JPH0694474B2 - 修飾されたヌクレオチドおよびその調製法およびその使用 - Google Patents

修飾されたヌクレオチドおよびその調製法およびその使用

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JPH0694474B2
JPH0694474B2 JP62083703A JP8370387A JPH0694474B2 JP H0694474 B2 JPH0694474 B2 JP H0694474B2 JP 62083703 A JP62083703 A JP 62083703A JP 8370387 A JP8370387 A JP 8370387A JP H0694474 B2 JPH0694474 B2 JP H0694474B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、天然ヌクレオチドの放射性ラベル体の代替と
して有用な修飾ヌクレオチドおよびその製造法に関す
る。
〔従来の技術〕
生物医学研究および組み換えDNA工学に用いられる多く
の方法は、水素（3H）、リン（32P）、炭素（14C）ある
いはヨード（125I）の同位元素により放射活性でラベル
された、ヌクレオチド誘導体あるいはポリヌクレオチド
誘導体の使用に大いに依存している。そのような放射活
性化合物は、使用者が核酸および、科学的あるいは臨床
的に目的とするその他の分子を、非常に少量しか存在し
ない場合でも、検出、モニター、位置決定、あるいは単
離することを可能にする、有用な指標プローブを提供す
る。今日まで、放射活性物質は、最も感度が高く、そし
て多くの場合、多くの重要な実験あるいは分析試験を行
う唯一の手段を提供して来た。しかし、放射活性化合物
の使用には、重大な制限および障害がある。第一に、放
射活性物質を取り扱う人は、潜在的に危険性のある照射
レベルに曝され得るので、放射性同位元素を調整、使
用、および廃棄する期間、入念な安全措置を維持しなけ
ればならない。第二に、放射性ヌクレオチドは、購入お
よび使用するのに、非常に費用がかかる。それは、大部
分は、適当な安全装置、生産者／使用者の健康監視サー
ビス、および廃棄物処理作業を供給するのに必要な装置
および入力にかかる費用である。第三に、放射活性物質
はしばしば、非常に不安定であり、限られた保存期間を
有し、それはさらに、使用経費を増加させる。この不安
定性は、放射性同位元素そのものの崩壊に伴う破壊的効
果による放射線分解の結果であり、そして多くの放射性
同位元素（例えば32Pおよび125I）がたった数日の半減
期しか有さないという事実の結果である。
ハプテンは抗体に結合し得るが、担体に結合した場合に
のみ免疫反応を開始し得ることが知られている。この性
質は検出および同定試験に利用され得る。
ビオチンおよびイミノビオチンが、卵白の68,000ダルト
ンの糖タンパク質であるアジビンと強く相互作用するこ
とも知られている。この相互作用は、自然に見られる最
も強い非共有結合定数（Kdis＝10-15）の１つを示す。
もしアビジンが、例えばフルオレセインあるいはローダ
ミンのような蛍光色素；フェリチン、ヘモシアニンある
いはコロイド状金のような高電子密度試薬；あるいはパ
ーオキシダーゼあるいはアルカリホスファターゼのよう
な不溶性の反応生成物を沈澱させ得る酵素を含む、潜在
的に証明可能な指標分子に結合されると、ビオチンプロ
ーブの存在、位置、あるいは量が確立され得る。イミノ
ビオチンはビオチンよりも弱くアビジンに結合するが、
同様の反応がその検出に使用され得る。さらに、溶液の
pHを下げることによる、イミノビオチン−アジビン相互
作用の可逆性は、ある種の適用において、有意な利点を
提供する。
ビオチン−アビジン複合体の特異性および保持力は、近
年、細胞上あるいは細胞内の特異的タンパク質、脂質、
あるいは糖質の位置を可視的に特定する方法の開発に使
用されて来た（E.A.BayerとM.WilchekのMethods of Bio
chemical Analysis,26,1,1980に総説されている）。染
色体中のRNAの位置は、ハイブリダイゼーションプロー
ブ用のRNAに化学的に架橋されたビオチン化タンパク
質、チトクロームＣを用いて、電子顕微鏡により決定さ
れてきた。ハイブリダイゼーションの位置は、アビジン
−ビオチン相互作用に仲介されるアビジン−フェリチン
あるいはアビジン−メタクリレート粒子の結合を通して
可視化された（J.E.Manning,N.D.Hershey,T.R.Broker,
M.Pellegrini,H.K.Mitchell,およびN.Davidson,Chromos
oma,53,107,1975;J.E.Manning,M.PellegriniおよびN.Da
vidson,Biochemistry,61,1364,1977;T.R.Broker,L.M.An
gerer,P.H.Yen,N.D.HerseyおよびN.Davidson,Nucleic A
cid Res.,５,363,1978;A.SodjaおよびN.Davidoson,Nucl
eic Acid Res.,５,383,1978）。ポリヌクレオチド配列
検出に対するこのアプローチは、高度に反復する配列の
特殊な場合には成功するが、１つ、あるいは少コピー数
しか存在しないポリヌクレオチドの分析への一般的使用
法ではない。
さらに、ピリミジンおよびプリン環に化学成分を結合さ
せる方法は知られている。数年前に、簡単で迅速なアセ
トキシ水銀化反応が、共有結合した水銀元素をヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドの両方のピリミジン環の５
位、プリン環のＣ−８位、あるいは７−デアザプリンの
Ｃ−７位に導入するために開発された（R.M.K.Dale,D.
C.LivingstonおよびD.C.Ward,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,70,2238,1973;R.M.K.Dale,E.Martin,D.C.Livingston
およびD.C.Ward,Biochemistry,14,2447,1975）。有機水
銀化合物が、パラジウム触媒の存在下で、オレフィン化
合物と反応し、炭素−炭素結合を形成することも数年前
に示された（R.F.Heck,J.Am.Chem.Soc.,90,5518,1968;
R.F.Heck,Ibid.,90,5526,1968;R.F.Heck,Ibid.,90,553
1,1968;R.F.Heck,Ibid.,90,5535,1968;およびR.F.Heck,
J.Am.Chem.Soc.,91,6707,1969）。Bergstromおよびその
共同研究者（J.L.RuthおよびD.E.Bergstrom,J.Org.Che
m.,43,2870,1978;およびD.E.BergstromおよびM.K.Ogaw
a,J.Am.Chem.Soc.,100,8106,1978）およびBiggeら（C.
F.Bigge,P.Kalaritis,J.R.DeckおよびM.P.Mertes,J.Am.
Chem.Soc.,102,2033,1980）は、最近この反応工程をＣ
−５が置換されたピリミジンヌクレオチド化合物の合成
に利用した。
最後に、修飾されたヌクレオチドに特異的な抗体が調製
され得、修飾されたヌクレオチドの特異的構成物質の単
離および特徴付けに使用され得ることが知られている
（T.W.MunnsおよびM.K.Liszewski,Progress in Nucleic
Acid Research and Molecular Biology,24,109,198
0）。しかし、現在までに調製された、天然のヌクレオ
チドに対するいかなる抗体も、ヌクレオチドが二本鎖RN
Aあるいは二重鎖DNA、あるいはDNA−RNAハイブリッド分
子中に存在するときにそのヌクレオチド決定基と反応す
ることが示されていない。
放射性ラベルされたプローブあるいはこれまでに使用さ
れてきた化学的および生物学的プローブの限界を避ける
ために、ピリミジンあるいはプリン環に共有結合したビ
オチン、イミノビオチン、リポ酸およびその他の決定基
を含む、一連の新規なヌクレオチド誘導体が合成されて
いる。これらのヌクレオチド誘導体およびポリヌクレオ
チドおよびそれらを含む補酵素は、アビジンあるいは抗
体のようなタンパク質と特異的に、そしてその１つずつ
と相互作用する。修飾されたヌクレオチドと特異的タン
パク質との相互作用は、生物医学的および組み換えDNA
工学に現在使用されている多くの方法の中で、核酸成分
の検出および位置特定のための放射性同位元素に代わる
ものとして使用され得る。これらの、修飾されたヌクレ
オチド−タンパク質相互作用を用いる方法は、放射性同
位元素を用いる方法と同等あるいはそれより大きい検出
能力を有し、それらはしばしば、より迅速に、より良い
分解能力で行なわれ得る。
後に本分中にさらに詳細に述べるように、これらの新し
いヌクレオチド誘導体は、開発されている標準化された
化学的方法によって、比較的安価に調製され得る。さら
に有意義なことには、本発明のどのヌクレオチドプロー
ブおよびそれらとともに用いられるタンパク質試薬も放
射活性がないので、放射性同位元素を用いる方法に必要
とされる、手の込んだ安全な手順を用いずにこれらの化
合物を調製、使用および廃棄し得る。さらに、これらの
ヌクレオチド誘導体は化学的に安定であり、数年あるい
はそれ以上の使用保存期間を有すると考えられる。最後
に、これらの化合物はより安全で、より経済的、より迅
速そしてより再現性のある研究および診断方法の開発を
可能にする。
〔発明の要旨〕
次の構造式を有する化合物であって； ここで、Ｂは糖成分のＣ１′位に共有結合したプリン、
７−デアザプリンあるいはピリミジン成分を表し、Ｂが
プリンあるいは７−デアザプリンの場合、Ｂはプリンあ
るいは７−デアザプリンのN9位において該結合し、Ｂが
ピリミジンの場合、N1位において該結合し； Ａは、少なくとも３個の炭素原子からなる成分であるハ
プテンあるいはリガンドを表し、該化合物が二本鎖リボ
核酸、二重鎖デオキシリボ核酸、あるいはDNA−RNAハイ
ブリッドに取り込まれた場合に、ポリペプチドと検出可
能な複合体を形成し得； 点線は、ＢとＡをつなぐ化学結合を表し、Ｂがプリンで
ある場合、該結合はプリンの８位に結合し、Ｂが７−デ
