JPH01215300A - ハイブリツド形成による定義された配列の核酸の検出方法 - Google Patents
ハイブリツド形成による定義された配列の核酸の検出方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、同じ溶液相中に存在する、検出すべき核酸の
異なる範囲に相補的な、一方の核酸プローブは検出プロ
ーブとして役立ち、化学結合により標識物質として少な
くとも1つのハプテン全結合含有し、他方の核酸プロー
ブは捕獲体 プローブとして役立ちかつ固駕マトリックスに結合され
る2つの単鎖核酸プローブでのハブリッド形成による定
義された配列の核酸の検出方法に関する。
異なる範囲に相補的な、一方の核酸プローブは検出プロ
ーブとして役立ち、化学結合により標識物質として少な
くとも1つのハプテン全結合含有し、他方の核酸プロー
ブは捕獲体 プローブとして役立ちかつ固駕マトリックスに結合され
る2つの単鎖核酸プローブでのハブリッド形成による定
義された配列の核酸の検出方法に関する。
広く使用される分子生物学的技術の1つは、相同核酸配
列を検出するためのDNA / DNA −。
列を検出するためのDNA / DNA −。
RNA / RNAないしはRNA / DNAハイブ
リッド形成である。このため、検出すべき核酸は修飾さ
れ、フィルター上に固着され、その後標識された相補的
核酸プローブでのハイブリッド形成による検出が行なわ
れる。ハイブリッド形成の場合には、検出すべき核酸と
核酸プローブの相補的配列の個々の鎖からなるハイブリ
ッド2本鎖が形成することになる。次いで、検出は相補
的核酸プローブを標識することによって行なわれる。従
来、プローブを標識するためには多くは、放射性に誘導
%iされたデスオキンリポヌクレオンド三リン酸の組み
込みが使用された。それから、ハイブリッドの検出がオ
ートラジオグラフィーによって行なわれた。放射性化合
物の取扱い不注意ならびに放射性化合物の範囲内で生じ
る他の危険の問題に基つき、核酸プローブの非放射性標
識が開発された。この標識は、たとえばビオチン/(ス
トレプト)−アビジン結合またはハプテン/抗ハプテン
抗体結合およびそれに結合した標識酵素接合体により行
なわれた。
リッド形成である。このため、検出すべき核酸は修飾さ
れ、フィルター上に固着され、その後標識された相補的
核酸プローブでのハイブリッド形成による検出が行なわ
れる。ハイブリッド形成の場合には、検出すべき核酸と
核酸プローブの相補的配列の個々の鎖からなるハイブリ
ッド2本鎖が形成することになる。次いで、検出は相補
的核酸プローブを標識することによって行なわれる。従
来、プローブを標識するためには多くは、放射性に誘導
%iされたデスオキンリポヌクレオンド三リン酸の組み
込みが使用された。それから、ハイブリッドの検出がオ
ートラジオグラフィーによって行なわれた。放射性化合
物の取扱い不注意ならびに放射性化合物の範囲内で生じ
る他の危険の問題に基つき、核酸プローブの非放射性標
識が開発された。この標識は、たとえばビオチン/(ス
トレプト)−アビジン結合またはハプテン/抗ハプテン
抗体結合およびそれに結合した標識酵素接合体により行
なわれた。
この場合、ハイブリッド形成生成物の検出は、結合され
た色素系により標識酵素の#素活性の測定によって行な
われる。しかし、非放射性系(ビオチン/(ストレプト
)−アビジン系を除く)は、放射性系に比して著しく低
い検出感度を有する、つまり感度は少なくともl/1o
に減少する。ビオチン/(ストレプト)−アビジン系で
は、ビオチン標識された核酸プローブを用いる核酸の直
接検出の場合達成可能な検出感度は放射性標識における
と同じ範囲内、即ちドツト・プロットでDNA 1〜0
.1 pgの検出およびrツムDNAフラグメント10
〜1μg中のrツムプロットでの6単コピー”遺伝因子
の検出にある。しかし、溶液中の結合された検出系にお
ける検出感度は、ビオチン/(ストレプト)−アビジン
指標系を使用する場合でも明らかに低い。
た色素系により標識酵素の#素活性の測定によって行な
われる。しかし、非放射性系(ビオチン/(ストレプト
)−アビジン系を除く)は、放射性系に比して著しく低
い検出感度を有する、つまり感度は少なくともl/1o
に減少する。ビオチン/(ストレプト)−アビジン系で
は、ビオチン標識された核酸プローブを用いる核酸の直
接検出の場合達成可能な検出感度は放射性標識における
と同じ範囲内、即ちドツト・プロットでDNA 1〜0
.1 pgの検出およびrツムDNAフラグメント10
〜1μg中のrツムプロットでの6単コピー”遺伝因子
の検出にある。しかし、溶液中の結合された検出系にお
ける検出感度は、ビオチン/(ストレプト)−アビジン
指標系を使用する場合でも明らかに低い。
従来使用された、検出すべき核酸配列のフィルター結合
の大きい欠点は、フィルターに対する単鎖核酸め吸着結
合により制約されて、たん在する核酸のかなりの部分が
/%イブリッド形成に利用されずかつ事情により全核酸
の僅か10〜30%が本来の検出に利用されるにすぎな
いからである。それに加えて、正確な検出が、フィルタ
ーに対する標識された核酸プローブの非特異的結合によ
って困難となる。
の大きい欠点は、フィルターに対する単鎖核酸め吸着結
合により制約されて、たん在する核酸のかなりの部分が
/%イブリッド形成に利用されずかつ事情により全核酸
の僅か10〜30%が本来の検出に利用されるにすぎな
いからである。それに加えて、正確な検出が、フィルタ
ーに対する標識された核酸プローブの非特異的結合によ
って困難となる。
従って、西ドイツ国特許出願公開第3546312号明
細書には、溶液中の核酸の検出のため2つの核酸プロー
ブを用いて操作し、その際プローブの一方を検出プロー
ブとして利用し、他方を捕獲7″ロープとして利用する
結合検出法が記載されている。
細書には、溶液中の核酸の検出のため2つの核酸プロー
ブを用いて操作し、その際プローブの一方を検出プロー
ブとして利用し、他方を捕獲7″ロープとして利用する
結合検出法が記載されている。
この場合、検出すべき核酸と、捕獲および検出プローブ
からなる形成した複合体は、親和力の組における取分と
して作用しうる、捕獲プローブに結合した成分により、
およびマ) IJラックス吸着結合した、親和力の組の
他の成分によりハイブリッド形成混合物から単離され、
標識物質を含有する検出プローブによって同定される。
からなる形成した複合体は、親和力の組における取分と
して作用しうる、捕獲プローブに結合した成分により、
およびマ) IJラックス吸着結合した、親和力の組の
他の成分によりハイブリッド形成混合物から単離され、
標識物質を含有する検出プローブによって同定される。
検出感度はng範囲内にある。かかるサンドインチハイ
ブリッド形成における検出プローブとしては、なかんず
く免疫学的に検出しうるハプテンが挙げられる。しかし
、ノーブチ/および相応する抗ハプテン抗体は、ビオチ
ン/(ストレプト)−アビジンの場合(K=1015モ
ル−1; Green、 N、 M、 (1975年)
” Adv、 Pro−tein Cbem、 ’第
29巻第85〜第166頁;Chaet、 L、、 W
nlf 、 Fig、 (1964年)”Arch、
Biochem、 Biophys、 ”第106巻第
1〜第5頁〕よりも著しく低い結合定数[:に=2X1
08モル−1〜7 X 1 09モ/l/−” ;
Hunter etal ” J、 Immuno
l、 ”第129巻A3 (1982年)第116頁;
Green 、 N、 M−(1975年)Adv、
Protel Chem、、 ”第29巻第85〜第
136頁;・Chaet 、 L、、 Wolf 、
Fig。
ブリッド形成における検出プローブとしては、なかんず
く免疫学的に検出しうるハプテンが挙げられる。しかし
、ノーブチ/および相応する抗ハプテン抗体は、ビオチ
ン/(ストレプト)−アビジンの場合(K=1015モ
ル−1; Green、 N、 M、 (1975年)
” Adv、 Pro−tein Cbem、 ’第
29巻第85〜第166頁;Chaet、 L、、 W
nlf 、 Fig、 (1964年)”Arch、
Biochem、 Biophys、 ”第106巻第
1〜第5頁〕よりも著しく低い結合定数[:に=2X1
08モル−1〜7 X 1 09モ/l/−” ;
Hunter etal ” J、 Immuno
l、 ”第129巻A3 (1982年)第116頁;
Green 、 N、 M−(1975年)Adv、
Protel Chem、、 ”第29巻第85〜第
136頁;・Chaet 、 L、、 Wolf 、
Fig。
(1964年)、Arch、 Biochem、 Bi
ophys、”第106巻第1〜5頁〕を有する(約”
/1015 )。
ophys、”第106巻第1〜5頁〕を有する(約”
/1015 )。
しかし、ビオチン/(ストレプト)−アビジン相互作用
を検出反応に利用するのは、ビタミンビオチンはほとん
どすべての生物学的物質中に出現するので妨害を受けや
ずいという重大な欠点を有する。
を検出反応に利用するのは、ビタミンビオチンはほとん
どすべての生物学的物質中に出現するので妨害を受けや
ずいという重大な欠点を有する。
本発明の根底ヲなす課題は、上記の欠点を回避する、溶
液中の核酸の冒感度非放射性検出法を提供することであ
る。
液中の核酸の冒感度非放射性検出法を提供することであ
る。
仁の課題は、本発明によれは、同じ溶液相中に存在する
。検出すべき核酸の異なる範囲に相補的な、一方の核酸
プローブ悼検出ノロープとして役立ちかつ化学結合によ
り標識体として少なくとも1つの・・ブテンを結合金石
し、他方のIfS、FRプローブは捕獲プローブとして
役立ち、かつ固体マトリックスに結合される2つの単鎖
核酸プローブでのハイブリッド形成による核酸配列を検
出する方法によって解決され、該方法はハプテンとして
、検出すべき核酸との水素架橋結合に診加していない検
出プローブの少なくとも1つの部位で、溶液中に存在す
る検出すべき核酸音検出プローブおよび捕獲プローブを
任意の順序でインキュベートする少なくとも4原子長の
架橋により共有結合しているステロイドを使用し、その
際捕獲プローブの結合はマ) IJラックス、検出すべ
き核酸をインキュベートする前、後またはその間に惹起
され、捕獲プローブ、検出すべき核酸および検出プロー
ブからなるマトリックス結合複合体の残留溶液を分離し
、複合体をそれ自体標識された抗ハプテン抗体により検
出すること全特徴とする。
。検出すべき核酸の異なる範囲に相補的な、一方の核酸
プローブ悼検出ノロープとして役立ちかつ化学結合によ
り標識体として少なくとも1つの・・ブテンを結合金石
し、他方のIfS、FRプローブは捕獲プローブとして
役立ち、かつ固体マトリックスに結合される2つの単鎖
核酸プローブでのハイブリッド形成による核酸配列を検
出する方法によって解決され、該方法はハプテンとして
、検出すべき核酸との水素架橋結合に診加していない検
出プローブの少なくとも1つの部位で、溶液中に存在す
る検出すべき核酸音検出プローブおよび捕獲プローブを
任意の順序でインキュベートする少なくとも4原子長の
架橋により共有結合しているステロイドを使用し、その
際捕獲プローブの結合はマ) IJラックス、検出すべ
き核酸をインキュベートする前、後またはその間に惹起
され、捕獲プローブ、検出すべき核酸および検出プロー
ブからなるマトリックス結合複合体の残留溶液を分離し
、複合体をそれ自体標識された抗ハプテン抗体により検
出すること全特徴とする。
従来は、ビオチン/(ストレプト)−アビジン相互作用
の大きい結合定数(K=1015 モル−1)に基づき
、すべての結合定数の小さい特異的相互作用は感度が小
さいことから出発したさらに、ビオチン/(ストレプト
)−アビジン相互作用は(ストレプト)−アビジンに対
する4つのビオチン結合個所の存在によって有利である
と思われる。従って、従来非放射性核酸検出系において
ピオチ゛ン/(ストレプト)−アビジン相互作用は検出
反応に有利に使用された。
の大きい結合定数(K=1015 モル−1)に基づき
、すべての結合定数の小さい特異的相互作用は感度が小
さいことから出発したさらに、ビオチン/(ストレプト
)−アビジン相互作用は(ストレプト)−アビジンに対
する4つのビオチン結合個所の存在によって有利である
と思われる。従って、従来非放射性核酸検出系において
ピオチ゛ン/(ストレプト)−アビジン相互作用は検出
反応に有利に使用された。
しかし、本発明によれは、核酸を特異的にビオチン・ス
トレプトアビジンと少なくとも等しい感度で検出するこ
とができ、その際選択性を、マトリックス結合ならびに
検出反応に択一的な、それぞれ高い核酸検出感度を有す
る特異的相互作用原理を使用することによって筒められ
る。
トレプトアビジンと少なくとも等しい感度で検出するこ
とができ、その際選択性を、マトリックス結合ならびに
