel-Lichtstreudetektor 24 (FALS-Detektor:
forward angle light scatter detector), typischerweise eine Photodiode
oder ein anderer Lichtdetektor ist gerade noch weg von der Laserachse
angeordnet und fängt
von dem Partikel gestreutes Licht ein. Es ist das Signal von dem
FALS-Detektor, welches das Vorhandensein der Partikel anzeigt, und es
ist normalerweise der Auslöser
für die
Datenerfassung. Wenn die Amplitude des FALS-Detektorsignals größer als
ein vorbestimmter Schwellwert ist, was das Vorhandensein eines Partikels
anzeigt, wird die Datenerfassungselektronik ausgelöst und von
den Photovervielfacherröhren
erzeugte Signale werden entweder als Integral- und/oder Spitzenwerte erfaßt.
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Für ein einzelnes
Lasersystem ist die Ausrichtung des Laserstrahls auf den Strömungsweg ebenso
wie die Ausrichtung für
die Erfassung des Streulichts unkompliziert. Typischerweise bedingt
die Ausrichtung das Einstellen der Position des Laserstrahls, um
die FALS-Reaktion zu maximieren, dann das Justieren des optischen
Erfassungssystems, um das Fluoreszenzsignal zu maximieren. Dieses
Verfahren ist in
US-A-4
038 556 dargestellt.
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Um
Multiplexen zu erleichtern, kann ein Partikel einen oder mehrere
Kodierfarbstoffe enthalten, die von einer oder mehreren Anregungslichtquellen angeregt
werden müssen.
Die Verwendung mehrerer Anregungslichtquellen trägt im allgemeinen zu einem erhöhten Komplexitätsniveau
bei, da alle Anregungslichtquellen in Bezug auf das optische Erfassungssystem
ausgerichtet werden müssen.
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Eine
Lösung
ist, die Anregungslichtquellen derart auszurichten, daß sie auf
den gleichen Punkt in der Durchflußkammer fokussieren. Die Anregungslichtquellen
können
kollinear sein oder nicht, aber sollten in dem Detektionsbereich
zusammenfallen. Die wechselseitige Ausrichtung der Anregungslichtquellen
sollte durch Beobachten des Vorwärtsstreusignals
von jeder der Anregungslichtquellen unter Verwendung eines Oszilloskops
durchgeführt werden,
während
Partikel die Durchflußkammer durchlaufen.
Die Positionen der Anregungslichtquellen werden justiert, bis die
Vorwärtsstreuung
von den Anregungslichtquellen zeitlich zusammenfällt. Dies führt dazu, daß die Anregungslichtquellen
das Partikel an der gleichen Stelle in der Durchflußkammer treffen.
Diese Justierung ist oft sehr mühsam
und zeitaufwendig, und jede relative Fehlausrichtung der Anregungslichtquellen
kann eine Signalverringerung für
einen oder mehrere Fluoreszenzkanäle verursachen.
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Es
ist häufig
wünschenswert,
die Anregungslichtquellen zu trennen, so daß jedes Partikel nacheinander
jede Anregungslichtquelle passiert. Die Trennung der Anregungslichtquellen
ergibt eine räumliche
Trennung der Signale von den Partikeln, was das Einfangen der spezifischen
Reaktionen der Partikel, um Anregungslichtquellen zu trennen, erleichtert.
Die Trennung der Anregungslichtquellen trägt jedoch zu einer erhöhten Komplexität bei, da
die Signale zeitlich getrennt sind. Ein Beispiel für ein System,
das separate Laser verwendet, ist in
US-A-4 243 318 offenbart.
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Alternative
Lösungen
für die
zeitliche Trennung, wie etwa die Verwendung von Gate-Verstärkern oder
Verzögerungsleitungen,
erfordern die vorher vorhandene Kenntnis der relativen Trennung
der Anregungslichtquellen und können
die Anregungslichtquelle oder eine Drift der Kerngeschwindigkeit während des
Verlaufs eines Experiments nicht korrigieren. Beispiele für alternative
Lösungen
sind in
US-A-5 528 045 ,
US-A-5 682 038 ,
US-A-5 880 474 und
in den Handbüchern
Beckman Coulter EPIC 750 und Beckman Coulter ELITE gezeigt.
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Es
besteht daher ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren zum Ausrichten
von zwei oder mehr Anregungslichtquellen mit Partikeln in einer Durchflußkammer.
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US-A-5 880 474 offenbart
einen Mehrfachbeleuchtungs-Durchflußpartikelanalysator
zum Messen der Strahlungsintensität fluoreszent markierter Partikel.
Der Mehrfachbeleuchtungs-Durchflußpartikelanalysator umfaßt ein Strömungsteilsystem
mit einem roten Diodenlaser und einem blauen Argonlaser und ein
Detektorteilsystem mit zwei Streuphotodetektoren und vier Fluoreszenzphotodetektoren.
Ein Auslöser
wird ausgelöst,
wenn eine Streudetektorausgabe einen Schwellwert kreuzt. Die fluoreszenten
Partikeldetektorausgaben können
verstärkt,
digitalisiert und verarbeitet werden, um beliebige Fluorochrome
zu identifizieren.
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Zusammenfassung
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Folglich
ist die vorliegende Erfindung auf ein System zum Messen der Strahlungsintensität eines fluoreszent
markierten Partikels gemäß Anspruch
1 ausgerichtet. Dieses System umfaßt eine zytometrische Durchflußkammer
mit einem Strömungsweg
für den
Durchtritt des fluoreszent markierten Partikels. Das System hat
auch eine Vielzahl von Anregungslichtquellen, von denen jede einen
Lichtstrahl emittiert, der auf die zytometrische Durchflußkammer
einfällt.
Eine Vielzahl von Streudetektoren steht in optischer Verbindung
mit dem Strömungsweg
der zytometrischen Durchflußkammer,
wobei jeder derart aufgebaut ist, daß er nur Licht von einer der
Vielzahl von Lichtquellen detektiert und derart angeordnet ist, daß er Streulicht
von dem fluoreszent markierten Partikel detektiert, während es
den Strömungsweg der
zytometrischen Durchflußkammer
durchläuft.
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Jeder
einer Vielzahl von Auslösern
ist mit der Vielzahl von Streudetektoren verbunden. Jeder Auslöser emittiert
ein Signal, wenn auf einen der Streudetektoren einfallendes Streulicht
einen vorgegebenen Schwellwert überschreitet.
Ein optisches Erfassungssystem ist in optischer Verbindung mit dem Strömungsweg
der zytometrischen Durchflußkammer,
um Emissionen von dem fluoreszent markierten Partikel zu sammeln
bzw. zu erfassen.
