JP7145760B2 - デュアルレーザービームを用いたフローサイトメトリー - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、発明者Ming Yan他によって２０１６年４月２１日に出願された「CYTOMETRY WITH DUAL LASER BEAMS」という発明の名称の米国仮特許出願第６２／３２５，９８８号の利益を主張する。

本発明の実施の形態は、包括的には、フローサイトメトリーに関する。

フローサイトメトリーは、サンプル流体がフローサイトメーターのレーザーによって生成されたレーザー光を通過する際に、当該サンプル流体のフロー内の粒子の物理特性及び化学特性を分析するのに用いられる技術である。細胞成分は、蛍光標識することができ、次いで、変動する波長において発光するようにレーザーによって励起することができる。

蛍光発光を測定して、単一の粒子の様々な性質を求めることができる。単一の粒子は、通常は細胞（例えば、血球）である。液体ストリーム内の粒子がレーザーの傍を通過する際に、毎秒数千個までの粒子を分析することができる。測定される性質の例には、粒子の相対的な粒度、サイズ及び蛍光発光強度、並びに粒子の内部の複雑度が含まれる。フローサイトメーターの光対電子結合システムが、粒子が蛍光発光し、レーザーからの入射ビームを散乱させる方法を記録するのに用いられる。

フローサイトメーターの光システムは、サンプル流体のストリーム内に存在する粒子を照射するレーザーを備える。粒子がレーザーからの入射レーザー光を通過する際、レーザー光は散乱する。さらに、レーザー光によって励起されると、粒子上に存在する何らかの蛍光分子が蛍光発光する。この蛍光は、慎重に位置決めされたレンズ及び検出器によって検出される。フローサイトメーターが、各粒子又は各事象についてのデータを収集する。それらの事象又は粒子の特性は、それらの蛍光特性及び光散乱特性に基づいて求められる。

フローサイトメーターの電子機器システムは、反射された光信号及び／又は散乱された光信号を１つ以上の検出器を用いて受信し、それらの光信号を、コンピューターが処理することができる経時的なデータを表す電子パルスに変換するのに用いられる。その後、このデータを、コンピューターを用いて分析し、短期間で多数の生体細胞についての情報を確認することができる。

本発明の実施の形態は、添付の特許請求の範囲によって要約される。

デュアルレーザービームを有するフローサイトメトリーシステムの概略図である。 粒子フロー方向を基準とした単一のレーザービームスポットを有するサンプル領域の概略図である。 粒子フロー方向を基準としたデュアルレーザービームスポットを有するサンプル領域の概略図である。 単一のレーザービームスポットの強度の一例示の分布を示す図である。 デュアルレーザービームスポットの強度の一例示の分布を示す図である。 デュアルレーザービームを有するサイトメトリーシステムの別の概略図である。 デュアルレーザービームを有するサイトメトリーシステムの概念図である。 サンプル流体を照射するレーザービームの広幅ビームプロファイルを示す図である。 粒子流体を照射する合焦されたデュアルレーザービームの狭幅ビームプロファイルを示す図である。 一例示の複屈折結晶体の概略図である。 サイトメトリーシステムにおける移動粒子を分析する一例示の方法のフローチャートである。

本発明の実施形態の以下の詳細な説明では、本発明の実施形態の完全な理解を提供するために、非常に多くの具体的な詳細が説明される。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細がなくても実施することができることが当業者には明らかであろう。その他の場合には、よく知られた方法、手順、構成要素、及び回路は、本発明の実施形態の態様を不必要に不明瞭にしないように詳細に説明されていない。

本発明の実施形態は、デュアルレーザービームを用いたフローサイトメトリーのための方法、システム、及び装置を含む。

総論
図１は、デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂを有するサイトメトリーシステム１００の概略図である。サイトメトリーシステム１００は、デバイスの中でも特に、中空円筒形フローチューブ１０１と、レーザーデバイス１０６と、１つ以上の検出器デバイス１０８とを備える粒子分析器である。レーザーデバイス１０６は、光学素子１０７に結合された光源である。レーザーデバイス１０６からの単一のレーザービームを用いて、光学素子１０７は、フローチューブ１０１に誘導されるデュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂを形成する。１つ以上の検出器デバイス１０８は、様々な角度の反射光又は散乱光１１３を検出する光学機器類及びセンサーを含む。

フローチューブ１０１の中央にあるサンプル流体フロー１０２は、背景流体フロー１０３によって取り囲まれている。サンプル流体フロー１０２及び背景流体フロー１０３は、フローチューブ１０１を通ってフロー方向１１０にともに流れる。サンプル流体１０２は、例えば、水溶液（例えば、血漿）に粒子１０４（例えば、血球、血球片等）を含むことができる。サンプル流体フロー１０２を取り囲む背景流体フロー１０３は、水及び／又は他の或る不活性流体とすることができる。場合によっては、望ましくない汚染物質粒子１０５が、背景流体フロー１０３内に見つかる場合がある。

デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂは合焦されて、サンプル流体フロー１０２内の粒子１０４がフローチューブ１０１内において傍を流れる際に、それらに粒子を照射する。デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂは、インターロゲーションスポット（interrogation spot）１１６を含むサンプル領域１１４（例えば、レーザービームスポット）においてサンプル流体１０２を照射する。設計では、照射サンプル領域１１４は、インターロゲーションスポット１１６から１つ以上の検出器デバイス１０８に向けて反射光及び／又は散乱光１１３を放出する。反射光及び／又は散乱光１１３を用いて、検出器デバイス１０８は、粒子を有するサンプル流体１０２がサンプル領域１１４を通過する際に粒子１０４の物理特性及び／又は化学特性を求めるように分析することができる信号を生成する。検出器がサンプル流体１０２において粒子１０４以外のものを検出したことから信号を生成するときに、雑音が生成される。例えば、背景流体フロー１０３内に見られる望ましくない汚染物質粒子１０５が照射及び検出された場合、検出器は、信号内に雑音を生成する。

したがって、背景流体フロー１０３における他の領域を照射することなく、サンプル領域１１４においてサンプル流体フロー１０２を照射することが望ましい。さらに、照射領域を通る軌道が僅かに異なることによって引き起こされる粒子間の信号変動を最小にするために、サンプルフロー方向１１０に垂直な方向に均一にサンプル領域１１４を照射することが望ましい。したがって、デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂとフロー方向１１０とは、互いに実質的に垂直（例えば、９０度±５度）である。光の一部を反射させることができ、及び／又は、散乱光をデュアルレーザービーム１１２Ａに実質的に垂直（９０度±５度）に反射若しくは散乱させることができる。例えば、システム１００が３次元（ｘｙｚ）直交座標系に位置していると仮定する。レーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂをｘ軸に沿って誘導することができ、反射光又は散乱光１１３をｙ軸に沿って誘導することができ、フロー方向１１０をｚ軸に沿ったものとすることができる。光を他の角度に反射又は散乱させて、反射光又は散乱光の角度の光軸に沿って位置決めされた１つ以上の検出器によって検出することもできる。

図２Ａは、サンプル領域１１４にわたって広がることができる高強度の単一のレーザービームスポット２１２を有する、粒子フロー方向１１０を基準としたサンプル領域１１４の概略図である。サンプル領域１１４において、レーザービームスポット２１２は、レーザービーム幅２０６及びレーザービーム高２０４を有する。この例では、レーザービーム幅２０６は、フロー方向１１０に対して垂直（例えば、９０度±５度）に測定される一方、レーザービーム（複数の場合もある）高２０４は、フロー方向１１０に対して平行に測定される。レーザービームは、サンプル領域１１４の外部にエネルギーを放出する場合があり、その結果、付加的な雑音が生じる可能性がある。効果的なレーザービーム幅２０６は、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間のサンプル領域１１４内の幅である。インターロゲーション点Ｘ_ＩＰは、通常、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間の中間部である。レーザービームスポットの強度は、通常、インターロゲーション点Ｘ_ＩＰ付近で最も強い。

理想的には、レーザービーム幅２０６は、粒子間の変動を最小にするためにレーザービーム高２０４よりも大きい。同様に、レーザービーム高２０４は、近傍の粒子間の一致を最小にするためにレーザービーム幅２０６よりも小さい。

図３Ａは、単一のレーザーによって形成されたサンプル領域１１４における単一のレーザービームスポット２１２の強度（例えば、エネルギー、密度等）の一例示の分布である。図３Ａの分布は、レーザー強度（縦軸）対レーザービームスポット内の位置Ｘ（横軸）を示している。レーザービームスポットの強度曲線３０２は、ガウス（すなわち、正規）プロファイルを有する。図２Ａに関して上述したように、効果的なレーザービーム幅は、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間のサンプル領域内の幅である。図３Ａにおいて強度曲線３０２によって示すように、レーザービームは、サンプル領域の点Ｘ_１及び点Ｘ_２の外部に一部のエネルギーを放出し、その結果、雑音が生じる可能性がある。インターロゲーション点Ｘ_ＩＰは、サンプル領域１１４の点Ｘ_１と点Ｘ_２との間のほぼ中間部にある。レーザービームスポットの強度は、通常、インターロゲーション点Ｘ_ＩＰ付近で最も強い。

