DE69531515T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Messung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung - Google Patents

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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Substanzen durch Messen der zwischen und innerhalb von Molekülen übertragenen Energie zu identifizieren, und noch genauer, um kleine Mengen von Substanzen innerhalb lebender Zellen durch Messen von Energieübertragung aufzuspüren.
  • Energieübertragung durch Fluoreszenzresonanz (FRET) innerhalb eines oder zwischen zwei unterschiedlichen Arten von Molekülen, die stattfindet, wenn Energie von einem angeregten Fluorophor eines Donors unmittelbar auf den Fluorophor eines Akzeptors übertragen wird, ist ein nützliches Phänomen zum Untersuchen der Wesensart von Molekülen. Dieses Verfahren ist besonders nützlich für in-vitro-Messungen von kleinen Mengen von Substanzen und kann auf die Analyse von genetischer Information angewendet werden, um die Expression von Genen und Veränderungen in der Primärstruktur von DNA und RNA mit einem hohen Grad von Genauigkeit zu messen.
  • Als nächstes wird eine Erklärung für ein allgemeines Verfahren zum Messen der Energieübertragung von einem angeregten Fluorophor (Donor) auf einen Absorber (Akzeptor) geboten.
    • 1. Die Spektren, einschließlich der Veränderungen in den Spektren, der Fluoreszenz von Donor und Akzeptor werden gemessen.
    • 2. Es wird die Verringerung der Intensität der Fluoreszenz des Donors oder der Anstieg der Intensität der Fluoreszenz des Akzeptors gemessen.
    • 3. Die Geschwindigkeit, mit der die Intensität der Fluoreszenzintensität des Donors nach der Anregung durch einen Laserpuls abnimmt, (das heißt, die Fluoreszenzlebensdauer), wird gemessen.
  • Manchmal enthält die Probe jedoch zahlenmäßig mehr Moleküle, die nicht Energie emittieren (das heißt, freie Moleküle), als Moleküle die Energie emittieren, in welchem Fall eine Messung unter Verwendung dieses drei-Schritte-Verfahrens unmöglich ist. Dieses drei-Schritte-Verfahren ist auch nicht möglich, wenn die Dichte von Energie übertragenden Donoren oder Akzeptoren nicht bestimmt werden kann. Weil bei diesem drei-Schritte-Verfahren Fluoreszenz sowohl von Energie emittierenden wie auch von nicht Energie emittierenden Molekülen gemessen wird, ist die kennzeichnende Veränderung bei der Fluoreszenz, die sich aus der Energieübertragung ergibt, in der Fluoreszenz verborgen, die durch Moleküle erzeugt wird, die nicht Energie emittieren. Auch wenn der Anstieg der Fluoreszenzintensität beim Akzeptor in Schritt 2 gemessen wird, absorbiert der Akzeptor unmittelbar einen Teil des Anregungslichtes und fluoresziert mit einer Intensität, die im Vergleich mit der Intensität der Emission des Fluorophors des Akzeptors aus der Energieübertragung erheblich ist. Dies macht eine Bestimmung der ausschließlich durch Energieübertragung hervorgerufenen Fluoreszenz aus dem Fluorophor des Akzeptors unmöglich.
  • Larry E. Morrison beschreibt ein Verfahren zum Messen von Energieübertragung unter diesen Bedingungen (Analytical Biochemistry 174, S. 101–120, 1988). Seine Methode „verlangt die Auswahl der Fluorophor von Donor und Akzeptor derart, dass die Fluoreszenzlebensdauer des Donors größer als die Fluoreszenzlebensdauer des Akzeptors ist". Die von dem Akzeptor emittierte Fluoreszenz wird während einer vorbestimmten Zeitdauer, die von einem Gate (Zeitfenster-Steuerelement) zur Verzögerung eingestellt wird, nachdem der Fluorophor des Donors durch den Lichtpuls angeregt worden ist, gemessen. Durch dieses Vorgehen wird die von dem Akzeptor als ein Ergebnis der unmittelbaren Absorption des Anregungslichtes emittierte Fluoreszenz zeitlich von der Fluoreszenz getrennt, die von dem Akzeptor durch Energieübertragung emittiert wird. Die Messung der Energieübertragung wird verbessert, weil die von der Anregung durch Licht (das heißt nicht durch Energieübertragung) beigetragene Fluoreszenz des Akzeptors ausgesondert wird.
  • Roger Y. Tsein et al. beschreiben ein Verfahren, bei dem das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten des Donors und des Akzeptors, wenn sie von Annregungslicht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden, berechnet wird und aus den Ergebnissen ein Bild hergestellt wird (Trends in Cell Biology, Vol. 3, S. 242–245, 1993). Takatoku Oida et al., beschreiben eine zeitliche Analyse von Bildgebung (Biophys. J., Vol. 64, S. 676–685, 1993). Mit diesen beiden Verfahren kann die Fluoreszenz für jeden Fluorophor durch elektrisches Abtasten der Detektorsignale abgetrennt werden. Streuung von Licht oder Vermischung mit Licht, das nicht zur Zielfluoreszenz gehört, kann vermieden werden. Die Genauigkeit bei der Messung von Fluoreszenzintensität kann durch Unterschiede in der Länge der optischen Wege erhöht werden. Energieübertragung innerhalb gezüchteter Zellen kann unter einem Mikroskop gemessen werden.
  • Wenn jedoch die Menge freier Fluorophore von Donoren, die nicht Energie emittieren, groß wird, wird der Bereich langer Wellenlängen der Fluoreszenz des Donors weitgehend vermischt mit dem Bereich kurzer Wellenlängen der Fluoreszenz des Akzeptors, mit dem Ergebnis, dass die Fluoreszenz aus dem Donor und die aus dem Akzeptor nicht getrennt werden können. Aus diesen Gründen ist Energieübertragung in lebenden Proben, wie gezüchteten Zellen, besonders schwierig zu messen.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereit zu stellen, die das Messen von Energieübertragung gestattet, die nur bei einigen wenigen Molekülen erfolgt, sogar wenn Energieübertragung bei den meisten der Moleküle nicht erfolgt.
  • Demgemäss besteht die Erfindung in einem ersten Aspekt aus einem Verfahren zur Messung der Energieübertragung zwischen Fluorophoren von Donoren zur Übertragung von Energie und Fluorophoren von Akzeptoren zur Aufnahme der Energie, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der freien Fluorophore der Donoren länger ist als diejenige der freien Fluorophore der Akzeptoren, wobei die beiden Arten von Fluorophoren Fluoreszenz in verschiedenen Banden der Wellenlänge emittieren, die sich teilweise überlappen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von:
    Bestrahlen der Fluorophore der Donoren und der Fluorophore der Akzeptoren mit einem Puls von Anregungslicht, so dass die Fluorophore der Donoren und die Fluorophore der Akzeptoren Fluoreszenz emittieren, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren nach der Einstrahlung des Pulses des Anregungslichts in Übereinstimmung mit ihren Lebensdauern der Fluoreszenz mit der Zeit abfällt, wobei die Fluoreszenzintensitäten der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren nach jeweils ersten und zweiten Zeitpunkten Null erreichen, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren sich verändert, wenn Energieübertragung zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt, so dass die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren während der Energieübertragung in Übereinstimmung mit der veränderten Lebensdauer der Fluoreszenz abfällt, wobei die veränderte Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren nach einem dritten Zeitpunkt im Wesentlichen Null erreicht, der von dem ersten Zeitpunkt und dem zweiten Zeitpunkt verschieden ist, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Akzeptoren im Wesentlichen bei dem dritten Zeitpunkt Null erreicht, wenn Energieübertragung von den Fluorophoren der Donoren zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt;
    Aufteilen des emittierten Lichtes in einen ersten Wellenlängenbereich und einen davon verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich;
    Ausführen eines Schrittes der Messung der zeitlichen Änderung, in dem die Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich während eines ersten Zeitabschnitts gemessen wird, die Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich während eines zweiten Zeitabschnitts gemessen wird, die Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich während des ersten Zeitabschnitts gemessen wird und die Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich während des zweiten Zeitabschnitts gemessen wird; und
    Ermittlung von Information über die zwischen den Fluorophoren der Donoren und den Fluorophoren der Akzeptoren erzeugte Übertragung von Energie;
    dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Messung der zeitlichen Änderung den Schritt des Einstellens des ersten Zeitabschnitts zwischen dem ersten Zeitpunkt und dem dritten Zeitpunkt und des Einstellens des zweiten Zeitabschnitts zwischen dem dritten Zeitpunkt und dem zweiten Zeitpunkt umfasst,
    wobei der Schritt des Aufteilens der Wellenlänge den ersten Wellenlängenbereich nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren und den zweiten Wellenlängenbereich nicht nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Akzeptoren einstellt, sondern auch innerhalb einer vorbestimmten Menge eines Teils der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren, und
    der Schritt der Ermittlung von Information die Information über die Übertragung von Energie ausgehend von den gemessenen Intensitätsergebnissen in jedem der Wellenlängenbereiche über jeden der Zeiträume ermittelt.
  • Der Schritt des Aufteilens der Wellenlänge kann die emittierte Fluoreszenz in einen ersten Wellenlängenbereich und einen zweiten Wellenlängenbereich aufteilen, die voneinander verschieden sind. Der Meßschritt kann zeitliche Veränderungen in dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich der Fluoreszenz über einen ersten Zeitabschnitt und einen zweiten Zeitabschnitt, die voneinander verschieden sind, messen. Der Schritt der Bestimmung der Information über Übertragung von Energie kann die Information, ausgehend von der Fluoreszenz sowohl in dem ersten wie in dem zweiten Wellenlängenbereich, während sowohl des ersten wie des zweiten Zeitabschnitts, bestimmen.
  • Der Schritt der Ermittlung von Information zur Übertragung von Energie kann mit der Fluoreszenz während jedes Zeitabschnitts die folgende Formel berechnen: {(ID2/ID1) – (IA2/IA1) }/(ID2/ID1)
  • Worin ID1 die während des ersten Zeitraums erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich ist; ID2 die während des zweiten Zeitraums erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich ist; IA1 die während des ersten Zeitraums erhaltene Fluoreszenzintensität in dem zweiten Wellenlängenbereich ist; und IA2 die während des zweiten Zeitraums erhaltene Fluoreszenzintensität in dem zweiten Wellenlängenbereich ist.