検出反応に択一的な、それぞれ高い核酸検出感度を有す
る特異的相互作用原理を使用することによって筒められ
る。
捕獲プローブまたは検出プローブの不在における恢出了
べき核酸の結合は、検出シグナルを生じない。
べき核酸の結合は、検出シグナルを生じない。
さらに、本発明方法の1蚤な利点は、測定の際に非特異
的結合の出現が明らかに少すく、従って測定の精度が増
加し、非特異的バックグラウンドが低下することである
。
的結合の出現が明らかに少すく、従って測定の精度が増
加し、非特異的バックグラウンドが低下することである
。
検出すべき核酸に対する検出プローブおよび捕獲プロー
ブの結合の順序ならびに捕獲プローブをマトリックスに
結合する順序は任意である。
ブの結合の順序ならびに捕獲プローブをマトリックスに
結合する順序は任意である。
なかんずく、まず同時に検出すべき核酸に検出プローブ
および捕獲プローブをインキュベートし、次−八で3つ
の核酸からなる形成せる複合体をマトリックスに結合す
ることも可能であり、もう1つの方法はマトリックスに
対する捕獲プローブの結合を、同時であるが空間的に分
離して、検出すべき核酸を検出プローブに結合し、引き
続き検出すべき核酸と検出プローブからなる複合体に、
マトリックス結合捕獲プローブをインキュベートするこ
とによって行なうことである。また、差当り捕獲プロー
ブをマトリックスに結合し、次いで同じ反応容器中で検
出すべき核酸および検出プローブ上インキュベートする
こともできる。核酸およびマトリックスをインキュベー
トする他の順序も同様に適当である。
および捕獲プローブをインキュベートし、次−八で3つ
の核酸からなる形成せる複合体をマトリックスに結合す
ることも可能であり、もう1つの方法はマトリックスに
対する捕獲プローブの結合を、同時であるが空間的に分
離して、検出すべき核酸を検出プローブに結合し、引き
続き検出すべき核酸と検出プローブからなる複合体に、
マトリックス結合捕獲プローブをインキュベートするこ
とによって行なうことである。また、差当り捕獲プロー
ブをマトリックスに結合し、次いで同じ反応容器中で検
出すべき核酸および検出プローブ上インキュベートする
こともできる。核酸およびマトリックスをインキュベー
トする他の順序も同様に適当である。
本発明の望ましい構成では、ステロイドとしてジゴキシ
ゲニンまたはジゴキンンが使用される。意外なことに、
これら双方のステロイドは、これらステロイドの相応す
る抗体に対する結合のに値が、ビオチン/(ストレプト
)−アビジン系の場合よりも約10−5低くかつ付加的
に(ストレプト)−アビジンはビオチンに対し4つの結
合個所を有するが、核酸の検出において、ビオチン/(
ストレプト)−アビジン系と同じ高さの感度を示す。
ゲニンまたはジゴキンンが使用される。意外なことに、
これら双方のステロイドは、これらステロイドの相応す
る抗体に対する結合のに値が、ビオチン/(ストレプト
)−アビジン系の場合よりも約10−5低くかつ付加的
に(ストレプト)−アビジンはビオチンに対し4つの結
合個所を有するが、核酸の検出において、ビオチン/(
ストレプト)−アビジン系と同じ高さの感度を示す。
従って、本発明により達成される結合検出系における感
度は、少なくともビオチン−(ストレプト)−アビジン
系を使用する際に達成可能な感度と比較可能であり、非
特異的結合に対する妨害発生も少ない。
度は、少なくともビオチン−(ストレプト)−アビジン
系を使用する際に達成可能な感度と比較可能であり、非
特異的結合に対する妨害発生も少ない。
ハプテンが検出プローブに結合している架橋の長さは4
〜32原子の間である。この場合架橋は、原子C,O,
Sおよび/またはNを含有する分子から構成されている
。これよりも大きい鎖長も可能ではあるがあまシ有意義
ではない。
〜32原子の間である。この場合架橋は、原子C,O,
Sおよび/またはNを含有する分子から構成されている
。これよりも大きい鎖長も可能ではあるがあまシ有意義
ではない。
それというのもこの場合には検出感度の悪化が考慮され
るからである。本発明の望ましい構成においては、ハプ
テンは11〜16原子長の架橋により検出プローブに結
合している。好ましくは、架橋は親水性基よりも多くの
疎水性基金含有する。
るからである。本発明の望ましい構成においては、ハプ
テンは11〜16原子長の架橋により検出プローブに結
合している。好ましくは、架橋は親水性基よりも多くの
疎水性基金含有する。
本発明の望ましい構成においては架、橋は線形である。
もう1つのすぐれた構成においては、架橋は分枝鎖であ
シかつ少なくとも1つの鎖端に1つのハプテン分子を含
有する。1つの分校架橋に数個のハプテン分子が存在す
ることによって、検出感度を付加的に増強することがで
きる。好ましいハプテン標識された、2つの異なる望ま
しい架橋鎖長を有するヌクレオシP三リン酸Dig −
u < L a > −durp次式に示されている0 検出プローブに対する架橋によるハプテンの結合は、末
端位または非末端位のホスフェート基によっても、リゼ
ース残基または核酸プローブの塩基によっても可能であ
る。しかし、架橋によるハプテンの結合は、双方の相補
的核酸鎖□ 間の水素架橋結合が損なわれないよう忙行なわねばなら
ない。望ましくは、ハプテンは架橋により検出プローブ
の塩基またはリーース残基に結合している。
シかつ少なくとも1つの鎖端に1つのハプテン分子を含
有する。1つの分校架橋に数個のハプテン分子が存在す
ることによって、検出感度を付加的に増強することがで
きる。好ましいハプテン標識された、2つの異なる望ま
しい架橋鎖長を有するヌクレオシP三リン酸Dig −
u < L a > −durp次式に示されている0 検出プローブに対する架橋によるハプテンの結合は、末
端位または非末端位のホスフェート基によっても、リゼ
ース残基または核酸プローブの塩基によっても可能であ
る。しかし、架橋によるハプテンの結合は、双方の相補
的核酸鎖□ 間の水素架橋結合が損なわれないよう忙行なわねばなら
ない。望ましくは、ハプテンは架橋により検出プローブ
の塩基またはリーース残基に結合している。
ハプテンが架橋によりウラシルまたはシトシンのC5部
位または検出プローブのリボースの2部位に結合してい
るのがとくに望ましい。
位または検出プローブのリボースの2部位に結合してい
るのがとくに望ましい。
ステロイドハプテンと架橋の結合は、とくにエステル結
合、アミド結合またはエーテル結合である。
合、アミド結合またはエーテル結合である。
捕−プローブは任意の方法で固体マ) IJラックス結
合することができる。配位結合、吸着結合および共有結
合も可能である。しかし、結合は結合系によって行なう
こともできる。
合することができる。配位結合、吸着結合および共有結
合も可能である。しかし、結合は結合系によって行なう
こともできる。
望ましい構成においては、捕獲プローブは固体マトリッ
クスに結合系により配位結合または共有結合されている
。かかる結合系は2つの成分からなり、その際1つの取
分は固形マ) IJラックス吸着、配位結合または共有
結合により結合されてお夛、第2の成分は捕獲プローブ
に結合されている。結合系の双方の成分の結合によって
、同時に捕獲プローブが固形マ) IJラックス結合さ
れる。適当な結合系は、たとえはビオチン−(ストレプ
ト)−アビジン系、ハプテン−抗ハプテン抗体系ならひ
に相補的核酸配列である。
クスに結合系により配位結合または共有結合されている
。かかる結合系は2つの成分からなり、その際1つの取
分は固形マ) IJラックス吸着、配位結合または共有
結合により結合されてお夛、第2の成分は捕獲プローブ
に結合されている。結合系の双方の成分の結合によって
、同時に捕獲プローブが固形マ) IJラックス結合さ
れる。適当な結合系は、たとえはビオチン−(ストレプ
ト)−アビジン系、ハプテン−抗ハプテン抗体系ならひ
に相補的核酸配列である。
望ましい構成においては、結合系の1成分は少なくとも
4原子長の架橋により、検出すべきもう1つの望ましい
構成にお−いては、結合系の双方の成分は1つのハプテ
ンと1つの抗ハプテン抗体であり、ただし該バッテンは
検出プローブの標識物質とは異なるハプテンであり、抗
ハプテン抗体は検出プローブの標識ハプテンとは交差反
応しないものとする。
4原子長の架橋により、検出すべきもう1つの望ましい
構成にお−いては、結合系の双方の成分は1つのハプテ
ンと1つの抗ハプテン抗体であり、ただし該バッテンは
検出プローブの標識物質とは異なるハプテンであり、抗
ハプテン抗体は検出プローブの標識ハプテンとは交差反
応しないものとする。
もう1つの望ましい構成においては、結合系の双方の成
分はビオチンと(ストレプト)−アビジン、またはオリ
ゴ−またはポリd(C)とオリゴ−またはポリd(G)
である。さらに、結合系としてオリゴ−またはボ!jd
(C’)/オリゴー1.+、はポ1,1 d (G)を
使用する場合には、双方の成分の1つが直接に捕獲プロ
ーブの5′−たは結合系の1成分が固着される任意の材
料を使用することができる。望ましくは、固体マトリッ
クスとしてニトロセルロースフィルター、ナイロンフィ
ルター、プラスチック、プレキシ。
分はビオチンと(ストレプト)−アビジン、またはオリ
ゴ−またはポリd(C)とオリゴ−またはポリd(G)
である。さらに、結合系としてオリゴ−またはボ!jd
(C’)/オリゴー1.+、はポ1,1 d (G)を
使用する場合には、双方の成分の1つが直接に捕獲プロ
ーブの5′−たは結合系の1成分が固着される任意の材
料を使用することができる。望ましくは、固体マトリッ
クスとしてニトロセルロースフィルター、ナイロンフィ
ルター、プラスチック、プレキシ。
ガラスまたはニトロセルロース−またはナイロン被覆デ
2スチツクまたはプレキシガラスが使用される。とくに
望ましい構成では、固体マトリックスとして反応容器の
器壁が使用され、該反応容器はたとえばポリエチレン試
験管、微量滴定板またはクペットであってもよく、その
際本発明のもう1つの利点は、呈色反応による検出を直
接に反応容器中で相応する波長での吸光の測定によって
実施することができる点に認められる。
2スチツクまたはプレキシガラスが使用される。とくに
望ましい構成では、固体マトリックスとして反応容器の
器壁が使用され、該反応容器はたとえばポリエチレン試
験管、微量滴定板またはクペットであってもよく、その
際本発明のもう1つの利点は、呈色反応による検出を直
接に反応容器中で相応する波長での吸光の測定によって
実施することができる点に認められる。
検出すべき核酸での検出グローブおよび捕獲プローブの
ハイブリッド形成は、溶液中で核酸プローブの長さおよ
びこれから得られる、期待されるハイブリッドの溶融温
度に依存して選択される温度において行なわれる。
ハイブリッド形成は、溶液中で核酸プローブの長さおよ
びこれから得られる、期待されるハイブリッドの溶融温
度に依存して選択される温度において行なわれる。
ハイブリッド形成およびマトリックス結合の後、ハプテ
ン標識され、錯結合した検出プローブを、複合体にイン
キュベートされる、それ自体標識された抗ハプテン抗体
または抗ハプテン抗体フラグメントの結合により検出す
ることによって行なわれる。
ン標識され、錯結合した検出プローブを、複合体にイン
キュベートされる、それ自体標識された抗ハプテン抗体
または抗ハプテン抗体フラグメントの結合により検出す
ることによって行なわれる。
検出プローブのハプテンに向けられた抗ハプテン抗体ま
たはフラグメント全標識するのは自体公知の方法で行な
われ、酵素標識、放射性標識、螢光標識または(バイオ
)発光標識が望ましい。酵素標識を使用するのがとくに
望ましく、この場合標識酵素として望1しくはアルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクト
シダーゼが使用される。望ましくは、標識系の肚媒活性
の測定はレドックス系によって実施される。これにはロ
イコ系がとくに好ましい。最も望ましくは、測定は還元
性化合物としてインジビイド系および酸化剤としてテト
ラゾリウム塩によって行なわれる。
たはフラグメント全標識するのは自体公知の方法で行な
われ、酵素標識、放射性標識、螢光標識または(バイオ
)発光標識が望ましい。酵素標識を使用するのがとくに
望ましく、この場合標識酵素として望1しくはアルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクト
シダーゼが使用される。望ましくは、標識系の肚媒活性
の測定はレドックス系によって実施される。これにはロ
イコ系がとくに好ましい。最も望ましくは、測定は還元
性化合物としてインジビイド系および酸化剤としてテト
ラゾリウム塩によって行なわれる。
望ましい構成においては、標識酵素としてアルカリホス
ファターゼが使用され、X−ホスフェート/ニトロブル
ーテトラゾリウムのレドックス系によって実施される。