レーザービーム幅２０６を増加させるとともにガウスプロファイルを平滑にする光学素子を用いてレーザービームスポットの幅を広げると、通常、強度曲線３０３によって示すように、インターロゲーション点Ｘ_ＩＰ（例えば、インターロゲーション点１１６）における出力密度は減少する。これによって、ひいては、検出器１０８における信号対雑音比（ＳＮＲ）も減少する。図１を参照すると、信号は、サンプル流体１０２内の粒子１０４の検出を含む一方、雑音は、サンプル流体１０２を取り囲む背景流体フロー１０３内の粒子１０５等の、サンプル流体１０２内の粒子１０４以外のものの検出を含む。

代替案として、より強力なレーザーを用いて、より広幅のレーザービームスポット及びより大きな信号エネルギーを、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間のサンプル領域内に提供し、曲線３０５によって示すように、検出器によって検出される信号エネルギーを増加させることができる。しかしながら、これによって、電力消費と、レーザーによって生成される望ましくない熱とが増加する。その上、電力が追加されることによって、ガウスプロファイルにおける追加されたレーザービームエネルギーが、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間の所望のサンプル領域の外部に存在する。この結果、雑音が追加され、信号対雑音比が低下する。

図３Ａを再び参照すると、サンプル領域１１４において均一な水平照射を提供し、それによって、高いエネルギー密度を維持することが望ましい。例えば、正規ガウスレーザープロファイルを上回る利点を有する、平坦な上部３０４を有するレーザープロファイルを有することが望ましい。

幾つかの従来の手法は、ガウスレーザープロファイル３０２から平坦な上部３０４を作り出すことを試みるために用いられてきた。最も単純なものの１つは、アポディゼーションであり、逆ガウス伝達特性を有する中性濃度フィルターが、レーザープロファイルを平坦にするのに用いられるものである。この手法は、エネルギー損失という不利点に加えて、フィルターをレーザービームと慎重に位置合わせしなければならないという保守が困難な要件も不利点として有する。米国特許第８，２５９，３９６号に開示されているような別の手法は、平坦な上部プロファイルを生成するように設計することができる回折光学機器類を利用するものである。この手法は、光学機器類を小さな容積で製造することが困難であるという不利点を有する。米国特許第８，４５１，５２４号に開示されている第３の手法は、サンプルフローに垂直にレーザービームを走査して、軌道が異なることによって生み出される粒子間の変動を除去するものである。この手法の不利点は、高価である可能性がある走査用光学機器類が必要とされることである。

複屈折結晶体を有するデュアルレーザーシステム
本明細書に開示される方法、装置、及びシステムは、デュアルレーザービームを提供することによって従来の手法の短所に対処する。デュアルレーザービームは、複屈折結晶体を用いて単一のレーザー光源から生成される。

ここで、図２Ｂを参照すると、デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂを用いたサンプル領域１１４の粒子フロー方向１１０を基準とした概略図が示されている。サンプル領域１１４において、デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂは、インターロゲーション点Ｘ_ＩＰ１１６付近において或る程度重複するレーザービームスポット２１２Ａ及び２１２Ｂを形成する。デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂは合わさって、レーザービーム幅２０６及びレーザービーム高２０４を有するマージされたレーザービームスポットを生成する。この例では、レーザービーム幅２０６は、フロー方向１１０に垂直（例えば、９０度±５度）に測定される一方、レーザービーム高２０４は、フロー方向１１０に平行（例えば、１８０度±５度）に測定される。効果的なレーザービーム幅２０６は、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間のサンプル領域１１４内の幅である。

理想的には、レーザービーム幅２０６は、粒子間の変動を最小にするためにレーザービーム高２０４よりも大きい。同様に、レーザービーム高２０４は、理想的には、粒子間の一致を最小にするためにレーザービーム幅２０６よりも小さい。

図３Ｂは、サンプル領域１１４における２つのレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂのそれぞれの強度（例えば、エネルギー、密度等）３１２Ａ及び３１２Ｂの一例示の分布である。各分布３１２Ａ及び３１２Ｂは、レーザー強度（縦軸）対レーザービームスポット内の位置Ｘ（横軸）を示している。各レーザービームの各強度分布３１２Ａ及び３１２Ｂは、ガウス（すなわち、正規）プロファイルを有する。図２Ｂに関して上述したように、効果的なレーザービーム幅は、点Ｘ_１と点Ｘ_２との間のサンプル領域内の幅である。図３Ｂに示すように、デュアルレーザービームは、雑音を最小にするために、サンプル領域の点Ｘ_１及び点Ｘ_２の外部にエネルギーをほとんど放出しない。デュアルレーザービームの強度分布３１２Ａ及び３１２Ｂが互いに組み合わされた場合、組み合わされた分布は、サンプル領域内において、理想的な平坦な上部の分布３０４を密接に近似したかなり平坦な上部及び狭幅の帯域を有する。

次に図４を参照すると、デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂを有するサイトメトリーシステム４００の概略図が示されている。サイトメトリーシステム４００は、デバイスの中でも特に、レーザーデバイス４０２と、光波長板４０３と、複屈折結晶体４０４と、レンズ４０６と、フローチューブ４１０とを備える特定の分析器である。システム４００のこれらのデバイスは、システム光軸４０１に従って整列されている。