アザプリンである場合、該結合はデアザプリンの７位に
おいて結合し、Ｂがピリミジンである場合、該結合はピ
リミジンの５位において結合し；そして x,yおよびｚの各々は； を表す、化合物が提供される。
この化合物は、直接、あるいはオリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドに取り込まれた場合に、広範囲に有
用なプローブを提供する。
適用には、染色体、固定された細胞、組織切片および細
胞抽出物中のポリヌクレオチド配列の検出および位置決
定が含まれる。特定の適用には、染色体の核型決定、核
酸を有する病原体、すなわち細菌、ウィルスあるいは真
菌類の臨床診断、および遺伝子疾患の診断が含まれる。
この化合物は、生物医学的研究および組み換えDNA工学
においてプローブとして広範囲に有用である。
１つあるいはそれ以上の次の特徴をさらに有する、この
構造に包含される化合物は特に有用である:Aは非芳香性
であり;Aは少なくともC5であり;BとＡをつなぐ化学結合
はα−オレフィン結合を含み;Aはビオチンあるいはイミ
ノビオチンであり；そして、Ｂはピリミジンあるいは７
−デアザプリンである。
これらの化合物は、次の工程を含むプロセスによって調
製され得る： （ａ）次の構造、 を有する化合物を、水銀塩と、適当な条件下、適当な溶
媒中で反応させて次の構造、 を有する水銀化化合物を生成する工程； （ｂ）前記水銀化化合物を、前記水銀化化合物の−Hg+
部分と反応する構造式・・・Ｎで表される化学成分と反
応させる工程であって、この反応が水溶液中K2PdCl4の
存在下で、適当な条件下で行われて、次の構造、 を有する化合物を生成し、ここで、Ｎは反応性の末端官
能基あるいはＡである、工程；および （ｃ）ＮがＡの場合、該化合物を該修飾ヌクレオチドと
して回収する工程、 またはＮが反応性末端基である場合、Ｍが水溶液中で適
当な条件下で前記修飾されたヌクレオチドを生成する、
Ｎとの反応性を有する官能基を表す時、前記化合物をＭ
−Ａ構造を有する化合物と反応させて、次いでそれを回
収する工程。
本発明はまた、次の構造を有する化合物を提供する： ここで、B,B′およびＢ″の各々は、糖成分のＣ１′位
に共有結合しているプリン、７−デアザプリンあるいは
ピリミジン成分を表し、B,B′あるいはＢ″がプリンあ
るいは７−デアザプリンである場合はいつも、該プリン
あるいは７−デアザプリンのN9位で結合し、Ｂ、Ｂ′あ
るいはＢ″がピリミジンである場合はいつも、N1位で結
合しており、 Ａは、少なくとも炭素原子３個からなる成分を表し、該
化合物が相補的リボ核酸あるいはデオキシリボ核酸分子
と形成される２重鎖複合体に導入される場合にポリペプ
チドと検出可能な複合体を形成し得、 点線は、ＢとＡとをつなぐ化学結合を表し、Ｂがプリン
である場合、該結合は該プリンの８位で結合しており、
Ｂが７−デアザプリンである場合、該結合は該デアザプ
リンの７位で結合しており、そしてＢがピリミジンであ
る場合、該結合は該ピリミジンの５位で結合しており； ｚはＨ−あるいはHO−を表し；そして ｍおよびｎは０から約100,000までの整数を表す。
これらの化合物は、本発明の修飾されたヌクレオチドを
含むヌクレオチドの混合物を酵素的に重合させることに
より、調製され得る。かわりに、オリゴヌクレオチドあ
るいはポリヌクレオチド中のヌクレオチドを、化学的方
法を用いて修飾させ得る。
本発明の実施により修飾されたヌクレオチドおよび修飾
されたヌクレオチドが導入されているオリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドは、生物医学的研究、臨床診
断および組み換えDNA工学においてプローブとして使用
され得る。これらの多様な有用性は、これらの分子のポ
リペプチドとの安定な複合体を形成する能力に基づく。
このポリペプチドは、ポリペプチド固有の性質による
か、あるいはポリペプチドと結合あるいは相互作用する
検出可能な成分によって検出され得る。
ある種の使用法は、細菌およびウィルスのような病原体
を含む核酸の検出および同定；抗生物質耐性菌のスクリ
ーニング；セラサミアおよび鎌状細胞貧血症のような遺
伝子疾患の診断；染色体核型の決定；および腫瘍細胞の
同定を含む。
〔発明の構成〕
天然ヌクレオチドの放射性ラベル体の代替として、概ね
適当であるためには、修飾されたヌクレオチドが、いく
つかの必須の規準を満たされねばならない。第一に、修
飾された化合物は、独特の、すなわち、通常、ヌクレオ
チドあるいはポリヌクレオチドに付随していない置換基
あるいはプローブ部分（リガンド）を有さなければなら
ない。第二に、プローブは、鋭敏な検出系を提供するた
めに、化学的あるいは生物学的試薬と特異的に反応しな
ければならない。第三に、アナログは、一般的に研究さ
れている核酸酵素の、比較的効率的な基質でなければな
らない。なぜならば、多くの実際の適用ではアナログが
酵素によって代謝されることを必要とする。たとえば、
アナログは核酸ポリメラーゼの基質として機能しなけれ
ばならない。この目的のために、プローブ成分は、塩基
の正常なワトソン−クリック水素結合能力を立体構造的
に妨げる、環位置に置かれるべきではない。そうでなけ
れば、置換基は、ポリメラーゼの基質としての活性のな
い化合物を産生する。正常な「アンチ」ヌクレオシド構
造を変化させる環位置における置換もまた、避けねばな
らない。なぜならば、そのような構造的変化は、通常、
ヌクレオチド誘導体をポリメラーゼの基質として受容不
能にするからである。通常、そのような配慮から置換位
置は、ピリミジンの５位および、プリンあるいは７−デ
アザプリンの８位に限定される。
第四に、検出系は、核酸ハイブリダイゼーションの方法
論に適合するために、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオ
チドの両方に導入されたプローブ置換基と、相互作用す
ることができるべきである。この規準を満たすために、
プローブ成分が、抗体、他の検出用タンパク質あるいは
化学試薬と容易に相互作用し得るように、プリンあるい
はピリミジンに、化学結合あるいは「リンカーアーム」
を介して結合させることが好ましい。
第五に、放射性ハイブリダイゼーションプローブを使用
する現在の方法を大幅に変更する必要のないように、小
数のプローブ置換基を有するポリヌクレオチドの物理的
および生物化学的性質を有意に変化させるべきではな
い。この規準は、プローブが酵素によって導入されて
も、あるいは直接的化学的手段によって導入されても、
満たされねばならない。
最後に、プローブ成分を付加する結合は、正常のヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドが日常的に供されるすべ
ての実験条件、たとえば高温での長時間のハイブリダイ
ゼーション、フェノールおよび有機溶媒による抽出、電
気泳動などにに耐え得るべきである。
本文に記載の修飾されたヌクレオチドは、これらの規準
のすべてを満たす。
これらの修飾されたヌクレオチドは次の構造を有する： ここで、Ｂは、糖成分のＣ１′位に共有結合したプリ
ン、７−デアザプリンあるいはピリミジン成分を表し、
Ｂがプリンあるいは７−デアザプリンである場合、それ
は該プリンあるいは該７−デアザプリンのN9位に付加さ
れ、Ｂがピリミジンである場合、それはN1位に付加され
ており； Ａは、少なくとも３個の炭素原子からなる成分を表し、
該化合物が二本鎖リボ核酸、デオキシリボ核酸の２重鎖
あるいはDNA−RNAハイブリッドに導入されるとポリペプ
チドと検出可能な複合体を形成し得； 点線は、ＢとＡをつなぐ結合基を表し、Ｂがプリンであ
る場合、該結合はプリンの８位において付加され、Ｂが
７−アザプリンである場合、該結合は該デアザプリンの
７位において付加され、そしてＢがピリミジンである場
合、該結合は該ピリミジンの５位において付加されてお
り；そして x,yおよびｚの各々は、 を表す。
これらの化合物は、生物医学的研究および組み換えDNA
工学におけるプローブとして広範囲に有用である。
この構造式の範囲に包含されるすべての化合物は本質的
に本発明の実施によって調製および使用され得るが、あ
る種の化合物はより容易に調製されるか、あるいは使用
されるか、またはその両方であり、従って、ここでは好
ましい。
従って、プリン、ピリミジンおよび７−デアザプリンが
主に有用なものであるが、ピリミジンおよび７−デアザ
プリンが好ましい。なぜならば、プリンの８位における
置換によって、ヌクレオチドがポリメラーゼの基質とし
て無効になるからである。従って、修飾されたプリン
は、ある点においては有用であるが、それらは概してピ
リミジンおよび７−デアザプリンほど有用ではない。さ
らに、本発明において有用なピリミジンおよび７−デア
ザプリンは、当然、各々、５位あるいは７位で置換され
てはならない。その結果、チミン、５−メチルシトシン
および５−ヒドロキシメチルシトシンのようなある種の
塩基は有用でない。本発明で、好ましい塩基はシトシ
ン、ウラシル、デアザアデニンおよびデアザグアニンで
ある。
Ａは、少なくとも３個の炭素原子を有する任意の成分で
あり得、そして該修飾されたヌクレオチドが、デオキシ
リボあるいはリボ核酸を有する２重鎖に導入される場合
に、ポリペプチドと、検出可能な複合体を形成する能力
がある。
従って、Ａは、これらの性質を有するすべてのリガンド
で有り得る。この中には適当な担体に付加された場合の
み免疫原性があるが、適切な抗体と相互作用して、複合
体を形成できるハプテンを含む。有用な成分の例は次の
ものを含む： これらのうち、好ましいＡ成分は、ビオチンおよびイミ
ノビオチンである。
さらに、芳香性成分は、塩基対ヘリックス構造にインタ
ーカレイトする傾向があるので、Ａ成分は非芳香性であ
ることが好ましい。さらに、小さい成分は、ポリペプチ
ドとの分子相互作用が十分でないので、安定な複合体の
形成を可能にするに十分な相互作用が起こるように、Ａ
は、少なくともC5であることが好ましい。ビオチンおよ
びイミノビオチンはこれらの規準の両方を満たす。
しかし、Ｂのα位におけるオレフィン結合を含む化学結
合が、概して好まれる。そのようなα−オレフィン結合
の存在位は、塩基が、周知の二重ヘリックス構造中の他
の塩基と対をなす場合に、Ａ成分を該塩基から離れたと
ころに保持する役割を果たす。これは、ポリペプチドと
の相互作用をより容易に起こすことを可能にし、それに