ファターゼが使用され、X−ホスフェート/ニトロブル
ーテトラゾリウムのレドックス系によって実施される。
この場合、X−ホスフェートは5−ブロム−4−クロル
−3−インドリルホスフェートの慣用名であり、ニトロ
シル−テトラゾリウムは3.3−(3,3’−ジメトキ
シ−4,4′−ビフェニル)−ビス−〔5−フェニル−
2−(4−二トロフェニル)−テトラゾリウムクロリP
〕の慣用名である。アルカリホスファターゼは、色原体
基質、この場合にはX−ホスフェートを分解し、このも
のはリン酸塩の離脱および酸化によって青色難溶性二量
体を形成し、この場合同時にテトラゾリウム化合物は同
様に青色難溶性のホルマザンに還元される。このしrツ
クス反応は次図に示されている。
−3−インドリルホスフェートの慣用名であり、ニトロ
シル−テトラゾリウムは3.3−(3,3’−ジメトキ
シ−4,4′−ビフェニル)−ビス−〔5−フェニル−
2−(4−二トロフェニル)−テトラゾリウムクロリP
〕の慣用名である。アルカリホスファターゼは、色原体
基質、この場合にはX−ホスフェートを分解し、このも
のはリン酸塩の離脱および酸化によって青色難溶性二量
体を形成し、この場合同時にテトラゾリウム化合物は同
様に青色難溶性のホルマザンに還元される。このしrツ
クス反応は次図に示されている。
他の適当な測定系の検出は自体公知の方法によって実施
される。
される。
架橋によりハゾテンで標識された単鎖の核酸プローブの
合成のためには、種々の方法を適用することができる。
合成のためには、種々の方法を適用することができる。
1、 ファージ−RNA−ポリメラーゼ接触の”転写”
法(’ J、 Mob、 Bio、 ”第166巻(1
983年)第477頁)の場合には、デオキシリボ核酸
依存性リボ核酸合成の間、形成したリボ核酸が誘導され
る。ファージ−コード化RNAポリメラーゼとして、た
とえばファージsp6− 、 ’r 7−またはT3−
コード化酵素が使用される。この方法には、5P6−
、T7−またはT3−プロモーターを含有する2本鎖デ
オキシリボ核酸が使用される。5P6− 、T7−また
はT3−RNA /リメラーゼおよび全部で4種のりボ
ヌクレオンド三リン酸の添加によって、相同プロモータ
ーから出発して、コード化デオキシリボ核徹鎖に相補的
のリボ核酸鎖(転写体)が形成する。この場合、基質と
して提供される4穐のりボヌクレオンド三リン酸が組み
込まれる。これら三リン酸の4種まで、部分的または完
全に、ステロイドを架橋によって結合することによって
誘導体化されているので、リボ核酸合成の場合このステ
ロイドが一緒に組み込まれる。ジがキシケゞニン/ジゴ
キシン標識する場合、ジゴキ7Jfニン/ジビキンン標
識されたりポヌクレオチドが使用され、ビオチン標識す
る場合にはビオチン標識されたりポヌクレオチドが使用
される。
法(’ J、 Mob、 Bio、 ”第166巻(1
983年)第477頁)の場合には、デオキシリボ核酸
依存性リボ核酸合成の間、形成したリボ核酸が誘導され
る。ファージ−コード化RNAポリメラーゼとして、た
とえばファージsp6− 、 ’r 7−またはT3−
コード化酵素が使用される。この方法には、5P6−
、T7−またはT3−プロモーターを含有する2本鎖デ
オキシリボ核酸が使用される。5P6− 、T7−また
はT3−RNA /リメラーゼおよび全部で4種のりボ
ヌクレオンド三リン酸の添加によって、相同プロモータ
ーから出発して、コード化デオキシリボ核徹鎖に相補的
のリボ核酸鎖(転写体)が形成する。この場合、基質と
して提供される4穐のりボヌクレオンド三リン酸が組み
込まれる。これら三リン酸の4種まで、部分的または完
全に、ステロイドを架橋によって結合することによって
誘導体化されているので、リボ核酸合成の場合このステ
ロイドが一緒に組み込まれる。ジがキシケゞニン/ジゴ
キシン標識する場合、ジゴキ7Jfニン/ジビキンン標
識されたりポヌクレオチドが使用され、ビオチン標識す
る場合にはビオチン標識されたりポヌクレオチドが使用
される。
2、 ″′逆転写”法の出発物質は単鎖RNAである。
リバーストランスクリプターゼによる再転写は、相補的
DNA鎖中へのハプテン標識されたヌクレオチドの組み
込みを生じる。リバーストランスクリデターゼとしては
、たとえはウィルスAMV−またはMO−MLvコード
化酵素が使用される。
DNA鎖中へのハプテン標識されたヌクレオチドの組み
込みを生じる。リバーストランスクリデターゼとしては
、たとえはウィルスAMV−またはMO−MLvコード
化酵素が使用される。
DNA鎖中にヘミ標識されたDNA/RNAハイブリッ
ドが得られる。標識されてないRNA鎖は、選択的にア
ルカリ性加水分解またはRNアーゼでの処理によりHが
消化される。
ドが得られる。標識されてないRNA鎖は、選択的にア
ルカリ性加水分解またはRNアーゼでの処理によりHが
消化される。
ジビキシrニン/ジゴキシン標識付けの場合には、ジゴ
キシケゞニン/ジゴキ7ン標識されたデオキシリボヌク
レオチドが使用され、ビオチン標識する場合にはビオチ
ン標識されたデオキシリボヌクレオチドが使用される。
キシケゞニン/ジゴキ7ン標識されたデオキシリボヌク
レオチドが使用され、ビオチン標識する場合にはビオチ
ン標識されたデオキシリボヌクレオチドが使用される。
6.1エキソヌクレアーゼI″法の場合、出発物質は2
本鎖DNAであり、双方の鎖の一方の7・ブテン誘導ヌ
クレオチドのプライマー依存性組み込みによりDNAポ
リメラーゼ(たとえはフレノウ酵素、ファージコード化
T4またはT7DNA−ボリメ2−ゼ、テルムス・アカ
チフス(Thermus aquatics )からの
DNAポリメラーゼ)で標識されていた。得られるヘミ
標識された二本鎖DNAは2つの異なるクラス■制限エ
ンドヌクレアーゼにより分断され、そのうチ一方は5′
−張出し単鎖末端を有するフラグメント端金つくり、他
方は6′−張出し単鎖末端をつくる。
本鎖DNAであり、双方の鎖の一方の7・ブテン誘導ヌ
クレオチドのプライマー依存性組み込みによりDNAポ
リメラーゼ(たとえはフレノウ酵素、ファージコード化
T4またはT7DNA−ボリメ2−ゼ、テルムス・アカ
チフス(Thermus aquatics )からの
DNAポリメラーゼ)で標識されていた。得られるヘミ
標識された二本鎖DNAは2つの異なるクラス■制限エ
ンドヌクレアーゼにより分断され、そのうチ一方は5′
−張出し単鎖末端を有するフラグメント端金つくり、他
方は6′−張出し単鎖末端をつくる。
エンドヌクレアーゼの選択は、5′−張出し単鎖末端が
ハプテン標識された鎖に所属しており、6′−張出し単
鎖末端が標識なしの鎖に所属しているようにする。引き
続き、エキソヌクレアーゼ塩で分解することにより、そ
の6′−末端が後。
ハプテン標識された鎖に所属しており、6′−張出し単
鎖末端が標識なしの鎖に所属しているようにする。引き
続き、エキソヌクレアーゼ塩で分解することにより、そ
の6′−末端が後。
退している、つまシ突出していない標識なしのDNA鎖
のみが切断される。3′−張出しフラグメント末端は、
エキソヌクレアーゼ1により著しく緩慢に加水分解され
る。残存する相補的単鎖はハプテン標識されている。
のみが切断される。3′−張出しフラグメント末端は、
エキソヌクレアーゼ1により著しく緩慢に加水分解され
る。残存する相補的単鎖はハプテン標識されている。
4、″λエキソヌクレアーゼ”法の場合、出発物質は2
本鎖DNAであり、双方の鎖の一方をノーブテン誘導ヌ
クレオチドのプライマー依存性組み込みにより、DNA
ポリメラーゼ〔たとえはフレノウ酵素、ファージコード
化T4またはT7DNAポリメラーゼ、テルムス・アカ
チフス(Thermus aquatjcus )から
のDNAポリメラーゼ〕で標識される。プライマーとし
ては、5′。
本鎖DNAであり、双方の鎖の一方をノーブテン誘導ヌ
クレオチドのプライマー依存性組み込みにより、DNA
ポリメラーゼ〔たとえはフレノウ酵素、ファージコード
化T4またはT7DNAポリメラーゼ、テルムス・アカ
チフス(Thermus aquatjcus )から
のDNAポリメラーゼ〕で標識される。プライマーとし
ては、5′。
6′−デホスホリル化オリビヌクレオチドまたは5′−
末端が消化に対してλエキソヌクレアーゼで保護された
プライマーが使用される。または、保護されたプライマ
ーは、単鎖DNAにおける3−末端の、少なくとも5つ
の塩基によって互いに分離されている逆反復配列の再生
成(内部6′−OR末端による成端輪状構造)によって
得ることもできる。
末端が消化に対してλエキソヌクレアーゼで保護された
プライマーが使用される。または、保護されたプライマ
ーは、単鎖DNAにおける3−末端の、少なくとも5つ
の塩基によって互いに分離されている逆反復配列の再生
成(内部6′−OR末端による成端輪状構造)によって
得ることもできる。
得られるヘミ標識された2本鎖DNAは標識されてない
鎖中にのみホスホリル化5′−フラグメント末端を有す
るので、優先的に標識された鎖のみが、λ−エキソヌク
レアーゼを引き続き作用させることによって分解される
。λ−エキソヌクレアーゼはホスホリル化5′−フラグ
メント末端に対し高い優先性を有する。ヒドロキシル化
5−7ラグメント末端は、著しく緩慢に加水分解される
。残存する相補的単鎖はハプテン標識されている。
鎖中にのみホスホリル化5′−フラグメント末端を有す
るので、優先的に標識された鎖のみが、λ−エキソヌク
レアーゼを引き続き作用させることによって分解される
。λ−エキソヌクレアーゼはホスホリル化5′−フラグ
メント末端に対し高い優先性を有する。ヒドロキシル化
5−7ラグメント末端は、著しく緩慢に加水分解される
。残存する相補的単鎖はハプテン標識されている。
5、 ”ニックトランスレーション”法でハ、出発物
質は2重鎖DNAフ2グメントである。たとえばファー
ジf1タンパク質Aにより1つの鎖中に特異的にニック
が形成し、引き続きE、コリDNAポリメラーゼIによ
りハプテン標識されたニクレオチドを置換した後、ニッ
ク保有鎖が標識される。得られるヘミ標識された2本鎖
DNAは、1項と同様、2つの異なる部類、転写プロー
ブヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼIでさらに処
理される。
質は2重鎖DNAフ2グメントである。たとえばファー
ジf1タンパク質Aにより1つの鎖中に特異的にニック
が形成し、引き続きE、コリDNAポリメラーゼIによ
りハプテン標識されたニクレオチドを置換した後、ニッ
ク保有鎖が標識される。得られるヘミ標識された2本鎖
DNAは、1項と同様、2つの異なる部類、転写プロー
ブヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼIでさらに処
理される。
方法1〜5に対する記載はマニアチス
(ManiatiS I T−)および協力者6モレキ
ュラ−・クローニング(Mo1ecular Clon
ing ) ’(1982年) (Co1d Spri
ng Harbor Labo−ratory 、 C
o1d Spring Harbor 、 New Y
ork):ケスラー (Kessler、 C)の雑文
「遺伝工学における酵素J(Enzymes in G
enetic Re5earch)”UI Imann
s Encyclopedia of Indu’5t
rialReSearCh ’第49巻、VCHVer
lagsgesel 1−schaft Weinh
eim s 1987年、第341頁〜第530頁に存
在する。
ュラ−・クローニング(Mo1ecular Clon
ing ) ’(1982年) (Co1d Spri
ng Harbor Labo−ratory 、 C
o1d Spring Harbor 、 New Y
ork):ケスラー (Kessler、 C)の雑文
「遺伝工学における酵素J(Enzymes in G
enetic Re5earch)”UI Imann
s Encyclopedia of Indu’5t
rialReSearCh ’第49巻、VCHVer
lagsgesel 1−schaft Weinh
eim s 1987年、第341頁〜第530頁に存
在する。
6、“光化学的”方法(“Nucl、 Ac1ds R
es、”第13巻(1985年)第745頁〜第761
頁)においては、核酸プローブをフォト・ジゴキシゲニ
ンc−>=’キシゲニンー3−ヘミスクシネート−CN
’−(4−アジPベンゾイル)〕−〕8−アミノー3.
6−シオキサオクチルアミP〕その合成式を下記に示す
)の存在においてUv部を有する可視光で照射する。窒
素(N2)の離脱下にニトレン基が生成し、これが核酸
に共有結合する。
es、”第13巻(1985年)第745頁〜第761
頁)においては、核酸プローブをフォト・ジゴキシゲニ
ンc−>=’キシゲニンー3−ヘミスクシネート−CN
’−(4−アジPベンゾイル)〕−〕8−アミノー3.