レーザーデバイス４０２は、偏光されていないか又は単一のビームの当初の偏光を有する入射ビーム４２０を放出する。入射ビーム４２０は、システム光軸４０１に従って整列されている。入射ビーム４２０は光波長板４０３に入力する。波長板４０３は、入射ビーム４２０を偏光して偏光ビーム４０５を放出する光学素子（例えば、偏光子）である。偏光ビーム４０５は、異なる偏光角を有する２つの成分を含む。偏光ビーム４０５は、システム光軸４０１と整列されている。

偏光ビーム４０５は、複屈折結晶体４０４に複屈折結晶体４０４の前側面（face side）に対して入射角４２１で到達する。システム４０１は、入射角４２１について高い許容範囲を有する。１つの実施形態では、入射角は、１０度と同程度とすることができる。

入射角４２１の高い許容範囲の利点には、少なくとも次のものが含まれる。すなわち、複屈折結晶体４０４の位置決めの較正は、極めて高い精度を必要とせず、困難な作業でないこと；複屈折結晶体４０４は、許容範囲内となるように安価に形成することができること；及び、システム４０１の製造の費用は、入射角４２１の高い許容範囲に起因して全体により少ないこと、が含まれる。

複屈折結晶体４０４は、偏光ビーム４０５の成分を分離する楔形の光学素子である。複屈折とは、水平偏光の屈折率が垂直偏光の屈折率と異なることを意味し、それによって、各ビーム成分の方向角は、偏光ごとに分割される（偏光については、本明細書において、図５を参照して更に説明される）。したがって、偏光ビーム４０５の半分は、常ビーム（ordinary beam：常光線）４２２Ａとして伝播し、偏光ビーム４０５の他の半分は、異常ビーム（extraordinary beam：異常光線）４２２Ｂとして伝播する。複屈折結晶体４０４は、２つのビーム４２２Ａ及び４２２Ｂが互いに対して分離角４２５で出てくるようにカットされている。分離角４２５は、各偏光の結晶体の屈折率及び各屈折率の所与の屈折角に比例する。

偏光ビーム４２２Ａ及び４２２Ｂはレンズ４０６に到達する。レンズ４０６は、２つのビーム４２２Ａ及び４２２Ｂを合焦させて、互いに対する焦点角（focus angle）４２６でデュアルビーム１１２Ａ及び１１２Ｂを放出する。レンズ４０６の焦点４３０において、デュアルビーム１１２Ａ及び１１２Ｂは、ビーム変位４２８だけ互いに変位される。１つの実施形態では、ビーム変位４２８は、入射ビーム４２０の直径の１０分の４（４／１０）～１０分の６（６／１０）にある。焦点４３０において、ビーム変位４２８は、以下の式、すなわち、式１によって近似することができる。
ビーム変位＝焦点距離×ｔａｎ（焦点角）

デュアルビーム１１２Ａ及び１１２Ｂは、フローチューブ４１０に到達し、図１に示すフローサイトメーターにおけるサンプル領域１１４を照射する。１つの実施形態では、複屈折結晶体４０４は、２つの組み合わされたビーム１１２Ａ及び１１２Ｂの９７％出力幅が単一のビーム（１１２Ａ又は１１２Ｂ）のピーク出力幅の約４倍（４×）になるように設計される。

次に図５を参照すると、デュアルレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂを用いたサイトメトリーシステム５００の概念図が示されている。サイトメトリーシステム５００は、レーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂの偏光と、ビーム空間プロファイル５０２、５１２Ａ及び５１２Ｂ、５２０とを示すために、異なる視点で提供されている。

レーザーデバイス４０２は、当初の偏光角５０５で入射ビーム４２０を放出する。この当初の偏光角は、０度として規定することができる。入射ビーム４２０は、正規ガウスエネルギー曲線を有するビーム空間プロファイル５０２を有する。正規ガウスエネルギー曲線は、そのピーク上限において先鋭なプロファイルを有する傾向がある。例えば、ガウスエネルギー曲線は、識別可能な最大エネルギー点をそのピークに有する傾向がある。

入射ビーム４２０は光波長板４０３に入力する。波長板４０３は、波長板角５０６に向くように回転される。１つの実施形態では、波長板角５０６は、当初の偏光角５０５に対して約４５度±５度である。波長板角５０６によって、波長板４０３は、入射ビーム４２０を偏光ビーム４０５として放出する。偏光ビーム４０５は、垂直角５０７及び水平角５０８を含む２つの異なる偏光角を有する２つの成分を含む。例えば、垂直角５０７は、当初の偏光角５０５に対して約０度とすることができ、水平角５０８は、当初の偏光角５０５に対して約９０度とすることができる。偏光ビーム４０５のこれらの２つの成分は、振幅（例えば、正弦成分及び余弦成分）がほぼ等しい。偏光ビーム４０５は、複屈折結晶体４０４に或る入射角で到達する。

