JPH0375559B2 - - Google Patents

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JPH0375559B2
JPH0375559B2 JP57064611A JP6461182A JPH0375559B2 JP H0375559 B2 JPH0375559 B2 JP H0375559B2 JP 57064611 A JP57064611 A JP 57064611A JP 6461182 A JP6461182 A JP 6461182A JP H0375559 B2 JPH0375559 B2 JP H0375559B2
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biotin
purine
deazapurine
pyrimidine
dna
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Shii Uoodo Deibido
Aaru Rangaa Penina
Ei Uorudorotsupu Za Saado Areguzandaa
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Yale University
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Yale University
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Publication date
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】
生物医学研究において用いられる多くの手順と
DNA組換え手法は水素（3H）、燐（32P）、炭素
（14C）、もしくはヨウ素（125I）の同位元素によ
つて放射能ラベルされたヌクレオチドもしくはポ
リヌクレオチド誘導体の使用に大巾にたよつてい
る。このような放射性化合物は単に甚だしく少量
の存在であつても使用者が核酸の検出、監視、位
置決め、単離等を行うことを可能にする有用な指
針探査を提供する。今日まで、放射性物質はもつ
とも敏感な、そして大くの場合多くの重要な実験
もしくは分析試験を遂行するための唯一の手段を
提供して来た。しかしながら放射性化合物の使用
に関連して重大なる制限と障害がある。第一に、
放射性物質を取扱かう作業者は放射能の危険な水
準に曝されるおそれがあり得るから手の込んだ安
全な予防策が放射性同位元素の調製、利用、そし
て廃棄処分の間に維持されていなければならな
い。第二に放射性ヌクレオチドには主として適当
な保護手段、生産者−使用者健康監視サービス、
そして廃棄処分計画を提供するに必要な装置や人
力の費用によるものであるが購入や使用のために
莫大な費用がかかる。第三に放射性物質は屡々非
常に不安定であり限られた保存期間を有し、そし
てそのために更に使用費用が増大する。この不安
定性は放射性同位元素それ自身の崩壊に関連する
破壊効果による放射線的分解、そして多くの放射
性同位元素（例えば32Pおよび125I）はたつた数
日の半減期しか有しないと言う事実に帰因するも
のである。 ハプテンは抗体と結合し得るが担体と結合した
場合においてのみ免疫性応答を行い得ると言うこ
とは知られている。この性質は検出および識別試
験に利用されることが出来る。 またビオチンやイミノビオチンはアビヂン、卵
白からの68000ダルトングリコプロテインと強力
に相互作用を行うことも知られている。この相互
作用は自然にみられる最も堅固な非共有結合常数
（Kdis＝10-15）の一つを示す。もしアビヂンが例
えばフルオレセインまたはローダミンのような螢
光染料、例えばフエリチン、ヘモシアニンもしく
はコロイダルな金のような高電子密度試薬、もし
くは例えばパーオキシダーゼもしくはアルカリホ
スフアターゼのような不溶解性反応生成物を沈積
し得る酵素を含む顕示し得る能力のある指標分子
と結びつけられるならばビオチンプローブの存
在、位置、もしくは量は証明せられることが出来
るであろう。イミノビオチンはビオチンよりも若
干弱くアビヂンと結合するけれども、同様な反応
がその検出のために用いられ得る。更に、溶液の
PHを減少させることによつてイミノビオチン−ア
ビヂン相互作用が転換され得ることはある応用に
おいて顕著な利点を提供する。 ビオチン−アビヂン錯体の特性と保持力は近年
細胞上もしくは細胞の中の特定の蛋白質、リピ
ド、もしくは炭水化物を可視的に位置決めするた
めの方法を開発するために用いられて来ている
（E.A.ベーヤーとM.ウイルチエク、生化学分析の
手法、26，１，1980において検討される）。RNA
の染色体位置はビオチン化した蛋白質、化学的に
RNAと架橋されたチトクロームC.を交配探査子
として用いて電子顕微鏡によつて測定されてい
る。交配の場所はアビヂン−ビオチン相互作用に
よつて仲介されるアビヂン−フエリチンもしくは
アビヂン−メタクリレート領域の結合を介して可
視化された（J.E.マニング，N.D.ハーシエイ，T.
R.ブローカー，M.ペレグリーニ，H.K.ミツチエ
ル、およびN.デビツドゾン，染色体，53，107，
1975；J.E.マニング，M.ペレグリーニ，および
N.デビツドソン，生化学，61，1364，1977；T.
R.ブローカー，L.M.アンジエラー，P.H.イエン，
N.D.ハーシエイ，およびN.デビツドソン，核酸
研究，５，363，1978；ＡソーヤおよびN.デビツ
ドソン，核酸研究．，５，383，1978.） ポリヌクレオチド連鎖の検出に対するこのアプ
ローチは高度に反復された連鎖のような特殊化せ
られた場合においては試験が成功したけれども単
一もしくは低い複写数において存在するポリヌク
レオチドの分析に対しては一般的に有用ではな
い。 更にピリミヂンやプリン環に化学部分を付加す
る方法が知られている。数年前に簡単なそして迅
速なアセトキシ水銀化反応が水銀原子の共有的結
合をヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの両方
におけるピリミヂン環の５−位置、プリン環のＣ
−８位置もしくは７−デアザプリン環のＣ−７位
置の中に導入するために開発された。（R.M.K.デ
ール，D.C.リビングストンおよびD.C.ワード，米
国自然科学学会会報，70.2238，1973；R.M.K.デ
ール，E.マーチン，D.C.リビングストンおよびD.
C.ワード，生化学，14，2447，1975.） 有機水銀化合物がパラヂウム触媒の存在下にお
いてオレフイン化合物と反応して炭素−炭素結合
を形成することは数年前に知られていた。（R.F.
ヘツク，米国化学会誌．Soc.，90，5518，1968；
R.F.ヘツク，同上．，90，5526，1968；R.F.ヘツ
ク，同上．，90，5531，1968；R.F.ヘツク，同
上．，90，5535，1968；およびR.F.ヘツク，米国
化学会誌．91，6707，1969.）バーグストームと
共同研究者（J.L.ルースおよびD.E.バーグストー
ム，有機化学雑誌．，43，2870，1978；およびD.
E.バーグストームおよびM.K.オガワ，米国化学
会誌，100，8106，1978.）およびビツゲ，等（C.
F.ビツゲ，P.カラリテイス，J.R.デツクおよびM.