6−シオキサオクチルアミP〕その合成式を下記に示す
)の存在においてUv部を有する可視光で照射する。窒
素(N2)の離脱下にニトレン基が生成し、これが核酸
に共有結合する。
1 1i ffi
n 7、 “化学的”方法には亜リン酸トリエステル法によ
るオリビヌクレオチP合成の範囲内で、保護されたヌク
レオシド・ホスホラミジット(dA/dG/dC/dT
)と共に、置換可能なアミノ官能基で修飾された保護
されたヌクレオシド・ホスホラミジット(dA/dVd
C/dU)が、オリゴ・デオキシリボ・ヌクレオチド単
鎖中への意図された組入れのために使用される。dC/
dUの修飾は、望ましくはピリミジン環の部血6に2い
て行なわれ、dA/dGのイー飾は望ましくはプリン分
子の部位8において行なわれる。
n 7、 “化学的”方法には亜リン酸トリエステル法によ
るオリビヌクレオチP合成の範囲内で、保護されたヌク
レオシド・ホスホラミジット(dA/dG/dC/dT
)と共に、置換可能なアミノ官能基で修飾された保護
されたヌクレオシド・ホスホラミジット(dA/dVd
C/dU)が、オリゴ・デオキシリボ・ヌクレオチド単
鎖中への意図された組入れのために使用される。dC/
dUの修飾は、望ましくはピリミジン環の部血6に2い
て行なわれ、dA/dGのイー飾は望ましくはプリン分
子の部位8において行なわれる。
合成周期が終了し、保護基を除去した後に、適当なハプ
テンで標識可能である、ヌクレオ塩基において置換可能
なアミノ官能基で修飾された単鎖のオリゴ・、デオキシ
リボ・ヌクレオチドが得られる。かかるハプテンは、ス
テロイド、望ましくはジゴキ7rニン、ジブキシンであ
る。
テンで標識可能である、ヌクレオ塩基において置換可能
なアミノ官能基で修飾された単鎖のオリゴ・、デオキシ
リボ・ヌクレオチドが得られる。かかるハプテンは、ス
テロイド、望ましくはジゴキ7rニン、ジブキシンであ
る。
つまり標識は、オリゴ・デオキシリボ・ヌクレオチドと
ハプテンの相応する活性化されたエステル、アミドまた
はエーテル、とくにそのN−ヒドロキ7スクンンイミド
エステルとの反応によって行なわれる。
ハプテンの相応する活性化されたエステル、アミドまた
はエーテル、とくにそのN−ヒドロキ7スクンンイミド
エステルとの反応によって行なわれる。
本発明の望lしい構成においては、そのハプテンが核酸
プローブ中へ酵素的に、RNAポリメラーゼ、DNAポ
リメラーゼ、エキソヌクレアーゼまたはリバーストラン
スクリプターゼおよび相応するハプテン修飾デオキシ−
またはリポヌクレオンド三リン酸置換基を用いて組み込
まれたハプテン標識された核酸プローブが使用される。
プローブ中へ酵素的に、RNAポリメラーゼ、DNAポ
リメラーゼ、エキソヌクレアーゼまたはリバーストラン
スクリプターゼおよび相応するハプテン修飾デオキシ−
またはリポヌクレオンド三リン酸置換基を用いて組み込
まれたハプテン標識された核酸プローブが使用される。
本発明のもう1つの望ましい構成においてはそのハプテ
ンが核酸プローブ中へ光化学的にフォトハプテンを用い
て組み込ま、れたハプテン標識された核酸プローブが使
用され、第6の望ましい構成においては、そのハプテン
が核酸プローブ中へ化学的に、オリゴ・デオキシリボヌ
クレオチド合成の範囲内で、置換可能なアミノ官能基で
修飾された保護されたヌクレオシドホスホアミジド全組
み込まれ、−保護基の除去後−1修師されたオリゴ・デ
オキシリボヌクレオチドとハプテンの活性化されたエス
テル、アミドまたはエーテルとの反応によって組み込ま
れた核酸プローブが使用される。
ンが核酸プローブ中へ光化学的にフォトハプテンを用い
て組み込ま、れたハプテン標識された核酸プローブが使
用され、第6の望ましい構成においては、そのハプテン
が核酸プローブ中へ化学的に、オリゴ・デオキシリボヌ
クレオチド合成の範囲内で、置換可能なアミノ官能基で
修飾された保護されたヌクレオシドホスホアミジド全組
み込まれ、−保護基の除去後−1修師されたオリゴ・デ
オキシリボヌクレオチドとハプテンの活性化されたエス
テル、アミドまたはエーテルとの反応によって組み込ま
れた核酸プローブが使用される。
例 1
シコキシデニンー〇−スクシニル−C5’−(アミドア
リル)−7−シスオキシ−ウリジンー5′−三すン酸〕
−4リチウム塩 (Dig−4−dUTP ) C39H52021N3P 3Li 4 分
子量1019.5シコキシグニンー〇−スクシニル−N
−ヒドロキシスフフンイミドエステル200 +115
i+(0,34ミリモル)をジメチルホルムアミド7
msに溶かし、H2O6μ中の5−アリルアミノ−2′
−デスオキシ−ウリジン−5′−三リン酸 4リチウム
塩186■の溶液に冷加する。反応混合物に、0.1モ
ルのホウ酸Na緩衝液(pH8,5) 62mgを加え
、室温で約15時間伐どおし攪拌する。
リル)−7−シスオキシ−ウリジンー5′−三すン酸〕
−4リチウム塩 (Dig−4−dUTP ) C39H52021N3P 3Li 4 分
子量1019.5シコキシグニンー〇−スクシニル−N
−ヒドロキシスフフンイミドエステル200 +115
i+(0,34ミリモル)をジメチルホルムアミド7
msに溶かし、H2O6μ中の5−アリルアミノ−2′
−デスオキシ−ウリジン−5′−三リン酸 4リチウム
塩186■の溶液に冷加する。反応混合物に、0.1モ
ルのホウ酸Na緩衝液(pH8,5) 62mgを加え
、室温で約15時間伐どおし攪拌する。
この時間後、ペーパー電気泳動(0,05モルのクエン
酸塩緩衝液、p)15.0)で紫外光下に、未反応の5
−アリルアミドdUTPのほかに所望生成物の若干低く
移動するスポットが観察される。
酸塩緩衝液、p)15.0)で紫外光下に、未反応の5
−アリルアミドdUTPのほかに所望生成物の若干低く
移動するスポットが観察される。
精製は、例9に記載したように行なう。
収fit:130■−理論値の67チ
UVスペクトル(リン酸塩緩衝液−7,0) :最大:
220 nm 、 290 nm例 2 ジゴキゾrニンー〇−スクシニル−ε−アミドカプロン
°酸 C33H4909N 分子量: 6
03.8250駐の丸底フラスコ中でジゴキシゲニンー
〇−スク/ニル−N−ヒドロキシスフフンイミドエステ
ル5 g(8,5ミリモル)をジメチルホルムアミド(
DMF)150[に溶かし、これにDMF 2 Oml
中の6−アミノカプロン[1,12g(8,5ミリモル
)およびトリエチルアミノ1.2mgの懸濁液を加える
。室温で夜どおし磁気攪拌する。その除徐々に均質な溶
液が生じる。
220 nm 、 290 nm例 2 ジゴキゾrニンー〇−スクシニル−ε−アミドカプロン
°酸 C33H4909N 分子量: 6
03.8250駐の丸底フラスコ中でジゴキシゲニンー
〇−スク/ニル−N−ヒドロキシスフフンイミドエステ
ル5 g(8,5ミリモル)をジメチルホルムアミド(
DMF)150[に溶かし、これにDMF 2 Oml
中の6−アミノカプロン[1,12g(8,5ミリモル
)およびトリエチルアミノ1.2mgの懸濁液を加える
。室温で夜どおし磁気攪拌する。その除徐々に均質な溶
液が生じる。
この時間後、反応は薄層クロマトグラフィー(クリカr
ル;酢酸エチルエステル/石油エーテル/エタノール1
:1:1.検出:氷酢酸10m1+濃硫酸0.2mb+
アニスアルデヒド0.1mgの混合物を吹付け、青黒色
のスポットが出現するまで120’Cに加熱:Rf約Q
、7 ; Rfジゴキシゲニン−O8uエステル約0.
85 )によれば実際に完全である。
ル;酢酸エチルエステル/石油エーテル/エタノール1
:1:1.検出:氷酢酸10m1+濃硫酸0.2mb+
アニスアルデヒド0.1mgの混合物を吹付け、青黒色
のスポットが出現するまで120’Cに加熱:Rf約Q
、7 ; Rfジゴキシゲニン−O8uエステル約0.
85 )によれば実際に完全である。
DMF ’i高度真空で成分なしに蒸留し、残留する油
状物t’H205Qmbに濃アンモニア水の祭加下に溶
かす。次に、クエン酸水溶液(クエン酸100g#り2
25成を添加することにより、”遊離”のジゴキシゲニ
ンアミドカプロン酸を析出させる。樹脂状の粘稠な物質
を、水と擦ることにより固化させ、吸引濾過し、H2O
で数回後洗浄し、最後に油ポンプ真空中でP2O5上で
乾燥する。
状物t’H205Qmbに濃アンモニア水の祭加下に溶
かす。次に、クエン酸水溶液(クエン酸100g#り2
25成を添加することにより、”遊離”のジゴキシゲニ
ンアミドカプロン酸を析出させる。樹脂状の粘稠な物質
を、水と擦ることにより固化させ、吸引濾過し、H2O
で数回後洗浄し、最後に油ポンプ真空中でP2O5上で
乾燥する。
収量: 3.45 & =理論値の68%例 3
シコー#’ypr’ニンー0−スクシニル−ε−アミド
カプロン酸−N−ヒドロキシスフフンイミドエステル C3)H52011N2 分子量700.
8100Mの丸底フラスコ中で、ジゴキシグニンー〇−
スクシニル−ε−アミドカフロン酸3.45 g(5,
7ミリモル)を無水のジメチルホルムアミド(DMF
) 20 mlに溶かし、順次にN−ヒドロキシスクシ
ンイミド0.7 g(6ミリモル)ならびにシック口へ
キシルカルボジイミド1.39 (6,3ミリモル)を
加える。室温で夜ど2し攪拌し、翌日析出したジシクロ
ヘキシル尿素を吸引濾過し、DMF′を油ポンプ真空中
で留去する。残留する油状物t−20ff1Jの酢酸エ
チルエステルにとり、水冷(−20°C)石油エーテル
約150ffiJ中に攪拌混入する。沈殿した、はじめ
はなお樹脂状の粘稠な生成物を水冷無水石油エーテルと
数回固化するまで擦る。真空中P2O5上で乾燥した後
に次のものが得られる:3.35 、!i’ =理論値
の84%元素分析: C理論値:63.4%H理論値=7.5チN 理論値:
4.0チ C実測値: 63.9% H実測値ニア、7チN 実測
値: 4.07% 例 4− ジゴキシゲニンー〇−スクシニル−ε−アミドカプロイ
ル−〔5−(アミドアリル)−2′−デオキシ−ウリジ
ン−5′−三すン酸〕−4ナトリウム塩 (Dig−11−dUTP ) C45H63022N4P3N&4 分子量:
1196.7シコキシデニンー〇−スタフニル−ε−
アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスフクンイミドエス
テル260■(0,37ミリモル〕をDMF 7μに溶
かし、Na06M中の5−アリルアミノ−2′−チオキ
ン−ウリジン−5す−三リン酸4リチウム塩200!n
9(0,37ミリモル)の溶液に加える。この混合物に
0.1モルのホウ酸ナトリウム緩衝液(p)18.5)
621Mを加え、室温で夜どおしく約15時間)攪拌す
る。
カプロン酸−N−ヒドロキシスフフンイミドエステル C3)H52011N2 分子量700.