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Eine
Vielzahl von Fluoreszenzdetektoren empfängt die von dem optischen Erfassungssystem erfaßten Emissionen
und erzeugt Ausgaben. Jeder der Fluoreszenzdetektoren ist derart
aufgebaut, daß er
nur auf ein diskretes Wellenlängenband
anspricht. Elektronische von Integratoren sind mit dem Auslöser verbunden,
um den zumindest einen Fluoreszenzdetektor auszulösen, um
ansprechend auf ein Signal von dem Auslöser die Ausgabe des zumindest einen
Fluoreszenzdetektors aufzuzeichnen.
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Außerdem ist
die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Messen der Fluoreszenz
eines Partikels mit einer Vielzahl von Farbstoffen gemäß Anspruch
13 ausgerichtet. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Abtastens
eines Partikels mit einer ersten Anregungslichtquelle; des Detektierens
der Abtastung des Partikels mit der ersten Anregungslichtquelle
unter Verwendung eines Streudetektors, der derart aufgebaut ist,
daß er
nur Licht von der ersten Anregungslichtquelle detektiert; und des
Detektierens jeglicher von dem Partikel emittierten Fluoreszenz
unter Verwendung eines Fluoreszenzdetektors, wenn detektiert wird,
daß das
Partikel von der ersten Anregungslichtquelle abgetastet wird.
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Außerdem umfaßt das Verfahren
die Schritte des Abtastens eines Partikels mit einer zweiten Anregungslichtquelle;
des Detektierens der Abtastung des Partikels mit der zweiten Anregungslichtquelle unter
Verwendung eines Streudetektors, der derart aufgebaut ist, daß er nur
Licht von der zweiten Anregungslichtquelle detektiert; und des Detektierens
jeglicher von dem Partikel emittierten Fluoreszenz unter Verwendung
eines Fluoreszenzdetektors, wenn detektiert wird, daß das Partikel
von der zweiten Anregungslichtquelle abgetastet wird.
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Außerdem kann
ein System zur Messung der Beleuchtungsintensität eines fuoreszent markierten Partikels
gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Vielzahl von Auslösern
haben, wobei jeder der Vielzahl von Auslösern mit einem separaten Streudetektor
verbunden ist. Das System kann auch eine Vielzahl von Fluoreszenzdetektoren
haben. Eine Vielzahl von Integratoren kann mit der Vielzahl von
Auslösern verbunden
sein, wobei jeder Integrator derart aufgebaut ist, daß er ansprechend
auf ein Signal von einem Auslöser
die Ausgabe von zumindest einem der Vielzahl von Fluoreszenzdetektoren
aufzeichnet. Wahlweise hat das System eine Steuerung bzw. Regelung,
die mit der Vielzahl von Integratoren und der Vielzahl von Auslösern verbunden
ist, wobei die Steuerung bzw. Regelung derart programmiert ist, daß sie die
Vielzahl der Integratoren und die Vielzahl der Auslöser steuert
bzw. regelt, um zu verhindern, daß abnorme Daten erfaßt werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Ein
besseres Verständnis
der vorliegenden Erfindung wird unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen
erhalten, wobei:
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1 eine
schematische Darstellung ist, die ein Durchflußzytometriesystem des Stands
der Technik zeigt;
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2 eine
schematische Darstellung ist, die ein Durchflußzytometriesystem zeigt, das
drei Anregungslichtquellen gemäß einer
Ausbildung der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei ein Partikel
durch einen Strahl von der ersten der drei Anregungslichtquellen
läuft;
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3 ein
Diagramm ist, das die von den Streudetektoren, wie in 2 dargestellt,
empfangenen Signale zeigt;
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4 eine
schematische Darstellung ist, die das Zytometriesystem von 2 zeigt,
wobei das Partikel durch einen Strahl von der zweiten der drei Anregungslichtquellen
läuft;
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5 ein
Diagramm ist, das die von den Streudetektoren, wie in 4 dargestellt,
empfangenen Signale zeigt;
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6 eine
schematische Darstellung ist, die das Zytometriesystem von 2 zeigt,
wobei das Partikel durch einen Strahl von der dritten der drei Anregungslichtquellen
läuft;
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7 ein
Diagramm ist, das die von den Streudetektoren, wie in 6 dargestellt,
empfangenen Signale zeigt;
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8 eine
schematische Darstellung ist, die ein Zytometriesystem gemäß einer
ersten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung zeigt, das drei Anregungslichtquellen
verwendet, wobei die zweite und dritte Anregungslichtquelle ein
wenig unterschiedliche Schnittpunkte entlang des Strömungswegs
haben;
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9 ein
Diagramm ist, das die von den Streudetektoren, wie in 8 dargestellt,
empfangenen Signale zeigt;
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10 eine
schematische Darstellung ist, welche die Anordnung von Streudetektoren
gemäß einer
zweiten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung zeigt;
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11 eine
Seitenansicht der Streudetektoren von 10 ist; 12 eine
schematische Darstellung ist, die die Anordnung von Streudetektoren gemäß einer
dritten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung zeigt;
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13 eine
schematische Darstellung eines Durchflußzytometriesystems gemäß einer
vierten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist, das mehrere Anregungslichtquellen
verwendet; und
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14 eine
schematische Darstellung eines Durchflußzytometriesystems gemäß einer
fünften
zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist, das mehrere Anregungslichtdetektoren
verwendet; die als seitliche Streudetektoren positioniert sind.
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Detaillierte Beschreibung
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Typischerweise
wird die vorliegende Erfindung in Verbindung mit Durchflußzytometrieanwendungen
verwendet. In der Durchflußzytometrie
werden eine oder mehrere Anregungslichtquellen verwendet, um Partikel
abzutasten, während
sie eines nach dem anderen einen Detektionsbereich einer Durchflußkammer
durchlaufen. Die Probenpartikel können Mikrokügelchen sein, die fluoreszente
Reporterfarbstoffe, die von einer Anregungslichtquelle angeregt
werden, enthalten und/oder damit beschichtet sind. Typischerweise
ist das Mikrokügelchen
ein Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 0,5 bis 10 μm.