P.マーテス，米国化学会誌．，102，2033，1980.）
は最近この反応をＣ−５置換ピリミヂンヌクレオ
チド化合物の合成に応用しようと企てた。 最後にヌクレオチドを変性するために特定の抗
体が調製されることが出来、そして該変性ヌクレ
オチドの特定な構成を単離しそして特徴づけるた
めに用いられることが出来ることは知られている
（T.W.ミユーンズおよびM.K.リスゼフスキイ，
核酸研究の進歩および分子生物学，24，109，
1980.）。しかしながら、今日までに自然に生ずる
ヌクレオチドに対して調製される抗体のいかなる
ものもそれが二重螺旋構造のRNAもしくはDNA
複合体中に存在する時、もしくはDNA−RNA交
配分子中に存在する時、これらヌクレオチド測定
子との反応を示さなかつた。 放射能的に標識付けされたプローブもしくは今
迄に利用された化学および生物学的プローブの限
界を回避するためにピリミヂンもしくはプリン環
と共有的に結合しているビオチン、イミノビオチ
ン、リポ酸、そして他の測定子が合成されてい
る。これらヌクレオチド誘導体はそれらを含んで
いるポリヌクレオチドや補酵素と同様にアビヂン
もしくは抗体のような蛋白質と選択的にそして特
有に相互作用を行うであろう。変性ヌクレオチド
と特定の蛋白質との間の相互作用は最近生物医学
的にそしてDNA組換え手法において用いられて
いる多くの手順において核酸成分の検出および配
置のための放射性同位元素に代るものとして利用
されることが出来る。これら変性ヌクレオチド−
蛋白質相互作用を用いる方法は放射性同位元素を
利用する手順に等しいかそれよりも大きな検出能
力を有し、そしてそれらは屡々より迅速にそして
より大きな分解能によつて遂行されることが出来
る。 これら新らしいヌクレオチド誘導体は以下によ
り完全に検討されるように開発せられそして画一
化せられて来た化学的手順によつて比較的安価に
調製せられることが出来る。更に意義深いことに
は本発明のヌクレオチドプローブもそれらに用い
られる蛋白質試薬も放射性ではないから該化合物
は放射性同位元素の取扱かい上要求される手の込
んだ安全手順なくして調製せられ、利用せられ、
そして処理される。更にこれらヌクレオチド誘導
体は化学的に安定であつて数年もしくはそれ以上
の可使保存期間を有することが期待されることが
出来る。最後にこれら化合物はより安全な、より
経済的な、より迅速な、そしてより再現性のある
研究および診断手順の開発を可能ならしめる。 本発明によれば構造式 ここにＢは糖部分のC1′−位置に共有的に結合
されたプリン、７−デアザプリンまたはピリミジ
ン部分を表わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプ
リンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリン
のN9−位置に存し、Ｂがピリミジンの時、該結
合はN1−位置に存するものと規定せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン、
【式】
【式】
【式】および
【式】からなる組から選ばれ、ポリ ペプチドと共に検知可能な錯体を形成し得る部分
を表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖また
は基（連結基ともいう）を表わし、もしＢがプリ
ンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に存
し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖
は該デアザプリンの７−位置に存し、そしてもし
Ｂがピリミジンであれば該化学鎖は該ピリミジン
の５−位置に存するものと規定せられ、そして
ｘ，ｙおよびｚの各々は Ｈ−，HO−，
【式】
【式】または
【式】を表わす。 を有する化合物が提供せられ、該化合物は生物医
学研究およびDNA組換え手法におけるプローブ
として広く有用である。 この構造の範囲に包含される化合物のうち特に
有用なものは更に次に示す特性の一つもしくはそ
れ以上を有する：Ａは非芳香性である；Ａは少く
ともC5である；ＢとＡとからなる化学結合は一
つのα−オレフイン結合を含む；Ａはビオチンも
しくはイミノビオチンである；そしてＢはピリミ
ジンもしくは７−デアザプリンである。 これら化合物は (a) 構造式 を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当
な条件下において反応せしめて構造式 を有する水銀化合物を形成すること。 (b) 上記水銀化合物を該水銀化合物の−Hg+部分
と反応し得、そして式…Ｎによつて表わされる
化学部分と反応せしめること、上記反応は水性
溶媒中で、そしてK2PdCl4の存在下に、適当な
条件下において行われ、構造式 ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡであ
る。 を有する化合物を形成する。 そして (c) 該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収
すること、ＮかＡの時またはＮが反応性末端基
の時、該化合物は構造式Ｍ−Ａを有する化合
物、ここにＭはＮと反応可能な官能基を表わ
す、と水性溶媒中適当な条件下において反応せ
しめられて上記変性ヌクレオチドを生成し、そ
れから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階を含む工程によつて調製せられるで
あろう。 本発明はまたは構造式 ここにＢ，B′、およびB″の各々は糖部分の
C1′−位置に共有的に結合されたプリン、デアザ
プリン、またはピリミジン部分を表わし、Ｂ，
B′、またはB″のいづれかがプリンまたはデアザ
プリンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリ
ンのN9−位置に存し、Ｂ，B′、またはB″のいづ
れかがピリミジンの時、該結合はN1−位置に存
するものと規定せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン、
【式】
【式】
【式】および
【式】からなる組から選ばれ、該複 合体もしくはハイブリツドが二重螺旋構造のリボ
核酸、デオキシリボ核酸複合体、またはDNA−
RNAハイブリツドの中へ取入れられた時ポリペ
プチドと共に検知可能な錯体を形成し得る部分を
表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わ
し、もしＢがプリンであれば該化学鎖は該プリン
の８−位置に存し、もしＢが７−デアザプリンで
あれば該化学鎖は該デアザプリンの７−位置に存
し、そしてもしＢがピリミジンであれば該化学鎖
はピリミジンの５−位置に存するものと規定せら
れ、 ｚはＨ−またはHO−を表わし、 そしてｍとｎは０から約100000までの整数を表
わす。 を有する化合物を提供するものである。 これら化合物は本発明の変性ヌクレオチドを含
むヌクレオチドの混合物の酵素的重合によつて調
製されることが出来る。それに代えてオリゴーも
しくはポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチ
ドは化学的方法を用いて変性されるであろう。 本発明の実施によつて変性されるヌクレオチド
そしてその中に該変性ヌクレオチドが取入れられ
ているオリゴーおよびポリヌクレオチドは生物医
学研究、臨床診断、そしてDNA組換え手法にお
けるプローブとして用いられるであろう。これら
の種々の有用性はポリペプチドの中に本来的に存
在する性質によるか、あるいはポリペプチドに結
合されるかもしくはそれと相互作用を行う検出可
能な部分によつて順番に検出されることの出来る
安定な錯体をポリペプチドと共に形成する該分子
の能力に基づくものである。 いくらかの用途は例えばバクテリアやウイルス
のような核酸を含む病因の検出と識別、抗生物質
耐性に対するバクテリアのスクリーニング、例え
ばサラセミアや鎌状細胞貧血症のような遺伝的欠
陥の診断、染色体核型分類、そして腫瘍細胞の識
別を含む。 本発明を以下に詳細に説明する。 自然に発生したヌクレオチドの放射性標識付け
された形状に置き代わるものとして変性ヌクレオ
チドが一般的に適するためにはいくらかの本質的
な規準が満足されなければならない。第一に、該
変性化合物は独特な、即ちヌクレオチドもしくは
ポリヌクレオチドに関連して正常には見出されな
い置換基もしくはプローブを含んでいなければな
らない。第二に、該プローブは化学的もしくは生
物学的試薬と特別に反応して鋭敏な検出システム