8100Mの丸底フラスコ中で、ジゴキシグニンー〇−
スクシニル−ε−アミドカフロン酸3.45 g(5,
7ミリモル)を無水のジメチルホルムアミド(DMF
) 20 mlに溶かし、順次にN−ヒドロキシスクシ
ンイミド0.7 g(6ミリモル)ならびにシック口へ
キシルカルボジイミド1.39 (6,3ミリモル)を
加える。室温で夜ど2し攪拌し、翌日析出したジシクロ
ヘキシル尿素を吸引濾過し、DMF′を油ポンプ真空中
で留去する。残留する油状物t−20ff1Jの酢酸エ
チルエステルにとり、水冷(−20°C)石油エーテル
約150ffiJ中に攪拌混入する。沈殿した、はじめ
はなお樹脂状の粘稠な生成物を水冷無水石油エーテルと
数回固化するまで擦る。真空中P2O5上で乾燥した後
に次のものが得られる:3.35 、!i’ =理論値
の84%元素分析: C理論値:63.4%H理論値=7.5チN 理論値:
4.0チ C実測値: 63.9% H実測値ニア、7チN 実測
値: 4.07% 例 4− ジゴキシゲニンー〇−スクシニル−ε−アミドカプロイ
ル−〔5−(アミドアリル)−2′−デオキシ−ウリジ
ン−5′−三すン酸〕−4ナトリウム塩 (Dig−11−dUTP ) C45H63022N4P3N&4 分子量:
1196.7シコキシデニンー〇−スタフニル−ε−
アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスフクンイミドエス
テル260■(0,37ミリモル〕をDMF 7μに溶
かし、Na06M中の5−アリルアミノ−2′−チオキ
ン−ウリジン−5す−三リン酸4リチウム塩200!n
9(0,37ミリモル)の溶液に加える。この混合物に
0.1モルのホウ酸ナトリウム緩衝液(p)18.5)
621Mを加え、室温で夜どおしく約15時間)攪拌す
る。
この時間後、ペーパー電気泳動(0,05モルクエン酸
塩緩衝液、pi−15,0)で紫外光下に、若干の禾反
応アリルアミドdUTPのほかに、所望化合物の若干低
いスポットが観察される(ないしは7リカrルでの薄層
クロマトグラフィー(D C) 、展開剤イソ酪酸/濃
アンモニア水/H2O−66:1:33.検出紫外光下
またはアニスアルデヒド試薬の吹付け(例2参照);R
f値:5−アリルアミノ−dUTP O,2; Dig
−アミドカプロン酸−08uエステル0.7 ; D
tg −11−dUTP O,45)。
塩緩衝液、pi−15,0)で紫外光下に、若干の禾反
応アリルアミドdUTPのほかに、所望化合物の若干低
いスポットが観察される(ないしは7リカrルでの薄層
クロマトグラフィー(D C) 、展開剤イソ酪酸/濃
アンモニア水/H2O−66:1:33.検出紫外光下
またはアニスアルデヒド試薬の吹付け(例2参照);R
f値:5−アリルアミノ−dUTP O,2; Dig
−アミドカプロン酸−08uエステル0.7 ; D
tg −11−dUTP O,45)。
情実のため、反応混合物を油ポンプ真空中で固形残渣が
得られるまで蒸発濃縮し、Na0200廐にとり、イオ
ン交換カラム(DEAEセファデックス(5ephad
ex ) A 25、HCO2−型、カラムの寸法1.
5X30cm)に加える。吸着させた抜水で短時間洗浄
し、Na011から0.4モルTEAB ()リエチル
アンモニウム重炭酸塩の勾配液(pH8)で溶離する。
得られるまで蒸発濃縮し、Na0200廐にとり、イオ
ン交換カラム(DEAEセファデックス(5ephad
ex ) A 25、HCO2−型、カラムの寸法1.
5X30cm)に加える。吸着させた抜水で短時間洗浄
し、Na011から0.4モルTEAB ()リエチル
アンモニウム重炭酸塩の勾配液(pH8)で溶離する。
純粋な生成物を含有する留分を合し、真空中で濃縮し、
メタノールと共に数回蒸発濃縮することにより過剰のT
EABを除去する(遊離トリエチルアミノ臭はもはやな
し)。フラスコ内容物を数成の水にと9、溶液を短いN
a+型カデカチオン交換カラムペックス(DOWEX)
50WS8(IXlocm)K通しカラム全洗浄水にO
DEがなくなるまで(240廐m U V中で測定)洗
浄し、真空中で約2Qmeにまで蒸発濃縮する。凍結乾
燥後、Dig −11−dUTP −Na4200■が
白色粉末として得られる。
メタノールと共に数回蒸発濃縮することにより過剰のT
EABを除去する(遊離トリエチルアミノ臭はもはやな
し)。フラスコ内容物を数成の水にと9、溶液を短いN
a+型カデカチオン交換カラムペックス(DOWEX)
50WS8(IXlocm)K通しカラム全洗浄水にO
DEがなくなるまで(240廐m U V中で測定)洗
浄し、真空中で約2Qmeにまで蒸発濃縮する。凍結乾
燥後、Dig −11−dUTP −Na4200■が
白色粉末として得られる。
分析:H2Oの測定ニア、9%
元素分析: (Na0含量の考慮下):C計算値:41
.8チ H計算値:5.6チN計算値:4.3チ P計
算値=7.2チC実測値:41.08% H計算値:
5.35%N実測値:4.7% P実測値ニア、1%
紫外スペクトル(リン酸塩緩衝液pH7,0):最大:
220廐m、290廐m 。
.8チ H計算値:5.6チN計算値:4.3チ P計
算値=7.2チC実測値:41.08% H計算値:
5.35%N実測値:4.7% P実測値ニア、1%
紫外スペクトル(リン酸塩緩衝液pH7,0):最大:
220廐m、290廐m 。
例 5
シコキシrニンー〇−スクシニル−r−7ミ)”酪酸
C31H4ISO9N 分子量: 57
5.8この化合物は、ジゴキシゲニンー〇−スクシニル
−N−ヒドロキシスフクンイミドエステル39 (5,
1ミリモル)と4−アミノ酪酸0.66& (6,1ミ
リモル)とを、例1にカプロン酸誘導体につき記載した
ようにして反応させることにより製造する。
5.8この化合物は、ジゴキシゲニンー〇−スクシニル
−N−ヒドロキシスフクンイミドエステル39 (5,
1ミリモル)と4−アミノ酪酸0.66& (6,1ミ
リモル)とを、例1にカプロン酸誘導体につき記載した
ようにして反応させることにより製造する。
反応を行なった後、反応混合物を真空中で蒸発濃縮し、
残液をH2O・メタノール(20チ)に溶かし、H+型
のカチオン交換カラム(ドペックス50WX8)に加え
る。溶離液および洗浄水(pH約4)を蒸発濃縮し、残
留するグリース状の粘稠な残渣ykn−ブタノールに溶
かし、水と6口中分に振とうする。ブタノール相は所望
生成物を含有し、ブタノールを留去し、無水DMFと6
回共蒸留(残存水の除去)した後、直接に引続き相応す
るN−ヒドロキシ−スフフンイミドエステル(例6)に
処理するために使用する。
残液をH2O・メタノール(20チ)に溶かし、H+型
のカチオン交換カラム(ドペックス50WX8)に加え
る。溶離液および洗浄水(pH約4)を蒸発濃縮し、残
留するグリース状の粘稠な残渣ykn−ブタノールに溶
かし、水と6口中分に振とうする。ブタノール相は所望
生成物を含有し、ブタノールを留去し、無水DMFと6
回共蒸留(残存水の除去)した後、直接に引続き相応す
るN−ヒドロキシ−スフフンイミドエステル(例6)に
処理するために使用する。
収量: 2.94 !i(油状物)
例 6
ジゴキ7rニンー〇−スク7ニルーγ−アミノMM−N
−ヒドロキシスクシンイミドエステルC35H4B01
1N2 分子量: 672.8例5からの
油状物としてのジゴキシゲニンー0−スク7ニルーγ−
アミド酪酸2.94.9 (約5.1ミリモル)ヲ、例
6に記載したように、無水DMF 20 Itt中でN
−ヒドロキシスクシンイミド0.62 F (5,4ミ
リモル)およびジシクロヘキシルカルボジイミド1.1
6 、!i’ (5,6ミリモル)と反応させ、後処理
する。得られるヒドロキシスクシンイミドエステル(油
状物)ヲ、例7に記載したように、ε−アミノカプロン
酸と反応させる。
−ヒドロキシスクシンイミドエステルC35H4B01
1N2 分子量: 672.8例5からの
油状物としてのジゴキシゲニンー0−スク7ニルーγ−
アミド酪酸2.94.9 (約5.1ミリモル)ヲ、例
6に記載したように、無水DMF 20 Itt中でN
−ヒドロキシスクシンイミド0.62 F (5,4ミ
リモル)およびジシクロヘキシルカルボジイミド1.1
6 、!i’ (5,6ミリモル)と反応させ、後処理
する。得られるヒドロキシスクシンイミドエステル(油
状物)ヲ、例7に記載したように、ε−アミノカプロン
酸と反応させる。
収i:3.46.9(油状物)
例 7
ジゴキシゲニンー〇−スク7ニルーγ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸 C3’FH51101ON2 分子量:
689.0250 mgの丸底フラスコ中で、ε−アミ
ノカプロン酸0.8 g(6,2ミリモル)およびトリ
エチルアミノ0.75成金DMF 12 mlに懸濁さ
せ、これにDMF q Q ml中のジゴキ7y =ン
ー〇−スクシニルーγ−アミド酪酸−N−ヒドロキンス
クシンイミドエステル3.469 (5,1ミリモル、
例6からの油状物)の溶液を加える。室温で約15時間
伐どおし攪拌し、その後はとんど均質な溶液が生成した
。DC(条件は例2参照)によれば、反応はほとんど定
量的である。
−ε−アミドカプロン酸 C3’FH51101ON2 分子量:
689.0250 mgの丸底フラスコ中で、ε−アミ
ノカプロン酸0.8 g(6,2ミリモル)およびトリ
エチルアミノ0.75成金DMF 12 mlに懸濁さ
せ、これにDMF q Q ml中のジゴキ7y =ン
ー〇−スクシニルーγ−アミド酪酸−N−ヒドロキンス
クシンイミドエステル3.469 (5,1ミリモル、
例6からの油状物)の溶液を加える。室温で約15時間
伐どおし攪拌し、その後はとんど均質な溶液が生成した
。DC(条件は例2参照)によれば、反応はほとんど定
量的である。
後処理を例5に記載したようにして行なう(ドペックス
50クロマトグラフィーにより”遊離”カルボン酸に変
え、n−ブタノールで抽出)。ブタノール相は所望生成
物のほかになお若干の有極性および無極性物質を含有し
、と・のためシリカデル60でのクロマトグラフィー(
カラム40X6crrL1溶離剤酢酸工チルエステル/
石油エーテル50/75/エタノール1:1:1)によ
って精製する。酸性画分を合し、蒸発濃縮した後、油状
物として次のものが得られる: 1.48 &−理論値の42チ 例 8 ジゴキシゲニンー〇−スクンニルーr −7ミ)’ブチ
リルーε−アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル 041H59012N3 分子量: 78
5.8ジゴキシゲニンー〇−7クシニルーr−アミドブ
チリル−ε−アミドカプロン酸0.29(例7からの油
状物、約0.29ミリモル)t−1例6に記載したよう
に、無水DMF a ff1A中でN−ヒドロキシスク
シンイミド0.034 、F (0,3ミリモル)およ
びジシクロヘキシルカルボジイミド66■(0,32ミ
リモル)と反応させ、後処理する。得られる油状残渣を
冷石油エーテルと数回擦っても固化せず、従って溶剤を
留去した後直接に、例9に記載したように、5−アミノ
アリルdUTPと反応させた。
50クロマトグラフィーにより”遊離”カルボン酸に変
え、n−ブタノールで抽出)。ブタノール相は所望生成
物のほかになお若干の有極性および無極性物質を含有し
、と・のためシリカデル60でのクロマトグラフィー(
カラム40X6crrL1溶離剤酢酸工チルエステル/
石油エーテル50/75/エタノール1:1:1)によ
って精製する。酸性画分を合し、蒸発濃縮した後、油状
物として次のものが得られる: 1.48 &−理論値の42チ 例 8 ジゴキシゲニンー〇−スクンニルーr −7ミ)’ブチ
リルーε−アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル 041H59012N3 分子量: 78
5.8ジゴキシゲニンー〇−7クシニルーr−アミドブ
チリル−ε−アミドカプロン酸0.29(例7からの油
状物、約0.29ミリモル)t−1例6に記載したよう
に、無水DMF a ff1A中でN−ヒドロキシスク
シンイミド0.034 、F (0,3ミリモル)およ
びジシクロヘキシルカルボジイミド66■(0,32ミ
リモル)と反応させ、後処理する。得られる油状残渣を
冷石油エーテルと数回擦っても固化せず、従って溶剤を
留去した後直接に、例9に記載したように、5−アミノ
アリルdUTPと反応させた。
収it : 0.25 Il(油状物)例 9
ジゴキシグニンー〇−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロイル−〔5−アミドアリル)−2′
−デスオキシ−ウリジン−5′−トリホスフェ−トコ−
4リチウム塩 (Dig−16−dUTP ) C49H70023N5P3Li4 分子量1
217.7ゾゴキシrニンー〇−スク7ニルーγ−アミ
ドブチリル−ε−アミドカシロン酸−N−ヒドロキシ−
スクシンイミドエステル250rn9(例8からの油状
物、約0.6ミリモル) f 、I)MP” 7− m
lに溶かし、H2O6at中の5−アリルアミノ−2′
−デオキシ−ウリジン−5’−)’ジホスフェート4リ
チウム塩210m9(0,38ミリモル)の溶液に加え
る。反応混合物に0.2モルのホウ酸ナトリウム緩衝液
(pH8,5) 62rneを加え、室温で約15時闇
夜どおし攪拌する。反応経過を、例4に記載したように
追跡する。
−ε−アミドカプロイル−〔5−アミドアリル)−2′
−デスオキシ−ウリジン−5′−トリホスフェ−トコ−
4リチウム塩 (Dig−16−dUTP ) C49H70023N5P3Li4 分子量1
217.7ゾゴキシrニンー〇−スク7ニルーγ−アミ
ドブチリル−ε−アミドカシロン酸−N−ヒドロキシ−
スクシンイミドエステル250rn9(例8からの油状
物、約0.6ミリモル) f 、I)MP” 7− m
lに溶かし、H2O6at中の5−アリルアミノ−2′
−デオキシ−ウリジン−5’−)’ジホスフェート4リ
チウム塩210m9(0,38ミリモル)の溶液に加え