図５に示すように、複屈折結晶体４０４は、偏光ビーム４０５の成分を分離する。複屈折とは、水平偏光の屈折率が垂直偏光の屈折率と異なることを意味する。複屈折結晶体４０４内の異なる屈折率は、それによって、各ビーム成分の方向角を偏光ごとに分割する。複屈折結晶体４０４は、偏光ビーム４０５の半分が常ビーム４２２Ａとして伝播し、偏光ビーム４０５の他の半分が異常ビーム４２２Ｂとして伝播するようにカットされている。常ビーム４２２Ａは垂直角５０７を維持し、異常ビーム４２２Ｂは水平角５０８を維持する。したがって、２つのビーム４２２Ａ及び４２２Ｂは、図４に示すように、互いに対して分離角４２５で出ていく。

２つのビーム４２２Ａ及び４２２Ｂは、レンズ４０６に結合される。レンズ４０６は、２つの入射レーザービーム４２２Ａ及び４２２Ｂを合焦させ、デュアル合焦ビーム１１２Ａ及び１１２Ｂを放出する。図４に示すように、レンズは、デュアルビーム１１２Ａ及び１１２Ｂを放出し、フローサイトメーターのサンプル領域内の焦点において単一のマージされたレーザービームスポットを形成する。図５において、常ビーム１１２Ａは垂直角５０７を維持する一方、異常ビーム１１２Ｂは水平角５０８を維持する。個別に検討すると、常ビーム１１２Ａは、正規ガウス曲線を有する空間エネルギープロファイル５１２Ａを有する一方、異常ビーム１１２Ｂも、正規ガウス曲線を有する空間エネルギープロファイル５１２Ｂを有するが、そのピークは、空間エネルギープロファイル５１２Ａにおけるピークから間隔が空いている。

フローサイトメーターシステム５００における光学素子は、それぞれのビーム１１２Ａ、１１２Ｂの空間エネルギープロファイル５１２Ａ及び５１２Ｂを、フローサイトメーターのサンプル領域内のレンズ４０６の焦点において互いに重ね合わせる。空間エネルギープロファイル５１２Ａ及び５１２Ｂを重ね合わせることによって、組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０がレンズの焦点に形成される。デュアルレーザービームの組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０は、正規ガウス曲線の通常の単一のレーザービーム空間エネルギープロファイルに関連した先鋭な上部ではなく、相対的に平坦な上部を有する。例えば、組み合わされた空間プロファイル５２０は、識別可能な最大点を有しない傾向があり、逆に、サンプル領域においてより平らなエネルギー（例えば、強度）を有する平坦な上部を有する傾向がある。これとは対照的に、正規ガウスエネルギー曲線は、識別可能な最大点をピークに有する傾向がある。

図６Ａは、図１に示すサンプル領域１１４等のサンプル領域にわたってサンプル流体ストリーム６０１Ａを照射するレーザービームの広幅ビームプロファイル６１２（例えば、正規ビームプロファイル）を示している。サンプル流体６０１Ａは、水溶液６０２Ａ（例えば、血漿）内の粒子６０３Ａ、６０４Ａ、及び６０５Ａ（例えば、血球、血球片等）を含む。サンプル流体ストリーム６０１Ａは、背景流体ストリーム６２０Ａ（例えば、水及び／又は他の或る流体）によって取り囲むことができる。汚染物質６１０Ａが、サンプル流体ストリーム６０１Ａの外側の背景流体ストリーム６２０Ａに懸濁している場合がある。

広幅ビームプロファイル６１２は、正規ガウスエネルギー曲線を有するが、サンプル流体ストリーム６０１Ａにおけるサンプル領域全体をカバーするために、図５のレーザービーム空間プロファイル５０２よりもはるかに大きくかつ広幅に広がった出力を有する。正規ガウスエネルギー曲線は、上限において尖鋭又は先鋭となる（ピークを有する）傾向があり、空間的に広がっている。例えば、減少していくサイドローブになって左右に広がるガウスエネルギー曲線は、識別可能な最大点をピークに有する傾向がある。

広幅ビームプロファイル６１２は、幾つかの不利点を有する。広幅ビームプロファイル６１２は、そのピークからのそのサイドローブにおいてエネルギーが低下することに起因して、サンプル流体ストリーム６０１Ａの中心を外れた異なるエリア６０７Ａにおける照射の減少を示す。例えば、サンプル流体ストリーム６０１Ａのそのような平らでない照射によって、粒子６０５Ａは、中心及びピークの近くではより強い照射を受けるので、より高い読み取りを受け得る一方、中心を外れた他の粒子６０３Ａ及び６０４Ａは、広幅ビームプロファイル６１２のより低いエネルギーの位置におけるレーザービームスポットからのより低い照射を受けるので、より低い読み取りを受け得る。

