DK171822B1 - Modificerede nucleotider og fremgangsmåder til deres fremstilling og påvisning - Google Patents

Description

DK 171822 B1

Opfindelsen angår et modificeret nucleotid med strukturen:

i J · · *A

x-CH, .CA

i<o>l

Hl H

OB 2 hvor B er en 7-deazapurin eller et pyrimidinderivat, der er kovalent bundet til sukkermolekyldelens C1,-stilling, forud-5 sat,at når B er 7-deazapurin, er sukkermolekyldelen bundet til deazapurinens N9-stilling, og når B er pyrimidin, er sukkermolekyldelen bundet til ^-stillingen, hvor A er en molekyldel bestående af mindst 3 carbonatomer og desuden betegner mindst én komponent af en signalerende mole-10 kyldel, som er i stand til at danne et påviseligt signal, hvor den punkterede linie repræsenterer en binding eller gruppe, som forbinder B og A, forudsat, at hvis B er 7-deazapurin, er bindingen bundet til deazapurinens 7-stilling, og hvis B er pyrimidin, er bindingen bundet til pyrimidinens 5-stilling, og 15 hvor x repræsenterer 0 0 0 0 0 0 " ’ " ti » ,1 H0-P-0-, H0-P-0-P-0- eller H0-P-0-P-0-P-0- ' » * . . , '

OH OH OH OH OH OH

og z er H- eller H0-, og en fremgangsmåde til fremstilling og påvisning af dette nucleotid.

Mange fremgangsmåder, der anvendes i biomedicinsk forskning og rekombinant DNA-teknologi, er i høj grad baseret på an- 2 DK 171822 B1 vendelse af nucleotid eller polynucleotidderivater, som er radioaktivt mærket med isotoper af hydrogen (½), phosphor •5? 14 12¾ ( P), carbon ( C) eller jod ( I). Sådanne radioaktive forbindelser giver nyttige indikatorsonder, som gør det 5 muligt for brugeren at påvise, undersøge, lokalisere eller isolere nucleinsyrer og andre molekyler af videnskabelig eller klinisk interesse, selv når de kun er til stede i yderst små mængder. Til dato har radioaktive materialer været det mest følsomme og i mange tilfælde det eneste mid-1° del til at udføre mange vigtige eksperimentelle eller analytiske prøver. Der er imidlertid alvorlige begrænsninger og ulemper forbundet med anvendelsen af radioaktive forbindelser. For det første, fordi personalet, som har at gøre med radioaktivt materiale, kan blive udsat for poten-15 tielt farlige strålingsniveauer, må der opretholdes detaljerede sikkerhedsforanstaltninger under fremstillingen, anvendelsen og bortskaffelsen af radioisotoperne. For det andet er radioaktive nucleotider meget kostbare at købe og anvende i stor udstrækning på grund af omkostningerne til 20 udstyr og arbejdskraft, som er nødvendig til at give de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger, sundhedsundersøgende tjenester for producent og bruger og programmer til bortskaffelse af affald. For det tredje er radioaktive materialer ofte meget ustabile og har en begrænset holdbarhed, som 25 yderligere forøger omkostningerne ved brugen. Denne ustabi litet er resultatet af radiolytisk dekomponering, som skyldes de destruktive virkninger, der står i forbindelse med henfaldet af radioisotopen selv, og den omstændighed, at mange isotoper (f.eks. P og I) har halveringstider på 30 kun nogle få dage.

Det er kendt, at haptener kan gå i forbindelse med antistoffer, men kun kan igangsætte en immunreaktion, hvis de er bundet til en bærer. Denne egenskab kan udnyttes til 35 påvisning og identifikationsprøver.

Det er også kendt, at biotin og iminobiotin reagerer stærkt med avidin, et 68.000 dalton glycoprotein fra æggehvide.

DK 171822 B1 3

Denne reaktion udviser en af de fasteste ikke-kovalente bindingskonstanter (K^ =10”^) · der findes i naturen. Hvis avidin kobles til potentielt påviselige indikatormolekyler, herunder fluorescerende farvestoffer, f.eks. fluorescein 5 eller rhodamin, elektrontætte reagenser, f.eks. ferritin, hæmocyanin eller kolloidt guld, eller enzymer, som er i stand til at aflejre uopløselige reaktionsprodukter, f.eks. peroxidase eller alkalisk phosphatase, kan tilstedeværelsen, beliggenheden eller mængden af en biotinsonde konstateres.

1° Selv om iminobiotin binder avidin mindre fast end biotin, kan lignende reaktioner anvendes til dets påvisning. Reversibiliteten af iminobiotin-avidinreaktionen frembyder endvidere ved at nedsætte opløsningens pH-værdi betydelige fordele til visse anvendelser.

15

Specificiteten og fastheden af biotin-avidinkomplekset har været anvendt i de senere år til at udvikle fremgangsmåder til visuelt at lokalisere specifikke proteiner, lipider eller kulhydrater på eller inden i celler (omtalt af E.A.

20 Bayer og M. Wilchek i Methods of Biochemical Analysis, 26, 1, 1980). Kromosomal lokalisering af RNA er blevet bestemt ved elektronmikroskopi under anvendelse af biotiniseret protein, cytokrom C, kemisk tværbundet til RNA som hybridise-ringssonde. Stedet for hybridiseringen blev visualiseret 25 gennem bindingen af avidin-ferritin eller avidin-methacry= latkugler formidlet af reaktionen avidin-biotin. (J.E. Manning, N.D. Hershey, T.R. Broker, M. Pellegrini, H.K. Mitchell og N. Davidson, Chromosoma, 53, 107, 1975, J.E. Manning, M. Pellegrini og N. Davidson, Biochemistry, 61, 1364, 30 1977, T.R. Broker, L.M. Angerer, P.H. Yen, N.D. Hersey og N. Davidson, Nucleic Acid Research, 5, 363, 1978, A Sodja og N. Davidson, Nucleic Acid Research, 5, 383, 1978). Selv om dette forsøg på at påvise polynucleotidsekvenser var vellykket i de specialiserede tilfælde, som blev undersøgt 35 og som var meget gentagne sekvenser, har den ikke generel anvendelighed til analyse af polynucleotider, der er til stede i en enkelt kopi eller i et lavt antal kopier.

4 DK 171822 B1

Der kendes endvidere fremgangsmåder til at binde kemiske molekyIdele til pyrimidin og purinringe. For flere år siden blev udviklet en simpel og hurtig acetoxymerkureringsreak-tion til indføring af kovalent bundne kviksølvatomer i 5-5 stillingen i pyrimidinringen, C-8-stillingen i purinringen eller C-7-stillingen i en 7-deazapurinring, begge i nucleo* tider og polynucleotider. (R.M.K. Dale, D.C. Livingston og D.C. Ward, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 2238, 1973, R.M.K. Dale, E. Martin, D.C. Livingston og D.C. Ward, Bio-10 chemistry, 14, 2447, 1975). Det var også kendt for flere år siden, at organomerkuriske forbindelser kunne reagere med olefiniske forbindelser i nærværelse af palladiumkatalysatorer til dannelse af carbon-carbonbindinger (R.F. Heck, J. Am. Chem. Soc., 90, 5518, 1968, R.F. Heck, Ibid., 90, 15 5526, 1968, R.F. Heck, Ibid, 90, 5531, 1968, R.F. Heck,

Ibid., 90, 5535, 1968 og R.F. Heck, J. Am. Chem. Soc. 91, 6707, 1969) Bergstrom og medarbejdere (J.L. Ruth og D.E. Bergstrom, J. Org. Chem., 43, 2870, 1978 og D.E. Bergstrom og M.K. Ogawa, J. Am. Chem. Soc., 100, 8106, 1978) og Bigge 20 med flere (C.F. Bigge, P. Kalaritis, J.R. Deck og M.P. Mer-tes, J. Am. Chem. Soc., 102, 2033, 1980) har nyligt anvendt dette reaktionsskema ved syntesen af C-5 substitueret pyri= midinnucleotidforbindeIser.

Tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.618.511 beskriver en frem-25 gangsmåde til bestemmelse af en ligand i et flydende medium samt midler til gennemførelse af fremgangsmåden. De i offentliggørelsesskriftet beskrevne ligander afviger imidlertid i strukturel henseende væsentligt fra de modificerede nucleoti-der, som er genstand for den foreliggende opfindelse, og som 30 kan fremstilles og påvises ifølge den foreliggende opfindelse.

Endelig er det kendt, at antistoffer, der er specifikke for modificerede nucleotider, kan fremstilles og anvendes til iso- DK 171822 B1 5 lering og karakterisering af specifikke bestanddele af de modificerede nucleotider. (T.W. Munns og M.K. Liszewski, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 24, 109, 1980). Ingen af de hidtil fremstillede antistoffer mod 5 naturligt forekommende nucleotider har dog vist sig at reagere med deres nuc1eotiddeterminant, når den eksisterer i et dobbeltstrenget RNA eller DNA dobbeltspiral eller når den er i DNA-RNA hybridmolekyler.

