DE102016208967B4

DE102016208967B4 - Photometer mit quantitativer Volumenerfassung

Info

Publication number: DE102016208967B4
Application number: DE102016208967.6A
Authority: DE
Inventors: Markus Meusel; Christian Prokisch
Original assignee: Axagarius GmbH and Co KG
Current assignee: Axagarius GmbH and Co KG
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2024-04-18
Anticipated expiration: 2036-05-25
Also published as: DE102016208967A1

Abstract

Verfahren zur photometrischen Messung einer Probenlösung, wobei die Probenlösung mit mindestens einer Reaktionslösung vermischt wird und in diesem Gemisch die Konzentration von mindestens einem Probenbestandteil photometrisch bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnung der Probenlösung durch die Mischung mit der mindestens einen Reaktionslösung mittels einer oder mehrerer in der mindestens einen Reaktionslösung vorhandenen Kalibriersubstanzen erfasst wird, in dem die Kalibriersubstanz(en) photometrisch und spektrometrisch quantifiziert werden, wobei die photometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz(en) nicht mit der photometrischen Quantifizierung des mindestens einen Probenbestandteils interferiert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Probenmessung unter Verwendung einer internen Kalibriersubstanz zur Berechnung einer korrigierten, die Verdünnung berücksichtigenden, Probenkonzentration.
Lösungen gefärbter Stoffe erscheinen umso intensiver, je höher die Konzentration der Stoffe in der Lösung ist. Die Farbe entsteht durch Absorption bestimmter Wellenlänge durch die gelösten Substanzen.
In der Photometrie wird diese Absorption sehr präzise gemessen und daraus die Konzentration der gelösten Substanz ermittelt. Üblicherweise wird Licht einer bestimmten Wellenlänge durch die Probe geleitet, dem Licht wird die Ausgangsintensität I₀ zugeordnet. Das Licht hinter der Probe (nach Absorption durch in der Lösung vorhandene Bestandteile der Probe) wird als Intensität 1 gemessen. Der Quotient aus I und I₀ wird als Transmission bezeichnet. Ausgehend von der Transmission wird eine weitere wichtige Größe, die dimensionslose Extinktion, bestimmt. Die Extinktion wird üblicherweise mit einem Photometer bestimmt, bei dem die in einer Messküvette vorliegende Probe von einem Lichtstrahl durchquert wird und mittels eines hinter der Küvette angeordneten Detektors die Abschwächung der Intensität gemessen wird.
In der Analytik interessiert zumeist jedoch nicht direkt die Extinktion, sondern die Konzentration der gelösten Substanz. Diese kann jedoch aus der Extinktion E nach dem Gesetz von Lambert-Beer einfach bestimmt werden. Hier gilt: E = ε × c × d, mit ε als Extinktionskoeffizienten, dem Durchmesser der Küvette im Strahlengang d. und der Stoffkonzentration c. Mit bekannten Werten für ε und d kann damit leicht über die Extinktion die Stoffkonzentration c ermittelt werden.
Hiermit wird klar, dass der gemessene Extinktionswert unmittelbar ein Maß für die Konzentration darstellt. Üblicherweise wird zunächst eine Kalibration mit bekannten Konzentrationen einer Substanz erstellt und dann anhand der Extinktion unbekannter Proben deren Konzentration berechnet. Bei der praktischen Durchführung kann z.B. eine Reaktionslösung in der Küvette vorgelegt werden. Wird Probe hinzugegeben, so reagieren Bestandteile der Reaktionslösung mit den Probenbestandteilen und es erfolgt eine konzentrationsabhängige Farbreaktion. Dabei ist es sehr wichtig, dass das Volumen der Probe möglichst exakt zuzugeben wird, da diese ja durch die vorgelegte Reaktionslösung verdünnt wird.
US 2004 / 0 136 871 A1 betrifft eine Methode zur Detektion einer Unterdosierung auf einem Teststrip, wobei der Nachweis der Unterdosierung durch die Verwendung einer Kontrollsubstanz und die Bestrahlung des analytischen Testelements in einem Kontrollwellenlängenbereich erfolgt.
EP 2 543 988 A1 betrifft eine Methode zur Bestimmung der optischen Pfadlänge des Testobjekts in einem Spektralphotometer durch Verwendung eines Pigments, das in einer definierten Konzentration in der zu vermessenden Lösung enthalten ist, so dass, basierend auf dem Lambert-Beer'schen Gesetz, durch Messung der Extinktion die Schichtdicke berechnet werden kann.
JP 2002- 228 587 A betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Volumens einer Flüssigkeitsprobe, wobei die Probe mit Ionen versetzt wird, die mit einem chromophoren Indikator eine Färbung der Probe erzeugen. Zur Messung des dispensierten Flüssigkeitsvolumens wird die Flüssigkeitsprobe in eine den chromophoren Indikator enthaltende Flüssigkeit pipettiert und auf ein bestimmtes Volumen aufgefüllt. Diese resultierende Mischung wird dann photometrisch vermessen und anhand einer Eichgerade kann dann auf das ursprünglich hinzupipettierte Volumen zurückgeschlossen werden.
DE 10 2006 023 083 A1 betrifft Vorrichtungen und Verfahren auf dem Gebiet der makrozyklischen Wirtsysteme und Fluoreszenzfarbstoffe zur Bestimmung einer Konzentrationsänderung eines Analyten in wässriger Lösung (> 50 Gew.-% Wassergehalt). DIN ISO 15705 2003-01-00 betrifft die Bestimmung der Wasserbeschaffenheit und insbesondere des chemischen Sauerstoffbedarfs.
