BR112016013866B1 - dispositivo para a representação por imagens de material biológico - Google Patents

Abstract

PADRÃO DE CALIBRAÇÃO PARA UM DISPOSITIVO PARA A REPRESENTAÇÃO POR IMAGENS DE MATERIAL BIOLÓGICO A presente invenção se refere a um padrão de calibração (7) para um dispositivo (1) para a representação por imagens de material biológico (6), que é pelo menos parcialmente excitado para a luminescência durante a análise. O dispositivo (1) apre senta uma unidade de iluminação (2) com uma fonte de radiação, pela qual pode ser emitida uma radiação de excitação (15) eletromagnética. Ainda está previsto um elemento de recepção (3), assegurando que o material biológico (6) disposto em um suporte (5) está posicionado dentro de uma trajetória de feixe da radiação de excitação (15). Ainda, o dispositivo apresenta pelo menos uma unidade de geração de imagens (4), recebendo a radiação de luminescência (16) emitida pelo material biológico (6) em função da excitação pela radiação de excitação (15) e gerando uma imagem pelo menos das regiões do material biológico (6) excitadas para a luminescência. Para a calibração, o dispositivo apresenta um padrão de calibração (7), emitindo uma radiação de calibração em função da excitação pela radiação de excitação (15), registrada pela unidade de geração de imagens (4) e sob consideração da radiação de calibração registrada pode gerar um sinal de calibração em um dispositivo de controle (18). A solução técnica descri ta é caracterizada pelo padrão (...).

Description

[001] A presente invenção se refere a um padrão de calibraçãoassim como a um dispositivo para a representação por imagens de material biológico, em que está integrado um padrão de calibração correspondente. Os componentes essenciais de um dispositivo desta natureza incluem uma unidade de iluminação com uma fonte de radiação, por meio da qual pode ser emitida uma radiação de excitação eletromagnética, assim como um elemento de recepção para o posicionamento do material biológico disposto em um suporte dentro de uma trajetória de feixe da radiação de excitação. Além disso está prevista uma unidade de geração de imagens, que recebe a radiação de luminescênciaemitida pelo material biológico em função da excitação pela radiação de excitação e que gera uma imagem pelo menos das regiões do material biológico excitadas para a luminescência. Além disso está previsto um padrão de calibração, que emite uma radiação de ca- libração em função da excitação pela radiação de excitação, que é registrada pela unidade de geração de imagens e sob consideração da radiação de calibração registrada pode gerar um sinal de calibração em um dispositivo de controle.

[002] Mais particularmente, no domínio dos diagnósticos in vitrona análise de amostras humanas ou animais são realizadas múltiplas análises de fluorescência. Em função dos processos de análise usados neste caso são registradas e analisadas imagens de fluorescência com diferentes sistemas. Para, apesar disso, se poder comparar os resultados uns com os outros é importante que se possa determinar e corrigir correspondentemente as influências específicas dos aparelhos sobre o sinal de fluorescência. Neste âmbito é particularmente significativo o uso de um padrão de calibração ou de um padrão de fluores- cência para a calibração dos aparelhos, cuja intensidade de radiação tem de estar em conformidade com padrões certificados.

[003] O significado de padrões desta natureza é evidenciado combase em um projeto, que foi realizado conjuntamente pelo Physikalisch Technische Bundesanstalt [Instituto Federal Físico-Técnico] (PTB), pelo Bundesanstalt für Materialforschung und -Prüfung [Instituto Federal de Investigação e Ensaio de Materiais] (BAM) assim como pelas firmas Gigahertz-Optik GmbH e Sigma-Aldrich GmbH. No âmbito deste projeto foi desenvolvida uma cadeia de rastreabilidade radiométrica para padrões de fluorescência, que é constituída por três elementos essenciais. Por um lado está previsto um elemento de radiação de Ulbricht de iluminação homogênea, cuja densidade de feixe espectral foi reduzida por várias grandezas em comparação com uma lâmpada de Wolfram, de forma que as respectivas propriedades de radiação estão significativamente mais bem adaptadas a uma amostra fluorescente que o padrão de densidade de feixe convencional. O segundo elemento é um fluorômetro de referência com aberrações ópticas mínimas, que rastreado por meio da norma de densidade de feixe permite a certificação do espectro de fluorescência com incertezas de medição radio- métricas suficientemente reduzidas. Como terceira parte da cadeia de rastreabilidade serve um conjunto de calibração "Padrões de Fluorescência Espectrais BAM-F001 assim como BAM-F005", cujos espectros de emissão corrigidos em janeiro de 2006 foram certificados pelo BAM. Estes padrões permitem a um usuário determinar e corrigir de forma relativamente simples e rastreável as sensibilidades espectrais relativas do canal de emissão de sistemas de medição de fluorescência sob condições relevantes de aplicação.