10 For at omgå begrænsningerne ved radioaktivt mærkede sonder eller tidligere anvendte kemiske og biologiske sonder, er der blevet syntetiseret en række hidtil ukendte nucleotidderiva-ter, som indeholder biotin, iminobiotin, lipoinsyre og andre determinanter bundet kovalent til pyrimidin eller purinringen. 15 Disse nucleotidderivater samt polynucleotider og coenzymer, som indeholder dem, vil reagere specifikt og unikt med proteiner, såsom avidin eller antistoffer. Reaktionen mellem modificerende nucleotider og specifikke proteiner kan udnyttes som et alternativ til radioisotoper til påvisning og lokalisering 20 af nuc1einsyrekomponenter i mange af de for tiden anvendte fremgangsmåder inden for biomedicinsk og rekombinant-DNA-tek-nologien. Fremgangsmåder, der anvender disse reaktioner mellem modificeret nucleotid og protein har påvisningskapaciteter, der er lig med eller større end fremgangsmåder, der udnytter 25 radio isotoper, og de kan ofte udføres hurtigere og med større opløsni ngskraft.

Disse hidtil ukendte nucleotidderivater kan fremstilles forholdsvis billigt ved kemiske fremgangsmåder, der er blevet 30 udviklet og standardiseret som diskuteret nærmere i det føl gende. Hvad der er mere betydningsfuldt er, at da hverken nu-cleotidsonderne ifølge opfindelsen eller proteinreagenserne, der anvendes sammen med dem, er radioaktive, kan forbindelserne fremstilles, anvendes og kasseres, uden de detaljerede s i k -35 kerhedsforanstaltninger, der kræves til arbejde med radioiso toper. Disse nucleotidderivater er endvidere kemisk stabile og kan forventes at have funktionelle levetider på flere år eller 6 DK 171822 B1 mere. Endelig muliggør disse forbindelser udvikling af sikrere, mere økonomiske, hurtigere og mere reproducerbare forskningsmetoder og diagnostiske metoder.

5 De modificerede nucleotider ifølge opfindelsen er omfattende anvendelige som sonder i biomedicinsk forskning og rekombinant DNA teknologi.

Særligt nyttige er forbindelser omfattet af den viste 10 struktur, som yderligere har en eller flere af følgende egenskaber: A er ikke-aromatisk, A er mindst C^, den kemiske binding, som forbinder B og A indbefatter en a-ole= finisk binding, A er biotin eller iminobiotin og B er en pyrimidin eller 7-deazapurin.

15

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede modificerede nucleotider, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter trinene 20 (a) omsætning af en forbindelse med strukturen: X-CH- . 0 25 \<Z* s?

Η H

OH 2 30 med et merkurisalt i et egnet opløsningsmiddel under passende betingelser til dannelse af en merkureret forbindelse med strukturen: 35 7 DK 171822 B1 B-Hg+

H

hH h OH 2 (b) omsætning af den merkurerede forbindelse med en kemisk molekyldel, som er reaktionsdygtig med -Hg -delen i den merkurerede forbindelse og repræsenteret ved formlen ...N, hvilken reaktion udføres i et vandigt opløsningsmiddel og i nærværelse af I^PdCl^ under passende betingelser til dannelse af en forbindelse med strukturen:

B · * *N

B>

Η H

OH Z

hvor N er en reaktionsdygtig endestillet funktionel gruppe 10 eller A, og (c) udvinding af forbindelsen som det nævnte modificerede nucleotide når N er A, eller når N er en reaktionsdygtig endestillet gruppe, omsætning af forbindelsen med en forbindelse, der har strukturen M-A, hvori M er en funktionel 15 gruppe, der er reaktionsdygtig med N i et vandigt opløsningsmiddel under passende betingelser til dannelse af det modificerede nucleotid, som derpå udvindes.

Nucleotider, der er modificeret i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes som sonder i bio-20 medicinsk forskning, klinisk diagnose og rekombinant DNA-tek-nologi, når de er inkorporeret i en dobbeltstrenget ribonu-cleinsyre, en desoxyribonucleinsyredobbeltspiral eller et DNA-RNA hybrid. Disse forskellige anvendelser er baseret på molekylernes evne til at danne stabile komplekser med poly- 8 DK 171822 B1 peptider, som igen kan påvises, enten ved hj*lp af iboende egenskaber i polypeptidet eller ved hjælp af påviselige molekyldele, som er bundet til eller som reagerer med polypeptidet .

5

Flere væsentlige kriterier må tilfredsstilles for, at et modificeret nucleotid kan være generelt egnet som erstatning for en radioaktivt mærket form af et naturligt forekommende nucleotid. For det første skal den modificerede 10 forbindelse indeholde en substituent eller sonde, som er unik, dvs., som normalt ikke findes forbundet med nucleo= tider eller polynucleotider. For det andet skal sonden reagere specifikt med kemiske eller biologiske reagenser til skabelse af et følsomt påvisningssystem. For det tredje 15 skal de analoge være forholdsvis effektive substrater for almindeligt undersøgte nucleinsyreenzymer, da talrige praktiske anvendelser kræver, at den analoge metaboliseres enzymatisk, f.eks. skal de analoge fungere som substrater for nucleinsyrepolymeraser. Til dette formål må sondemole-20 kyldele ikke anbringes på ringstillinger som sterisk eller på anden måde generer det normale Watson-Crick hydrogen-bindingspotientiale af baserne. Ellers vil substituenterne give forbindelser, der er inaktive som polymerasesubstrater. Substitution i ringstillinger, som ændrer den normale "anti"-25 nucleosidkonformation, skal også undgås, da sådanne konfor- mationsmæssige ændringer i reglen gør nucleotidderivaterne uacceptable som polymerasesubstrater. Normalt begrænser disse betragtninger substitutionsstillinger til 5-stilling-en i en pyrimidin og 7-stillingen i en purin eller en 7-30 deazapurin.

For det fjerde skal påvisningssystemet være i stand til at reagere med sondesubstituenter inkorporeret i både enkeltstrengede og dobbeltstrengede polynucleotider for at være 35 forenelig med nucleinsyrehybridiseringsmetodik. For at til fredsstille dette kriterium foretrækkes det, at sondemole-kyldelen er bundet til purinen eller pyrimidinen gennem en DK 171822 B1 9 kemisk binding eller "bindingsarm", således at den let kan reagere med antistoffer/ andre detektorproteiner eller kemiske reagenser.

5 For det femte må de fysiske og biokemiske egenskaber af polynucleotider indeholdende et lille antal sondesubstitu-enter ikke ændres væsentligt, således at eksisterende fremgangsmåder under anvendelse af radioaktive hybridiserings-sonder ikke behøver at ændres i omfattende grad. Dette kri-10 terium skal tilfredsstilles, hvadenten sonden indføres ved enzymatiske eller direkte kemiske midler.

Endelig skal bindingen, som binder sondemolekyldelen kunne tåle alle forsøgsbetingelser som normale nucleotider og 15 polynucleotider rutinemæssigt udsættes for, f.eks. længere hybridiseringstider ved forhøjede temperaturer, phenol og ekstraktion med organisk opløsningsmiddel, elektroforese osv. .

20 Alle disse kriterier tilfredsstilles af de modificerede nucleotider, som er beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

De omhandlede modificerede nucleotider er meget nyttige som sonder ved biomedicinsk forskning og rekombinant DNA teknolo-25 gi.

Selv om i princippet alle forbindelser omfattet af denne strukturformel kan fremstilles og anvendes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, kan visse af for-30 bindeiserne lettere fremstilles eller anvendes eller begge dele og foretrækkes derfor for tiden.

Selv om således puriner, pyrimidiner og 7-deazapuriner er principielt nyttige, foretrækkes pyrimidiner og 7-deazapu= 35 riner, idet purinsubstitution i 8-stillingen er tilbøjelig 10 DK 171822 B1 til at gøre nucleotiderne ineffektive som polymerasesub-strater. Selv om modificerede puriner således er nyttige i visse henseender, er de ikke generelt så nyttige som py= rimidiner og 7-deazapuriner. Endvidere må pyrimidiner og 5 7-deazapuriner, der er nyttige ifølge opfindelsen, ikke være naturligt substituerede i henholdsvis 5- eller 7-stillingerne. Som følge heraf er visse baser såsom thymin, 5-methylcyto= sin og 5-hydroxymethylcytosin ikke nyttige. De i øjeblikket foretrukne baser er cytosin, uracil, deazaadenin og deaza= 10 guanin.

A kan være enhver molekyldel, som har mindst 3 carbonatomer, og er i stand til at danne et påviseligt kompleks med et polypeptid, når det modificerede nucleotid er inkorporeret 15 i en dobbeltstrenget dobbeltspiral indeholdende enten des- oxyribonucleinsyre eller ribonucleinsyre.

A kan derfor være enhver ligand, som har disse egenskaber, herunder haptener, som kun er immunogene, når de er bundet 20 til en egnet bærer, men er i stand til at reagere med pas sende antistoffer til fremstilling af komplekser. Eksempler på molekyldele, der er nyttige, indbefatter: 25 -?-«*,> . -c-,ch2,4_^\ .

O NH

30 — "“^^3 ' -S-CH2-NM^~3~ N02 ' 35 N02 11 DK 171822 B1 s/S '"l

-C-CH„-CH«C-0-, P

fl ^ Λ ft 0 O -C-(CH2)4-1- og 5 5 0

II

io 0H o

Af disse er de foretrukne A molekyldele biotin og imino= biotin.