  • In einem weiteren Aspekt besteht die Erfindung aus einem Gerät zum Messen der Energieübertragung zwischen Fluorophoren von Donoren zur Übertragung von Energie und Fluorophoren von Akzeptoren zur Aufnahme der Energie, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der freien Fluorophore der Donoren länger ist als diejenige der freien Fluorophore der Akzeptoren, wobei die beiden Arten von Fluorophoren Fluoreszenz in verschiedenen Banden der Wellenlänge emittieren, die sich teilweise überlappen, wobei das Gerät umfasst:
    eine Lichtquelle zum Bestrahlen der Fluorophore der Donoren und der Fluorophore der Akzeptoren mit einem Puls von Anregungslicht, so dass die Fluorophore der Donoren und die Fluorophore der Akzeptoren Fluoreszenz emittieren, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren nach der Einstrahlung des Pulses des Anregungslichts in Übereinstimmung mit ihren Lebensdauern der Fluoreszenz mit der Zeit abfällt, wobei die Fluoreszenzintensitäten der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren nach jeweils ersten und zweiten Zeitpunkten Null erreichen, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren sich verändert, wenn Energieübertragung zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt, so dass die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren während der Energieübertragung in Übereinstimmung mit der veränderten Lebensdauer der Fluoreszenz abfällt, wobei die veränderte Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren nach einem dritten Zeitpunkt im Wesentlichen Null erreicht, der von dem ersten Zeitpunkt und dem zweiten Zeitpunkt verschieden ist, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Akzeptoren im Wesentlichen bei dem dritten Zeitpunkt Null erreicht, wenn Übertragung von Energie von den Fluorophoren der Donoren zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt;
    einen Wellenlängenteiler zum Aufteilen des emittierten Lichtes in einen ersten Wellenlängenbereich und einen zweiten Wellenlängenbereich, die unterschiedlich voneinander sind;
    eine Messeinheit, eingerichtet zum Messen der Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich während eines ersten Zeitabschnitt, der Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich während eines zweiten Zeitabschnitts, der Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich während des ersten Zeitabschnitts und der Intensität der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich während des zweiten Zeitabschnitts; und
    eine Ermittlungseinheit, eingerichtet zum Ermitteln von Information über die zwischen den Fluorophoren der Donoren und den Fluorophoren der Akzeptoren stattfindende Übertragung von Energie,
    dadurch gekennzeichnet, dass die Messeinheit eingerichtet ist, den ersten Zeitabschnitt zwischen dem ersten Zeitpunkt und dem dritten Zeitpunkt einzustellen und ferner eingerichtet ist, den zweiten Zeitabschnitt zwischen dem dritten Zeitpunkt und dem zweiten Zeitpunkt einzustellen,
    der Wellenlängenteiler eingerichtet ist, den ersten Wellenlängenbereich nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren einzustellen und ferner eingerichtet ist, den zweiten Wellenlängenbereich nicht nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Akzeptoren einzustellen, sondern auch innerhalb einer vorbestimmten Menge eines Teils der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren, und
    die Bestimmungseinheit eingerichtet ist, die Information über die Übertragung von Energie ausgehend von den gemessenen Intensitätsergebnissen in jedem der Wellenlängenbereiche über jeden der Zeiträume zu ermitteln.
  • Das vorstehende und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch das Lesen der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform offensichtlicher werden, in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen, in denen:
  • 1 eine schematische Struktur des Gerätes zum Messen der Energieübertragung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
  • 2 eine Struktur eines ausführlichen Beispiels des Gerätes zum Messen der Energieübertragung der Ausführungsform zeigt;
  • 3 die Struktur eines konkreten Beispiels des Gerätes zum Messen der Energieübertragung der Ausführungsform zeigt;
  • 4 veranschaulicht, wie die Wellenlängenbereiche für das Fluoreszenzlicht von Donor und Akzeptor eingestellt werden;
  • 5(a) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität eines Fluorophors zeigt;
  • 5(b) einen Zeitablauf der Einstrahlung von Anregungslicht, um den Fluorophor zu veranlassen, die in 5(a) gezeigte Fluoreszenz zu emittieren, zeigt;
  • 5(c) einen Zeitablauf der Öffnung des Gates gemäß einem ersten Verfahren zeigt;
  • 5(d) einen Zeitablauf der Öffnung des Gates gemäß einem zweiten Verfahren zeigt;
  • 6(a) die chemische Formel von IEADANS zeigt;
  • 6(b) die chemische Formel von TRITC zeigt;
  • 7(a) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität eines freien Fluorophors eines Donors zeigt;
  • 7(b) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität eines freien Fluorophors eines Akzeptors zeigt;
  • 7(c) einen Zeitablauf der Einstrahlung von Anregungslicht zeigt, um den Fluorophor des freien Donors zu veranlassen, die in 7(a) gezeigte Fluoreszenz zu emittieren und den Fluorophor des freien Akzeptors zu veranlassen, die in 7(b) gezeigte Fluoreszenz zu emittieren;
  • 8 die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität einer Probe zeigt, die Fluorophore von freien Donoren und Fluorophore von freien Akzeptoren enthält;
  • 9(a) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität eines Wellenlängenbereiches ΓD der Fluoreszenz von 8 zeigt;
  • 9(b) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität eines Wellenlängenbereiches ΓA der Fluoreszenz von 8 zeigt;
  • 10 ein Schaltungsdiagramm eines Beispiels der Vorrichtung zum Berechnen für die Berechnung der Kenngröße Z ist;
  • 11(a) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓD des Fluorophors eines freien Donors zeigt;
  • 11(b) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓD des Fluorophors eines freien Akzeptors zeigt;
  • 11(c)die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓA des Fluorophors eines freien Donors zeigt;
  • 11(d) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintertsität in einem Wellenlängenbereich ΓA des Fluorophors eines freien Akzeptors zeigt;
  • 11(e) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓD des Fluorophors eines Donors zeigt, wenn Energieübertragung stattfindet;
  • 11(f) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓD des Fluorophors eines Akzeptors zeigt, wenn Energieübertragung stattfindet;
  • 11(g) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓA des Fluorophors eines Donors zeigt, wenn Energieübertragung stattfindet;
  • 11(h) die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität in einem Wellenlängenbereich ΓA des Fluorophors eines Akzeptors zeigt, wenn Energieübertragung stattfindet;
  • 12 die Beziehung zwischen der Kenngröße Z und dem Zeitabschnitt T1, für F/B und E* zeigt;
  • 13 die Beziehung zwischen der Kenngröße Z und dem Zeitabschnit T2, für F/B und E* zeigt;
  • 14 die Beziehung zwischen der Kenngröße Z und E* zeigt;
  • 15 zeigt, wie IEADANS in einer ersten Probe mit Streptoavidin markiert wird;
  • 16 zeigt, wie TRITC in einer ersten Probe mit Streptoavidin markiert wird;
  • 17 eine Struktur eines anderen ausführlichen Beispiels des Gerätes zum Messen der Energieübertragung der Ausführungsform zeigt; und
  • 18 veranschaulicht, wie Fluoreszenzbilder für die beiden Wellenlängenbereiche bei den beiden Zeitabschnitten getrennt werden, so dass sie auf ein bildaufnehmendes Gebiet der CCD-Kamera des Gerätes der 17 auftreffen.
  • Ein Verfahren und Gerät zum Messen der Übertragung von Energie durch Fluoreszenzresonanz gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen gleiche Teile und Bauelemente mit den selben Bezugsnummern bezeichnet sind, um eine verdoppelnde Beschreibung zu vermeiden.
  • Wie in 1 gezeigt, schließt eine Vorrichtung zum Messen der Energieübertragung gemäß der vorliegenden Erfindung ein: eine Quelle für Anregungslicht 40; einen Probenhalter 30; einen Wellenlängenteiler 20, wie ein Filter, ein Prisma, oder ein Beugungsgitter; einen Lichtdetektor 10 einschließlich eines Gates (Zeitfensters); einen Teil zur Datenverarbeitung 50; und einen Prozessor 60.
  • Die Quelle für Anregungslicht 40 ist dazu da, eine in dem Probenhalter 30 gelagerte Probe mit Anregungslicht zu bestrahlen. Die Quelle für Anregungslicht 40 kann ein Gaslaser sein, wie ein Stickstoff-, Helium-Neon- oder Argonionenlaser, ein Halbleiterlaser, oder eine Quelle für ultraviolettes Licht. Der Laser ist für die Lichtquelle vorzuziehen, und der Gaslaser ist noch bevorzugter, weil Laserlicht, vorzugsweise von einem Gaslaser erzeugt, im Hinblick auf die Fähigkeit zur Anregung und hinsichtlich der Intensität ein gutes Anregungslicht ergibt. Der Lichtdetektor 10 kann eine Photovervielfacher-Röhre, eine Avalanche-Photodiode, eine Streakröhre oder ein ladungsgekoppelter Speicher (CCD) sein.
  • FRET wird durch resonante Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen erzeugt: einem Energie liefernden Donormolekül und einem Energie- empfangenden Akzeptor. Sowohl das Donormolekül wie auch das Akzeptormolekül sind Licht emittierende Moleküle, wie fluoreszierende, phosphoreszierende und chemilumineszierende Moleküle, die Licht emittieren, wenn sie durch Anregungslicht angeregt werden. Das Donormolekül und das Akzeptormolekül weisen unterschiedliche Emissionslebensdauern auf. Energieübertragung kann stattfinden, wenn sich das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappt. Auch müssen der Donor und der Akzeptor sich innerhalb eines bestimmten Abstandes (zum Beispiel weniger als 8 nm) voneinander befinden. Vorzugsweise sind Donor/Akzeptor – Kombinationen, die mit diesem Verfahren verwendet werden können, fluoreszierende Donoren mit fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Akzeptoren, oder phosphoreszierende Donoren mit fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Akzeptoren.
  • Das Messgerät der vorliegenden Erfindung wird nachstehend beschrieben, mit Bezug auf ein Beispiel, bei dem die zu messende Probe zwei Fluorophore einschließt, die unterschiedliche Lebensdauern der Fluoreszenz aufweisen, wenn sie durch das Anregungslicht angeregt werden.
  • Bei Bestrahlung mit einem Anregungslicht erzeugte Fluoreszenz kann durch Verwendung des Wellenlängenteilers 20 in eine vorbestimmte Anzahl (zwei in der vorliegenden Ausführungsform) von verschiedenen Wellenlängen geteilt werden. Danach wird das aufgetrennte Licht durch den Lichtdetektor 10 gemessen. Die Messung durch den Lichtdetektor 10 wird durchgeführt, nachdem eine vorbestimmte Zeitdauer nach der Bestrahlung durch die Quelle für Anregungslicht 40 verflossen ist. Das heißt, wenn die Bestrahlung unter Verwendung eines Lichtpulses von der Quelle für Anregungslicht 40 durchgeführt wird, wird der Lichtdetektor 10 nach der Abklingkante des Lichtpulses aktiviert. Der zeitliche Abfall des Detektionssignals des Lichtdetektors 10 wird über mindestens zwei getrennte Zeitdauern ausgelesen und an den Datenverarbeitungsteil 50 gesendet. Detektionssignale können über zwei verschiedene Zeitabschnitte ausgelesen werden, indem das Gate (Zeitfenster) des Lichtdetektors 10 während der Zeitabschnitte geöffnet wird. Der Prozessor 60 steuert den Betrieb der Quelle für Anregungslicht 40 und den Lichtdetektor 10 und die Arbeitsabläufe des Datenverarbeitungsteil 50.