[004] Para a realização prática de análises do estado da técnicasão conhecidos inúmeros dispositivos para o registro e para a análise de imagens luminescentes, particularmente de imagens fluorescentes, com os quais são analisadas amostras de material biológico. Os dispositivos desta natureza frequentemente dispõem de um microscópio ou de uma unidade de câmera, com os quais respectivamente são gerados registros de amostras biológicas marcadas com um corante de fluorescência. Além disso são conhecidos scanners de microarranjos, com os quais podem ser analisadas amostras de ADN marcadas com fluorescência, que estão dispostas nos chamados biochips.

[005] Da WO 2009/127424 são conhecidos diferentes padrões defluorescência, que podem ser usados para a espectroscopia de fluorescência. O que é problemático no caso dos padrões de fluorescência conhecidos frequentemente é que estes não apresentam fotoestabili- dade ou perdem facilmente a cor durante o período de tempo de uso, sobretudo no caso de uma iluminação prolongada ou no caso de uma iluminação de intensidade mais elevada. Além disso os corantes usados em muitos casos apenas podem ser usados em uma região espectral reduzida.

[006] Os problemas adicionais frequentemente residem no fatode serem relativamente dispendiosos, de serem mecanicamente, ter- micamente e quimicamente instáveis e além disso envelhecerem ou secarem rapidamente, o que por sua vez conduz à alteração da intensidade de fluorescência em função da radiação.

[007] O documento acima referido neste âmbito descreve diferentespadrões de fluorescência ou corantes de fluorescência, que são caracterizados por ser usado um mineral fluorescente ou uma substância que contém um mineral fluorescente. No caso dos minerais descritos tanto se trata de minerais naturais como igualmente sintéticos.

[008] Além dos corantes de fluorescência minerais são igualmente usados outros corantes, tais como por exemplo polímeros, como padrão de fluorescência. Da EP 1 373 870 B1 é conhecido um disposi- tivo para o referenciamento de sinais de fluorescência e/ou para a ca- libração de sistemas de detecção de fluorescência, que assenta no uso de polímeros específicos. O dispositivo descrito apresenta essencialmente um suporte não fluorescente, em que em várias regiões definidassão aplicadas camadas poliméricas com uma espessura e/ou uma composição parcialmente diferente. As camadas poliméricas são aplicadas sobre o suporte, de forma que se tornam fluorescentes depois da radiação correspondente, de forma que o suporte revestido pode ser usado como padrão de fluorescência.

[009] Os padrões de fluorescência descritos são usados para aestandardização de experiências, que se baseiam na análise de arranjos de sondas, em que os padrões de fluorescência com as sondas contendo o material biológico se encontram conjuntamente sobre um suporte. No caso dos suportes se trata de suportes de objetos epoxi- dados, nos quais são introduzidos furos por perfuração por ultrassons, que são preenchidos com um polímero fluorescente e subsequentemente colados.

[0010] Para a elaboração de um diagnóstico sobre um suporteprimeiro é aplicada uma série de pontos de produtos PCR, em que nos pontos PCR individuais são imobilizados cADNs específicos purificados e marcados por fluorescência por hibridização. Subsequentemente estas amostras são lidas por meio de um scanner a laser confocal e são analisados os resultados, em que a análise é realizada sob consideração de uma comparação com as intensidades das diferentes regiões do padrão de fluorescência.

[0011] Partindo dos sistemas conhecidos para o registro de imagens de luminescência, particularmente de imagens de fluorescência de material biológico, e dos padrões usados para a calibração destes sistemas, a presente invenção tem por objetivo divulgar um padrão de calibração que possa ser produzido de forma simples e reprodutível, com o qual possa ser realizada de forma relativamente simples e exata a calibração de um dispositivo de análise correspondente. Neste caso, por um lado, é essencial que a substância de luminescência usada seja caracterizada por uma durabilidade particular, particularmente para evitar uma perda de cor rápida, mas apesar disso permita um manuseamento relativamente simples e, por conseguinte, seja econômica. Mais particularmente, o padrão de calibração deve ser realizado de forma que a calibração de uma unidade de análise correspondente possa ser realizada em um procedimento laboratorial normal, em que tem de ser processado um número elevado de diferentes amostras em um período de tempo reduzido, sem grande complexidade e em um período de tempo reduzido. Além disso, o padrão de calibração deve permitir uma calibração tanto quanto possível automática e no entanto exata de uma unidade de análise. Além disso preferencialmente deve ser assegurado, que mesmo no caso da produção de uma pluralidade de unidades de análises, são usados padrões de calibração para cada unidade, que podem ser comparados entre si. A rastreabilidade do padrão de calibração a indicar em um padrão normalizado por conseguinteé uma característica essencial adicional. O padrão de calibra- ção além disso espectralmente deve estar tanto quanto possível em conformidade com um fluorocromo usado na aplicação de fluorescência.