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Die
Anregungslichtquelle kann, wie Fachleuten der Technik bekannt ist,
ein Diodenlaser ein Festkörperlaser,
ein Gaslaser, ein Farbstofflaser, eine Bogenlampe oder eine andere
Beleuchtungsquelle sein. Zum Beispiel kann ein 532 nm-Laser verwendet werden,
um Fluoreszenz von Farbstoffen, wie etwa Phycoerythrin-(PE), CY3-
und DBCY3-Farbstoffen bei etwa 550 bis 620 nm zu induzieren, während ein 635
nm-Laser verwendet werden kann, um Fluoreszenz von Farbstoffen,
wie etwa Squarine- und Cyaninfarbstoffen, bei etwa 650 nm bis 750
nm zu induzieren. Ein dritter Laser, der bei 488 nm emittiert, kann aufgenommen
werden, und die hier offenbarte Erfindung kann leicht auf mehr als
drei Laser erweitert werden. Zusätzliche
Farbstoffe, die verwendet werden können, umfassen Fluorescein,
Alexa 532 und Alexa 633. Weitere Wellenlängen von Anregungslichtquellen,
die verwendet werden können,
umfassen 650 nm und 750 nm.
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Induzierte
Fluoreszenz wird von Fluoreszenzdetektoren detektiert. Typischerweise
sind Fluoreszenzdetektoren, wie in der Technik bekannt, Photovervielfacherröhren oder
andere Detektoren. Die Fluoreszenzdetektoren sind typischerweise
mit einem Integrator verbunden, der von den Fluoreszenzdetektoren
erzeugte Signale innerhalb eines Zeitfensters erfaßt. Ein
Integrator kann nicht nur verwendet werden, um das gesamte von einem
Fluoreszenzdetektor empfangene Signal zu integrieren, sondern kann
auch verwendet werden, um die von dem Fluoreszenzdetektor empfangene
Spitzen- oder maximale
Intensität
aufzuzeichnen.
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In
der vorliegenden Erfindung wird die Notwendigkeit zur Ausrichtung,
und die Ausrichtung von zwei oder mehr Anregungslichtquellen aufrechtzuerhalten,
minimiert, indem Streulicht mit zwei oder mehr Streudetektoren eingefangen
wird. Typischerweise hat jeder Streudetektor eine Photodiode oder einen
anderen bekannten Detektor. Ein Bandpaßfilter ist vor jeder Photodiode
angeordnet, um nur für
Licht von einer Anregungslichtquelle zuzulassen, daß es diese
Photodiode erreicht. Wenn daher ein Streudetektor Streulicht detektiert,
ist bekannt, daß das
untersuchte Partikel in dem Weg eines Strahls von einer bestimmten
Anregungslichtquelle ist. Das Streudetektorsignal kann die Datenerfassung
von den Fluoreszenzdetektoren auslösen, die zu einer bestimmten
Anregungslichtquelle gehören.
Alternativ kann das Streudetektorsignal die Datenerfassung von allen
Fluoreszenzdetektoren auslösen.
Typischerweise findet die Datenverarbeitung statt, nachdem die Signale
die Verzögerungsleitungen
durchlaufen haben. Die Verwendung von Verzögerungsleitungen ist in
US-A-5 367 474 diskutiert,
dessen gesamte Inhalte hier hiermit per Referenz eingebunden sind.
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2 bis 9 zeigen
ein Durchflußzytometer 30 gemäß einer
Ausbildung der vorliegenden Erfindung. Drei Anregungslichtquellen 32, 34, 36 sind derart
fokussiert, daß jede
ein Partikel 38 an einem anderen Punkt entlang eines Strömungswegs 40 abtastet.
Drei Photodioden 42, 44, 46, die als
Streusensoren wirken, sind nacheinander angeordnet. Jede Photodiode
ist optisch mit einem separaten Bandpaßfilter 48, 50, 52 verbunden,
das nur Licht von einer der Anregungslichtquellen ermöglicht,
zu der Photodiode hindurchzugehen. Außerdem hat jede der Photodioden 42, 44, 46 eine
separate Sammellinse 54, 56, 58, die
vor ihr angeordnet ist, um Streulicht für die Detektion durch die Photodiode
zu sammeln. Wahlweise blocken (nicht gezeigte) Beam Dumps bzw. Strahlfallen
alle ungestreuten Anregungslichtquellenstrahlen und verhindern,
daß sie
in die Sammellinse eintreten. Die Photodioden sind elektrisch mit
einem Auslöser 60 verbunden.
Der Auslöser 60 ist
elektrisch mit einem Integrator 62 verbunden. Der Integrator 62 ist
elektrisch mit einer Vielzahl von (nicht gezeigten) Fluoreszenzdetektoren
verbunden. Der/Die Fluoreszenzdetektor(en) sind außerhalb
des direkten Wegs der Anregungslichtquellenstrahlen angeordnet.
Fachleute der Technik werden verstehen, daß jede Photodiode mit einem
separaten Auslöser verbunden
sein kann, jeder separate Auslöser
mit einem separaten Integrator verbunden sein kann und jeder separate
Integrator mit einem separaten Fluoreszenzdetektor verbunden sein
kann.
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In 2 und 3 läuft das
durch den Strömungsweg 40 strömende Partikel 38 durch
einen Lichtstrahl 64 von der ersten Anregungslichtquelle 32.
Die erste Photodiode 42, die mit dem ersten Bandpaßfilter 48 aufgebaut
ist, um nur Licht bei der Wellenlänge der ersten Anregungslichtquelle 32 zu detektieren,
detektiert Streulicht. Wenn die Menge an detektiertem Streulicht
größer als
ein vorgewählter Schwellwert
ist, veranlaßt
der Auslöser 60 die
Integratoren 62, die Signale von den Fluoreszenzdetektoren,
die zu den von der ersten Anregungslichtquelle 32 angeregten
Farbstoffe gehören,
zu integrieren. Die zweiten und dritten Photodioden 44, 46,
die derart aufgebaut sind, daß sie
Streulicht von den zweiten und dritten Anregungslichtquellen 34, 36 detektieren, detektieren
kein Licht.
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In 4 und 5 geht
das Partikel 38 durch einen Lichtstrahl 66 von
der zweiten Anregungslichtquelle 34. Die zweite Photodiode 44,
die mit dem zweiten Bandpaßfilter 50 aufgebaut
ist, um nur Licht bei der Wellenlänge der zweiten Anregungslichtquelle 34 zu
detektieren, detektiert Streulicht. Wenn die Menge an detektiertem
Streulicht höher
als ein vorgewählter
Schwellwert ist, dann veranlaßt
der Auslöser 60 die
Integratoren 62, die Signale von den Fluoreszenzdetektoren,
die zu den von der zweiten Anregungslichtquelle 34 angeregten
Farbstoffen gehören,
zu integrieren. Die ersten und dritten Photodioden 42, 46,
die derart aufgebaut sind, daß sie
Streulicht von den ersten und dritten Anregungslichtquellen 32, 36 detektieren,
detektieren kein Licht.