  • Der Lichtdetektor 10 muss jedoch nicht mit Gates versehen sein. Zum Beispiel könnte der Lichtdetektor 10 fortlaufend Detektionssignale an den Datenverarbeitungsteil 50 ausgeben, und der Verarbeitungsteil 50 so betrieben werden, dass er die Detektionssignale nach Zeitabschnitten aufteilt. Jedoch sollten die Zeiteinstellung der Einstrahlung des Anregungslichtes und die beiden Zeitdauern der Aufnahme von Detektionssignal innerhalb eines sehr kurzen Zeitabschnitts, relativ zu der Ansprechgeschwindigkeit des Datenverarbeitungsteils 50, eingestellt werden. Demgemäss ist es wünschenswert, die beiden Zeitabschnitte unmittelbar über den Lichtdetektor 10 einzustellen.
  • Die Kombination des Wellenlängenteilers 20 und des Lichtdetektors 10 dient dazu, von der angeregten Probe emittiertes Licht in zwei getrennte Wellenlängen und in zwei getrennte Zeitabschnitte aufzutrennen, um so Daten über vier getrennte physikalische Werte zu erhalten. Die Daten können dann durch den Datenverarbeitungsteil 50 in einer später zu beschreibenden Weise verarbeitet werden, um das Vorhandensein von Energieübertragung, die Bedingungen der Energieübertragung und die anderen Informationen zu bestimmen.
  • 2 zeigt ein Beispiel in mehr Einzelheiten des in 1 gezeigten Gerätes zum Messen von Energieübertragung 1. Die in dem Probenhalter 30 gehaltene Probe SM enthält in diesem Beispiel Fluorophore von Donoren und Akzeptoren. Die Lichtquelle 40 schließt einen Gaslaser 40a und eine Laserpuls-Antriebsschaltung 40a ein, die dazu da ist, den Laser gepulst zu betreiben. Die Probe SM emittiert Fluoreszenz bei Bestrahlung durch Licht aus dem Gaslaser 40a. Weil die Probe fluoreszierende Moleküle sowohl des Donors wie auch des Akzeptors einschließt, erstrecken sich die Wellenlängen der Fluoreszenz aus der Probe über einen Wellenlängenbereich ΓD von Licht, das von dem angeregten Donor emittiert wird, und einen Wellenlängenbereich ΓA von Licht, das von dem Akzeptor emittiert wird. Ein Transmissionsfilter 201, mit einem Transmissionsgebiet entsprechend dem Wellenlängenbereich ΓD, und ein Transmissionsfilter 202 mit einem Transmissionsgebiet entsprechend dem Wellenlängenbereich ΓA, dienen als der Wellenlängenteiler 20. Die erzeugte Fluoreszenz wird deshalb in zwei verschiedene Wellenlängenbereiche aufgeteilt, wenn sie durch diese Filter 201 und 202 hindurchgeschickt wird.
  • Fluoreszenz bei den Wellenlängenbereichen ΓD und ΓA wird den Bildverstärkern (B. V.) 101a beziehungsweise 101b eingegeben. Jeder der Bildverstärker 101a und 101b ist eine An von Photovervielfacherröhre, um die Energie des eingegebenen Lichtes in Elektronen umzuwandeln, während die flächige oder räumliche Verteilung (das heißt, ein Bild) des Lichtes beibehalten wird. Jeder Bildverstärker schließt eine Photokathode und eine Mehrkanalplatte (MCP) ein. Die anregungsinduzierte Fluoreszenz fällt auf die Photokathode und wird in Elektronen umgewandelt. Die Elektronen werden dann in der MCP vervielfacht. Die MCP fungiert als ein Gate zum Vervielfachen dieser Elektronen nur, wenn sie mit einer Antriebsspannung betrieben wird. Die vervielfachten Elektronen werden auf einen fluoreszierenden Stoff eingestrahlt, der an der Ausgabeoberfläche des Bildverstärkers untergebracht ist, wo sie in Fluoreszenz (das heißt, ein Fluoreszenzbild) umgewandelt werden.
  • Die auf diese Weise von den Bildverstärkern 101a und 101b ausgegebenen Fluoreszenzbilder werden von den CCD-Kameras 102a beziehungsweise 102b aufgenommen. Die CCD-Kameras 102a und 102b werden beide auf eine Temperatur von –40°C vorgekühlt. Nachdem der Gaslaser 40a einen Puls von Anregungslicht ausgegeben hat, gibt die Schaltung zum Steuern des Gates 60a ein Steuerimpulssignal gleichzeitig an beide Bildverstärker 101a und 101b ab. Die Bildverstärker 101a und 101b geben Signale (das heißt Fluoreszenzbilder) nur während der vorbestimmten Zeitdauer ab, während derer ihnen Steuerimpulssignale eingegeben werden. Die Steuerimpulssignale werden so eingestellt, dass die Bildverstärker 101a und 101b während eines ersten Zeitabschnittes T1 und eines zweiten Zeitabschnittes T2 ausgeben, bevor der Fluoreszenzabfall der Probe vollständig ist. Die CCD-Kameras 102a und 102b erhalten Bilder, die die Intensität der während der beiden Zeiträume emittierten Fluoreszenz abbilden.
  • Auf die Fluoreszenzintensität jedes Bildpunktes (Pixels) der CCD-Kameras 102a und 102b, integriert über jeden Zeitraum, wird hierin nachfolgend als die Pixel-Fluoreszenzintensität Bezug genommen. Auf den räumlich integrierten Wert der Pixel-Fluoreszenzintensitäten aller Bildpunkte von jeder CCD-Kamera wird als gesamte Fluoreszenzintensität Bezug genommen.
  • Die von den CCD-Kameras 102a und 102b während des ersten Zeitraumes T1 und des zweiten Zeitraumes T2 ausgegebenen Signalspannungen werden nacheinander durch die Analog/Digital – Umwandler (A/D – Umwandler) 501a beziehungsweise 501b in digitale Signale umgewandelt und in den Rahmenspeichern 50a beziehungsweise 50b gesammelt. Als ein Ergebnis werden die Pixel-Fluoreszenzintensitäten während der Zeiträume T1 und T2 in den Wellenlängenbereichen ΓD und ΓA in den Rahmenspeichern 50a beziehungsweise 50b erhalten. Die Vorrichtung zum Berechnen 50c berechnet dann die gesamte Fluoreszenzintensität für jeden Wellenlängenbereich, indem sie die Pixel-Fluoreszenzintensitäten in jedem Zeitraum räumlich integriert. Auf die gesamte Fluoreszenzintensität im Wellenlängenbereich ΓD während des ersten Zeitraums T1 wird hierin nachfolgend als Fluoreszenzintensität ID1 Bezug genommen. Auf die gesamte Fluoreszenzintensität im Wellenlängenbereich ΓD während des zweiten Zeitraums T2 wird hierin nachfolgend als Fluoreszenzintensität ID2 Bezug genommen. Auf die gesamte Fluoreszenzintensität im Wellenlängenbereich ΓA während des ersten Zeitraums T1 wird hierin nachfolgend als Fluoreszenzintensität IA1 Bezug genommen. Auf die gesamte Fluoreszenzintensität im Wellenlängenbereich ΓA während des zweiten Zeitraums T2 wird hierin nachfolgend als Fluoreszenzintensität IA2 Bezug genommen. Information über Energieübertragung kann ausgehend von den Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1, IA2 berechnet werden, wie später beschrieben wird. Die Fluoreszenzintensitäten und die berechnete Information über Energieübertragung werden zu der Steuervorrichtung 60b gesendet, so dass sie an die CRT (Kathodenstrahlröhre) 70 ausgegeben werden können, die als externe Ausgabevorrichtung dient.
  • 3 zeigt ein konkretes Beispiel des in 2 gezeigten Gerätes. Von dem Gaslaser 40a emittiertes kohärentes Anregungslicht wird von einem planaren Spiegel 101 wegreflektiert, durchläuft ein Anregungs-Transmissionsfilter 30b und ein Probenhalterungsglas 30a und bestrahlt die auf dem Glas 30a aufgebrachte Probe SM. Die von der Probe SM emittierte Fluoreszenz wird von einem Mikroskop MS gebündelt, so dass sie auf einen Halbspiegel 100 auftrifft. Der Halbspiegel 100 trennt das auftreffende Licht in zwei Teile. Ein Teil durchläuft den Halbspiegel 100, so dass er auf das Transmissionsfilter 201 für den Wellenlängenbereich ΓD des Donors auftrifft. Der andere Teil wird von dem Halbspiegel 100 wegreflektiert, so dass er auf das Transmissionsfilter 202 für den Wellenlängenbereich ΓA des Akzeptors auftrifft. Die gleichen Vorgänge, die mit Bezugnahme auf das in 2 gezeigte Gerät beschrieben wurden, werden mit der Fluoreszenz durchgeführt, die die Transmissionsfilter 201 und 202 durchläuft, woraufhin die sich ergebenden Fluoreszenzintensitäten und die Information über Energietransfer auf der CRT 70 angezeigt werden.
  • Das Transmissionsfilter für Anregungslicht 30b ist dazu da, den Durchlass von Anregungslicht in dem Wellenlängenbereich zu gestatten, der für die Anregung des Donors notwendig ist, und um Durchlass von Hintergrundlicht zu verhindern. Das Mikroskop MS schließt Objektivlinsen OL1 und OL2 ein, die sich auf der Probenseite des Mikroskops befinden, und Okularlinsen CL1 und CL2, die sich auf der Seite der Filter (das heißt 201 und 202) des Mikroskops befinden.
  • Das Gerät zum Messen der Energieübertragung ist in einem Licht ausschließenden Gehäuse VE untergebracht, um zu verhindern, dass externes Licht auf die Probe, die CCD-Kameras 102a und 102b und dergleichen auftreffend wird. Dies gestattet die Ermittlung der Energieübertragung mit größerer Genauigkeit.
  • Nachstehend wird eine Erklärung eines Verfahrens zur Bestimmung des Wellenlängenbereiches ΓD des Donors und des Wellenlängenbereiches ΓA des Akzeptors gegeben, in welche die Transmissionsfilter 201 und 202 die Fluoreszenz aufteilen.
  • Der in 4 gezeigte Graph zeigt die spektrale Charakteristik (das heißt die Beziehung zwischen Wellenlänge und Intensität) der von fluoreszierenden Molekülen emittierten Fluoreszenz an. Die durchgezogene Linie steht für Veränderungen in der Fluoreszenz aus dem Donor und die gestrichelte Linie steht für Veränderungen in der Fluoreszenz aus dem Akzeptor. Der Wellenlängenbereich des Donors ΓD ist als sich von der Wellenlänge λ1 bis zur Wellenlänge λ2 erstreckend definiert, und der Wellenlängenbereich des Akzeptors ΓA ist als sich von der Wellenlänge λ3 an aufwärts erstreckend definiert. Die Wellenlänge λ2 des Wellenlängenbereiches des Donors ΓD wird unterhalb der ansteigenden Kante des Fluoreszenzspektrums des Akzeptors eingestellt. Die Wellenlänge λ3 wird so eingestellt, dass fünf Prozent des langwelligen Teils der Fluoreszenz des Donors in den Wellenlängenbereich des Akzeptors ΓA hineingemischt werden. Weil die spektralen Charakteristiken der jeweiligen Arten von Fluorophoren bekannt sind, können die Werte λ1, λ2 und λ3 (das heißt ΓA und ΓD) für die jeweiligen Fluorophore festgelegt werden.