る。反応混合物に0.2モルのホウ酸ナトリウム緩衝液
(pH8,5) 62rneを加え、室温で約15時闇
夜どおし攪拌する。反応経過を、例4に記載したように
追跡する。
後処理のため、バッチを油ポンプ真空中で固形残渣が生
じるまで蒸発濃縮し、H20約200mBに溶かし、イ
オン交換カラム(DEAE−セファデックスA−25、
ct−型、カラム寸法1.5X30cIn)に加える。
じるまで蒸発濃縮し、H20約200mBに溶かし、イ
オン交換カラム(DEAE−セファデックスA−25、
ct−型、カラム寸法1.5X30cIn)に加える。
H2Oで洗浄した後、H2O2tから0.3モルのLi
Cl2 lへの線状勾配液で溶離する。純粋な生成物を
含有する画分を合し、真空中で、H2Oがもはや留去し
なくなるまで濃縮し、濃縮物を引き続きアセトン/エタ
ノール混合物(3:1)中に攪拌混入することによって
沈殿させる。上澄みを遠心分離し、C1−がなくなるま
でエタノールで洗浄し、P2C)57KOH上で真空乾
燥する。
Cl2 lへの線状勾配液で溶離する。純粋な生成物を
含有する画分を合し、真空中で、H2Oがもはや留去し
なくなるまで濃縮し、濃縮物を引き続きアセトン/エタ
ノール混合物(3:1)中に攪拌混入することによって
沈殿させる。上澄みを遠心分離し、C1−がなくなるま
でエタノールで洗浄し、P2C)57KOH上で真空乾
燥する。
収に:250rn9=理論値の68%
分析: H2O測定:6.3%
元素分析(H2O含量の考慮下):
C計算値: 45.5チ H計算値:5.7%N計算値
=5.4% P計算値ニア、2チC実測値:45.1%
H実測値=5.6チN実測値:5.6% P実測値ニア
、0%UVスペクトル(リン酸塩緩衝液pH7,0):
最大: 220 nm (肩部) 289 nm 例10 ジゴキンrニンー0−スク7ニルーε−アミドカプロイ
ル−〔5−(アミドアリル)−ウリジン−5′−トリホ
スフェート]−4リチウム塩(Dig−11−UTP
) C+5Ha302sN4PsL14 分子量:
1148.5この化合物は、例4と同様に、ゾゴキシ
グニンー〇−スクシニル−ε−アミドカフロ/酸−N−
ヒドロキシスクシンイミドエステル520m9(0,7
4ミリモル)と5−アリルアミノ−UTP −4’リチ
ウム塩416.5m9 (0,7Aミリモル)との反応
によって製造する。しかし、イオン交換クロマトグラフ
ィーは例9によりCt−型のDEAE−セファデックス
A−25に一用いて行なう。
=5.4% P計算値ニア、2チC実測値:45.1%
H実測値=5.6チN実測値:5.6% P実測値ニア
、0%UVスペクトル(リン酸塩緩衝液pH7,0):
最大: 220 nm (肩部) 289 nm 例10 ジゴキンrニンー0−スク7ニルーε−アミドカプロイ
ル−〔5−(アミドアリル)−ウリジン−5′−トリホ
スフェート]−4リチウム塩(Dig−11−UTP
) C+5Ha302sN4PsL14 分子量:
1148.5この化合物は、例4と同様に、ゾゴキシ
グニンー〇−スクシニル−ε−アミドカフロ/酸−N−
ヒドロキシスクシンイミドエステル520m9(0,7
4ミリモル)と5−アリルアミノ−UTP −4’リチ
ウム塩416.5m9 (0,7Aミリモル)との反応
によって製造する。しかし、イオン交換クロマトグラフ
ィーは例9によりCt−型のDEAE−セファデックス
A−25に一用いて行なう。
収量: 560m9=理論値の66チ
分析二H20測定=8.1チ
元素分析(H2O含量を考慮して):
C計算値: 43.5% H計算値=5.4チN計算値
=4.5% P計算値: 7.47チC実測値: 43
.1% H実測値=5.6チN実測値=4.5% P実
測値: 7.35チUVスペクトル(リン酸塩緩衝液p
!−17,0):Dig−11−4UTpに一致 例11 ジゴキシゲニンー〇−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロイル−〔5−(アミドアリル)−ウ
リジン−5′−三すン酸〕−4リチウム塩 (Dig−16−dUTP ) C,9H,。024N5P3Li4 分子量:
1233.7この化合物は、例9と同様に、ジゴキシ
ケ9ニンー0−スクシニル−γニアミドブチリルーε−
アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル250rn9(0,6ミリモル、例8により得られ
る)と5−アリルアミノ−UTP −Li4214rn
q(0,38ミリモル)との反応によって製造される。
=4.5% P計算値: 7.47チC実測値: 43
.1% H実測値=5.6チN実測値=4.5% P実
測値: 7.35チUVスペクトル(リン酸塩緩衝液p
!−17,0):Dig−11−4UTpに一致 例11 ジゴキシゲニンー〇−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロイル−〔5−(アミドアリル)−ウ
リジン−5′−三すン酸〕−4リチウム塩 (Dig−16−dUTP ) C,9H,。024N5P3Li4 分子量:
1233.7この化合物は、例9と同様に、ジゴキシ
ケ9ニンー0−スクシニル−γニアミドブチリルーε−
アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル250rn9(0,6ミリモル、例8により得られ
る)と5−アリルアミノ−UTP −Li4214rn
q(0,38ミリモル)との反応によって製造される。
収j*:218mg=理論値の59チ
分析:H20の定量=7.2チ
元素分析(H2O値を考慮して):
C計算値: 44.45% H計算値: 5.67%N
計算値=5.6チ P言」算値=7.0%C実側値:
44.3% H実測値:5.5%N災測値:5.6%
P実測値ニア、1チUVスペクトル(リン酸塩緩衝液p
H7,0):Dig−16−dUTPに一致 例12 N−アジドペン・戸イルー1,8−ジアミノ−3,6−
ジオキサオクタンの製造 アジド安息香酸−N−ヒドロキシスフフンイミドエステ
/l/ (Pierce社、D=6054Rodgan
1 ) 5.20 g(20ミリモル)t−無水酢酸
エステルに溶かし、1,8−ジアミノ−6,6−シオキ
サオクタン29.3ffiシ(200ミリモル)を加え
る。反応混合物を暗所で20°Cで20時間攪拌する。
計算値=5.6チ P言」算値=7.0%C実側値:
44.3% H実測値:5.5%N災測値:5.6%
P実測値ニア、1チUVスペクトル(リン酸塩緩衝液p
H7,0):Dig−16−dUTPに一致 例12 N−アジドペン・戸イルー1,8−ジアミノ−3,6−
ジオキサオクタンの製造 アジド安息香酸−N−ヒドロキシスフフンイミドエステ
/l/ (Pierce社、D=6054Rodgan
1 ) 5.20 g(20ミリモル)t−無水酢酸
エステルに溶かし、1,8−ジアミノ−6,6−シオキ
サオクタン29.3ffiシ(200ミリモル)を加え
る。反応混合物を暗所で20°Cで20時間攪拌する。
溶剤を真空中で除去し、油状残渣を水300Mに溶かす
。生成物をパーコレーター中でドルオール21で水相か
う抽出する。その際装置にアルミニウムホイルを巻き付
ける。抽出は約16時間後に終了する。有機相から真空
で溶剤を除去し、生成物をシリカグルでの分取カラムク
ロマトグラフィー(カラム80x10cm、溶離剤:ク
ロロホルム/メタノール/濃アンモニア水65:30:
5)によって精製し、溶剤を蒸発し去った後高度真空中
で乾燥する。
。生成物をパーコレーター中でドルオール21で水相か
う抽出する。その際装置にアルミニウムホイルを巻き付
ける。抽出は約16時間後に終了する。有機相から真空
で溶剤を除去し、生成物をシリカグルでの分取カラムク
ロマトグラフィー(カラム80x10cm、溶離剤:ク
ロロホルム/メタノール/濃アンモニア水65:30:
5)によって精製し、溶剤を蒸発し去った後高度真空中
で乾燥する。
収量: 3.2 、V (55%);無色、粘稠な油状
物 例13 ジゴキシゲニンー3−ヘミスクシネー) CW−(4−
アジドベンゾイル)〕−8−アミノ−6,6−シオキサ
オクチルアミド(フォトジゴキシゲニン) 例12からの生成物2.93.9 (10ミリモル)を
無水ジオキサン200#;に溶かし、ジゴキシグニンー
3−ヘミスクシネート−N−ヒドロキシスクンンイミド
エステル(C)、C,○1iver 。
物 例13 ジゴキシゲニンー3−ヘミスクシネー) CW−(4−
アジドベンゾイル)〕−8−アミノ−6,6−シオキサ
オクチルアミド(フォトジゴキシゲニン) 例12からの生成物2.93.9 (10ミリモル)を
無水ジオキサン200#;に溶かし、ジゴキシグニンー
3−ヘミスクシネート−N−ヒドロキシスクンンイミド
エステル(C)、C,○1iver 。
Tr、 Bront 、 M、 Parker 、 D
、L、 BrasfieMおよびch、 W、 Par
ker ; ” J、 c’lin、 Invest″
、第47巻(1986年)第1065頁と同様にして製
造’) 5.87 g(10ミリモル)を加える。
、L、 BrasfieMおよびch、 W、 Par
ker ; ” J、 c’lin、 Invest″
、第47巻(1986年)第1065頁と同様にして製
造’) 5.87 g(10ミリモル)を加える。
室温で20時間撹拌し、真空中で溶剤を除去し、生成し
た生成物を分取中圧液体クロマトグラフィーによって分
離する(カラム容積:1640m13、Labochr
om Reversed−Phase Sj、1ica
HD −5IL−18−30−60、溶離剤メタノー
ル/水7 : 3+1≦氷酢酸)。相応する画分を集め
た後、溶剤全真空中で除去し、油状残渣をジオキサンに
溶かす。凍結乾燥し、ジインプロピルエーテル100成
で洗浄した後、生成物ジゴキシゲニンー6−ヘミスクシ
ネート(N’−(4”アシドベンゾイル)〕−8−アミ
ノ−6,6−シオキサオクチルアミドは無色の軽度に粘
漕性固形物として得られ、高度真空中で乾燥する。
た生成物を分取中圧液体クロマトグラフィーによって分
離する(カラム容積:1640m13、Labochr
om Reversed−Phase Sj、1ica
HD −5IL−18−30−60、溶離剤メタノー
ル/水7 : 3+1≦氷酢酸)。相応する画分を集め
た後、溶剤全真空中で除去し、油状残渣をジオキサンに
溶かす。凍結乾燥し、ジインプロピルエーテル100成
で洗浄した後、生成物ジゴキシゲニンー6−ヘミスクシ
ネート(N’−(4”アシドベンゾイル)〕−8−アミ
ノ−6,6−シオキサオクチルアミドは無色の軽度に粘
漕性固形物として得られ、高度真空中で乾燥する。
収量: 4.9.9 (64チ〕
IR(アセトン):=2150.1728゜1639a
n−’ 例14 RNAの試験管内転写による核酸プローブの標識付け(
” TranScrjptj(yns”法ン反応の原理
は、第入囚から認められる。標識る。ベクターは、SP
6用プロモーターおよびT 7 RNAポリメラーゼ用
プロモーター全含有する。DNAは、標識反応前に、挿
入されたDNA配列およびプロモーター、ならびにプロ
モーターとDNA配列を結合する配列外の個所で線状に
される。
n−’ 例14 RNAの試験管内転写による核酸プローブの標識付け(
” TranScrjptj(yns”法ン反応の原理
は、第入囚から認められる。標識る。ベクターは、SP
6用プロモーターおよびT 7 RNAポリメラーゼ用
プロモーター全含有する。DNAは、標識反応前に、挿
入されたDNA配列およびプロモーター、ならびにプロ
モーターとDNA配列を結合する配列外の個所で線状に
される。
線状にされた基質DNA1μgに、反応容器中でアデノ
7ン三リン酸、ジチゾン三リン酸およびグアノシン三リ
ン酸のそれぞれ10ミリモル/l溶液1μIt加える。
7ン三リン酸、ジチゾン三リン酸およびグアノシン三リ
ン酸のそれぞれ10ミリモル/l溶液1μIt加える。
これに、ウリジン二リン酸6.5ミリモル/lおよびジ
ゴキシゲニン−11−UTP 3.5ミリモル/lを含
有する溶液1μlを加える。ジゴキシゲニンー1.1−
UTPは、例10において、例4でジゴキゾデニン−
11−dUTPと同様に農遺され、たんに出発物質とし
てアリルアミノ−デオキシウリジン塩の代シにアリルア
ミノ−ウリジン塩を使用する。
ゴキシゲニン−11−UTP 3.5ミリモル/lを含
有する溶液1μlを加える。ジゴキシゲニンー1.1−
UTPは、例10において、例4でジゴキゾデニン−
11−dUTPと同様に農遺され、たんに出発物質とし
てアリルアミノ−デオキシウリジン塩の代シにアリルア
ミノ−ウリジン塩を使用する。
さらに、バッチに10倍濃度の緩衝液(トリス−HCl
0.4モル/ l ; MgC1−z 60ミリモル
/l;ジチオトレイトール50ミリモル/l;スペルミ
ジン40ミリモル/l;PI(7,2)2μlを加え、
2回蒸留した無菌水で19μlにし、最後にRNAポリ
メラーゼ(SF3ないしはT 7)1μ1(10単位に
相当)の添加により反応を開始させる。
0.4モル/ l ; MgC1−z 60ミリモル
/l;ジチオトレイトール50ミリモル/l;スペルミ
ジン40ミリモル/l;PI(7,2)2μlを加え、
2回蒸留した無菌水で19μlにし、最後にRNAポリ
メラーゼ(SF3ないしはT 7)1μ1(10単位に
相当)の添加により反応を開始させる。
短時間の遠心分離後、バッチを37℃で1時間インキュ
ベートした。
ベートした。
引き続き、基質DNAをDNAアーゼl (RNAアー
ゼ不含)1μ1(10単位に相当)を67°Cで15分
間添加することによって分解する。
ゼ不含)1μ1(10単位に相当)を67°Cで15分
間添加することによって分解する。
反応を、EDTA 2μl (0,2モル)/1(p)
18.0)の添加によって停止した。得られるジゴキシ
ゲニン標識されたRNAプローブを、フェノール1容賞
で抽出し、引き続きエタノール沈殿によってタンパク質
およびヌクレオチドを除去し、最後に無菌緩衝液(トリ
スHCI 10ミリモル/ l ; EDTA 1ミリ
