JPS6399093A - ヌクレオチドの製造と該ヌクレオチドの使用の方法 - Google Patents

ヌクレオチドの製造と該ヌクレオチドの使用の方法

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JPS6399093A
JPS6399093A JP62083703A JP8370387A JPS6399093A JP S6399093 A JPS6399093 A JP S6399093A JP 62083703 A JP62083703 A JP 62083703A JP 8370387 A JP8370387 A JP 8370387A JP S6399093 A JPS6399093 A JP S6399093A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物医学研究において用いられる多くの千顆とＤＮＡ組
換え手法は水素（３Ｈ）、燐（３２Ｐ　）。
炭素（１４Ｃ）、もしくはヨウ素（１２５Ｉ＞の同位元
素によって放射能ラベルされたヌクレオチドもしくはポ
リヌクレオチド誘導体の使用に大巾にたよっている。こ
のような放射性化合物は単に甚だしく少量の存在であっ
ても使用者が核酸の検出、監視１位置決め、単離等を行
うことを可能にする有用な指針探査を提供する。今日ま
で、放射性物質はもつとも敏感な、そして大くの場合多
くの重要な実験もしくは分析試験を遂行するための唯一
の手段を提供して来た。しかしながら放射性化合物の使
用に関連して重大なる制限と障害がある。第一に、放射
性物質を取扱かう作業者は放射能の危険な水準に曝され
るおそれがあり得るから手の込んだ安全な予防策が放射
性同位元素の調製、利用、そして廃棄処分の間に維持さ
れていなければなら々い。第二に放射性ヌクレオチドに
は主として適当な保護手段、生産者−使用者健康監視サ
ービス、そして廃棄処分計画を提供するに必要な装置や
人力の費用によるものであるが購入や使用のために莫大
表費用がかかる。第三に放射性物質は屡々非常に不安定
であシ限られた保存期間を有し、そしてそのために更に
使用費用が増大する。この不安定性は放射性同位元素そ
れ自身の崩壊に関連する破壊効果による放射線的分解、
そして多くの放射性同位元素（例えば３２Ｐおよび１２
５Ｉ）はたった数日の半減期しか有しないと言う事実に
帰因するものである。
ハプテンは抗体と結合し得るが担体と結合した場合にお
いてのみ免疫性応答を行い得ると言うことは知られてい
る。この性質は検出および識別試験に利用されることが
出来る。
またビオチンやイミノビオチンはアビヂン。
卵白からの６８，０００ダルトングリコプロテインと強
力に相互作用を行うことも知られている。
この相互作用は自然にみられる最とも堅固な非共有結合
常数（Ｋｄｉｓ＝１０−１５）の一つを示す。
もしアビヂンが例えばフルオレセインまたはローダミン
のような螢光染料、例えばフェリチン。
ヘモシアニンもしくはコロイダルに金のような高電子密
度試薬、もしくは例えばパーオキシダーゼもしくはアル
カリホスファターゼのような不溶解性反応生成物を沈積
し得る酵素を含む顕示し得る能力のある指標分子と結び
つけられるならばビオチンプローブの存在９位置、もし
くは量は証明せられることが出来るであろう。イミノビ
オチンはビオチンよシも若干弱くアビヂンと結合するけ
れども、同様な反応がその検出のために用いられ得る。
更に、溶液のｐＩ（を減少させることによってイミノビ
オチンーアビヂン相互作用が転換され得ることはある応
用において顕著な利点を提供する。
ビオチンーアビヂン錯体の特性と保持力は近年細胞上も
しくは細胞の中の特定の蛋白質、リビド、もしくは炭水
化物を可視的に位置決めするための方法を開発するため
に用いられて来ている（Ｅ、Ａ、ベーヤーとＭ、ウイル
チェク。
生化学分析の手法、　２６．１．１９８０において検討
される）。ＲＮＡの染色体位置はビオチン化した蛋白質
、化学的にＲＮＡと架橋されたチトクロームＣ０を交配
探査子として用いて電子顕微鏡によって測定されている
。交配の場所はアビヂンービオチン相互作用によって仲
介されるアビヂンーフェリチンもしくはアビヂンーメタ
クリレート領域の結合を介して可視化された（Ｊ、Ｅ、
　マエング、Ｎ、Ｄ、バージエイ、Ｔ。
Ｒ，ブローカー、Ｍ、ベレグリ一二、Ｈ，Ｋ。
ミッチェル、およびＮ、デビッドソン、染色体。
５３．１０７．１９７５　；Ｊ、Ｅ、マエング２Ｍ、ペ
レグリ一二、およびＮ、デビッドソン、生化学。
６１．１３６４．１９７７；　Ｔ、Ｒ，ブローカー、Ｌ
。
Ｍ、アンシェラ−、Ｐ、Ｈ，イエン、Ｎ、Ｄ、バージエ
イ、およびＮ、デビッドソン、核酸研究、。
５．３６３．１９７８　；ＡソーヤおよびＮ、デビッド
ソン、核酸研究、、５，３８３，１９７８．）ポリヌク
レオチド連鎖の検出に対するこのアプローチは高度に反
復された連鎖のような特殊化せられた場合においては試
験が成功したけれども単一もしくは低い複写数において
存在するポリヌクレオチドの分析に対しては一般的に有
用ではない。
更にピＩ）　ミヂンやプリン環に化学部分を付加する方
法が知られている。数年前に簡単なそして迅速なアセト
キシ水銀化反応が水銀原子の共有的結合をヌクレオチド
およびポリヌクレオチドの両方におけるビリミヂン環の
５−位置、プリン環のＣ−８位置もしくは７−デアザプ
リン環のＣ−７位置の中に導入するために開発された。
（Ｒ，Ｍ、に、ゾール、Ｄ、Ｃ，リビングストンおよび
り、　　Ｃ，ワード、米国自然科学学会会報、、７０．
２２３８，１９７３；Ｒ，Ｍ、に、ゾール。
Ｅ、マーチン、Ｄ、Ｃ，リビングストンおよびり、　　
Ｃ，ワード、生化学、　１４．２４４７．１９７５．）
有機水銀化合物がパラヂウム触媒の存在下においてオレ
フィン化合物と反応して炭素−炭素結合を形成すること
は数年前に知られていた。
（Ｒ，Ｆ、ヘック、米国化学会誌、、９０゜５５１８．
１９６８；Ｒ，Ｆ、ヘック、同上、、９０゜５５２６．
１９６８；Ｒ，Ｆ、ヘック、同上、、９０゜５５３１．
１９６８；Ｒ，Ｆ、ヘック、同上、、９０゜５５３５．
１９６８；およびＲ，Ｆ、ヘツク、米国化学会誌、　９
１．６７０７．１９６９．）バースドームと共同研究者
（Ｊ、Ｌ、ルースおよびり、　　Ｅ、バースドーム、有
機化学雑誌、、４３．２８７０゜１９７８；およびり、
　　Ｅ、バーゲスドームおよびＭ、に、オガワ、米国化
学会誌、、　１００．８１０６゜１９７８、）およびビ
ッグ２等（Ｃ，Ｆ、ビッグ、Ｐ。
カラリティス、Ｊ、Ｒ，デックおよびＭ、　Ｐ、マーテ
ス、米国化学会誌、、　１０２．２０３３．１９８０．
）は最近この反応をｃ−ｓｉ換ピリミヂンヌクレオチド
化合物の合成に応用しようと企てた。
最後にヌクレオチドを変性するために特定の抗体が調製
されることが出来、そして該変性ヌクレオチドの特定な
構成を単離しそして特徴づけるために用いられることが
出来ることは知られている（Ｔ、Ｗ、ミューンズおよび
Ｍ、　Ｋ、　リスゼ７スキイ、核酸研究の進歩および分
子生物学、２４，１０９．１９８０．）。しかしながら
、今日までに自然に生ずるヌクレオチドに対して調製さ
れる抗体のいかなるものもそれが二重螺旋構造のＲＮＡ
もしくはＤＮＡ複合体中に存在する時、もしくはＤＮＡ
−ＲＮＡ交配分子中に存在する時、これらヌクレオチド
測定子との反応を示さなかった。
放射能的に標識付けされたプローブもしくは今迄に利用
された化学および生物学的プローブの限界を回避するた
めにピリミヂンもしくはプリン環と共有的に結合してい
るピオチン、イミノビオチン、リボ酸、そして他の測定
子が合成されている。これらヌクレオチド誘導体はそれ
らを含んでいるポリヌクレオチドや補酵素と同様にアビ
ヂンもしくは抗体のような蛋白質と選択的にそして特有
に相互作用を行うでおろう。
変性ヌクレオチドと特定の蛋白質との間の相互作用は最
近生物医学的にそしてＤＮＡ組換え手法において用いら
れている多くの手順において核酸成分の検出および配置
のだめの放射性同位元素に代るものとして利用されるこ
とが出来る。
これら変性ヌクレオチド−蛋白質相互作用を用いる方法
は放射性同位元素を利用する手順に等しいかそれよりも
大きな検出能力を有し、そしてそれらは屡々よシ迅速に
セしてよシ大きな分解能によって遂行されることが出来
る。
これら新らしいヌクレオチド誘導体は以下によシ完全に
検討されるように開発せられそして画一化せられて来た
化学的手順によって比較的安価に調製せられることが出
来る。更に意義深いことには本発明のヌクレオチドグロ
ーブもそれらに用いられる蛋白質試薬も放射性ではない
から該化合物は放射性同位元素の取扱かい上要求される
手の込んだ安全手順なくして調製せられ、利用せられ、
そして処理される。更にこれらヌクレオチド誘導体は化
学的に安定であって数年もしくはそれ以上の可使保存期
間を有することが期待されることが出来る。最後にこれ
ら化合物はよシ安全な、よシ経済的な、よシ迅速か、そ
してよシ再現性のある研究および診断手順の開発を可能
ならしめる。
本発明によれば構造式 ここにＢは糖部分の０１′−位置に共有的に結合された
プリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表わ
し、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合は
該プリンまたはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂが
ピリミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するものと規
定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
ジンであれば該化学鎖は該ピリミジンの５−位置に存す
るものと規定せられ、そしてＸ。
ｙおよび２の各々は ０Ｈ０ＨＯＨ ＯＨＯＨＯＨ を表わす。
を有する化合物の製造方法が提供せられ、該化合物は生
物医学研究およびＤＮＡ組換え手法におけるプローブと
して広く有用である。
この構造の範囲に包含される化合物のうち特に有用なも
のは更に次に示す特性の一つもしくはそれ以上を有する
二Ａは非芳香性である；Ａは少くともＣ５である；Ｂと
Ａとからなる化学結合は一つのα−オレフィン結合を含
む；Ａはビオチンもしくはイミノビオチンである；そし
てＢはピリミヂンもしくは７−デアザプリンである０ これら化合物は （ａ）　　構造式 を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
下において反応せしめて構造式を有する水銀化合物を形
成すること。
（ｂ）　　上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＋部
分°と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる
化学部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で
、そしてに２ＰｄＣ１４の存在下に、適当な条件下にお
いて行われ、構造式 ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである０ を有する化合物を形成する。
そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
こと、ＮかＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここＫＭはＮと反応
可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを生成し、
それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。
以上の段階を含む工程によりて調製せられるであろう。
本発明はまた構造式 ここにＢ、Ｂ′、およびＢ′の各々は糖部分のＣ１′−
位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、また
はピリミジン部分を表わし、Ｂ　、　Ｂ’、またはＢ′
のいづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は
該プリンまたはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂ　
、　Ｂ’、またはＢ′のいづれかがピリミジンの時、該
結合はＮ１−位置に存するものと規定せられ、Ａは本化
合物が対をなすリポ核酸またはデオキシリボ核酸分子に
よって形成される二重螺旋構造の中に取入れられた時、
ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成することの
出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖ｄ該
デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
ジンであれば該結合はピリミジンの５−位置に存するも
のと規定せられ、 ２はＨ−ま−たはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約ｘｏ０，０００１での整数を表
わす。
を有する化合物の製造方法を提供するものである０ これら化合物は本発明の変性ヌクレオチドを含むヌクレ
オチドの混合物の酵素的重合によって調製されることが
出来る。それに代えてオリゴ−もしくはポリヌクレオチ
ド中に存在するヌクレオチドは化学的方法を用いて変性
されるであろう。
本発明の実施によりて変性されるヌクレオチドそしてそ
の中に該変性ヌクレオチドが取入れられているオリゴ−
およびポリヌクレオチドは生物医学研究、臨床診断、そ
してＤＮＡ組換え手法におけるプローブとして用いられ
るであろう。これらの種々の有用性はポリペプチドの中
に本来的に存在する性質によるか、あるいはポリペプチ
ドに結合されるかもしくはそれと相互作用を行う検出可
能な部分によって順番に検出されることの出来る安定な
錯体をポリペプチドと共に形成する該分子の能力に基づ
くものである０ いくらかの用途は例えばバクテリアやウィルスのような
核酸を含む病因の検出と識別、抗生物質耐性に対するバ
クテリアのスクリーニング、例えばサラセミアや鎌状細
胞貧血症のような遺伝的欠陥の診断、染色体核型分類、
そして腫瘍細胞の識別を含む。
本発明を以下に詳細に説明する。
自然に発生したヌクレオチドの放射性標識付けされた形
状に置き代わるものとして変性ヌクレオチドが一般的に
適するためＫはいくらかの本質的な規準が満足されなけ
ればならない。第一に、該変性化合物は独特な、即ちヌ
クレオチドもしくはポリヌクレオチドに関連して正常に
は見出されない置換基もしくはプローブを含んでいなけ
ればならない。第二に、該プローブは化学的もしくは生
物学的試薬と特別に反応して鋭敏な検出システムを提供
しなければならない。
第三に、多くの実際の応用が、該相似物が酵素的に代謝
され、゛例えば該相似性が核酸ポリメラーゼに対する基
質としての役目をすべきことを要求しているので該相似
物は一般的に研究されている核酸酵素に対する比較的効
果的な基質でなければならない。この目的のために、プ
ローブ部分は立体的位置に関して、あるいは逆に、塩基
の正常なワトソンークリック水素結合能力を妨害する環
位置に配置されてはならない。さもなければ該置換体は
ポリメラーゼ基質として不活性な化合物を得るであろう
。形状変化は通常ヌクレオチド訪導体をポリメラーゼ基
質として受容することが出来ないようにするので正常な
１アンチ′ヌクレオシド形状を変更するような環位置の
置換はまた避けられ々ければ々らない０ 第四に、該検出システムは核酸交配方法学と矛盾しない
ために一重螺旋樽造および二重螺旋構造の両方のポリヌ
クレオチドの中に取入れられるプローブ置換体と相互作
用を行う能力を有すべきである。この基準を満足せしめ
るには、それが抗体、その他の検出蛋白質、もしくは化
学試薬と容易に相互作用を行うことが出来るように化学
結合もしくは１結合手′を介して該プローブ部分がプリ
ンもしくはビリミヂンと結合されていることが望ましい
。
第五に、プローブ置換体の少数を含んでいるポリヌクレ
オチドの物理的および生化学的性質は放射性交配プロー
ブを用いる最近の手順が広範囲にわたって変性される必
要がないがために大巾に変更てれるべきではない。この
規準は該プローブが酵素的に導入されるかまたは直接化
学的手段で導入されるかのいづれの場合においても満足
せしめられねばならない。
最後に、該グローブが付加される結合は正常なヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドが日常支配されているすべ
ての実験的条件、例えば高温における長期の交配時間、
フェノールおよび有機溶剤抽出、１！気泳動等に耐える
べきである。
これら規準のすべてはここに記述される変性ヌクレオチ
ドによって満足せしめられる。
該変性ヌクレオチドとは構造式 ここにＢは糖部分のＣ１′−位置に共有的に結合された
プリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表わ
し、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合は
該プリンまたはデアザプリンのマー位置に存し、Ｂがピ
リミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するものと規定
せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリポ
核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
ジンであれば該化学鎖は該ピリミジンの５−位置に存す
るものと規定せられ、 そしてＸ、ｙおよび２の各々は ＯＨＯＨＯＨ ０ＨＯＨＯＨ を表わす。
を有する化合物である０ これら化合物は生物医学研究およびＤＮＡ組換え手法に
おけるプローブとして広く有用である０ この構造式の範囲に包含されるすべての化合物は主とし
て本発明の実施によって調製されそして使用されるであ
ろうけれども、該化合物のいくらかのものよシ容易に’
ＡＭされもしくは／そして使用され、そしてそれ故に目
下の所より望ましいものである。
かくしてプリン、ピリミヂン、および７−デアザプリン
は主として有用なものであるけれども、ピリミジン、お
よび７−デアザプリンはプリン８−位置置換体が該核酸
をポリメラーゼ基質として無効にするから望ましいもの
である。
かくして変性プリンはある点では有用であるけれどもビ
リミヂンおよび７−デアザプリン程一般的に有用ではな
い。更に本発明に有用なピリミヂンおよび７−デアザプ
リンは夫々５−もしくは７−位置に当然置換されてはな
らない。結果として、チミン、５−メチルシトシン、お
よび５−ハイドロキシメチルシトシンのようないくらか
の塩基は有用でない。目下の所有用な塩基はシトシン、
ウラシル、デアザアデニン、およびデアザグアニンであ
る。
Ａは少くとも三個の炭素原子を有し、そして変性ヌクレ
オチドがデオキシリ鹸核酸かリボ核酸かのいづれかに取
入れられた時ポリヌクレオチドと検出可能な錯体を形成
し得るいかなる部分にも相当する。
Ａはそれ故に適当な抛体に付加した時単に免疫原的であ
るが、しかし適当な抗体と相互作用を行って錯体を形成
し得るノ・ブテンを含むこれら性質を有しているいかな
るリガンドにも相当するであろう。有用であるこれら部
分の例は次の通りである。
これら望ましいＡ部分としてはビオチン、およびイミノ
ビオチンがある。
更に芳香性部分は塩基と対になっている螺旋構造の中に
介入せんとする傾向があるので、部分Ａは非芳香性であ
ることが望ましい。またより小さい部分はポリペプチド
との分子相互作用が充分でないから、充分な相互作用が
起って安定な錯体を形成せしめるためにはＡは少くとも
Ｃ５であることが望ましい。ビオチンとイミノビオチン
はこれら基準の両方を満足する。しかしながら、該化学
鎖はＢに関連してα−位置にオレフィン結合を含むこと
が一般的に望ましい。
このよりなα−オレフィン結合の存在は塩基が良く知ら
れている二重部旋形状において他のものと対をなす時、
部分Ａが該塩基から離れた所に維持する役目を果す。こ
れはポリペプチドとの相互作用をより容易に行わしめ、
それによって錯体の形成を促進せしめる。更に大きな回
転自由度を有する一重結合は必ずしも螺旋から該部分を
光分離れた所に維持してポリペプチドによる認識および
ポリペプチドとの錯体の形成を行わしめるわけではない
。
該化学銀の鎖が第一級アミンから誘導され、そして−Ｃ
Ｈ２−ＮＨ−構造を有することは、このような化学結合
が良く知られたアミン変性反応のいかなるものも利用し
て容易に形成されるからさらにより望ましいことである
。アリルアミンおよびアリル−（３−アミノ−２−）−
イドワキシー１−プロピル）エーテル基から誘導される
望ましい化学銀の例は夫々式 ％式％ これらの化学銀は望ましいものではあるけれども、特に
例えばチオール、カルボン酸、およびエポキシド官能基
のような他の変性可能な官能基を有するオレフィン結合
手を含むその他のものも使用されることが出来る。
該化学銀は特別な位置、即ちビＩｊ　ミヂンの５−位置
、プリンの８−位置、もしくはデアザプリンの７−位置
に結合する。前に述べたように１プリンの８−位置の置
換はここに検討されるすべての方法において有用な変性
ヌクレオチドを形成しない。プリンの７−位置は窒素原
子で占められているが、化学銀が結びつく点になシ得る
であろう。しかしながら今日用いられそしてここに検討
される化学的置換方法はこの目的には適していない。
記号！、）’、および２は糖部分５／、３１．および２
′位置に結びついている基を表わす。これらは １　　　　　　　　　　　　’ｌ　　　　　　１ＯＩ（
ＯＩ（ＯＨ １ｌ ＯＨＯＨＯＨ のうちのいづれかである。
考えられ得ることではあるけれども、！　＋　’Ｉｓお
よび２のすべてが同時に同一のものであることはありそ
うにない０よりあシそうなことは少くともＸｓ’！ｚお
よび２のうち一つがモノ−。
ジー、もしくはトリーホスフェイトのいづれかのホスフ
ェイト含有基であり、そして少くとも一つがＨＯ−もし
くはＨ−であることである。
容易に評価されるように、最もあシそうな２の正体は夫
々リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド
を示しているＨＯ−もしくはＨ−である。かようなヌク
レオチドの例はジーリボヌクレオシドモノホスフエイト
、５′−リボヌクレオシドジホスフエイト、ダーリポヌ
クレオシドトリホスフエイト、タープオキシリポヌクレ
オシドモノホスフェイト、５′−デオキシリポヌクレオ
シドジホスフエイト、５′−デオキシリポヌクレオシド
トリホス７エイト、５′Ｐ−リボヌクレオシド３′Ｐ１
および５’Ｐ−デオキシリボヌクレオシド３’Ｐを含む
、より特殊な例はＡがビオチンもしくはイミノビオチン
、化学銀が−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨｚ−ＮＨ−もしくは−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−
ＯＨ モしてＢがウラシルもしくはシトシンであるこのタイプ
の変性ヌクレオチドを含む０ 化学銀手およびプローブ部分を塩基上へ導入するために
採用せられる一般的合成方法は上記に検討せられる（　
Ｊ、　Ｌ、　　ルーズおよびり、　Ｅ。
バーゲスドーム、有機化学雑誌、、　４３，２８７０゜
１９７８　：　　バーゲスドームおよびＭ、　Ｋ、オガ
ワ。
米国化学会誌、１００，８１０６，１９７８　：および
Ｃ，Ｆ、ビッグ、Ｐ、カラリティス、Ｊ、Ｒ，デックお
よびＭ、Ｐ、マーテス、米国化学会誌、１０２゜２０３
３．１９８０．をみよ） しかしながら、ここに用いられるオレフィン置換体は以
前には用いられたことがない０プロ一ブ部分Ａの結びつ
きを容易にするために、例えばアリルアミン［：ＡＡ〕
、もしくはアリル−（３−アミノ−２−ハイドロキシ−
１−プロピル）エーテル（ＮＡＧＥ）のような第一級ア
ミン官能基を有するオレフィイを用いることが特に望ま
しいことが見出され、そして該オレフィンは例えば イミデート 警 ア ンハイドライド ＮＨＳ−エステル（Ｎ−ハイドロキシサクシミド）−Ｃ
Ｈ２ＮＨ２＋Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ→−ＣＨ２ＮＨＣＮＨＲイ
ソチオシアナート のような標準的なアミン変性反応によりてグローブを結
びつけることを可能にする。
調製の容易さのために、ＮＨＳ−エステルをグローブの
付加のために用いることが望ましいことが見出されてい
る。しかしながら、例えばチオール、カルボン酸，エポ
キシドのような他の変性可能な官能基を有するオレフィ
ン結合幼子もまた用いられることが出来る０更にまた、
結合幼子とプローブの両方共が望ましいと思われるなら
ば単一段階において付加されることが出来る。
特に構造式 ここにＢｔｉ糖部分のＣｌ′−位置に共有的に結合され
たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
は該プリンまたはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂ
がピリミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するものと
規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸，デオキシリボ
核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
表わし、 点腺はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
しＢがプリンであれば該化学鎖はプリンの８−位置に存
し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該デ
アザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジ
ンであれば該化学鎖は該ピリミジンの５−位置に存する
ものと規定せられ、 そしてｘ　、　ｙ，および２の各々は １　　　　　　　　　　　ＩＩ Ｈ−、　ＨＯ−、　ＨＯ−Ｐ−０−、ＨＯ−Ｐ−０−Ｐ
−０−。
０Ｈ　　　　　ＯＨＯＨ ＯＨ　　ＯＨ　　ＯＨ を表わす。
を有する変性ヌクレオチドは （ａ）　　構造式 を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
下において反応せしめて構造式を有する水銀化合物を形
成するとと０ （ｂ）　　上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｋｇ”部
分と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化
学部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、
そしてに２ＰｄＣ１４の存在下に、適当な条件下におい
て行われ、構造式 ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである０ を有する化合物を形成する。
そして （ｃ）　　該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収
すること、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該
化合物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと
反応可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下
において反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成
し、それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。
以上の段階によって調製されることが出来る。
以下に実例案を示す。
Ｒ−Ｔ、　　　　　　　　　＞１０ 該反応はｐＨ１と同程度に低い水素イオン濃度で、もし
くはｐＨ１４と同程度に高い水素イオン濃度で行われる
ことが出来るけれども、約４から８までの範囲において
行うととが望ましい。このことはこの範囲以外のｐＨに
おいては加水分解される例えばヌクレオシドポリホスフ
ェイト、ポリヌクレオチド、およびヌクレオチド補酵素
のような不安定な化合物を取扱かう場合には特に真実で
ある。同様に標識付けされた有機基質の分解の可能性を
防止するために約２０℃から３０°Ｃの範囲の温度で行
うことが望ましい。しかしながら、該反応は約５°Ｃか
ら１００℃の温度で行われ得る。化学反応においては通
常のことであるが、より高温は反応速度を促進し、そし
てより低温はそれを遅くする。
かくして５℃から１００℃までの温度範囲において、最
適反応時間は約１０分から９８時間迄変化するであろう
。望ましい温度範囲においては、反応時間は通常３から
２４時間迄変化する。
ｐＨを所望の範囲に維持するための望ましい手順はバッ
ファーを用いることによる。種々なバッファーが用いら
れ得る。これらは例えば、酢酸ソーダもしくはカリウム
、クエン酸ソーダもしくはカリウム、クエン酸−燐酸カ
リウム。
トリス酢酸、そしてホウ酸、水酸化ソーダバッファーを
含む。使用時のバッファーの濃度は約２．０モルまでの
広い範囲にわたって変化し得る。
水銀化反応およびパラジウム触媒を用いる付加反応の特
別な利点はこれらが水中で行われ得ることであるが、有
機溶媒の少量が溶解性補助として有用に含まれることが
出来る。通常選択される有機溶媒は水と混和性を有する
ものである。これらは例えばメタノール、エタノール。
プロパツール、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ビ
リデン、およびジメチルホルムアミドのヨウナエーテル
、アルコール、エステル、ケトン、アミド等から選ばれ
るであろう。しかしながら、例えばメタノールのような
アルコールの存在は屡々オレフィン二重結合に対するア
ルコキシ付加の原因となるので、溶解性補助として用い
られる有機溶媒は注意深く選択されなければならない。
アルコキシ置換基のα−またはβ−外環炭素原子に対す
る導入は屡々酵素基質として利用されて非常に効果の少
ない化合物の生成の原因となる。
種々の水銀塩が利用されるけれども、現在望ましい塩は
酢酸水銀である。また、前に示されたように、該化合物
は先づ結合幼子を付加し、そしてそれから部分Ａを付加
することによってか、もしくは既に部分Ａが結びついて
いる結合鎖を付加することによって調製される。かくし
て式・・―Ｎで表わされる化学部分は所望の化合物の形
成を最終的にもたらすものであればいかなるものでもよ
い。
例としては −ＣＨ−ＣＨ−ＣｌセーＮＨ２ｐ −ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ
Ｈ２−Ｈ −ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−ｂｉｏｔｉｎ　、および
−０Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２Ｎ
Ｈ−イＨ ミノビオチン。
を含む。
これらの反応において用いられる反応物の量は広く変化
する。しかしながら水銀化されていない化合物、水銀化
された化合物、およびパラヂウム含有化合物の量は一般
的に略化学量論的であるが、一方水銀塩および化合物φ
・・Ｎは過剰モル、例えば夫々の水銀化されている化合
物もしくは水銀化されていない化合物のモルに対してＮ
・・・Ｎもしくは水銀塩の５〜２０モル存在せられる。
実際には、量は反応条件や反応物の詳細な性質の変化に
よりて変化する。
酵素基質として機能することが出来るヌクレオチド誘導
体に直接結びつけられているビオチンプローブを有する
ことは遂行され得る実験原案においても、分析のために
利用され得る検出方法（顕微鏡的および非顕微鏡的）に
おいても可成シ広範囲にわたる可能性を提供する。例え
ばビオチンヌクレオチドは細胞によって、もしくは粗細
胞抽出物による合成過程中に存するポリヌクレオチドの
中に導びかれることが出来、かくして発生期（成長期）
のポリヌクレオチド鎖を検出および／または単離するこ
とを可能ならしめる。とのような手順はいかなる直接化
学的変性方法によってもすることが不可能である。
更に、酵素は例えばビオチンのよう々プローブをポリヌ
クレオチド中の高度に選択性のある、または位置特性の
ある配性の中へ導入するための試薬として用いられるこ
とが出来る。同様なプローブ変性生成物の化学的合成は
どうみても達成することが甚だ困難であろう。
ビオチンもしくはイミノビオチンを含むヌクレオチドの
合成は以下に記述される実施例において詳しく述べられ
るようＫして達成される。
Ｃ−５炭素原子に結びついているこれらプローブのいづ
れかを含むビオチンヌクレオチドは原始核もしくは真生
核の両方に起因する精製された核酸ポリメラーゼの種々
なものに対して優れた基質として役立つ。これらはＥ、
Ｃｏ１１のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージ
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ネヅミ（Ａ−９）およびヒ）
　（ＨｅＬａ　）細胞からのＤＮＡポリメラーゼαおよ
びβ、そしてヘルペス単純ウィルスのＤＮＡポリメラー
ゼを含む。確認データはリグビイ等のニック転換条件（
Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、　！ｊグピイ。
Ｍ、　ティックマン、Ｃ，ローデスおよヒＰ、ハーグ、
