JPH0544621B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、流動細胞測定装置、特に、広角の散
乱光および蛍光を検知する改良した光学要素を備
え、細胞等の１または複数の特性を判定する流動
細胞測定装置に関する。

（従来の技術および問題点） 流動細胞測定装置は、液体流中の細胞または他
の粒子に関する１または複数の特性を判定するた
めの装置である。例えば、細胞を含有する体液標
本を急速な液体流の状態にて、この流動細胞測定
装置に供給し、各細胞が、１度におおむね１つず
つ、次々と検知領域を通過するようにする。細胞
の容積は、各細胞が検知領域を通過する際の、電
気抵抗の変化によつて、求めることができる。同
様に、入射光を検知領域に照射した場合、その光
は、その検知領域を通過する各細胞によつて、散
乱される。この散乱光を基に、細胞の形状、屈折
度、不透明度、粗さ等を知ることができる。入射
光という励起エネルギを通過することで励起され
た、標識細胞から発光される蛍光を検知すること
により、特別に標識した細胞を探知することがで
きる。かかる流動細胞測定装置は、細胞の分析の
みでなく、細胞の分類をも行なうことが可能であ
る。この流動細胞測定装置における照射用の入射
光源としては、レーザ並びにインコヒーレントで
且つ非平行の光線の光源として、水銀灯、または
キセノンアーク灯等が使用されている。

現在、公知で且つ入手可能なほとんどの流動細
胞測定装置では、細胞によつて発光された蛍光
は、一般に、光励起軸に対して、90°の視軸各に
て、集光される。さらに、一般に90°という広角
の散乱光を検知して、細胞の形状および内部形態
に関するデータを得ている。単一の光学式集光装
置によつて、散乱光および蛍光の双方とも90°で
集光することができる場合には、フイルタおよび
ビームセパレータを使用して、90°の蛍光および
散乱光を分岐させ、各光線を別々に検知すること
ができる。さらに、最も効率的に集光するため、
レーザを入射光線とする場合、光線は、一般に、
励起軸と集光軸とによつて画定される90°の角度
を含む面に対して、直角に配向された電気ベクト
ルとなるように偏光される。

入射光から直角に散乱された光線がその偏光状
態を保持するのは、散乱光自体の性質による、一
方、蛍光の偏光は、入射光ではなく、分子自体に
関係する。しかし、実際には、ほとんどの細胞か
らの蛍光は、通常適度の無偏光状態にある。

現在、干渉フイルタを用いて、蛍光および散乱
光双方の成分を備えた光線の分離を行なつている
が、かかるフイルタは、多くの場合、蛍光の透過
効率があまり良くない。さらに、かかる干渉フイ
ルタは、一般に光の波長によつて光の濾過を行な
うものである。このため、例えば、励起波長を変
更する場合には、干渉フイルタも別のものと交換
しなければならない。さらに、これら干渉フイル
タの製造コストは高くつく。

例えば絶縁性広領域のフイルタを使用して、光
線の散乱光と蛍光の成分の分離を行なうこともあ
るが、かかる広領域のフイルタでは、通常偏光に
よる利点を享受することができない。換言すれ
ば、例えば散乱光の25％が反射されるということ
は、蛍光の透過率は75％にしか過ぎないことを意
味する。

また、流動細胞測定装置において、ビームスプ
リツタ板として、コーテイングなしのガラスまた
は石英を使用することは公知である。かかるガラ
ス板は、一般に、散乱光および蛍光双方の成分を
包含する入射光に対して、45°の角度に位置決め
される。この45°の角度で、蛍光は効率的に透過
されるが、散乱光の反射効率は、かなり劣る。

「レビユー・オブ・サイエンテイツク・インス
ツルメント（Review of Scientific
Instruments）」の1984年９月号55(9)のジヨン・
エー・ステインカンプ（John Ａ・Steinkamp）
による論文「流動細胞測定術（Flow
Cytometry）」において、様々な流動細胞測定装
置および技術が紹介されている。細胞の特性を光
学的に検知する様々な手法が利用可能であるが、
細胞に関するデータをより効率良く且つ確実に入
手することができるようにするため、かかる光学
要素をさらに改良する必要性がある。