  • Nachstehend wird eine Erklärung eines Verfahrens zum Bestimmen der zeitlichen Abfolge der Öffnungszeiten des Gates mittels der Bildverstärker 101a und 101b gegeben, das heißt zum Bestimmen der Zeiträume T1 und T2.
  • Angenommen, dass die Probe einige freie Fluorophore (zum Beispiel freien Donor) mit einer spezifischen Fluoreszenzlebensdauer τF enthält. Wenn die sowohl in 2 wie 3 gezeigte Steuervorrichtung 60b das in 5(b) gezeigte Taktsignal in die Schaltung 40b zum Pulsbetreiben des Lasers eingibt, emittieren die angeregten Fluorophore in der Probe SM Fluoreszenz mit Intensitäten, die mit der Zeit abfallen, wie in 5(a) gezeigt.
  • Die Fluoreszenzintensitäten der Fluoreszenz während des ersten Zeitraums T1 und während des zweiten Zeitraums T2 werden erhalten, indem während der beiden Zeiträume T1 und T2 nach jedem in 5(b) gezeigten Puls des Anregungslichtes eine Spannung an die MCP's der Bildverstärker 101a und 101b angelegt wird. Der zeitliche Ablauf dieses Arbeitsvorgangs wird in 5(c) gezeigt, und es wird auf ihn als das Gate-Verfahren A Bezug genommen.
  • Um das Signal/Rausch – Verhältnis der CCD-Kameras 102a und 102b zu verbessern, können die von den Bildverstärkern 101a und 101b ausgegebenen Lichtbilder aufgenommen werden, während die CCD-Kameras 102a und 102b in einem langsamen Abtastdurchlauf betrieben werden. Dies verlängert jedoch die Zeit, die die CCD-Kameras 102a und 102b benötigen, um einen Rahmen abzutasten. Deshalb ist es wünschenswert, wie in 5(d) gezeigt, während einem der Zeiträume (in diesem Beispiel dem ersten Zeitraum T1) nach dem ersten Puls von Anregungslicht Spannung an die MCP's der Bildverstärker 101a und 101b zu legen. Dann wird, nach dem zweiten Puls von Anregungslicht, Spannung an die MCP's der Bildverstärker 101a und 101b während des anderen Zeitraums (in diesem Beispiel dem zweiten Zeitraum T2) gelegt. Auf dies wird als das Gate-Verfahren B Bezug genommen.
  • Das Signal/Rausch – Verhältnis kann weiter verbessert werden, indem in wiederholter Weise die Pixel-Fluoreszenzintensität während der vorbestimmten Zeiträume T1 und T2 abgetastet wird, unter Verwendung entweder des Gate-Verfahrens A oder B, und indem die Pixel-Fluoreszenz aufgespeichert wird, um die gesamte Fluoreszenzintensität zu erhalten.
  • Konkrete Werte des ersten Zeitraums T1 und des zweiten Zeitraums T2 sollten gemäß den Fluoreszenzlebensdauern τ der Fluorophore eingestellt werden, die mit dem Detektor für Energieübertragung 1 gemessen werden sollen.
  • Nachstehend wird ein Verfahren zum Bestimmen der Werte T1 und T2 beschrieben, mit Bezug auf eine Probe zur Verwendung von IEADANS (gezeigt in 6(a)) als Donor und TRITC (gezeigt in 6(b)) als Akzeptor. Es ist bekannt, dass IEADANS (Donor) unter Bedingungen, wo kein TRITC (Akzeptor) in der Nähe von IEADANS vorhanden ist, das heißt wenn IEADANS frei ist, eine Fluoreszenzlebensdauer τF-D von 15,0 ns hat. Es ist ebenso bekannt, dass TRITC, wenn es frei ist, das heißt unter Bedingungen, wo kein IEADANS in der Nähe von TRITC vorhanden ist, eine Fluoreszenzlebensdauer τF-A von 1,5 ns hat. Weil die Fluoreszenzlebensdauer von IEADANS (Donor) länger als die von TRITC ist, sind sie dazu geeignet, mit dem Gerät der vorliegenden Erfindung gemessen zu werden.
  • Der erste Zeitraum T1 und der zweite Zeitraum T2 sollten wie in 7 gezeigt eingestellt werden, wenn die Probe diese freien Donor- und freien Akzeptormoleküle enthält. Es wird angemerkt, dass die Werte entlang der vertikalen Achse von 7 logarithmisch ausgedrückt sind. Wenn diese Probe mit dem in 7(c)gezeigten Puls von Anregungslicht bestrahlt wird, emittiert der freie Donor Fluoreszenz während einer Zeit wie in 7(a) gezeigt, und der freie Akzeptor emittiert Fluoreszenz während einer Zeit wie in 7(b) gezeigt. Wie man in den 7(a) und 7(b) sehen kann, fällt die Fluoreszenz sowohl aus dem freien Donor wie aus dem freien Akzeptor mit dem Lauf der Zeit ab, bis die Fluoreszenz aus dem freien Akzeptor an dem Zeitpunkt tF-A-end eine Intensität von Null erreicht und die Fluoreszenz aus dem freien Donor an dem Zeitpunkt tF-D-end eine Intensität von Null erreicht. Der erste Zeitraum T1 wird so eingestellt, dass er nach dem Zeitpunkt tF-A-end beginnt, und der zweite Zeitraum T2 wird so eingestellt, dass er nach dem ersten Zeitraum T1 beginnt und vor dem Zeitpunkt tF-D-end endet.
  • 8 zeigt zeitliche Veränderungen in der Intensität der von der Probe, die sowohl den Donor wie den Akzeptor enthält, insgesamt erzeugten Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensität wird für den ersten Zeitraum T1 und den zweiten Zeitraum T2, wie durch den schraffierten Teil des Graphen in 8 angezeigt, bestimmt. In dem Gerät der vorliegenden Erfindung wird die Fluoreszenz in Licht verschiedener Wellenlängen aufgeteilt, wenn sie die Transmissionsfilter 201 und 202 durchläuft. Wie in 9 gezeigt, wird die Fluoreszenz des Wellenlängenbereiches des Donors (9(a)) und des Wellenlängenbereiches des Akzeptors (9(b)) in die Bildverstärker 101a beziehungsweise 101b eingegeben, wo sie vervielfacht wird. Durch Integrieren der Fluoreszenz über den ersten Zeitraum T1 und den zweiten Zeitraum T2 können die Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2, angezeigt durch die schraffierten Teile der 9(a) und 9(b), gemessen und berechnet werden.
  • Wenn die Probe nicht nur freie Donoren und freie Akzeptoren, sondern auch Donoren und Akzeptoren unter Bedingungen der Energieübertragung enthält, verändern sich die in 8 und 9 gezeigten zeitlichen Veränderungen der Fluoreszenzintensitäten, und die Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2 während der Zeiträume T1 und T2 verändern sich ebenfalls. Auf diese Weise kann Detektion dieser Intensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2 Information über Energieübertragung bereitstellen, die in der Probe stattfindet.
  • Die Art und Weise, mit der Information über Energieübertragung erhalten wird, wird gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • Die Information bezüglich des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Energieübertragung und/oder der Menge an Energieübertragung wird aus den Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2 durch die nachstehend beschriebene Berechnung erhalten.
  • Zuerst wird unter Verwendung der folgenden Formel 1 eine Kenngröße Z der Fluoreszenzintensität berechnet: Z = { (ID2/ID1) – (IA2/IA1) }/(ID2/ID1) (Formel 1)
  • Ein Verfahren zur Durchführung dieser Berechnung ist, dies mit einer Vorrichtung zum Berechnen 50c mit der in 10 gezeigten Schaltung zu tun. Die Kenngröße Z wird berechnet, indem zuerst die Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1, IA2 in diese Struktur eingegeben werden, die drei Dividierschaltungen 501c, 502c und 504c und eine Subtrahierschaltung 503c einschließt. Die von dieser Schaltung ausgegebene Kenngröße Z wird dann der Schaltung zum Bestimmen 505c eingegeben, wo entschieden wird, ob die Kenngröße Z größer ist als der Schwellwert Z0. Ist das der Fall, wird bestimmt, dass Energieübertragung in der Probe stattgefunden hat. Wenn die Kenngröße Z für kleiner als der Schwellwert Z0 befunden wurde, dann wird bestimmt, dass Energieübertragung nicht stattgefunden hat.
  • Der Schwellwert Z0 wird ausgehend von verschiedenen, vorher bekannten Informationen über Energieübertragung in der Probe festgelegt, wie den ersten Zeitraum T1; den zweiten Zeitraum T2; die Wellenlängen λ1, λ2, und λ3; die Fluoreszenzlebensdauern τF-D und τF-A von Donor und Akzeptor unter freien Bedingungen; das Verhältnis ND/NA zwischen der Anzahl von Donormolekülen und der Anzahl von Akzeptormolekülen in der Probe; das Verhältnis F/B zwischen der Anzahl von Donormolekülen unter freien Bedingungen und der Anzahl von Donormolekülen unter Bedingungen der Energieübertragung; und der Wirkungsgrad der Energieübertragung E*, definiert durch eine Gleichung E* = 1 – (τF-DA/τF-D), wobei τF-DA die Fluoreszenzlebensdauer des Donors unter Bedingungen der Energieübertragung ist. Es wird angemerkt, dass der Wirkungsgrad der Energieübertragung E* von der sechsten Potenz r6 des Abstandes r zwischen Donor und Akzeptor abhängt.
  • Die Beziehung zwischen den vorstehend aufgeführten Werten T1, T2, λ1, λ2, λ3, τF-D, τF-A, ND/NA, F/B und E*; und den Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2 (das heißt der Kenngröße Z) wird nachstehend beschrieben.
  • 11(a) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Ia (t) des Wellenlängenbereiches ΓD des Donors, die von freiem Donor emittiert wird, wenn das Anregungslicht zum Zeitpunkt t0 eingestrahlt wird. 11(b) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Ib (t) des Wellenlängenbereiches ΓD des Donors, die von freiem Akzeptor emittiert wird, wenn das Anregungslicht zum Zeitpunkt t0 eingestrahlt wird. 11(c) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Ic (t) des Wellenlängenbereiches ΓA des Akzeptors, die von freiem Donor emittiert wird, wenn das Anregungslicht zum Zeitpunkt t0 eingestrahlt wird. 11(d) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Id (t) des Wellenlängenbereiches ΓA des Akzeptors, die von freiem Akzeptor emittiert wird, wenn das Anregungslicht zum Zeitpunkt t0 eingestrahlt wird.
  • Wie aus den Abbildungen ersichtlich, fällt die Fluoreszenz sowohl aus dem freien Donor wie aus dem freien Akzeptor mit dem Lauf der Zeit ab, bis die Fluoreszenz aus dem freien Akzeptor an dem Zeitpunkt τF-A-end eine Intensität von Null erreicht und die Fluoreszenz aus dem freien Donor an dem Zeitpunkt τF-D-end eine Intensität von Null erreicht. Der zeitliche Abfall jeder dieser Intensitäten kann unter Verwendung der folgenden Formeln 2 bis 5 ausgedrückt werden: Ia (t) = A exp (–t/τF-D) (Formel 2) Ib (t) = 0 (Formel 3) Ic (t) = C exp (–t/τF-D) (Formel 4) Id (t) = D exp (–t/τF-A) (Formel 5)wobei A, C und D Konstanten sind.