分子生物学雑誌、１１３，２３７，１９７７、）もしく
はバーガイノン等によって述べられている間隙充填反応
（Ｇ、Ｊ、バーガイノン、Ｐ、Ｊ。
タラターサルおよびり、　Ｃ，ワード、ウィルス学雑誌
、２０，２９０，１９７６、）のいづれかを用いること
により、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼについて
得られた。Ｂｉｏ−ｄＵＴＰまたはミラー等の方法（Ｍ
、　Ｒ，ミラー、Ｊ、Ｃ，キャステロッ）　、　Ｊｒ−
およびＡ、　　Ｂ、バーディ、細胞研究速報、１２０，
４２１．１９７９．）によるリソレチンを用いた処理に
よって透過されたＣＨＯ細胞においても、そしてヘルペ
ス単純ウィルス感染ＢＨＫ細胞から調製された核複製シ
ステムにおいてもポリメラーゼ基質として機能すること
が見出されている。ビオチン化リボヌクレオシドトリホ
スフェイトはＥ−ｃｏｌＬおよびバクテリオファージＴ
７のＲＮＡポリメラーゼに対する基質として機能するこ
とが見出されたけれども、これらのデオキシリボヌクレ
オチドトリホスフェイト相当物と同様な利用効率はない
。事実、それらは実験せられる真生核ＲＮＡポリメラー
ゼ（ＨｅＬａ細胞Ｒ細胞ＲＮＡポリメラーゼ中胸腺ＲＮ
Ａポリメラーゼしおよびマウス細胞ＲＮＡポリメラーゼ
Ｉ）によって多少なυとも不完全に取入れられる。この
基質機能の限定された範囲はいくらかの生体的もしくは
試験的な転写研究において有用性を限定するのであるが
、ピオチン標識付けされたＲＮＡプローブはＤＮＡ鋳型
からＥ、　ｃｏｌｔもしくはＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ
を用いて、もしくは例えばビオチン化−ｐＣｐのような
化合物と共にＲＮＡリガーゼを用いる末端ラベル付は方
法によって酵素的に調製され得る０ＵＴＰのＡＡ−およ
びＮＡＧＥ誘導体はしかしながら上記の真正核ＲＮＡポ
リメラーゼに対する基質である。これら類似物に対する
抗体の有効性によれば、免疫学的もしくは親和力方法に
よる発生期転写の単離は実行可能である。
ビオチンもしくはイミノビオチン置換体を含むヌクレオ
チドの酵素的重合はこれらのプローブのいづれもが放射
性ラベル付けられてはいないので直接に監視されない。
しかしながら実験的証拠の二つの系列は明らかにビオチ
ン化ヌクレオチドが取入れられたことを示している。第
一はビオチンヌクレオチドの存在において合成されるポ
リヌクレオチドはアビヂンもしくはストレプトアビチン
親和性カラムでクロマトグラフした時、選択的に保持さ
れていることである。
（第１および１表）。例えば　Ｐ−ｄＡＭＰでニック転
換された正常ＤＮＡは０．５Ｍ　ＮａＣ１の添加におい
て定量的に流出するのに、ビオチン化ＤＮＡもしくはイ
ミノビオチン化ＤＮＡの膨大な量が高濃度塩、尿素、グ
アニヂン−ＭＣＩ　　。
ホルムアミド、もしくは５０　ｍＭ　ＮａＯＨによる長
時間の洗滌の後ですらもレジンに結合して残っている。
これら洗滌条件によって流出される放射性ラベルの小フ
ラクションは二度目にレジンに対して適用された時には
保持されず、放射性がビオチン置換の行われていないＤ
ＮＡ断片と結合されていることを暗示する。証拠の第二
の系列は精製アンチ−ビオチンＩｇＧｓ次いでホルマリ
ン固定されたスタフィロコッカス　アウレウスによって
処理された時、ビオチンラベルされたポリヌクレオチド
のみが免疫沈澱されることである（第■表）０ビオチン
の極めて少量がこの方法によって検知されることはこれ
ら表中のデータから明らかである。これら結果はまたも
し抗体結合もしくはアビテン親和力方法が交配手法を用
いるプローブ検出において有用であればピオチン分子は
アビヂン、ストレプトアビヂン、もしくは固有の抗体に
よって認められることが出来る一方、ＤＮＡはいまだそ
の本来の、二重螺旋構造形能、即ち絶対的に本質的な条
件下にある。
第１表 アビテン−セファローズ上のビオチン 化ＤＮＡの選択的保持性 ０．２Ｍ　ＮａＣ１ （１）　　０．５ＭＮａＣ１１０００，１（２）　　１
．０Ｍ　　ＮａＣ１９９，７＜０．０１（３）　８　Ｍ
尿素　　　１００　　　＜０．０１（４）　　６　　Ｍ
　　グアニヂンーＨＣＩ　　　　　９５，２　　　　　
　＜０．０１（５）９９　　％　ホルムアルデヒド　　
　　　９４．７　　　　　　＜０．０１（６）２ｍＭ　
　ビオチン　　　　　　　　　９７．６　　　　　　＜
０．０１（力５０ｍＭ　ＮａＯＨ８９Ｂ　　　　　　＜
０．０１第五表 化ＤＮＡの親和クロマトグラフ ５０ｍＭＮａＣ１Ｏ，８１００９９，７（１）　　０１
　？ｗＩＮａＣ１＜０．１　　　１００　　　９９．７
（２１１［ＭＮａＣｌ　　　　−＜ｏ、ｏｉ　　　　ｉ
ｏｏ　　　　９９．４（３）　８　Ｍ尿素　　＜０．０
１　　９７．５　９８．５（４１６ＭグηリシーＨＣＩ
　　＜０．０１　　　９７．０　　９７．０２ｍＭ　　
ビオチン 第■表 に議ＢＩＯ−ＤＮＡの選択的免疫沈澱 Ｔ−ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　７０　　４８６
７Ｔ−ＤＮＡ　　　　抗−）９オＩｇＧ　　　　　８７
　　　５１９７Ｔ−ＤＮＡ　　　　非免疫　　ＩｇＧ　
　　　　５ｓ　　　　５１０７ノ毫イオーＤＮＡ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５３　
　　　　３８８６ノ匂オーＤＮＡ　　抗−ノＡオ　Ｉｇ
Ｇ　　　３３４７　　　　７３６パイオーＤＮＡ　　　
非免疫　　ＩｇＧ　　　　　６０　　　３９００＊Ｎ、
Ｔ、　　　　ＰＢＲ−３２２ＤＮＡ、　　　３２Ｐ−ラ
ー０しｌチ　ビオチン置換体 相対活性　２Ｘ１０７ｃｐｍ／’μｇ ビオテΔ突出０．００１−０．０１ピコモルかくして構
造式 ここにＢ　、　Ｂ’、およびＢの各々は糖部分の０１′
−位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
たはピリミジン部分を表わし、Ｂ　、　Ｂ’、またはＢ
′のいづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合
は該プリンまたはデアザプリンのＮ−位置に存し、Ｂ、
Ｂ′、またはＢ′のいづれかがピリミジンの時、該結合
はＮ１−位置に存するものと規定せられ、Ａは本化合物
が対をなすリボ核酸またはデオキシリポ核酸分子によっ
て形成される二重螺旋構造の中に取入れられた時、ポリ
ペプチドと共に検知され得る錯体を形成することの出来
ることも３個の炭素原子からなる部分を表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
ジ／であれば該化学鎖はピリミジンの５−位置に存する
ものと規定せられ、 ２はＨ−またはＨＯ−を表わし、 セしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
わす。
を有する新規な化合物を調製することが可能である。
勿論、その場合には該化合物は単に前述したように変性
ヌクレオチドになるから、一般的にはｍおよびｎは同時
に０ではないことは容易に理解せられるべきことである
。一般的にＢ′およびＢ′は同じオリゴ−もしくはポリ
ヌクレオチドの中にあって変化し、夫々ウラシル、シト
シン。
チミン、グアニン、アデニン等となる。また一般的に、
該変化はよく知られている遺伝コードによるペプチド合
成に対するコードを行うヌクレオチドの整列された連鎖
に一致するだろう。
しかしながら、示される該構造はまたもし本発明により
て核酸が変性されることのみであれば、子牛胸腺Ｄ　Ｎ
　Ａ　＊　Ｅ−ｃｏｌ　１もしくはイーストのＲＮＡ、
バクテリオファージＲＮＡおよびＤＮＡ（Ｒ１７、ｆｄ
　）、動物ｆｙペイルｔ、’（ＳＶ４０ＤＮＡ）、染色
体ＤＮＡ等のみならず、例えばポリｃ、ボＪｕｔポリｒ
（Ａ−Ｕ）およびポリｄ（Ａ−Ｕ）のようなポリヌクレ
オチドをも包含することを留意すべきである。
該構造は例えば２から３０の変性ヌクレオチドからなる
オリゴマーもしくはポリマー中に存在する一つ以上の変
性ヌクレオチドを含むこともまた理解されるべきである
。この配慮における重大な因子は変性の数があまり大で
はないのでポリヌクレオチドは意図された用途には効果
がないことである。
最後に変性オリゴ−およびポリヌクレオチドは合同して
末端基が相溶性もしくは反応性を与えられる限りにおい
て同一構造を有するよシ長い実体を形成し得ることは理
解せられるべきである。
これら化合物は適当な条件下で合成を指揮する核酸鋳型
の存在下において適当な核酸、特にヌクレオチドトリホ
スフェイトの酵素的重合によって造られ得る。このよう
な条件は用いられる酵素、存在するヌクレオチドの量、
そしてその他の変数によって広く変化する。酵素の実例
はＥ、ｃｏｌｉＯＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファ
ージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、ネズミおよびヒト（Ｈｅ
ｌａ）細胞からのＤＮＡポリメラーゼαおよびβ、ヘル
ペス単純ウィルスからのＤＮＡポリメラーゼｅ　Ｅ−ｅ
　ｏ　ｌ　ｉのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファー
ジＴ７のＲＮＡポリメラーゼ＋Ｈｅ１ａ細胞ＲＮＡポリ
メラーゼ■。
子牛胸腺ＲＮＡポリメラーゼ１１およびマウス細胞ＲＮ
ＡポリメラーゼＩを含む真生核ＲＮＡを含むものである
。
また該化合物はオリゴ−もしくはポリヌクレオチドを末
端付加して付加が５′もしくは３′位置に行われるかど
うかＫよってｍもしくはｎが０である化合物を形成する
ことによって調製せられることが出来る０更に塩基がビ
オチン化されている例えばｐＣｐもしくはｐＵｐのよう
表化合物は酵素ＲＮＡＩＪガーゼを用いて目下の分子に
付加され得る。
変性オリゴ−およびポリヌクレオチドはまた前記した個
々のヌクレオチドの変性のための方法を目下のオリゴ−
もしくはポリヌクレオチドの化学的変性によりても調製
され得る。
本発明の種々な変性ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
、ｂよびポリヌクレオチドはもし該ポリペプチドが一つ
の錯体もしくは複数個の錯体が形成される時に一般的に
通常の検出手法によって検出され得る一個もしくはそれ
以上の部分を含んでいるとすれば適尚な条件下で該化合
物をそれらと錯体を形成し得るポリペプチドと接触させ
て錯体を形成させることによって検出されるであろう。
ビオチン型プローブに対する一つのポリペプチド検出子
はアビヂンである。アビヂンービオチン相互作用は自然
にみられる最とも強固な非共有結合定数（Ｋｄｉｓ＝１
０＝１５）の一つを示す。もしアビヂンが例えば螢光染
料（フルオロセイン。
ローダミン）、高電子密度試薬（フェリチン。
ヘモシアニン、金コロイド）もしくは不溶性反応生成物
を沈積し得るひ素のような潜在的に明瞭な指示分子と結
合されたならばビオチングローブの位置的および／また
は量的存在は設定せられるであろう。
アピヂンは下車にも核酸もしくはクロマチン物質と連絡
せられて用いられる時、ビオチン−指示蛋白質としては
余シ望ましくなくなる一つの性質を有している。アピヂ
ンが濃縮クロマチンもしくは核酸の大量を含む副細胞区
画に対してビオチン結合性質から独立した様式で強固に
結合することは報告されている（Ｍ、Ｈ，ヘゲネス、染
色技術−，５２，１６５，１９７７；Ｍ、Ｈ−ヘグネス
およびＪ、　Ｆ、アシュ、細胞生物学雑誌。
７３、７８３．１９７７；　Ｅ、　Ａ、ベーヤーおよび
Ｍ、ウィルテエク、生物学分析の手法２６．１．１９８
０．）アビヂンは１０．５のｐＩを有する塩基性蛋白質
であるから、そのヒストン様特性またはその炭水化物部
分はこれら観察される非特定相互作用に対して最とも責
任がありそうである。
ビオチン含有ヌクレオチドおよびその誘導体に対する望
ましいプローブは土壌菌、ストレプトミセス、アビヂン
によって合成されたアビチン様蛋白であるストレプトア
ビヂンである。その調製と精製はホフマン等、自然科学
学会誌。
７７、４６６６（１９８０）Ｋ記載されている。ストレ
プトアビヂンはより低いｐＩ（５，０）を有し、グリコ
ジル化されておらず、そしてアビヂンよシもＤＮＡに対
するよシ非常に低い非特定結合性を示し、そしてそれ故
に核酸検出方法論を含む応用において潜在的な利点を提
供する。
ビオチン様グローブ検出に対する最も望ましい蛋白質は
単一特定ラビットＩｇＧ、アンビチオチン免疫グロブリ
ンである。この化合物は前述のように（Ｍ、バーガー、
酵素学における手法、　６２．３１９　ｒ１９７９Ｊ　
）、ビオチンとウシ科血清アルブミン変性ビオチンによ
って免疫化されたラビットによって調製せられ、そして
親和性クロマトグラフによって精製せられる。免疫グロ
ブリン−ハプテンの会合定数はアビヂンービオチン錯体
に対してよシも可成シ低いＫａｓｓｎ（１０６から１０
”）値を有するけれども、それらはアビヂンーイミノビ
オチン錯体で観察される値と略等しい０更にアンチ−ビ
オチン抗体はもしあったとしても抗体とクロマチン物質
との非特定結合は僅かしか起らないので生体内原位置交
配による染色体上の特定ポリヌクレオチド連鎚の検出に
おいて非常に有用であることが証明されている。
本発明の変性ポリヌクレオチドは交配プローブとしてこ
れらの使用に適合する売件下において変質および回復の
能力を有する。熱的変質の様相といくらかのビオチン置
換ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーの交配特性の分析は明ら
かにこれを示す。例えば、ニック転換を行なってキロペ
ースに対して約１０〜１００ビオチン残渣を導入したｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡもしくはλＤＮＡは対照のビオチンを
含まないＤＮＡのＴｒｎ値と本質的に同一であるＴｍ値
を有する。更Ｋ　３２ｐ−ラベルされたビオチン置換体
ｐＢＲ３２２ＤＮＡはプラスミドを含むバクテリア群の
検出に対する交配プループとして用いられた時、対照で
あるチミヂン含有ＤＮＡと同様な程度の特性および自動
放射線記録信号強度を示した。
一本の糸（５ｋｂＫ対して全体で１２５０）におけるす
べてのチミヂン残渣がビオチン化ヌクレオチドによりて
置き換えられる例えばＭＶＰＲＦ　　ＤＮＡのようなり
ＮＡ複合体においては、該Ｔｍは置換されていない対照
のそれよりも小さくたった５℃である。各々の塩基対が
一つのｂｉｏ−ｄＵＭＰ残渣を含んでいるポリｄ（Ａ−
ｂｉｏＵ）のＴｍはポリａ（Ａ−Ｔ）対照よシも低い１
５℃であるけれども、変性および回復の両方の間に観察
せられる協調性の度合および紫外線吸収性の範囲は該二
つのポリマーに対するものと同じである。ＲＮＡ複合体
とＤＮＡ／ＲＮＡ交配体の平行分析はこれらのＴｍの値
がポリマーのビオチン含有量の増加にともなってまた減
少すると言うことを示している。しかしながらビオチン
分子の実質的な数がポリマーの交配特性を顕著に変える
ことなく導入されることが出来ることは明らかである。
これらの結果はビオチン置換ポリヌクレオチドが染色体
、固定細胞において特定のポリヌクレオチド連鎖を検出
および／ｌたは位置決めするためのプローブとして用い
られ得るのであろうことを強く示唆するものである。ビ
オチン置換プローブを検出する丸めの一般的な原案は以
下に図示される。
生体内原位置群もしくは北方／南方交配方法による坑グ
ローブ連鎖 ３１　　出　　　１）不溶性パーオキシダーイ生成物：
ＤＡＢ２）抗体サンドイッチ寸法 この一般的な図は遺伝子地図（細胞遺伝学的）および組
換えＤＮＡ手法に対して用いられた手順のみを説明する
ものである。しかしながら臨床試料におけるバクテリア
、ウィルス、菌、もしくは寄生源の核酸連鎖の検出に対
してそれは同様都合よく適用され得、そしてこれは放射
性同位元素の使用に依存しない臨床診断に対する有力が
新らしい方法の基礎を形成する。
ビオチンの検出に対する免疫学的および組織化学的方法
は該基礎的方法が生体内インジフツ交配の遺伝子地図を
作成す石迅速な方法および汚染交配方法による特定核酸
連鎖の検出のための非放射能性手順のために使用可能で
あることを示している。用途は新らしい臨床診断手順の
開発におけるこの手法からなるものである。
この方法を用いれば、特定デオキシリボ核酸またはリボ
核酸−分子、特に例えばバクテリア、菌。
ウィルス、イーストもしくは哺乳類から誘導される分子
の存在を測定することが可能である。これは患者もしく
はその他の被検体における核酸含有病因の順次の診断を
可能ならしめる。
更に抗体耐性を測定することはバクテリアのスクリーニ
ングに対する方法を提供する。かくして、例えば、スト
レプトコッカス　ピオゲネスもしくはネイセリス　メニ
ンギチディスにおけるペニシリン耐性、スタフィロコッ
カス　アウレウス、カンヂダ　アルビカンス、ブシュ−
トモナス　アエルギノザ、ストレプトコフカス　ビオゲ
ネシスもしくはネイセリア　ゴノロエアエにおけるテト
ラサイクリン耐性、およびミコバクテリウム　テエバキ