モル/l;X8.0)に溶かした。
18.0)の添加によって停止した。得られるジゴキシ
ゲニン標識されたRNAプローブを、フェノール1容賞
で抽出し、引き続きエタノール沈殿によってタンパク質
およびヌクレオチドを除去し、最後に無菌緩衝液(トリ
スHCI 10ミリモル/ l ; EDTA 1ミリ
モル/l;X8.0)に溶かした。
例15
ジゴキ7デニンーおよびビオチン標識されたオリゴヌク
レオチドを有するサンドイツチノ・イブリッド形成 a〕 使用されたオリゴヌクレオチド 検出すべき核酸: 95 mar 単一ジープロー プ5mer、48個の塩基(検出すべき核酸に対して相
補的) 5 ’ −CTGGG TTGGACCG’IT GC
TTGGAAGA ACAACnCCG捕獲プローブ: 95mar、47個の塩基(検出すべき核酸に対して相
補的) b)オリゴヌクレオチドの光標識 蒸留水20μ!中の単一プローブ10μgに、フオ恕ト
ビオチン(Forsterおよび協力者” Nuct、
Ac1ds、 Res、 ”第13巻(1985年)
第745頁〜第761頁)1m9/m12μlt−減衰
光下に加えた。混合物を、開放のエツペンドルフ反応容
器中で、水冷下に距離10のにある°フィリン11社の
HPLR400Wの放電灯で20分間照射した。
レオチドを有するサンドイツチノ・イブリッド形成 a〕 使用されたオリゴヌクレオチド 検出すべき核酸: 95 mar 単一ジープロー プ5mer、48個の塩基(検出すべき核酸に対して相
補的) 5 ’ −CTGGG TTGGACCG’IT GC
TTGGAAGA ACAACnCCG捕獲プローブ: 95mar、47個の塩基(検出すべき核酸に対して相
補的) b)オリゴヌクレオチドの光標識 蒸留水20μ!中の単一プローブ10μgに、フオ恕ト
ビオチン(Forsterおよび協力者” Nuct、
Ac1ds、 Res、 ”第13巻(1985年)
第745頁〜第761頁)1m9/m12μlt−減衰
光下に加えた。混合物を、開放のエツペンドルフ反応容
器中で、水冷下に距離10のにある°フィリン11社の
HPLR400Wの放電灯で20分間照射した。
反応後、トリスHC1(pH9,0) 0.1モル、E
DTA 10ミリモルで100μlにし、ブタン−2−
オールで2回抽出した。第2の抽出後、水相の体積は3
0〜40μlに達した。
DTA 10ミリモルで100μlにし、ブタン−2−
オールで2回抽出した。第2の抽出後、水相の体積は3
0〜40μlに達した。
担体キャリヤ) t RNA (約1μg)および3モ
ルの酢酸アンモニウムl/、o容の添加後、エタノール
3容で一20℃で夜どおし沈殿させた。
ルの酢酸アンモニウムl/、o容の添加後、エタノール
3容で一20℃で夜どおし沈殿させた。
4℃で遠心分離した後に得られるペレットヲ、冷エタノ
ールで洗浄し、乾燥した。標瞭されたDNA ’i、ト
リスHct (pH7,5)、EDTA O,1ミリモ
ルにと9.4℃で保存した。
ールで洗浄し、乾燥した。標瞭されたDNA ’i、ト
リスHct (pH7,5)、EDTA O,1ミリモ
ルにと9.4℃で保存した。
同じ方法によりジビキ7デニンで標識付けを行なった。
ジメチルホルムアミド中のフォトジゴキシゲニン(例1
3)1m9/継の溶液全使用した。ブタン−2−オール
で抽出する際の相分離のため、5モルのNaC210μ
l’r加えた。
3)1m9/継の溶液全使用した。ブタン−2−オール
で抽出する際の相分離のため、5モルのNaC210μ
l’r加えた。
C)ストレプトアビジンによる膜の被覆シュライヒエル
・ラント・シュル社(Schlei−cher & 5
chtill )のナイロン13NMt−使用した。
・ラント・シュル社(Schlei−cher & 5
chtill )のナイロン13NMt−使用した。
’/ユライヒエル・ラント・ンユル社のスロットマルチ
濾過装を敗込みの膜細長片に細断し、蒸留水で湿らせた
。引き続き、膜をサーモR8A(欧州特許871174
11.6号により製造)(ストレプトアビジン)1rn
9/#!J中で室温で30分間奈とう下にインキュベー
トした。膜をトリスHC1(pH7,5) 0.1モル
、NaC2150ミリモル(緩衝液1)で2回洗浄した
。
濾過装を敗込みの膜細長片に細断し、蒸留水で湿らせた
。引き続き、膜をサーモR8A(欧州特許871174
11.6号により製造)(ストレプトアビジン)1rn
9/#!J中で室温で30分間奈とう下にインキュベー
トした。膜をトリスHC1(pH7,5) 0.1モル
、NaC2150ミリモル(緩衝液1)で2回洗浄した
。
DNA結合個所を飽和するために、60分間上述したよ
うに新しく修飾したニシンの精子(Heringspe
rm ) DNA 30 ml 7 mlと共にインキ
ュベートした。引き続き、緩衝液1で2回洗浄し、膜を
直ちにマルチ濾過装置に嵌込んだ。
うに新しく修飾したニシンの精子(Heringspe
rm ) DNA 30 ml 7 mlと共にインキ
ュベートした。引き続き、緩衝液1で2回洗浄し、膜を
直ちにマルチ濾過装置に嵌込んだ。
d)ハイブリッド形奴
反応バッチ: 反応体積 25μl捕獲プロー
ブ(ピオチン標識性)5ng検出プローブ(ジゴキシデ
ニン標識付) 5ng緩衝液1 5 X SSC−
NaCL Q、5 モルクエン酸Na 50ミリ
モル 検出すべきDNA 2 pg−1−000ng反応混
合物を95℃で5分間修飾し、引き続き68℃で1時間
インキュベートした。冷後、反応混合物をマルチ濾過装
置中で前処理した膜上で室温で15分インキュベートし
た。その後、溶液は膜に吸収された。短時間吸引濾過し
、次いで緩衝液150μ宛で2回洗浄した。
ブ(ピオチン標識性)5ng検出プローブ(ジゴキシデ
ニン標識付) 5ng緩衝液1 5 X SSC−
NaCL Q、5 モルクエン酸Na 50ミリ
モル 検出すべきDNA 2 pg−1−000ng反応混
合物を95℃で5分間修飾し、引き続き68℃で1時間
インキュベートした。冷後、反応混合物をマルチ濾過装
置中で前処理した膜上で室温で15分インキュベートし
た。その後、溶液は膜に吸収された。短時間吸引濾過し
、次いで緩衝液150μ宛で2回洗浄した。
e)サンドインチDNA複合体の検出
e1)ブロッキング
膜を濾過装置から取り出し、緩衝液1中の6チ脱脂粉乳
中で室温で振とり下に40分間インキュベートした。
中で室温で振とり下に40分間インキュベートした。
e2)免疫反応
ブロッキングした膜を、緩衝液1中の抗ジゴキンrニン
抗体・アルカリホスファターゼ接合インキュベートした
。
抗体・アルカリホスファターゼ接合インキュベートした
。
e3)洗浄
膜を緩衝液1で3回、0.1モルのトリスHC1(pH
9,5) 、0.1モルのNact、50ミリモルのM
gCl2で1回洗浄した。
9,5) 、0.1モルのNact、50ミリモルのM
gCl2で1回洗浄した。
e4)呈色反応
膜を、ニトロテトラψ−ルブル−0,331TI9/m
tおよび5−ブロム−4−クロル−3−インドリル−ホ
スフェート肌167即/mlの窒素で洗浄した新しい溶
液中で、空気遮1下に暗所で、最良には箔製に溶封して
、室温でインキュベートした。
tおよび5−ブロム−4−クロル−3−インドリル−ホ
スフェート肌167即/mlの窒素で洗浄した新しい溶
液中で、空気遮1下に暗所で、最良には箔製に溶封して
、室温でインキュベートした。
f)結果
この方法で、反応溶液25μl中の検出子べきオリゴヌ
クレオチドDNA 10〜10100pこれは4 ng
/ mlの濃度に相当)を検出することる。
クレオチドDNA 10〜10100pこれは4 ng
/ mlの濃度に相当)を検出することる。
異種DNAにシン精液) 5000 ng/ml =
5μi/mlまでの添加は、シグナル減少をもたらさな
い。
5μi/mlまでの添加は、シグナル減少をもたらさな
い。
対照反応:
サンPイツチハイブリツP形成・ζツチを前記したと同
様に、サーモR9Aで被覆した膜で濾過する場合、80
mHのパックブラウンPが測定された。試料DNA量に
よる依存性は観察されない。
様に、サーモR9Aで被覆した膜で濾過する場合、80
mHのパックブラウンPが測定された。試料DNA量に
よる依存性は観察されない。
ビオチン捕獲プローブDNAまたはジザキシゲニン検出
プローブDNAが存在しない対照反応は、同様に80m
EのパックブラウンP値を示す。
プローブDNAが存在しない対照反応は、同様に80m
EのパックブラウンP値を示す。
第1図a +tプラスミPpSPT18テノ5P6RN
Aポリメラーゼ接触の転写法によるRNA トラン2ス
クリプトの製造を示す図であり、第1図bバフラスミr
pSPT18テノT7RNAホリメラーゼ接触の転写法
に・よるRNAトランスクリシトの製造を示す図でちり
、第2図はプラスミPpSPT18の略示図であり、第
3図はニトロセルロース・ストレプトアビジンにオリザ
サンPイツチを結合する場合の色素形成反応に対する吸
光(mE 530 nm) /試料DNA(pg)曲線
IDテあり、第4A図はDNA配列表であり、第4B図
はpsPT18の制限図である。 551 GTAAAAAGG(: CにCCTTCC
τG1601 GAGCATCACAAAAAτCG
ACに 1651 ACTATAAAGA TACC
AGGCGT ’701 CTGTTCCにACCC
τGCCGCTT 。 751 GGAAGCにτGG C(:CτττCτ
CA 。 801CτACCτCCττCGCτCCAAにC’8
51 CCにA(:CにCτG CGCCττATC
(:・901 AC;ACACGACTτAτCGC
CACτ951 AGCGAGGTAT GTAGG
;C(:GTGlool ACにGCτACACTA
GAAGにACA1051 GττACCττCG
G:AAphAA(:AGτ1101 CGC:TG
GTAにCGにTGGτττTT1151 uGGA
T(:τCAAGAAGAT1201 CAGτGG
AA(:G AAAA(:TCACGにCGTττττ
CCATAGに(:TCCに CCCCCCτCACC
T(:AAGτCAG AGGTGGCGAA ACC
CGACAGGτTCCCCCτGG AAGCτCC
CτCCτGC(:CτCτC八CCCへATACCτ
Cτcccccττ τCTCCCττCC八τGCτ
CACCへ τにTAにGTAτCτCAGττCG
GTτccccτGτGT GCACGAACCCCC
CGττCAG(:ccτAACTATC′GτCττ
GAGT(: CAACCCGGTAGGCAGCAG
CCACτGGTAACA GGAττAGCAGCT
A(:ACAGττCττGAAGτGGτにGCCT
AACτGTATTTにGτAτCTGCにCτCτC
CτGAAGCCAτGGTAにCTCT TGAτC
CGGCA AACAAACCACTTGTTTGCA
A GCAGCAGATT A(:GCGCAGAAC
CτττGATCT TτTCτACGGG GτCτ
GACGCTτTAAGGGATτττCCτCAτG
A GAτTAτCAAA21351 GTAGAG
GATCτCCCτAGCG;A2901 CCG;
GGτcccc cAcccccτTA2951 C
CG;ACTCTCA CににCAGTTτA3001
C;CCACATCCT ACACAATTAG3
051 ACAATTAATA CATAACCτT
A ’3101 τATA
Aポリメラーゼ接触の転写法によるRNA トラン2ス
クリプトの製造を示す図であり、第1図bバフラスミr
pSPT18テノT7RNAホリメラーゼ接触の転写法
に・よるRNAトランスクリシトの製造を示す図でちり
、第2図はプラスミPpSPT18の略示図であり、第
3図はニトロセルロース・ストレプトアビジンにオリザ
サンPイツチを結合する場合の色素形成反応に対する吸
光(mE 530 nm) /試料DNA(pg)曲線
IDテあり、第4A図はDNA配列表であり、第4B図
はpsPT18の制限図である。 551 GTAAAAAGG(: CにCCTTCC
τG1601 GAGCATCACAAAAAτCG
ACに 1651 ACTATAAAGA TACC
AGGCGT ’701 CTGTTCCにACCC
τGCCGCTT 。 751 GGAAGCにτGG C(:CτττCτ
CA 。 801CτACCτCCττCGCτCCAAにC’8
51 CCにA(:CにCτG CGCCττATC
(:・901 AC;ACACGACTτAτCGC
CACτ951 AGCGAGGTAT GTAGG
;C(:GTGlool ACにGCτACACTA
GAAGにACA1051 GττACCττCG
G:AAphAA(:AGτ1101 CGC:TG
GTAにCGにTGGτττTT1151 uGGA
T(:τCAAGAAGAT1201 CAGτGG
AA(:G AAAA(:TCACGにCGTττττ
CCATAGに(:TCCに CCCCCCτCACC
T(:AAGτCAG AGGTGGCGAA ACC
CGACAGGτTCCCCCτGG AAGCτCC
CτCCτGC(:CτCτC八CCCへATACCτ
Cτcccccττ τCTCCCττCC八τGCτ
CACCへ τにTAにGTAτCτCAGττCG
GTτccccτGτGT GCACGAACCCCC
CGττCAG(:ccτAACTATC′GτCττ
GAGT(: CAACCCGGTAGGCAGCAG
CCACτGGTAACA GGAττAGCAGCT
A(:ACAGττCττGAAGτGGτにGCCT
AACτGTATTTにGτAτCTGCにCτCτC
CτGAAGCCAτGGTAにCTCT TGAτC
CGGCA AACAAACCACTTGTTTGCA
A GCAGCAGATT A(:GCGCAGAAC
CτττGATCT TτTCτACGGG GτCτ
GACGCTτTAAGGGATτττCCτCAτG
A GAτTAτCAAA21351 GTAGAG
GATCτCCCτAGCG;A2901 CCG;
GGτcccc cAcccccτTA2951 C
CG;ACTCTCA CににCAGTTτA3001
C;CCACATCCT ACACAATTAG3
051 ACAATTAATA CATAACCτT