広幅ビームプロファイル６１２は、背景流体ストリーム６２０Ａにあるサンプル領域の外部の背景エリア６０８Ａにおける照射の増加も示す。そのような背景エリア６０８Ａにおける照射の増加は、背景流体ストリーム６２０Ａ内の汚染物質６１０Ａを検出することによって雑音を増加させ、それによって、信号対雑音比を減少させる可能性がある。

図６Ｂは、サンプル流体ストリーム６０１Ｂを照射する合焦されたデュアルレーザービームの組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０（例えば、平坦な上部ビームプロファイル６０７Ｂを有する）を示している。組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０は、そのエネルギーのより多くが、サンプル領域に関連した狭幅空間領域に合焦されている。サンプル流体ストリーム６０１Ｂは、水溶液６０２Ｂ（例えば、血漿）内の粒子６０３Ｂ、６０４Ｂ及び６０５Ｂ（例えば、血球、血球片等）を含む。サンプル流体ストリーム６０１Ｂは、背景流体ストリーム６２０Ｂ（例えば、水及び／又は他の或る流体）によって取り囲むことができる。汚染物質６１０Ｂが、サンプル流体ストリーム６０１Ｂの外側の背景流体ストリーム６２０Ｂに懸濁している可能性がある。

組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０は、図５のそれぞれのレーザービーム１１２Ａ及び１１２Ｂの空間プロファイル５１２Ａ及び５１２Ｂを互いに加えることから形成される。組み合わされた空間プロファイル５２０は、通常のレーザープロファイルである正規ガウス曲線の先鋭な上部ではなく、相対的に平坦な上部６０７Ｂを有する。その上、組み合わされた空間プロファイル５２０の相対的に平坦な上部６０７Ｂは、サンプル領域をカバーする狭幅空間領域内にあり、広幅ビームプロファイル６１２のビームプロファイルよりも狭幅のビームプロファイルを提供する。

組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０の平坦な上部及び狭幅のビームプロファイルは、幾つかの利点を有する。組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０の平坦な上部及び狭幅のビームプロファイルは、サンプル流体ストリーム６０１Ｂの相対的に一様な照射をサンプル領域において提供する。そのような一様な照射（例えば、定出力密度）によって、サンプル流体ストリーム内の異なる箇所における粒子６０３Ｂ、６０４Ｂ、及び６０５Ｂは、相対的に公平な読み取りを受ける。組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０の平坦な上部及び狭幅のビームプロファイルによって、図６Ａのサンプルストリーム６０１Ａ上で合焦された広幅ビームプロファイル６１２の出力密度と比較して、サンプル領域及びサンプルストリーム６０１Ｂ上でより合焦された同じ出力密度に対してより低い出力源のレーザーの使用が可能になる。

図６Ｂにおいて、組み合わされた空間エネルギープロファイル５２０における狭幅ビームプロファイルは、サンプル領域の外部の背景流体ストリームにおける背景エリア６０８Ｂの照射の低減も示している。背景エリアにおけるそのような照射の減少によって、汚染物質６１０Ｂ等から検出される場合がある雑音が減少し、それによって、信号対雑音比が増加する。

図７は、図４及び図５に示す複屈折結晶体４０４に用いることができる切頭された楔の形状の３次元複屈折結晶体７００の一例の概略図である。複屈折結晶体７００は、少なくとも前側面７０１と、楔側面７２０と、主要側面７２２とを備える。これらの側面は、互いに実質的に垂直（９０度±５度）である。例えば、複屈折結晶体７００は、３次元（ｘｙｚ）直交座標系に位置していると仮定する。前側面７０１は、ｘｙ平面に存在することができ、主要側面７２２は、ｙｚ平面に存在することができ、楔側面７２０は、ｘｚ平面に存在することができる。３次元である複屈折結晶体７００は、平行な楔側面７２０を備える。

図７に示すように、楔側面７２０及び平行な楔側面を形成する三角形を切頭することができ、それによって、図示するように、主要側面７２２に平行でかつ前側面７０１に垂直な側面７２４が形成される。切頭された楔側面７２０は、３次元複屈折結晶体７００の切頭された楔形状、すなわち、六面体を形成して、空間を節約する。楔角７０２は、楔側面７２０と、この楔側面を形成する三角形とに関連している。図４及び図５に示すように、入射偏光光ビーム４０５は、複屈折結晶体の光軸（ＯＡ）７０６との或る入射角（例えば、図４に示す角度４２１）で複屈折結晶体７００に結合される。