エロシスにおけるアミノグリコシド耐性は測定されるこ
とが出来るのである。
これらの方法においては、生物もしくはその抗生物質耐
性を特徴づける核酸鎖と対をなす。そして更に本発明に
よる変性核酸の一つもしくはそれ以上を含むポリヌクレ
オチドが調製される。このポリヌクレオチドは精査下に
おいて生物から得られた核酸によって交配される。交配
のための欠陥は生物もしくは耐性特性の不在を示す。
交配された核酸複合体はそれから該複合体と検出可能な
部分を担持する適当なポリペプチドとの錯体を形成し、
そして適当な検出手法を使用して該錯体の存在を検出す
ることによって識別される。
陽性検出は錯体、複合体、そしてそれ故に関心のある核
酸鎖が存在することを示す。
この方法は例えばサラセミアおよび鎌状細胞貧血症のよ
うな遺伝的欠陥の診断に拡張され得る。
その存在もしくは不存在が該欠陥と関連している（サラ
セミアの場合）デオキシリボヌクレオチド酸遺伝子鎖は
適当な検出可能なポリヌクレオチドによる錯体形成に基
づく本発明によるポリヌクレオチドプローブとの下記の
交配によって検出されることが出来る。
遺伝子の地図を作成することもしくは染色体上の特定の
位置に封子るこれらの転写は細胞融合や体細胞遺伝の手
法を主として含む冗長な時間を消費する仕事であった。
生体内インジヮツ交配は例えばドロソフィラのような染
色体ポリテン化を受ける種において、−重複写遺伝子連
鎖の地図を作成するためには首尾よく用いられて来たけ
れども、大部分のよシ高度表真生核染色体における特有
の連鎖遺伝子の検出は例え不可能ではないＫしても標準
交配方法を用いては著るしく困難であった。
非常に高度に特定されている放射性のポリヌクレオチド
プローブが交配位置の自動放射能記録位置決めを容易に
するための必要性はまた探査子の急速な放射性分解と、
銀粒状沈澱物の背後ノイズにおける付随的な増加を招来
する。低度から中度の特定放射性を有す為交配プローブ
の使用は例えばリボゾームＲＮＡ遺伝子もしくは衛星Ｄ
ＮＡのような多重複写連鎖を検出する場合でさえも、多
くの日数もしくは週にわたる露出時間を必要とする。
組換えＤＮＡ手法は真生核細胞中に見出される殆んどす
べての一重複写連鎖の分子クローン化を実行可能してい
るから、かようなりローン化された遺伝的断片の染色体
起源の地図を作成するための迅速なそして鋭敏な方法を
有することは非常に有益々ことである。
変性ヌクレオチドは放射性同位元素の使用を回避する生
体内インジフツ交配による遺伝子地図の作成において用
いられるであろう。この手順はＤＮＡプローブの中ヘニ
フク転換によって酵素的に取入れられ得るビオチンを含
むチミヂン類似物を利用する。生体内原位置交配の後、
ビオチン分子は精製されたラビットアンチ−ビオチン抗
体の親和力のための抗原として役立つ。フルオレセイン
標識付されたヒツジのアンチ−ラビットＩｇＧと共に形
成される免疫螢光抗体サンドイッチは緑−黄バンドとし
てクローン化された遺伝子連鎖の迅速なそして明確な細
胞遺伝学的位置決めを準備する。この方法は生体内原位
置遺伝子位置決めの通常の自動放射能記録方法に比して
よシ少ない背後ノイズ、バンド間の分解能力の向上、プ
ローブ交配の位置測定Ｋｌ！する時間の短縮、そして化
学的に安定な交配プローブという四つの主な利点を提供
する。この方法はドロンフイラ　ミラツガスターのポリ
テン染色体およびマウス中期染色体上の衛星ＤＮＡにお
ける反復されたそして独特なりＮＡ鎖の位置決めに対し
て首尾よく適用されて来た。
かくしてポリテン染色体が生体内原位置遺伝子地図作成
に対する間接的免疫螢光性によって検出されるのである
が、本発明による変性ヌクレオチドを用いたプローブの
効能を証明するだめの試験システムとして用いられるこ
とが出来ると云うことは見出されている。該プローブは
例えば約５から約２２キロベースの範囲の大きさの挿入
によるプラスミドベクトルの中におけるクローン化され
たｔ　ＲＮＡ遺伝子のようなオツトー　シュミットおよ
びディーター　ゼルから得られたクローン化ドロソフィ
ラ連鎖の変種を含んでいた。これらクローンの多くのも
のは既に放射性同位元素を用いた通常の生体内インジフ
ッ交配方法によってドロンフイラ染色体地図上に特有な
バンドを割当てられている。
ＤＮＡプローブはＢｉｏ　−ｄＵＴＰの存在下において
二重り転換せしめられた。時々３ＨｄＡＴＰおよび／ま
たは３）１ｄＣＴＰが該二フク転換反応混合液中和含ま
れた。このことは単−染色体広がり上の連鎖の自動放射
能記録的および免疫螢光的の双方の位置決めを可能和す
る。生体内インジフッ交配はＭ。
Ｌ、パーリエク、およびＪ、　Ｇ、ガール、細胞生物学
における手法、　１０　、１（１９７５）中に記載され
たと同様に遂行された。交配されていないプローブを除
去するための最後の２ＸＳＳＣ洗滌の後、スライドはＰ
ＢＳ（燐酸で緩衝化された塩類）です＼かれ、そしてＰ
ＢＳおよび１０ｎｌｊｒ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ中の２．５
μｇ／ｍｌラビットアンチービオチンと共に３７℃２〜
１６時間詳置された。装れにつづいて該スライドはＦＩ
ＴＣ標識付標識札たヒツジアンチ−ラビットＩｇＧ（マ
イルス研究所、ＰＢＳおよび１０ｍｇ／ｍｌ　　ＢＳＡ
中１：１００に希釈されてい６．８ν□〜４．間ゎユヶ
れえ。３７，２ユ　ツルーは屡々螢光照明によって染色
体を見るために赤色遊着色剤として必要とせられる。
夫々５ｋｂと２２ｋｂ挿入を含むプラスミドｐＢＲ１７
Ｄとｐｐｗ　５３９がこの方法によって交配された時、
交配のパターンは広がりから広がりへ再現され、そして
与えられたスライド上に染色体拡がシの９０係以上が明
瞭に観察されることが見出された。
クローン化されている置換可能要素ｐＡｃ１０４はドロ
ンフィラゲノムに沿りて多くの位置に地図を形成するも
のとして知られている。このプローブの生体内インジフ
ッ交配によって得られた自動放射能記録と螢光写真の比
較はこの方法の大きな利点、即ち銀粒の拡散地域が自動
放射能記録上に現われる所に二重または一連のバンドが
免疫螢光標識付けによって識別出来るということを示す
。
この方法の他の直ちに明らかな利点は間接免疫螢光によ
ってなされるべき遺伝子指定に必要とされる時間におけ
る著じるしい短縮である。特定バンドに対するＤＮＡ断
片の指定は６時間の交配の範囲でなされることが出来る
。これは自動放射能記録露出方法に必要とされる数日閲
もしくは数週間と比べれば明らかである。この要因は分
解能の向上と合わせて間接免疫螢光によって検出される
変性ヌクレオチドの使用をこれよシ従前の方法に比して
直接より望ましいものとしているのである。
この免疫学的方法はまた衛星ＤＮＡがマウス中期染色体
の動原体領域の地図を作成したところの哺乳類染色体を
動かすことが示されている。該結果はヒトおよびその他
の哺乳類からの染色体中の単一複写（独特）連鎖のため
の単一遺伝子地図作成手順の開発に対する基礎を提供す
る。かよう力手順は染色体の遺伝的構成についての我々
の理解を極めて容易にしそして臨床細胞遺伝的診断をよ
υ迅速かつ実際化するのである。
染色体拡がシがラビットアンチ−ビオチンＩｇＧと共に
交配の後に注目される単一段階１抗体サントイフチ′方
法は成功はするであろうが、この原案は明確々遺伝子指
定のために充分な螢光を発しない。しかしながら、ラム
等（１９７２）　、フォシー等（１９７４）によって記
述された１ハプテン−抗体サンドイッチ手法′を用いる
ことによってよυ強力な螢光的信号が得られることが出
来る。この手順においては第一次抗体、我々の場合は単
一種的。
即ちラビリト　アンチ−ビオチンＩｇＧは望ましくは免
疫グロブリンが一つの抗原親和性カラム（ビオチン−セ
ファローズＴＭ）に結びついている間＆Ｃ例、ｔば２．
４−ジニトロフルオロベンゼンのようなハプテン化試薬
によって化学的に変性される。１５〜２０だけのハプテ
ン（ＤＮＰ）グループが親和性もしくは特性を抱束して
いるその抗原を減少することなくして第一次抗体に結合
されることが出来る（ワレースおよびフォシー、　１９
７９）　。
該試験試料の第一次抗体処理に続いて螢光標識付けされ
たアンチ−ＩｇＧよシもむしろ螢光標識付けされたアン
チ−ハプテンＩｇＣ抗体と共に養生が行われるならば、
螢光信号における５から７倍の増加が得られることが出
来る。また単一種的ギニアビッグ　アンチ−ＤＮＰＩｇ
Ｇが利用出来るので、我々はこの第二次抗体をビオチン
でハプテン化しかくして二つのアンチーハプテンエｇＧ
集団、ＤＮＰ−標識付けされたアンチービオチンエｇＧ
とビオチン標識付けされたアンチ−ＤＮＰＩｇＧとを作
ることが出来る。もしこれらがハプテン−抗体サンドイ
ッチを行なうために交互に用いられ、そしてそれから多
くの哺乳動物種からのＩｇＧ分子に固有的に結びついて
いるスタフィロコッカス。
アウレウスからの螢光標識付けされた蛋白質入に従かわ
れるならば、それは付随の有用性と共に第一次抗体信号
の英文な増幅を結果として生ずる。
ストレプトミセス　アビヂンからの蛋白質ストレプトミ
セスンは結合された可視化システム〔例えば螢光プロー
ブ（上〕もしくは組織化学試薬（下）〕を交配されたビ
オチン含有ポリヌクレオチドの位置に対して固有的に指
向を行なうための乗物として可能性ある選択物である。
アンチ−ビオチンＩｇＧに対してストレプトアビヂンが
優る一つの点はハプテン−ＩｇＧ相互作用の会合常数が
１０７から１０　であるのに対してビオチンに対するそ
れの親和性はＫａｓｓｎ＝１０１５であることである。
迅速な反応速度と英文な親和性はビオチン化されたプロ
ーブの位置決めに要する時間が免疫学的試薬における時
間単位に対してストレプト　アビヂンにおいては分単位
になることであろう。
ストレプト　アビヂン検出システムの最初の評価は現在
進行中である。ビオチン化ＤＮＡ探査子と交配されたポ
リテン染色体はストレプトアビヂンと共に郷量せられ、
次いでビオチンおよびＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ，ビオチン化
−ＢＳＡ）で二重に標識付けされたウシ血清アルブミン
と共に後装置されるであろう。四つのストレプトアビヂ
ン亜単位のうちの只一つだけが各々のビオチン化ＤＮＡ
位はの結合の中に含まれることが可能であると思われる
から、一つの標識付され九ＢＳＡ分子が該ストレブトア
ビヂンービオチン化ヌクレオチド錯体のうちの残存する
三つの非共役並単位の各々と結合することが出来る可能
性を有する。この単一ストレプトアビヂン＋ＦＩＴＣ、
ビオチン化ＢＳＡからの螢光信号は先に述べた基礎の４
抗体サンドイッチ方法′を用いて対照と比較されるであ
ろう。
もし１抗体サンドイッチ′とストレブトアビヂン＋ＦＩ
ＴＣ、ビオチン化ＢＳＡ検出強度が比較出来るならば、
ストレブトアビヂン＋ＦＩＴＣ，ビオチン化−ＢＳＡシ
ステムは多Ｍ′″ハプテンー抗体すンドイッチ′方法と
匹敵する様式で単一複写の複写感度に迄高めることが企
てられ得る。ＢＳＡ上のビオチン基のいくらかのものは
ストレプトアビヂンの第一層には結合されていないので
、ストレプトアピヂンの第二層は充分な信号が得られる
まで付加されることが出来る。例えばもし第二層におい
て只二つのストレプトアビヂンプロモーターが第一層Ｂ
ＳＡの各々と結合しそしてこれらストレプトアビヂンプ
ロモーターの各々が三つのＦＩＴＣ−ビオチン化ＢＳＡ
分子と結合するならば、第二層強度は第一層からのそれ
の二倍になυ、第三ＷＩＫ対しては化学全論的に結合し
ている類似物と共に螢光強度は第一層のそれの１２倍に
なシ、それ故に全強度は引続いて加えられる層と共に急
速に増加するであろう。
結び付けられている螢光物質とビオチンプローブの量を
最大にするためＩｃＢｓＡよシもむしろ甲状腺グロブリ
ンのような大きな担体蛋白質が用いられる計画がある。
ビオチンプローブと担体蛋白質との間のよシ長い結合幼
子を用いることはまた必要であろう。よシ長い結合幼子
はビオチン化された螢光性担体分子を各々の非共役スト
レプトアビヂン亜単位に理論的に配達することを分子空
間的１ｃ最適化し、そして該ビオチン化された螢光性担
体と結び付くであろう後続の層におけるストレプトアビ
ヂンプロモーターの数を最大にする。先のように、適当
な対照は螢光プローブとビオチンを有する担体蛋白質の
置換は溶解性および／または非特定結合問題を生じ々い
。
ストレプトアビヂンー担体配達システムはその配達速度
に加えて免疫螢光方式と比べて二つの重大表利点を有す
る。第一に、只二つの蛋白質成分が層形成に必要とされ
るのみである。第二に、只一つの担体蛋白質が変性のた
めに必要であシそしてそれは官能性を維持する必要か々
くまたはビオチン基と同程度の長さの全構造形態でさえ
もストレプトアビヂンに接近し得る。
交配されたプローブを可視化するだめの螢光方法の一つ
の選択されたものは例えばパーオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼのアルカリホスファターゼのような酵素を
可溶性基質を不溶性着色沈澱物に酵素的に転換すること
が光顕微鏡で可視化せしめられ得る交配位置に指向する
ことである。
この手法の重要な利点は組織化学的方法が螢光検出より
も１０から１００倍以上敏感であることである。加うる
に１着色沈澱物は広範囲にわたる光露出によりても色が
あせず、かくして螢光光顕微鏡検査の一般的な欠点を回
避するものである。これら酵素は例えばグルタルアルデ
ヒドのような二官能性試薬を用いるゝハプテンー抗体サ
ンドイウチ′手法において、またパーオキシダーゼの場
合はパーオキシダーゼ炭水化物部分をアルデヒドに酸化
しそしてこれらの残渣を所望の蛋白質のＣ−アミノ基と
結合することによって螢光プローブの代りだ最終的な抗
体に結合せしめられ得る。ストレプトアビヂンービオチ
ン化担体蛋白質方法に対しては、それと結合されるビオ
チン基を有する酵素は螢光的にビオチン化された担体シ
ステムを置き代えることが出来た。交互に該酵素はビオ
チン化されたＢＳＡもしくは甲状腺グロブリンを用いて
先の層の中に形成されたストレブトアビヂン位置の増幅
をともなってビオチンによってストレブトアビヂンの最
後の層に結合され得た。我々は必要な組織化学的試薬お
よび生体内原位置交配を背後問題なくして可視化するた
めの適当な基質／不溶解生成物結合体の開発に間もなく
着手するであろう。
信号増幅に対する組織化学的研究はそれ故に１９８１年
の夏に試験の準備がなされるべきである０螢光の非常に
低いレベルを検出および／または推定することはレーザ
および光増感剤からなる現在用いられている像増強物も
しくはシステムを用いることによって可能である。これ
らの方法は個々の光子のレベル程度に低い光の検出を可
能ならしめる。像の例えば各々の映写像である各々の点
が目的物の点によって発せられる光子の数に厳密に比例
する適当なディジタル処理システムによりて、像が形成
されることが出来る。この糧のシステムもしくは細胞の
全部もしくは一部がレーザ光線を通り過ぎて流動する流
動システムを用いて、１００から目視で検出され得る１
０００以上までの間の因子からの螢光物質に対する検出
感度増強が得られることが出来る。この増強は単一複写
遺伝子の螢光を検出するに充分である。
望ましい変性において、アリルアミン結合幼子を介して
ピリミヂン環のＣ−５位置に共有的に結−合されている
ビオチン分子を含むｄＵＴＰおよびＵＴＰ類似物は合成
されている。これらビオチン化−ヌクレオチドは試験管
内でのＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの種々のものに
対する効果的な基質である。ビオチン置換体の低レベル
（５０分子もしくはそれ以下／キロベース）を含んでい
るＤＮＡは直換されていない対照ＤＮＡのそれから区別
することの出来ない変性、再合同、そして交配特性を有
する。
かくして本発明はまた染色体核型形成の方法を提供する
。この方法においては、変性されたポリヌクレオチドが
既知の遺伝子に相当しそして変性ヌクレオチドを含む変
性ポリヌクレオチドが調製される。これらヌクレオチド
は染色体デオキシリボ核酸と交配せられ、生じた複合体
は適当な條件下において適当なポリペプチドと接触せし
められ、錯体を形成する。該ポリヌクレオチドは検出可
能な部分を含み、それ故に該錯体の位置は測定が可能で
あυそして固有な遺伝子の位ｎはそれによりて固定され
る。
本発明の他の実施例はウラシル塩基のいくらかが変性さ
れてプローブを含むポリＵを用いるポリＡ含有連鎖の検
出を含む。更に他の実施例ではＸ。
ｙおよび２のうちの二つが反応せしめられて環状部分 を形成する環状変性ヌクレオチドを含む。
このような環状変性ヌクレオチドはそれから癌もしくは
腫瘍細胞を検出する方法として順次に用いられる細胞表
面上のホルモン受入れ住設の識別のために用いられる。
最後に、腫瘍細胞は本発明によって変性され、例えばα
−胎児蛋白質もしくは癌胚種抗原のようなポリペプチド
の生成に関連するデオキシリボ核酸遺伝子連鎖から合成
され、その存在が特定の腫瘍細胞に対する診断に役立つ
メツセンジャーリボ核酸と対をなすポリヌクレオチドの