EP 1 221 341 A1 betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Testkit zur Durchführung dieses Verfahrens zur Bestimmung des Volumens einer Probe einer Flüssigkeit. Bei dem Verfahren wird - zum Anfärben der Flüssigkeit eine bestimmte Konzentration eines chromophoren Indikators in dieser Flüssigkeit erstellt, eine Probe von der Flüssigkeit abgetrennt, die optische Absorption der abgetrennten Probe gemessen und das Volumen der abgetrennten Probe durch Korrelation der gemessenen optischen Absorption mit der Konzentration des Indikators in dieser Flüssigkeit bestimmt. Als Indikator zum Anfärben der Flüssigkeit werden Ionen verwendet, welche durch Komplexierung mit einem spezifischen Liganden die Färbung der Probe erzeugen.
In vielen Fällen ist nun eine Probenvorbehandlung vor der eigentlichen photometrischen Messung notwendig. Ein solcher Fall liegt beispielsweise bei der photometrischen CSB-Bestimmung vor. Der CSB (chemischer Sauerstoffbedarf) ist ein Maß für die Belastung von Wasser mit organischen Substanzen. Dieser Parameter liefert beispielsweise Anhaltspunkte für die Reinigungsleistung (Effizienz) von Kläranlagen und wird im Zu- und Ablauf von Kläranlagen gemessen.
Bei diesem Parameter kann es aber zu Störungen der Messung durch im Wasser vorhandene Chlorid-Ionen kommen. Üblicherweise wird die Störung durch Chlorid dadurch eliminiert, dass zur Reaktionslösung Quecksilbersalze gegeben werden, z.B. Quecksilbersulfat. Aus Gründen des Umweltschutzes möchte man gerne auf das Quecksilber verzichten. In einem verbesserten Verfahren wird das Chlorid im Rahmen einer Probenvorbereitung durch Fällung z.B. mit Silbersulfat entfernt. Der Anwender zieht dazu üblicherweise eine Wasserprobe in eine Kartusche, in der sich Silbersulfat befindet. Dann wird die Kartusche geschüttelt und die klare, vom Chlorid befreite Lösung in ein Reaktionsglas gegeben. Aus diesem Gefäß wird dann eine definierte Menge (z.B. exakt 2 ml) in eine Küvette mit Reaktionslösung für die CSB Bestimmung gegeben. Um Verdünnungsfehler zu vermeiden, ist die exakte Zugabe an dieser Stelle kritisch.
Da das Volumen exakt bestimmt werden muss, ist eine Zugabe direkt aus der Kartusche nicht möglich. Die Verwendung eines weiteren Gefäßes und die nachfolgende exakte Dosierung mit einer Pipette sind unumgänglich. Dies Verfahren ist somit aufwändig und fehleranfällig, insofern es einen Pipettierschritt als essentiellen Schritt des Verfahrens beinhaltet.
Selbst bei Verwendung einer Pipette ist können Pipettierfehler auftreten, die dann unweigerlich zu einer fehlerhaften Konzentrationsbestimmung führen.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten Verfahren und Mittel zur photometrischen Bestimmung von Probenkonzentrationen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein photometrisches Testverfahren dahingehend zu verbessern, dass sie bezüglich mindestens einer der oben genannten Nachteile verbessert wird.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch den Gegenstand des Hauptanspruchs gelöst. Spezifische Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der zusätzlichen abhängigen oder unabhängigen Ansprüche.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur photometrischen Messung einer Probenlösung, wobei die Probenlösung mit mindestens einer Reaktionslösung vermischt wird und in diesem Gemisch die Konzentration von mindestens einem Probenbestandteil photometrisch bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnung der Probenlösung durch die Mischung mit der mindestens einen Reaktionslösung mittels einer oder mehrerer in der mindestens einen Reaktionslösung vorhandenen Kalibriersubstanz erfasst wird, in dem die Kalibiersubstanz(en) photometrisch und spektrometrisch quantifiziert werden, wobei die photometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz(en) nicht mit der photometrischen Quantifizierung des mindestens einen Probenbestandteils interferiert. Die Erfindung und die bevorzugten Ausführungsformen sind aus den Ansprüchen ersichtlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren vereinigt mehrere entscheidende Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren.
Wie die Erfinder festgestellt haben, stellt eine in der Reaktionslösung vorhandene Kalibriersubstanz eine präzise und anwendungsfreundliche Möglichkeit bereit, die Verdünnung der Probenlösung durch Vermischung mit der Reaktionslösung zu erfassen, und damit entsprechend eine Volumenkorrektur durchzuführen. Damit kann basierend auf der direkt über die Extinktion ermittelten Konzentration C_gemessen eines vermessenen Probenbestandteils eine korrigierte Konzentration C_korrigiert berechnet werden.
Da die Bestimmung der Verdünnung ebenso wie die Bestimmung der Probenkonzentration photometrisch erfolgt, kann die Messung in einem Gerät durchgeführt werden. Es werden keine zusätzlichen Messsubstanzen, Messverfahren oder Messgeräte benötigt.