（問題点を解決するための手段） 流体流れ中における粒子等の１または複数の特
性を判定する、本発明による流動細胞測定装置
は、流体流中の粒子を１度におおむね１つずつ動
かす手段を備えている。この手段は、流体中を移
動する粒子を照射する平面偏光された光線を提供
するものである。ビームスプリツタ手段が光路内
に位置決めしてあり、移動する各粒子によつて散
乱された光および発光された蛍光が、この分割手
段に当たる。このスプリツタ手段は、好ましく
は、ブルースターの角に近い45°以上の入射角に
配向し、蛍光の透過および散乱光の反射を行ない
得るようにする。各粒子に関係する透過された蛍
光および反射された散乱光を検知する手段も備え
ている。この検知手段は、検知した散乱光および
蛍光とかかる粒子の１または複数の特性との関係
を明らかにする。

本発明の好適実施態様において、直接偏光され
た入射光の光源はレーザを使用している。このレ
ーザは、流体中の蛍光標識した細胞に蛍光を発光
させる励起エネルギも提供する。好適な測定装置
は、レーザ光線の光軸に対して、略90°の角度に
て、移動中の各細胞から発光された散乱光および
蛍光をそれぞれ検知する散乱光検知器および蛍光
検出器を備えている。ビームスプリツタが、細胞
と両検出器間の光路内に位置決めしてあり、この
ため、散乱光および蛍光双方とも、入射光に対し
て約90°の角度方向にてビームスプリツタに当た
る。このビームスプリツタは、入射する散乱光お
よび蛍光に対して、ブルースターの角を形成する
ように配向し、蛍光の透過および散乱光の反射を
行ない得るようにすることが望ましい。

本発明の基本的考えによると、散乱光および蛍
光を分割し、特に、流動細胞測定装置を通して移
動する細胞に関する光による情報を広角度にて検
知する改良した光学要素が得られる。本発明は、
散乱光および蛍光の双方とも、を単一の集光系に
よつて集光させることができるようにすれば、特
に、有利である。入射面がレーザ光線の電気ベク
トルに対して、直角となり、入射角がブルースタ
ーの角といつた広角度となるようにし、また、好
ましくは、非被覆で平坦なガラス板を使用するこ
とにより、理想的なビームスプリツタが得られ
る。本発明のビームスプリツタは、無偏光の蛍光
を極めて高い透過率で透過させることができる一
方、散乱光は、ビームスプリツタから効果的な反
射率で反射され、検知される。さらに、本発明
は、干渉フイルタまたは絶縁性広領域フイルタを
使用せずに、上記の如きビームスプリツタを実現
するのである。

従つて、本発明のビームスプリツタは、製造が
簡易且つ経済的で、しかも、励起エネルギの波長
にはほとんど左右されない。さらに、このビーム
スプリツタは、最適な入射角度に配向し、散乱光
のゲインと蛍光のロスとの釣合を図り、散乱光お
よび蛍光双方とも、最適な検知効率を達成しよう
とするものである。以下の説明を読むことによつ
て、明らかとなるように、本発明は、上記の重要
な利点に加えて、これ以外の多数の利点をもたら
すものである。

（実施例） 本発明は、様々な実施態様にて具体化すること
ができるが、本発明の好適実施態様について説明
する。但し、この開示内容は、本発明の基本的考
えの１例にしか過ぎず、本発明の範囲は、この実
施態様にのみ限定されるものではなく、本発明の
範囲は、特許請求の範囲の記載およびその均等の
範囲により判断されるべきである。

第１図を参照すると、流動細胞測定装置１０の
光学要素および粒子流動要素が図示してある。第
１図の光学要素および流動要素は、液体流体の細
胞等の粒子を、１度におおむね１つずつ移動さ
せ、これら粒子を測定し、特異な特性を検知する
流動細胞測定装置の主要な構成要素である。例え
ば、第１図の装置の構成要素は、カリフオルニア
州、マウンテン・ビユーのベクトンデイツキンソ
ンイムノサイトメトリーシステムズ（Becton
Dickinson Immunocytometry Systems）が製
造、販売するFACS（商品名）蛍光励起細胞分類
装置に内蔵できるものである。このFACS細胞分
類装置は、広範囲な研究・実験の用途にて、散乱
光および蛍光に基づいて、細胞の固体群の分析と
分類を行なうものである。ここで、より詳細に説
明し、FACS細胞分類装置等の装置に組込むこと
のできる光学要素および流動要素に加えて、本発
明に有用な細胞分類装置の他の詳細は、米国特許
第3826364号に開示されている。本発明は、散乱
光、粒子容積、蛍光、または他の光学的パラメー
タを測定し、液体標本中の細胞等の同定または定
量化を行なう様々な型式の流動細胞測定装置また
は流動蛍光測定装置に有用である。本発明の光学
要素は、特に、上述した米国特許に記載された流
動細胞測定装置の改良に係るものである。