調製によりて診断され得る。かくして交配複合体の交配
および検出は腫瘍細胞の検出のための方法を提供する。
以下の実施例は本発明の種々の様相を説明するだめのも
のであるが、「特許請求の範囲」中に記載されるよシも
本発明の技術的範囲をより詳細に如何なる方法において
も制限する意図を有するものではない。
実施例１および２ ビオチン化−ＵＴＰとビオチン化−ｄＵＴＰの合成 （ａ）水銀化ヌクレオチドの調製 ＵＴＰ　（５７０ｍｇ　、　１．０ミリモル）もしくは
ｄＵＴＰ（５５４ｍｇ　、１．０ミリモル）が０．１Ｍ
酢酸ソーダバッファーｐＨ６，０の１００ｍ１溶解され
そして酢酸水銀（１，５９ｇｍ　ｓ　５．０　ミＩＪモ
ル）が添加された。該溶液は５０℃で４時間加熱せられ
、それから氷上で冷却された。塩化リチウム（３９２ｍ
ｇ　Ｃ９、Ｏミ１７モル）が添加せられそして該溶液は
酢酸エチルの等量によって６回抽出せられて過剰のＨｇ
Ｃ１ｚを除去された。該抽出過程の効率は４，４−ヒス
（ジメチルアミノ）−チオベンゾフェノンを用いて有機
層中の水銀イオン濃度を測定することによって監視され
た（Ａ、Ｎ、クリストファー。
アナリスト、９４，３９２（１９６９））。ゾール等（
Ｒ，Ｍ、　Ｋ、ゾール、Ｄ、Ｃ，ワード、　Ｄ、　Ｃ。
リビングストン、およびＥ、マーチン、核酸研究。
２．９１５（１９７５）　　）によって述べられている
ようだ水性溶液の一部分をとってそれをヨウ素化し、そ
の後分光分析を行なうととＫよって測定せられたヌクレ
オチド水銀化の程度は通常９０から１００俤までの間で
あった。水性層中の該ヌクレオチド生成物は酢酸エチル
抽出の間に屡々濁るようになるのであるが、水冷エタノ
ールの３倍量の添加により沈澱せられそして遠心分離に
よって集められた。沈澱物は冷純エタノールで二回、エ
チルエーテルで一回洗滌せられ、そしてそれから風乾せ
られた。かくして調製せられた水銀化ヌクレオチドは更
々る精製を行なうことなくしてアリルアミン−ヌクレオ
チドの合成に用いられる。
（ｂ）アリルアミン−ｄＵＴＰおよびアリルアミン−Ｕ
ＴＰの合成 水銀化ヌクレオチド（段階ａの）はｐ”Ｈ５，０の０．
１Ｍ酢酸ソーダバフファー中に溶解せられそして２０ミ
リモル（２６７ｎｍで２０００Ｄ／ｒｎｌ　）に調節さ
れた。水性酢酸中の酢酸アリルアミンの新らしい２．０
モル溶液が１．５　ｍｌのアリルアミン（１８，３ミリ
モル）を８．５ｍｌの水冷４Ｍ酢酸にゆっくり添加する
ととＫよって調製せられた。中和されたアリルアミンス
トワクの３ｍｊ（６、Ｏミリモル）かヌクレオチド溶液
の２５ｍ１　（０，５ミリモル）に添加された。４ｍｌ
の水中に溶解され九に２ＰｄＣ１４（１６３ｍｇ、０．
５ミリモル）の一つのヌクレオチド相当量が添加せられ
て反応が開始された。パラヂウム塩（アルファーペント
ロン）の添加において１反応容器の壁面に生ずる会名（
ＨｇおよびＰｄ）沈積物によって溶液は次第に黒色に変
化した。１８〜２４時間室温に放散した後、該反応混合
物は０．４５ｍｍ膜フィルタ−（ナルチン）を通して残
存する金属沈澱物の殆んどを除去した。該黄色ｒ液は５
倍に希釈せられＤＥＡＥ　−セフアゾ・？クスＴＭＡ−
２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）の１００ｍ１カラムに適
用された。ｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ソーダの１カラム
容量による洗滌の後、該生成物はｐＨ８〜９の酢酸ソー
ダもしくはｐＨ７，５の重炭酸トリエチルアンモニウム
塩のいづれかの１１線型勾配（０，１〜０．６モル）を
用いて流出せしめられた。所望の生成物は０．３０と０
．３５Ｍ塩の間に流出する主ＵＶ吸収部分中に存在した
。スペクトル分析はこのピークが幾らかの生成物を含ん
でいることを示し、最終的な精製はｐＨ３，３の０．５
　Ｍ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４バツフアー（分析的分離）もし
くはｐＨ４，３の０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム
（予備分離）のいづれかを用いてＰａｒｔｉｓｉｌ　−
ＯＤＳ　２のカラム上での逆層−ＨＰＬＣクロマトグラ
フィーによって行われた。５（３−アミノプロペン−１
−イル）ウリチン（ウリチンのアリルアミンアダクト）
の５′−トリホスフェイトが該ＨＰＬＣカラムから流出
されるべき最後の部分でありそしてこれらはいまだ特性
付けされていないけれども三種の夾雑物から明確に分離
せられた。これらヌクレオチドはプロ゛トロＮＭＲ元素
分析によって（ＡＡ−ｄＵＴＰ（Ｃ１２Ｂ１６　Ｎ３０
１４　Ｐ３Ｎａ４＊　ｌＨ２Ｏ）　：理論値、ｃ、　２
２．９ｉ；ｕ、　２．８８：Ｎ、　６．６８：Ｐ、　１
４．７７゜根拠値、Ｃ，２Ｂ、１０：　Ｈ，２，８５：
Ｎ、　　６．４９ＳＰ。
１４．７５．ＡＡ−ＵＴＰ（Ｃ１２Ｂ１６Ｎ３０１５　
Ｐ３　Ｎａ４・４Ｈ２０）：理論値、　Ｃ２０，６１：
　Ｈ，８，４６：　Ｎ。
６．０１ＳＰ、　１Ｂ、３．根拠値Ｃ，２０，６７：Ｉ
（、４，１１：Ｎ、　５．３９ＳＰ、　１８．５４　）
であるとスペクトル的にそしてクロマトグラフ的に特徴
付けられた。
（ｃ）ＡＡ−ｄＵＴＰ’またはＡＡ−ＵＴＰのビオチン
化ビオチン化−Ｎ−ハイドロキシサクシミドエステル（
ＮＨ８Ｂ）は前述したように（Ｈ，ハイラマンおよヒＦ
、　Ｍ、　　リチャーズ、米国自然科学学会会報、７１
．３５３７（１９７４））ｔ　ビオチン（５１ｇｍｍ　
）から調製せられた。７ＬＡ−ｄＵＴＰ・Ｈ２０（６３
ｍｇ　、　０．１ミリモル）もしくはＡＡ−ＵＴＰ　・
４Ｈ２０（７０ｍｇ、０．１ミリモル）がｐＨ８，５の
０．１Ｍホウ酸ソーダバウファーの２０ｍ１中に溶解せ
られ、セしてジメチルフォルムアルデヒドの２ｍｌ中に
溶解せられ九ＮＨ８Ｂ　（３４，１ｍｇ　ｅＯｏｌ　ミ
’）モル）が添加された。反応混合物は４時間室温に放
置されそしてそれからｐＨ７，５の０．１Ｍ　ＴＥＡＢ
によって予備平衡化されているＤＥＡＥ−セファデウク
スＴＭＡ−２５の３０ｍ１カラム上に直接負荷された。
該カラムはＴＥＡＢの４００ｍ１線型勾配（０，１〜ｌ
１９Ｍ）によって流出された。
０．５５と０．６５Ｍ　ＴＥＡＢ間に流出したビオチン
化−ｄＵＴＰもしくはビオチン化−ＵＴＰを含む区画は
メタノール存在下でロータリーエバポレーションにより
て脱塩せられそして水に再溶解された。時々若干濁った
溶液が得られた。ある種のＴＥＡＢ溶液中の夾雑物の故
であるとの濁りは０．４５ｍｍフィルターを通してｒ遇
することによって除去された。長期間の貯蔵に対しては
、該ヌクレオチドはＤｏｗｅｘ　ＴＭ５０　（Ｎａ”ｍ
　）の存在中で該溶液を短時間攪拌することによってソ
ーダ塩に変換された。濾過の後、該ヌクレオチドは冷エ
タノールの３倍量の添加によって沈澱せしめられ、エチ
ルエーテルで洗滌せられ、水酸化ソーダペレット上で真
空乾燥せられ、そして−２０°Ｃでデシケータ−中にて
貯蔵された。直接の使用に対しては、該ヌクレオチド溶
液はｐＨ７，５のトリス−ＨＣｌ中に２０ｍＭとされそ
して最終ヌクレオチド濃度を５ｍＭに調節される。スト
ック溶液は一２０℃にて凍結貯蔵されるっ ｔｔｂｉｏ−ｄＵＴＰおよびｂｌｏ−ＵＴＰ生成物の元
素分析は次の結果を得る。Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ（Ｃ２２Ｈ
３０Ｎ５０１８　Ｐａ　ＳＩ　Ｎａ４・Ｉ　Ｈ２０）−
理論値；Ｃ，２９，８０：Ｈ，：１１．３８：Ｎ、　７
．８９：Ｐ、　１０．４７：Ｓ。
８．６１．根拠値：　Ｃ，３０，１４Ｈ，８，２２：Ｎ
、　７．６３：Ｐｔ　　１０．３１　：　Ｓｓ　Ｂ、７
０．Ｂｉｏ−ＵＴＰ（Ｃ２ｚＨｓｏ　Ｎ５０１９　Ｐａ
　８１　Ｎａ４　・３　Ｈ２０）　：理論値：　Ｃ，２
９，１５：Ｈ，８，１９：Ｎ、７．４５　：Ｐ、９．８
９　：Ｓ、８．４１゜根拠値：　Ｃ，２８，７６：Ｈ，
８，３５：　Ｎ、　？−６８　Ｓ　Ｐ。
９．８１　：　Ｓ、　　８．３２゜ ｐＨ７，５におけるｂｉｏ−ｄＵＴＰとｂｉｏ−ＵＴＰ
のスペクトル性質〔１ｍｇｗ、２８９ｎｍ（ｇ＝７．１
００）：　１ｍａｘ、２４０ｎｍ（ｇ＝１０．７００）
：λｍｉｎ、２６２ｎｍ　（ε＝４．３００）　）はビ
リミチン環と共役する一つの外環二重結合の存在を反映
している。エタノール性硫酸中のＰ−ジメチルアミノシ
ンナムアルデヒドで処理するビオチン定量分析に用いら
れる方法（Ｄ、Ｂ、マコーミフクおよびＪ、　Ａ、ルー
ス、生化学分析、、　　３４　、３２６　、１９７０　
）を行なった時、これらヌクレオチドはまた強い陽性反
応を示す。しかしながら、これらはもはやＡＡ−ｄＵＴ
ＰおよびＡＡ−ＵＴＰ出発物質の特徴的反応であるニン
ヒドリン反応を示さない。
実施例３および４ ビオチン化−ＣＴＰとビオチン化−ｄＣＴＰの合成ＣＴ
ＰとｄＣＴＰは本質的には実施例１に記述したように（
ａ）水銀化され、（ｂ）アリルアミンと反応せられ、（
ｃ）ＮＨ８−ビオチンでビオチン化された。
ＣＴＰ　（５６，３ｍｇ　、　０．１ミリモル）もしく
はｄＣＴＰ（５９，１ｍｇ　、０．１ミリモル）がｐＨ
５，０の０．１Ｍ酢酸ソーダバッファーの２０　ｍｌ中
に溶解せられそして酢酸水銀（０，１５９ｇｍ　、０．
５ミリモル）が添加された。該溶液は５０°Ｃで４，５
時間加熱せられそれから氷上で冷却せられた。塩化リチ
ウム（３９，２ｍｇ　、　０．９ミリモル）が添加せら
れそして該溶液は酢酸エチルで６回抽出せられた。水性
層中の該ヌクレオチド生成物は冷エタノールの３倍量の
添加によって沈澱せられ、該沈澱物は純エタノール、エ
チルエーテルで洗滌せられ、そしてそれから乾燥せられ
た。これら生成物は夫々ＡＡ−ＣＴＰおよびＡＡ−ｄＣ
ＴＰの合成のために更なる精製を行なうことなくして用
いられた。該水銀化ヌクレオチドはｐＨ５，ｏの０．１
Ｍ酢酸ソーダバッ７ア−の中に溶解せられそして１０ｍ
Ｍ（２７５ｎｍにおいて９２０Ｄ／ｍｌ　）の濃度に調
節せられた。２．０Ｍ酢酸アリルアミンストック（実施
例１に述べたと同様に調製せられた）の０．６　ｍｌ　
（１，２ミリモル）がヌクレオチド溶液（０，１ミリモ
ル）の１０ｍ１に添加せられ次いで１．ＯｒｎｌのＨ２
０に溶解せられたヌクレオチド溶液（０，１ミリモ／’
）　Ｋ２ＰｄＣ１４（３２，６ｍｇ　、　０．１ミリモ
ル）が添加された。室温で２４時間放置した後、該溶液
は０．４５　ｍｍ膜を通して濾過を行ない金属沈澱物を
除去した。該ｒ液は５倍に希釈されそしてｐＨ７，５の
５０ｍＭ　ＴＥＡＢによって予備平衡化されたＤＥＡＥ
−セファデックスＡ−２５の５０ｍ１カラム上に負荷さ
れた。該ヌクレオチド生成物はｐＨ７，５の５００　ｍ
ｌ　線型勾配（０，０５〜０．６Ｍ）の応力によって分
別された。所望の生成物は０．２８と０．３８Ｍ塩の間
に流出する主ＵＶ吸収部分中に存在した。集められた試
料はロータリーエバポレージ１ンによって脱塩せラレ、
ｐＨ４，２に０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中に
溶解され、そして最終的な精製は０．５Ｍ酢酸トリエチ
ルアンモニウムを流出液として用いてＰａｒｔｌａｉｌ
　ＯＤＳ　−２のカラム上でＨＰＬＣクロｆｆトゲラフ
を行うことによって達成せられた。適当な区画が集めら
れ凍結真空乾燥せられ、そして生成物はＨ２０中に溶解
せられた。該ヌクレオチドはＤｏｗｅｘ　ＴＭ５０　（
Ｎａ型）の存在において短時間攪拌することＫよりてＮ
ａ塩に変換せられた。
Ｄｏｗｅｘ　　レジンを除去するためのｒ過後、ヌクレ
オチドは冷エタノールの３倍量の添加によって沈澱せら
れた。該沈澱物はエーテルで洗滌されそしてそれから風
乾せられた。分析結果：　ＡＡ−ｄＣＴＰ（Ｃ１２Ｈ１
７Ｎ４０１３　Ｐ３　Ｎａ４　　・２Ｈ２０）　　；理
論値、　Ｃ，２２，２９；　Ｈ，２，６３；　Ｎ、　８
．６７、　Ｐ　。
１４．４０．根拠値Ｃ，２２，１６；　Ｌ　２．８９；
　Ｎ、　　８．７７；　Ｐ、　１４．１８．　ＡＡ−Ｃ
ＴＰ（Ｃ１２１ｈｒ　　Ｎ４　０１４ＮＪＬ４　・２Ｈ
２０）；理論値Ｃ，２１，７５；　Ｌ　２．５７；Ｎ、
　８．４６；　Ｐ、　１４．０１．根拠値、Ｃ，２２，
０３；Ｉ（。
２．４７；Ｎ、８．６９；Ｐ−１３，８１；　ｐＨ８，
０の０．１Ｍホウ酸塩バッファー中のスペクトル性質、
λｍａｘ３０１　ｎｍ　（ε＝６　ｐ　４００　）　ｅ
　　λｍｉｎ　２７１　　ｒｕｎ　（ｔ＝３．９５０）
λｍａｚ　２５０　ｎｍ（ε＝９，７００）。
ＡＡ−ｄＣＴＰおよびＡＡ−ＣＴＰ（７）双方共に陽性
ニンヒドリン試験を示した。
ＡＡ−ＣＴＰ　（６，６ｍｇ　、　０．０１ミリモル）
もしくはＡＡ−ｄＣＴＰ　（６，４ｍｇ、０．０１ミリ
モル）がｐＨ８，５の０．１Ｍホウ酸ソーダバッファー
の５ｍｌ中に溶解せられ、セしてジメチルホルムアミド
の０．２　ｍｌ中に溶解せられているＮＨ３−ビオチン
（３，４ｍｇ。
０．０１　ミリそル）が添加された。室温で４時間放置
後、該試料はｐＨ７，５のＴＥＡＨの１５０　ｍｌ線厘
勾配（０，１〜０．９Ｍ）を流出液として用いてＤＥＡ
Ｅ−セファデックスＡ−２５の１０ｍ１カラム上でクロ
マトグラフにかけられた。０．５０と０．６０ＭＴＥＡ
Ｂ間に流出したビオチン化−ＣＴＰもしくはビオチン化
−ｄｃＴＰを含む区画は集められ、ロータリーエバポレ
ージ１ンによって脱塩せられ、そしてｐＨ７，５の０．
０２Ｍ）リスー塩酸バッファー中で５ｍＭの最終濃度に
調節された後、−２０″Ｃで凍結された。該生成物はエ
タノール性硫酸中にてｐ−ジメチルアミノシンナムアル
デヒドによってビオチンに対する強い陽性反応を示すが
、ニンヒドリンによるスプレ一時には第一級アミンに対
する陰性反応を示す。これら生成物の更なる構造的特徴
づけは現在進行中である。
実施例５および６ イミノビオチン化−ＵＴＰおよびイミノビオチン化−ｄ
ＵＴＰの合成 イミノビオチンハイドロプロマイトは前述したようにし
てビオチンから調製された（Ｋ、ホフマン、Ｄ、Ｂ、メ
ルビールおよびＶ、　ｄｕ　　ビクニード。
生化学雑誌、１４１，２０７−２１１．１９４１　；　
Ｋ、　　ホフマンおよびＡ、　Ｅ、アキセルロッド、同
上、。
１８７．２９−３３．１９５０）、イミノビオチンのＮ
−ハイドロキシサクシニミド（ＮＨ８）エステルはＮＨ
３−ビオチンの合成のために先に記述された原案（Ｈ，
ハイラマンおよびＦ、　Ｍ、リチャーズ。
米国自然科学学会誌、７１，５５３７．１９７４）を用
いて調製せられた。実施例１（ｂ部）において詳細に説
明されたようにしてＡＡ−ＵＴＰ　（７，０ｍｇ　。
０．０１ミリモル）もしくはＡＡ−ｄＵＴＰ　（６，３
ｍｇ　、　０．０１ミリモル）が調製せられＰＨ８，５
の０．１Ｍホウ酸ソーダパｊファーの５ｍｌ中に溶解せ
られ、ジメチルホルムアミドの（１５ｍｌ中に溶解せら
れたＮＨ３−イミノビオチン（８，５ｍｇ　、　０．０
１ミリモル）が添加された。該反応混合物は室温で１２
時間放置されそしてそれからｐＨ７，５の０．０５Ｍ　
ＴＥＡＢで予備平衡化されたＤＥＡＥ−セファデックス
Ａ−２５の１０ｍ１カラム上に直接負荷された。該カラ
ムはＴＥＡＢの１５０ｍ１線型勾配（０，０５〜０．６
Ｍ　）によッテ流出された。０．３５　、！：　０．４
０Ｍ　ＴＥＡＢ　Ｉ！［流出したイミノビオチン−ＵＴ
Ｐもしくはイミノビオチン−ｄＵＴＰを含む区画はメタ
ノール存在におけるロータリーエバポレーションによっ
て脱塩せらし、Ｈ２Ｏ中に溶解せられた。了りルアミン
ーヌクレオチドアダクトの少量を不純分として含む該生
成物上ニンヒドリン試験において弱い陽性を示した。最
終的な精製はアビチン−セファローズ上の親和性クロマ
トグラフィーによりて行われた。
ｐＨ８，５のホウ酸ソーダバフファー中にて０．ＩＭに
せられた不純生成物の区画はアビジン−セファローズの
５ｍｌカラムに適用されそして同じバフ７ア′−の２５
ｍ１によって洗滌せられた。カラムはそれからｐＨ４，
０の５０ｍＭ酢激ア７モニウムで洗滌せられ、それは鋭
いピークで所望のイミノビオチン−ヌクレオチド生成物
を流出した。該ヌクレオチドは冷エタノールの３倍量の
添加によって沈澱せられ、エチルエーテルで洗滌せられ
、水酸化ソーダペレグト上で真空乾燥せられ、−２０’
Ｃのデシケータ−中で保存せられた。生成物はスペクト
ルおよびクロマトグラフ的性質のみならず元素分析によ
っても特徴付けられた。
実施例７および８ ＮＡＧＥ−ＵＴＰおよびＮＡＧＥ−ｄＵＴＰの合成アリ
ル（３−アミノ−２−７１イドロキシ−ンプロビルエー
テル、　ＮＡＧＦＩ：と省略されるが、アリルグリシジ
ルエーテル（Ａｇｅ）（アルトリフチケミカルカンパニ
ーから得られた）から１！Ｉｌ製せられた。Ａｇｅ（８
４ミリモル）の１０ｍ１が９Ｍ水酸化アンモニウムの５
０　ｍｌにゆりくり（蒸気よけフード中にて）添加され
そして該混合物は６時間室温で放置せしめられた。過剰
のアンモニアが減圧下ロータリーエバポレーションによ
って除去せられて粘ちょうな黄色油を得た。プロトンＮ
ＭＲによるこの生成物の分析はそれが要求せられる構造
を有していることを示した。５−水銀−ｄＵＴＰ　（０
，１ミリモル）もしくは５−水銀−ＵＴＰ（０，２ミリ
モル）がｐＨ５，０の０．２Ｍ酢酢酸ソーダパーツファ