[0012] Este objetivo é alcançado com um dispositivo de acordocom a reivindicação 1 assim como com um padrão de calibração de acordo com a reivindicação 15. Um uso do padrão de calibração de acordo com a presente invenção é enunciado na reivindicação 17. As formas de realização vantajosas da presente invenção são objeto das reivindicações dependentes e são mais detalhadamente explicadas na descrição que se segue com referência parcial às figuras.

[0013] A presente invenção se refere a um dispositivo para a re-presentação por imagens de material biológico, com uma unidade de iluminação, que apresenta uma fonte de radiação, por meio da qual pode ser emitida uma radiação de excitação eletromagnética. Além disso está previsto um elemento de recepção, que assegura, que o material biológico disposto em um suporte está posicionado dentro de uma trajetória de feixe da radiação de excitação. Além disso, o dispositivo apresenta pelo menos uma unidade de geração de imagens, que recebe a radiação de luminescência emitida pelo material biológico devido à excitação pela radiação de excitação e que gera uma imagem pelo menos das regiões do material biológico excitadas para a luminescência.Para a calibração o dispositivo apresenta um padrão de calibração, que emite uma radiação de calibração em função da excitação pela radiação de excitação, que é registrada pela unidade de geração de imagens e sob consideração da radiação de calibração registrada pode gerar um sinal de calibração em um dispositivo de controle. A presente invenção é caracterizada por o padrão de calibra- ção apresentar um alojamento com uma substância que pode ser excitada para a luminescência neste e que está fixamente conectado com a unidade de iluminação ou o elemento de recepção com o auxílio de um meio de fixação.

[0014] Por conseguinte, o padrão de calibração de acordo com apresente invenção é um componente, que representa um componente essencial do dispositivo para a análise óptica de material biológico. Mais particularmente, o padrão de calibração é um componente integrante integral do dispositivo, em que este permanece mesmo no caso da alteração dos suportes de amostras e, por conseguinte, pode ser usado durante muito tempo ou para uma pluralidade de análises.

[0015] Em uma primeira forma de realização específica da presente invenção o alojamento apresenta uma janela, que é pelo menos parcialmente transparente para a radiação de excitação assim como para a radiação de luminescência. Preferencialmente o alojamento do padrão de calibração é realizado como armação em aço, em cujo lado superior, quer dizer no lado do padrão de calibração voltado para a fonte de radiação, é introduzida uma janela. No lado do alojamento oposto à janela vantajosamente está prevista uma abertura, através da qual durante a produção do padrão de calibração pode ser introduzida a substância luminescente, particularmente um pó, no alojamento e que depois da introdução da substância luminescente é fechada e colada com uma tampa, preferencialmente em aço.

[0016] Uma forma de realização vantajosa adicional da presenteinvenção prevê que a janela apresenta uma marcação para a determinação de uma distância definida entre a unidade de recepção e a marcação. Preferencialmente a marcação é realizada sob a forma de um retículo, que serve para a focalização exata e reprodutível com uma objetiva da unidade de registro, em que neste caso é possível uma fo- calização por pontos exata nas três direções de movimento (direção X, Y e Z). As objetivas com uma ampliação de 20 vezes ou de 40 vezes são particularmente adequadas para o uso no dispositivo de acordo com a presente invenção.

[0017] Alternativamente ou adicionalmente na superfície da janelaestão previstas outras estruturas. Estas estruturas alternativas ou adicionais preferencialmente são realizadas de modo que possam assegurarfunções, como por exemplo a definição e a calibração da posição XY e/ou da posição original e/ou a determinação da medida de representação.

[0018] De acordo com um aperfeiçoamento específico da presenteinvenção no caso da substância que pode ser excitada para a lumi-nescênciase trata de um corante que pode ser excitado para a fluorescência, quer dizer um chamado corante de fluorescência. Vantajosamente o corante luminescente ou fluorescente se apresenta sob a forma de pó. O uso de uma mistura de um fluorocromo e de um dióxido de silício (SiO2) ou de quartzo é particularmente adequada. O fluo- rocromo é misturado com uma substância adicional, particularmente o dióxido de silício acima referido, para reduzir a intensidade de radiação da radiação de luminescência ou de fluorescência proveniente do padrão de calibração em comparação com o fluorocromo puro.