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In 6 und 7 geht
das Partikel 38 durch einen Lichtstrahl 68 von
der dritten Anregungslichtquelle 36. Die dritte Photodiode 46,
die mit dem dritten Bandpaßfilter 52 aufgebaut
ist, um nur Licht bei der Wellenlänge der dritten Anregungslichtquelle 36 zu
detektieren, detektiert Streulicht. Wenn die Menge an detektiertem
Streulicht höher
als ein vorgewählter
Schwellwert ist, dann veranlaßt
der Auslöser 60 die
Integratoren 62, die Signale von den Fluoreszenzdetektoren,
die zu den von der dritten Anregungslichtquelle 36 angeregten
Farbstoffen gehören, zu
integrieren. Die ersten und zweiten Photodioden 42, 44,
die derart aufgebaut sind, daß sie
Streulicht von den ersten und zweiten Anregungslichtquellen 32, 34 detektieren,
detektieren kein Licht.
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Die
Anregungslichtquellen brauchen nicht auf verschiedene Abschnitte
des Strömungswegs
fokussiert werden. Da die Bandpaßfilter jeder Photodiode nur
erlauben, Licht von einer Anregungslichtquelle zu detektieren, ist
das richtige Auslösen
des Integrators möglich.
Wenn eine Überlappung
auftritt, wird von zwei oder mehr Photodioden Streulicht detektiert,
was die Integration an den passenden Fluoreszenzdetektoren auslöst.
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In
einer ersten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung, wie in 8 und 9 gezeigt,
durchläuft
das Partikel 38 sich schneidende Lichtstrahlen 66, 68 von
den zweiten und dritten Anregungslichtquellen 34, 36.
Die zweite Photodiode 44, die derart aufgebaut ist, daß sie nur
Licht bei der Wellenlänge
der zweiten Anregungslichtquelle 34 detektiert, detektiert
Streulicht und löst
die Integration durch die Fluoreszenzdetektoren aus, die zu fluoreszenten
Farbstoffen gehören,
welche von der zweiten Anregungslichtquelle 34 ausgelöst werden.
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Gleichzeitig
detektiert die dritte Photodiode 46, die derart aufgebaut
ist, daß sie
nur Licht bei der Wellenlänge
der dritten Anregungslichtquelle 36 detektiert, Streulicht
und löst
die Integration durch die Fluoreszenzdetektoren aus, die zu fluoreszenten Farbstoffen
gehören,
die von der dritten Anregungslichtquelle 36 ausgelöst werden.
Die erste Photodiode 42, die derart aufgebaut ist, daß sie Streulicht
von der ersten Anregungslichtquelle 32 detektiert, detektiert
kein Licht und löst
keine Integration durch ihren zugehörigen Fluoreszenzdetektor aus.
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Vorzugsweise
haben die Laserstrahlen an den Schnittpunkten mit dem Strömungsweg
eine elliptische Form. Die Längenverhältnisse
der breiten zu den schmalen Achsen des elliptischen Strahls sind etwa
zehn zu eins, wobei die schmale Achse der Ellipse quer zur Strömungsachse
ausgerichtet ist. Die schmale Achse hat etwa acht Mikrometer, und
die breite Achse hat etwa 80 Mikrometer. Vorzugsweise sind die Strahlen
entlang des Strömungswegs
ohne Überlapp
so dicht wie möglich
zueinander beabstandet. Der Abstand zwischen den Strahlen beträgt bevorzugt
etwa 30 bis 50 Mikrometer.
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10 und 11 zeigen
eine Anordnung von Streudetektoren gemäß einer zweiten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung. Eine einzelne Sammellinse 69 mit
großer Öffnungsfläche, die
als eine Fourierlinse arbeitet, sammelt das von allen drei Anregungslichtquellen
gestreute Licht. Die Laserstrahlen werden durch einen einzigen (nicht
gezeigten) Beam Dump geblockt, der vor der Linse angeordnet ist.
Drei Photodioden 70, 72, 74 sind in etwa gleichen
Abständen
von einer optischen Achse der Linse angeordnet. Die Photodioden 70, 72, 74 befinden
sich in einer Ebene, die in einer Brennweite von der Linse angeordnet
ist und senkrecht zu der optischen Achse der Linse ist. In der Ebene
der Photodioden wird die optische Fouriertransformation des von den
Partikeln gestreuten Lichts erzeugt. Diese Transformation wandelt
die Intensität
des Streulichts gegen den Streuwinkel in die Lichtintensität gegen
den Abstand von der optischen Achse der Linse um. Diese Transformation
ist unabhängig
von dem Standort der Quelle. Jede Photodiode fängt Licht über einen großen Winkelbereich
von etwa +/–1° bis etwa
+/–19° ein, was
zu einem elektronischen Signal führt,
das mit der Partikelgröße monoton
zunimmt.
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Wahlweise
hat eine der Photodioden 70 etwa zweimal die Fläche der
beiden anderen Photodioden 72, 74. Die Flächendifferenz
trägt dazu
bei, die sich mit der Anregungswellenlänge ändernde Empfindlichkeit der
Photodioden zu kompensieren. Die Photodioden sind weniger empfindlich
für Anregungslicht in
blauen Wellenlängen,
und ihre Empfindlichkeit nimmt zu, wenn das Anregungslicht sich
in rote und infrarote Wellenlängen
verschiebt. Außerdem
kann die Verstärkung
der Vorverstärker
für die
zwei kleineren Photodioden derart justiert werden, daß sie Empfindlichkeitsunterschiede
weiter kompensiert. Das Ziel der Justierung ist, für eine gegebene
Partikelgröße etwa
das gleiche Amplitudensignal von jeder Diode zu erhalten.
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Vor
jeder Photodiode ist ein Lichtfilter 76, 78, 80,
das nur eine der drei Anregungslichtwellenlängen die Photodiode erreichen
läßt. Die
Ausgabe von jedem Photodiodendetektor 70, 72, 74 kann
in eine separate Signalverarbeitungsbaugruppe, die als ein (nicht
gezeigter) Auslöser
wirkt, eingespeist werden, so daß jedes Signal als ein unabhängiger Auslöser wirken
kann. Außerdem
können
die Ausgangssignale von allen drei Photodetektoren 70, 72, 74 zusammenaddiert
werden und das sich ergebende zusammengesetzte Signal für die Anzeige
in einen einzelnen Oszilloskopkanal zugeführt werden.
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Jede
Signalverarbeitungsbaugruppe prüft die
Ausgabe von der Photodiode, um zu bestimmen, ob die Ausgabe einen
vorbestimmten Auslösepegel erreicht
hat. Wenn die Ausgabe von der Photodiode höher als der vorgegebenen Auslösepegel
ist, dann weist die Signalverarbeitungsbaugruppe einen (nicht gezeigten)
Integrator an, das von den passenden Fluoreszenzdetektoren empfangene
Signal zu integrieren.