ー２〜４ｍｌ中に溶解され、使用に先立ちｐＨ５，ＯＫ
酢酸で調節され九ＮＡＧＥの１６倍モル過剰量が添加せ
られた。最終的か反応容量（４，３および８．４ｍ１）
は夫々４３および４２　ｍＭのヌクレオチド濃度を有す
る。Ｋ２ＰｄＣ１４の一当量（０，１もしくは０．２ミ
ＩＪモル）が反応を開始するために添加せられた。室温
で１８時間放置の後、該反応混合物は０．４５μｍＭ膜
を通してデ過せられ、該試料は５倍に希釈せられ、そし
て酢酸ソーダの線型勾配（０，１−０，６Ｍ）を用いて
ＤＥＡＥ−セファデツクスＡ−２５のカラム上にクロマ
トグラフされた。ＵＶスペクトルとＰａｒｔｉｓｉｌ　
ＯＤＳ　−２上の特徴的な）ｉＰＬｃ流出様相によって
判定せられるのであるが、所望の生成物を含む区画は集
められ、希釈せられ、そして更にｐＨ８，５の重炭酸ア
ンモニウムの浅薄勾配（０，１〜０．５Ｍ）を用いたＤ
ＥＡＥ−セファデックス上での再クロマトグラフィーに
よって精製せられた。これらの條件下において、該ＮＡ
ＧＥ−ｄＵＴＰ　（またはＮＡＧＥ−ＵＴＰ）の大部分
が残存する不純物からきれいに分離されることが出来た
。
ヌクレオチドが凍結真空乾燥されセしてＤ２０中に再溶
解されたのみにプロトンＮＭＲスペクトルがこの精製の
段階で得られた。元素分析に対して、該生成物はソーダ
塩型に変換された。典型的な分析結果は次の通１）　：
　Ｎａｇｅ　−ｄＵＴＰ　（Ｃ１５Ｈ２２Ｎａ　Ｏｌｓ
　Ｐ３　Ｎａ４　−２Ｈ２０Ｌ理論値、Ｃ９２４，９９
：　Ｈ，８，６３Ｓ　Ｎ、　５．８３　Ｓ　Ｐ、　１２
．８Ｂ、　　根拠値、　Ｃ，２５，３９：Ｈ，８，７１
：Ｎ、　５．６３　：　Ｐ、　１２．８８実旅例９ ラベルされたＤＮＡ鎖の用途 Ｉ核型分頚 （ａ）　　約１００から２００のクローンを人間遺伝子
貯蔵庫から選ぶ。上記のようにしてそれらを標識付けし
、そして各々のクローンについて可視的にもしくは低光
レベルビデオシステムによって交配の位置を決定する。
特有な連鎖遺伝子に相当するこれらクローンに対してこ
れは特殊なヒト染色体中のクローン化されたＤＮＡの位
置を測定する。各々の染色体について幾つかのクローン
を得る。これらラベルされたクローンの各々は特殊が染
色体を識別するために用いられることが出来る。これら
はまた４６個の染色体の各々を２２個の常染色体対の一
つもしくはＸ染色体もしくはＹ染色体であるとして識別
するために結合して用いられ得る。
ラベルされたクローンの一組を染色体と交配せしめるこ
とによって、クローンの該組とそれらの位置とが可視化
され得そして特殊表色で螢光を発するであろう。ラベル
されたクローンの第二組はそれから使用せられて第二螢
光染料と反応せしめられ得る。同様な過程が細口か繰返
えされ得る０かくして、もし所望なれば染色体の各々の
上に異なったしかし固有な位置において細胞ＤＮＡと結
び付けられている螢光ラベルの幾組かを有することが出
来る。これらラベルは可視的もしくはコンピューター化
された自動抜型分類のために用いられることが出来た。
（ｂ）自動核凰分類のために、各々の染色体上のラベル
した位置の数に相当するスボフトの組を見出すことによ
って４６個の染色体の各々の大体の位置はクローンの一
組を用いて識別せられ得る。かくして染色体が更々る分
析にまで手を拡げるに適するかどうかを測定することが
ディジタル化された像のコンピューター分析によって可
能となる。
もしこれらが手を拡げるに適しているならば、各々の上
のラベルされたスボグトの位置および分散によって個々
の染色体の各々を識別することがコンピー−ター分析を
用いて可能となる０螢光スボフトが各々の染色体上の固
有々位置に配置され得ると云う事実を用いて、このよう
な標識のない場合よりははるかに効果的にマニュアルも
しくは自動的な核型分類のいずれかを行なうことが可能
となる。
■遺伝的欠陥の診断 例えば２３番のような特殊な染色体に固有的に結合して
いるクローンを選択することによって、例え染色体が中
期において濃縮されていない場合においてすらも細胞中
の特殊な染色体の複写の数を数えることが可能である。
かくして三倍体染色体２１の胎児期の診断のために胎児
の細胞が得られた時には診断は例え染色体が中期におい
て濃縮されていない場合においてすらもなされ得る。も
し必要とあれば、ラベルの二組、即ち染色体２３に対し
て固有的である一つとそしていくらかの他の染色体に対
する一つとが用いられ得る。異なりた色であろう該二つ
のラベルの比率を各々の細胞Ｋ＞いて測定することによ
って、染色体２３番の異常数を示す細胞を識別すること
が可能である。
この手原は低光レベルビデオシステムによるスライド上
で、またはレーザ賦活を用いる流動チトメーターシステ
ムにおいてのいづれかを用いることが出来る。
Ｉ微生物検出および識別 上記のようなりＮＡの固有鎖のラベル付けは個々のバク
テリアの識別と計数を可能にする。ＤＮＡの特殊断片が
交配されている個々のバクテリアを識別するために、感
度は単一ラベルされた構造が検出される程度でなければ
ならない。これは低光レベルビデオシステムおよび像の
コンピューター総和を用いて、もしくは光像を強化する
ためのいくらかの他の装置を用いて達成され得る。流動
システムはまたもし感度が充分大きくされるならば用い
られ得る。もしスライド上のバクテリアが不動化せられ
るならば、これらの位置は見出されかような螢光スポッ
トの数は数えられることが出来る。これは利用される特
殊クローンで交配され有るＤＮＡを含むこれらバクテリ
アのすべてを計数することを提供するであろう。もしク
ローンが特殊な系列もしくはバクテリアに対して固有で
あるとして選択されるならば、その系列の生物の数が数
えられ得る。加うるに１特殊な遺伝子が識別されている
いかなる抗生物質耐性も抗生物質耐性遺伝子中に含まれ
ているＤＮＡ鎖をプローブとして用いる同様な方法だお
いて特徴付けられることが出来る。加うるに１−個また
はそれ以上の抗生物質耐性遺伝子を含んでいる耐性プラ
スミドに対して固有的である探査子が用いられ得る。個
々のバクテリアに加えて、もしそれらが小さなスポット
中に位置付けせられそれ故にスポット中の交配されたＤ
ＮＡに対して固有な全螢光が測定され得るならば特殊系
列のバクテリア細胞の集団が検出せられそしてそれらの
数が定められ石。この方法においては特殊ＤＮＡ連鎖を
含んでいる生物の数はバクテリアの混合体において測定
され得る。

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の −Ｈｇ＾＋部分と反応し得、そして式・・・Ｎによって
    表わされる化学部分と反応せしめ ること、上記反応は水性溶媒中で、そして Ｋ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下において
    行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアゾプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチドの製造方法。
  2. （２）該適当な条件はｐＨは約１から１４の範囲であり
    、温度は５°から１００℃の範囲であり、そして反応時
    間は約３から２４時間の範囲である「特許請求の範囲（
    １）」に記載の方法。
  3. （３）該水銀塩は酢酸水銀である「特許請求の範囲（１
    ）」に記載の方法。
  4. （４）式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は−Ｃ
    Ｈ＿２＝ＣＨ−ＣＨ＿２−ＮＨ＿２である「特許請求の
    範囲（１）」に記載の方法。
  5. （５）式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は ▲数式、化学式、表等があります▼ である「特許請求の範囲（１）」に記載の方法。
  6. （６）該水性溶媒はバッファーを含む「特許請求の範囲
    （１）」に記載の方法。
  7. （７）該バッファーは酢酸ソーダ、酢酸カリウム、クエ
    ン酸ソーダ、クエン酸カリウム、クエン酸−燐酸カリウ
    ム、トリスアセテート、およびホウ酸−水酸化ソーダか
    らなる「特許請求の範囲（６）」に記載の方法。
  8. （８）該バッファーの濃度は約２．０モル以下である「
    特許請求の範囲（７）」に記載の方法。
  9. （９）段階Ｂにおける該水性溶媒は更に有機溶媒を含む
    「特許請求の範囲（１）」に記載の方法。
  10. （１０）該有機溶媒は水混和性である「特許請求の範囲
    （９）」に記載の方法。
  11. （１１）該有機溶媒はエーテル、アルコール、エステル
    、ケトン、およびアミドからなる「特許請求の範囲（９
    ）」に記載の方法。
  12. （１２）該有機溶媒はメタノール、エタノール、プロパ
    ノール、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ピリジン
    、およびジメチルホルムアミドからなる「特許請求の範
    囲（１１）」に記載の方法。
  13. （１３）Ａはビオチンまたはイノビオチン、そしてＭは
    Ｎ−ハイドロキシサクシミドエステル、イミデート、ア
    ンハイドライド、イソチオシアナート、およびエポキシ
    ドからなる「特許請求の範囲（１）」に記載の方法。
  14. （１４）ＭはＮ−ハイドロキシサクシミドエステルであ
    る「特許請求の範囲（１）」に記載の方法。
  15. （１５）Ｍはイミデート、アンハイドライド、イソチオ
    シアナート、およびエポキシドからなる「特許請求の範
    囲（１）」に記載の方法。
  16. （１６）・・・Ｎはチオール、カルボン酸、エポキシド
    、およびアミンからなる「特許請求の範囲（１）」に記
    載の方法。
  17. （１７）式・・・Ｎで表わされる該化学部分は−ＣＨ＝
    ＣＨ−ＣＨ＿２−ＮＨ−ビオチンである「特許請求の範
    囲（１）」に記載の方法。
  18. （１８）該式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は ▲数式、化学式、表等があります▼ ビオチンである「特許請求の範囲（１）」に記載の方法
    。
  19. （１９）該式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は
    −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＿２−ＮＨ−イミノビオチンである
    「特許請求の範囲（１）」に記載の方法。
  20. （２０）該式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は ▲数式、化学式、表等があります▼ イミノビオチンである「特許請求の範囲（１）」に記載
    の方法。
  21. （２１）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＱはＢ・・・Ａ、Ｂ′、またはＢ″を表わし、そ
    してｘおよびｙのうちの一つは▲数式、化学式、表等が
    あります▼を表わし、ｘおよびｙのうちのその他のもの
    はＨＯ−を表わす。 を有するヌクレオチドトリホスフェイトを核酸鋳型の存
    在下適当な条件下において酵素的に重合せしめて本化合
    物を形成することからなる構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表
    わし、もしＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−
    位置に存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合
    は該デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピ
    リミジンであれば該結合はピリミジンの５−位置に存す
    るものと規定せられ、ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物を製造する方法。
  22. （２２）上記酵素重合は該ヌクレオチドトリホスフェー
    トをＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオフ
    ァージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、ネズミ科動物およびヒ
    ト（ＨｅＬａ）細胞からのＤＮＡポリメラーゼ、ヘルペ
    ス単純ウィルスからのＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌ
    ｉのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ７のＲ
    ＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｌａ細胞ＲＮＡポリメラーゼI
    II、子牛胸腺ＲＮＡポリメラーゼII、およびハツカネヅ
    ミ細胞ＲＮＡポリメラーゼIIを含む真生核ＲＮＡポリメ
    ラーゼからなる群から選ばれた適当な酵素に接触せしめ
    ることからなる「特許請求の範囲（２１）」に記載の方
    法。
  23. （２３）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたは ピリミジン部分を表わし、Ｂがプリンまたは７−デアザ
    プリンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリンのＮ
    ＾９−位置に存し、Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾
    １−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる結合または組を表わし、もしＢ
    がプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存し、
    もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デアザプ
    リンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジンであ
    れば該結合は該ピリミジンの５−位置に存するものと規
    定せられ、 そして ｘは▲数式、化学式、表等があります▼、ｙは▲数式、
    化学式、表等があります▼、 そしてｚはＨＯ−またはＨである。 を表わす。 を有する化合物を適性な条件下にオリゴもしくはポリヌ
    クレオチドの末端に付加せしめて本化合物を形成するこ
    とからなる構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１＾
    ′−位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、
    またはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″
    のいづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は
    該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ
    、Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結
    合はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物の製造方法。
  24. （２４）該酵素的付加は該変性ヌクレオチドをＲＮＡリ
    ガーゼと接触せしめることからなる「特許請求の範囲（
    ２３）」に記載の方法。
  25. （２５）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と、水銀塩とを適当な溶剤中で適当な条
    件下で反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化誘導体を形成すること。 （ｂ）上記水銀化誘導体と、上記水銀化合物の−Ｈｇ＾
    ＋部分と反応し得そして式・・・Ｎによって、表わされ
    る化学部分と反応せしめ、上記反応は水性溶媒中でＫ＿
    ２ＰｄＣｌ＿４の存在下適当な条件の下で行われ、構造
    式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基またはＡである。 を有する化合物を形成すること。 （ｃ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１＾