Ein besonderer Vorteil ist, dass die Zugabe der Probenlösung nicht exakt erfolgen muss, da über den per Kalibriersubstanz ermittelten Verdünnungsfaktor immer auf die originäre Konzentration zurückgerechnet werden kann. Es kann somit sogar ganz auf eine Pipettiervorrichtung verzichtet werden. Der Benutzer kann beispielsweise die Probenflüssigkeit mittels einer an der Messküvette vorhandenen Markierung zugeben, ohne das Volumen exakt bestimmen zu müssen. Durch die photometrisch erfasste Konzentration der Kalibriersubstanz wird der Verdünnungsfaktor dann exakt erfasst und direkt zur Berechnung der photometrischen Daten verwendet.
Dies ist gerade auch bei Messungen außerhalb eines Laboratoriums, wie beispielsweise bei Feldmessungen oder Messungen in Kläranlagen von Vorteil, da neben einem portablen Photometer lediglich die mit Reaktionslösung vorbereiteten Messküvetten benötigt werden.
Das offenbarte Photometer bietet den Vorteil, dass die Messwerte mit Hilfe einer in dem Photometer vorhandenen Datenverarbeitungseinheit ausgewertet werden können.
Die photometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz kann anhand verschiedenster Messparameter erfolgen, wie beispielsweise Extinktion, Fluoreszenz oder Polarisation. Der Fachmann kann hier entsprechend den apparativen oder analytischen Anforderungen den geeigneten Messparameter auswählen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorteilhaft für komplexere Analysestrategien eingesetzt werden. So kann nach einer ersten Messung eine weitere Reaktionslösung hinzugegeben werden (z. B. um durch Derivatisierung eines Reaktionsprodukts eine Differenzialanalytik zu betreiben) um dann bei einer erneuten photometrischen Quantifizierung dieses zweiten Reaktionsprodukts die durch die zweite Reaktionslösung hervorgerufene zusätzliche Verdünnung zu berücksichtigen. So können Probenlösungen in kontrollierter Weise verdünnt werden, bzw. die Verdünnung quantitativ erfasst werden. Hierfür kann die verdünnungs-assoziierte Abnahme der Extinktion der mindestens einen Kalibriersubstanz herangezogen werden.
Zudem kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu dienen, Fehler zu vermeiden, so kann eine zu geringe Befüllung der Messküvette, die mit einer zu geringen Verdünnung einhergeht, detektiert werden und beispielsweise in einem Warnhinweis an den Benutzer resultieren. Dies gilt auch für Messungen, bei denen die Probenlösung exakt zudosiert wird, beispielsweise mit Hilfe einer Pipette.
Weiterhin erlaubt das Verfahren völlig neue photometrische Analysemöglichkeiten. So können auch viskose oder gelförmige und damit schwer pipettierbare Probensubstanzen in kontrollierter Weise der Messküvette zugegeben werden, ohne dass eine genaue Volumenbestimmung oder ein genaues Abwiegen erforderlich sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren erleichtert auch die Erstellung einer Reaktionskinetik, insofern die durch die Extinktionsänderung der mindestens einen Kalibriersubstanz die Zugabe eines notwendigerweise verdünnend wirkenden „Startreagenzes“ die kinetische Messung zeitlich präzise erfasst werden kann und damit der Start der kinetischen Messung exakt bestimmt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ohne Mehraufwand in die bereits etablierten Testsysteme integriert werden und darüber hinaus mit den etablierten Photometern durchgeführt werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Verwendung mindestens einer Kalibriersubstanz in der Reaktionslösung. Durch Zugabe von weiteren Lösungen, hier insbesondere der Probenlösung (oder auch mehrerer Probenlösungen), wird die Reaktionslösung und damit auch die in ihr enthaltende mindestens eine Kalibriersubstanz in gleichem Maße verdünnt. Handelt es sich bei der Kalibriersubstanz um eine chromophore Substanz so geht diese Verdünnung mit einer photometrisch erfassbaren Abnahme ihrer Extinktion einher.
Erfindungsgemäß wird die Verdünnung der Probenlösung durch die Reaktionslösung mit Hilfe der Kalibriersubstanz in der Reaktionslösung erfassbar. Diese Kalibriersubstanz kann durch eine Differenzmessung erfasst werden, indem zunächst die Reaktionslösung vor Zugabe der Probenlösung vermessen wird und dann erneut nach Zugabe und Vermischung mit der Reaktionslösung. Die Differenzmessung ist dabei optional, alternativ kann die Kalibriersubstanz nur nach Zugabe der Probenlösung gemessen werden. Falls diesem Gemisch noch weitere Lösungen hinzugegeben werden, kann hier erneut durch die spektrometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz die genauen Verdünnungsfaktoren berechnet werden.
Erfindungsgemäß soll die photometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz(en) nicht mit der photometrischen Quantifizierung des mindestens einen Probenbestandteils interferieren. Dies bedeutet, dass eine Veränderung in der Konzentration der Kalibriersubstanz die photometrische Quantifizierung der Probensubstanz nicht oder nur unwesentlich stört und umgekehrt, dass eine Veränderung in der Konzentration der Probensubstanz die photometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz nicht oder nur unwesentlich stört. Dies kann beispielsweise dadurch erzielt werden, dass sich bei Messung der Extinktion die Extinktionspeaks der beiden Substanzen nicht oder nur unwesentlich überlappen.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die mindestens eine Kalibriersubstanz in der Reaktionslösung in einer Konzentration vor, die mit einer Extinktion in einer Standardmessküvette von 0,1 bis 1,0 und bevorzugt von zwischen 0,2 und 0,8 einhergeht. Damit liegt die Extinktion im bevorzugten Messbereich von Photometern und erlaubt eine genaue und fehlerfreie Messung.