  • Es wird angemerkt, dass wenn τF-D, τF-D-end, τF-A oder τF-A-end unbekannt sind, sie mit dem Messgerät der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Die Probe einschließlich des freien Donors wird in das Gerät gesetzt und der Abfall der Fluoreszenzintensität aus dem freien Donor wird ermittelt. In gleicher Weise wird die Probe einschließlich des freien Akzeptors in das Gerät gesetzt und der Abfall der Fluoreszenzintensität aus dem freien Akzeptor wird ermittelt. Ausgehend von diesen ermittelten Ergebnissen werden die Fluoreszenzlebensdauern τF-D und τF-A und die Zeitpunkte der Beendigung des Fluoreszenzabfalls τF-D-end und τF-A-end unter freien Bedingungen berechnet.
  • Energieübertragung findet statt, wenn der Donor und der Akzeptor angeregt werden, wenn sie in der Probe in enger Nachbarschaft, innerhalb von etwa 8 nm zueinander, vorhanden sind. Wenn Energieübertragung stattfindet, werden sich die zeitlichen Veränderungen der Fluoreszenz aus Donor und Akzeptor ändern.
  • 11(e) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Ie (t) des Wellenlängenbereiches ΓD des Donors, die von Energie übertragendem Donor emittiert wird. 11(f) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität If (t) des Wellenlängenbereiches ΓD des Donors, die von an Energieübertragung teilnehmendem Akzeptor emittiert wird. 11(g) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Ig (t) des Wellenlängenbereiches ΓA des Akzeptors, die von Energie übertragendem Donor emittiert wird. 11(h) zeigt zeitliche Veränderungen der Fluoreszenzintensität Ih (t) des Wellenlängenbereiches ΓA des Akzeptors, die von an Energieübertragung teilnehmendem Akzeptor emittiert wird.
  • Auf diese Weise fällt die Fluoreszenz sowohl aus dem Donor wie aus dem Akzeptor, zwischen denen Energieübertragung stattfindet, mit dem Lauf der Zeit ab, bis die Fluoreszenz sowohl aus dem Donor wie auch dem Akzeptor an dem Zeitpunkt tE-DA- end eine Intensität von Null erreicht. Es ist aus diesen Abbildungen ersichtlich, dass wenn Energieübertragung vom Donor zum Akzeptor erfolgt, die Menge an Zeit, die benötigt wird, bis die Fluoreszenzintensität des Donors eine Intensität von Null erreicht, abnimmt, und die Menge an Zeit, die benötigt wird, bis die Fluoreszenzintensität des Akzeptors eine Intensität von Null erreicht, zunimmt.
  • Der Abfall jeder dieser Intensitäten über die Zeit t kann unter Verwendung der folgenden Formeln 6 bis 9 ausgedrückt werden: Ie (t) = E exp (–t/τE-DA) Formel 6 If (t) = 0 Formel 7 Ig (t) = G exp (–t/τE-DA) Formel 8 Ih (t) = H1Id (t) + H2Ie (t) Formel 9
  • Wobei E, G, H1 und H2 Konstanten sind, und τE-DA die Fluoreszenzlebensdauer des Energie übertragenden Donors ist.
  • Es ist ersichtlich, dass Energieübertragung die Fluoreszenzlebensdauer des Donors verkürzt. Mit anderen Worten, die Fluoreszenzlebensdauer des Donors τE-DA unter Bedingungen der Energieübertragung ist kürzer als die Lebensdauer τF-D unter freien Bedingungen.
  • Es wird angemerkt, dass wenn τE-DA oder τE-DA-end unbekannt sind, sie ebenfalls mit dem Messgerät der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Die Probe einschließlich des Donors und des Akzeptors unter den Bedingungen der Energieübertragung wird in das Gerät gesetzt und der Abfall der Fluoreszenzintensität aus dem Donor und dem Akzeptor wird ermittelt. Ausgehend von diesen ermittelten Ergebnissen werden die Fluoreszenzlebensdauer τE-DA und die Zeitpunkte der Beendigung des Fluoreszenzabfalls τE-DA-end unter den Bedingungen der Energieübertragung berechnet.
  • Im Allgemeinen enthält die zu messende Probe freien Donor, freien Akzeptor und Donor und Akzeptor, bei denen Energieübertragung erfolgt. In diesem Fall wird die in den 1(e)–1(h) gezeigte Fluoreszenz aus Donor und Akzeptor, die durch Energieübertragung verursacht ist, zusätzlich zu der in 1(a)–1(d) gezeigten Fluoreszenz aus dem freien Donor und dem freien Akzeptor beobachtet.
  • Um die auf diese Weise in der Probe stattfindende Energieübertragung zu messen, wird deshalb, wie in den 11(a) bis (h) gezeigt, der erste Zeitraum T1 so eingestellt, dass er nach dem Zeitpunkt τF-A-end beginnt und vor dem Zeitpunkt tE-DA- end endet (das heißt, tF-A-end < T1 < tE-DA-end), und der zweite Zeitraum T2 wird so eingestellt, dass er nach dem Zeitpunkt tE-DA-end beginnt und vor dem Zeitpunkt tF-D- end endet (das heißt, tE-DA-end < T2 < tF-D-end). Mit anderen Worten erfüllen die Zeiteinstellungen t1 und t2, die die Zeitdauer T1 zwischen ihnen definieren, und die Zeiteinstellungen t3 und t4, die die Zeitdauer T2 zwischen ihnen definieren, die folgenden Ungleichungen: tF-A-end < t1, t2 < tE-DA-end, tE-DA-end < t3 und t4 < tF-D-end. Diese Einstellungen der Zeiträume bewirken, dass die von dem Energie übertragenden Donor emittierte Fluoreszenz während des zweiten Zeitraums T2 in dem Wellenlängenbereich ΓD oder dem Wellenlängenbereich ΓA nicht beobachtet wird (11(e) und (g)). Diese Einstellungen der Zeiträume bewirken auch, dass die von dem Energie aufnehmenden Akzeptor emittierte Fluoreszenz während des ersten Zeitraums T1 in dem Wellenlängenbereich ΓA beobachtet wird (11(h)).
  • Es wird angemerkt, dass weil die Fluoreszenzlebensdauern τF-D, τF-A und τF-DA und die Zeitpunkte der Beendigung des Abfalls τF-A-end, τE-DA-end und τF-D-end bekannt oder mittels des Gerätes der vorliegenden Erfindung gemessen sind, die Zeiträume T1 und T2 leicht bestimmt werden können. Wenn zum Beispiel die vorstehend beschriebenen IEADANS und TRITC als der Donor und der Akzeptor verwendet werden, kann bestimmt werden, dass T1 zwischen 9 und 12 ns eingestellt wird und T2 zwischen 21 und 27 ns eingestellt wird. Mit anderen Worten gilt t1 = 9 ns, t2 = 12 ns, t3 = 21 ns und t4 = 27 ns, wenn t0 (Zeiteinstellung der Anregungseinstrahlung) = 0 ns ist.
  • Beruhend auf diesen Einstellungen der Zeiträume haben die Werte ID1, ID2, IA1 und IA2 die folgenden Beziehungen mit den Werten T1, T2, λ1, λ2, λ3, τF-D, τF-A, ND/NA, F/B und E* E* = 1 – (τF-DA/τF-D) (Formel 10) ∫t=∞ (Ia(t))dt × 5% = ∫t=∞ (Ic (t)) dt (Formel 11) F B = ∫t=∞ (Ia (t)) dt/∫t=∞ (Ie (t)) dt (Formel 12) F/B = ∫t=∞ (Ic (t)) dt/∫t=∞ (Ig (t)) dt (Formel 13) F/B = ∫t=∞ (Ia (t)) dt/∫t=∞ (Ih (t)) dt (Formel 14) ND/NA = 1 (zum Beispiel) (Formel 15) ID1 = ∫T1 (Ia (t) dt + ∫T1 (Ie (t) dt (Formel 16) ID2 = ∫T2 (Ia (t)) dt + ∫T2 (Ie (t)) dt (Formel 17) IA1 = ∫T1 (Ic (t)) dt + ∫T1 (Id (t)) dt + ∫T1 (Ig (t)) dt + ∫T1 (Ih (t)) dt (Formel 18) IA2 = ∫T2 (Ic (t)) dt + ∫T2(Id (t)) dt + ∫T2 (Ig (t)) dt + ∫T2 (Ih (t)) dt (Formel 19)
  • Wobei jeder der Werte ∫T2 (Ia(t))dt, (Ih(t))dt ∫T1 (Id (t)) dt, ∫T2 (Id (t)) dt, ∫T2 (Ig (t)) dt und ∫T2 beinahe gleich Null ist.
  • Weil die Kenngröße Z gemäß der Formel 1 durch die Werte ID1, ID2, IA1 und IA2, definiert ist, hat die Kenngröße Z die Beziehung mit den Größen T1, T2, λ1, λ2, λ3, τF-D, τF-A, ND/NA, F/B und E*, die durch die Formeln 1 und 10–19 bestimmt ist.
  • Die 12 und 13 zeigen die Beziehungen zwischen der Kenngröße Z und den Werten T1 und T2, F/B und E*, wobei die anderen Werte λ1, λ2, λ3, τF-D, τF-A, und ND/NA, auf 460 nm, 510 nm, 530 nm, 15,0 ns, 1,5 ns beziehungsweise 1 festgelegt sind. Es wird angemerkt, dass diese Werte für das Messen von IEADANS und TRITC sind. 12 zeigt, wie sich die Kenngröße Z in Abhängigkeit von dem ersten Zeitraum T1 verändert, wenn der zweite Zeitraum T2 so eingestellt wird, dass er sich zwischen 21 und 27 ns nach dem Puls des Anregungslichtes erstreckt. 13 zeigt, wie sich die Kenngröße Z in Abhängigkeit von dem zweiten Zeitraum T2 verändert, wenn der erste Zeitraum T1 so eingestellt wird, dass er sich zwischen 9 und 12 ns nach dem Puls des Anregungslichtes erstreckt. Jede der Abbildungen zeigt mehrere Linien für den Fall, in dem die Werte F/B und E* mehrere Werte haben.
  • Man kann aus den Abbildungen erkennen, dass wenn Energieübertragung zwischen dem Donor und dem Akzeptor erfolgt, die Kenngröße Z gleich oder größer 0,049 ist. Durch Einstellen des Schwellwertes Z0 auf 0,049 für die Messung von IEADANS und TRITC wird demgemäss das in 2 oder 3 gezeigte Gerät 1 zum Messen der Energieübertragung bestimmen, dass Energieübertragung vorhanden ist, wenn die gemessene und berechnete Kenngröße Z gleich oder größer ist als der Schwellwert Z0, oder abwesend ist, wenn die gemessene und berechnete Kenngröße Z kleiner ist als der Schwellwert Z0.