    ′−位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、
    またはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″
    のいづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は
    該プリンまたはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物を回収すること、ＮがＡの時またはＮが
    反応性末端基の時、上記化合物は構造式Ｍ−Ａ、 ここにＭはＮと反応し得る官能基を表わす、を有する化
    合物と水性溶媒下、適当な条件の下に反応せしめて構造
    式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物を形成せしめ、その後それを回収するこ
    と、 以上の段階からなる構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物の製造方法。
  26. （２６）該適当な条件は約１から１４の範囲のｐＨ、約
    ５°から１００℃の範囲の温度、そして約３から２４時
    間の範囲の反応時間からなる「特許請求の範囲（２５）
    」に記載の方法。
  27. （２７）該水銀塩は酢酸水銀である「特許請求の範囲（
    ２５）」に記載の方法。
  28. （２８）式・・・Ｎで表わされる上記化学部分は−ＣＨ
    ＝ＣＨ−ＣＨ＿２−ＮＨ＿２である「特許請求の範囲（
    ２５）」に記載の方法。
  29. （２９）式・・・Ｎで表わされる上記化学部分は▲数式
    、化学式、表等があります▼である「特許請求の範囲（
    ２５）」に記載の方法。
  30. （３０）上記水性溶媒はバッファーを含む「特許請求の
    範囲（２５）」に記載の方法。
  31. （３１）上記バッファーは酢酸ソーダ、酢酸カリウム、
    クエン酸ソーダ、クエン酸カリウム、クエン酸−リン酸
    カリウム、トリス−酢酸、および硼酸−水酸化ソーダか
    らなる「特許請求の範囲（３０）」に記載の方法。
  32. （３２）上記バッファーの濃度は約２．０モル以下であ
    る「特許請求の範囲（３１）」に記載の方法。
  33. （３３）段階（ｂ）においては、該水性溶媒は更に有機
    溶媒を含む「特許請求の範囲（２５）」に記載の方法。
  34. （３４）上記有機溶媒は水混和性である「特許請求の範
    囲（３３）」に記載の方法。
  35. （３５）上記有機溶媒はエーテル、アルコール、エスチ
    ル、ケトン、およびアミドからなる「特許請求の範囲（
    ３３）」に記載の方法。
  36. （３６）上記有機溶媒はメタノール、エタノール、プロ
    パノール、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ピリジ
    ン、およびジメチルホルムアミドからなる「特許請求の
    範囲（３５）」に記載の方法。
  37. （３７）Ａはビオチンまたはイミノビオチンからなり、
    そしてＭはＮ−ハイドロキシサクシミドエステル、イミ
    デート、アンハイドライド、イソチオシアナート、およ
    びエポキシドからなる「特許請求の範囲（３５）」に記
    載の方法。
  38. （３８）ＭはＮ−ハイドロキシサクシミドエステルであ
    る「特許請求の範囲（２５）」に記載の方法。
  39. （３９）Ｍはイミデート、アンハイドライド、イソチオ
    シアナート、およびエポキシドからなる「特許請求の範
    囲（２５）」に記載の方法。
  40. （４０）・・・Ｎはチオール、カルボン酸、エポキシド
    、およびアミンからなる「特許請求の範囲（２５）」に
    記載の方法。
  41. （４１）式・・・Ｎで表わされる該化学部分は−ＣＨ＝
    ＣＨ−ＣＨ＿２−ＮＨ−ビオチンである「特許請求の範
    囲（２５）」に記載される方法。
  42. （４２）該式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は ▲数式、化学式、表等があります▼ ビオチンである「特許請求の範囲（２５）」に記載され
    る方法。
  43. （４３）該式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は
    −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＿２−ＮＨ−イミノビオチンである
    「特許請求の範囲（２５）」に記載される方法。
  44. （４４）該式・・・Ｎによって表わされる該化学部分は ▲数式、化学式、表等があります▼ イミノビオチンである「特許請求の範囲（２５）」に記
    載される方法。
  45. （４５）本化合物を適当な条件下でこれと錯体を形成し
    得るポリペプチドと接触せしめて上記錯体を形成するこ
    と、該ポリペプチドは本化合物と該ポリペプチドとの該
    錯体が形成される時、検出されることが出来る部分を含
    み得る、そして適当な検出手法を用いて該錯体を検出す
    ること、からなる（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の −Ｈｇ＾＋部分と反応し得、そして式・・・Ｎによって
    表わされる化学部分と反応せしめ ること、上記反応は水性溶媒中で、そして Ｋ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下において
    行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアゾプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表
    わし、もしＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８
    −位置に存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化
    学鎖は該デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢ
    がピリミジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置
    に存するものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各
    々はＨ−、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼
    、▲数式、化学式、表等があります▼、または▲数式、
    化学式、表等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチドの製造方法により製造された
    化合物の検出方法。
  46. （４６）上記化合物の部分Ａはビオチンおよびイミノビ
    オチンからなる「特許請求の範囲（４５）」に記載の方
    法。
  47. （４７）上記ポリペプチドはアヴィヂン、ストレプトア
    ヴィヂン、およびＩｇＧアンチ−Ａ−イムノグロブリン
    からなる「特許請求の範囲（４５）」に記載の方法。
  48. （４８）上記化合物の部分Ａはハプテンであり、そして
    上記ポリペプチドは抗体である「特許請求の範囲（４５
    ）」に記載の方法。
  49. （４９）上記化合物の部分Ａはリガントである「特許請
    求の範囲（４５）」に記載の方法。
  50. （５０）該ポリペプチド中に含まれる検出され得る部分
    は螢光染料、高電子密度試薬、または不溶性反応生成物
    を沈積し得る酵素である「特許請求の範囲（４５）」に
    記載の方法。
  51. （５１）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表
    等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチドと、該変性ヌクレオチドと錯
    体を形成し得るポリペプチドからなる錯化合物
  52. （５２）該ポリペプチドは検出され得る部分を含む「特
    許請求の範囲（５１）」に記載の錯化合物。
  53. （５３）該検出され得る部分は螢光染料、高電子密度試
    薬、または不溶性反応生成物を沈積し得る酵素である「
    特許請求の範囲（５２）」に記載の錯化合物。
  54. （５４）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    して Ｋ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下において
    行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表
    わし、もしＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８
    −位置に存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化
    学鎖は該デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢ
    がピリミジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置
    に存するものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各
    々はＨ−、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼
    、▲数式、化学式、表等があります▼、または▲数式、
    化学式、表等があります▼を表わす。 を有する変性ヌクレオチドを適当な条件下でこれと錯体
    を形成し得るポリペプチドと接触せしめて錯体を形成す
    ること、該ポリペプチドは該変性ヌクレオチドと該ポリ
    ペプチドとの該錯体が形成される時、検出されることが
    出来る部分を含む、そして適当な検出手法を用いて該錯
    体を検出すること、からなる構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物の検出方法。
  55. （５５）該化合物の部分Ａはビオチンおよびイミノビオ
    チンからなる「特許請求の範囲（５４）」に記載の方法
    。
  56. （５６）該ポリペプチドはアヴィヂン、ストレプトアヴ
    ィヂン、およびＩｇＧアンチ−Ａ−イムノグロブリンか
    らなる「特許請求の範囲（５４）」に記載の方法。
  57. （５７）該化合物の部分Ａはハプテンであり、そして上
    記ポリペプチドはそれに対する抗体である「特許請求の
    範囲（５４）」に記載の方法。
  58. （５８）該化合物の部分Ａはリガンドである「特許請求
    の範囲（５４）」に記載の方法。
  59. （５９）該ポリペプチド中に含まれる検出され得る部分
    は螢光染料、高電子密度試薬、または不溶性反応生成物
    を沈積し得る酵素である「特許請求の範囲（５４）」に
    記載の方法。
  60. （６０）該ポリヌクレオチド複合体をこれと錯体を形成
    し得るポリペプチドと適当な条件下において接触せしめ
    て該錯体を形成すること、該ポリペプチドは該ポリヌク
    レオチド複合体と該ポリペプチドとの錯体が形成される
    時、検出され得る部分を含む、および該錯体を検出する
    こと、からなる（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中 で適当な条件下において反応せしめて構造 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の −Ｈｇ＾＋部分と反応し得、そして式・・・Ｎによって
    表わされる化学部分と反応せしめること、上記反応は水
    性溶媒中で、そしてＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適
    当な条件下において行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼を表わす。 を有する変性ヌクレオチドまたは構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物のいづれにも記載の化合物を含む二重螺
    旋構造ポリヌクレオチド複合体の検出方法。
  61. （６１）該ポリヌクレオチド複合体の部分Ａはビオチン
    およびイミノビオチンからなる「特許請求の範囲（６０
    ）」に記載の方法。
  62. （６２）上記ポリペプチドはアヴィヂン、ストレプトア
    ヴィヂン、およびＩｇＧアンチ−Ａ−イムノグロブリン
    からなる「特許請求の範囲（６０）」に記載の方法。
  63. （６３）上記化合物の部分Ａはハプテンであり、そして
    上記ポリペプチドはそれに対する抗体である「特許請求
    の範囲（６０）」に記載の方法。
  64. （６４）上記化合物の部分Ａはリガンドである「特許請
    求の範囲（６０）」に記載の方法。
  65. （６５）該ポリペプチド中に含まれる検出され得る部分
    は螢光染料、高電子密度試薬、または不溶性反応生成物
    を沈積し得る酵素である「特許請求の範囲（６０）」に
    記載の方法。
  66. （６６）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼を表わす。 を有する変性ヌクレオチドまたは、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物のいづれの化合物を含む二重螺旋構造ポ
    リヌクレオチド複合体。
  67. （６７）該ポリヌクレオチド螺旋構造はリボ核酸分子で
    ある「特許請求の範囲（６６）」に記載の複合体。
  68. （６８）該ポリヌクレオチド螺旋構造はデオキシリボ核
    酸分子である「特許請求の範囲（６６）」に記載の複合
    体。
  69. （６９）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、 ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成することの
    出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチドまたは、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１＾
    ′−位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、
    またはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″
    のいづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は
    該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ
    、Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結
    合はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物のいづれの化合物を含む二重螺旋構造ポ
    リヌクレオチド複合体と該複合体と錯体を形成し得るポ
    リペプチドとからなる分子錯体。
  70. （７０）デオキシリボ核酸またはリボ核酸分子と、構造
    式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物とに相当するかもしくはそれから誘導さ
    れるデオキシリボ核酸またはリボ核酸の単一螺旋構造を
    含む二重螺旋構造の交配ポリヌクレオチド複合体を形成
    すること、および該ポリヌクレオチド複合体をこれと錯
    体を形成し得るポリペプチドと適当な条件下において接
    触せしめて該錯体を形成すること、該ポリペプチドは該
    ポリヌクレオチド複合体と該ポリペプチドとの錯体が形
    成される時、検出され得る部分を含む、および該錯体を
    検出すること、からなる （ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、 ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成することの