を提供しなければならない。第三に、多くの実際
の応用が、該相似物が酵素的に代識され、例えば
該相似性が核酸ポリメラーゼに対する基質として
の役目をすべきことを要求しているので該相似物
は一般的に研究されている核酸酵素に対する比較
的効果的な基質でなければならない。この目的の
ために、プローブ部分は立体的位置に関して、あ
るいは逆に、塩基の正常なワトソン−クリツク水
素結合能力を妨害する環位置に配置されてはなら
ない。さもなければ該置換体はポリメラーゼ基質
として不活性な化合物を得るであろう。形状変化
は通常ヌクレオチド誘導体をポリメラーゼ基質と
して受容することが出来ないようにするので正常
な“アンチ”ヌクレオチド形状を変更するような
環位置の置換はまた避けられなければならない。 第四に、該検出システムは核酸交配方法学と矛
盾しないために一重螺旋構造および二重螺旋構造
の両方のポリヌクレオチドの中に取入れられるプ
ローブ置換体と相互作用を行う能力を有すべきで
ある。この基準を満足せしめるには、それが抗
体、その他の検出蛋白質、もしくは化学試薬と容
易に相互作用を行うことが出来るように化学結合
もしくは“結合手”を介して該プローブ部分がプ
リンもしくはピリミヂンと結合されていることが
望ましい。 第五に、プローブ置換体の少数を含んでいるポ
リヌクレオチドの物理的および生化学的性質は放
射性交配プローブを用いる最近の手順が広範囲に
わたつて変性される必要がないがために大巾に変
更されるべきではない。この規準は該プローブが
酵素的に導入されるかまたは直接化学的手段で導
入されるかのいづれの場合においても満足せしめ
られねばならない。 最後に、該プローブが付加される結合は正常な
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが日常支配
されているすべての実験的条件、例えば高温にお
ける長期の交配時間、フエノールおよび有機溶剤
抽出、電気泳動等に耐えるべきである。 これら規準のすべてはここに記述される変性ヌ
クレオチドによつて満足せしめられる。 該変性ヌクレオチドとは構造式 ここにＢは糖部分のC1′−位置に共有的に結合
されたプリン、７−デアザプリンまたはピリミジ
ン部分を表わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプ
リンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリン
のN9−位置に存し、Ｂがピリミジンの時、該結
合はN1−位置に存するものと規定せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン、
【式】
【式】
【式】および
【式】からなる組から選ばれ、ポリ ペプチドと共に検知可能な錯体を形成し得る部分
を表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖また
は基を表わし、もしＢがプリンであれば該化学鎖
は該プリンの８−位置に存し、もしＢが７−デア
ザプリンであれば該化学鎖は該デアザプリンの７
−位置に存し、そしてもしＢがピリミジンであれ
ば該化学鎖は該ピリミジンの５−位置に存するも
のと規定せられ、 そしてｘ，ｙおよびｚの各々は Ｈ−，HO−，
【式】
【式】または
【式】を表わす。 を有する化合物である。 これら化合物は生物医学研究およびDNA組換
え手法におけるプローブとして広く有用である。 この構造式の範囲に包含されるすべての化合物
は主として本発明の実施によつて調製されそして
使用されるであろうけれども、該化合物のいくら
かのものより容易に調製されもしくは／そして使
用され、そしてそれ故に目下の所より望ましいも
のである。 かくしてプリン、ピリミヂン、および７−デア
ザプリンは主として有用なものであるけれども、
ピリミジン、および７−デアザプリンはプリン８
−位置置換体が該核酸をポリメラーゼ基質として
無効にするから望ましいものである。かくして変
性プリンはある点では有用であるけれどもピリミ
ヂンおよび７−デアザプリン程一般的に有用では
ない。更に本発明に有用なピリミヂンおよび７−
デアザプリンは夫々５−もしくは７−位置に当然
置換されてはならない。結果として、チミン、５
−メチルシトシン、および５−ハイドロキシメチ
ルシトシンのようないくらかの塩基は有用でな
い。目下の所有用な塩基はシトシン、ウラシル、
デアザアデニン、およびデアザグアニンである。 Ａは少くとも三個の炭素原子を有し、そして変
性ヌクレオチドがデオキシリボ核酸かリボ核酸か
のいづれかに取入れられた時ポリヌクレオチドと
検出可能な錯体を形成し得るいかなる部分にも相
当する。 Ａはそれ故に適当な擔体に付加した時単に免疫
原的であるが、しかし適当な抗体と相互作用を行
つて錯体を形成し得るハプテンを含むこれら性質
を有しているいかなるリガンドにも相当するであ
ろう。有用であるこれら部分の例は次の通りであ
る。
【式】
【式】
【式】
【式】 これら望ましいＡ部分としてはビオチン、およ
びイミノビオチンがある。 更に芳香性部分は塩基と対になつている螺旋構
造の中に介入せんとする傾向があるので、部分Ａ
は非芳香性であることが望ましい。またより小さ
い部分はポリペプチドとの分子相互作用が充分で
ないから、充分な相互作用が起つて安定な錯体を
形成せしめるためにはＡは少くともC5であるこ
とが望ましい。ビオチンとイミノビオチンはこれ
ら基準の両方を満足する。しかしながら、該化学
鎖はＢに関連してα−位置にオレフイン結合を含
むことが一般的に望ましい。このようなα−オレ
フイン結合の存在は塩基が良く知られている二重
螺旋形状において他のものと対をなす時、部分Ａ
が該塩基から離れた所に維持する役目を果す。こ
れはポリペプチドとの相互作用をより容易に行わ
しめ、それによつて錯体の形成を促進せしめる。
更に大きな回転自由度を有する一重結合は必ずし
も螺旋から該部分を充分離れた所に維持してポリ
ペプチドによる認識およびポリペプチドとの錯体
の形成を行わしめるわけではない。 該化学鎖が第一級アミンから誘導され、そして
−CH2−NH−構造を有することは、このような
化学結合が良く知られたアミン変性反応のいかな
るものも利用して容易に形成されるからさらによ
り望ましいことである。アリルアミンおよびアリ
ル−（３−アミノ−２−ハイドロキシ−１−プロ
ピル）エーテル基から誘導される望ましい化学鎖
の例は夫々式 −CH−CH−CH2−NH−および を有する。 これらの化学鎖は望ましいものではあるけれど
も、特に例えばチオール、カルボン酸、およびエ
ポキシド官能基のような他の変性可能な官能基を
有するオレフイン結合手を含むその他のものも使
用されることが出来る。 該化学鎖は特別な位置、即ちピリミヂンの５−
位置、プリンの８−位置、もしくはデアザプリン
の７−位置に結合する。前に述べたように、プリ
ンの８−位置の置換はここに検討されるすべての
方法において有用な変性ヌクレオチドを形成しな
い。プリンの７−位置は窒素原子で占められてい
るが、化学鎖が結びつく点になり得るであろう。
しかしながら今日用いられそしてここに検討され
る化学的置換方法はこの目的には適していない。 記号ｘ，ｙ、およびｚは糖部分5′，3′，および
2′位置に結びついている基を表わす。これらは Ｈ−，HO−，
【式】
【式】または
【式】のうちのいづれか である。 考えられ得ることではあるけれども、ｘ，ｙ、
およびｚのすべてが同時に同一のものであること
はありそうにない。よりありそうなことは少くと
もｘ，ｙ、およびｚのうち一つがモノ−，ジ−、
もしくはトリ−ホスフエイトのいづれかのホスフ
エイト含有基であり、そして少くとも一つがHO
−もしくはＨ−であることである。容易に評価さ
れるように、最もありそうなｚの正体は夫々リボ
ヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド
を示しているHO−もしくはＨ−である。かよう
なヌクレオチドの例は5′−リボヌクレオシドモノ
ホスフエイト、5′−リボヌクレオシドジホスフエ
イト、5′−リボヌクレオシドトリホスフエイト、
5′−デオキシリボヌクレオシドモノホスフエイ
ト、5′−デオキシリボヌクレオシドジホスフエイ
ト、5′−デオキシリボヌクレオシドトリホスフエ
イト、5′P−リボヌクレオシド3′P、および5′P−
デオキシリボヌクレオシド3′Pを含む、より特殊
な例はＡがビオチンもしくはイミノビオチン、化
学鎖が−CH−CH−CH2−NH−もしくは そしてＢがウラシルもしくはシトシンであるこ
のタイプの変性ヌクレオチドを含む。 化学鎖手およびプローブ部分を塩基上へ導入す
るために採用せられる一般的合成方法は上記に検
討せられる（J.L.ルースおよびD.E.バーグストー