本発明の流動細胞測定装置の光エネルギーは、
レーザ等の光源１２から供給され、直線偏光され
た平行な単一波長または別の異なる波長による光
線が得られる。レーザではなく、水銀またはキセ
ノン灯等の広いスペクトル型アーク灯を光源１２
とし、光源１２の形成する励起光路１４に偏光手
段を設けてもよい。一般に、測定装置１０は、対
象とする粒子または細胞を含有する液体流に対し
て、光線を一点に集光するレンズ１５を備えてい
る。

本発明の流動細胞測定装置に内蔵したノズル１
８は、液体流１６中の細胞または粒子の流動の促
進を図るものである。この種のノズルの使用は周
知であり、例えば、米国特許第3826364号に記載
されている。ノズル１８は、液体流１６を構成す
るシース流体および細胞に対し、流体力学的に集
中した流動を行わせるものである。各細胞または
粒子が光線１４と液体流１６の交差する集光領域
２０を通過すると、これら細胞等によつて散乱さ
れた光が検知される。第１図に示した適当な光検
知器２１が位置決めされており、各細胞によつ
て、前方に散乱された光を検知することができ
る。以下蛍光および広角の散乱光と関係する構成
要素について説明するが、液体流１６中の粒子
は、適当な容器内に集めるか、または、流動細胞
測定装置が分類機能を備えるならば、別の容器に
分類し、集めることができる。

光源から光の照射によつて励起された細胞によ
つて発生する蛍光があれば、これも検知すること
ができる。同様に、前方向以外に、別の方向に散
乱された光も検知することができる。レーザ励起
による流動細胞測定装置においては、蛍光と広角
の散乱光との両方とも一般に、視軸が光線１４の
励起軸に対して90°であるような角度で集光され
る。第１図において、軸２４は、蛍光および広角
の散乱光を集光するための90°の視軸を示してい
る。このように、軸２４に沿つて進む光には、散
乱光および蛍光が含まれるものとして説明する。

蛍光および散乱光を90°の角度で集光するため
には、散乱光および蛍光の分離、または分岐を行
わなければならない。現在使用されている干渉フ
イルタに依らず、上記分岐を行なうため、本発明
では、ビームスプリツタ板２５を使用している。
このビームスプリツタ板２５は、散乱光および蛍
光の双方を90°の角度で受光し、これらを別の方
向に再度偏光させる作用を行なう。かかる散乱光
および蛍光の方向変更により、各散乱光および蛍
光は最初、90°の角度で放射されても、別々に集
光させることができる。

具体的には、ビームスプリツタ板２５は、蛍光
を透過し、散乱光を反射することを目的としてい
る。この目的のため、このビームスプリツタ板
は、軸２４に対し、斜めの角度となるように、軸
２４に沿つて位置決めしてある。通常、入射角と
称されるこの角度は、第２図において、角度Ｂと
して示してあり、軸２４と、ビームスプリツタ板
２５の表面２８に対し直角に伸長する線であるベ
クトル２６間の角度となる。本発明によつて最良
の効果を得るためには、角度Ｂは、45°以上とす
る必要がある。角度Ｂは、ビームスプリツタ板の
ブルースターの角とすることが望ましい。光学分
野にて周知のように、ブルースターの角とは、入
射面に対して平行に偏光された光の反射率が最小
となる入射角すなわち入射面に対し直角に偏光さ
れた光の反射率が最大となる入射角をいう。従つ
て、この入射角における反射ロスはほとんど、ま
たは全くない。さらに、ブルースターの角は、ビ
ームスプリツタ板２５の製造に採用する材料の係
数である。第２図に示すように、斜めに配向させ
た場合、散乱光および蛍光で構成され、軸２４に
沿つて進む光は、２つの光線に分岐される。両偏
光ベクトルで構成される蛍光は、ビームスプリツ
タ板２５によつて、効果的に透過され、矢印３０
で示す線に沿つて進む。他方、散乱光は、ブルー
スターの角における反射成分を備える偏光ベクト
ルによつてのみ構成され、従つて、矢印３１で示
してある。散乱光および蛍光は、一旦、分離され
たならば、各々、適当な光検知器によつて集光す
ることができる。