よって、複合体の形成が促進される。さらに、より自由
に旋回できる単結合は、必ずしもヘリックスから該成分
を十分に離れたところに保持して、該成分がポリペプチ
ドに認識され、ポリペプチドと複合体を形成することを
可能にするとは限らない。
さらに、第一級アミンから誘導され、−CH2−NH−構造
を有する化学結合基がより好ましい。なぜならば、その
ような結合は、どの周知のアミン修飾反応を用いても容
易に形成できるからである。アリルアミンおよびアリル
−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）エー
テル基から誘導される、好ましい結合の例は、各々、構
造式、 −CH＝CH−CH2−NH−および を有する。
これらの結合が好ましいが、チオール、カルボン酸およ
びエポキシド官能基のような、他の修飾可能な官能基と
のオレフィン結合手を含む、他のものも使用され得る。
前記結合基は特異的位置、すなわち、ピリミジンの５
位、プリンの８位、デアザプリンの７位に付加される。
前述したように、プリンの８位における置換によって、
本明細書で議論する全ての方法に有用な修飾されたヌク
レオチドは産生されない。窒素原子で占められているプ
リンの７位が結合を付加できると考えられる位置であり
得る。しかし、現在まで用いられ、本明細書に議論され
る化学的置換法はこの目的には適当でない。
記号ｘ、ｙおよびｚは、糖成分の５′、３′および２′
位に付加された基を表す。それらは次のどれかである。
考えられることではあるが、ｘ、ｙおよびｚの全てが同
時に同じものであることは、ありにくい。ｘ、ｙおよび
ｚの少なくとも１つが、一、二あるいは三リン酸のどれ
かのリン酸含有基であり、少なくとも１つがHO−あるい
はＨ−であることがより有り得る。容易に理解されるよ
うに、ｚが、HO−あるいはＨ−であり、各々リボヌクレ
オチドあるいはデオキシリボヌクレオチドを示すことが
最もあり得る。そのようなヌクレオチドの例には、５′
−リボヌクレオシド−リン酸、５′−リボヌクレオシド
二リン酸、５′−リボヌクレオシド三リン酸、５′−デ
オキシリボヌクレオシド−リン酸、５′−デオキシヌク
レオシド二リン酸、５′−デオキシヌクレオシド三リン
酸、５′ｐ−リボヌクレオシド−３′ｐ、および５′ｐ
−デオキシリボヌクレオシド−３′ｐが含まれる。より
特異的な例には、Ａがビオチンあるいはイミノビオチン
であり、化学結合が、 −CH＝CH−CH2−NH−もしくは であり、Ｂがウラシルあるいはシトシンである、このタ
イプの修飾されたヌクレオチドが含まれる。
リンカーアームおよびプローブ成分の塩基への導入に採
用される一般的合成方法は本明細書中前記に述べられて
いる（特に、J.L.RuthおよびD.E.Bergstrom,J.Org.Che
m.,43,2870,1978;D.E.BergstromおよびM.K.Ogawa,J.Ame
r.Chem.Soc.100,8106,1978:およびC.F.Bigge,P.Kalarit
is,J.R.DeckおよびM.P.Mertes,J.Amer.Chem.Soc.102,20
33,1980を参照）。しかし、本明細書に用いられるオレ
フィン置換体は以前には用いられてない。プローブ成分
Ａの結合を促進するために、オレフィンを、アリルアミ
ン［AA］あるいはアリル−（３−アミノ−２−ヒドロキ
シ−１−プロピル）エーテル［NAGE］のような第１級ア
ミンの官能基とともに用いることが特に望ましいことが
知られている。これによって、以下のような標準的なア
ミンの修飾反応によるプローブの付加が可能になる。
調製が容易であるために、プローブ部分の付加にはNHS
−エステルを使用することが好ましいことが知られてい
る。しかし、チオール、カルボン酸、エポキシドなどの
ような、他の修飾可能な官能基とともにあるオレフィン
リンカーアームもまた、使用され得る。さらに、望まし
いと思われる場合には、リンカーアームおよびプローブ
部分の両方を１つの工程で付加し得る。
特に、次の構造を有する修飾されたヌクレオチド； ここで、Ｂは、糖成分のＣ１′位に共有結合したプリ
ン、７−デアザプリンあるいはピリミジン成分を表し、
Ｂがプリンあるいは７−デアザプリンである場合、それ
は該プリンあるいは該デアザプリンのN9位に付加され、
Ｂがピリミジンである場合、それはN1位に付加されてお
り； Ａは、少なくとも３個の炭素原子からなる成分を表し、
該化合物が二本鎖リボ核酸、デオキシリボ核酸の二重鎖
あるいはDNA−RNAハイブリッドに導入されるとポリペプ
チドと検出可能な複合体を形成し得； 点線は、ＢとＡをつなぐ結合基を表し、Ｂがプリンであ
る場合、該結合はプリンの８位において付加され、Ｂが
７−デアザプリンである場合、該係合は該デアザプリン
の７位において付加され、Ｂがピリミジンである場合、
該結合は該ピリミジンの５位において付加されており；
そして x,yおよびｚの各々は、 を表す、ヌクレオチドは、次の工程によって調製され得
る： （ａ）次の構造、 を有する化合物を、水銀塩と、適当な条件下、適当な溶
媒中で反応させて次の構造、 を有する水銀化化合物を生成する工程； （ｂ）前記水銀化化合物を、前記水銀化化合物の−Hg+
部分と反応する、構造式・・・Ｎで表される化学成分と
反応させる工程であって、前記反応が水溶液中K2PdCl4
の存在下で、適当な条件下で行われて、次の構造、 を有する化合物を生成し、ここで、Ｎは反応性の末端官
能基あるいはＡである工程；および （ｃ）ＮがＡの場合、該化合物を該修飾ヌクレオチドと
して回収する工程、 またはＮが反応性末端基である場合、Ｍが水溶液中で適
当な条件下で前記修飾されたヌクレオチドを生成する、
Ｎとの反応性を有する官能基を表す時、前記化合物をＭ
−Ａ構造を有する化合物と反応させて、次いでそれを回
収する工程。
次の図は実例である： 該反応は、水素イオン濃度がpH1ほど低くても、あるい
はpH14ほど高くても行い得るが、約４から８の範囲で操
作するのが好ましい。このことは、特に、このpH範囲外
では加水分解される、ヌクレオシドポリホスフェート、
ポリヌクレオチドおよびヌクレオチド補酵素のような不
安定な化合物を取り扱う場合にそうである。同様に、不
安定な有機性基質の分解の可能性を避けるために、約20
℃から30℃の範囲で操作することが好ましい。しかし、
該反応は約５℃から100℃の間で行い得る。化学反応で
は通常のことであるが、高温は反応速度を促進し、低温
は遅める。従って、５℃から100℃の温度範囲では、至
適反応時間は約10分から98時間の間で変化し得る。好ま
しい温度範囲では、反応時間は通常約３から24時間の間
で変化する。
pHを所望の範囲内に維持する好ましい方法は、緩衝液の
使用による。種々の緩衝液が使用され得る。これらに
は、例えば、酢酸ナトリウムあるいは酢酸カリウム、ク
エン酸ナトリウムあるいはクエン酸カリウム、クエン酸
カリウム−リン酸、トリス−酢酸およびホウ酸−水酸化
ナトリウム緩衝液が含まれる。使用時の緩衝液の濃度は
最高約2Mまでの広い範囲で変化し得る。
水銀化およびパラジウム触媒による付加反応の特に有利
な点は、水中で行えることであり、少量の有機溶媒を、
溶解性を補助するものとして有用に含み得る。通常選択
される有機溶媒は、水と混和可能なものである。これら
は、メタノール、エタノール、プロパノール、グリセリ
ン、ジオキサン、アセトン、ピリミジンおよびジメチル
ホルムアミドのようなエーテル、アルコール、エステ
ル、ケトン、アミドなどから選択され得る。しかし、メ
タノールのようなアルコールの存在が、しばしば、オレ
フィン２重結合にかかるアルコキシ付加を起こすことが
知られているので、溶解性を補助するのに使用される有
機溶媒は、注意深く選択するべきである。α−あるいは
β−外環炭素原子へのアルコキシ置換体の導入によって
しばしば、酵素基質として非常に効率悪くしか使用され
ない化合物が産生される。
種々の水銀塩が使用され得るが、ここで好まれる塩は、
酢酸水銀である。さらに、前述したように、化合物は、
先ずリンカーアームを付加し、次いでＡ成分を付加する
か、あるいはＡがすでに結合しているリンカーアームを
付加することにより調製され得る。従って、構造式・・
・Ｎで表される化学成分は、最終的結果として所望の化
合物が生成されればいかなるものでも有り得る。
例には、次のものが含まれる； −CH−CH−CH2−NH2, −CH−CH−CH2−NH−biotin,および これらの反応に用いられる反応物の量は広く変化し得
る。しかし、概して、非水銀化化合物、水銀化化合物お
よびパラジウム含有化合物の量は実質的に化学量論的で
あるが、一方、水銀塩および・・・Ｎ化合物はモル濃度
単位で過剰である。例えば、 各々、１モルの水銀化化合物あるいは非水銀化化合物当
り５−20モルの・・・Ｎあるいは水銀塩量が存在する。
実際には、量は反応条件の変化および反応物の厳密な性
質に依って変化する。
酵素基質として機能可能なヌクレオチド誘導体に直接付
加されたビオチンプローブ部分を有することは、遂行し
得る実験的方法および分析に使用し得る検出方法（顕微
鏡的および非顕微鏡的）の両方にかなりの多用性を与え
る。例えば、ビオチンヌクレオチドは、細胞あるいはク
ルードの細胞抽出物により合成過程にある、ポリヌクレ
オチドに導入され得、従って、発生期（成長中）のポリ
ヌクレオチド鎖の検出および／あるいは単離を可能にす
る。そのような方法は、どのような直接的化学修飾によ
っても不可能である。さらに、酵素は、ビオチンのよう
なプローブ部分をポリヌクレオチドの高度に選択的ある
いは部位特異的位置へ導入するための試薬として使用さ
れ得る。
同様のプローブ部分で修飾された生成物の化学合成で
は、最良の場合でも達成は非常に困難と考えられる。
ビオチンあるいはイミノビオチンを含有するヌクレオチ
ドの合成は、本明細書中これ以後に述べる実施例に詳細
に示されるようにして達成された。Ｃ−５位の炭素原子
に結合されたこれらのプローブ部分のどれかを含む、ピ
リミジンヌクレオシド三リン酸は、原核細胞あるいは真
核細胞に由来する、精製された、多様な核酸ポリメラー
ゼの優れた基質であった。これらには、E. coliのDNA
ポリメラーゼＩ、バクテリオファージT4DNAポリメラー
ゼ、ネズミ（Ａ−９）およびヒト（HeLa）細胞のDNAポ
リメラーゼαおよびβ、および単純ヘルペスウィルスの
DNAポリメラーゼが含まれる。これを確認するデータ
を、Rigbyらのニックトランスレーションの条件（P.W.