[0019] Em uma forma de realização adicional está previsto quealternativamente ou adicionalmente à diluição do fluorocromo com dióxido de silício (SiO2), estão previstos meios de atenuação adicionais. Mais particularmente, neste âmbito é possível prever a janela do alojamento do padrão de calibração com pelo menos um meio de atenuação, por meio do qual é reduzida uma intensidade da radiação de luminescênciaemitida pela substância luminescente durante a passagem pela janela. Preferencialmente o meio de atenuação está disposto em uma superfície da janela voltada para a substância luminescente e apresenta um filtro cinzento parcialmente transparente e/ou uma estrutura de orifícios de encaixe. É igualmente possível que a janela seja realizada de forma parcialmente transparente em relação a um espectro da radiação de luminescência emitida, para alcançar a atenuação desejada da intensidade de radiação da radiação de luminescência.

[0020] Alternativamente ao uso de um padrão de calibração comum fluorocromo sob a forma de pó é igualmente possível prever os chamados nanopontos como substância luminescente na região da unidade de iluminação ou no elemento de recepção, em que se encontra aquele para o suporte com o material biológico a ser analisado. Vantajosamente neste caso é possível gerar resina epóxi opticamente pura e encher uma cuvete, que neste caso forma o alojamento do padrão de calibração. Preferencialmente uma cuvete desta natureza é introduzida em um elemento de retenção adequado da unidade de recepção de um microscópio ou de um scanner de microarranjos. Tam- bém neste caso a cuvete constitui um componente integral da unidade de análise e está fixamente ligada a esta. De acordo com um aperfeiçoamento particularmente específico da presente invenção esta cuvete no caso de calibração é adicionada ou introduzida pelo exterior.

[0021] Um pensamento essencial da presente invenção reside emdivulgar um padrão de calibração para um dispositivo para a análise óptica de material biológico, que representa um componente do dispositivo e, por conseguinte, é duradouro e sobretudo está conectado fixamente com o dispositivo de análise. Preferencialmente o alojamento do padrão de calibração apresenta uma rosca externa, com a qual o padrão de calibração pode ser aparafusado no elemento de recepção previsto para o posicionamento do suporte com o material biológico, por exemplo uma mesa de movimentos cruzados de um microscópio ou uma unidade de câmera ou um compartimento de recepção de amostras de um scanner de microarranjos. Além disso é igualmente possível realizar uma conexão removível fixa duradoura entre o padrão de calibração e a unidade de registro ou de iluminação do dispositivo de análise por meio de uma conexão por encaixe ou de uma adaptação por sobremedida.

[0022] De acordo com um aperfeiçoamento específico da presenteinvenção o padrão de calibração é realizado de forma rastreável, de forma que os resultados de medição, que são gerados com o auxílio do padrão de calibração, podem ser rastreados por meio de uma fonte de radiação certificada ou em um padrão calibrado pela fonte de radiação certificada. Isto pode ser alcançado pelo fato de o padrão de cali- bração ter sido calibrado com uma fonte de radiação certificada ou por meio de um padrão de calibração calibrado pela fonte de radiação certificada. De acordo com um aperfeiçoamento específico para este efeito, durante a produção do padrão de calibração, está prevista uma construção mecânica específica com um elemento de recepção para o padrão de calibração. Além disso está previsto um díodo a laser, que alternativamente pode ser substituído por uma outra fonte de radiação de banda estreita adequada, particularmente um LED. De acordo com uma forma de realização específica até é possível usar uma fonte de radiação de banda larga e gerar um espectro adequado com o auxílio de meios auxiliares ópticos.

[0023] A potência de radiação da fonte de iluminação acima descrita preferencialmente é medida e ajustada com um detector calibrado. Quando é usado um díodo a laser como fonte de iluminação, a respectiva temperatura e potência de radiação é ajustada de forma regulada estável. A vantagem da excitação de banda estreita é que o espectro de excitação (estimulação) e de emissão não se sobrepõem de forma significativa e, por conseguinte, o espectro de emissão do padrão de calibração pode ser aproximadamente totalmente medido espectralmente.

[0024] Para a medição do espectro de emissão vantajosamente éusado um sistema de espectrômetro, que foi previamente calibrado de forma rasteável com uma fonte de radiação certificada. Durante a verificação do padrão de calibração este é excitado para a radiação com o díodo a laser usado preferencialmente. Subsequentemente o espectro de emissão é detectado com o espectrômetro calibrado, de forma que é assegurada uma medição de intensidade de radiação rastreável para a fonte de radiação certificada. Para a supressão eficaz da luz difusa o espectrômetro é equipado com um filtro passa-banda longo, que bloqueia a radiação de excitação e transmite a radiação de emissão. Devido a uma medição realizada desta forma o padrão de calibração verificado pode igualmente ser usado como meio de verificação, mesmo pelo usuário.