ム，有機化学雑誌，43，2870，1978；D.E.バーグ
ストームおよびM.K.オガワ，米国化学会誌．
100，8106，1978；およびC.F.ビツゲ，P.カラリ
テイス，J.R.デツクおよびM.P.マーテス，米国化
学会誌．102，2033，1980.をみよ） しかしながら、ここに用いられるオレフイン置
換体は以前には用いられたことがない。プローブ
部分Ａの結びつきを容易にするために、例えばア
リルアミン〔AA〕、もしくはアリル−（３−アミ
ノ−２−ハイドロキシ−１−プロピル）エーテル
〔NAGE〕のような第一級アミン官能基を有する
オレフインを用いることが特に望ましいことが見
出され、そして該オレフインは例えば のような標準的なアミン変性反応によつてプロー
ブを結びつけることを可能にする。 調製の容易さのために、NHS−エステルをプ
ローブの付加のために用いることが望ましいこと
が見出されている。しかしながら、例えばチオー
ル、カルボン酸、エポキシドのような他の変性可
能な官能基を有するオレフイン結合鎖手もまた用
いられることが出来る。更にまた、結合鎖手とプ
ローブの両方共が望ましいと思われるならば単一
段階において付加されることが出来る。 特に構造式 ここにＢは糖部分のC1′−位置に共有的に結合
されたプリン、７−デアザプリンまたはピリミジ
ン部分を表わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプ
リンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリン
のN9−位置に存し、Ｂがピリミジンの時、該結
合はN1−位置に存するものと規定せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン、
【式】
【式】
【式】および
【式】からなる組から選ばれ、ポリ ペプチドと共に検知可能な錯体を形成し得る部分
を表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖また
は基を表わし、もしＢがプリンであれば該化学鎖
はプリンの８−位置に存し、もしＢが７−デアザ
プリンであれば該化学鎖は該デアザプリンの７−
位置に存し、そしてもしＢがピリミジンであれば
該化学鎖は該ピリミジンの５−位置に存するもの
と期定せられ、 そしてｘ，ｙ、およびｚの各々は Ｈ−，HO−，
【式】
【式】または
【式】を表わす。 を有する変性ヌクレオチドは (a) 構造式 を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当
な条件下において反応せしめて構造式 を有する水銀化合物を形成すること。 (b) 上記水銀化合物を該水銀化合物の−Hg+部分
と反応し得、そして式…Ｎによつて表わされる
化学部分と反応せしめること、上記反応は水性
溶媒中で、そしてK2PdCl4の存在下に、適当な
条件下において行われ、構造式 ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡであ
る。 を有する化合物を形成する。 そして (c) 該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収
すること、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基
の時、該化合物は構造式Ｍ−Ａを有する化合
物、ここにＭはＮと反応可能な官能基を表わ
す、と水性溶媒中適当な条件下において反応せ
しめられて上記変性ヌクレオチドを形成し、そ
れから該変性ヌクレオチドが回収せられる。 以上の段階によつて調製されることが出来る。 以下に実例案を示す。 該反応はPH１と同程度に低い水素イオン濃度
で、もしくはPH14と同程度に高い水素イオン濃度
で行われることが出来るけれども、約４から８ま
での範囲において行うことが望ましい。このこと
はこの範囲以外のPHにおいては加水分解される例
えばヌクレオシドポリホスフエイト、ポリヌクレ
オチド、およびヌクレオチド補酵素のような不安
定な化合物を取扱かう場合には特に真実である。
同様に標識付けされた有機基質の分解の可能性を
防止するために約20℃から30℃の範囲の温度で行
うことが望ましい。しかしながら、該反応は約５
℃から100℃の温度で行われ得る。化学反応にお
いては通常のことであるが、より高温は反応速度
を促進し、そしてより低温はそれを遅くする。か
くして５℃から100℃までの温度範囲において、
最適反応時間は約10分から98時間迄変化するであ
ろう。望ましい温度範囲においては、反応時間は
通常３から24時間迄変化する。 PHを所望の範囲に維持するための望ましい手順
はバツフアーを用いることによる。種々なバツフ
アーが用いられ得る。これらは例えば、酢酸ソー
ダもしくはカリウム、クエン酸ソーダもしくはカ
リウム、クエン酸−燐酸カリウム、トリス酢酸、
そしてホウ酸、水酸化ソーダバツフアーを含む。
使用時のバツフアーの濃度は約2.0モルまでの広
い範囲にわたつて変化し得る。 水銀化反応およびパラジウム触媒を用いる付加
反応の特別な利点はこれらが水中で行われ得るこ
とであるが、有機溶媒の少量が溶解性補助として
有用に含まれることが出来る。通常選択される有
機溶媒は水と混和性を有するものである。これら
は例えばメタノール、エタノール、プロパノー
ル、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ピリヂ
ン、およびジメチルホルムアミドのようなエーテ
ル、アルコール、エステル、ケトン、アミド等か
ら選ばれるであろう。しかしながら、例えばメタ
ノールのようなアルコールの存在は屡々オレフイ
ン二重結合に対するアルコキシ付加の原因となる
ので、溶解性補助として用いられる有機溶媒は注
意深く選択されなければならない。アルコキシ置
換基のα−またはβ−外環炭素原子に対する導入
は屡々酵素基質として利用されて非常に効果の少
ない化合物の生成の原因となる。 種々の水銀塩が利用されるけれども、現在望ま
しい塩は酢酸水銀である。また、前に示されたよ
うに、該化合物は先づ結合鎖手を付加し、そして
それから部分Ａを付加することによつてか、もし
くは既に部分Ａが結びついている結合鎖を付加す
ることによつて調製される。かくして式…Ｎで表
わされる化学部分は所望の化合物の形成を最終的
にもたらすものであればいかなるものでもよい。 例としては −CH＝CH−CH2−NH2， −CH＝CH−CH2−NH−biotin，および ミノビオチン． を含む。 これらの反応において用いられる反応物の量は
広く変化する。しかしながら水銀化されていない
化合物、水銀化された化合物、およびパラヂウム
含有化合物の量は一般的に略化学量論的である
が、一方水銀塩および化合物…Ｎは過剰モル、例
えば夫々の水銀化されている化合物もしくは水銀
化されていない化合物のモルに対してＮ…Ｎもし
くは水銀塩の５〜20モル存在せられる。実際に
は、量は反応条件や反応物の詳細な性質の変化に
よつて変化する。 酵素基質として機能することが出来るヌクレオ
チド誘導体に直接結びつけられているビオチンプ
ローブを有することは遂行され得る実験原案にお
いても、分析のために利用され得る検出方法（顕
微鏡的および非顕微鏡的）においても可成り広範
囲にわたる可能性を提供する。例えばビオチンヌ
クレオチドは細胞によつて、もしくは粗細胞抽出
物による合成過程中に存するポリヌクレオチドの
中に導びかれることが出来、かくして発生期（成
長期）のポリヌクレオチド鎖を検出および／また
は単離することを可能ならしめる。このような手
順はいかなる直接化学的変性方法によつてもする
ことが不可能である。更に、酵素は例えばビオチ
ンのようなプローブをポリヌクレオチド中の高度
に選択性のある、または位置特性のある配置の中
へ導入するための試薬として用いられることが出
来る。同様なプローブ変性生成物の化学的合成は
どうみても達成することが甚だ困難であろう。 ビオチンもしくはイミノビオチンを含むヌクレ
オチドの合成は以下に記述される実施例において
詳しく述べられるようにして達成される。Ｃ−５
炭素原子に結びついているこれらプローブのいづ
れかを含むピリミヂンヌクレオシドは原始核もし
くは真生核の両方に起因する精製された核酸ポリ
メラーゼの種々なものに対して優れた基質として
役立つ。これらはE.ColiのDNAポリメラーゼ、
バクテリオフアージT4DNAポリメラーゼ、ネヅ
ミ（Ａ−９）およびヒト（HeLa）細胞からの
DNAポリメラーゼαおよびβ、そしてヘルペス
単純ウイルスのDNAポリメラーゼを含む。確認
データはリグビイ等のニツク転換条件（P.W.J.リ
グビイ，M.デイツクマン，C.ローデスおよびP.