15 Da aromatiske molekyldele er tilbøjelige til at indføjes 1 en baseparret spiralstruktur, foretrækkes det endvidere, at molekyldelen A er ikke-aromatisk. Da endvidere mindre molekyldele muligvis ikke kan tillade tilstrækkelig mole-kulær reaktion med polypeptider, foretrækkes det, at A er 20 mindst C^, således at der kan ske tilstrækkelig reaktion til at muliggøre dannelse af stabile komplekser. Biotin og iminobiotin tilfredsstiller begge disse kriterier.

Bindingen eller gruppen, som forbinder molekyldelen A til 25 basen B, kan indbefatte enhver af de velkendte bindinger, herunder carbon-carbon-enkeltbindinger, carbon-carbon-dobbeltbindinger, carbon-nitrogen-enkeltbindinger eller carbon-oxygen-enkeltbindinger. Det foretrækkes dog i almindelighed, at den kemiske binding indbefatter en olefi= 30 nisk binding i α-stillingen i forhold til B. Tilstedeværel se af en sådan α-olefinisk binding tjener til at holde mo-lekyIdelens A væk fra basen, når basen parres med en anden i den velkendte konfiguration af en dobbeltspiral. Dette gør det muligt, at reaktion med polypeptid lettere kan ske 35 og letter derved kompleksdannelse. Endvidere er det muligt, at enkeltbindinger med større rotationsfrihed ikke altid kan holde molekyldelen tilstrækkelig på afstand af dobbelt- DK 171822 B1 12 spiralen til at muliggøre genkendelse af og kompleksdannelse med polypeptid.

Det foretrækkes endnu mere, at den kemiske bindingsgruppe 5 er afledt af en primær amin og har strukturen -CH2~NH-, da sådanne bindinger let dannes under anvendelse af enhver af de velkendte reaktioner til modifikation af amin. Eksempler på foretrukne bindinger afledt af allylamin og allyl-(3-amino-2-hydroxy-l-propyl)ethergrupper har formlerne hen-10 holdsvis -CH=CH-CH2-NH- og -CH=CH-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH- ,

OH

Selv om disse bindinger foretrækkes, kan andre anvendes, herunder især olefinbindingsarme med andre modificerbare funktionaliteter såsom thiol, carboxylsyre og epoxidfunk- 15 tionaliteter.

Bindingsgrupperne er bundet i specielle stillinger, nemlig 5-stiliingen i en pyrimidin og 7-stillingen i en deazapjurin. Scm nævnt tidligere giver 7-stillingen i en deazapurin. Som nævnt tidligere giver 20 substitution i 8-stillingen i en purin ikke et modificeret nucleotid, som er nyttigt til alle de heri omtalte metoder. Det kan være, at 7-stillingen i en purin, der er optaget af et nitrogenatom, kunne være bindingspunktet. De kemiske substitutionsmetoder, der er anvendt til dato og diskuteret 25 i den foreliggende beskrivelse, er imidlertid ikke egnede til dette formål.

x repræsenterer 30 0 0 0 ooo

I II II >1 II II

H0-P-0-, H0-P-0-P-0- eller H0-P-0-P-0-P-0-,

I II III

OH OH OH OH OH OH

og z er H- eller H0-.

35 DK 171822 B1 13

Eksempler på sådanne nucleotider indbefatter s’-ribo- nucleosidmonophosphater, 5 *-ribonucleosiddiphosphater, 5’- ribonucleosidtriphosphater,5'-desoxyribonucleosidmonophospha-ter, 5'-desoxyribonucleosiddiphosphater og 5'-desoxyribo-5 nucleosidtriphosphater. Mere specielle eksempler indbefatter modificerede nucleotider af denne type, hvori A er biotin eller iminobiotin, den kemiske binding er -CH=CH-CH2-NH- eller -CH=CH-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH-,

OH

og B er uracil eller cytosin.

10 Den generelle syntesevej, der benyttes til at indføre bindingsarmen og sondemolekyldelen på basen, er diskuteret ovenfor. (Se især J.L. Ruth og D.E. Bergstrom, J. Org. Chem., 43, 2870, 1978, D.E. Bergstrom og M.K. Ogawa, J. Amer. Chem.

Soc. 100, 8106, 1978 og C.F. Bigge, P. Kalaritis, J.R. Deck 15 og M.P. Mertes, J. Amer. Chem. Soc. 102, 2033, 1980). De heri anvendte olefinsubstituenter har dog ikke tidligere været brugt. For at lette binding af sondemolekyldelen A har det vist sig særligt ønskeligt at anvende definer med primære aminfunktionelle grupper, såsom allylamin [AA] el-20 ler allyl-(3-amino-2-hydroxy-l-propyl) ether [NAGE], som muliggør fastgørelse af sonden ved standardreaktioner til aminmodifikation, såsom DK 171822 B1 14 + + NH2 nh2 -CH2NH2 + R-C-OR —> -CH2NHCR Imidat

O

" O

R-Cx m

O -> -CH2NHCR

-CH-NH0 + R-C^

O

Anhydrid

O

J\ O o -ch2nh2 ♦ -ch2nh™ o NHS-ester (N-hydroxysuccinimid)

S

-CH2NH2 + R-N=C=S—> -CH2NHCNHR Isothiocyanat

A _ ?H

-CH2NH2 + L-i-R —> -CH2NHCH2CHR

Epoxid På grund af den lette fremstilling har det vist sig fordelagtigt at anvende NHS-estere til tilføjelse af sonden. Olefinbindingsarme med andre modificerbare funktionelle 5 grupper, såsom thioler, carboxylsyrer, epoxider og lignende, kan dog også anvendes. Endvidere kan både bindingsarm og sonde tilføjes i et enkelt trin, hvis det findes ønskeligt .

Fremgangsmåden til fremstilling af de omhandlede modificerede nucleotider er ejendommelig ved, at den omfatter trinnene DK 171822 B1 15 (a) omsætning af en forbindelse med strukturen:

B

X-CH, ° <M H j>|

H 1 f H

OH 2 5 med et merkurisalt i et egnet opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af en merkureret forbindelse med strukturen: B-Hg+ x-CH2 0

Hl 1 H

OH 2 (b) omsætning af den merkurerede forbindelse med en kemisk 10 molekyldel, som er reaktionsdygtig med -Hg+-delen af den merkurerede forbindelse og repræsenteret ved formlen ...N, hvilken reaktion udføres i et vandigt opløsningsmiddel og i nærværelse af I^PdCl^ under egnede betingelser til dannelse af en forbindelse med strukturen:

B· · -N

15 X-CH-, h> ηΊ-I h OH z hvor N er en reaktionsdygtig endestillet funktionel gruppe eller er A, og (c) udvinding af forbindelsen som det modificerede nucleo= tid, når N er A, eller når N er en reaktionsdygtig endestil- 20 let gruppe, omsætning af denne forbindelse med en forbindelse, der har strukturen M-A, hvori M er en funktionel gruppe, som DK 171822 B1 16 er reaktionsdygtig med N i et vandigt opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af det modificerede nucleo= tid, som derpå udvindes.

5

Det følgende skema illustrerer dette: /

O

A HgX Relativ HN i] koncentration

10 i I

0^» ^ 1 0 9 ‘ K-PdCl. 1 2 4

Allylamin >10 R.T.

15 18-24 timer ^ acetatstødpude,pH 4-5 o ch2

JL PdCl- · CH

20 j li CH2NH2 ♦ ^ Ustabil

O

XJ i 9 9

' O

Biotin- η 30 NHS ester

s/ JU

x · H° Π τ-γνν- (ch2> λ s > 35 ^ " 9 0 DK 171822 B1 17

Selv om reaktionerne kan udføres ved hydrogenionkoncentra-tioner så lave som pH 1 eller så høje som pH 14, foretræk-5 kes det at arbejde i intervallet fra ca. 4 til 8. Dette gælder især, når man har at gøre med ustabile forbindelser, såsom nucleosidpolyphosphater, polynucleotider og nucleo= tidcoenzymer, som hydrolyseres ved pH-værdier uden for dette interval. Ligeledes foretrækkes det at arbejde ved en 10 temperatur i intervallet fra ca. 20 til 30°C for at undgå

mulig dekomponering af labile organiske substrater. Reaktionerne kan dog udføres ved temperaturer fra ca. 5 til 100°C. Som sædvanligt med kemiske reaktioner fremmer højere temperaturer reaktionshastigheden, og lavere temperatu-15 rer gør den langsommere. I temperaturintervallet fra 5°C

til 100°C kan den optimale reaktionstid således variere fra ca. 10 minutter til 98 timer. I det foretrukne temperaturinterval varierer reaktionstiderne normalt fra ca. 3 til 24 timer.

20

Den foretrukne fremgangsmåde til at holde pH-værdien i det ønskede interval er ved anvendelse af stødpuder. Mange forskellige stødpuder kan anvendes. Disse indbefatter f.eks. natrium- eller kaliumacetat, natrium- eller kaliumcitrat, 25 kaliumcitrat-phosphat, tris-acetat og borat-natriumhydroxid= stødpuder. Koncentrationen af stødpude, når en sådan anvendes, kan variere inden for et bredt interval, op til ca. 2,0 molær.