[0025] A presente invenção se refere ainda a um padrão de cali-bração para a calibração de um dispositivo para a representação por imagens de material biológico. O padrão de calibração apresenta um alojamento, que circunda pelo menos parcialmente uma substância que pode ser excitada para a luminescência, particularmente para a fluorescência. Este alojamento do padrão de calibração é realizado pelo menos parcialmente por um material transparente para uma radiação de excitação assim como para uma radiação de luminescência emitida pela substância excitada. Além disso no lado externo do alojamentoestá previsto pelo menos um meio de fixação, por meio do qual o padrão de calibração pode ser fixado dentro do ou no dispositivo para a representação por imagens do material biológico. Por conseguinte, o padrão de calibração é realizado de forma que este pode constituir um componente integral de um dispositivo de análise. De acordo com a presente invenção o padrão de calibração é caracterizado por o meio de fixação apresentar uma rosca, um conector ou um elemento de encaixe, que respectivamente é adequado, para ser repetidamente fixado em uma contrapeça do dispositivo que apresenta um contracontorno.

[0026] No caso do corante de luminescência usado preferencialmente se trata de um corante de fluorescência, que está disposto no interior do alojamento e ou se apresenta sob a forma de pó e apresenta pelo menos um fluorocromo tal como um quartzo (SiO2) ou apresenta uma resina epóxi ou um polímero semelhante que podem ser excitados para a luminescência.

[0027] De acordo com um aperfeiçoamento específico um padrãode calibração realizado de acordo com a presente invenção pode ser usado com um microscópio, uma unidade de câmera ou na região de um elemento de recepção de amostras de um scanner de microarran- jos, pelo fato de o padrão de calibração ser fixado de forma removível fixa duradoura na mesa de movimentos cruzados de um microscópio ou da unidade de câmera ou na região do elemento de recepção deamostras de um scanner de microarranjos.

[0028] Em seguida a presente invenção é mais detalhadamenteexplicada sem limitação do pensamento geral subjacente à presente invenção sob consideração das figuras. A:

[0029] Figura 1 um apresenta um microscópio de fluorescênciaautomático com um padrão de calibração, e;

[0030] Figura 2 apresenta um padrão de calibração realizadode acordo com a presente invenção.

[0031] A Figura 1 apresenta esquematicamente um dispositivo 1para a análise óptica de material biológico 6, que apresenta um padrão de calibração 7 realizado de acordo com a presente invenção. No caso do material biológico 6 a ser analisado neste caso se trata de amostras de tecido incubadas com um soro de paciente e pelo menos um marcador de fluorescência. As amostras de tecido 6 são dispostas em um suporte de objetos 5, que por sua vez está posicionado sobre o elemento de recepção 3 da unidade de análise 1, neste caso uma mesa de movimentos cruzados. Como dispositivo 1 para a análise óptica de material biológico 6 é usado um microscópio de fluorescência, que apresenta um dispositivo de controle 17, que assegura, que a análise das amostras 6 opcionalmente pode ser realizada manualmente ou pelo menos parcialmente automaticamente. Para o registro das imagens do material biológico 6 a ser analisado marcado com um corante de fluorescência está prevista uma unidade de câmera 4 para a geração de imagens, que em um procedimento automático focaliza respectivamente a amostra 6 a registrar e subsequentemente gera pelo menos uma imagem de fluorescência da amostra 6 e a armazena em um dispositivo de armazenamento de dados 18.

[0032] Antes do início da primeira análise o microscópio de fluorescência automático 1 é calibrado no âmbito do procedimento laboratorial convencional. Para este efeito na mesa de movimentos cruzados3 do microscópio está previsto um padrão de calibração 7, que apresenta um pó fluorescente 12 acondicionado em um alojamento 9. No caso do pó fluorescente 12 usado preferencialmente se trata de uma mistura de um fluorocromo e de um dióxido de silício (SiO2), em que para uma parte de fluorocromo existem pelo menos 300 partes de dióxido de silício (SiO2 = quartzo). O alojamento 9 do padrão de calibra- ção 7 no respectivo lado superior associado à fonte de radiação 2 do microscópio de fluorescência 1, neste caso um LED azul, apresenta uma janela 8, que, por um lado, é transparente para a radiação de excitação 15, e, por outro lado, é parcialmente transparente para a radiação de fluorescência 16 emitida pelo corante de fluorescência 12 no estado excitado. Além disso na janela 8 do alojamento 9 está prevista uma marcação 13 sob a forma de um retículo, que é focalizada antes do procedimento de calibração com o auxílio da unidade de registro de imagens 4. Desta forma pode ser assegurado que mesmo durante a calibração do microscópio de fluorescência 1 está constantemente ajustada a distância correta (direção Z) entre a unidade de registro de imagens 4 e o padrão de calibração 7 e, por conseguinte, são obtidos resultados de medição fiáveis. Além disso a janela 8 apresenta uma marcação adicional 14, que permite a determinação da posição inicial assim como de uma posição do padrão de calibração 7 em um plano paralelo (posição XY) em relação à mesa de movimentos cruzados 3.