例えば、反射した散乱光は、第１図に示すよう
に、光検知器３２内に集光させることができる。
軸３０に沿つて進む、透過された蛍光を集光させ
る前に、蛍光信号は、さらに、純化させることが
できる。透過された蛍光が、多数の異なる色領域
を備える場合、干渉ミラー３４を用いて、異なる
色波長を分離することができる。このように、例
えば、緑色領域内の蛍光は、干渉ミラー３４によ
つて軸３５に沿つて、反射し、適当な光検知器３
６に集光させることができる。他方、赤色領域内
の蛍光は、干渉ミラー３４によつて軸３８に沿つ
て透過し、適当な光検知器３９に集光させること
ができる。第１図には図示していないが、当業者
は、各光検知器と共に、各種のレンズ、フイル
タ、バリヤー等を使用して、可能な限り純粋な信
号を得られることが了知されよう。光学的に純粋
な信号を得ることは、第１図に図示する如き、４
パラメータの検知装置（蛍光チヤネル２、散乱チ
ヤネル２）を使用する場合、特に、望ましいこと
である。

再度、第２図を参照すると、ビームスプリツタ
板２５の両面２８，２９を使用して、散乱光を反
射させ蛍光を透過させることがわかる。ビームス
プリツタ板の両面を効果的に使用し、それぞれ透
過および反射特性を得るためには、ビームスプリ
ツタ板２５は、薄厚で、非被覆の平板製とするこ
とが望ましい。例えば、厚み範囲１乃至２mmのビ
ームスプリツタ板が、本発明の場合、効果的であ
ることが確認されている。

特に、散乱光を反射し、また特に無偏光の蛍光
を透過させる能力を備えたビームスプリツタ板と
しては、様々な材料を選択することができるが、
一般に入手可能な低廉なガラスが最も望ましい材
料である。特に、Pyrexという商標で販売されて
いるホウケイ酸ガラスが本発明にとつて、最適で
あることが確認されている。ホウケイ酸ガラスの
薄厚、平坦な研磨片は、スプリツタに当たる無偏
光蛍光の略75％以上を透過させる能力のビームス
プリツタ板を提供することができる。このホウケ
イ酸ガラス製ビームスプリツタ板は、十分に検知
し得る信号の得られる量の散乱光を反射できる。
ホウケイ酸ガラスの場合、ブルースターの角は、
約56°となる。このため、ホウケイ酸ガラスを用
いて、ビームスプリツタ板２５を製造した場合、
本発明による効果を得るためには、第２図の角度
Ｂは、約56°とする必要があろう。

ビームスプリツタ板２５を軸２４に沿つて、配
向する角度は、一般に、蛍光の透過率と散乱光の
反射率の兼合いで決定される。蛍光が無偏光状態
にあると仮定した場合、第３図は蛍光の透過率お
よび散乱光の反射率をビームスプリツタの角度の
関数として示したものである。ビームスプリツタ
板の入射角が大きくなるにつれて、蛍光の透過効
率は低下し、散乱光の反射効率は増加する。故
に、最適な入射角を選択することは、蛍光のロス
と、散乱光のゲインの釣合いをとることである。
散乱光は蛍光よりもはるかに効率の高いプロセス
なので、Ｓ／Ｎ比の点で、蛍光の損失がおおむね
検知し得ない程度まで、大きな入射角とすべきで
ある。例えば、入射角45°から、ブルースターの
角（第３図にて約56°）まで増加させることによ
り、蛍光透過効率は、僅か約４％しか低下せず、
これは信号−ノイズの点で、おおむね気付かない
ほど僅かである。この場合、散乱光の反射効率
は、約60％増加する。例えば、ビームスプリツタ
板の角度を、さらに、65°まで大きくすると、蛍
光透過効率は、約11％低下し、蛍光感度の点で、
この辺から蛍光ロスが明らかになつてくる。故
に、ホウケイ酸ガラスに対するブルースターの角
において、本発明のビームスプリツタ板は、90°
のときの約88％の無偏光蛍光を透過させ、90°の
角度のときの約25％の散乱光を反射する。上記効
率は、蛍光および散乱光それぞれの信号を集める
際、極めて満足し得るものである。