30 En særlig fordel ved merkurerings- og palladiumkatalyserede additionsreaktioner er, at de kan udføres i vand, men små mængder af et organisk opløsningsmiddel kan inkluderes som opløselighedshjælpemiddel. De organiske opløsningsmidler, som i reglen vælges, er de, der er blandbare med vand. De 35 kan vælges blandt ethere, alkoholer, estere, ketoner, ami= der og lignende, såsom methanol, ethanol, propanol, glyce® rin, dioxan, acetone, pyridin og dimethylformamid. Da det DK 171822 B1 18 er blevet iagttaget at tilstedeværelse af alkoholer, såsom methanol, ofte resulterer i alkoxyaddition over olefindob-beltbindingen, må et eventuelt organisk opløsningsmiddel 5 anvendt som opløsningshjælpemiddel vælges omhyggeligt. Ind føring af alkoxysubstituenter på a- eller β-exocykliske carbonatomer resulterer ofte i produktion af forbindelser, der udnyttes meget mindre effektivt som enzymsubstrater.

10 Selv om forskellige merkurisalte kan anvendes, er det for tiden foretrukne salt merkuriacetat. Som tidligere vist kan forbindelserne også fremstilles ved først at tilføje en bindingsarm og derefter molekyldelen A eller ved at tilføje en bindingsarm, hvortil A allerede er bundet. Den ke-15 miske molekyldel repræsenteret ved formlen ··*N kan være enhver af de talrige enheder, som til slut resulterer i produktion af de ønskede forbindelser.

Eksempler indbefatter -CH=CH-CH2-NH2, 20 -CH=CH-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH2, -CH=CH-CH2-NH-biotin, og

OH

-CH=CH2-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH-iminobiotin.

OH

2 5

De mængder af reaktionsdeltagerne, som anvendes til disse reaktioner, kan variere meget. I almindelighed vil mængderne af ikke-merkureret forbindelse, merkureret forbindelse og palladiumholdig forbindelse dog være i hovedsagen støkiometriske, hvorimod merkurisaltet og forbindelsen ··*N vil være til stede i molært overskud, f.eks. 5-20 mol ·*·Ν eller merkurisalt pr. mol merkureret forbindelse henholdsvis umerkureret forbindelse. I praksis vil mængderne variere med variationer i reaktionsbetingelserne og den nøjagtige identitet af reaktionsdeltagerne.

At have biotinsonden direkte bundet til nucleotidderivater, som er i stand til at fungere som enzymsubstrater, giver 35 DK 171822 Bl 19 betydelig alsidighed, både ved forsøgsmetoder, der kan udføres, og ved påvisningsmetoder (mikroskopiske og ikke-mikroskopiske), der kan anvendes til analyse. F.eks. kan 5 biotinnucleotider indføres i polynucleotider, som er ved at blive syntetiseret af celler eller rå celleekstrakter og derved gør det muligt at påvise og/eller isolere poly= nucleotidkæder, der er under skabelse (vækst). En sådan fremgangsmåde er det umuligt at udføre ved nogen direkte 10 kemisk modifikationsmetode. Endvidere kan enzymer anvendes som reagenser til indføring af sonder, såsom biotin, på højt selektive eller stedsspecifikke steder i polynucleo= tider. Den kemiske syntese af lignende sondemodificerede produkter ville i bedste fald være yderst vanskelig at op-15 nå.

Syntesen af nucleotider indeholdende biotin eller imino= biotin blev opnået som beskrevet i detaljer i de følgende eksempler. Pyrimidinnucleosidtriphosphater indeholdende 20 enhver af disse sonder bundet til C-5 carbonatomet var gode til udmærkede substrater for mange forskellige rensede nucleinsyrepolymeraser af både prokaryotisk og eukaryotisk oprindelse. Disse indbefatter DNA polymerase I af E. coli, bacteriophag T4 DNA polymerase, DNA polymeraser α og 3 fra 25 murin (A—9) og humane (HeLa) celler og DNA polymerase af

Herpes simplex virus. Bekræftende data blev opnået med E. coli DNA polymerase I under anvendelse af enten hak-trans= lationsbetingelsen ifølge Rigby m.fl. (P.W.J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes og P. Berg, J. Mol. Biol. 113, 237, 30 1977) eller den mellemrumsfyldende reaktion, der er be skrevet af Bourguignon m.fl. (G.J. Bourguignon, P.J. Tat-tersall og D.C. Ward, J. Virol. 20, 290, 1976). Bio-dUTP har også vist sig at fungere som et polymerasesubstrat, både i CHO-celler, permeabiliseret ved behandling med lyso= 35 lecithin ifølge fremgangsmåden ifølge Miller m.fl. (M.R.

Miller, J.C. Castellot, Jr. og A.B. Pardee, Exp. Cell Res. 120, 421, 1979) og i et kernereplikationssystem fremstillet DK 171822 B1 20 af Herpes simplex-inficerede BHK-celler. Selv om biotinyl= ribonucleosidtriphosphater viste sig at fungere som substrater for RNA polymeraserne fra E. coli og bacteriophag T7, 5 udnyttes de ikke så effektivt som de tilsvarende desoxyri= bonucleotidtriphosphater. De inkorporeres faktisk dårligt eller slet ikke af de undersøgte eukaryotiske RNA polymera= ser (HeLa-celle RNA polymerase III, kalvethymus RNA poly= merase II og musecelle RNA polymerase II). Dette begrænsede 10 interval af substratfunktion begrænser anvendeligheden i nogle in vivo eller in vitro transskriptionsundersøgelser, men biotinmærkede RNA sonder kan fremstilles enzymatisk af DNA skabeloner under anvendelse af E. coli eller T7 RNA polymeraser eller ved 3’ endemærkningsmetoder under anvend-15 else af af RNA ligase med forbindelser, såsom biotinyl-pCp.

AA- og NAGE-derivaterne af UTP er dog substrater for de ovennævnte eukaryotiske RNA polymeraser. Med tilgængeligheden af antistoffer til disse analoge skulle isolering af transskripter under skabelse være mulig ved immunologiske 20 eller affinitetsmetoder.

Den enzymatiske polymerisation af nucleotider indeholdende biotin eller iminobiotinsubstituenter blev ikke overvåget direkte, da ingen af disse sonder var radiomærket. To ræk-25 ker eksperimentelt bevis viser dog klart, at biotinylnucleo= tiderne blev inkorporeret. Den første er, at polynucleotider syntetiseret i nærværelse af biotinnucleotider selektivt tilbageholdes, når de kromatograferes over avidin eller streptavidinaffinitetssøjler. (Tabel I og II). Medens f.eks. 30 normal DNA, hak-translateret med P-dAMP elueres kvanti tativt ved tilsætning af 0,5 M NaCl, forbliver langt størstedelen af biotinyl-DNA eller iminobiotinyl-DNA bundet til harpiksen, selv efter omfattende vask med højt indhold af salt, urinstof, guanidin-HCl, formamid eller 50 mM NaOH. 35 Den lille brøkdel af radiomærket, som elueres ved disse vaskebetingelser, tilbageholdes ikke, når den påføres på harpiksen en anden gang, hvilket antyder, at radioaktivi- DK 171822 B1 21 teten er forbundet med DNA-fragmenter, der er fri for bio= tinsubstitution. Den anden bevisrække er, at kun biotinmærkede polynucleotider immunoudfældes, når de behandles 5 med renset anti-biotin IgG efterfulgt af formalinfikseret

Staphylococcus aureus (tabel III). Det er klart af dataene i disse tabeller, at yderst små mængder biotin kan påvises på denne måde. Disse resultater viser også, at biotinmolekylet kan genkendes af avidin, streptavidin eller specifik-10 ke antistoffer, medens DNA stadig er i sin naturlige dob beltstrengede form, en betingelse, som er absolut væsentlig, hvis antistofbinding eller avidinaffinitetsmetoderne skal være nyttige til påvisning af sonde under anvendelse af hybridiseringsteknik.

15

Tabel I.

Selektiv tilbageholdelse af biotiniseret DNA på avidin-sepharose % DNA tilbageholdt på harpiks

Eluent Bio-DNA (1%) T-DNA

20 c

Ladet med - 3 x 10 cpm 10 mM tris 7,5 100 100% + 0,2 M NaCl (1) 0,5 M NaCl 100 0,1 (2) 1,0 M NaCl 99,7 <0,01

2 O

(3) 8 M urinstof 100 <0,01 (4) 6 M guanidin-HCl 95,2 <0,01 (5) 99% formamid 94,7 <0,01 (6) 2 mM biotin 97,6 <0,01 30 (7) 50 mM NaOH 89,5 <0,01 35 DK 171822 B1 22

Tabel II.

Affinitetskromatografi af iminobiotin-dUTP og iminobiotini= 5 seret DNA på streptavidin-sepharose

% tilbageholdt på SA-sepharose Eluent T-DNA ^i-IB-dUTP IB-DNA

Ladet med - 10 mM tris-HCl,8,3 10 50 mM NaCl 8,7 100 99,7 (1) 0,1 M NaCl <0,1 100 99,7 (2) 1,0 M NaCl <0,01 100 99,4 (3) 8 M urinstof <0,01 97,5 98,5 (4) 6 M guanidin-HCl <0,01 97,0 97,0 15 (5) 50 mM NH4-acetat, pH 4,0 <0,01 <0,01 96,5 (6) 50 mM,NH4~acetat, pH 4,0 <0,01 <0,01 <0,01 2 mM biotin 20

Tabel III.