バーグ．分子生物学雑誌．113，237，1977.）も
しくはバーガイノン等によつて述べられている間
隙充填反応（G.J.バーガイノン，P.J.タツターサ
ルおよびD.C.ワード，ウイルス学雑誌20，290，
1976.）のいづれかを用いることにより、E.coli
DNAポリメラーゼについて得られた。Bio−
dUTPまたはミラー等の方法（M.R.ミラー，J.C.
キヤステロツト，Jr.およびA.B.パーデイ，細胞
研究速報．120，421，1979.）によるリソレチン
を用いた処理によつて透過されたCHO細胞にお
いても、そしてヘルペス単純ウイルス感染BHK
細胞から調製された核複製システムにおいてもポ
リメラーゼ基質として機能することが見出されて
いる。ビオチン化リボヌクレオシドトリホスフエ
イトはE.coli、およびバクテリオフアージT7の
RNAポリメラーゼに対する基質として機能する
ことが見出されたけれども、これらのデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフエイト相当物と同様な
利用効率はない。事実、それらは実験せられる真
生核RNAポリメラーゼ（HeLa細胞RNAポリメ
ラーゼ、子牛胸腺RNAポリメラーゼ、およ
びマウス細胞RNAポリメラーゼ）によつて多
少なりとも不完全に取入れられる。この基質機能
の限定された範囲はいくらかの生体的もしくは試
験管的な転写研究において有用性を限定するので
あるが、ビオチン標識付されたRNAプローブは
DNA鋳型からE.coliもしくはT7RNAポリメラー
ゼを用いて、もしくは例えばビオチン化−pCpの
ような化合物と共にRNAリガーゼを用いる末端
ラベル付け方法によつて酵素的に調製され得る。
UTPのAA−およびNAGE誘導体はしかしなが
ら上記の真正核RNAポリメラーゼに対する基質
である。これら類似物に対する抗体の有効性によ
れば、免疫学的もしくは親和力方法による発生期
転写の単離は実行可能である。 ビオチンもしくはイミノビオチン置換体を含む
ヌクレオチドの酵素的重合はこれらのプローブの
いづれもが放射性ラベル付けられてはいないので
直接に監視されない。しかしながら実験的証拠の
二つの系列は明らかにビオチン化ヌクレオチドが
取入れられたことを示している。第一はビオチン
ヌクレオチドの存在において合成されるポリヌク
レオチドはアビヂンもしくはストレプトアビヂン
親和性カラムでクロマトグラフした時、選択的に
保持されていることである。（第および表）。
例えば32P−dAMPでニツク転換された正常DNA
は0.5M NaClの添加において定量的に流出する
のに、ビオチン化DNAもしくはイミノビオチン
化DNAの膨大な量が高濃度塩、尿素、グアニヂ
ン−HCl、ホルムアミド、もしくは50mM
NaOHによる長時間の洗滌の後ですらもレジン
に結合して残つている。これら洗滌条件によつて
流出される放射性ラベルの小フラクシヨンは二度
目にレジンに対して適用された時には保持され
ず、放射性がビオチン置換の行われていない
DNA断片と結合されていることを暗示する。証
拠の第二の系列は精製アンチ−ビオチンIgG、次
いでホルマリン固定されたスタフイロコツカス
アウレウスによつて処理された時、ビオチンラベ
ルされたポリヌクレオチドのみが免疫沈澱される
ことである（第表）。ビオチンの極めて少量が
この方法によつて検知されることはこれら表中の
データから明らかである。これら結果はまたもし
抗体結合もしくはアビヂン親和力方法が交配手法
を用いるプローブ検出において有用であればビオ
チン分子はアビヂン、ストレプトアビヂン、もし
くは固有の抗体によつて認められることが出来る
一方、DNAはいまだその本来の、二重螺旋構造
形能、即ち絶対的に本質的な条件下にある。
【表】
【表】 ド
(6) 2mMビオチン 97.6 ＜0.01
(7) 50mM NaOH 89.5 ＜0.01
【表】
【表】 かくして構造式 ここにＢ，B′、およびB″の各々は糖部分の
C1′−位置に共有的に結合されたプリン、デアザ
プリン、またはピリミジン部分を表わし、Ｂ，
B′、またはB″のいづれかがプリンまたはデアザ
プリンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリ
ンのN9−位置に存し、Ｂ，B′、またはB″のいづ
れかがピリミジンの時、該結合はN1−位置に存
するものと規定せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン、
【式】
【式】
【式】および
【式】からなる組から選ばれ、ポリ ペプチドと共に検知可能な錯体を形成し得る部分
を表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖また
は基を表わし、もしＢがプリンであれば該化学鎖
は該プリンの８−位置に存し、もしＢが７−デア
ザプリンであれば該化学鎖は該デアザプリンの７
−位置に存し、そしてもしＢがピリミジンであれ
ば該化学鎖はピリミジンの５−位置に存するもの
と規定せられ、 ｚはＨ−またはHO−を表わし、 そしてｍとｎは０から約100000までの整数を表
わす。 を有する新規な化合物を調製することが可能であ
る。 勿論、その場合には該化合物は単に前述したよ
うに変性ヌクレオチドになるから、一般的にはｍ
およびｎは同時に０ではないことは容易に理解せ
られるべきことである。一般的にB′およびB″は
同じオリゴーもしくはポリヌクレオチドの中にあ
つて変化し、夫々ウラシル、シトシン、チミン、
グアニン、アデニン等となる。また一般的に、該
変化はよく知られている遺伝コードによるペプチ
ド合成に対するコードを行うヌクレオチドの整列
された連鎖に一致するだろう。しかしながら、示
される該構造はまたもし本発明によつて核酸が変
性されることのみであれば、子牛胸腺DNA，E.