J. Rigby, M. Dieckmann, C. RhodesおよびP. Berg, J.
Mol. Biol. 113, 237, 1977）あるいはBourguignonら
のギャップ修復反応（G.J. Bourguignon, P.J.Tattersa
llおよびD.C. Ward, J.Virol. 20, 290, 1976）のどち
らかを用いて、E. coliのDNAポリメラーゼ反応から得
た。Bio−dUTPもまた、Millerらの方法によるリゾレシ
チンの処置（M.R. Miller, J.C. Castellot, Jr.および
A.B. Pardee, Exp. Cell Res. 120, 421, 1979）により
透過性となったCHO細胞、および単純ヘルペスウィルス
に感染したBHK細胞から調製した核の複製系の両方で、
ポリメラーゼの基質として機能することが見い出されて
いる。ビオチン化リボヌクレオシド三リン酸が、E. co
liおよびバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼの基
質として機能することが見い出されているが、それらの
デオキシリボヌクレオチド三リン酸相当物ほど効果的に
使用されない。実際、調査された真核細胞RNAポリメラ
ーゼ（HeLa細胞RNAポリメラーゼIII、仔ウシ胸腺RNAポ
リメラーゼIIおよびマウス細胞RNAポリメラーゼII）に
よる、それらの導入は非常に悪い。この基質の機能の範
囲が限られていることは、ある種のインビボあるいはイ
ンビトロでの転写の研究における使用を制限するが、ビ
オチンでラベルされたRNAプローブは、E. coliあるい
はT7 RNAポリメラーゼを用いてDNA鋳型から酵素的に調
製され得るか、あるいはRNAリガーゼをビオチン化−pCp
のような化合物とともに用いる３′末端標識法より、調
製され得る。しかし、UTPのAA誘導体およびNAGE誘導体
は、上述の真核細胞のRNAポリメラーゼの基質である。
これらのアナログに対する抗体が入手可能であれば、免
疫学的あるいは親和性による方法で転写途中の転写物の
単離は実行可能である。
ビオチンあるいはイミノビオチン置換体を有するヌクレ
オチドの酵素的重合は直接モニターされなかった。なぜ
ならば、これらのプローブ部分はいすれも放射性ラベル
されていなかったためである。しかし、２つの実験系に
よる証拠によって、ビオチン化−ヌクレオチドが導入さ
れたことが明かに示された。第一に、ビオチン−ヌクレ
オチドの存在下で合成されたポリヌクレオチドは、アビ
ジンあるいはストレプトアビジンアフィニティーカラム
でのクロマトグラフによって選択的に保持される（表Ｉ
およびII）。例えば、ニックトランスレーション法によ
り32P−dAMPを取り込ませた正常なDNAは、0.5MのNaClを
加えると定量的に溶出されるが、高濃度の塩、尿素、グ
アニジン−塩酸、ホルムアミドあるいは50mMのNaOHでよ
く洗浄した後でも、ビオチン化−DNAあるいはイミノビ
オチン化−DNAの大部分は樹脂に結合したまま残る。こ
れらの洗浄条件で溶出される少量の放射性ラベルのフラ
クションは、２度目に樹脂にかけても保持されず、この
ことは放射活性は、ビオチン置換のないDNA断片にある
ことを提示する。第二の証拠は、精製した抗ビオチンIg
Gでの処理後、ホルマリン固定されたStaphylococcus au
reusによる処理した場合、ビオチンラベルされたポリヌ
クレオチドのみが免疫沈澱されることである（表II
I）。これらの表のデータから、この方法によって、非
常に少量のビオチンが検出され得ることは明かである。
これらの結果はまた、DNAはその天然の二本鎖の形態の
ままで、ビオチン分子がアビジン、ストレプトアビジン
あるいは特異的な抗体によって認識され得ることを示
す。これは、抗体結合あるいはアビジン親和性による方
法が、ハイブリダイゼーション法を用いるプローブの検
出に有用であるために全く必須のものである。
従って、次の構造を有する、優れた化合物の調製が可能
である： ここで、B,B′およびＢ″の各々は、糖成分のC1′位に
共有結合しているプリン、７−デアザプリンあるいはピ
リミジン成分を表し、B,B′あるいはＢ″がプリンある
いは７−デアザプリンである場合はいつも、該プリンあ
るいは７−デアザプリンのN9位で結合し、そしてＢ、
Ｂ′あるいはＢ″がピリミジンである場合はいつも、N1
位で結合しており、 Ａは、少なくとも３個の炭素からなる成分を表し、該化
合物が相補的リボ核酸あるいはデオキシリボ核酸分子で
形成される２重鎖複合体に導入される場合にポリペプチ
ドと検出可能な複合体を形成し得、 点線は、ＢとＡとをつなぐ化学結合を表し、Ｂがプリン
である場合、該結合は該プリンの８位で結合しており、
Ｂが７−デアザプリンである場合、該結合は該デアザプ
リンの７位で結合しており、そしてＢがピリミジンであ
る場合、該結合は該ピリミジンの５位で結合しており； ｚはＨ−あるいはHO−を表し；そして ｍおよびｎは０から約100,000までの整数を表す。
もちろん、概してｍおよびｎが同時に０であることはな
いということは、容易に理解されるべきである。なぜな
らば、その場合には化合物は、前述の単なる修飾された
ヌクレオチドになるからである。概して、Ｂ′および
Ｂ″は同じオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチ
ド内でも変化し、交互にウラシル、シトシン、チミン、
グアニン、アデニンなどとなる。さらに、概して、その
変化は、周知の遺伝コードのペプチド合成をコードする
順序のヌクレオチド配列に相当する。しかし、示されて
いる構造はまた、本発明による修飾することのみを目的
とする、ポリC,ポリＵ、ポリｒ（Ａ−Ｕ）、およびポリ
ｄ（Ａ−Ｕ）、および仔ウシ胸腺DNA、E. coliあるい
は酵母のリボゾームRNA、バクテリオファージRNAおよび
DNA（R17、fd）、動物ウィルス（SV40 DNA）、染色体DN
Aなどのようなポリヌクレオチドを包含することを意図
する。
さらに、前記構造はオリゴマーあるいはポリマー中に存
在する、１つ以上の修飾されたヌクレオチド、例えば、
２から30の修飾されたヌクレオチドを包含することも理
解されるべきである。この点に関する重要な因子は、修
飾箇所の数が多くないと目的とする使用には効果がなく
なることである。
最後に、末端基が適合可能あるいは反応性である限り、
修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド
をつないで、同じ構造を有するより大きな分子を形成で
きる。
これらの化合物は適当なヌクレオチド、特に、適当な条
件下で合成を導く核酸鋳型の存在下での、ヌクレオチド
三リン酸の酵素的重合によって作成し得る。そのような
条件は、用いられる酵素、存在するヌクレオチドの量、
および他の変わり得る因子によって広く変化し得る。酵
素の実例には、E. coliのDNAポリメラーゼＩ、バクテ
リオファージT4のDNAポリメラーゼ、ネズミおよびヒト
（HeLa）細胞のDNAポリメラーゼαおよびβ、単純ヘル
ペスウィルスのDNAポリメラーゼ、E. coliのRNAポリメ
ラーゼ、バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼ、そ
してHeLa細胞のRNAポリメラーゼIII、仔ウシ胸腺RNAポ
リメラーゼII、およびマウス細胞RNAポリメラーゼIIIを
含む真核細胞RNAポリメラーゼが含まれる。
さらに、オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド
の末端に付加して、５′に付加されるか、あるいは３′
に付加されるかによってｍあるいはｎが０である化合物
を調製し得る。さらに、塩基がビオチン化されているpC
pあるいはpUpのような化合物は、酵素RNAリガーゼを用
いて、存在する分子に付加され得る。
修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド
はまた、各々のヌクレオチドの修飾のための前述した方
法を用いて、存在するオリゴヌクレオチドあるいはポリ
ヌクレオチドの化学的修飾によって、調製し得る。
本発明の種々の修飾されたヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドは、複合体を形成するの
に適当な条件下で複合体を形成できるポリペプチドに、
化合物を接触させることにより検出され得る。ここでポ
リペプチドは、複合体が形成されると、概して従来の検
出法で検出され得る、１つ、あるいはそれ以上の成分を
含む。
ビオチン化型プローブ用のポリペプチド検出分子の１つ
はアビジンである。アビジン−ピオチン相互作用は、自
然界に見られる、最も強い非共有結合定数の１つ（Kdis
＝10＝15）を持つ。アビジンを潜在的に証明可能な指標
分子、例えば、蛍光色素（フルオロセン、ローダミ
ン）、高電子密度試薬（フェリチン、ヘモシアニン、コ
ロイド金）あるいは不溶性の反応生成物を沈積できる酵
素（パーオキシターゼ、アルカリフォスファターゼ）に
結合させると、ビオチンプローブの存在、位置、および
／あるいは量を確立し得る。
あいにく、アビジンは核酸あるいは染色質と共に使用さ
れる場合、望ましくない１つの性質を有する。アビジン
が、濃縮した染色質あるいは大量の核酸を含む細胞分画
に、そのビオチン結合性とは無関係に固く結合すること
が、報告されている（M.H.Heggeness, Stain Technol.,
52,165,1977;M.H HeggenessおよびJ.F. Ash, J.Cell.
Biol., 73,783, 1977;E.A. BayerおよびM. Wilchek, Me
thods of Biochemical Analysis 26,1,1980）。アビジ
ンはpI10.5の塩基性の糖タンパク質であるので、そのヒ
ストン様特性あるいはその糖質成分に、これらの観察さ
れている非特異的相互作用の原因が最もありそうであ
る。
ビオチン含有ヌクレオチドおよび誘導体のための好まし
いプローブは、土壌微生物Streptomycesavidiniiによっ
て合成されるアビジン様タンパク質、ストレプトアビジ
ンである。この調製および精製はHoffmanら、Proc., Na
tl. Acad.Sci., 77,4666（1980）に記載されている。ス
トレプトアビジンはアビジンより非常に低いpI（5.0）
を有し、糖鎖を持たず、アビジンより非常に弱いDNAへ
の非特異的結合を示し、従って、核酸検出法の適用に有
力な利点を提供する。
ビオチン様プローブの検出に最も好ましいタンパク質
は、単特異性ウサギIgGの抗ビオチン免疫グロブリンで
ある。以前に報告されている方法に従って、この化合物
をウサギをビオチンを結合したウシ血清アルブミンで免
疫して調製し（M. Berger, Methods in Enzymology,62,
319［1979］）、アフィニティークロマトグラフィーで
精製した。免疫グロブリン−ハプテンの親和定数は、ア
ビジン−ビオチン複合体のそれよりかなり低いKassn値
（106から1010）を有するが、アビジン−イミノビオチ
ン複合体のそれと実質的に同等である。さらに、抗ビオ
チン抗体は、インサイチュハイブリダイゼーションによ
る染色体上の特異的ポリヌクレオチド配列の検出に非常
に有用であることが証明されている。なぜならば、抗体
の染色質物質への非特異的結合は、もしあっても、ごく
僅かだからである。
本発明の修飾されたポリヌクレオチドは、ハイブリダイ
ゼーションプローブとしての使用に適合可能な条件下
で、変性および復元可能である。数種のビオチン置換DN
AおよびRNAポリマーの温度変性の様相およびハイブリダ
イゼーション特性分析はこのことを明かに示す。例え
ば、ニックトランシレーション法により１キロベース当
り約10〜100のビオチン残基を導入させたpBR322 DNAあ
るいはλDNAは、ビオチンを含有しないコントロールのD
NAのTm値と基本的に同一のTm値を有する。さらに、32P
ラベルされ、ビオチン置換されたpBR322 DNAは、プラス
ミドを有する細菌のコロニーの検出にハイブリダイゼー