[0033] Depois de o padrão de calibração 7 ter sido focalizado e arespectiva posição em relação à unidade de registro de imagens 4 ter sido estabelecida, pelo fato de a mesa de movimentos cruzados 3 do microscópio de fluorescência 1 ter sido deslocada correspondentemente, a unidade de registro de imagens 4 determina a intensidade de radiação da radiação de fluorescência 16 emitida pelo padrão de cali- bração 7. Por meio da calibração é assegurado que as medições de fluorescência das diferentes amostras biológicas 6 realizadas depois da calibração conduzem constantemente a resultados comparáveis. Com o auxílio do padrão de calibração 7 usado é implementado um padrão, que assegura e verifica a durabilidade do microscópio de fluorescência 1. O corante de fluorescência 12 usado, neste caso uma mistura de fluorocromo e de dióxido de silício, é caracterizado, por um lado, pela respectiva durabilidade e, por outro lado, pela semelhança do respectivo espectro com o espectro do corante IFT, o chamado FITC, usado convencionalmente para a marcação de fluorescência de material biológico 6.

[0034] Considerando que no caso do padrão de calibração 7 usado de acordo com a presente invenção se trata de um padrão rastreá- vel, que foi verificado espectrometricamente quanto ao padrão de intensidade de radiação certificado, o padrão de calibração 7 pode ser usado como meio de verificação. Além da estabilidade, quer dizer da comparabilidade de diferentes microscópios de fluorescência 1, pode ainda ser verificada a comparação dos sistemas entre si.

[0035] A unidade de iluminação 2 do microscópio de fluorescência1 apresenta um LED como fonte de radiação. A excitação com o auxílio de um LED apresenta a grande vantagem de por meio da filtração e da representação até à detecção com a câmera 4 a totalidade da cadeia de representação poder ser verificada ou controlada ou até regulada conjuntamente com o auxílio do padrão de calibração 7 usado.

[0036] A Figura 2 apresenta uma vista detalhada do padrão de ca-libração 7 usado para a calibração. O padrão de calibração 7 apresenta um alojamento em aço 9, em que é introduzida uma janela 8 no respectivo lado superior. O padrão de fluorescência sob a forma de pó 12 usado é introduzido através de uma abertura 10 no lado inferior do padrão de calibração 7 durante a produção do padrão de calibração 7 e subsequentemente a abertura 10 é fechada e colada com o auxílio de uma tampa 11. Na região inferior, o padrão de calibração 7 apresenta uma rosca externa como meio de fixação 19, por meio da qual o padrão de calibração 7 pode ser aparafusado em uma rosca interna prevista para este efeito na mesa de movimentos cruzados 3 de uma unidade de análise 1 para a geração de imagens de fluorescência. O padrão de calibração 7 é conectado fixamente com a unidade de análise 1, particularmente um microscópio de fluorescência de operação automática com unidade de câmera 4 e, por conseguinte, constitui um componente integral da unidade de análise 1. O padrão de calibração 7 por conseguinte não tem de ser novamente posicionado na trajetória de feixe da radiação de excitação 15 durante cada medição ou durante cada início de uma nova série de medições.

[0037] No lado superior da janela 8 está previsto um retículo 13como marca. Abaixo da janela 8 se encontra o corante de luminescência sob a forma de pó 12, neste caso um corante de fluorescência, que é realizado como uma mistura de fluorocromo, particularmente com base em uma mistura de ortosilicato-dióxido de silício dotada.

[0038] O retículo 13 aplicado no lado superior da janela 8 servepara a focalização exata e reprodutível do padrão de calibração 7 com o auxílio da objetiva, que neste caso é uma parte da unidade de geração de imagens 4 de um microscópio de fluorescência de operação automática. Preferencialmente são usadas objetivas com uma ampliação de 20 vezes ou de 40 vezes e a focalização é realizada na direção X, Y e Z. Por meio de uma focalização realizada desta forma do padrão de calibração 7 é constantemente ajustada uma distância definida entre a unidade de geração de imagens ou de registro de imagens 4, particularmente a objetiva correspondente, e o padrão de calibração 7, de forma que é assegurada uma iluminação reprodutível e homogênea no campo visual da unidade de registro de imagens 4, por exemplo, uma câmera. A medição da intensidade da radiação de fluorescência 16, que é emitida pelo padrão de calibração 7, por conseguinte é re-produtível.