上述した光検知器が散乱光および蛍光の信号を
受けたならば、その情報を、さらに、利用するこ
とができる。各種の光検知器は、光信号を電気イ
ンパルスに変換し、これによつて検知した光と装
置を通つて流動する細胞とを関係づけることので
きる周知の光電子増倍管または同様の装置とする
ことができる。光検知器からの電気信号は、一般
に、表示、記憶またはさらに処理する目的のた
め、電子装置（図示せず）に送られ、対象とする
細胞の１または複数の特性を判定することができ
る。

このように、本発明は、広角の散乱光および蛍
光の検知に、特に、有効な流動細胞測定装置用の
散乱光／蛍光スプリツタを提供するものである。
本発明のビームスプリツタは、ブルースターの角
等の広い入射角となるように配向した場合、特に
簡単、経済的で且つ軽量な光フイルタを提供する
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、細胞等の１または複数の特性を判定
する本発明による流動細胞測定装置の光学要素お
よび光路の好適実施態様を示す説明図、第２図
は、本発明の好適実施態様による斜めに配向させ
た散乱光／蛍光スプリツタの拡大図、および第３
図は、パラメータとして、90°の散乱光および蛍
光に対する、本発明のビームスプリツタの効率特
性を示す、グラフである。 （主要符号の説明） １０……流動細胞測定装
置、１２……光源、１４……光線、１６……液体
流、１８……ノズル、２０……集光領域、２１…
…光検知器、２２……容器、２４……軸、２５…
…ビームスプリツタ板、３２……光検知器、３４
……干渉ミラー、３５……軸、３６……光検知
器、３９……軸。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体流中の細胞を一度におおむね１つずつ動
   かす手段と、 前記液体流中の細胞に向けて平面偏光させた入
   射光を提供する手段と、 前記入射光の軸に対して略90°の角度で角細胞
   によつて散乱された光及び角細胞によつて発光せ
   しめられた蛍光に対して、略ブリユースターの角
   を形成するように傾斜せしめられ且つ偏光してい
   ない蛍光を透過し散乱光を反射する実質的に波長
   に依存しないビームスプリツタと、 前記ビームスプリツタによつて反射された散乱
   光を検知する散乱光検知手段と、 前記ビームスプリツタによつて透過された蛍光
   を検知する蛍光検知手段と、 前記散乱光検知手段及び前記蛍光検知手段の検
   知結果を用いて、前記細胞の１または複数の特性
   を判定する手段と、を備えることを特徴とする液
   体流中を流動する細胞の特性を判定する細胞測定
   装置。 ２ 前記照射光線を提供する手段が、コヒーレン
   トな光の光源であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載した流動細胞測定装置。 ３ 前記コヒーレントな光の光源がレーザである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載し
   た流動細胞測定装置。 ４ 前記ビームスプリツタが、そのビームスプリ
   ツタに当たる無偏光の蛍光の約75％以上を透過さ
   せることができることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載した流動細胞測定装置。 ５ 前記ビームスプリツタが、非被覆で且つ略平
   坦な研磨ガラス片であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載した流動細胞測定装置。 ６ 前記ビームスプリツタが珪硼酸ガラスで作ら
   れていることを特徴とする特許請求の範囲第５項
   に記載した流動細胞測定装置。 ７ 前記ビームスプリツタを入射散乱光及び蛍光
   に対して約56°の角度で配設したことを特徴とす
   る特許請求の範囲第６項に記載した流動細胞測定
   装置。 ８ 前記ビームスプリツタを入射散乱光及び蛍光
   に対して45°以上となるように配設したことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載した流動細
   胞測定装置。