ションプローブとして使用されると、チミジン含有コン
トロールDNAと同程度の特異性およびオートラジオグラ
フのシグナル強度を示した。
一方のストランドのすべてのチミジン（5Kb当り全部で1
250個）がビオチン化ヌクレオチドで置換されている、M
VM RF DNAのようなDNA二重鎖では、Tmは置換されていな
いコントロールのそれより５℃低いのみである。各々の
塩基対がビオチン化−dUMP残基を有するポリｄ（Ａ−bi
oU）のTmはポリｄ（Ａ−Ｔ）コントロールより15℃低い
が、変性および復元の両方の間に観察される協調性の度
合および吸光性の程度は２つのポリマーで同様であっ
た。RNA二重鎖およびDNA/RNAハイブリッドの平行した分
析は、それらのTmもポリマーのビオチン含有量の増加に
従って低下することを示す。しかし、ポリマーのハイブ
リダイゼーション特性を有意に変化させることなく、十
分な量のビオチン分子を導入させ得ることは明かであ
る。
これらの結果は、染色体、固定された細胞あるいは組織
切片中の特異的ポリヌクレオチドの検出および／あるい
は位置決定のためのプローブとして、ビオチン置換され
たポリヌクレオチドを使用し得たことを強く提言した。
ビオチン置換されたプローブを検出する、概括的プロト
コールを以下に図説する： インサイチュコロニーハイブリダイゼーション法あるい
はノーザン／サザンハイブリダイゼーション法によるプ
ローブ検出の概括的プロトコール この概括的図解は、遺伝子マッピング（細胞遺伝学）お
よび組み換えDNA工学に使用される方法のみを説明す
る。しかし、これは、臨床試料中の細菌、ウィルス、真
菌、あるいは寄生虫由来の核酸の検出に同等に適用され
得、放射性同位元素の使用に依らない臨床診断への強力
な新しい方法の基礎となる。
ビオチン検出の免疫学的および組織学的方法は、迅速な
遺伝子マッピングのためのインサイチュハイブリダイゼ
ーション、およびブロットハイブリダイゼーション法に
よる特異的核酸配列の検出のための非放射性方法にこの
基本的方法が使用され得ることを示した。この技術は、
新しい臨床診断法の開発に使用され得る。
この方法を用いて、特異的デオキシリボ核酸あるいはリ
ボ核酸分子、特に、生存する生物、例えば細菌、真菌、
ウィルス、酵母、あるいは哺乳類のような生存する生物
に由来するような分子の存在を決定することが可能であ
る。そして、このことは患者あるいはその他の被験体中
の核酸を有する病原体の診断を可能にする。
さらに、それは抗生物質耐性を調べるための細菌のスク
リーニング法を提供する。従って、例えば、Streptococ
cus pyogenesあるいはNeisseriameningitidisのペニシ
リン耐性;Staphylococcusaureus、Candida albicans、P
seudomonas aeruginosa、Streptococcus pyogenes、あ
るいはNeisseria gonorrhoeaeのテトラサイクリン耐
性；およびMycobacterium tuberculosisのアミノグリコ
シド耐性を決定し得る。
これらの方法では、微生物あるいはその抗生物質耐性を
特徴付ける核酸配列に相補的で、そして本発明による１
つあるいはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを付加的
に含むポリヌクレオチドを調製する。このポリヌクレオ
チドを、該微生物から採取した核酸に精密にハイブリダ
イズさせる。ハイブリダイズしないことは、前記微生物
あるいは耐性特性が存在しないことを示す。ハイブリダ
イズした核酸二重鎖は次に、該二重鎖と、検出可能な成
分を有する適当なポリペプチドとの複合体を形成し、適
当な検出技術を用いて複合体の存在を検出することによ
り、同定される。陽性の検出は、この複合体、二重鎖が
存在し、従って、目的の核酸配列が存在することを示
す。
この方法は、サラセミアおよび鎌状赤血球性貧血の様な
遺伝子疾患の診断に応用され得る。その存在あるいは欠
失（サラセミアの場合）が疾患に関連するデオキシリボ
核酸遺伝子配列は、以下に述べる、適当な検出可能なポ
リペプチドとの複合体形成に基づく、本発明によるポリ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって検出
され得る。
染色体上の特異的遺伝子座への遺伝子、あるいはそれら
の転写物のマッピングは、細胞融合および体細胞遺伝子
学の技術を主に用いた、冗長で時間を浪費する仕事であ
った。インサイチュハイブリダイゼーションは、ショウ
ジョウバエのような染色体の多糸形成を行う種の、単一
コピーの遺伝子配列のマッピングに都合よく用いられて
きたが、標準のハイブリダイゼーション法を用いての、
多くの高等真核細胞染色体中の特有の配列遺伝子の検出
は、不可能でなくとも、非常に困難であった。ハイブリ
ダイゼーション部位のオートラジオグラムによる位置決
定を促進するための、非常に高い特異的放射性を有する
ポリヌクレオチドプローブの必要性はまた、プローブの
急速な放射性分解とそれに伴う銀粒子沈積による背景ノ
イズの増加という結果を生む。低度から中度の特異的放
射性を有するハイブリダイゼーションプローブを使用し
た場合、リボゾームRNA遺伝子あるいはサテライトDNAの
ような、複数のコピーが存在する配列の検出でも、長い
日数あるいは週におよぶ露出時間が必要となる。組み換
えDNA工学によって、真核細胞に見い出される、実質上
すべての単一コピーの配列の分子クローニングを実現可
能になったため、そのようなクローン化されたゲノムの
断片の染色体上の元の位置をマッピングするための、迅
速で感度の良い方法があることは非常に有益と考えられ
る。
修飾されたヌクレオチドは、放射性同位元素の使用を避
けたインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子
のマッピング法に使用され得る。この方法は、ニックト
ランスレーションによって酵素的にDNAプローブに導入
し得る、ビオチンを含有するチミジンアナログの利点を
利用する。インサイチュでのハイブリダイゼーション
後、ビオチン分子は、アフィニティー精製されたウサギ
抗ビオチン抗体に対する抗原として働く。フルオレセイ
ンラベルされたヤギ抗ウサギIgGからなる免疫蛍光抗体
サンドイッチ法は、クローン化された遺伝子配列の、緑
黄色のバンドとして検出される細胞遺伝学的位置の、迅
速で特異的な決定を可能にする。この方法は、インサイ
チュでの遺伝子の位置を決める通常のオートラジオグラ
ム法に４つの主要な利点を提供する；背景ノイズの減
少、バンド間の解像能の増加；プローブがハイブリダイ
ズした位置の決定に要する時間の減少；および化学的に
安定なハイブリダイゼーションプローブ。この方法は、
Drosophila melanogasterの多糸染色体中の反復する配
列および１つしかない配列の位置決定およびマウスの分
裂中期染色体中のサテライトDNAの位置決定にうまく適
用されてきた。
従って、本発明による修飾されたヌクレオチドを用いる
インサイチュ遺伝子マッピングのための間接免疫蛍光法
によって、多糸染色体をプローブの有効性を証明する実
験系として使用し得ることが、見い出されている。プロ
ーブには、約５から約22キロベースの範囲の挿入物を有
するプラスミドベクター中にクローン化されたtRNA遺伝
子のような、Otto SchmidtおよびDieter Sollから取得
された種々のクローン化されたショウジョウバエの配列
が含まれる。多くのこれらのクローンは、放射性同位元
素を用いる通常のインサイチュハイブリダイゼーション
法により、ショウジョウバエ染色体地図上の特異的なバ
ンドにすでに割り当てられている。
DNAプローブをBio−dUTPの存在下でニックトランスレー
トした。時によって、3H dATPおよび／あるいは3H dCTP
をニックトランスレーション反応混合液に加えた。これ
は、オートラジオグラフおよび免疫蛍光の両方による、
１個の染色体塗布試料中の配列の位置決定を可能にし
た。インサイチュハイブリダイゼーションは、M.L.Pard
ueおよびJ.G.Gall, Methods in Cell Biol., 10, 1（19
75）に記載のように行われた。2xSSCで最後に洗浄して
ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、スラ
イドをPBS（リン酸緩衝化生理食塩水）ですすぎ、PBS中
のウサギ抗ビオチン抗体2.5μg/mlおよび10mg/mlのBSA
とともに37℃で２−16時間インキュベートした。次にス
ライドをFITCラベルしたヤギ抗ウサギIgG（Miles Labor
atories、10mg/ml BSA含有PBSで1:100に希釈した）とと
もに１−４時間インキュベートした。蛍光発色している
染色体を見るため、エバンズブルーが、赤色に対する対
比染色として、しばしば必要とされた。
5kbおよび22kbの挿入物を各々有する、プラスミドpBR17
DおよびpPW539をこの方法でハイブリダイズさせたとこ
ろ、ハイブリダイゼーションのパターンは各試料塗布毎
に再現性があり、１枚のスライド上の90％を超える染色
体塗布に明白に観察された。
クローン化転移因子pAC104はショウジョウバエゲノムの
多くの部位に位置することが知られている。このプロー
ブのインサイチュハイブリダイゼーションにより得られ
たオートラジオグラフおよび蛍光写真の比較は、この方
法の主要な利点、すなわち、オートラジオグラフに現れ
る銀粒子が拡散した部位に、免疫蛍光ラベルによって２
重あるいは一連のバンドが識別されることを説明する。
この方法の直ちに明かとなる他の利点は、間接免疫蛍光
法による遺伝子位置指定に要する時間の著しい短縮であ
る。６時間以内のハイブリダイゼーションにより、DNA
断片を特異的バンドに指定し得る。これは、何日も、あ
るいは何週間も要するオートラジオグラフの露出法に比
較される。解像能の増加とともにこの要素は、間接免疫
蛍光法により検出される修飾されたヌクレオチドの使用
を直ちに、古典的方法よりも好ましいものにする。
この免疫学的方法はまた、哺乳類の染色体にも使用でき
ることが示され、分裂中期のマウス染色体のセントロメ
アの部位にサテライトDNAの位置が決定されている。こ
の結果は、ヒトおよびその他の哺乳類の染色体の単一コ
ピー（ただ１つの）配列のための簡単な遺伝子マッピン
グ法の開発の基盤を提供する。そのような方法は、我々
の染色体の遺伝学的機構の理解を深め、臨床的細胞遺伝
学的診断をより迅速にまた実用的にする。
ハイブリダイゼーション後、染色体塗布試料をウサギ抗
ビオチンIgGと作用させる１工程の「抗体サンドイッ
チ」法は成功し得るが、この方法は明確な遺伝子位置の
決定に十分な蛍光を発色し得ない。しかし、Lammら、
（1972）;Wofsyら、（1974）によって記載された「ハプ
テン−抗体サンドイッチ法」を用いて、非常に強い蛍光
定量性シグナルを達成し得る。この方法では、我々の場
合では単特異的ウサギ抗ビオチンIgGである一次抗体
を、好ましくはこの免疫グロブリンが抗原アフィニティ
ーカラム（ビオチン−セファロース TM）に結合してい
る間に、2,4−ジニトロフルオロベンゼンのようなハプ
テン化試薬で化学的に修飾する。その抗原結合親和性あ
るいは特異性を低下させることなく、15−20個のハプテ
ン（DNP）基を一次抗体に結合させ得る（Wallaceおよび
Wofsy、1979）。試験試料を一次抗体で処理した後、蛍
光ラベルした抗IgGではなく、蛍光ラベルした抗ハプテ
ンIgG抗体とともにインキュベートすると、蛍光シグナ
ルの５−７倍の増加が達成され得る。また、単特異的モ
ルモット抗DNP IgGをも入手できるので、我々はこの二
次抗体をハブテン化し得、従って、DNPラベルした抗ビ
オチンIgG、およびビオチンラベルした抗DNP IgGの２種
類の抗ハプテンIgGを作成する。これらを交互に使用し
て、数回繰り返すハプテン−抗体サンドイッチを作成
し、次に，多くの哺乳類のIgG分子に特異的に結合す
る、蛍光ラベルしたStaphylococcusaureusプロテインＡ
を作用させ得ると、それはそれに付随する有用性ととも
に、一次抗体シグナルを膨大に増幅させ得ると考えられ