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Wenn
er einem ausgelöst
ist, kann der Integrator jedes detektierte Signal eine vorgewählte minimale
Zeitspanne lang integrieren. Die Signalverarbeitungsbaugruppe prüft weiterhin
die Ausgabe von der auslösenden
Photodiode, bis die Ausgabe unter den vorgegebenen Auslösepegel
fällt.
Wenn die Ausgabe von der auslösenden
Photodiode einmal unter den vorgegebenen Auslösepegel fällt, weist die Signalverarbeitungsbaugruppe
den Integrator an, das Integrieren einzustellen.
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In
einer dritten zusätzlichen
Ausbildung der vorliegenden Erfindung, wie in 12 gezeigt,
wird ein Lichtwellenleiterbündel 82 verwendet,
um die Streudetektoren zu bilden. Drei Laser 84, 86, 88 werden
als Anregungslichtquellen verwendet. Das Lichtwellenleiterbündel 82 enthält drei
verschiedene Sätze
von Wellenleitern 90, 92, 94. Jeder der
drei Sätze von
Wellenleitern 90, 92, 94 gehört zu einem
der drei Laser 84, 86, 88. Jeder der
drei Sätze
von Wellenleitern 90, 92, 94 ist auf
eine separate Photodiode 96, 98, 100 gerichtet.
Jede der drei Photodioden 96, 98, 100 ist
für das
Detektieren von Licht von einem der drei Laser verantwortlich. Die
Photodioden können mit
oder ohne eine Fourierlinse verwendet werden.
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Jede
Photodiode 96, 98, 100 hat ein Bandpaßfilter 102, 104, 106 vor
sich, um nur für
eine Wellenlänge
von Licht zuzulassen, daß sie
zu der Photodiode 96, 98, 100 durchgelassen
wird. Wie in 12 gezeigt, kann das Lichtwellenleiterbündel 82 derart angeordnet
sein, daß jeder
dritte Wellenleiter ein Element des gleichen Satzes ist und die
gleiche Photodiode anspricht. Da die relative Position der Anregungslichtquelle
bekannt ist, können
kleine Drifts bzw. Abweichungen der Anregungslichtquellenposition
zwischen Experimenten hingenommen werden.
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Die
vorliegende Erfindung läßt auch
eine verringerte Anzahl von Fluoreszenzdetektoren zu. Typischerweise
wird für
jeden unterschiedlichen Farbstoff, der detektiert werden soll, ein
separater Fluoreszenzdetektor verwendet. Jeder Fluoreszenzdetektor
hat ein Filter vor sich, um nur Licht mit einer Wellenlänge eines
spezifischen Farbstoffs durchzulassen.
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Typischerweise
werden in einem System mit zwei verschiedenen Anregungslichtquellen,
wobei jede Anregungslichtquelle zwei verschiedene Farbstoffe auf
einem Partikel anregt, vier verschiedene Fluoreszenzdetektoren benötigt. Wenn
ein Partikel vor der ersten Anregungslichtquelle vorbeiläuft, beginnen
zwei zu den von der ersten Anregungslichtquelle angeregten Farbstoffen
gehörende
Fluoreszenzdetektoren zu integrieren. Ebenso beginnen die zwei Fluoreszenzdetektoren,
die zu den von der zweiten Anregungslichtquelle angeregten Farbstoffen
gehören,
zu integrieren, wenn das Partikel vor der zweiten Anregungslichtquelle
vorbeiläuft.
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Die
vorliegende Erfindung verwendet Streudetektoren, die für jede Anregungslichtquelle
spezifisch sind, um zu erkennen, welche Anregungslichtquelle zu
einer gegebenen Zeit ein Partikel abtastet. Außerdem verwendet die vorliegende
Erfindung in Verbindung mit jedem Fluoreszenzdetektor Mehrfachbandpaßfilter,
um die Anzahl der notwendigen Fluoreszenzdetektoren zu verringern.
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Eine
vierte zusätzliche
Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist in 13 gezeigt.
Wie in 13 gezeigt, hat ein beispielhaftes
System, das Mehrfachbandpaßfilter
in Verbindung mit Fluoreszenzdetektoren verwendet, zwei Anregungslichtquellen 106,
die auf ein Partikel 108 in einem Strömungsweg 110 fokussiert
sind. In dieser beispielhaften Ausbildung sind die zwei Anregungslichtquellen
Laser. Ein Laser hat eine Wellenlänge von 532 nm, und der andere
Laser hat eine Wellenlänge
von 635 nm. Zwei Photodioden 112, die jeweils mit einem
separaten Bandpaßfilter 114,
das zu einer der zwei Laserwellenlängen gehört, verbunden sind, sind derart
positioniert, daß sie
gestreutes Anregungslicht empfangen. Jede Photodiode ist elektrisch
mit einem Auslöser 116 verbunden,
der mit einem Integrator 118 elektrisch verbunden ist.
Wahlweise ist die Steuerung bzw. Regelung 119 mit den Auslösern 116 und
den Integratoren 118 verbunden. Beachten Sie, daß der Strömungsweg 110 in 13 senkrecht
zu der Seite ausgerichtet ist. Daher ist jeweils nur eine der zwei Anregungslichtquellen 106,
der Photodioden 112, der Bandpaßfilter 114, der Auslöser 116 und
der Integratoren 118 sichtbar.
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Von
den mit dem Partikel verbundenen Farbstoffen emittierte Fluoreszenz
wird von dem optischen Fluoreszenzerfassungssystem 120 erfaßt. Eine
erste Photovervielfacherröhre 122 und
eine zweite Photovervielfacherröhre 124 werden
als Fluoreszenzdetektoren verwendet. Die erste und zweite Photovervielfacherröhre 122 und 124 sind
mit den Integratoren 118 elektrisch verbunden und in 90
Grad zueinander um einen 50/50-Spiegel 126 positioniert. Der
50/50-Spiegel 126 ist derart konstruiert, daß er 50%
des auf ihn einfallenden Lichts reflektiert und 50% des auf ihn
einfallenden Lichts durchläßt.
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Die
erste Photovervielfacherröhre 122 ist
mit einem ersten Doppelbandpaßfilter 128 verbunden. Die
zweite Photovervielfacherröhre 124 ist
mit einem zweiten Doppelbandpaßfilter 130 verbunden
Jedes Doppelbandpaßfilter 128, 130 ist
derart konstruiert, daß es
Licht von einem Farbstoff durchläßt, der
von jedem der zwei Laser angeregt wird.