A ’3101 τATA
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、同じ溶液相中に存在する、検出すべき核酸の異なる
範囲に相補的な、一方の核酸プローブは検出プローブと
して役立ちかつ化学結合により標識物質として少なくと
も1つのハプテンを結合含有し、他方の核酸プローブは
捕獲プローブとして役立ちかつ固体マトリックスに結合
される2つの単鎖核酸プローブでのハイブリッド形成に
よる定義された配列の核酸の検出方法において、ハプテ
ンとして、検出すべき核酸との水素架橋形成に参加して
いない検出プローブの少なくとも1つの部位に、少なく
とも4原子長の架橋により共有結合しているステロイド
を使用し、溶液中に存在する、検出すべき核酸に、検出
プローブおよび捕獲プローブを任意の順序でインキュベ
ートし、その際マトリツクスへの捕獲プローブの結合を
、検出すべき核酸のインキュベートの前、間またはその
後に生起させ、残留する溶液を捕獲プローブ、検出すべ
き核酸および検出プローブからなるマトリックス結合し
た複合体から分離し、複合体をそれ自体標識された抗ハ
プテン抗体により検出することを特徴とするハイブリッ
ド形成による定義された核酸の検出方法。 2、ステロイドとしてジゴキシゲニンまたはジゴキシン
を使用する請求項1記載の方法。 3、捕獲プローブを、吸着、配位結合、共有結合または
結合系によつて固体マトリックスに結合する請求項2記
載の方法。 4、結合系が特異的に互いに結合しうる2つの成分から
なり、その際1つの成分は捕獲プローブに結合し、他方
の成分は固体マトリックスに結合している請求項3記載
の方法。 5、結合系の1つの成分は、少なくとも4原子長の架橋
により、検出すべき核酸との水素架橋形成に参加してい
ない、少なくとも1つの捕獲プローブの部位に結合して
いる請求項4記載の方法。 6、そのハプテンが核酸プローブ中へ化学的に、オリゴ
デオキシリボヌクレオチド合成の範囲内で、置換可能な
アミノ官能基で修飾された、保護されたヌクレオシドホ
スホラミジトを組み込み、−保護基の除去後−、修飾さ
れたオリゴデオキシリボヌクレオチドとハプテンの活性
化されたエステル、アミドまたはエーテルとの反応によ
つて組み込まれたハプテン 標識されたプローブを使用する請求項1から5までのい
ずれか1項記載の方法。 7、架橋が分枝鎖であり、少なくとも1つの鎖端にハプ
テン分子を有する請求項1から5までのいずれか1項記
載の方法。 8、ハプテンが架橋により、検出プローブの少なくとも
1つの塩基またはリボース成分に結合している請求項1
から7までのいずれか1項記載の方法。 9、ハプテンが架橋により、ウラシルのC_5部位また
はアデニンまたはグアニンのC_8部位に結合している
請求項8記載の方法。 10、ハプテンが架橋によりリボースの2部位に結合し
ている請求項8記載の方法。 11、ハプテンと架橋との間の結合が、エーテル結合、
アミド結合またはエステル結合である請求項1から10
までのいずれか1項記載の方法。 12、単一プローブが吸着、配位結合、共有結合による
かまたは結合系により固体マトリックスに結合されてい
る請求項1から11までのいずれか1項記載の方法。 16、結合系が互いに特異的に結合しうる2つの成分か
らなり、その際1つの成分が捕獲プローブに結合し、他
方の成分が固体マトリックスに結合している請求項12
記載の方法。 14、結合系の1つの取分が少なくとも4原子長の架橋
により、検出すべき核酸との水素架橋形成に参加してい
ない単一プローブの少なくとも1つの部位に結合してい
る請求項13記載の方法。 15、結合系の双方の成分がビオチンおよび(ストレプ
ト−)アビジンである請求項16または14記載の方法
。 16、結合系の双方の成分がオリゴ−またはポリd(C
)およびオリゴ−またはポリd(G)である請求項13
または14記載の方法。 17、結合系の双方の成分がハプテンおよび抗ハプテン
抗体である、ただしハプテンは検出プローブの標識物質
とは異なるハプテンであり、抗ハプテン抗体は検出プロ
ーブの標識ハプテンと交差反応しないものとする請求項
13または14記載の方法。 18、結合系がオリゴ−またはポリd(C)/オリゴ−
またはポリd(G)であり、双方の成分の1つが直接に
単一プローブの5′−または3′末端に存在する請求項
13記載の方法。 19、固体マトリックスとして、ニトロセルロースフィ
ルター、ナイロンフィルター、プラスチツク、プレキシ
ガラス、またはニトロセルロース−またはナイロン被覆
せるプラスチツクまたはプレキシガラスを使用する請求
項1から18までのいずれか1項記載の方法。 20、固体マトリックスとして反応容器の器壁を使用す
る請求項1から18までのいずれか1項記載の方法。 21、ハプテンが核酸プローブ中へ酵素的に、RNAポ
リメラーゼ、DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ
またはリバーストランスクリプターゼおよび相応するハ
プテン修飾されたデオキシ−またはリボヌクレオシド三
リン酸基質を用いて組み込まれたハプテン標識されたプ
ローブを使用する請求項1から20までのいずれか1項
記載の方法。 22、ハプテンが核酸プローブ中へ光化学的に、フオト
ハプテンを用いて組み込まれたハプテン標識されたプロ
ーブを使用する請求項1から20までのいずれか1項記
載の方法。 23、ハプテンが核酸プローブ中へ化学的に、オリゴデ
オキシリボヌクレオチド合成の範囲内で、置換可能アミ
ノ基で修飾された保護されたヌクレオシドホスホアミジ
ドを組み込み、−保護基の脱離後−、修飾オリゴデオキ
シリボヌクレオチドとハプテンの活性化されたエステル
、アミドまたはエーテルとの反応によつて組み込まれた
ハプテン標識されたプローブを使用する請求項1から2
0までのいずれか1項記載の方法。 24、検出プローブのハプテンに向けられた抗ハプテン
抗体を標識するため、酵素標識、放射性標識、螢光標識
または(バイオ)ルミネセンス標識を使用する請求項1
から23までのいずれか1項記載の方法。 25、抗ハプテン抗体を酵素標識するため、標識酵素と
してアルカリホスファターゼ、ペル オキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを使用する請
求項24記載の方法。 26、標識酵素の触媒活性の測定をレドックス系により
行なう請求項25記載の方法。 27、標識酵素の触媒活性の測定をロイコ系により行な
う請求項26記載の方法。 28、測定を、被酸化性化合物としてインジゴイド系お
よび酸化剤としてテトラゾリウム塩によつて行なう請求
項27記載の方法。 29、標識酵素としてアルカリ性ホスファターゼを使用
し、測定をレドックス系X−ホスフェート/ニトロブル
ー・テトラゾリウムによつて行なう請求項24から28
までのいずれか1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3800644A DE3800644A1 (de) | 1988-01-12 | 1988-01-12 | Verfahren zum hochspezifischen nachweis von nukleinsaeuren in loesung |
DE3800644.8 | 1988-01-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01215300A true JPH01215300A (ja) | 1989-08-29 |
Family
ID=6345123
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1003882A Pending JPH01215300A (ja) | 1988-01-12 | 1989-01-12 | ハイブリツド形成による定義された配列の核酸の検出方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0324468A3 (ja) |
JP (1) | JPH01215300A (ja) |
DE (1) | DE3800644A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06311899A (ja) * | 1993-04-16 | 1994-11-08 | Becton Dickinson & Co | 核酸分析法 |
US5728531A (en) * | 1994-09-30 | 1998-03-17 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Method of detecting nucleic acid |
EP1542018A2 (en) | 2003-12-12 | 2005-06-15 | Fuji Photo Film Co. Ltd. | Method for detecting proteins |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4027616A1 (de) * | 1990-08-31 | 1992-03-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von polymerase-aktivitaet |
DE4222254A1 (de) * | 1992-07-07 | 1994-01-13 | Bayer Ag | Fotochemische Markierung von Nukleinsäuren mit Digoxigenin-Reagenzien und ihre Verwendung in Gensondentestsystemen |
JP3027770B2 (ja) * | 1994-03-05 | 2000-04-04 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | イムノアッセイで使用するための干渉除去剤 |
DE19516196A1 (de) * | 1995-05-08 | 1996-11-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum quantitativen Nachweis von Nukleinsäuren |
GB2326712B (en) * | 1997-06-25 | 2001-09-26 | Fujirebio Kk | Colour devoloping method,enzyme immunoassay using the colour developing method,and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6160697A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-28 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 新規な誘導体化核酸配列、その製法および核酸ないし核酸配列の検出法 |
JPS61185200A (ja) * | 1985-01-02 | 1986-08-18 | オリオン−ユヒチユメ・オユ | 核酸の同定方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
GB8509367D0 (en) * | 1985-04-12 | 1985-05-15 | Amersham Int Plc | Nucleic acid hybridisation |
-
1988
- 1988-01-12 DE DE3800644A patent/DE3800644A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-01-12 EP EP19890100473 patent/EP0324468A3/de not_active Withdrawn
- 1989-01-12 JP JP1003882A patent/JPH01215300A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6160697A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-28 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 新規な誘導体化核酸配列、その製法および核酸ないし核酸配列の検出法 |
JPS61185200A (ja) * | 1985-01-02 | 1986-08-18 | オリオン−ユヒチユメ・オユ | 核酸の同定方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06311899A (ja) * | 1993-04-16 | 1994-11-08 | Becton Dickinson & Co | 核酸分析法 |
US5728531A (en) * | 1994-09-30 | 1998-03-17 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Method of detecting nucleic acid |
EP1542018A2 (en) | 2003-12-12 | 2005-06-15 | Fuji Photo Film Co. Ltd. | Method for detecting proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3800644A1 (de) | 1989-07-20 |
EP0324468A2 (de) | 1989-07-19 |
EP0324468A3 (de) | 1991-04-17 |
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