る。
Streptomyces avidiniのタンパク質ストレプトアビジン
は、結合された可視化システム（例えば、蛍光プローブ
（上述）あるいは組織化学的試薬（下述））をハイブリ
ダイズしたビオチン含有ポリヌクレオチドの部位に特異
的に結合させる担体として、抗ビオチンIgGに代わり得
る。抗ビオチンIgGより優れているストレプトアビジン
の利点の１つは、ハプテン−IgG相互作用の親和定数が1
07から1010であるのに対し、ストレプトアビジンのビオ
チンに対する親和性はKassn＝1015である点である。速
い反応速度および非常に強い親和性は、ビオチン化プロ
ーブの位置を決めるのに要する時間が、免疫学的試薬の
場合は数時間であるのに対し、ストレプトアビジンの場
合は数分であることを意味する。
ストレプトアビジン検出システムの初期の評価は現在進
行中である。ビオチン化DNAプローブにハイブリダイズ
した多糸染色体をストレプトアビジンとインキュベート
し、次に、ビオチンおよびFITCで２重にラベルしたウシ
血清アルブミン（FITC,ビオチン化BSA）とともに引続き
インキュベートする。４つのストレプトアビジンサブユ
ニットのうちの１つだけが、各々のビオチン化DNAの部
位に結合するらしいので、ストレプトアビジン−ビオチ
ン化ヌクレオチド複合体の、残りの３つの結合されてい
ないサブユニットの各々に、ラベルしたBSA分子１個が
結合し得る可能性がある。このストレプトアビジン＋FI
TC,ビオチン化BSAの単層からの蛍光シグナルを先に述べ
た基本的「抗体サンドイッチ法」を用いてコントロール
と比較する。
「抗体サンドイッチ法」およびストレプトアビジン＋FI
TC,ビオチン化BSAの検出強度が比較可能であれば、スト
レプトアビジン＋FITC,ビオチン化BSAシステムを、多重
「ハプテン−抗体サンドイッチ」法に相当する様式で１
コピーを検出できる感度に増強することを試みる。いく
らかのBSA上のビオチン基は第一層のストレプトアビジ
ンに結合しないので、十分なシグナルが得られるまで第
二層のストレプトアビジンを加え得る。例えば、もし第
二層で２個のストレプトアビジンプロトマーのみが各々
の第一層BSAに結合し、これらのストレプトアビジンプ
ロトマーの各々が３つのFITC,ビオチン化BSA分子に結合
すると、第二層のシグナルの強度は第一層のそれの２倍
になる；第三層では、同様の結合化学量論的に、蛍光強
度は第一層の12倍になり、従って、総強度は連続的に付
加された層とともに急速に増加する。
付加する蛍光およびビオチンプローブの量を最大にする
ために、サイログロブリンのような、BSAより大きなタ
ンパク質担体を使用する計画がある。また、ビオチンプ
ローブと担体タンパク質との間に長いリンカーアームを
使用することも必要であり得る。長いリンカーアーム
は、ビオチン化蛍光担体分子を各々の結合していないス
トレプトアビジンサブユニットへの理論上の輸送を、立
体的に最良にし、ビオチン化蛍光担体に結合する次の層
のストレプトアビジンプロトマーの数を最大にする。蛍
光プローブおよびビオチンの担体タンパク質への置換が
可溶性および／あるいは非特異的結合の問題を起こさな
いことを確認するために、先のように、適当なコントロ
ールをとる。
ストレプトアビジン−担体タンパク質輸送システムは、
その輸送の速さに加えて、免疫蛍光法より優れた２つの
有意な利点を有する。第一に、層の形成には２つのタン
パク質しか必要としない。第二に、修飾される必要があ
るのは担体タンパク質のみであり、ビオチン基がストレ
プトアビジンに近付ける限り、機能的あるいは構造的統
合性でさえ必ずしも維持する必要はない。
ハイブリダイズしたプローブを可視化する蛍光法に代わ
るものは、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
あるいはβ−ガラクトシダーゼをハイブリダイゼーショ
ン部位に送り、そこで可溶性基質を不溶性の色素沈澱物
に酵素的に転換して光学顕微鏡下で観察可能にすること
である。この技術の重要な利点は、組織学的方法は蛍光
検出より10から100倍感度が高いことである。それに加
えて、色素沈澱物は長く光に曝されても色が薄れず、従
って、蛍光顕微鏡の一般的欠点の１つを回避できる。こ
れらの酵素は蛍光プローブの代わりに「ハプテン−抗体
サンドイッチ」法の最後の抗体に、グルタルアルデヒド
のような二機能性試薬を用いて、あるいはパーオキシダ
ーゼの場合はパーオキシダーゼの糖成分を酸化してアル
デヒドにしてこれらの残基を所望のタンパク質のε−ア
ミノ基に結合することによって結合し得る。ストレプト
アビジン−ビオチン化担体タンパク質法用には、ビオチ
ン化基を結合した酵素が蛍光的ビオチン化担体システム
に置き代わる。さらに、酵素は、ビオチン化BSAあるい
はサイログロブリンを用いて前の層に蓄積されるストレ
プトアビジン部位の増幅を有する、ストレプトアビジン
の最後の層に、ビオチンを介して結合し得る。我々は近
い将来、インサイチュハイブリダイゼーションを背景の
問題なく可視化するために、必要な組織化学的試薬およ
び適当な基質／不溶性生成物の組み合わせの開発を開始
する。シグナル増幅のための組織化学的方法は、従っ
て、1981年夏に試験準備が完了する。
非常に低いレベルの蛍光の検出および／あるいは画像
は、現在入手可能な画像増感剤あるいは、レーザーおよ
び光電子増倍管からなる画像増感系を用いて可能であ
る。これらの方法は光の検出を個々の光量子のレベルま
で可能にする。適切なデジタル処理システムによって、
画像の各々の点、すなわち、各々のピクセルが物体の点
によって放射される光量子の数に厳密に比例する画像が
作成され得る。この種のシステムあるいは細胞あるいは
細胞の一部がレーザー光線を通って流れるフローシステ
ムを用いて、蛍光物質の検出感度は100および1,000の間
の因数で高くし得、肉眼で検出可能となる。この感度の
増強は１コピーの遺伝子の蛍光を検出するに十分であ
る。
好ましい実施態様では、ピリミジン環のＣ−５位にアリ
ルアミンリンカーアームを介して共有結合したビオチン
分子を有するdUTPおよびUTPのアナログを合成した。こ
れらのビオチン化ヌクレオチドはインビトロで種々のDN
AおよびRNAポリメラーゼの有効な基質である。低レベル
のビオチン置換（１キロベースあたり50モルあるいはそ
れより少ない）を有するDNAは、置換されていないコン
トロールDNAと区別のつかない、変性、再親和性および
ハイブリダイゼーション特性を有する。
従って、本発明はまた、染色体の核型分析法をも提供す
る。この方法では、修飾されたポリヌクレオチドは既知
の遺伝子に相当し、修飾されたヌクレオチドを含むよう
に調製される。これらのポリヌクレオチドを染色体のデ
オキシリボ核酸にハイブリダイズさせ、その結果生じた
二重鎖を、複合体を形成するように、適当な条件下で適
切なポリペプチドと接触させる。このポリペプチドは検
出可能な成分を含むので、複合体の位置を決定し得、従
って、特異的遺伝子の位置を指定し得る。
本発明の他の実施態様は、いくつかのウラシル塩基がプ
ローブ部分を有するように修飾されたポリＵを使用する
ポリＡ含有配列の検出を含む。それとは別の実施態様
は、ｘ、ｙおよびｚのうちの２つが反応して環状成分； を形成する、環状の修飾されたヌクレオチドを含む。そ
して、そのような環状の修飾されたヌクレオチドは、細
胞表面上のホルモンレセプター部位の同定に使用され
得、従って、癌あるいは腫瘍細胞の検出法に使用され得
る。
最後に、本発明により修飾され、その存在が特定の癌細
胞の診断となる、α−胎児タンパク質あるいは癌胎児性
抗原のようなポリペプチドの産生に関与するデオキシリ
ボ核酸遺伝子配列から合成されるメッセンジャーリボ核
酸に相補する、ポリヌクレオチドを調製することによ
り、腫瘍細胞を診断し得る。ハイブリダイゼーションお
よびハイブリッド２重鎖の検出は、従って、腫瘍細胞の
検出法を提供すると考えられる。以下に示す実施例は、
本発明を種々の観点から説明するために述べられるが、
いかなる場合にも本発明の範囲を限定することを意図せ
ず、請求の範囲により特定して述べる。
〔実施例〕
実施例１および２ ビオチン化−UTPおよびビオチン化−dUTPの合成 ａ）水銀化ヌクレオチドの調製 UTP（570mg、1.0ミリモル）あるいはdUTP（554mg、1.0
ミリモル）を100mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0に
溶かし、酢酸水銀（1.59gm、5.0ミリモル）を加えた。
溶液を50℃で４時間加熱し、次いで氷上で冷却した。塩
化リチウム（392mg、9.0ミリモル）を加え、過剰のHgCl
2を除くために、溶液を同容量の酢酸エチルで６回抽出
した。抽出過程の効率を、４、４′−ビス（ジメチルア
ミノ）−チオベンゾフェノンを用いて有機層中の水銀イ
オン濃度を測定することにより、モニターした（A.N.Ch
ristoper,Analyst,94,392,1969）。Daleらが記載した方
法（R.M.K.Dale,D.C.Ward,D.C.Livingston,およびE.Mar
tin,Nucleic Acid Res.2,915,［1975］）で水溶液の一
部をヨード化した後、分光光度計で測定したヌクレオチ
ドの水銀化の程度は常に90％と100％との間であった。
水性層は酢酸エチルによる抽出の間にしばしば濁った
が、その水性層中のヌクレオチド生成物を３容量の氷冷
エタノールを加えて沈澱させ、遠心して集めた。沈澱物
を、冷やした純エタノールで２回、エチルエーテルで１
回洗浄し、次いで風乾した。そうして調製したこれらの
水銀化ヌクレオチドをこれ以上精製せずに、アリルアミ
ンヌクレオチドの合成に使用した。
ｂ）アリルアミン−dUTPおよびアリルアミン−UTPの合
成 （工程ａの）水銀化ヌクレオチドをpH5.0の0.1M酢酸ナ
トリウム緩衝液に溶解し、20mMの濃度（267nmで200 OD/
ml）になるように調整した。水性酢酸溶液中の新鮮な酢
酸アリルアミン2.0Mを、1.5mlのアリルアミン（13.3ミ
リモル）を8.5mlの氷冷4M酢酸にゆっくりと加えること
により調整した。3ml（6.0ミリモル）の中和したアリル
アミンストックを25ml（0.5ミリモル）のヌクレオチド
溶液に加えた。4mlの水に溶解したK2PdCl4の１ヌクレオ
チド相当分（163mg、0.5ミリモル）を、反応を開始する
ために加えた。パラジウム塩（Alfa−Ventron）を添加
すると、反応容器の壁面にでてくる金属沈澱物（Hgおよ
びPd）によって溶液は次第に黒色に変化した。室温に18
−24時間放置後、残っている金属沈澱物の大部分を取り
除くために反応混合液を0.45mmの濾過膜（nalgene）に
通した。黄色の濾過液を５倍に希釈し、100mlのDEAE−S
ephadex TM A−25（Pharmacia）のカラムにかけた。１
カラム容量の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0で洗浄
後、pH〜８−９の酢酸ナトリウムか、あるいはpH7.5の
重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）の、１リットル
の直線濃度勾配（0.1−0.6M）で生成物を溶出した。所
望の生成物は0.30Mおよび0.35Mの間の塩濃度で溶出され
た主要なUV吸収画分にあった。スペクトル分析は、この
ピークがいくつかの生成物を含むことを示し、最終的精
製は、pH3.3の0.5M NH4H2PO4緩衝液（分析用分離）か、
あるいはpH4.3の0.5M酢酸トリエチルアンモニウム（調
製用分離）を溶出液として用いる、Partisil−ODS2カラ
ムの逆相HPLCクロマトグラフィーで達成した。５−（３
−アミノプロペン−１−イル）ウリジン（ウリジンのア
リルアミン付加物）の５′−３リン酸はHPLCカラムから
溶出される最後の画分であり、それらは、まだ特性を調
べていない、３つの夾雑物から明確に分離された。これ
らのヌクレオチドの特性を陽子NMR元素分析によってス
ペクトル的におよびクロマトグラフ的に調べた［AA−dU
TP（C12H16N3O14P3Na4・1H2O）：理論値、C,22.91;H,2.