Da die Probensubstanz im allgemeinen durch das analytische Problem vorgegeben ist, wird der Fachmann ausgehend von der breiten Palette möglicher Kalibriersubstanzen die geeignete Kalibriersubstanz identifizieren können, die nicht mit der Messung der Probe interferiert.
Weiterhin sollte die Kalibriersubstanz chemisch stabil sein, d.h. keine Reaktion mit der Probenlösung eingehen, die zu einem abweichenden photometrischen Verhalten führt. Diese Abweichungen betreffen immer das entsprechende photometrische Messverfahren. So sollte bei Messung der Extinktion der Extinktionskoeffizient unverändert bleiben, bei Messung der Fluoreszenz die Lage und Intensität der Emissionspeaks und bei der Polarisation der spezifische Drehwinkel [α]. Auch pH-Wertschwankungen sollten ohne Einfluss auf die Messung bleiben. Gerade Veränderungen des pH-Wertes können bei Substanzen zu einer Veränderung der photometrischen Eigenschaften führen, wie es klassischerweise bei pH-Indikatoren der Fall ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die photometrische Konzentrationsbestimmung des mindestens einen Probenbestandteils als Ergebnis der Mischung mit der Reaktionslösung durch die Bildung mindestens eines chromophoren Reaktionsprodukts oder durch die Abnahme mindestens eines in der Reaktionslösung vorhanden chromophoren Reaktanten. Dies stellt die beiden hauptsächlichen Mechanismen dar, durch die ein Probebestandteil nach Reaktion mit Bestandteilen der Reaktionslösung quantifiziert werden kann. In einer ersten Ausführungsform entsteht ein chromophores Reaktionsprodukt. Dieses kann direkt durch die Reaktion aus dem Probenbestandteil als Produkt hervorgehen oder aber mittelbar entstehen, z.B. durch eine Weiterreaktion des Produkts (oder eine Komplexierung oder Chelatisierung desselben).
In einer alternativen Ausführungsform wird durch die Reaktion mit dem Probenbestandteil die Konzentration eines chromophoren Reaktanten in der Reaktionslösung verringert. Dies kann durch eine direkte Reaktion mit dem Probenbestandteil geschehen, wodurch der chromophore Reaktant zu einem Produkt mit abweichenden chromophoren Eigenschaften abreagiert und entsprechend dessen Konzentrationsabnahme photometrisch quantifiziert werden kann.
Das Vorliegen von photometrisch unterscheidbaren Reaktanten-Reaktionsprodukt-Paaren erlaubt es, auch über eine einfache Quantifizierung hinaus, durch eine vertiefte Analyse (wie bspw. durch eine Messung bei mehreren Wellenlängen oder Aufnahme eines Spektrums) die korrekte Umsetzung des Reaktanten nachzuvollziehen und damit die Messung einem Qualitätscheck zu unterziehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich hierbei den unterschiedlichsten photometrischen Verfahren bedienen. So kann die photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz und/oder des mindestens einen Reaktionsprodukts / Reaktanten durch Messung eines der folgenden Messparameter erfolgen: Lumineszenz wie Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, Polarisation, Extinktion oder Reflexion. Bevorzugtes Messverfahren ist hierbei die Messung der Extinktion.
In einer Ausführungsform werden sowohl Kalibriersubstanz(en) als auch Reaktionsprodukt/Reaktant mit demselben Messverfahren erfasst, also beispielsweise beide durch Messung der Extinktion. Dies ist apparativ besonders einfach, weil das Photometer nur zur Durchführung dieses einen Messparameters eingerichtet sein muss. Dies bedingt aber auch eine spektrometrische Differenzierung der beiden Klassen innerhalb dieses Messverfahrens, also bspw. durch unterschiedliche Extinktionsmaxima bzw. Extinktionspeaks.
Erfindungsgemäß erfolgt daher in einer Ausführungsform die photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz und/oder des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktanten bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen oder unterschiedlichen Detektionswellenlängen.
In einer alternativen Ausführungsform werden Kalibriersubstanz(en) und Reaktionsprodukt/Reaktant mit unterschiedlichen Messverfahren erfasst, also beispielsweise die Kalibriersubstanz durch Messung der Polarisation und das Reaktionsprodukt bzw. der Reaktant durch Messung der Extinktion. Dies erfordert zwar einen apparativen Mehraufwand, aber durch die unterschiedlichen Messverfahren ist eine gegenseitige Beeinflussung der jeweiligen Konzentrationsbestimmung weitaus unwahrscheinlicher.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Kalibriersubstanz für die im Folgenden aufgelisteten Messparameter aus der entsprechenden Gruppe ausgewählt:

• Fluoreszenz: Xanthen-Farbstoffe wie Rhodamin 6G1, Sulforhodamin und Fluorescein; Cyaninfarbstoffe wie Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, und Cy7; Cumarinfarbstoffe wie Cumarin 120, Cumarin 1, Cumarin 307, Cumarin 152, Cumarin 153 und Cumarin 6; und Oxazin-Farbstoffe;
• Phosphoreszenz: z.B. Sulfide zweiwertiger Metallionen (Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Zn²⁺)
• Polarisation: optisch aktive Substanzen aus der Klasse der Mono-, Di- und Polysaccharide; Aminosäuren, Carbonsäuren, Terpene und Alkaloide;
• Extinktion: anorganische Chromophore wie Cu(EDTA)^2-, Fe(SCN)₃, Ti(III)-Salz, Ni(II)-Salz, Fe(II)-Salz, Cr(III)-Salz, organische Chromophore wie Methylgrün, Kristallviolett, Amaranth, Carotin, Ponceau S, Tartrazin,
• Reflexion: z.B. Mikropartikel.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen einer Reaktionslösung enthaltend mindestens eine photometrisch quantifizierbare Kalibriersubstanz;
b) Optional die quantitative Erfassung der mindestens einen Kalibriersubstanz und/oder des mindestens einen Reaktanten durch eine photometrische Messung;
c) Vermischen der Reaktionslösung mit einer flüssigen Probe enthaltend den mindestens einen Probenbestandteil;
d) optionale zusätzliche Zugabe einer oder mehrerer Lösungen, wobei diese nicht photometrisch mit der Kalibriersubstanz aus Schritt a) interferieren;
e) Bildung des mindestens einen Reaktionsprodukts, oder Abnahme des mindestens einen Reaktanten in dem Gemisch aus Schritt c) oder d);
f) Separate photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz und des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktanten;
g) Berechnung der Konzentration des mindestens einen Reaktionsprodukts/ Reaktanten in der Probenlösung unter Berücksichtigung der Volumenanteile von Probenlösung und Reaktionslösung, die durch die Verdünnung der photometrisch quantifizierbaren mindestens einen Kalibriersubstanz erfassbar ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei dem oben geschilderten Messverfahren die Reaktionslösung in Schritt a) in einer Messküvette vorgelegt und die Probenlösung in die Messküvette zur Vermischung mit der Reaktionslösung hinzugegeben.
Die Konzentration der Kalibriersubstanz in der Reaktionslösung kann als c = n/V dargestellt werden. Dabei ist c die Konzentration, n die Stoffmenge und V das Volumen. Über die Quantifizierung der Kalibriersubstanz kann bei bekannter Stoffmenge das Volumen berechnet werden. So kann leicht ermittelt werden, welche Verdünnung durch die Zugabe der Probe erreicht wurde. Weicht diese vom vorher definierten SOLL-Volumen ab, kann eine Differenz zum IST-Volumen ermittelt werden. Diese Volumenkorrektur kann nun dazu herangezogen werden, um das mindestens eine Reaktionsprodukt bzw. den mindestens einen Reaktanten photometrisch zu quantifizieren und den Volumenfehler durch eine vom SOLL abweichende Probenmenge zu korrigieren.
Für die Volumenkorrektur stehen mehrere einfache mathematische Möglichkeiten zur Verfügung.
Die erfindungsgemäße Korrektur des Volumens zur photometrischen Quantifizierung des Reaktionsprodukts/Reaktanten kann durch verschiedene Verfahren erfolgen, die entweder auf im Photometer hinterlegten Formeln oder Korrekturfaktoren basieren oder auf der empirischen Berechnung von Korrekturfaktoren anhand von Funktionen oder Funktionsscharen beruhen. Folgende Korrekturverfahren seien hier beispielhaft beschrieben:

In einem ersten Verfahren wird eine allgemeine Formel zur Korrektur der Messwerte bereitgestellt.

Alternativ kann die Funktion zu Berechnung eines Korrekturfaktors empirisch ermittelt werden, wobei in die Berechnung des Korrekturfaktors nur das tatsächlich pipettierte Volumen oder die Abweichung zum korrekten Wert eingehen.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Schar von Funktionen zur Berechnung eines Korrekturfaktors empirisch ermittelt, wobei in die Berechnung des Korrekturfaktors neben dem tatsächlich pipettierten Volumen auch die tatsächlich gemessene Extinktion eingeht.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine sogenannte Korrekturmatrix empirisch ermittelt, wobei mit Hilfe der tatsächlich ermittelten Extinktion und dem tatsächlich pipettierten Volumen bzw. der Abweichung vom korrekten Volumen der Korrekturfaktor abgelesen wird.
Diese vorab beschriebenen Korrekturverfahren sind auch als eigenständige Verfahren zur Korrektur eines Messwerts basierend auf der Bestimmung des Flüssigkeitsvolumens innerhalb der Messküvette offenbart.
Offenbart ist auch eine Reaktionslösung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Reaktionslösung die folgenden Bestandteile umfasst: mindestens eine photometrisch quantifizierbare Kalibriersubstanz und mindestens ein Reaktant zur probenabhängigen Generierung mindestens eines photometrisch quantifizierbaren Reaktionsprodukts, wobei die photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz nicht mit der photometrischen Quantifizierung des mindestens einen Reaktionsprodukts interferiert.
In einem Aspekt der Offenbarung einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Reaktionslösung:

a) Puffersubstanz;
b) Kalibriersubstanz; und
c) Reaktant

In einem Aspekt der Offenbarung handelt es sich bei der Reaktionslösung um eine Reaktionslösung zur Bestimmung des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB).
In einem Aspekt der Offenbarung entspricht die CSB-Reaktionslösung den Anforderungen der ISO 15705:2002 (Wasserbeschaffenheit - Bestimmung des chemischen Sauerstoffbedarfs (ST-CSB) - Küvettentest). Neben den Bestandteilen wie Schwefelsäure und Dichromat wird der Reaktionslösung das anorganische oder organische Chromophor als Kalibriersubstanz in einer Konzentration, die mit einer Extinktion in einer Standardmessküvette von 0,1 bis 1,0 und bevorzugt von zwischen 0,2 und 0,8 einhergeht, zugegeben.
In einem Aspekt der Offenbarung wird ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt, wobei der Kit bevorzugt zur Bestimmung des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) geeignet ist und besonders bevorzugt folgendes umfasst:

• Messküvetten enthaltend eine erfindungsgemäße Reaktionslösung;
• Optional eine Kartusche enthaltend Silbersulfat;
• Optional ein portables Photometer;
• Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In einem Aspekt der Offenbarung wird ein Photometer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt, das eine Recheneinheit mit einer Software zur Berechnung der Konzentration des Probenbestandteils in der Probenlösung anhand der vorab offenbarten Formel umfasst.
Definitionen
Gemäß der Erfindung ist unter einem Photometer ein Instrument zur Messung photometrischer Größen zu verstehen. Dies kann neben Messung im sichtbaren Bereich des Lichts (400 nm bis 800 nm) auch Messungen im UV-Bereich und/oder Infrarotbereich umfassen. Als photometrische Größe kann hier die Extinktion, Fluoreszenz, Polarisation oder Reflexion einer Probe vermessen werden.
Unter einer Messküvette ist erfindungsgemäß ein Behälter zu verstehen, der die zu vermessende Flüssigkeit enthält und für die Messung der photometrischen Größe im Photometer geeignet ist. Diese Messküvette ist aus einem Material und einer Oberflächenbeschaffenheit, die im Wellenlängenbereich, der bei der Messung zur Anwendung kommt, zweckmäßigerweise stark lichtdurchlässig bzw. transparent ist. In bevorzugter Weise handelt es sich bei der Messküvette um ein Gefäß mit planparallelen Seitenflächen. Es können aber auch Rundgefäße wie Reagenzgläser als Messküvette verwendet werden.
Gemäß der Erfindung ist die Probenlösung als diejenige Lösung definiert, für die eine Konzentration mindestens eines Probenbestandteils photometrisch quantitativ bestimmt werden soll. Durch Umsetzung der Probenlösung mit der Reaktionslösung entsteht mindestens ein photometrisch detektierbares Reaktionsprodukt, das in seiner Konzentration Rückschlüsse auf die Konzentration des jeweiligen Probenbestandteils erlaubt und im Idealfall der Konzentration des Probenbestandteils entspricht. Alternativ wird durch Umsetzung der Probenlösung mit der Reaktionslösung mindestens ein photometrisch detektierbarer Reaktant abgebaut oder umgewandelt, wobei die Konzentrationserniedrigung des Reaktanten Rückschlüsse auf die Konzentration des jeweiligen Probenbestandteils erlaubt und im Idealfall der Konzentration des Probenbestandteils entspricht. Die Umsetzung kann jegliche chemische Reaktionen umfassen, wie beispielsweise Säure-Basen-Reaktion, Komplexierung, Chelatisierung, Oxidation, Reduktion, Derivatisierung, Oligomerisierung, Polymerisierung oder Spaltung.
Ausführungsbeispiele
Verwendung von Chrom(III)chlorid als interner Standard
Als Beispiel für eine internen Standard wurde ein Chrom(III)-Salz (hier: Chrom(III)chlorid) untersucht. Zunächst wurde ein Spektrum von Chrom(III)chlorid in Wasser aufgenommen (siehe 2). Das Spektrum zeigt zwei ausgeprägte Extinktionsmaxima bei 443 und 633 nm.
Anschließend wurde eine 1% Chrom(III)chlorid Lösung in 1:1 Schritten mit Wasser verdünnt und die Extinktion bei 443 und 633 nm gemessen. Die Verdünnungsreihen sind in 3 dargestellt. Wie man sieht, erhält man über einen großen Konzentrationsbereich eine sehr gute lineare Abhängigkeit zwischen Konzentration des Standards und Extinktion. Dies gilt für beide Extinktionspeaks bei 443 und 633 nm.
Würde das Chrom(III)-Salz als interner Standard im Test mitgeführt und hätte dieser nach Zugabe der Probe z.B. eine Konzentration von 0,2 Gewichtsprozent, so ließe sich eine abweichende Verdünnung durch Messung der Extinktion leicht bestimmen. Gemäß 3 A) würde die Extinktion bei 0,2 % 0,80 betragen. Würde der Standard durch eine zu hohe Menge an Probe verdünnt, z.B. auf 0,18 %, so ergäbe sich eine Extinktion von 0,72. Das abweichende Probenvolumen könnte also leicht anhand der Abnahme der Extinktion ermittelt werden.
Umgekehrt kann nun über die gemessene Extinktion des internen Standards eine Volumenkorrektur bei der Bestimmung der Konzentration des mindestens einen Probenbestandteils vorgenommen werden.
Wird der Standard beispielsweise nicht mit einer Extinktion-SOLL von 0,8 sondern mit einer Extinktion-IST von 0,72 gemessen, so kann über die Kalibrierfunktion (die auch in einer Auswerteeinheit abgelegt sein kann), eine Konzentration des internen Standards von 0,18 % (IST) im Vergleich zu 0,2 % (SOLL) ermittelt werden. In diesem Beispiel wurde also zu viel Probe zugegeben, so dass der Standard stärker verdünnt vorliegt. Der Verdünnungsfaktor kann als Konzentration des internen Standards IST/SOLL ermittelt werden. In diesem Beispiel beträgt der Faktor 0,9. Die Extinktion des Probenbestandteils kann dann leicht mit diesem Faktor multipliziert werden um eine, um den Volumenfehler korrigierte, Extinktion zu erhalten.
Die Erfindung ist zudem in den folgenden Zeichnungen dargestellt und nachfolgend beschrieben. Es zeigt:

1 eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Lichtquelle 1, einem Filter 2, der den Lichtstrahl 5 filtert, der im Strahlengang gelegenen Messküvette 3 und dem Detektor 4, wobei in (A) die Messküvette mit Reaktionslösung, in (B) die Messküvette mit Reaktionslösung und Probenlösung im unvermischten Zustand und in (C) die Messküvette mit Reaktionslösung und Probenlösung nach Vermischung dargestellt ist. Die Punktmusterdichte der Lösung soll das Ausmaß der Konzentration der Kalibriersubstanz widerspiegeln.
2 Spektrum vom Chrom(III)chlorid-Hexahydrat in Wasser.
3 Abhängigkeit der Extinktion vom der Konzentration von Chrom(III)chlorid in Wasser. A) Messung bei 443 nm; B) Messung bei 633 nm.

Bezugszeichenliste

1: Lichtquelle
2: Filter
3: Messküvette
4: Detektor
5: Lichtstrahl
6: Reaktionslösung
7: Zugegebene Probenlösung vor dem Vermischen
8: Gemisch aus Probenlösung und Reaktionslösung

Weitere Varianten der Erfindung und ihre Ausführung ergeben sich für den Fachmann aus der vorangegangenen Offenbarung, den Figuren und den Patentansprüchen.
In den Patentansprüchen verwendete Begriffe wie „umfassen“, „aufweisen“, „beinhalten“, „enthalten“ und dergleichen schließen weitere Elemente oder Schritte nicht aus. Die Verwendung des unbestimmten Artikels schließt eine Mehrzahl nicht aus. Eine einzelne Einrichtung kann die Funktionen mehrerer in den Patentansprüchen genannten Einheiten bzw. Einrichtungen ausführen. In den Patentansprüchen angegebene Bezugszeichen sind nicht als Beschränkungen der eingesetzten Mittel und Schritte anzusehen.