  • Es kann auch aus den 12 und 13 bestimmt werden, dass wenn Energieübertragung in Molekülen (IEADANS und TRITC) mit einem Wirkungsgrad der Energieübertragung E* von 0,3 bis 0,7 stattfindet, der Wert der Kenngröße Z größer als 0,116 wird. Durch Einstellen eines anderen Schwellwertes Z1 von 0,116 beim Messen von IEADANS und TRITC wird demgemäss das in 2 oder 3 gezeigte Gerät 1 zum Messen der Energieübertragung bestimmen, dass Energieübertragung bei einem Wirkungsgrad der Energieübertragung E* von 0,3 bis 0,7 stattfindet, wenn die gemessene und berechnete Kenngröße Z größer ist als der Schwellwert Z1, oder nicht stattfindet, wenn die gemessene und berechnete Kenngröße Z kleiner ist als der Schwellwert Z1.
  • 14 zeigt, dass die Kenngröße Z unmittelbar von dem Wirkungsgrad der Energieübertragung E* abhängt, wenn sowohl F/B auf 20 festgesetzt wie auch der zweite Zeitraum T2 auf zwischen 21 und 27 eingestellt wird (21 ≤ T2 ≤ 27). Der Graph zeigt ferner, dass wenn die gemessene Kenngröße Z gleich oder kleiner als der Schwellwert Z0 von 0,049 ist, Energieübertragung dann als nicht vorhanden bestimmt wird. 14 zeigt ferner, dass wenn die gemessene Kenngröße Z gleich oder größer als ein Schwellwert Z1 von 0,116 ist, der Wirkungsgrad der Energieübertragung E* der stattfindenden Energieübertragung 0,3 oder 0,7 oder dazwischen ist (das heißt, 0,3 ≤ E* ≤ 0,7). Weil der Wirkungsgrad der Energieübertragung E* umgekehrt proportional zu der sechsten Potenz des Abstandes r zwischen dem Donor und dem Akzeptor (das heißt r6) ist, kann auch der Bereich des Abstandes r ausgehend von dem auf diese Weise bestimmten Bereich des Wirkungsgrades der Energieübertragung E* bestimmt werden. Wenn irgendwelche anderen Werte (wie F/B oder ND/NA) unbekannt sind, können die Bereiche dieser Werte in gleicher Weise berechnet werden. Auf diese Weise kann jede Energieübertragung betreffende Information erhalten werden.
  • Es wurden unter Verwendung des in 3 gezeigten Gerätes Versuche durchgeführt, um Information über Energieübertragung zwischen IEADANS (worauf hierin nachfolgend als fluoreszierendes Molekül D Bezug genommen wird) und TRITC (worauf hierin nachfolgend als fluoreszierendes Molekül A Bezug genommen wird) zu bestimmen.
  • Zuerst wurde eine erste Probe von Streptoavidin (ein Protein), mit dem fluoreszierenden Molekül D markiert, wie in 15 gezeigt, hergestellt. Dann eine zweite Probe von Streptoavidin, mit dem fluoreszierenden Molekül A markiert, wie in 16 gezeigt. Eine dritte Probe Streptoavidin, markiert sowohl mit dem fluoreszierenden Molekül D wie auch dem fluoreszierenden Molekül A, wurde hergestellt. In der dritten Probe wurden die Moleküle A und D an Stellen des Streptoavidins angebracht, die nahe genug beieinander liegen, so dass Energieübertragung stattfinden kann.
  • Dann wurde die Fluoreszenzlebensdauern τF-D und τF-A der fluoreszierenden Moleküle A und D unter freien Bedingungen mit der in 3 gezeigten Apparatur zur Energieübertragung 1 gemessen. Das heißt, eine die erste Probe enthaltende Probenlösung wurde auf das Probenabsetzglas 30a gesetzt. Fluoreszenzintensität wurde gemessen, während der Zeitraum, bei dem die Bildverstärker 101a und 101b angesteuert waren, verändert wurde. Auf diese Weise wurde der Abfall der Fluoreszenzintensität ermittelt, um die Fluoreszenzlebensdauer τF-D zu bestimmen. Der gleiche Vorgang wurde an der zweiten Probe durchgeführt, um ihre Fluoreszenzlebensdauer τF-A zu bestimmen. Die Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierenden Moleküls D wurde als 15,0 ns betragend gemessen, und die Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierenden Moleküls A wurde als 1,5 ns betragend gemessen.
  • Es wird angemerkt, dass ausgehend von diesen Messungen auch Werte für die Zeitpunkte des Abschlusses der Fluoreszenzabfälle τF-D-end und τF-A-end für die Moleküle D und A unter freien Bedingungen erhalten wurden. Zusätzlich wurde eine die dritte Probe mit einer verhältnismäßig hohen Dichte enthaltende Probelösung auf das Probenabsetzglas 30a gesetzt. Fluoreszenzintensität wurde gemessen, während der Zeitraum, bei dem die Bildverstärker 101a und 101b angesteuert waren, verändert wurde. Auf diese Weise wurde der Abfall der Fluoreszenzintensität ermittelt, um die Fluoreszenzlebensdauer τE-DA und den Zeitpunkt des Abschlusses des Fluoreszenzabfalls tE-DA-end zu bestimmen. Ausgehend von den so erhaltenen Werten für die Zeitpunkte tF-D-end tE-DA-end und tF-A-end wurden die ersten und zweiten Zeiträume T1, T2 bestimmt, so dass diese Werte die folgenden Beziehungen haben: 0 < tF-A-end < T1 < tE-DA-end < T2 < tF-D-end wobei 0 den Zeitpunkt anzeigt, an dem das Anregungslicht auf die Probe eingestrahlt wird.
  • Gemäß diesen Versuchen wurde der erste Zeitraum T1 auf zwischen 9 und 12 ns nach dem Zeitpunkt der Einstrahlung des Anregungslichtes eingestellt, und der zweite Zeitraum T2 wurde auf zwischen 21 und 27 ns nach dem Zeitpunkt der Einstrahlung des Anregungslichtes eingestellt.
  • Dann wurde, um die Energieübertragung zu messen, das Gerät der 3 wie folgt aufgebaut. Ein Stickstofflaser 40a wurde bereitgestellt, um die Proben mit einem Laserstrahl von 337 nm Wellenlänge anzuregen. Ein Filter 201 wurde bereitgestellt, um den Durchgang eines von 460 bis 510 nm reichenden Wellenlängenbereiches T1 zuzulassen. Ein Filter 202 wurde bereitgestellt, um den Durchgang eines von 530 nm an aufwärts reichenden Wellenlängenbereiches T2 zuzulassen. Der erste Zeitraum T1 für den Betrieb des Bildverstärkers 101a wurde auf zwischen 9 und 12 ns eingestellt. Der erste Zeitraum T2 für den Betrieb des Bildverstärkers 101b wurde auf zwischen 21 und 27 ns eingestellt.
  • In einem ersten Experiment wurden die Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2 für eine Probelösung gemessen, die 1 μM der ersten Probe und 1 μM der zweiten Probe enthielt. In dieser Probelösung erfolgte keine Energieübertragung von dem fluoreszierenden Molekül D auf das fluoreszierende Molekül A. Die folgenden Fluoreszenzintensitäten wurden bei dem ersten Versuch gemessen: ID2/ID1 = 0,820 IA2/IA1 = 0,780
  • In einem zweiten Experiment wurden die Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1 und IA2 für eine Probelösung gemessen, die 1 μM der ersten Probe, 1 μM der zweiten Probe und 0,05 μM der dritten Probe enthielt. Von allen Molekülen in der Probe trat Energieübertragung in 5% der Probelösung auf und trat in 95% nicht auf. Demgemäß war, das Verhältnis F/B 20. Die folgenden Fluoreszenzintensitäten wurden bei dem zweiten Versuch gemessen: ID2/ID1 = 0,741 IA2/IA1 = 0,601
  • Die vo n der Vorrichtung zum Berechnen 50c aus dem ersten und dem zweiten Versuch berechneten Werte für die Kenngröße Z waren: Z = 0,049 (Erster Versuch) Z = 0,189 (Zweiter Versuch)
  • Durch Vergleichen der berechneten Werte Z mit dem Schwellwert Z0 von 0,049 konnte bestimmt werden, dass während des ersten Versuchs keine Energieübertragung in irgendwelchen Molekülen stattfand, und dass während des zweiten Versuchs Energieübertragung in einigen Molekülen stattfand. Durch Vergleichen der berechneten Werte Z mit dem Schwellwert Z1 von 0,016 konnte ferner bestimmt werden, dass während des zweiten Versuchs Energieübertragung mit einem Wirkungsgrad der Energieübertragung E* zwischen 0,3 und 0,7 stattfand. Da der Wirkungsgrad der Energieübertragung E* umgekehrt proportional zu der sechsten Potenz des Abstandes zwischen Stellen auf dem Streptoavidin ist, kann bestimmt werden, wo der Donor und der Akzeptor aufmarkiert wurden.
  • Als nächstes wird ein Gerät zur Energieübertragung 1 gemäß einem zweiten Beispiel der vorliegenden Ausführungsform beschrieben, wobei auf die 17 und 18 Bezug genommen wird. In dem ersten Beispiel, wie in 3 gezeigt, ist das Gerät mit zwei für Wellenlängen selektiven Filtern ausgerüstet, um die Fluoreszenz nach der Wellenlänge aufzuteilen, und mit zwei Bildverstärkern, um während jedes Zeitraums die Wellenlänge jeder Fluoreszenz aufzunehmen. Im Gegensatz dazu wird in dem zweiten Beispiel ein einziges Beugungsgitter oder Prisma dazu verwendet, die Fluoreszenz nach der Wellenlänge aufzuteilen, und eine einzige Streakkamera wird verwendet, um während jedes Zeitraums die Wellenlänge jeder Fluoreszenz aufzunehmen.
  • Ein Gerät zum Messen der Energieübertragung mit dieser Struktur wird unter Bezugnahme auf 17 beschrieben. Der Gaslaser 40a (zum Beispiel ein Stickstofflaser) wird durch die Pulsbetriebsschaltung 40b gepulst betrieben. Die Probe SM erzeugt bei Bestrahlung Fluoreszenz. Die Fluoreszenz wird von dem Mikroskop MS gesammelt, so dass sie nach Durchgang durch einen Schlitz 501, ein Filter zum Abschneiden des Anregungslichts 502 und ein Beugungsgitter (Prisma) 500 auf eine Streakröhre SR auffällt. Das Filter zum Abschneiden des Anregungslichts 502 ist dazu da, das Anregungslicht (kohärentes Licht von dem Stickstoff- Gaslaser) abzuschneiden. Das Anregungslicht wird zum Rauschen für die schwache Fluoreszenz, die das Filter durchlaufen hat. Das Beugungsgitter teilt die Fluoreszenz, die das Filter durchlaufen hat, räumlich in die beiden Wellenlängenbereich ΓD und ΓA auf.