88;N,6.68;P,14.77、実測値、C,23.10;H,2.85;N,6.49;
P,14.75.AA−UTP（C12H16N3O15P3Na4・4H2O）：理論
値、C,20.61;H,3,46;N,6.01;P,13.3、実測値、C,20.67;
H,4.11;N,5.39;P,13.54］。
ｃ）AA−dUTPあるいはAA−UTPのビオチン化 既述の方法（H.HeitzmannおよびF.M.Richards,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.71,3537,［1974］）により、ビオチン
化−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHSB）を
調整した。AA−dUTP・H2O（63mg、0.1ミリモル）あるい
はAA−UTP・4H2O（70mg、0.1ミリモル）を20mlの0.1Mホ
ウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5に溶解し、2mlのジメチル
ホルムアミドに溶解したNHSB（34.1mg、0.1ミリモル）
を加えた。反応液を室温に４時間放置し、次いで、pH7.
5の0.1M TEABで予め平衡化したDEAE−Sephadex TM A−2
5の30mlのカラムに直接かけた。400mlのTEABの直線濃度
勾配（0.1−0.9M）でカラムを溶出した。ビオチン化−d
UTPあるいはビオチン化−UTPを含む画分は、TEAB濃度0.
55Mと0.65Mとの間に溶出されるが、それをメタノールの
存在下で回転蒸発によって脱塩し、水に再溶解した。時
によって、わずかに濁った溶液が得られた：いくつかの
TEAB溶液中にあった夾雑物によるこの混濁を0.45mmのフ
ィルターで濾過して除去した。長期保存のために、Dowe
x TM 50（Na+型）の存在下で溶液を短時間撹拌すること
により、ヌクレオチドをナトリウム塩に転換した。濾過
後、ヌクレオチドを３容量の冷エタノールを加えて沈澱
させ、エチルエーテルで洗浄し、水酸化ナトリウムのペ
レット上で真空乾燥し、デシケーター内に−20℃で貯蔵
した。直接使用する場合には、pH7.5のtris−HClで20mM
ヌクレオチド溶液を調製し、ヌクレオチドの最終濃度を
5mMに調製した。ストック溶液は−20℃で凍結保存し
た。
bio−dUTPおよびbio−UTP生成物の元素分析で次の結果
を得た。bio−dUTP（C22H30N5O18P3S1Na4・1H2O）：理
論値、C,29.80;H,3.38;N,7.89;P,10.47;S,3.61、実測
値、C,30.14;H,3.22;N,7.63;P,10.31,S,3.70。bio−UTP
（C22H30N5O19P3S1Na4・3H2O）：理論値、C,29.15;H,3.
19;N,7.45;P,9.89;S,3.41、実測値、C,28.76;H,3.35;N,
7.68;P,9.81;S,3.32。
pH7.5でのbio−dUTPおよびbio−UTPのスペクトル特性
［λmax,289nm（ε＝7100）；λmax,240nm（ε＝10,70
0）；λmin,262nm（ε＝4300）］はピリミジン環との結
合に外環２重結合が存在することを反映する。ビオチン
の定量に使用される方法（D.B.McCormickおよびJ.A.Rot
h,Anal.Biochem.,34,326,1970）である、エタノール性
硫酸中でのｐ−ジメチル−アミノシンナムアルデヒドに
よる処理で、これらのヌクレオチドはまた、強い陽性反
応（オレンジ−赤色）を示す。しかし、それらは、AA−
dUTPおよびAA−UTP出発材料の特徴的反応であるニンヒ
ドリンに、もはや反応しない。
実施例３および４ ビオチン化−CTPおよびビオチン化−dCTPの合成 CTPおよびdCTPを、基本的には実施例１で述べたよう
に、ａ）水銀化し、ｂ）アリルアミンと反応させ、およ
びｃ）NHS−ビオチンでビオチン化した。CTP（56.3mg、
0.1ミリモル）あるいはdCTP（59.1mg、0.1ミリモル）を
20mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0に溶解し、酢
酸水銀（0.159gm、0.5ミリモル）を加えた。溶液を50℃
で4.5時間加熱し、次いで、氷上で冷却した。塩化リチ
ウム（39.2mg、0.9ミリモル）を加え、溶液を酢酸エチ
ルで６回抽出した。水性層中のヌクレオチド生成物を３
容量の冷エタノールを加えて沈澱させ、沈澱物を遠心に
よって集めた。沈澱物を純エタノール、エチルエーテル
で洗浄し、そして風乾した。これらの生成物をこれ以上
精製せずに、各々、AA−CTPおよびAA−dCTPの合成に使
用した。水銀化ヌクレオチドを0.1Mの酢酸ナトリウム緩
衝液、pH5.0に溶解し、10mMの濃度（275nmで92 OD/ml）
に調整した。0.6ml（1.2ミリモル）の2.0M酢酸アリルア
ミンストック（実施例１で記載のように調製）を10mlの
ヌクレオチド溶液（0.1ミリモル）に加え、次いで1.0ml
のH2Oに溶解したK2PdCl4（32.6mg、0.1ミリモル）を加
えた。室温に24時間放置後、溶液を0.45mmの膜で濾過し
て金属沈澱物を取り除いた。濾過液を５倍に希釈し、予
め50mMのTEAB、pH7.5で平衡化した、50mlのDEAEセファ
デックスＡ−25のカラムにかけた。ヌクレオチド生成物
を500mlのTEAB、pH7.5の直線濃度勾配（0.05−0.6M）で
分画した。所望の生産物は0.28Mと0.38Mの塩濃度の間に
溶出される、主要なUV吸収部分にあった。次いで、プー
ルした試料を回転蒸発により脱塩し、0.5Mの酢酸トリエ
チルアンモニウム、pH4.2に溶解し、0.5Mの酢酸トリエ
チルアンモニウムを溶出液として用いて、Partisil ODS
−２カラムにおけるHPLCクロマトグラフィーによって最
終精製した。適当な画分をプールし、凍結乾燥し、その
生成物をH2Oに溶解した。Dowex TM 50（Na+型）の存在
下で短時間、撹拌することにより、ヌクレオチドをNa+
塩に転換した。濾過後、Dowex樹脂を取り除くために、
３容量の冷エタノールを加えてヌクレオチドを沈澱し
た。沈澱物をエーテルで洗浄し、次いで風乾した。分析
結果は以下の通りであった:AA−dCTP（C12H17O13N4P3Na
4・2H2O）；理論値、C,22.29;H,2.63;N,8.67;P,14.40.
実測値、C,22.16;H,2.89;N,8.77;P,14.18。AA−CTP（C
12H17N4O14Na4・2H2O）；理論値、C,21.75;H,2.57;N,8.
46;P,14.01.実測値、C,22.03;H,2.47;N,8.69;P,13.81、
0.1Mホウ酸緩衝液、pH8.0中でのスペクトル特性、λmax
301nm（ε＝6,400）、λmin271nm（ε＝3,950）λmax25
0nm（ε＝9,700）。AA−dCTPおよびAA−CTPはどちらも
ニンヒドリン試験で陽性であった。AA−CTP（6.6mg、0.
01ミリモル）あるいはAA−dCTP（6.4mg、0.01ミリモ
ル）を5mlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5に溶解
し、0.2mlのジメチルホルムアミドに溶解したNHS−ビオ
チン（3.4mg、0.01ミリモル）を加えた。室温に４時間
放置後、150mlのTEABの直線濃度勾配（0.1−0.9M）、pH
7.5を溶出液として用いて、試料を10mlのDEAEセファデ
ックスＡ−25のカラムにかけてクロマトグラフィーを行
った。TEABの濃度0.50Mおよび0.60Mの間に溶出される、
ビオチン化CTPあるいはビオチン化dCTPを含有する画分
をプールし、回転蒸発により脱塩し、最終濃度を、pH7.
5の0.02M Tris−HCl緩衝液中で5mMに合わせた後、−20
℃に保存した。生成物はエタノール性硫酸中で、ｐ−ジ
メチルアミノシンナムアルデヒドによって強い陽性ビオ
チン反応を示すが、ニンヒドリンを噴霧すると、第１級
アミンに対する試験で陰性となる。これらの生成物のさ
らなる構造的特徴付はただ今進行中である。
実施例５および６ イミノビオチン化−UTPおよびイミノビオチン化−dUTP
の合成 イミノビオチン臭化水素を既述のようにビオチンから調
製した（K.Hofmann,D.B.MelvilleおよびV.du Vigneaud,
J.Biol.Chem.,141,207−211,1941;K.HofmannおよびA.E.
Axelrod,Ibid.,187,29−33,1950）。イミノビオチンの
Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（NHS）エステルを、既
述されているNHS−ビオチンの合成手順（H.Heitzmannお
よびF.M.Richards,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,71,5537,19
74）によって調製した。実施例１（ｂ項目）に詳細に記
載の通りに調製したAA−UTP（7.0mg、0.01ミリモル）あ
るいはAA−dUTP（6.3mg、0.01ミリモル）を、5mlの0.1M
ホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5に溶解し、0.5mlのジメ
チルホルムアミドに溶解したNHS−イミノビオチン（3.5
mg、0.01ミリモル）を加えた。反応混合液を室温に12時
間放置後、予め0.05M TEAB,pH7.5に平衡化した10mlのDE
AEセファデックスＡ−25に直接かけた。150mlのTEABの
直線濃度勾配（0.05−0.6M）でカラムから溶出した。0.