coliもしくはイーストのRNA、バクテリオフア
ージRNAおよびDNA（R17，fd）、動物ウイルス
（SV40DNA）、染色体DNA等のみならず、例え
ばポリｃ、ポリｕ、ポリｒ（Ａ−Ｕ）およびポリ
ｄ（Ａ−Ｕ）のようなポリヌクレオチドをも包含
することを留意すべきである。 該構造は例えば２から30の変性ヌクレオチドか
らなるオリゴマーもしくはポリマー中に存在する
一つ以上の変性ヌクレオチドを含むこともまた理
解されるべきである。この配慮における重大な因
子は変性の数があまり大ではないのでポリヌクレ
オチドは意図された用途には効果がないことであ
る。 最後に変性オリゴーおよびポリヌクレオチドは
合同して末端基が相溶性もしくは反応性を与えら
れる限りにおいて同一構造を有するより長い実体
を形成し得ることは理解せられるべきである。 これら化合物は適当な条件下で合成を指揮する
核酸鋳型の存在下において適当な核酸、特にヌク
レオチドトリホスフエイトの酵素的重合によつて
造られ得る。このような条件は用いられる酵素、
存在するヌクレオチドの量、そしてその他の変数
によつて広く変化する。酵素の実例はE.coliの
DNAポリメラーゼ、バクテリオフアージ
T4DNAポリメラーゼ、ネズミおよびヒト
（Hela）細胞からのDNAポリメラーゼαおよび
β、ヘルベス単純ウイルスからのDNAポリメラ
ーゼ、E.coliのRNAポリメラーゼ、バクテリオ
フアージT7のRNAポリメラーゼ、Hela細胞
RNAポリメラーゼ、子牛胸腺RNAポリメラー
ゼ、およびマウス細胞RNAポリメラーゼを
含む真生核RNAを含むものである。 また該化合物はオリゴーもしくはポリヌクレオ
チドを末端付加して付加が5′もしくは3′位置に行
われるかどうかによつてｍもしくはｎが０である
化合物を形成することによつて調製せられること
が出来る。更に塩基がビオチン化されている例え
ばpCpもしくはpUpのような化合物は酵素RNA
リガーゼを用いて目下の分子に付加され得る。 変性オリゴーおよびポリヌクレオチドはまた前
記した個々のヌクレオチドの変性のための方法を
目下のオリゴーもしくはポリヌクレオチドの化学
的変性によつても調製され得る。 本発明の種々な変性ヌクレオチド、オリゴヌク
レオチド、およびポリヌクレオチドはもし該ポリ
ペプチドが一つの錯体もしくは複数個の錯体が形
成される時に一般的に通常の検出手法によつて検
出され得る一個もしくはそれ以上の部分を含んで
いるとすれば適当な条件下で該化合物をそれらと
錯体を形成し得るポリペプチドと接触させて錯体
を形成させることによつて検出されるであろう。 ビオチン型プローブに対する一つのポリペプチ
ド検出子はアビヂンである。アビヂン−ビオチン
相互作用は自然にみられる最とも強固な非共有結
合定数（Kdis＝10=15）の一つを示す。もしアビ
ヂンが例えば螢光染料（フルオロセイン、ローダ
ミン）、高電子密度試薬（フエリチン、ヘモシア
ニン、金コロイド）もしくは不溶性反応生成物を
沈積し得る酵素のような潜在的に明瞭な指示分子
と結合されたならばビオチンプローブの位置的お
よび／または量的存在は設定せられるであろう。 アビヂンは不率にも核酸もしくはクロマチン物
質と連絡せられて用いられる時、ビオチン−指示
蛋白質としては余り望ましくなくなる一つの性質
を有している。アビヂンが濃縮クロマチンもしく
は核酸の大量を含む副細胞区画に対してビオチン
結合性質から独立した様式で強固に結合すること
は報告されている（M.H.ヘゲネス、染色技術．，
52，165，1977；M.H.ヘゲネスおよびJ.F.アシ
ユ，細胞生物学雑誌．，73，783，1977；E.A.ベ
ーヤーおよびM.ウイルチエク，生物学分析の手
法26，１，1980.）アビヂンは10.5のpIを有する塩
基性蛋白質であるから、そのヒストン様特性また
はその炭水化物部分はこれら観察される非特定相
互作用に対して最とも責任がありそうである。 ビオチン含有ヌクレオチドおよびその誘導体に
対する望ましいプローブは土壌菌、ストレプトミ
セス、アビヂンによつて合成されたアビヂン様蛋
白であるストレプトアビヂンである。その調製と
精製はホフマン等、自然科学学会誌、77，4666
（1980）に記載されている。ストレプトアビヂン
はより低いpI（5.0）を有し、グリコシル化されて
おらず、そしてアビヂンよりもDNAに対するよ
り非常に低い非特定結合性を示し、そしてそれ故
に核酸検出方法論を含む応用において潜在的な利
点を提供する。 アビヂン様プローブ検出に対する最も望ましい
蛋白質は単一特定ラビツトIgG，アンビヂオチン
免疫グロブリンである。この化合物は前述のよう
に（M.バーガー，酵素学における手法，62，319
「1979」）、ビオチンとウシ科血清アルブミン変性
ビオチンによつて免疫化されたラビツトによつて
調製せられ、そして親和性クロマトグラフによつ
て精製せられる。免疫グロブリン−ハプテンの会
合定数はアビヂン−ビオチン錯体に対してよりも
可成り低いKassn（106から1010）値を有するけれ
ども、それらはアビヂン−イミノビオチン錯体で
観察される値と略等しい。更にアンチ−ビオチン
抗体はもしあつたとしても抗体とクロマチン物質
との非特定結合は僅かしか起らないので生体内原
位置交配による染色体上の特定ポリヌクレオチド
連鎖の検出において非常に有用であることが証明
されている。 本発明の変性ポリヌクレオチドは交配プローブ
としてこれらの使用に適合する条件下において変
質および回復の能力を有する。熱的変質の様相と
いくらかのビオチン置換DNAおよびRNAポリマ
ーの交配特性の分析は明らかにこれを示す。例え
ば、ニツク転換を行なつてキロベースに対して約
10〜100ビオチン残渣を導入したpBR322DNAも
しくはλDNAは対照のビオチンを含まないDNA
のTm値と本質的に同一であるTm値を有する。
更に32P−ラベルされたビオチン置換体
pBR322DNAはプラスミドを含むバクテリア群
の検出に対する交配プローブとして用いられた
時、対照であるチミヂン含有DNAと同様な程度
の特性および自動放射線記録信号強度を示した。 一本の糸（5kbに対して全体で1250）における
すべてのチミヂン残渣がビオチン化ヌクレオチド
によつて置き換えられる例えばMVFRF DNAの
ようなDNA複合体においては、該Tmは置換さ
れていない対照のそれよりも小さくたつた５℃で
ある。各々の塩基対が一つのbio−dUMP残渣を
含んでいるポリｄ（Ａ−bioU）のTmはポリｄ（Ａ
−Ｔ）対照よりも低い15℃であるけれども、変性
および回復の両方の間に観察せられる協調性の度
合および紫外線吸収性の範囲は該二つのポリマー
に対するものと同じである。RNA複合体と
DNA／RNA交配体の平行分析はこれらのTmの
値がポリマーのビオチン含有量の増加にともなつ
てまた減少すると言うことを示している。しかし
ながらビオチン分子の実質的な数がポリマーの交
配特性を顕著に変えることなく導入されることが
出来ることは明らかである。 これらの結果はビオチン置換ポリヌクレオチド
が染色体、固定細胞において特定のポリヌクレオ
チド連鎖を検出および／または位置決めするため
のプローブとして用いられ得るのであろうことを
強く示唆するものである。ビオチン置換プローブ
を検出するための一般的な原案は以下に図示され
る。 この一般的な図は遺伝子地図（細胞遺伝学的）
および組換えDNA手法に対して用いられた手順
のみを説明するものである。しかしながら臨床試
料におけるバクテリア、ウイルス、菌、もしくは
寄生源の核酸連鎖の検出に対してそれは同様都合
よく適用され得、そしてこれは放射性同位元素の
使用に依存しない臨床診断に対する有力な新らし
い方法の基礎を形成する。 ビオチンの検出に対する免疫学的および組織化