  • Demgemäss fällt Fluoreszenz, die gemäß ihrer Wellenlänge räumlich aufgespreizt ist, auf die Streakröhre SR. Streakröhren der Streakröhren-Serie N3373, hergestellt von Hamamatsu Photonics, sind geeignet zur Verwendung als die Streakröhre SR. Der Zeitraum für die Messung kann in Zeitintervallen von Picosekunden bis Femtosekunden eingestellt werden. Die Streakröhre SR schließt eine photoelektrische Oberfläche ein, auf die Fluoreszenz einfällt. Aus photoelektrischer Umwandlung der Fluoreszenz sich ergebende Elektronen werden durch Ablenkungselektroden abgelenkt. Eine fluoreszierende Oberfläche, um die Elektronen zurück in Fluoreszenz umzuwandeln, ist am Ausgang der Streakröhre SR bereitgestellt. Der Zeitraum wird durch die an die Ablenkelektroden zum Abtasten der Elektronen angelegte Zeitablenkspannung eingestellt. Die Zeitablenkspannung wird den Ablenkelektroden von einer Schaltung zur Erzeugung der Zeitablenkspannung 503 geliefert. Die von der Streakröhre SR ausgegebene Fluoreszenz wird von der gleichen CCD-Kamera 102a als ein Bild aufgenommen, wie in 3 gezeigt.
  • 18 zeigt eine Wiedergabe eines Fluoreszenzbildes, das auf das lichtempfangende Gebiet der CCD-Kamera 102 auftrifft. Das Fluoreszenzbild wird durch das Beugungsgitter 500 horizontal in getrennte Wellenlängen und durch die Zeitablenkung der Streakröhre SR vertikal in Zeiträume aufgetrennt. Die Fluoreszenzintensitäten der Gebiete, entsprechend den Empfangsgebieten R1 bis R4, werden jeweils in der Rechenschaltung 50c gesammelt, um die Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA2, IA2 zu bestimmen. Andere Bestandteile des in 17 gezeigten Gerätes zur Energieübertragung sind die gleichen wie diejenigen, die in 3 gezeigt werden. Energieübertragung betreffende Information kann aus den Fluoreszenzintensitäten ID1, ID2, IA1, IA2 erhalten werden. Die Fluoreszenzintensitäten und die Information über Energieübertragung werden zu dem Steuergerät 60b gesendet und auf der CRT 70 angezeigt.
  • Mit dem Gerät gemäß dem zweiten Beispiel können Zeiträume unter Verwendung der Streakröhre SR mit einem hohen Grad an Genauigkeit eingestellt werden. Auch weil ein Beugungsgitter 500 zum Auftrennen der Fluoreszenz nach Wellenlängen verwendet wird, kann die Fluoreszenz aus dem Donor von der Fluoreszenz aus dem Akzeptor unter Verwendung der gleichen CCD-Kamera 102a getrennt werden. Dies stellt sicher, dass Fluoreszenz aus dem Donor und aus dem Akzeptor gleichzeitig gemessen werden, mit keinem Unterschied in den Zeiträumen, der hervorgerufen werden kann, wenn diese durch getrennte Einheiten gemessen werden.
  • Während die Erfindung in Einzelheiten mit Bezug auf besondere Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es für die Fachleute offensichtlich, dass verschiedene Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können, ohne von dem Geltungsbereich der angehängten Ansprüche abzuweichen.
  • Zum Beispiel wird in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform unter Verwendung der Kenngröße Z bestimmt, ob Energieübertragung stattgefunden hat. Jedoch wäre es praktisch, andere Kenngrößenfunktionen zu definieren, die auf verschiedenen Testergebnissen für jede Fluorophorprobe beruhen. Ein Experimentator könnte sich dann einfach auf Werte der Kenngrößenfunktionen beziehen (zum Beispiel Z ≤ Z0), um leicht seine/ihre benötigte Information zu bestimmen.
  • Obwohl IEADANS und TRITC als eine Donor/Akzeptor – Kombination vorgeschlagen werden, kann jede Kombination verwendet werden, solange wie der Donor eine Fluoreszenzlebensdauer τF-D länger als diejenige des Akzeptors τF-A hat, und das Fluoreszenzspektrum des Donors sich mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappt. Zum Beispiel ergeben Fluorescein und Tetramethylrhodamin eine gute Kombination, mit einem Verhältnis der Fluoreszenzlebensdauern von vier.
  • Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Energieübertragung zu übermitteln, die nur in einer kleinen Menge der Moleküle in der gesamten Probe stattfindet, obwohl Energieübertragung in den meisten Molekülen der Probe nicht stattfindet.
  • Die vorstehend beschriebene Messung der Energieübertragung der vorliegenden Erfindung ist eine sehr wirkungsvolle, wenn sie auf die in-vivo – Aufspürung von Substanzen angewendet wird, die nur in kleinen Mengen vorliegen. Das Energieübertragungs-Verfahren ist auf ein Verfahren anwendbar, bei dem Sonden (das heißt, Donor- und Akzeptormoleküle, die sich an die Zielsubstanz auf besondere Weise binden) der Zielsubstanz zugesetzt werden. Beispiele von Sonden sind Antikörper, wenn das Zielmolekül ein Protein ist, oder komplementäre Oligonucleotide, wenn das Zielmolekül DNA oder RNA ist. Durch Ermitteln der Energieübertragung zwischen den Sonden wird die Menge an Zielsubstanz, die sich mit den Sonden verbunden hat, gemessen. Manchmal sind große Mengen an freien Sonden (freie Donoren und freie Akzeptoren), die nicht in Bindung mit dem Zielmolekül oder der Zielsubstanz vorliegen, in der in Untersuchung befindlichen lebenden Zelle vorhanden. Obwohl die freien Sonden ausgewaschen werden können, wenn die Messung in vitro durchgeführt wird, ist das bei in vivo – Messungen nicht möglich. In vivo – Messung muss unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen viele freie Donormoleküle vorhanden sind.
  • Wenn nur eine kleine Menge der an die Sonden zu bindenden Zielmoleküle oder Zielsubstanzen vorhanden sind, werden die Sonden manchmal in einer An absorbiert, die anders ist die vorstehend beschriebene besondere Weise. Das Signal von Sonden, die an Zielmoleküle in der kennzeichnenden Art gebunden sind, unterscheidet sich von dem Signal aus freien Sonden oder aus Sonden, die von dem Zielmolekül in einer nicht kennzeichnenden An absorbiert wurden. Indem diese Erscheinung auf die Energieübertragungsmethode der vorliegenden Erfindung angewendet wird, können Experimente so entworfen werden, dass das Signal einer sich in kennzeichnender Weise mit dem Zielmolekül verbindenden Sonde sich ändert, wenn die Sonde sich in kennzeichnender Weise mit dem Zielmolekül verbindet. Wenn zum Beispiel die Basensequenz in einer DNA oder RNA untersucht wird, werden zwei Arten von Oligonucleotid – Sonden, die mit unterschiedlichen fluoreszierenden Reagenzien an ihren Endteilen markiert sind, hergestellt. Indem diese Sonden durch Hybridisierung an verschiedenen, etwa zwei bis sieben Basen auseinanderliegenden Gebieten auf der Ziel-DNA oder Ziel-RNA angebracht werden, kann die Ziel-DNA oder Ziel-RNA durch Messen der Energieübertragung zwischen den beiden fluoreszierenden Sonden aufgespürt werden. Diese Detektionsmethode wird durch Heller, M. J. et al. in der europäischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 070685 von 1983 und durch Heller, M. J. und Jablonski E. J. in der europäischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 229943 von 1987 beschrieben.
  • Unter Bedingungen wie in vivo, wenn die ungebundene Sonde nicht fortgewaschen werden kann, sind viele Moleküle, bei denen Energieübertragung nicht stattfindet, in der Probe vorhanden. Daher war Energieübertragung herkömmlicherweise auf diese An von DNA-Sequenzierung nicht anwendbar. Das Gerät und das Verfahren zur Energieübertragung gemäß der vorliegenden Erfindung lösen dieses Problem, so dass Messung der Energieübertragung auch unter Bedingungen möglich ist wie in vivo, wenn nicht gebundene Sonde nicht fortgewaschen werden kann.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung und dem Gerät und Verfahren zur Energieübertragung gemäß der vorliegenden Erfindung wird die durch Anregungslicht erzeugte Fluoreszenz gemessen, nachdem sie unter Verwendung zum Beispiel eines Wellenlängenteilers in mindestens zwei verschiedene Wellenlängenbereiche geteilt wurde. Zusätzlich wird die Fluoreszenz jedes der verschiedenen Wellenlängenbereiche während mindestens zwei verschiedenen Zeiträumen gemessen. Deshalb kann das Vorhandensein einer nur geringen Anzahl von Molekülen, in denen Energieübertragung stattfindet, aufgespürt werden, auch wenn Moleküle, bei denen Energieübertragung nicht stattfindet, in großen Mengen anwesend sind. Gemäß dem Gerät zum Messen von Energieübertragung der vorliegenden Erfindung kann auch die Identifikation einer Kenngröße durchgeführt werden, die bestimmt, ob Energieübertragung vorhanden ist, oder die die Mengen und die Art unterschiedlicher Substanzen in kleinen Quantitäten bestimmt. Weil Energieübertragung besonders abhängig von dem Abstand zwischen den Fluorophoren ist, können Basensequenzen von Nukleinsäuren mit größerer Genauigkeit bestimmt werden, indem Information über Energieübertragung von mit hybridisierten komplementären Nukleinsäuren markierten Fluorophoren während der Analyse von genetischer Information gemessen wird, wie der Anwesenheit oder dem Vorhandensein genetischer Expression oder von Veränderung in der Primärstruktur von DNA oder RNA.