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In
dieser beispielhaften Ausbildung hat jedes Partikel drei Farbstoffe:
Phycoerythrin (PE), das ansprechend auf die Anregung durch 532 nm-Licht
bei 575 nm und 605 nm emittiert, BCD646, ein Squaraine-Farbstoff,
der ansprechend auf die Anregung durch 635 nm-Licht bei 660 nm emittiert,
und BCD676, ein Cyanin-Farbstoff, der ansprechend auf die Anregung
durch 635 nm-Licht bei 780 nm emittiert. Wie für Fachleute der Technik selbstverständlich,
können
andere Farbstoffe die vorstehend aufgelisteten ersetzen.
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Das
erste Doppelbandpaßfilter 128 läßt 575 nm-Licht,
das aus der 532 nm-Anregung entsteht, und 660 nm-Licht, das aus
der 635 nm-Anregung entsteht, durch. Das zweite Doppelbandpaßfilter 130 läßt 605 nm-Licht,
das aus der 532 nm-Anregung entsteht, und 780 nm-Licht, das aus
der 635 nm-Anregung entsteht, durch. Andere Anregungslichtquellen/Emissionskombinationen
sind, wie für
Fachleute der Technik klar zu erkennen, möglich.
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Die
Laser werden räumlich
gegeneinander versetzt, indem die Laser manuell oder automatisch neu
positioniert werden und die zwei Abtastphotodioden für die Vorwärtsstreuung überwacht
werden. Die Laser sind räumlich
versetzt, wenn die Signale von den zwei Photodioden 112 zeitlich
nicht zusammenfallen.
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Da
die Photodioden anzeigen, welcher Laser das Partikel gegenwärtig beleuchtet,
kann die Antwort von jeder Photovervielfacherröhre einem bestimmten Farbstoff
zugeordnet werden. Zu Veranschaulichungszwecken spricht das Partikel
zuerst den 532 nm-Laser und dann den 635 nm-Laser an. Wie jedoch
Fachleute der Technik zu schätzen
wissen, braucht die Reihenfolge vor der Verwendung nicht bekannt
zu sein.
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Wenn
die Photodiode mit dem 532 nm-Bandpaßfilter eine Antwort detektiert,
ist das Partikel 108 vor dem 532 nm-Laser. Der angesprochene
Farbstoff ist PE, das bei 575 nm und 605 nm emittiert. Fluoreszenz
von diesen zwei Kanälen
wird die Emission dominieren. Die Ausgabe sowohl der ersten als
auch der zweiten Photovervielfacherröhre wird integriert und PE
zugeordnet.
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Während das
Partikel 108 weiterhin den Strömungsweg 110 hinunter
strömt,
erreicht das Partikel den 635 nm-Laser, und die Photodiode mit dem 635
nm-Bandpaßfilter
löst die
Integration des Signals von den Photovervielfacherröhren aus.
Die zwei Farbstoffe, die nun angesprochen werden, sind BCD646 und
BCD676. Die Ausgabe von der ersten Photovervielfacherröhre wird
BCD646 zugeordnet, und die Ausgabe von der zweiten Photovervielfacherröhre wird
BCD676 zugeordnet. In der Tat ermöglichen die Streuabtastungsphotodioden
in Kombination mit den Fluoreszenzdetektoren, daß die integrierten Informationen
von jeder Photovervielfacherröhre
basierend darauf, welcher Laser das Partikel abtastet, dynamisch
zugeordnet werden.
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Wenn
ein Partikel den Weg eines Anregungslichts kreuzt, tritt in vielen
Richtungen Streuung von dem Partikel auf. Obwohl das Streulicht
im Vorwärtswinkel
vorherrscht, tritt eine erhebliche Menge an Streuung senkrecht zu
der Richtung des Anregungslichts auf.
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In
einer fünften
zusätzlichen
Ausbildung, wie in 14 gezeigt, sind Streudetektoren
derart angeordnet, daß sie
seitliches Streulicht erfassen. In dieser Ausbildung gibt es zwei
Anregungsquellen, wie etwa Laser. Anregungslicht 106 wird
auf ein Partikel 108 in einem Strömungsweg 110 fokussiert.
Seitliche Streuung und Fluoreszenz, die von den zu dem Partikel
gehörenden
Farbstoffen emittiert werden, werden von dem optischen Fluoreszenzerfassungssystem 120 erfaßt. Beachten
Sie, daß der
Strömungsweg
in 14 senkrecht zu der Seite ausgerichtet ist. Daher
ist nur eine der zwei Anregungslichtquellen 106 sichtbar.
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Ein
erstes Stück
Glas 132, das in etwa 45 Grad relativ zu dem Weg des Lichts
angeordnet ist, welches das optische Erfassungssystem verläßt, reflektiert
eine kleine Lichtmenge, wie etwa 4%. Das reflektierte Licht durchläuft ein
erste optisches Filter 136, das derart konstruiert ist,
daß es
nur das Licht von einem der zwei Laser durchläßt. Das reflektierte Licht,
welches das erste optische Filter 136 durchlaufen hat,
wird dann von einem ersten Photodetektor 140, wie etwa
einer Photovervielfacherröhre
oder einer Photodiode detektiert.
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Das
Licht, das durch das erste Stück
Glas 132 durchgelassen wird, trifft auf ein zweites Stück Glas 134,
das in etwa 45 Grad relativ zu dem Weg des Lichts angeordnet ist,
welches das optische Erfassungssystem verläßt. Das zweite Stück Glas 134 reflektiert
eine kleine Lichtmenge, wie etwa 4%. Das von dem zweiten Glasstück 134 reflektierte
Licht geht durch ein zweites optisches Filter 138, das
derart konstruiert ist, daß es
Licht von dem anderen Laser durchläßt. Das reflektierte Licht,
welches das zweite optische Filter 138 durchlaufen hat,
wird dann von einem zweiten Photodetektor, 142, wie etwa
einer Photovervielfacherröhre
oder einer Photodiode, detektiert.
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Die
Ausgaben von den ersten und zweiten Phototdetektoren 140, 142 werden
an Signalverarbeitungsbaugruppen gesendet, die als Auslöser für (nicht
gezeigte) Integratoren dienen, welche mit zu jedem Laser gehörenden Fluoreszenzdetektoren 144 verbunden
sind. Wahlweise ist eine (nicht gezeigte) Steuerung bzw. Regelung
mit den Signalverarbeitungsbaugruppen und den Integratoren verbunden.