Selektiv immunofældning af Bio-DNA

med anti-biotin IgG og Staphylococcus aureus.

DNA* Antistof CPM i CPM i immuno ppt. supernatant 25 T-DNA - 70 4867 T-DNA anti-bio IgG 87 5197 T-DNA ikke immun IgG 55 5107

Bio-DNA - 53 3886

Bio-DNA anti-bio IgG 3347 736

Bio-DNA ikke immun IgG 60 3900

O O

*N.T. pBR-322 DNA, p-mærket; 1% biotinsubstitution. Specifik aktivitet, 2 x 107 cpm/yg

Biotinpåvisning 0,001-0,01 pmol.

35 DK 171822 B1 23

De modificerede nucleotider ifølge opfindelsen kan påvises ved at bringe forbindelserne i kontakt med polypeptider, som er i stand til at danne komplekser dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekserne, forudsat at polypeptiderne inde-5 holder en eller flere molekyldele, som kan påvises, når komplekset eller komplekserne dannes, i almindelighed ved hjælp af sædvanlig påvisningsteknik.

En polypeptiddetektor til sonden af biotinyltypen er avidin. 10 Av idin-bi ot in-reaktionen udviser en af de fasteste ikke-kova-lente bindingskonstanter (K(j-js = 10“15) , der er set i naturen. Hvis avidin kobles til potentielt påviselige indikatormolekyler, f.eks. fluorescerende farvestoffer (f1uoroscein, rhoda-min), elektrontætte reagenser (ferritin, hæmocyanin, kollo-15 dialt guld) eller enzymer, som er i stand til at aflejre uopløselige reaktionsprodukter (peroxidase, alkalisk phosphatase), kan tilstedeværelsen, beliggenheden og/eller mængden af biotinsonden konstateres.

20 Avidin har uheldigvis en egenskab, som gør det mindre ønskeligt som bi ot inindikatorprotein, når det anvendes sammen med nucleinsyrer eller kromatinmateriale. Det er blevet oplyst (M.H. Heggeness, Stain Techno!., 52, 165, 1977; Μ.H. Heggeness og J.F. Ash, J. Cell. Biol., 73, 783, 1977; E.A. Bayer og M.

25 Wilchek, Methods of Biochemical Analysis 26, 1, 1980), at avidin binder sig fast til kondenseret kromat in eller til sub-cellulære fraktioner, der indeholder store mængder nucleinsyre på en måde, som er uafhængig af dets biotinbindingsegenskab. Da avidin er et basisk glycoprotein med en pi på 10,5, er dens 30 histonagtige karakter eller dens kulhydratmolekyler sandsynligvis ansvarlige for disse iagttagne ikke-specifikke reaktioner .

En foretrukken sonde til biotinholdige nucleotider og deri-35 vater er streptavidin, som er et av idi η 1 ignende protein synte- DK 171822 B1 24 tiseret af jordbundsorganismen Streptomyces avidinii. Dets fremstilling og rensning er beskrevet af Hoffmann m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4666 (1980). Streptavidin har et meget lavere pi (5,0), er ikke-glycosyleret og udviser meget lavere 5 uspecifik binding til ONA end avidin og frembyder derfor po tentielle fordele til anvendelser, der indebærer metodik til påvisning af nucleinsyre.

Et meget foretrukket protein til bi oti η 1 i g nende sondepåvisning 10 er monospecifik kanin IgG, antibiotin immunoglobulin. Denne forbindelse blev fremstillet ved at immunisere kaniner med okseserumalbumin konjugeret biotin som tidligere beskrevet (M. Berger, Methods in Enzymology, 62, 319 (1979)) og renset ved affinitetskromatografi. Selv om associationskonstanten af 15 immunoglobulin-haptener har værdier af Kassn (106 til 1010), der er betydeligt lavere end for av idin-bi otin-komp1ekser, er de i hovedsagen ækvivalente med de, der er iagttaget med avidin-iminobiotin-komplekset. Anti-biotinantistofferne har endvidere vist sig yderst nyttige til påvisning af specifikke 20 polynucleotidsekvenser på kromosomer ved in situ hybrid i se ring, da der sker ringe eller ingen uspecifik binding af antistoffet til kromat i nmater i a 1e.

Selvom en enkelttrins ”anti stofsandwich"-metode kan være vel-25 lykket, kan denne fremgangsmåde muligvis ikke udvikle til strækkelig fluorescens til utvetydig påvisning af modificerede nucleotider. Et meget stærkere f 1 uorometri sk signal kan derimod opnås ved at anvende den af Lamm. m.fl. ( 1972 ), Wofsy, m.fl., ( 1974 ) beskrevne " hapten-anti stof sandwichteknik”. Ved 30 denne fremgangsmåde bliver det primære antistof i det foreliggende tilfælde monospecifikt kanin anti-biotin IgG, kemisk modificeret med et hapteniseringsreagens, såsom 2,4-dinitro-fluorbenzen, fortrinsvis medens immunog1 obu 1 i net er bundet til en antigenaffinitetssøjle (biotin-sepharose TM). Så mange som 35 DK 171822 B1 25 15-20 hapten (DNP) grupper kan kobles til det primære antistof uden at nedsætte dets antigenbindende affinitet eller specificitet (Wallace og Wofsy, 1979). Hvis den primære antistofbehandling af forsøgsprøven efterfølges af en inkubation med et 5 fluorescerende mærket anti-hapten IgG-antistof i stedet for et fluorescerende mærket anti-IgG, kan der opnås en 5-7 dobbelt forøgelse i fluorescenssignal. Da man også har tilgængeligt monospecifikt marsvineanti-DNP IgG, kan man også hapten i sere dette sekundære antistof med biotin og derved udvikle to anti-10 hapten IgG populationer, DNP-mærket anti-biotin IgG og biotinmærket anti-DNP IgG. Hvis disse kan anvendes skiftevis til at opnå flere omgange hapten-anti stofsandwichdanne1 se og så følges af fluorescerende mærket protein A fra Staphylococcus aureus, som binder specifikt til IgG molekyler fra mange pat-15 tedyrarter, kunne det resultere i en enorm forstærkelse af det primære anti stofs igna1 med deraf følgende anvendelighed.

Proteinet streptavidin fra Streptomyces avidini er et potentielt alternativ til anti-biotin IgG som en bærer til spec i-20 fikt at rette et koblet visualiseringssystem [f.eks. fluorescerende sonder (ovenfor) eller histokemiske reagenser (nedenfor)] mod stedet for det hybridi serede bi ot inho1dige polynu-cleotid. En af streptavidins fordele frem for anti-biotin IgG er, at dets affinitet til biotin er Kassn = 1015, hvorimod 25 associationskonstanterne for hapten-IgG reaktioner er 10 7 til 1010. Den store reaktionshastighed og ekstreme affinitet betyder, at den tid, der kræves til at lokalisere den biotinise-rede sonde, vil være minutter med streptavidin til forskel fra timer med immunologiske reagenser.

30

Indledende bedømmelser af et streptavidinpåvisningssystem er i gang for tiden. Polytenkromosomer hybridiseret med biotinise-rede DNA-sonder vil blive inkuberet med streptavidin efterfulgt af en inkubation med okseserumalbumin, som er blevet 35 dobbelt mærket med biotin og FITC (FITC, biotinyl-BSA). Da DK 171822 B1 26 sandsynligvis kun en af de fire streptavidinunderenheder vil indgå i binding ved hvert biotiniseret DNA-sted, kan et mærket BSA molekyle potentielt binde til hver af de resterende tre ikke-konjugerede underenheder af komplekset af streptavidin og 5 biotinylnucleotid. Fluorescenssignalet fra dette enkelte streptavidin + FITC, bi ot i ny1-BSA-1 ag vil blive sammenlignet med en kontrol under anvendelse af den tidligere beskrevne grundlæggende "anti-stofsandwichmetode".

10 Hvis "anti stofsandwich” og streptavidin + FITC, biot i ny 1-BSA-påvisningsintensiteterne er sammeniignelige kan man forsøge at forstærke streptavidin + FITC, biotinyl-BSA-systemet til en-keltkopi-kopieringsfølsomhed på en måde, som er parallel med den multiple "hapten-antistofsandwich"-metode. Da nogle bio-15 tingrupper på BSA ikke vil bindes til det første lag strep tavidin, kan der tilføjes et andet lag streptavidin, indtil der opnås tilstrækkeligt signal. Hvis f.eks. i det andet lag kun to streptavidinprotomere binder til hvert første lag BSA og hver af disse streptavidinprotomere binder tre FITC-bioti-20 nyl BSA-molekyler, så vil intensiteten af det andet lag være dobbelt så stor som den af det første lag. For det tredje lag vil med analoge bindingsstøkiometrier den fluorescerende intensitet være 12 gange intensiteten af det første lag, således at den totale intensitet hurtigt vil vokse med successivt ti 1 — 25 føjede lag.