Claims

Verfahren zur photometrischen Messung einer Probenlösung, wobei die Probenlösung mit mindestens einer Reaktionslösung vermischt wird und in diesem Gemisch die Konzentration von mindestens einem Probenbestandteil photometrisch bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnung der Probenlösung durch die Mischung mit der mindestens einen Reaktionslösung mittels einer oder mehrerer in der mindestens einen Reaktionslösung vorhandenen Kalibriersubstanzen erfasst wird, in dem die Kalibriersubstanz(en) photometrisch und spektrometrisch quantifiziert werden, wobei die photometrische Quantifizierung der Kalibriersubstanz(en) nicht mit der photometrischen Quantifizierung des mindestens einen Probenbestandteils interferiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Konzentrationsbestimmung des mindestens einen Probenbestandteils durch die Bildung mindestens eines chromophoren Reaktionsprodukts oder durch die Abnahme mindestens eines in der Reaktionslösung vorhanden chromophoren Reaktanten als Ergebnis der Mischung mit der Reaktionslösung erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz und/oder des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktanten durch Messung eines der folgenden Messparameter erfolgt: Lumineszenz wie Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, Polarisation, Extinktion oder Reflexion, und hierbei bevorzugt durch Extinktion erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz und/oder des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktanten bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen oder unterschiedlichen Detektionswellenlängen erfolgt.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Kalibriersubstanz für die im folgenden aufgelisteten Messparameter aus der entsprechenden Gruppe ausgewählt ist: a) Fluoreszenz: Xanthen-Farbstoffe wie Rhodamin 6G1, Sulforhodamin und Fluorescein; Cyaninfarbstoffe wie Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5,und Cy7; Cumarinfarbstoffe wie Cumarin 120, Cumarin 1, Cumarin 307, Cumarin 152, Cumarin 153 und Cumarin 6; und Oxazin-Farbstoffe; b) Phosphoreszenz: Sufide zweiwertiger Metallionen; c) Polarisation: optisch aktive Substanzen aus der Klasse der Mono-, Di- und Polysaccharide; Aminosäuren, Carbonsäuren, Terpene und Alkaloide; d) Extinktion: anorganische Chromophore wie Cu(EDTA)^2-, Fe(SCN)₃, Ti(III)-Salz, Ni(II)-Salz, Fe(II)-Salz, Cr(III)-Salz, organische Chromophore wie Methylgrün, Kristallviolett, Amaranth, Carotin, Ponceau S, Tartrazin, e) Reflexion: Mikropartikel.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Kalibriersubstanz ein Fluoreszenzfarbstoff ist, dessen Absorptionspeak mit dem Extinktionspeak des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktants eine für die Quantifizierung der beiden Substanzen ausreichende Schnittmenge bildet, wobei der Emissionspeak des Fluoreszenzfarbstoff von dem Extinktionspeak des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktants so stark abweicht, dass eine separate Quantifizierung möglich ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer Reaktionslösung enthaltend mindestens eine photometrisch quantifizierbare Kalibriersubstanz; b) Optional die quantitative Erfassung der mindestens einen Kalibriersubstanz und/oder des mindestens einen Reaktanten durch eine photometrische Messung; c) Vermischen der Reaktionslösung mit einer flüssigen Probe enthaltend den mindestens einen Probenbestandteil (Probenlösung); d) optionale zusätzliche Zugabe einer oder mehrerer Lösungen, wobei diese nicht photometrisch mit der Kalibriersubstanz aus Schritt a) interferieren; e) Bildung des mindestens einen Reaktionsprodukts, oder Abnahme des mindestens einen Reaktanten in dem Gemisch aus Schritt c) oder d); f) Separate photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz und des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktanten; g) Berechnung der Konzentration des mindestens einen Reaktionsprodukts/Reaktanten in der Probenlösung unter Berücksichtigung der Volumenanteile von Probenlösung und Reaktionslösung, die durch die Verdünnung der photometrisch quantifizierbaren mindestens einen Kalibriersubstanz erfassbar ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung in Schritt a) in einer Messküvette vorgelegt wird und die Probenlösung in die Messküvette zur Vermischung mit der Reaktionslösung hinzugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8 dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Quantifizierung der mindestens einen Kalibriersubstanz für die Korrektur des Volumens der Probenlösung erfolgt, wobei die Korrektur durch eine der folgenden Verfahren erfolgt: a. Bereitstellen einer allgemeinen Formel zur Korrektur der Messwerte; b. empirische Ermittlung einer Funktion zu Berechnung eines Korrekturfaktors, wobei in die Berechnung des Korrekturfaktors zumindest das tatsächlich pipettierte Volumen oder die Abweichung zum korrekten Wert eingehen; c. empirische Ermittlung einer Schar von Funktionen zur Berechnung eines Korrekturfaktors, wobei in die Berechnung des Korrekturfaktors neben dem tatsächlich pipettierten Volumen auch die tatsächlich gemessene Extinktion eingeht; oder c. empirische Ermittlung einer Korrekturmatrix, wobei mit Hilfe der tatsächlich ermittelten Extinktion und dem tatsächlich pipettierten Volumen bzw. der Abweichung vom korrekten Volumen der Korrekturfaktor abgelesen wird.