Claims (11)

  1. Ein Verfahren zur Messung der Energieübertragung zwischen Fluorophoren von Donoren zur Übertragung von Energie und Fluorophoren von Akzeptoren zur Aufnahme der Energie, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der freien Fluorophore der Donoren τ F-D länger ist als diejenige der freien Fluorophore der Akzeptoren τ F- A, wobei die beiden Arten von Fluorophoren Fluoreszenz in verschiedenen Banden der Wellenlänge emittieren, die sich teilweise überlappen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von: Bestrahlen der Fluorophore der Donoren und der Fluorophore der Akzeptoren mit einem Puls von Anregungslicht (40), so dass die Fluorophore der Donoren und die Fluorophore der Akzeptoren Fluoreszenz emittieren, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren nach der Einstrahlung des Pulses des Anregungslichts in Übereinstimmung mit ihren Lebensdauern der Fluoreszenz mit der Zeit abfällt, wobei die Fluoreszenzintensitäten der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren bei jeweils ersten (tF-A-end) und zweiten (tF-D-end) Zeitpunkten Null erreichen, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren sich verändert, wenn Energieübertragung zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt, so dass die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren während der Energieübertragung in Übereinstimmung mit der veränderten Lebensdauer der Fluoreszenz (τ E-DA) abfällt, wobei die veränderte Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren bei einem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END) im Wesentlichen Null erreicht, der von dem ersten Zeitpunkt (tF-A-END) und dem zweiten Zeitpunkt (tF-D-END) verschieden ist, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Akzeptoren im Wesentlichen bei dem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END) Null erreicht, wenn Übertragung von Energie von den Fluorophoren der Donoren zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt; Aufteilen des emittierten Lichtes in einen ersten Wellenlängenbereich (ΓD) und einen davon verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich (ΓA); Ausführen eines Schrittes der Messung der zeitlichen Änderung, in dem die Intensität (ID1) der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) während eines ersten Zeitabschnitts (T1) gemessen wird, die Intensität (ID2) der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) während eines zweiten Zeitabschnitts (T2) gemessen wird, die Intensität (IA1) der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) während des ersten Zeitabschnitts (T1) gemessen wird und die Intensität (IA2) der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) während des zweiten Zeitabschnitts (T2) gemessen wird; und Ermittlung von Information über zwischen den Fluorophoren der Donoren und den Fluorophoren der Akzeptoren erzeugte Übertragung von Energie; dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Messung der zeitlichen Änderung den Schritt des Einstellens des ersten Zeitabschnitts (T1) zwischen dem ersten Zeitpunkt (tF-A-END) und dem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END) und des Einstellens des zweiten Zeitabschnitts (T2) zwischen dem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END)und dem zweiten Zeitpunkt (tF-D-END) umfasst, wobei der Schritt des Aufteilens der Wellenlänge den ersten Wellenlängenbereich (ΓD) nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren und den zweiten Wellenlängenbereich (Γ A) nicht nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Akzeptoren einstellt, sondern auch innerhalb einer vorbestimmten Menge eines Teils der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren, und der Schritt der Ermittlung von Information die Information über die Übertragung von Energie ausgehend von den gemessenen Intensitätsergebnissen (ID1, ID2, IA1, IA2) in jedem der Wellenlängenbereiche (ΓA, ΓD) über jeden der Zeiträume (T1, T2) ermittelt.
  2. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei der Schritt der Ermittlung von Information zur Übertragung von Energie mit der Fluoreszenz während jedes Zeitabschnitt (T1, T2) die folgende Formel berechnet: { (ID2/ID1) – (IA2/IA1) }/(ID2/ID1)Worin ID1 die während des ersten Zeitraums (T1) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) ist; ID2 die während des zweiten Zeitraums (T2) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) ist; IA1 die während des ersten Zeitraums (T1) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) ist; und IA2 die während des zweiten Zeitraums (T2) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) ist
  3. Das Verfahren von Anspruch 2, wobei der Schritt der Ermittlung von Information über die Übertragung von Energie ferner den berechneten Wert mit einem vorbestimmten Wert vergleicht, und ausgehend von dem Ergebnis des Vergleichs bestimmt, ob Übertragung von Energie zwischen den Fluorophoren der Donoren und den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt ist.
  4. Ein Gerät zum Messen der Energieübertragung zwischen Fluorophoren von Donoren zur Übertragung von Energie und Fluorophoren von Akzeptoren zur Aufnahme der Energie, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der freien Fluorophore der Donoren τ F-D länger ist als diejenige der freien Fluorophore der Akzeptoren τ F- A, wobei die beiden Arten von Fluorophoren Fluoreszenz in verschiedenen Banden der Wellenlänge emittieren, die sich teilweise überlappen, wobei das Gerät umfasst: eine Lichtquelle (40) zum Bestrahlen der Fluorophore der Donoren und der Fluorophore der Akzeptoren mit einem Puls von Anregungslicht, so dass die Fluorophore der Donoren und die Fluorophore der Akzeptoren Fluoreszenz emittieren, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren nach der Einstrahlung des Pulses des Anregungslichts in Übereinstimmung mit ihren Lebensdauern der Fluoreszenz mit der Zeit abfällt, wobei die Fluoreszenzintensitäten der Fluorophore der Donoren und der Akzeptoren bei jeweils ersten (tF-A-END) und zweiten (tF-A-END) Zeitpunkten Null erreichen, wobei die Lebensdauer der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren sich verändert, wenn Energieübertragung zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt, so dass die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren während der Energieübertragung in Übereinstimmung mit der veränderten Lebensdauer der Fluoreszenz (τ E-DA) abfällt, wobei die veränderte Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Donoren bei einem dritten Zeitpunkt (tE- DA-END) im Wesentlichen Null erreicht, der von dem ersten Zeitpunkt (tF-A-END) und dem zweiten Zeitpunkt (tF-D-END) verschieden ist, wobei die Fluoreszenzintensität der Fluorophore der Akzeptoren im Wesentlichen bei dem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END) Null erreicht, wenn Übertragung von Energie von den Fluorophoren der Donoren zu den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt; einen Wellenlängenteiler (201, 202) zum Aufteilen des emittierten Lichtes in einen ersten Wellenlängenbereich (ΓD) und einen zweiten Wellenlängenbereich (ΓA), die unterschiedlich voneinander sind; eine Messeinheit (10, 50a, 50b, 50c), eingerichtet zum Messen der Intensität (ID1) der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) während eines ersten Zeitabschnitts (T1), der Intensität (ID2) der emittierten Fluoreszenz in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) während eines zweiten Zeitabschnitts (T2), der Intensität (IA1) der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) während des ersten Zeitabschnitts (T1) und der Intensität (IA2) der emittierten Fluoreszenz in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) während des zweiten Zeitabschnitts (T2); und eine Ermittlungseinheit (50c), eingerichtet zum Ermitteln von Information über zwischen den Fluorophoren der Donoren und den Fluorophoren der Akzeptoren stattfindende Übertragung von Energie, dadurch gekennzeichnet, dass die Messeinheit (10, 50a, 50b) eingerichtet ist, den ersten Zeitabschnitt (T1) zwischen dem ersten Zeitpunkt (tF-A-END) und dem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END) einzustellen und ferner eingerichtet ist, den zweiten Zeitabschnitt (T2) zwischen dem dritten Zeitpunkt (tE-DA-END)und dem zweiten Zeitpunkt (tF-D-END) einzustellen, der Wellenlängenteiler (201, 202) eingerichtet ist, den ersten Wellenlängenbereich (ΓD) nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren einzustellen und ferner eingerichtet ist, den zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) nicht nur innerhalb der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Akzeptoren einzustellen, sondern auch innerhalb einer vorbestimmten Menge eines Teils der Bande der Wellenlänge der Fluoreszenz der Fluorophore der Donoren, und die Bestimmungseinheit (50c) eingerichtet ist, die Information über die Übertragung von Energie ausgehend von den gemessenen Intensitätsergebnissen (ID1, ID2, IA1, IA2) in jedem der Wellenlängenbereiche (ΓA, ΓD) über jeden der Zeiträume (T1, T2) zu ermitteln.
  5. Das Gerät wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei der Wellenlängenteiler ein Paar Filter (201, 202) zum Durchlassen von Licht des ersten (ΓD) beziehungsweise des zweiten (ΓA) Wellenlängenbereiches umfasst.
  6. Das Gerät wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei der Wellenlängenteiler ein Beugungsgitter (500) zum räumlichen Aufteilen des Lichtes des ersten (ΓD) und des zweiten (ΓA) Wellenlängenbereiches umfasst.
  7. Das Gerät wie in Anspruch 4 oder 5 beansprucht, wobei die Messeinheit (10, 50a, 50b, 50c) umfasst: ein Paar Bildverstärker (101a, 101b) jeweils zum Empfang des betreffenden Wellenlängenbereiches (ΓA, ΓB) des Lichtes und zum Vervielfachen des empfangenen Lichtes während des ersten (T1) und zweiten (T2) Zeitraumes; ein Paar Einheiten zum Aufnehmen von Licht (102a, 102b) jeweils zum Empfangen des betreffenden Wellenlängenbereiches (ΓA, ΓB) des während des ersten (T1) und zweiten (T2) Zeitraumes vervielfachten Lichtes, und zum Herstellen elektrischer Signale, die für die Intensitäten des empfangenen Lichtes kennzeichnend sind; und eine Einheit zum Aufspeichern von Lichtintensitäten (50a, 50b, 50c) zum Empfangen der elektrischen Signale von dem Paar Einheiten zum Aufnehmen von Licht (102a, 102b) und zum Aufspeichern der Lichtintensitäten für den ersten (ΓA) und den zweiten (ΓB) Wellenlängenbereich während des ersten (T1) und des zweiten (T2) Zeitraums, wodurch die Intensitätswerte (ID1, ID2, IA1, IA2) erhalten werden.
  8. Das Gerät wie in Anspruch 4 oder 6 beansprucht, wobei die Messeinheit umfasst: eine einzige Streakkamera (SR) zum Aufnehmen des ersten (ΓD) und des zweiten (ΓA) Wellenlängenbereiches an unterschiedlichen Stellen, und zum weiteren räumlichen Unterteilen des während des ersten (T1) und des zweiten (T2) Zeitraums empfangenen Lichtes, um Licht an vier verschiedenen Stellen (R1, R2, R3, R4) auszugeben; und eine einzige Einheit zum Aufnehmen von Licht (102a) zum Empfangen der Lichtausgabe an vier verschiedenen Stellen (R1, R2, R3, R4) und zum Herstellen elek trischer Signale, die für die Intensität des empfangenen Lichtes kennzeichnend sind; und eine Einheit zum Aufspeichern von Lichtintensitäten (50a, 50c) zum Empfangen der elektrischen Signale von der Einheit zum Aufnehmen von Licht (102a) und zum Aufspeichern der Lichtintensitäten der Lichtausgabe an vier verschiedenen Stellen (R1, R2, R3, R4), wodurch die Intensitätswerte (ID1, ID2, IA1, IA2) erhalten werden.
  9. Das Gerät wie in einem der Ansprüche 4 bis 8 beansprucht, wobei die Ermittlungseinheit (50c) die Information über die Übertragung von Energie ausgehend von den für den ersten (ΓA) und den zweiten (ΓB) Wellenlängenbereich während des ersten (T1) und des zweiten (T2) Zeitraums aufgespeicherten Lichtintensitäten (IA1, IA2, ID1, ID2) ermittelt.
  10. Das Gerät wie in einem der Ansprüche 4 bis 9 beansprucht, bei dem die Ermittlungseinheit (50c) mit der Fluoreszenz während jedes Zeitabschnitt (T1, T2) die folgende Formel berechnet: { (ID2/ID1) – (IA2/IA1) }/(ID2/ID1)Worin ID1 die während des ersten Zeitraums (T1) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) ist; ID2 die während des zweiten Zeitraums (T2) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓD) ist; IA1 die während des ersten Zeitraums (T1) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem ersten Wellenlängenbereich (ΓA) ist; und IA2 die während des zweiten Zeitraums (T2) erhaltene Fluoreszenzintensität in dem zweiten Wellenlängenbereich (ΓA) ist.
  11. Das Gerät wie in einem der Ansprüche 4 bis 10 beansprucht, bei dem die Ermittlungseinheit (50c) ferner den berechneten Wert mit einem vorbestimmten Wert vergleicht, und ausgehend von dem Ergebnis des Vergleichs bestimmt, ob Übertragung von Energie zwischen den Fluorophoren der Donoren und den Fluorophoren der Akzeptoren erfolgt ist.
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