[0039] Quando as medições adicionais são realizadas com o auxílio do padrão de calibração 7, tal como a determinação da medida de representação ou a definição e a calibração da posição XY assim como da posição inicial, na superfície da janela são aplicadas marcas 14 adequadas para o efeito adicionais.

[0040] Considerando que o corante de fluorescência 12 usadoapresenta uma densidade luminosa elevada, a intensidade de radiação é atenuada por meio de medidas adequadas no padrão de cali- bração 7. Desta forma a radiação de fluorescência 12 do padrão de calibração 7 é adaptado à densidade luminosa do corante de fluorescência (FITC) usado convencionalmente para a marcação do material biológico 6.

[0041] A maior influência sobre a atenuação da intensidade de radiação é exercida pela mistura do fluorocromo sob a forma de pó com dióxido de silício. Geralmente neste caso são usadas misturas, em que uma parte do fluorocromo é misturada com pelo menos 300 partes de dióxido de silício. No alojamento 9 do padrão de calibração 7 se podem encontrar entre 180 mg e 220 mg da mistura sob a forma de pó 12 de fluorocromo e de dióxido de silício.

[0042] Para a diluição do fluorocromo com dióxido de silício podemser tomadas medidas de atenuação adicionais no padrão de calibra- ção 7. Por um lado, a janela 8 pode ser revestida com um filtro cinzento parcialmente transparente no lado traseiro, que reduz a excitação e a emissão, de forma que a intensidade de radiação da radiação de fluorescência 16 emitida pelo padrão de calibração 7 é significativamente reduzida. A radiação de fluorescência 16 emitida é atenuada, de forma que a intensidade de radiação da radiação de fluorescência 16 do padrão de calibração 7 é essencialmente adaptada à intensidade de radiação da radiação de fluorescência emitida durante a análise do ma-terial biológico 7.

[0043] Alternativamente ou adicionalmente ao uso de um filtro cinzentoé igualmente possível que a janela 8 apresente uma estrutura de orifícios de encaixe no lado traseiro, cuja proporção de aspecto define a transmissão. Também neste caso, por sua vez, é alcançada uma redução da intensidade da radiação de fluorescência 16 emitida pelo padrão de calibração 7. Uma outra variante prevê que a janela 8 seja parcialmente transparente espectralmente para a radiação de fluorescência 16 proveniente do padrão de fluorescência 7 e eventualmente igualmente para a radiação de excitação 15. Desta forma em combinação com o espectro de emissão do fluorocromo pode ser adaptado o espectro emitido.

[0044] Por meio do uso de filtros passa-banda longos adequadosneste caso é igualmente possível a adaptação do espectro de emissão do padrão de calibração 7 aos espectros correspondentes de outros corantes de fluorescência, que emitem, por exemplo, luz vermelha.

[0045] Devido a uma tolerância muito estreita da espessura da janela se reduz adicionalmente a difusão de produção dos padrões entre si. Uma espessura de janela constante na produção é assegurada pelo fato de a janela 8 ser polida até alcançar a medida final desejada antes da montagem no alojamento 9.

[0046] O padrão de calibração 7 representado na Figura 2 e acimareferido é caracterizado sobretudo por ser rastreável em um padrão ou em uma fonte de luz de referência. Para assegurar isto, cada padrão de calibração 7 é calibrado em uma construção mecânica depois da respectiva produção. A construção mecânica neste caso apresenta um elemento de recepção para o padrão de calibração 7, que é excitado para a radiação de fluorescência com o auxílio de um díodo a laser. Neste caso é possível que o díodo a laser seja substituído por uma outra fonte de radiação de banda estreita adequada. A potência de ra- diação do padrão de calibração 7 excitado para a radiação de fluorescência é medida e ajustada com o auxílio de um detector calibrado. Neste caso o díodo a laser é operado de forma regulada estável quanto à temperatura e à potência de radiação. Devido ao uso de uma excitação de banda estreita é seguramente evitada a sobreposição do espectro de excitação e do espectro de emissão, de forma que o espectro de emissão do padrão de calibração 7 pode ser medido totalmente espectralmente.