この例では、複屈折結晶体７００は、以下の仕様を有することができる。
光に対して透明であり、石英鉱物を含む材料組成物；
約２．０度±０．１度の楔側面７２０に関連した楔角７０２；
約９０．０度±０．１度の前側面７０１上の面角７０４；
約８．０ミリメートル（ｍｍ）±０．１ｍｍの前側面７０１の幅７０８；
約１０．０ｍｍ±０．１ｍｍの前側面７０１の高さ７１０；
約１．５ｍｍ±０．１ｍｍの主要側面７２２の厚さ７１２；
０．１度よりも小さい（＜）誤差を有する幅７０８に沿った光軸７０６；及び
約４００ナノメートル（ｎｍ）～約６５０ｎｍの反射防止ＡＲコーティング。

複屈折結晶体７００の上記仕様は、説明の目的で提供されたものである。異なる仕様及び／又は追加の仕様も本発明の実施形態の範囲内にある。

方法の概略
次に図８を参照すると、粒子分析器（例えば、サイトメトリーシステム）において移動粒子を分析する一例示の方法８００のフローチャートが示され、次に説明される。１つの実施形態では、図４のサイトメトリーシステム４００が、この例示の方法８００を実行することができる。

例示の方法８００の動作８０５において、レーザーデバイス４０２は、入射ビーム４２０を、光波長板４０３に入力するように誘導する。

動作８１０において、光波長板４０３は、入射ビーム４２０を偏光して、光波長板４０３から偏光ビーム４０５を放出する。偏光ビーム４０５は、システム光軸４０１と整列されている。

動作８１５において、光波長板４０３は、偏光ビーム４０５を、システム４００のシステム光軸４０１に対して入射角４２１で複屈折結晶体４０４に入力するように誘導する。

動作８２０において、偏光ビーム４０５が複屈折結晶体４０４に入力したことに応答して、複屈折結晶体４０４は、偏光ビーム４０５の２つのビーム成分を分離する。これらの２つのビーム成分は、常光ビーム４２２Ａ及び異常光ビーム４２２Ｂを含む。複屈折結晶体４０４は、２つのビーム４２２Ａ及び４２２Ｂが互いに対して分離角４２５で出ていくようにカットされている。

動作８２５において、複屈折結晶体４０４は、常光ビーム４２２Ａ及び異常光ビーム４２２Ｂを、レンズ４０６に入力するように誘導する。

動作８３０において、レンズ４０６は、常光ビーム４２２Ａ及び異常光ビーム４２２Ｂを、ビーム変位４２８だけ分離されたデュアル光ビーム１１２Ａ及び１１２Ｂに合焦させる。

動作８３５において、レンズ４０６は、デュアル光ビーム１１２Ａ及び１１２Ｂをサンプル領域１１４（例えば、光ビームスポット）に結合する。サンプル領域１１４は、粒子分析器において移動粒子を分析するために、組み合わされたデュアル光ビームからの実質的に均一な光強度を有する。

他の動作及び／又は詳細は、他の図を参照して議論されており、実施態様に応じて、方法８００の一部とすることもできる。

結論
本発明の実施形態は、上記のように説明される。幾つかの特定の例示的な実施形態が説明され、添付図面に示されているが、そのような実施形態は、広い本発明の例示にすぎず、広い本発明を限定するものでないこと、並びに、本発明の実施形態が、図示及び説明された特定の構造及び構成に限定されるものでないことが理解されよう。なぜならば、当業者は、他の様々な変更を想起することができるからである。

本明細書は、多くの具体的内容を含むが、これらは、本開示の範囲に対する限定としても、請求項に記載され得るものの範囲に対する限定としても解釈されるべきではなく、逆に、本開示の特定の実施態様に特有の特徴の説明として解釈されるべきである。個別の実施態様として本明細書に説明された幾つかの特定の特徴は、単一の実施態様において組み合わせて実施することもできる。逆に、単一の実施態様として説明された様々な特徴は、複数の実施態様において別々に又は一部を組み合わせて実施することもできる。さらに、特徴は、上記において、幾つかの特定の組み合わせで動作するものとして説明することができ、さらには、そのようなものとして最初に特許請求することもできるが、特許請求される組み合わせからの１つ以上の特徴は、幾つかの場合には、その組み合わせから削除される場合があり、特許請求される組み合わせは、部分的な組み合わせ又は部分的な組み合わせの変形形態を対象とする場合がある。したがって、特許請求される発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定される。
また、以下の態様も可能である。
（１）複屈折結晶体であって、
石英鉱物を含む材料組成物であって、
９０度±０．１度の面角を有する前側面と、
前記前側面に実質的に垂直であり、２度±０．１度の楔角を有する楔側面と、
前記前側面及び前記楔側面に実質的に垂直であり、１．５ミリメートル±０．１ミリメートルの厚さを有する主要側面と、
を有する、材料組成物、
を備え、
該複屈折結晶体に或る入射角で入力する偏光光ビームが、常光ビーム及び異常光ビームに分離される、複屈折結晶体。
（２）（１）において、前記材料組成物の周囲に反射防止ＡＲコーティングを更に備える複屈折結晶体。
（３）（１）において、前記材料組成物は、前記楔側面を形成する切頭された三角形を有する六面体である複屈折結晶体。