35Mおよび0.40Mの間のTEABの濃度で溶出されたイミノビ
オチン−UTPあるいはイミノビオチン−dUTP画分を、メ
タノール存在下で回転蒸発して脱塩し、H2Oに溶解し
た。生成物はニンヒドリン試験で弱い陽性と判定され
る、少量のアリルアミンヌクレオチド付加物の不純物を
含んでいた。最終精製はアビジンセファロースによるア
フィニティークロマトグラフィーによってなされた。ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5で0.1Mに調製された不純
物を含んでいる生成物の画分を5mlのアビジンセファロ
ースカラムにかけ、25mlの同緩衝液で洗浄した。次いで
カラムを50mM酢酸アンモニウム緩衝液、pH4.0で洗浄
し、これは所望のイミノビオチン−ヌクレオチド生成物
を鋭いピーク中に溶出した。３容量の冷エタノールを加
えてヌクレオチドを沈澱させ、エチルエーテルで洗浄
し、水酸化ナトリウムのペレット上でin vacuoで乾燥
し、デシケーター中に−20℃で保存した。元素分析およ
び、スペクトルおよびクロマトグラフィーの特性によっ
て、生成物の特徴付を行った。
実施例７および８ NAGE−UTPおよびNAGE−dUTPの合成 アリル（３−アミノ−２−ヒドロキシ−）プロピルエー
テル、略してNAGE、をアリルグリシジルエーテル（Ag
e）（Aldrich Chemical Co.より入手）から調製した。1
0mlのAge（84ミリモル）を、50mlの9M水酸化アンモニウ
ムにゆっくりと加え（蒸発よけフード中で）、そして混
合物を室温に６時間放置した。過剰のアンモニアを減圧
下で回転蒸発させて除き、粘性の黄色油を生成した。プ
ロトンNMRによるこの生成物の分析は、必要とする構造
を有していることを示した。５−水銀−dUTP（0.1ミリ
モル）あるいは５−水銀−UTP（0.2ミリモル）を２−4m
lの0.2M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0に溶解し、使用前
に酢酸でpH5.0に調整した、16倍過剰モル濃度のNAGEを
加えた。最終反応量（4.3および8.4ml）のヌクレオチド
濃度は、各々、43mMおよび42mMであった。１当量のK2Pd
Cl4（0.1あるいは0.2ミリモル）を加えて反応を開始し
た。室温に18時間放置後、反応混合液を0.45μｍの膜で
濾過し、サンプルを５倍に希釈し、酢酸ナトリウムの直
線濃度勾配（0.1−0.6M）を用いてDEAEセファデックス
Ａ−25のカラムでクロマトグラフを行った。そのUVスペ
クトルおよびPartisil ODS−２によるHPLC溶出プロフィ
ールの特徴によって判断された、所望の生成物を含む画
分をプールし、希釈し、さらに重炭酸アンモニウム、pH
8.5の浅い濃度勾配（0.1−0.5M）を用いるDEAEセファデ
ックスでの再クロマトグラフィーによって精製した。こ
れらの条件下で、大部分のNAGE−dUTP（あるいはNAGE−
UTP）を不純物残査からきれいに分離した。この精製段
階において、ヌクレオチドを凍結乾燥し、D2Oに再溶解
した後、プロトンNMRスペクトルを調べた。元素分析用
に、生成物をそのナトリウム塩の形態に転換した。典型
的な分析結果は以下の通りである:Nage−dUTP（C15H22N
3O16P3Na4・2H2O）、理論値、C,24.99;H,3.63;N.5.83;
P,12.88、実測値、C,25.39;H,3.71;N,5.63;P,12.88。
実施例９ 標識されたDNA配列の使用 I.核型分類 （ａ）ヒト遺伝子ライブラリーから約100から200個のク
ローンを選択する。それらを上述のように標識し、各々
のクローンの位置あるいはハイブリダイズした位置を、
肉眼で、あるいは低光レベルビデオシステムで決定す
る。独特の配列の遺伝子に相当するそれらのクローンに
対して、これは特定のヒト染色体上にあるクローン化DN
Aの位置を決定する。各々の染色体に対するいくつかの
クローンを得る。これらの標識されたクローンの各々
は、特定の染色体の同定に使用され得る。それらはま
た、組み合わせて、46個の染色体の各々を22個の常染色
体対の１つ、あるいはX,あるいはＹとして同定するの
に、使用され得る。１セットの標識されたクローンを染
色体にハイブリダイズさせ、次いで蛍光染色剤を加えて
標識することにより、クローンのセットおよびそれらの
位置を可視化させ得、それは特定の色の蛍光を発する。
２番目のセットの標識されたクローンを次いで、使用
し、２番目の蛍光色素と反応させ得る。同じ工程を数回
繰り返し得る。従って、所望するならば、いくつかのセ
ットの蛍光標識を細胞のDNAの、各々の染色体上の異な
る特異的な位置に結合させ得る。これらの標識を視覚的
にあるいはコンピューターによる自動核型分類に使用さ
れ得ると考えられる。
（ｂ）自動核型分類のためには、各々の染色体上の標識
の数に相当するスポットのセットを見い出すことによ
り、46個の染色体の各々のおおよその位置を同定するの
に１セットのクローンを用い得ると考えられる。従っ
て、デジタル化されたイメージをコンピューターで分析
することにより、染色体がさらに分析するのに適当に塗
布されているかを決定できる。それらが適当に塗布され
ているならば、次いで、各々の染色体上の標識されたス
ポットの位置および分布によって、個々染色体の各々を
コンピューター分析で同定することが可能である。
各々の染色体上の特異的な位置に蛍光スポットを配置し
得るという事実を利用することにより、手動によって、
あるいは自動的に、核型分類をそのようなラベルがない
場合よりも非常に効率的に遂行し得る。
II.遺伝的疾患の診断 23番のような特定の染色体に特異的に結合するクローン
を選択することにより、染色体が分裂中期に濃縮されて
いない場合でも、特定の染色体のコピー数を数えること
が可能である。従って、23番の三染色体性の胎児期診断
用に胎児細胞の採取時に、染色体が濃縮していなくても
診断可能である。必要ならば、１セットは23番染色体に
特異的であり、もう一方は他の染色体に特異的であるよ
うな、２セットの標識を使用できる。異なる色であるか
もしれない、各々の細胞中の２つの標識の比を測ること
により、23番染色体数が異常である細胞を同定すること
が可能である。この手順は、低光量のビデオシステムを
使用するスライド上でか、あるいはレザーで励起される
フローサイトメーターの使用において使用され得ると考
える。これはどの染色体数の異常を決定するのに使用さ
れ得る。
III.微生物の検出および同定 上記のようにDNAの特異的配列に標識することは個々の
細菌の同定および計数を可能にする。特定のDNA断片が
ハイブリダイズする、個々の細菌を同定するためには、
感度は１つの標識された構造を検出し得ねばならない。
これは、低光量ビデオシステムおよびイメージのコンピ
ューターによる総和を用いて、あるいは光像を強化する
他の装置を用いて行い得る。感度を十分に高くし得るな
らば、フローシステムもまた使用できる。細菌をスライ
ド上に固定すると、その位置を見い出すことができ、そ
のような蛍光スポットの数を数えることができるであろ
う。これは、使用される特異的クローンとハイブリダイ
ズするDNAを含有する、すべての細菌の計数法を提供す
る。特定の細菌株に特異的なクローンを選択すれば、そ
の株の微生物数を計数し得る。さらに、特定の遺伝子が
同定されている、いかなる抗生物質耐性も、プローブと
して抗生物質耐性遺伝子に含まれるDNA配列を用いて、
同様の方法で特徴付けできるであろう。さらに、１つあ
るいはそれ以上の抗生物質耐性遺伝子を含む、耐性プラ
スミドに特異的なプローブを使用でし得るであろう。個
々の細菌に加えて、特定の株の細菌細胞の集団を検出し
得、もしそれらが小さなスポットに位置し、そのためス
ポット内のハイブリダイズしたDNAに特異的な蛍光の総
和を測定し得るならば、それらの数を算出し得る。この
ようにして、細菌の混合物中の特異的DNA配列を含有す
る生物の数を測定し得る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 23/00 // Ｃ１２Ｑ 1/04 6807−4Ｂ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 7055−2Ｊ 33/53 Ｍ 8310−2Ｊ (72)発明者 アレグザンダーエイ．ウオルドロップ ザ サード アメリカ合衆国 22901 バージニア シ ャーロットビル，ハイドローリック ロー ド デイ 2663

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の構造式を有する修飾ヌクレオチドを調
    製する方法であって： ここでＢは、糖成分のC1′位に共有結合したプリン、７
    −デアザプリンあるいはピリミジン成分を表し、Ｂがプ
    リンあるいは７−デアザプリンの場合、プリンあるいは
    ７−デアザプリンのN9位において結合し、Ｂがピリミジ
    ンの場合、N1位において結合し； Ａは、少なくとも３個の炭素原子を含む、ハプテンある
    いはリガントを表し、該ヌクレオチドが二本鎖リボ核
    酸、二重鎖デオキシリボ核酸、あるいはDNA−RNAハイブ
    リッドに取り込まれている場合に、核ハプテンあるいは
    リガンドと結合し得るポリペプチドとともに、検出可能
    な複合体を形成し得、； 点線は、ＢとＡとを結合する化学結合を表し、Ｂがプリ
    ンである場合、該結合は、プリンの８位に結合し、Ｂが
    ７−デアザプリンである場合、該結合は、デアザプリン
    の７位に結合し、そしてＢがピリミジンである場合、該
    結合は、ピリミジンの５位に結合し；そして ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して であり、そしてｘ、ｙ、およびｚの少なくとも１つは、 であり； （ａ）以下の構造式 を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
    下において反応させて、構造式 を有する水銀化化合物を形成する工程； （ｂ）該水銀化化合物を、該水銀化化合物の−Hg+部分
    と反応し得、そして式・・・Ｎで表される化学部分と反
    応させる工程であって、該反応が、以下の構造式を有す
    る化合物を形成するような適当な条件下で、K2PdCl4の
    存在下で水性溶媒中において行われ、 ここで、Ｎは、反応性の末端官能基あるいはＡであっ
    て、 Ａは、少なくとも３個の炭素原子を含む、ハプテンある
    いはリガンドを表し、該ヌクレオチドが二本鎖リボ核
    酸、二重鎖デオキシリボ核酸、あるいはDNA−RNAハイブ
    リッドに取り込まれている場合に、核ハプテンあるいは
    リガンドと結合し得るポリペプチドとともに、検出可能
    な複合体を形成し得る、工程；および （ｃ）ＮがＡの場合、該化合物を該修飾ヌクレオチドと
    して回収する工程、 または、Ｎが反応性の末端基である場合、該化合物をＭ
    −Ａを有する化合物と反応させ、その後該修飾ヌクレオ
    チドを回収する工程であって、ここでＭは、該修飾ヌク
    レオチドを形成するような適当な条件下で水性溶媒中で
    Ｎと反応し得る官能基を表す、工程； を包含する、方法。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の方法であって、 前記Ａが、以下からなる群から選択され、 前記・・・Ｎで表される化学成分が、チオール、カルボ
    ン酸、エポキシド、およびアミンでなる群から選択され
    るか、あるいは、チオール、カルボン酸、エポキシド、
    およびアミンの末端に、該Ａが付加している化合物でな
    る群から選択され、 前記Ｍが、イミデート、無水物、Ｎ−ハイドロキシサク
    シミド、イソチオシアナート、およびエポキシドでなる
    群から選択される、方法。
  3. 【請求項３】請求項１に記載の方法であって、前記適当
    な条件が、約１から14の範囲のpH、約５℃から100℃の
    範囲の温度、および約３時間から24時間の範囲の反応時
    間を包含する、方法。
  4. 【請求項４】前記水銀塩が、酢酸水銀である、請求項１
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記式Ｎ・・・で表される前記化学部分
    が、 である、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記式・・・Ｎで表される前記化学部分
    が、 である、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記水性溶媒がバッファーを含む、請求項
    １に記載の方法。
  8. 【請求項８】請求項７に記載の方法であって、前記バッ
    ファーが、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、クエン酸ナ
    トリウム、クエン酸カリウム、クエン酸−リン酸カリウ
    ム、トリスアセテート、およびホウ酸水酸化ナトリウム
    を包含する、方法。
  9. 【請求項９】前記バッファーの濃度が2.0モルより少な
    い、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記（ｂ）の工程中の水性溶媒がさらに
    有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記有機溶媒が、水混和性である、請求
    項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記有機溶媒が、エーテル、アルコー
    ル、エステル、ケトン、およびアミドを包含する、請求
    項10に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記有機溶媒が、メタノール、エタノー
    ル、プロパノール、グリセリン、ジオキサン、アセト
    ン、ピリジン、およびジメチルホルムアミドを包含す
    る、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】請求項１に記載の方法であって、Ａがビ
    オチンあるいはイミノビオチンを含み、そしてＭがＮ−
    ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミデート、無水
    物、イソチオシアネート、およびエポキシドを含む、方
    法。
  15. 【請求項１５】ＭがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
    テルである、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】Ｍがイミデート、無水物、イソチオシア
    ネート、およびエポキシドを含む、請求項１に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】・・・Ｎが、チオール、カルボン酸、エ
    ポキシド、およびアミンを含む、請求項１に記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】式・・・Ｎで表される前記化学部分が、 −CH＝CH−CH2−NH−ビオチン である、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】式・・・Ｎで表される前記化学部分が、 である、請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】式・・・Ｎで表される前記化学部分が、 −CH＝CH−CH2−NH−イミノビオチン である、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】式・・・Ｎで表される前記化学部分が、 である、請求項１に記載の方法。
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