学的方法は該基礎的方法が生体内インジツツ交配
の遺伝子地図を作成する迅速な方法および汚染交
配方法による特定核酸連鎖の検出のための非放射
能性手順のために使用可能であることを示してい
る。用途は新らしい臨床診断手順の開発における
この手法からなるものである。 この方法を用いれば、特定デオキシリボ核酸ま
たはリボ核酸分子、特に例えばバクテリア、菌、
ウイルス、イーストもしくは哺乳類から誘導され
る分子の存在を測定することが可能である。これ
は患者もしくはその他の被検体における核酸含有
病因の順次の診断を可能ならしめる。 更に抗体耐性を測定することはバクテリアのス
クリーニングに対する方法を提供する。かくし
て、例えば、ストレプトコツカス ピオゲネスも
しくはネイセリス メニンギチデイスにおけるペ
ニシリン耐性、スタフイロコツカス アウレウ
ス、カンヂダ アルビカンス、プシユードモナス
アエルギノザ、ストレプトコツカス ピオゲネ
シスもしくはネイセリア ゴノロエアエにおける
テトラサイクリン耐性、およびミコバクテリウム
テユバキユロシスにおけるアミノグリコシド耐
性は測定されることが出来るのである。 これらの方法においては、生物もしくはその抗
生物質耐性を特徴づける核酸鎖と対をなす。そし
て更に本発明による変性核酸の一つもしくはそれ
以上を含むポリヌクレオチドが調製される。この
ポリヌクレオチドは精査下において生物から得ら
れた核酸によつて交配される。交配のための欠陥
は生物もしくは耐性特性の不在を示す。 交配された核酸複合体はそれから核複合体と検
出可能な部分を担持する適当なポリペプチドとの
錯体を形成し、そして適当な検出手法を使用して
該錯体の存在を検出することによつて識別され
る。陽性検出は錯体、複合体、そしてそれ故に関
心のある核酸鎖が存在することを示す。 この方法は例えばサラセミアおよび鎌状細胞貧
血症のような遺伝的欠陥の診断に拡張され得る。
その存在もしくは不存在が該欠陥と関連している
（サラセミアの場合）デオキシリボヌクレオチド
酸遺伝子鎖は適当な検出可能なポリヌクレオチド
による錯体形成に基づく本発明によるポリヌクレ
オチドプローブとの下記の交配によつて検出され
ることが出来る。 遺伝子の地図を作成することもしくは染色体上
の特定の位置に対するこれらの転写は細胞融合や
体細胞遺伝の手法を主として含む冗長な時間を消
費する仕事であつた。生体内インジツツ交配は例
えばドロソフイラのような染色体ポリテン化を受
ける種において、一重複写遺伝子連鎖の地図を作
成するためには首尾よく用いられて来たけれど
も、大部分のより高度な真生核染色体における特
有の連鎖遺伝子の検出は例えば不可能ではないに
しても標準交配方法を用いては著るしく困難であ
つた。非常に高度に特定されている放射性のポリ
ヌクレオチドプローブが交配位置の自動放射能記
録位置決めを容易にするための必要性はまた探査
子の急速な放射性分解と、銀粒状沈澱物の背後ノ
イズにおける付随的な増加を招来する。低度から
中度の特定放射性を有する交配プローブの使用は
例えばリボゾームRNA遺伝子もしくは衛星DNA
のような多重複写連鎖を検出する場合でさえも、
多くの日数もしくは週にわたる露出時間を必要と
する。組換えDNA手法は真生核細胞中に見出さ
れる殆んどすべての一重複写連鎖の分子クローン
化を実行可能しているから、かようなクローン化
された遺伝的断片の染色体起原の地図を作成する
ための迅速なそして鋭敏な方法を有することは非
常に有益なことである。 変性ヌクレオチドは放射性同位元素の使用を回
避する生体内インジツツ交配による遺伝子地図の
作成において用いられるであろう。この手順は
DNAプローブの中へニツク転換によつて酵素的
に取入れられ得るビオチンを含むチミヂン類似物
を利用する。生体内原位置交配の後、ビオチン分
子は精製されたラビツトアンチ−ビオチン抗体の
親和力のための抗原として役立つ。フルオレセイ
ン標識付されたヒツジのアンチ−ラビツトIgGと
共に形成される免疫螢光抗体サンドイツチは緑−
黄バンドとしてクローン化された遺伝子連鎖の迅
速なそして明確な細胞遺伝学的位置決めを準備す
る。この方法は生体内原位置遺伝子位置決めの通
常の自動放射能記録方法に比してより少ない背後
ノイズ、バンド間の分解能力の向上、プローブ交
配の位置測定に要する時間の短縮、そして化学的
に安定な交配プローブという四つの主な利点を提
供する。この方法はドロソフイラ ミラノガスタ
ーのポリテン染色体およびマウス中期染色体上の
衛星DNAにおける反復されたそして独特なDNA
鎖の位置決めに対して首尾よく適用されて来た。 かくしてポリテン染色体が生体内原位置遺伝子
地図作成に対する間接的免疫螢光性によつて検出
されるのであるが、本発明による変性ヌクレオチ
ドを用いたプローブの効能を証明するための試験
システムとして用いられることが出来ると云うこ
とは見出されている。該プローブは例えば約５か
ら約22キロベースの範囲の大きさの挿入によるプ
ラスミドベクトルの中におけるクローン化された
tRNA遺伝子のようなオツトー シユミツトおよ
びデイーター ゼルから得られたクローン化ドロ
ソフイラ連鎖の変種を含んでいた。これらクロー
ンの多くのものは既に放射性同位元素を用いた通
常の生体内インジツツ交配方法によつてドロソフ
イラ染色体地図上に特有なバンドを割当てられて
いる。 DNAプローブはBio−dUTPの存在下において
ニツク転換せしめられた。時々3HdATPおよ
び／または3HdCTPが該ニツク転換反応混合液中
に含まれた。このことは単一染色体広がり上の連
鎖の自動放射能記録的および免疫螢光的の双方の
位置決めを可能にする。生体内インジツツ交配は
M.L.パーデユウ，およびJ.G.ガール，細胞生物学
における手法．，10.1（1975）中に記載されたと同
様に遂行された。交配されていないプローブを除
去するための最後の2xSSC洗滌の後、スライド
はPBS（燐酸で緩衝化された塩類）ですゝがれ、
そしてPBSおよび10mg／mlBSA中の2.5μｇ／ml
ラビツトアンチ−ビオチンと共に37℃２〜16時間
孵置された。これにつづいて該スライドはFITC
標識付けされたヒツジアンチ−ラビツトIgG（マ
イルス研究所、PBSおよび10mg／mlBSA中１：
100に希釈されている）と共に１〜４時間孵置さ
れた。エバンス ブルーは屡々螢光照明によつて
染色体を見るために赤色逆着色剤として必要とせ
られる。 夫々5kbと22kb挿入を含むプラスミドpBR17D
とpPW539がこの方法によつて交配された時、交
配のパターンは広がりから広がりへ再現され、そ
して与えられたスライド上に染色体拡がりの90％
以上が明瞭に観察されることが見出された。 クローン化されている置換可能要素pAC104は
ドロソフイラゲノムに沿つて多くの位置に地図を
形成するものとして知られている。このプローブ
の生体内インジツツ交配によつて得られた自動放
射能記録と螢光写真の比較はこの方法の大きな利
点、即ち銀粒の拡散地域が自動放射能記録上に現
われる所に二重または一連のバンドが免疫螢光標
識付けによつて識別出来るということを示す。 この方法の他の直ちに明らかな利点は間接免疫
螢光によつてなされるべき遺伝子指定に必要とさ
れる時間における著じるしい短縮である。特定バ
ンドに対するDNA断片の指定は６時間の交配の
範囲でなされることが出来る。これは自動放射能
記録露出方法に必要とされる数日間もしくは数週
間と比べれば明らかである。この要因は分解能の
向上と合わせて間接免疫螢光によつて検出される
変性ヌクレオチドの使用をこれより従前の方法に
比して直接より望ましいものとしているのであ
る。 この免疫学的方法はまた衛星DNAがマウス中
期染色体の動原体領域の地図を作成したところの
哺乳類染色体を動かすことが示されている。該結