    出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物のいづれにも記載の化合物を含む二重螺
    旋構造ポリヌクレオチド複合体の検出方法によって該二
    重螺旋構造の交配ポリヌクレオチドを検出すること、か
    らなるデオキシリボ核酸もしくはリボ核酸分子の存在を
    測定する方法。
  71. （７１）該デオキシリボ核酸またはリボ核酸は生きてい
    る生物から誘導される「特許請求の範囲（７０）」に記
    載の方法。
  72. （７２）該生きている生物はバクテリア、菌、ウィルス
    、イーストおよび補乳動物からなる「特許請求の範囲（
    ７０）」に記載の方法。
  73. （７３）被検物から適当な試料を得ること、病因に当然
    に関連するデオキシリボ核酸もしくはリボ核酸の該試料
    中における存在を構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物と、適当な条件下において該病因と当然
    に関連する該デオキシリボ核酸もしくはリボ核酸に相当
    するかもしくはそれから誘導されるデオキシリボ核酸も
    しくはリボ核酸の単一螺旋構造とを含む二重螺旋構造の
    ポリヌクレオチド複合体を形成することによって測定す
    ること、および該ポリヌクレオチド複合体をこれと錯体
    を形成し得るポリペプチドと適当な条件下において接触
    せしめて該錯体を形成すること、該ポリペプチドは該ポ
    リヌクレオチド複合体と該ポリペプチドとの錯体が形成
    される時、検出され得る部分を含む、および該錯体を検
    出すること、からなる（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチド または 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢ、Ｂ′、およびＢ″の各々は糖部分のＣ＾１′
    −位置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、ま
    たはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′、またはＢ″の
    いづれかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該
    プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、Ｂ、
    Ｂ′、またはＢ″のいづれかがピリミジンの時、該結合
    はＮ＾１−位置に存するものと規定せられ、 Ａは本化合物が対をなすリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子によって形成される二重螺旋構造の中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとからなる化学結合または組を表わし、も
    しＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に存
    し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デア
    ザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジン
    であれば該結合はピリミジンの５−位置に存するものと
    規定せられ、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表
    わす。 を有する化合物のいづれにも記載の化合物を含む二重螺
    旋構造ポリヌクレオチド複合体の検出方法を用いて該二
    重螺旋構造のポリヌクレオチド複合体の存在を検出する
    こと、からなる被検物中の核酸を含む病因の存在を診断
    する方法。
  74. （７４）該被検物はヒト、または動物であり、そして該
    病因はバクテリア、ウィルス、および菌を含む「特許請
    求の範囲（７３）」に記載の方法。
  75. （７５）抗生物質に対して耐性を与え、そしてその中に
    取入れられる（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチドを含むバクテリアのデオキシ
    リボ核酸遺伝子列と対をなすべきポリヌクレオチドを調
    製すること、該ポリヌクレオチドを適当な条件下におい
    て該バクテリアから得られたデオキシリボ核酸と接触せ
    しめて二重螺旋構造の交配複合体を形成すること、該複
    合体を該交配複合体と適当な条件下で錯体を形成し得る
    ポリペプチドと接触せしめること、該ポリペプチドはも
    し該錯体が形成されるならば検出されることが出来る部
    分を含む、および適当な検出手法を用いて該錯体の存在
    を検出すること、該錯体の存在は該抗生物質に対する耐
    性を発現し、該錯体の不存在は該抗生物質に対する感受
    性を発現する、以上からなる抗生物質に対する耐性の存
    在を測定するためのバクテリア試験方法。
  76. （７６）上記バクテリアはストレプトコッカス、ピオゲ
    ネス、もしくはネイセリスメニンギチディス、そして上
    記抗生物質はペニシリンである「特許請求の範囲（７５
    ）」に記載の方法。
  77. （７７）該バクテリアはスタフィロコッカスアウレウス
    、カンディダアルビカンス、プシュードモナスアエルギ
    ノザ、ストレプトコッカスピオゲネス、もしくはネイセ
    リアゴノロエアエ、そして上記抗生物質はテトラサイク
    リンである「特許請求の範囲（７５）」に記載の方法。
  78. （７８）該バクテリアはミコバクテリウムテュペルキュ
    ロシス、そして上記抗生物質はアミノグリコシドである
    「特許請求の範囲（７５）」に記載の方法。
  79. （７９）遺伝的不調に関連しそしてその中に取入れられ
    る（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼を表わす。 を有する変性ヌクレオチドを含む被検体のデオキシリボ
    核酸遺伝子列と対をなすべきポリヌクレオチドを調製す
    ること、該ヌクレオチドを適当な条件下で被検体から得
    られたデオキシリボ核酸と接触せしめて二重螺旋構造交
    配複合体を形成すること、該複合体を該交配複合体と錯
    体を形成し得るポリペプチドと接触せしめること、該ポ
    リペプチドは該錯体が形成される時、検出されることが
    出来る部分を含む、および適当な検出手法を用いて該錯
    体の存在を検出すること、該錯体の存在または不存在は
    該遺伝的不調の存在または不存在となって発現される、
    以上からなる被検体中の遺伝的不調の診断方法。
  80. （８０）β−マイナスサラセミア被検体においては存在
    せずそしてその中に取入れられる（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の −Ｈｇ＾＋部分と反応し得、そして式・・・Ｎによって
    表わされる化学部分と反応せしめること、上記反応は水
    性溶媒中で、そしてＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適
    当な条件下において行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼ を表わす。 を有する変性ヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸遺伝
    子列と対をなすべきポリヌクレオチドを調製すること、
    該ポリヌクレオチドを適当な条件下において該被検体か
    ら得られたデオキシリボ核酸と接触せしめて二重螺旋構
    造交配複合体を形成すること、該複合体を核交配複合体
    と適当な条件下において錯体を形成し得るポリペプチド
    と接触せしめること、該ポリペプチドは該錯体が形成さ
    れる時検出されることが出来る部分を含んでいる、そし
    て適当な検出手法を用いて該錯体の存在を検出すること
    、該錯体の不存在はβ−マイナスサラセミアの存在を発
    現する、以上からなるヒト被検体におけるサラセミアの
    検診方法。
  81. （８１）染色体上に配置される限定された一連の遺伝連
    鎖に相当する一連の変性ポリヌクレオチドを調製するこ
    と、該ポリヌクレオチドは（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼を表わす。 を有する変性ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチドを
    染色体から得られたデオキシリボ核酸と接触せしめて交
    配複合体を形成すること、該複合体の各々を該複合体の
    各々と錯体を形成し得るポリペプチドと接触せしめるこ
    と、該ポリペプチドは該錯体が形成される時検出される
    ことが出来る部分を含む、そして該染色体上の各々の錯
    体の位置を測定してそれによって該染色体上の遺伝連鎖
    の位置を測定すること、からなる染色体の核型決定方法
    。
  82. （８２）少くとも一つのウラシル部分が変性ウラシル部
    分が二重螺旋構造のポリＡ−ポリＵ複合体の中へ取入れ
    られる時ポリペプチドと共に検出し得る錯体を形成する
    ことの出来る少くとも三つの炭素原子からなる部分Ａの
    ５−位置に化学的付加されている変性ポリＵ分子を調製
    すること、かようなポリＡ−ポリＵ複合体を、該ポリＡ
    連鎖を含んでいる該ポリヌクレオチドと該変性ポリＵ分
    子とを適当な条件下において接触せしめることによって
    形成すること、および結果として得られた複合体を検出
    してそれによって該ポリヌクレオチドを検出すること、
    からなる末端ポリヌクレオチド連鎖ポリＡを含むポリヌ
    クレオチドの検出方法。
  83. （８３）ｚはＨ−またはＨＯ−そしてｘおよびｙは反応
    せしめられて環状部分 ▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する「特許請求の範囲１、」に記載の化合物。
  84. （８４）ｘはＨ−またはＨＯ−そしてｙおよびｚは反応
    せしめられて環状部分 ▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する「特許請求の範囲１、」に記載の化合物。
  85. （８５）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼を表わし、 ここでｚはＨ−またはＨＯ−そしてｘおよびｙは反応せ
    しめられて環状部分 ▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する。 又は、 ここでｘはＨ−またはＨＯ−そしてｙおよびｚは反応せ
    しめられて環状部分 ▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する。 を有する変性ヌクレオチドを結合せしめるに適当な条件
    下において細胞の表面のホルモン接受位置と結合せしめ
    ること、該細胞を分裂せしめて該化合物が結合されてい
    る細胞表面断片を形成すること、該細胞表面断片を別々
    に回収すること、そしてそれらを識別して該ホルモン接
    受位置を識別すること、からなる細胞の表面のホルモン
    接受位置を識別する方法。
  86. （８６）（ａ）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応せしめて構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する水銀化合物を形成すること。 （ｂ）上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＾＋部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化学
    部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、そ
    してＫ＿２ＰｄＣｌ＿４の存在下に、適当な条件下にお
    いて行われ、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである。Ａは本
    化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ核酸複
    合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れられた時
    、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成すること
    の出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表わす
    。 を有する化合物を形成する。 そして （ｃ）該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収する
    こと、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該化合
    物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと反応
    可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下にお
    いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、
    それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階からなる。 構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１′−位置に共有的に結合され
    たプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表
    わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、該結合はＮ＾１−位置に存するも
    のと規定せられ、 Ａは本化合物が二重螺旋構造のリボ核酸、デオキシリボ
    核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡ交配物中に取入れら
    れた時、ポリペプチドと共に検知され得る錯体を形成す
    ることの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
    しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
    デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
    ジンであれば該結合は該ピリミジンの５−位置に存する
    ものと規定せられ、そしてｘ、ｙおよびｚの各々はＨ−
    、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼、または▲数式、化学式、
    表等があります▼を表わし、 ここでｚはＨ−またはＨＯ−そしてｘおよびｙは反応せ
    しめられて環状部分 ▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する。 又は、 ここでｘはＨ−またはＨＯ−そしてｙおよびｚは反応せ
    しめられて環状部分 ▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する。 を有する変性ヌクレオチドを結合せしめるに適当な条件
    下において細胞の表面のホルモン接受位置と結合せしめ
    ること、該細胞を分裂せしめて該化合物が結合されてい
    る細胞表面断片を形成すること、該細胞表面断片を別々
    に回収すること、そしてそれらを識別して該ホルモン接
    受位置を識別すること、からなる細胞の表面のホルモン
    接受位置を識別する方法によって悪性細胞に関連されて
    いる異常ホルモン接受位置を検出することによって悪性
    細胞を検出することからなる腫瘍もしくは癌識別の方法
    。
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