Claims (17)

1. 光源からの入射光ビームを、光波長板に入力するように誘導することと、
   前記入射光ビームが前記光波長板を通じて入力したことに応答して、前記入射光ビームを偏光して偏光光ビームにし、前記偏光光ビームは、異なる偏光角を有する二つの成分を含むことと、
   前記偏光光ビームを、複屈折結晶体に入力するように誘導することと、
   前記偏光光ビームが前記複屈折結晶体に入力したことに応答して、前記偏光光ビームを常光ビーム及び異常光ビームに分離することと、
   前記常光ビーム及び前記異常光ビームを、レンズに入力するように誘導することと、
   前記常光ビーム及び前記異常光ビームを合焦させてビーム変位だけ分離された重複するデュアル光ビームにすることと、
   を含み、
   前記合焦させることは、レンズを用いて行われ、
   前記常光ビームの光軸と及び前記異常光ビームの光軸は、前記レンズの焦点における前記デュアル光ビームの前記ビーム変位だけ分離され、
   前記ビーム変位は、前記入射光ビームの直径の１０分の４～１０分の６にある、粒子分析器において移動粒子を分析する方法。
2. 前記デュアル光ビームを結合して、前記粒子分析器において移動粒子を分析する実質的に均一な光強度を有するサンプル領域を形成すること、
   を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記複屈折結晶体は、石英を含む材料組成物を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記レンズの前記焦点における前記デュアル光ビームの光ビームスポットの出力幅が、前記常光ビームのピーク出力幅よりも大きく、かつ前記異常光ビームのピーク出力幅よりもよりも大きい、請求項１に記載の方法。
5. 前記粒子分析器はサイトメトリーシステムを含み、
   前記入射光ビームはレーザービームを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記光波長板は、前記入射光ビームの当初の偏光角に対して約４５度の角度に向けられる、請求項１に記載の方法。
7. 前記偏光光ビームは、前記複屈折結晶体の面に対して或る入射角で前記複屈折結晶体に入力する、請求項１に記載の方法。
8. 前記常光ビーム及び前記異常光ビームは、前記複屈折結晶体において分離角だけ分離され、
   前記デュアル光ビームは、前記レンズにおいて焦点角だけ分離される、請求項１に記載の方法。
9. 入射光ビームを放出するレーザーデバイスと、
   前記入射光ビームを偏光して偏光光ビームにする光波長板であって、前記偏光光ビームは、異なる偏光角を有する二つの成分を含む、光波長板と、
   前記偏光光ビームを常光ビーム及び異常光ビームに分離する複屈折結晶体と、
   前記常光ビーム及び前記異常光ビームを、ビーム変位だけ分離された光軸を有する重複するデュアル光ビームを含むビームスポットに合焦させるレンズと、
   を備え、
   前記常光ビームの光軸と及び前記異常光ビームの光軸は、前記レンズの焦点における前記デュアル光ビームの前記ビーム変位だけ分離され、
   前記ビーム変位は、前記入射光ビームの直径の１０分の４～１０分の６にある、移動粒子を分析するシステム。
10. サンプルフロー内に前記移動粒子を有するフローチューブを更に備え、
    前記レンズは、前記デュアル光ビームを結合して、前記移動粒子を分析する実質的に均一な光強度を有する、前記サンプルフローのサンプル領域における前記ビームスポットを形成するように更に構成される、請求項９に記載のシステム。
11. 前記システムは、
    粒子分析器、又は、
    サイトメトリーシステム、
    のうちの少なくとも一方である、請求項９に記載のシステム。
12. 前記複屈折結晶体は、石英を含む材料組成物を有する、請求項９に記載のシステム。
13. 前記レンズの前記焦点における前記デュアル光ビームの光ビームスポットの出力幅が、前記常光ビームのピーク出力幅よりも大きく、かつ前記異常光ビームのピーク出力幅よりもよりも大きい、請求項９に記載のシステム。
14. 前記入射光ビームはレーザービームを含む、請求項９に記載のシステム。
15. 前記光波長板は、前記入射光ビームの当初の偏光角に対して約４５度の角度に向けられる、請求項９に記載のシステム。
16. 前記偏光光ビームは、前記複屈折結晶体の面に対して或る入射角で前記複屈折結晶体に入力する、請求項９に記載のシステム。
17. 前記常光ビーム及び前記異常光ビームは、前記複屈折結晶体において分離角だけ分離され、
    前記デュアル光ビームは、前記レンズにおいて焦点角だけ分離される、請求項９に記載のシステム。
    

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