Der er planer om at anvende et større bærerprotein, såsom thyroglobulin i stedet for BSA for at maksimere mængder af bundet fluorescens og biotinsonder. Det kan også være nødven-30 digt at anvende en større bindingsarm mellem biotinsonden og bærerproteinet. En længere bindingsarm skulle sterisk optimere den teoretiske afgivelse af et biotiniseret fluorescerende bærermolekyle til hver ikke-konjugeret streptavidinunderenhed og maksimere antallet af streptavidinprotomere i det følgende 35 lag, som vil binde til den bi ot i ni serede fluorescerende bærer. Som før vil der blive udført en passende kontrol for at sikre, at substitution af bærerproteinet med fluorescerende sonder og DK 171822 B1 27 biotin ikke giver anledning til opløsel i ghedsproblemer og/el-ler uspecifikke bindingsproblemer.

Afgivelsessystemet streptavidin-bærerprotein har to væsentlige 5 fordele frem for den immunof1uorescerende metode foruden hastigheden i afgivelsen. For det første kræves kun to proteinkomponenter til at danne lagene. For det andet behøver kun ét bærerprotein at blive modificeret, og det er ikke nødvendigt at opretholde funktionel eller endog total strukturel integri-10 tet, når blot biotingrupperne er tilgængelige for streptavi-d i n.

Påvisning og/eller billeddannelse af meget lave niveauer af fluorescerende lys er muligt under anvendelse af i øjeblikket 15 tilgængelige bi 1 ledforstærkere eller systemer sammensat af lasere og fotomultiplikatorer. Disse metoder muliggør påvisning af lys ned til niveauet individuelle fotoner. Med egnede digitalforarbejdningésystemer kan der fremstilles billeder, hvori hvert punkt, dvs. hver pixel, af billedet er strengt 20 proportionalt med antallet af fotoner udsendt af et punkt på genstanden. Under anvendelse af systemer af denne slags eller strømningssystemer, hvori cellerne eller en del af cellerne strømmer forbi en laserstråle, kan man opnå forøgelse af påvisningsfølsomhed for fluorescerende materiale med faktorer 25 mellem 100 og 1000 ud over det, der kan registreres af øjet. Denne forøgelse er tilstrækkelig til at påvise fluorescens af enkeltkopigener.

Et alternativ til fluorescensmetoden til visualisering af 30 hybrid i serede sonder er at rette enzymer, såvel som peroxi dase, alkalisk phosphatase af β-galactosidase mod hybridi-seringsstedet, hvor enzymatisk omdannelse af opløselige substrater til uopløselige farvede bundfald muliggør visualisering med lysmikroskop. Den vigtige fordel ved denne teknik 35 er, at de histokemiske metoder er 10 til 100 gange mere følsomme end fluorescenspåvisning. Desuden bleges de farvede bundfald ikke ved omfattende eksponering i lys, således at man DK 171822 B1 28 undgår én af de generelle ulemper ved fluorescerende lysmikroskopi. Disse enzymer kan kobles til det endelige antistof i stedet for fluorescerende sonder ved "hapten-anti stofsand-wich"-teknikken under anvendelse af bi funktionel le reagenser, 5 såsom g 1 ut ara 1dehyd, eller hvis det drejer sig om peroxidase via oxidation af peroxidase carbohydratmolekyldelene til aldehyder og kobling af disse rester med e-aminogrupper i det ønskede protein. Til metoden med streptavidin-bi ot ini seret bærerprotein kunne et enzym med bi ot i ny 1 grupper koblet dertil 10 erstatte et fluorescerende biotiniseret bærersystem. Alternativt kunne enzymet kobles via biotin til det sidste lag strep-tavidin, idet der opbygges forstærkelse af streptavid i nsteder i foregående lag under anvendelse af biotiniseret BSA eller thyrog1 obu 1 i η . I den nærmeste fremtid vil blive påbegyndt ud-15 vikling af de nødvendige histokemiske reagenser og de egnede kombinationer af substrat og uopløseligt produkt til visualisering af in situ hybridi ser i nger uden baggrundsproblemer. De histokemiske metoder til signal forstærkelse skulle derfor være parat til afprøvning i sommeren 1981.

20 I en foretrukken modifikation er blevet syntetiseret analoge af dUTP og UTP, som indeholder et biotinmolekyle kovalent bundet til C-5-sti11 ingen i pyrimidinringen gennem en allylamin-bindingsarm. Disse bi ot i ny 1-nuc1eoti der er effektive substra-25 ter for mange forskellige DNA og RNA polymeraser in vitro. DNA indeholdende lave grader af biotinsubstitution (50 molekyler eller mindre/ki1 obase) har denatureringsegenskaber, reassocie-ringsegenskaber og hybridi ser ingsegenskaber, som ikke kan skelnes fra egenskaberne af usubsti tueret kontrol DNA.

30 35 DK 171822 B1 29

De følgende eksempler er anført for at illustrere forskellige sider af den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1 og 2.

Syntese af biotinvi - UTP og biotinyl - dUTP. a) Fremstilling af merkurerede nucleotider.

UTP (570 mg, 1,0 mmol) eller dUTP (554 mg, 1,0 mmol) blev opløst i 100 ml 0,1 M natriumacetatstødpude pH 6,0, og der blev tilsat merkuri acetat (1,59 g, 5,0 mmol). Opløsningen blev opvarmet til 50°C i 4 timer og derpå afkølet på is.

Lithiumch1 or id (392 mg, 9,0 mmol) blev tilsat, og opløsningen blev ekstraheret seks gange med lige store rumfang ethylacetat for at fjerne overskud af HgCl2· Effektiviteten af ekstraktionsprocessen blev styret ved at bestemme merkuri ionkoncentrationen i det organiske lag ved anvendelse af 4,4'-bi s(dimethy1 am i no)-thiobenzophenon (A.N.

Christopher, Analyst, 94, 392 (1969)). Omfanget af nucleotid- 5 merkurering, bestemt spektrofotometrisk efter iodering af en aliquotdel af den vandige opløsning som beskrevet af Dale m.fl. (R.M.K. Dale, D.C. Ward, D.C. Livingston og E. Martin, Nucleic Acid Res. 2, 915 [1975]), var mellem 90 og 100%. Nucleotidprodukterne i det vandige lag, der 10 ofte blev uklart under ethylacetatekstraktionen, blev fældet ved tilsætning af 3 rumfang iskold ethanol og blev opsamlet ved centrifugering. Bundfaldet blev vasket to DK 171822 B1 30 gange med kold absolut ethanol, én gang med ethylether og derefter lufttørret. De således fremstillede merkurerede nucleotider blev anvendt til syntese af allylaminnucleo= tiderne uden yderligere rensning.

5 b) Syntese af allylamin - dUTP og allylamin - UTP.

De merkurerede nucleotider (fra trin a) blev opløst i 0,1 M natriumacetatstødpude ved pH 5,0 og indstillet til en koncentration på 20 mmol (200 OD/ml ved 267 nm). En frisk 2,0 M opløsning af allylaminacetat i vandig eddike-10 syre blev fremstillet ved langsomt at sætte 1,5 ml allyl= amin (13,3 mmol) til 8,5 ml iskold 4 M eddikesyre. 3 ml (6,0 mmol) af den neutraliserede allylaminstamopløsning blev sat til 25 ml (0,5 mmol) nucleotidopløsning. Et nucleo= tidækvivalent af I^PdCl^ (163 mg, 0,5 mmol), opløst i 4 ml 15 vand blev så tilsat for at igangsætte reaktionen. Efter tilsætning af palladiumsaltet (Alfa-Ventron) blev opløsningen gradvis sort af metal (Hg og Pd) aflejringer, der fremkom på reaktionsbeholderens vægge. Efter henstand ved stuetemperatur i 18-24 timer blev reaktionsblandingen ført 20 gennem et 0,45 mm membranfilter (nalgene) for at fjerne det meste af det resterende metalbundfald. Det gule filtrat blev fortyndet fem gange og ført på en 100 ml søjle af DEAE-Sephadex TM A-25 (Pharmacia). Efter vask med 1 søjlerumfang af 0,1 M natriumacetatstødpude med pH 5,0, blev produkter-25 ne elueret under anvendelse af en 1 liter lineær gradient (0,1-0,6 M) af enten natriumacetat ved pH ca. 8-9 eller DK 171822 B1 31 triethylammoniumbicarbonat (TEAB) ved pH 7,5. Det ønskede produkt var i den større UV-absorberende del, som eluerede mellem 0,30 og 0,35 M salt. Spektralanalyse viste, at den-5 ne top indeholdt flere produkter, og den endelige rensning blev opnået ved omvendt fase HPLC-kromatografi på søjler af Partisil - 0DS2, under anvendelse af enten 0,5M NH4H2P04 stødpude ved pH 3,3 (analytiske adskillelser) eller 0,5M triethylammoniumacetat ved pH 4,3 (præparativ adskillelse) 10 som eluenter. 5'-triphosphaterne af 5-(3-aminopropen-l-yl)- uridin (allylaminadduktet til uridin) var de sidste dele, der blev elueret fra HPLC-søjlen, og de var klart adskilt fra tre hidtil ukarakteriserede forureninger. Disse nucleo= tider blev karakteriseret ved proton NMR elementæranalyse 15 [AA-dUTP (C12 H16 N3 Οχ4 P3 Na4,l H20): teoretisk C, 22,91, H, 2,88, N, 6,68, P, 14,77. Fundet, C, 23,10, H, 2,85, N, 6,49, P, 14,75. AA-UTP (C12 Hlg N3 015 P3 Na4# 4H20):

Teoretisk, C,20,61, H, 3,46, N, 6,01, P, 13,3. Fundet, C, 20,67, H, 4,11, N, 5,39, P, 13,54] spektralt og kromatogra- 20 fisk.

c) Biotinering af AA-dUTP eller AA-UTP.

Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester (NHSB) blev fremstillet 25 af biotin (Sigma) som tidligere beskrevet (H. Heitzmann og F.M. Richards, Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 71, 3537 (1974)). AA-dUTP,H20 (63 mg, 0,1 mmol) eller AA-UTP,4H20 (70 mg, O, 1 mmol) blev opløst i 20 ml 0,1 M natriumboratstødpude ved pH 8,5, og der blev tilsat NHSB (34,1 mg, 0,1 mmol) 30 opløst i 2 ml dimethylformamid. Reaktionsblandingen blev henstillet ved stuetemperatur i fire timer, og derefter fyldt direkte på en 30 ml søjle af DEAE-Sephadex TM A-25, der forud var bragt i ligevægt med 0,1 M TEAB ved pH 7,5. Søjlen blev elueret med en 400 ml lineær gradient (0,1-35 0,9 M) af TEAB. Fraktioner indeholdende biotinyl-dUTP el ler biotinyl-UTP, som eluerede mellem 0,55 og 0,65 M TEAB, blev afsaltet ved roterende inddampning i nærværelse af DK 171822 B1 32 methanol og blev genopløst i vand. Lejlighedsvis fremkom en svagt uklar opløsning: Denne uklarhed, der skyldes en forurening i nogle TEAB-opløsninger, blev fjernet 5 ved filtrering gennem et 0,45 mm filter. Til lasngere tids lagring blev nucleotiderne omdannet til natriumsaltet ved kort at omrøre opløsningen i nærværelse af Dowex TM 50 (Na+ form). Efter filtrering blev nucleotidet fældet ved tilsætning af 3 rumfang kold ethanol, vasket med ethyl= 10 ether, tørret i vakuum over natriumhydroxidkugler og lag ret i en ekssikkator ved -20°C. Til umiddelbar brug blev nucleotidopløsningen gjort 20 mM i tris-HCl ved pH 7,5, og indstillet til en endelig nucleotidkoncentration på 5mM. Stamopløsninger blev lagret frosne ved -20°C.

15

Elementæranalyse af bio-dUTP og bio-UTP produkterne gav følgende resultater. Bio-dUTP (C22 H3o N5 °18 P3 S1 Na47 1 H20). Teoretisk, C, 29,80, H, 3,38, N, 7,89, P, 10,47, S, 3,61. Fundet, C, 30,14, H, 3,22, N, 7,63, P, 10,31, 20 S, 3,70. Bio-UTP (C22 H3Q Ng C>19 P-j Na4, 3 HjO) : Teore tisk, C, 29,15, H, 3,19, N, 7,45, P, 9,89, S, 3,41. Fundet, C, 28,76, H, 3,35, N, 7,68, P, 9,81, S, 3,32.

Spektralegenskaberne af bio-dUTP og bio-UTP ved pH 7,5 25 [λ maks. 289 nm (ε = 7.100); λ maks. 240 nm (ε = 10.700); λ min. 262 nm (ε = 4.300)] afspejler tilstedeværelsen af en exocyklisk dobbeltbinding i konjugation med pyrimidin-ringen. Disse nucleotider giver også en stærk positiv reaktion (en orange-rød farve), når de behandles med p-dimethyl= 30 aminokanelaldehyd i ethanolisk svovlsyre, en fremgangsmåde, der anvendes til kvantitativ bestemmelse af biotin (D.B. McCormick og J.A. Roth, Anal. Biochem., 34, 326, 1970).

De reagerer imidlertid ikke længere med ninhydrin, en karakteristisk reaktion af AA-dUTP og AA-UTP udgangsmateria-35 lerne.

DK 171822 B1 33

Eksempel 3 og 4.

Syntese af biotinyl-CTP og biotinyl-dCTP.

5 CTP og dCTP blev a) merkureret, b) bragt til at reagere med allylamin og c) biotiniseret med NHS-biotin, i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1. CTP (56,3 mg, 0,1 mmol) eller dCTP (59,1 mg, 0,1 mmol) blev opløst i 20 ml 10 0,1 M natriumacetatstødpude ved pH 5,0, og der blev tilsat merkuriacetat (0,159 g, 0,5 mmol). Opløsningen blev opvarmet til 50°C i 4 1/2 time og derpå afkølet på is. Lithium= chlorid (39,2 mg, 0,9 mmol) blev tilsat, og opløsningen ekstraheret seks gange med ethylacetat. Nucleotidproduk-15 terne i det vandige lag blev fældet ved tilsætning af 3

rumfang kold ethanol, og bundfaldet blev opsamlet ved centrifugering. Bundfaldet blev vasket med absolut ethanol, ethylether og derpå lufttørret. Disse produkter blev anvendt uden yderligere rensning til syntese af AA-CTP og 20 AA-dCTP. De merkurerede nucleotider blev opløst i 0,1 M

natriumacetatstødpude ved pH 5,0 og indstillet til en koncentration på 10 mmol (92 OD/ml ved 275 nm). 0,6 ml (1,2 mmol) af en 2,0 M allylaminacetatstamopløsning (fremstillet som beskrevet i eksempel 1) blev sat til 10 ml nucleotid-25 opløsning (0,1 mmol) efterfulgt af tilsætning af K2PdCl4 (32,6 mg, 0,1 mmol), opløst i 1,0 ml HjO. Efter henstand ved stuetemperatur i 24 timer blev opløsningen filtreret gennem en 0,45 mM membran for at fjerne metalbundfald. Filtratet blev fortyndet fem gange og fyldt på en 50 ml søjle 30 af DEAE-Sephadex A-25, der forud var bragt i ligevægt med 50 mM TEAB ved pH 7,5. Nucleotidprodukterne blev fraktioneret ved anvendelse af en 500 ml lineær gradient (0,05— 0,6 M) af TEAB ved pH 7,5. Det ønskede produkt var i den større UV-absorberende del, som eluerede mellem 0,28 og 35 0,38 M salt. De forenede prøver blev afsaltet ved roteren de inddampning, opløst i 0,5 M triethylammoniumacetat ved pH 4,2, og den endelige rensning blev opnået ved HPLC- DK 171822 B1 34 kromatografi på søjler af Partisil ODS-2, under anvendelse af 0,5 M triethylammoniumacetat som eluent. De ønskede fraktioner blev forenet, lyofiliseret og produktet opløst i 5 H20. Nucleotiderne blev omdannet til Na+ saltet ved kort omrøring i nærværelse af Dowex TM 50 (Na+ formen). Efter filtrering for at fjerne Dowex-harpiksen, blev nucleotiderne fældet ved tilsætning af 3 rumfang kold ethanol. Bundfaldet blev vasket med ether og derefter lufttørret. Ana-10 lytiske resultater: AA-dCTP (C^ H^7 0^ P3 Na^ ,2H20), teoretisk, C, 22,29, H, 2,63, N, 8,67, P, 14,40. Fundet, C, 22,16, H, 2,89, N, 8,77, P, 14,18. AA-CTP (C12 Ηχ7 N4 °14 Na4 ' 2H20)J teoretisk, C, 21,75, H, 2,57, N, 8,46, P, 14,01. Fundet, C, 22,03, H, 2,47, N, 8,69, P, 13,81.

15 Spektralegenskaber i 0,1 M boratstødpude ved pH 8,0, λ maks. 301 nm (ε = 6.400), λ min. 271 nm (ε = 3.950), λ maks. 250 nm (ε = 9.700). Både AA-dCTP og AA-CTP giver en positiv ninhydrinprøve.

20 AA-CTP (6,6 mg, 0,01 mmol) eller AA-dCTP (6,4 mg, 0,01 mmol) blev opløst i 5 ml 0,1 M natriumboratstødpude ved pH 8,5, og der blev tilsat NHS-biotin (3,4 mg, 0,01 mmol), opløst i 0,2 ml dimethylformamid. Efter omrøring ved stuetemperatur i 4 timer blev prøven kromatograferet på en 10 25 ml søjle af DEAE-Sephadex A-25, under anvendelse af en

150 ml lineær gradient (0,1-0,9 M) af TEAB ved pH 7,5 som eluent. Fraktioner indeholdende biotinyl-CTP eller bioti®= nyl-dCTP, som eluerede mellem 0,50 og 0,60 M TEAB, blev forenet, afsaltet ved roterende inddampning, og efter ind-30 stilling til en endelig koncentration på 5 mM i 0,02 M

tris-HCl stødpude ved pH 7,5, blev de frosset ved -20°C. Produkterne giver en stærk positiv reaktion for biotin med p-dimethylaminokanelaldehyd i ethanolisk svovlsyre, men giver en negativ prøve for primære aminer, når de sprøj-35 tes med ninhydrin. Yderligere strukturel karakterisering af disse produkter er ved at blive foretaget.