[0047] O sistema de espectrômetro usado para a medição foiigualmente calibrado de forma rastreável com uma fonte de radiação certificada. O padrão de calibração 7 é excitado para a radiação com um díodo a laser, o espectro de emissão é detectado com o espectrô- metro calibrado, de forma que é assegurada uma medição da densidade luminosa rastreável para a fonte de radiação certificada. Por conseguinte o padrão de calibração 7 descrito pode ser usado como meio de verificação. Preferencialmente é usado um padrão de densidade luminosa certificado, o chamado "padrão mestre", durante a produção. Este, durante a produção de unidades de análise 1, tal como microscópios de fluorescência de operação automática, serve para a comparação das unidades de análise 1 entre si com o padrão de cali- bração 7 montado nestas, derivado do mestre. Com o auxílio do padrão de calibração 7 realizado de acordo com a presente invenção podem ser disponibilizados microscópios de fluorescência que, por um lado, são simples de calibrar e, por outro lado, são duradouros e podem ser comparados entre si. Esta vantagem é alcançada pelo fato de na produção do padrão de calibração 7 pela excitação por meio do LED através da filtração e da representação até à detecção com a unidade de câmera 4, a cadeia de representação completa poder ser verificada ou controlada ou até regulada conjuntamente. Por outro lado, o padrão de calibração 7 realizado de acordo com a presente invenção é um componente integrante da unidade de análise 1 e preferencialmente permanece no aparelho durante a totalidade da vida útil. Lista dos números de referência 1 Dispositivo de análise 2 Unidade de iluminação 3 Elemento de recepção 4 Unidade de geração de imagens 5 Suporte 6 Material biológico 7 Padrão de calibração 8 Janela 9 Alojamento 10 Abertura 11 Tampa 12 Corante de luminescência 13 Marcação para a focalização 14 Marcação adicional 15 Radiação de excitação 16 Radiação de luminescência 17 Dispositivo de controle 18 Dispositivo de armazenamento de dados 19 Meio de fixação

Claims (14)

1. Dispositivo (1) para a representação por imagens de material biológico (6), - compreendendo uma unidade de iluminação (2), que apresenta uma fonte de radiação, por meio da qual pode ser emitida uma radiação de excitação (15) eletromagnética, - compreendendo um elemento de recepção (3) para o po-sicionamento do material biológico (6) disposto em um suporte (5) dentro de uma trajetória de feixe da radiação de excitação (15), - compreendendo pelo menos uma unidade de geração de imagens (4), que recebe a radiação de luminescência (16) emitida pelo material biológico (6) em função da excitação pela radiação de excitação (15) e que gera uma imagem pelo menos das regiões do material biológico (6) excitadas para a luminescência, e, - compreendendo um padrão de calibração, que emite uma radiação de calibração em função da excitação pela radiação de excitação (15), que é registrada pela unidade de geração de imagens e sob consideração da radiação de calibração registrada pode gerar um sinal de calibração em um dispositivo de controle (17), caracterizado pelo fato de o padrão de calibração apresentar um alojamento (9) pelo menos parcialmente enchido com uma substância (12) que pode ser excitada para a luminescência neste, que está montado na unidade de iluminação (2) ou no elemento de recepção (3) por meio de pelo menos um meio de fixação (19) sendo que padrão de calibração (7) é implementado de forma rastreável, de modo que com os resultados de medição gerados com ajuda do padrão de calibração (7) sejam rastreados em uma fonte de radiação certificada ou por um padrão calibrado por uma fonte de radiação certificada.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pela substância luminescente (12) no alojamento (9) do padrão de calibração (7) estar fechada em relação ao meio ambiente.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo alojamento (9) apresentar uma janela (8).

4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopela janela (8) apresentar uma marcação (13) para a determinação de uma distância definida entre um sistema óptico da unidade de geração de imagens (4) e o padrão de calibração (7).

5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, carac-terizadopela janela (8) apresentar pelo menos um meio de atenuação, por meio do qual é reduzida uma intensidade da radiação de cali- bração emitida pela substância luminescente durante a passagem através da janela (8).

6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo meio de atenuação estar disposto em uma superfície da janela (8) voltada para a substância luminescente (12) e apresentar um filtro cinzento parcialmente transparente e/ou uma estrutura de orifícios de encaixe e/ou ser realizado de forma parcialmente transparente em relação a um espectro da radiação de excitação (15) e/ou da radiação luminescência (16) emitida.

7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela substância luminescente (12) ser realizada sob a forma de pó.

8. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela substância luminescente (12) poder ser excitada para a fluorescência pela radiação de excitação (15).

9. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela substância luminescente (12) conter pelo menos fluorocromo e quartzo pulverizado (SiO2).

10. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pela substância luminescente (12) compreender uma resina epóxi ou um polímero semelhante.

11. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo meio de fixação (19) ser realizado como rosca externa disposta no alojamento (9).

12. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo elemento de recepção (3) ser uma mesa de movimentos cruzados de um microscópio ou um elemento de recepção de amostras de um scanner de microarranjos.

13. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo padrão de calibração (7) ter sido calibrado por meio de uma fonte de radiação certificada ou por meio de um padrão calibrado por uma fonte de radiação certificada.

14. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela fonte de radiação da unidade de iluminação (2) ser um LED calibrado em conformidade com um padrão.

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