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Das
vorliegende erfinderische Konzept kann auf eine größere Anzahl überwachter
Farbstoffe erweitert werden. Wenn X die maximale Anzahl von Farbstoffen
ist, die von einem beliebigen Laser in dem System angeregt wird,
dann sind X Detektoren erforderlich, wobei die Filter vor jedem
Detektor ein Maximum von Y Bandpaßbereichen enthalten, wobei Y
die Anzahl von Lasern ist. Wenn es als ein Beispiel insgesamt 15
Farbstoffe und drei Laser gibt, wobei von jedem Laser fünf Farbstoffe
angeregt werden, dann können
fünf Detektoren
verwendet werden, wobei jeder Detektor mit einem Mehrfachbandpaßfilter mit
drei Bandpässen
verbunden ist.
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Obwohl
diese Erfindung den Bereich vergrößert, über den Laser ausgerichtet
werden können, um
gute Fluoreszenzinformationen zu erhalten, ist der Bereich begrenzt.
Die Begrenzung liegt in erster Linie an dem Betrachtungsbereich
des optischen Fluoreszenzerfassungssystems. Typischerweise erfaßt das Fluoreszenzerfassungssystem
die fluoreszente Emission von einem Partikel, fokussiert die fluoreszente
Emission durch eine Lochblende mit einer Breite von einigen hundert
Mikrometern und richtet die fluoreszente Emission dann parallel
auf den Fluoreszenzdetektor. Die Lochblende ist vorhanden, um Streulicht
räumlich
auszufiltern. Wenn die Anregungslichtquellen bewegt werden, so daß das Fluoreszenzlicht
jenseits des Bereichs ist, den das optische System erfassen und
durch die Lochblende weiterleiten kann, dann fällt der Erfassungswirkungsgrad ab,
was die Fluoreszenzintensität
verringert. Diese Begrenzung kann etwas verringert werden, indem die
Lochblende durch einen vertikalen Schlitz ersetzt wird. Der Bereich,
den das optische System erfassen und weiterleiten kann, wird dann
entlang des Partikelstroms erweitert.
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Wenn
gewisse Bedingungen nicht gesteuert bzw. geregelt werden, wenn unabhängige Auslöser von
räumlich
getrennten Anregungslichtquellen verwendet werden, können abnorme
Daten erfaßt
werden. Es gibt mehrere Quellen für diese Abweichungen, die von
einer Steuerung bzw. Regelung, die Signale von den Auslösern verarbeitet,
gesteuert bzw. geregelt werden können,
um genaue Daten sicherzustellen.
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Eine
erste Quelle für
abnorme Daten ergibt sich, wenn ein Auslösesignal von einer der Anregungslichtquellen,
aber von keiner der Anzahl der anderen Anregungslichtquellen, erzeugt
wird. Dies kann passieren, wenn das Signal, das von einem Auslöser durch
seinen zugehörigen
Streudetektor empfangen wird, eine ausreichende Amplitude hat, um
den vorgegebenen Schwellwert zu durchqueren, aber die Signale von
allen Streudetektoren nicht ausreichen, um ihre jeweiligen vorgegebenen
Schwellwerte zu durchqueren. Ein erstes Verfahren zur Vermeidung
der ersten Quelle für
abnorme Daten ist, die Auslöseschwellwerte
in Bezug auf die Streudetektorsignalamplitude so niedrig wie möglich zu
halten. Dieser Ansatz ist jedoch beschränkt, weil die vorgegebenen
Schwellwerte auch über
dem Hintergrundrauschpegel gehalten werden sollten, um unberechtigte
Auslösesignale
von Trümmern,
optischem Rauschen und elektronischem Rauschen zu verhindern.
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Ein
zweites Verfahren zur Vermeidung der ersten Quelle für abnorme
Daten ist, ein Streudetektorsignal mit ausreichender Amplitude zu
fordern, um den ersten Auslöseschwellwert
zu durchqueren, um ein "Ereignis" auszulösen und
dann nachfolgende Auslöser
unter Verwendung des „Ereignis"-Signals zu ermöglichen.
Bei diesem Verfahren sollte es auch eine Zeitschaltereinrichtung
geben, welche die Dauer des „Ereignisses" begrenzt, wenn ein
oder mehrere der nachfolgenden Auslöseschwellwerte nicht durchquert
werden. In einer einfachen Implementierung wird eine einzige Zeitschaltereinrichtung
durch den Beginn eines „Ereignisses" angestoßen und
erreicht ein wenig nach dem erwarteten Ende des „Ereignisses" eine abschließende Auszählung, wenn
keiner der erforderlichen Auslöser
aufgetreten ist.
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In
einer komplexeren Implementierung sollte die Zeitschaltereinrichtung
eine Zeitspanne festlegen, die ein wenig länger als die erwartete Zeit
zwischen zwei aufeinanderfolgenden Auslösern ist, und sollte einen
Auslöser
erzwingen, wenn keiner aufgetreten ist. In einem System mit mehreren
unabhängigen
Auslösern
sollte dieser Zeitschalter zurückgesetzt
werden und zwischen jedem Paar möglicher
unabhängiger
Auslöser
nachgeladen werden. Diese Implementierung ermöglicht die Identifizierung,
welcher Auslöser
gefehlt hat. In jeder Implementierung hält das Erzwingen der Auslöserfunktion
die Integrität
der Einfang- und der Erfassungstakte aufrecht. Jeder Datenrahmen,
der einen erzwungenen Auslöser
enthält,
sollte markiert werden, was anzeigt, daß dieser Rahmen verdächtige Daten
enthalten kann und nicht in den abschließenden Datensatz aufgenommen werden
sollte.
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Eine
zweite Quelle möglicher
abnormer Daten ist das Vorhandensein eines zweiten Partikels, das
in der Nähe
des Partikels wandert, von dem Daten erfaßt werden. Dieses Problem nimmt
an Schärfe zu,
wenn die Häufigkeit
der Probenpartikel zunimmt. Wegen der Taktzeit des Einfangverfahrens
gibt es einen endlichen Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden
Ereignissen, innerhalb dem nicht beide Ereignisse eingefangen werden
können,
die ist die „Belegt"-Zeit. Diese „Belegt"-Zeit führt dazu,
daß alle „Ereignisse" in zwei Klassen
unterteilt werden: „Ereignisse", die eingefangen
werden, und „Ereignisse", die verpaßt werden. Über ein „verpaßtes Ereignis" werden nicht nur
keine Daten aufgezeichnet, sondern es kann auch die Daten von einem „eingefangenen
Ereignis" verunreinigen,
wenn ein Abschnitt des Signals von einem „verpaßten Ereignis" in das Einfangfenster
für ein „eingefangenes
Ereignis" fällt.
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Das
Verunreinigen „verpaßter Ereignisse" fällt in zwei
Klassen; die, die einem „eingefangenen Ereignis" vorausgehen, und
die, die einem „eingefangenen
Ereignis" folgen.