DK 171822 B1 35

Eksempel 5 og 6.

Syntese af iminobiotinyl-UTP og iminobiotinyl-dUTP.

5 Iminobiotinhydrobromid blev fremstillet af biotin som tid ligere beskrevet (K. Hofmann, D.B. Melville og V. du Vigne-aud, J. Biol. Chem., 141, 207-211, 1941; K. Hofmann og A.E. Axelrod, Ibid., 187, 29-33, 1950). N-hydroxysuccinimid (NHS) esteren af iminobiotin blev fremstillet ved anvendelse af 10 den metode, der tidligere er beskrevet for syntese af NHS- biotin (H. Heitzmann og F.M. Richards, Proc. Nat. Acad.

Sci. USA, 71, 5537, 1974). AA-UTP (7,0 mg, 0,01 mmol) eller AA-dUTP (6,3 mg, 0,01 mmol), fremstillet som beskrevet i eksempel 1 (del b), blev opløst i 5 ml 0,1 M natriumborat-15 stødpude ved pH 8,5, og NHS-iminobiotin (3,5 mg, 0,01 mmol), opløst i 0,5 ml dimethylformamid, blev tilsat. Reaktionsblandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 12 timer og derefter fyldt direkte på en 10 ml søjle af DEAE-Sepha= dex A-25, der forud var bragt i ligevægt med 0,05 Μ TEAB 20 ved pH 7,5. Søjlen blev elueret med en 150 ml lineær gra dient (0,05-0,6 M) af TEAB. Fraktioner indeholdende imino= biotin-UTP eller iminobiotin-dUTP, som eluerede mellem 0,35 og 0,40 M TEAB, blev afsaltet ved roterende inddamp-ning i nærværelse af methanol og opløst i H20. Produkterne 25 indeholdt en ringe mængde allylamin-nucleotidaddukt som urenhed, bedømt ved et svagt positivt resultat ved ninhy* drinprøven. Endelig rensning blev opnået ved affinitetskromatografi på avidin-sepharose. Fraktioner af det urene produkt, gjort 0,1 M i natriumboratstødpude ved pH 8,5, 30 blev påført på en 5 ml søjle af avidin-sepharose og vasket med 25 ml af samme stødpude. Søjlen blev så vasket med 50 mM ammoniumacetatstødpude ved pH 4,0, som eluerede det ønskede iminobiotin-nucleotidprodukt i en skarp top. Nucleotidet blev udfældet ved tilsætning af 3 rumfang kold ethanol, 35 vasket med ethylether, tørret i vakuum over natriumhydroxid* kugler og lagret i en ekssikkatcr ved -20°C. Produkter blev DK 171822 B1 36 karakteriseret ved elementæranalyse og ved spektrale og kromatografiske egenskaber.

5 Eksempel 7 og 8.

Syntese af NAGE-UTP og NAGE-dUTP.

Allyl (3-amino-2-hydroxy-)-propylether, forkortet NAGE, 10 blev fremstillet af allylglycidylether (Age} (fra Aldrich

Chemical Co.). 10 ml Age (84 mmol) blev tilsat langsomt (i stinkskab) til 50 ml 9 M ammoniumhydroxid, og blandingen fik lov at henstå ved stuetemperatur i 6 timer. Overskud af ammoniak blev fjernet ved roterende inddampning under redu-15 ceret tryk til dannelse af en viskos gul olie. Analyse af dette produkt ved proton NMR viste, at det havde den ønskede struktur. 5-merkuri-dUTP (0,1 mmol) eller 5-merkuri-UTP (0,2 mmol) blev opløst i 2-4 ml 0,2 M natriumacetatstødpude ved pH 5,0, og et 16-dobbelt molært overskud af NAGE ind-20 stillet til pH 5,0 med eddikesyre før brugen blev tilsat.

De endelige reaktionsrumfang (4,3 og 8,4 ml) havde nucleo= tidkoncentrationer på henholdsvis 43 og 42 mM. Et ækvivalent KjPdCl^ (0,1 eller 0,2 mmol) blev tilsat for at igangsætte reaktionen. Efter henstand ved stuetemperatur i 18 25 timer blev reaktionsblandingerne filtreret gennem 0,45 ymM- membraner, prøverne fortyndet fem gange og kromatograferet på søjler af DEAE-Sephadex A-25, under anvendelse af linære gradienter (0,1-0,6 M) natriumacetat. Fraktioner indeholdende de ønskede produkter, bedømt ved deres UV-spektre og 30 karakteristiske HPLC elueringsprofiler på Partisil ODS-2, blev forenet, fortyndet og yderligere renset ved genkromatografi på DEAE-Sephadex under anvendelse af lave gradienter (0,1-0,5 M) af ammoniumbicarbonat ved pH 8,5. Under disse betingelser kunne størstedelen af NAGE-dUTP (eller 35 NAGE-UTP) let adskilles fra resterende urenheder. Proton NMR spektre blev taget på dette stadium af rensningen, efter at nucleotiderne var lyofiliseret og genopløst i DjO.

Claims (12)

1. 5 Patentkrav.
2. 1. Modificeret nucleotid med strukturen: B · · · A tf-r- OH Z hvor B er en 7-deazapurin eller et pyrimidinderivat, der er 10 kovalent bundet til sukkermolekyldelens C1'-stilling, forudsat, at når B er 7-deazapurin, er sukkermolekyldelen bundet til deazapurinens N®-stilling, og når B er pyrimidin, er suk-kermolekyldelen bundet til N1-stillingen, hvor A er en molekyldel bestående af mindst 3 carbonatomer og 15 desuden betegner mindst én komponent af en signalerende molekyldel, som er i stand til at frembringe et påviseligt signal, hvor den punkterede linje repræsenterer en binding eller gruppe, som forbinder B og A, forudsat, at hvis B er 7-deazapurin, er bindingen bundet til deazapurinens 7-stilling, og hvis B er 20 pyrimidin, er bindingen bundet til pyrimidinens 5-stilling, og hvor x repræsenterer o 0 0 000 " ·· 11 II II II H0-P-0-, H0-P-0-P-0- eller H0-P-0-P-0-P-0-, ' * · II," OH OH OH OH OH OH DK 171822 B1 38 og z er H- eller H0-.
3. 2. Modificeret nucleotid ifølge krav l, kendetegnet ved, at A er biotin.
4. 3. Modificeret nucleotid ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at A er iminobiotin.
5. 4. Fremgangsmåde til fremstilling af et modificeret nucleotid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter trinene (a) omsætning af en forbindelse med strukturen: 10 ? x-CH2 .0 H i—Γ H OH 2 med et merkurisalt i et egnet opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af en merkureret forbindelse med strukturen: : i-Hg+ X-CH- O. kf ί H OH 2 15 (b) omsætning af den merkurerede forbindelse med en kemisk mo-lekyldel, som er reaktionsdygtig med -Hg+-delen af den merkurerede forbindelse og repræsenteret ved formlen •••N, hvilken reaktion udføres i et vandigt opløsningsmiddel og i nærvære 1 se af K2PdCl4 under egnede betingelser til dannelse af en forbin-20 delse med strukturen: DK 171822 B1 39 B* · -N x-CH2/0>. Η I H OH 2 hvor N er en reaktionsdygtig endestillet funktionel gruppe eller A, og (c) udvinding af forbindelsen som det modificerede nucleotid, 5 når N er A, eller, når N er en reaktionsdygtig endestillet gruppe, omsætning af denne forbindelse med en forbindelse med strukturen M-A, hvori M er en funktionel gruppe, som er reaktionsdygtig med N i et vandigt opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af det modificerede nucleotid, som 10 derpå udvindes.
6. 5. Fremgangsmåde til påvisning af et modificeret nucleotid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter trinene a) nucleotidet bringes i kontakt med et polypeptid, som er i 15 stand til at danne et kompleks dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekset, hvilket polypeptid kan påvises eller indeholder en molekyldel, som kan påvises, når komplekset af det modificerede nucleotid og polypeptidet er dannet, og b) påvisning af komplekset under anvendelse af en egnet påvis-20 ningsteknik.
7. 6. Modificeret nucleotid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A er en molekyldel valgt blandt benzoyl, 2-(2,4-dini-trophenylaminojacetyl, succinyl, lipoyl og phthaloyl. DK 171822 B1 40
8. 7. Modificeret nucleotid ifølge krav l, kendetegnet ved, at molekyIdelen A er en ligand eller hapten.
9. 8. Modificeret nucleotid ifølge krav 7, kendetegnet ved, at molekyldelen A er i stand til at danne et påviseligt 5 kompleks med et polypeptid.
10. 9. Modificeret nucleotid ifølge krav 8, kendetegnet ved, at polypeptidet, som kan påvises, omfatter et fluorescerende farvestof, et elektrontæt reagens eller et enzym.
11. 10. Modificeret nucleotid ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at den kemiske binding repræsenteret ved den punkterede linje er en molekyldel valgt fra gruppen bestående af en mole-kyldel indbefattende en olefinisk binding i a-stillingen i forhold til B, en tre carbonatomers linker med en reaktiv amingruppe, -CH=CH-CH2-NH-, samt -CH=CH-CH2-0-CH2-<j:H-CH2-NH-.
12. 15 OH