Die vorausgehenden „verpaßten Ereignisse" sind Ereignisse,
die während
der „Belegt"-Zeit eines früher stattfindenden „eingefangenen
Ereignisses" stattfinden.
Wenn das Einfangsystem, einschließlich des/der Auslöser und
Integrators/en das Einfangen eines Ereignisses beendet hat und bereit
ist, nachgeladen zu werden, dann sollte eine Bestimmung durchgeführt werden,
daß sich nicht
schon ein anderes Ereignis bereits im Verlauf befindet. Wenn das
Einfangsystem während
eines Ereignisses nachgeladen wird, dann kann die Position des Probenpartikels
nicht genau bestimmt werden, und Daten, die dieses Partikel betreffen,
können nicht
genau eingefangen werden. Daher sollte das Nachladeverfahren das/die
Auslösersignal/e
prüfen, um
zu verifizieren, daß sich
kein Ereignis im Verlauf befindet.
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Wenn
das Einfangsystem sofort, nachdem ein „verpaßtes Ereignis" endet, nachgeladen
wird und dann von einem dicht folgenden nächsten Ereignis ausgelöst wird,
können
in dem Einfangfenster beide Ereignisse vorhanden sein. Ein Verfahren
zur Vermeidung dieses Problems ist, das Nachladen des Einfangverfahrens
um eine Zeitspanne zu verschieben, die sich über das Ende des führenden
Ereignisses um eine vorgewählte
Verzögerungszeitspanne erstreckt.
Die vorgewählte
Verzögerungszeitspanne kann
zum Beispiel gleich oder etwa die Hälfte der Einfangfensterbreite
sein. Jedes Ereignis setzt die Verzögerungszeitspanne zurück und startet
sie neu.
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Um
die Verunreinigung durch ein folgendes „verpaßtes Ereignis" zu detektieren und
zu kompensieren, untersucht das Einfangsystem den Auslöserprozessor
für zusätzliche
Ereignisse während
der „Belegt"-Zeitspanne. Wenn
zusätzliche
Ereignisse stattfinden, dann wird das „eingefangene Ereignis" als ein möglicherweise
verunreinigtes markiert und sollte nicht in den abschließenden Datensatz
aufgenommen werden.
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Eine
dritte Quelle möglicherweise
abnormer Daten ist das Vorhandensein eines „verpaßten Ereignis"-Partikels, der weit
genug von dem eingefangenen Partikel wandert, so daß er nicht
in dem gleichen Einfangfenster erscheint, aber dem eingefangenen Partikel
dicht genug vorangeht, daß es
den nächsten Auslöser frühzeitig
auslöst.
Um diese Möglichkeit
zu verringern, wird die vorstehend beschriebene Zeitschaltereinrichtung
verändert,
um ein Freigabefenster bereitzustellen, das die Zeit des erwarteten
Auslösers
einklammert. Dies benachteiligt frühzeitiges Auslösen, während erlaubt
wird, daß der
Auslöser von
dem Signal von dem eingefangenen Partikel abhängt. Wenn das Freigabefenster
endet und kein Auslöser
aufgetreten ist, dann wird der erste Auslöser, wie vorstehend beschrieben,
erzwungen, um die Korrelation aufrechtzuerhalten. Jegliche Daten,
die einen erzwungenen Auslöser
enthalten, sollten markiert werden, was anzeigt, daß der Rahmen
verdächtige
Daten enthalten kann und nicht in den abschließenden Datensatz aufgenommen
werden sollte.
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Eine
letzte Quelle einer möglichen
Verunreinigung von „eingefangenen
Ereignissen" ist,
wenn es in den Einfangfenstern einen Überlapp für zwei Ereignisse gibt, die
sich in dem Einfangverfahren befinden, aber an verschiedenen Laserpositionen
sind. Die Wahrscheinlichkeit für
dieses mögliche
Problem nimmt zu, wenn die Anzahl der Laserabtastpunkte zunimmt,
der Abstand zwischen den Abtastpunkten zunimmt, und wenn die Abtastpartikelrate
zunimmt. Die Schärfe
dieses Problems ist von dem Grad der optischen Trennung zwischen
den verschiedenen optischen Meßkanälen abhängig. Die
Tatsache, daß zwischen
zwei oder mehr Einfangfenstern ein Überlapp aufgetreten ist, ist
detektierbar und kann verwendet werden, um möglicherweise abnorme Ergebnisse
zu kennzeichnen.
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Alle
dieser möglichen
Gründe
für unrichtiges Einfangen
sollten detektiert und von der Elektronik, welche die Auslösesignale
verarbeitet, gesteuert werden, um zu verhindern, daß abnorme
Daten erfaßt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung beseitigt die Notwendigkeit, daß die Lichtstrahlen
von zwei oder mehr Anregungslichtquellen sich an einem einzigen
Punkt in einer Durchflußzelle
schneiden. Außerdem
verringert die vorliegende Erfindung die interferierende Fluoreszenz
von Farbstoffen, die von anderen Anregungslichtquellen angeregt
werden („Nebensprechen"). Außerdem ist
die Gesamtausrichtung von Anregungslichtquellen weniger restriktiv,
da die Anregungslichtquelle ihren eigenen Positionsmesser hat. Die
Verwendung von Mehrfachbandpaßfiltern
in Verbindung mit weniger Photovervielfacherröhren und den zugehörigen Elektroniken
führt zu
erheblichen Kosten- und Raumeinsparungen.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung unter Bezug auf gewisse bevorzugte Versionen
von ihr in beträchtlichem
Detail beschrieben wurde, sind andere Versionen möglich. Daher
sollte der Bereich der beigefügten
Patentansprüche
nicht auf die Beschreibung der hier beschriebenen bevorzugten Versionen eingeschränkt werden.
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Alle
in der Patentbeschreibung, einschließlich der Patentansprüche, der
Zusammenfassung und den Zeichnungen, offenbarten Merkmale und alle
Schritte in jedem offenbarten Verfahren oder Prozeß können in
jeder Kombination kombiniert werden, abgesehen von Kombinationen,
in denen zumindest einige derartiger Merkmale und/oder Schritte
sich gegenseitig ausschließen.
Jedes in der Patentbeschreibung, einschließlich der Patentansprüche, der
Zusammenfassung und den Zeichnungen, offenbarte Merkmal kann durch
alternative Merkmale ersetzt werden, die den gleichen, äquivalenten
oder ähnlichen
Zweck erfüllen,
es sei denn, es ist ausdrücklich anders
angegeben. Es sei denn, es ist ausdrücklich anders angegeben, ist
folglich jedes offenbarte Merkmal nur ein Beispiel aus einer generischen
Reihe äquivalenter
oder ähnlicher
Merkmale.