果はヒトおよびその他の哺乳類からの染色体中の
単一複写（独特）連鎖のための単一遺伝子地図作
成手順の開発に対する基礎を提供する。かような
手順は染色体の遺伝的構成についての我々の理解
を極めて容易にしそして臨床細胞遺伝的診断をよ
り迅速かつ実際化するのである。 染色体拡がりがラビツトアンチ−ビオチンIgG
と共に交配の後に注目される単一段階“抗体サン
ドイツチ”方法は成功はするであろうが、この原
案は明確な遺伝子指定のために充分な螢光を発し
ない。しかしながら、ラム等（1972）、フオシー
等（1974）によつて記述された“ハプテン−抗体
サンドイツチ手法”を用いることによつてより強
力な螢光的信号が得られることが出来る。この手
順においては第一次抗体、我々の場合は単一種
的、即ちラビツト アンチ−ビオチンIgGは望ま
しくは免疫グロブリンが一つの抗原親和性カラム
（ビオチン−セフアローズTM）に結びついてい
る間に例えば２，４−ジニトロフルオロベンゼン
のようなハプテン化試薬によつて化学的に変性さ
れる。15〜20だけのハプテン（DNP）グループ
が親和性もしくは特性を抱束しているその抗原を
減少することなくして第一次抗体に結合されるこ
とが出来る（ワレースおよびフオシー、1979）。
該試験試料の第一次抗体処理に続いて螢光標識付
けされたアンチ−IgGよりもむしろ螢光標識付け
されたアンチ−ハプテンIgG抗体と共に養生が行
われるならば、螢光信号における５から７倍の増
加が得られることが出来る。また単一種的ギニア
ピツグ アンチ−DNP IgGが利用出来るので、
我々はこの第二次抗体をビオチンでハプテン化し
かくして二つのアンチ−ハプテンIgG集団、
DNP−標識付けされたアンチ−ビオチンIgGと
ビオチン標識付けされたアンチ−DNPIgGとを
作ることが出来る。もしこれがハプテン−抗体サ
ンドイツチを行なうために交互に用いられ、そし
てそれから多くの哺乳動物種からのIgG分子に固
有的に結びついているスタフイロコツカス、アウ
レウスからの螢光標識付けされた蛋白質Ａに従が
われるならば、それは付随の有用性と共に第一次
抗体信号の莫大な増幅を結果として生ずる。 ストレプトミセス アビヂンからの蛋白質スト
レプトアビヂンは結合された可視化システム〔例
えば螢光プローブ（上）もしくは組織化学試薬
（下）〕を交配されたビオチン含有ポリヌクレオチ
ドの位置に対して固有的に指向を行なうための乗
物として可能性ある選択物である。アンチ−ビオ
チンIgGに対してストレプトアビヂンが優る一つ
の点はハプテン−IgG相互作用の会合常数が107
から1010であるのに対してビオチンに対するそれ
の親和性はKassn＝1015であることである。迅速
な反応速度と莫大な親和性はビオチン化されたプ
ローブの位置決めに要する時間が免疫学的試薬に
おける時間単位に対してストレプト アビヂンに
おいては分単位になることであろう。 ストレプト アビヂン検出システムの最初の評
価は現在進行中である。ビオチン化DNA探査子
と交配されたポリテン染色体はストレプトアビヂ
ンと共に孵置せられ、次いでビオチンおよび
FITC（FITC，ビオチン化−BSA）で二重に標識
付けされたウシ血清アルブミンと共に後孵置され
るであろう。四つのストレプトアビヂン亜単位の
うちの只一つだけが各々のビオチン化DNA位置
の結合の中に含まれることが可能であると思われ
るから、一つの標識付されたBSA分子が該スト
レプトアビヂン−ビオチン化ヌクレオチド錯体の
うちの残存する三つの非共役亜単位の各々と結合
することが出来る可能性を有する。この単一スト
レプトアビヂン＋FITC，ビオチン化BSAからの
螢光信号は先に述べた基礎の“抗体サンドイツチ
方法”を用いて対照と比較されるであろう。 もし“抗体サンドイツチ”とストレプトアビヂ
ン＋FITC，ビオチン化BSA検出強度が比較出来
るならば、ストレプトアビヂン＋FITC，ビオチ
ン化−BSAシステムは多重“ハプテン−抗体サ
ンドイツチ”方法と匹敵する様式で単一複写の複
写感度に迄高めることが企てられ得る。BSA上
のビオチン基のいくらかのものはストレプトアビ
ヂンの第一層には結合されていないので、ストレ
プトアビヂンの第二層は充分な信号が得られるま
で付加されることが出来る。例えばもし第二層に
おいて只二つのストレプトアビヂンプロモーター
が第一層BSAの各々と結合しそしてこれらスト
レプトアビヂンプロモーターの各々が三つの
FITC−ビオチン化BSA分子と結合するならば、
第二層強度は第一層からのそれの二倍になり、第
三層に対しては化学量論的に結合している類似物
と共に螢光強度は第一層のそれの12倍になり、そ
れ故に全強度は引続いて加えられる層と共に急速
に増加するであろう。 結び付けられている螢光物質とビオチンプロー
ブの量を最大にするためにBSAよりもむしろ甲
状腺グロブリンのような大きな担体蛋白質が用い
られる計画がある。ビオチンプローブと担体蛋白
質との間のより長い結合鎖手を用いることはまた
必要であろう。より長い結合鎖手はビオチン化さ
れた螢光性担体分子を各々の非共役ストレプトア
ビヂン亜単位に理論的に配達することを分子空間
的に最適化し、そして該ビオチン化された螢光性
担体と結び付くであろう後続の層におけるストレ
プトアビヂンプロモーターの数を最大にする。先
のように、適当な対照は螢光プローブとビオチン
を有する担体蛋白質の置換は溶解性および／また
は非特定結合問題を生じない。 ストレプトアビヂン−担体配達システムはその
配達速度に加えて免疫螢光方式と比べて二つの重
大な利点を有する。第一に、只二つの蛋白質成分
が層形成に必要とされるのみである。第二に、只
一つの担体蛋白質が変性のために必要でありそし
てそれは官能性を維持する必要がなくまたはビオ
チン基と同程度の長さの全構造形態でさえもスト
レプトアビヂンに接近し得る。 交配されたプローブを可視化するための螢光方
法の一つの選択されたものは例えばパーオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼのアルカリホスフア
ターゼのような酵素を可溶性基質を不溶性着色沈
澱物に酵素的に転換することが光顕微鏡で可視化
せしめられ得る交配位置に指向することである。
この手法の重要な利点は組織化学的方法が螢光検
出よりも10から100倍以上敏感であることである。
加うるに、着色沈澱物は広範囲にわたる光露出に
よつても色があせず、かくして螢光光顕微鏡検査
の一般的な欠点を回避するものである。これら酵
素は例えばグルタルアルデヒドのような二官能性
試薬を用いる“ハプテン−抗体サンドイツチ”手
法において、またパーオキシダーゼの場合はパー
オキシダーゼ炭水化物部分をアルデヒドに酸化し
そしてこれらの残渣を所望の蛋白質のε−アミノ
基と結合することによつて螢光プローブの代りに
最終的な抗体に結合せしめられ得る。ストレプト
アビヂン−ビオチン化担体蛋白質方法に対して
は、それと結合されるビオチン基を有する酵素は
螢光的にビオチン化された担体システムを置き代
えることが出来た。交互に該酵素はビオチン化さ
れたBSAもしくは甲状腺グロブリンを用いて先
の層の中に形成されたストレプトアビヂン位置の
増幅をともなつてビオチンによつてストレプトア
ビヂンの最後の層に結合され得た。我々は必要な
組織化学的試薬および生体内原位置交配を背後問
題なくして可視化するための適当な基質／不溶解
生成物結合体の開発に間もなく着手するであろ
う。信号増幅に対する組織化学的研究はそれ故に
1981年の夏に試験の準備がなされるべきである。 螢光の非常に低いレベルを検出および／または
推定することはレーザおよび光増感剤からなる現
在用いられている像増強物もしくはシステムを用
いることによつて可能である。これらの方法は
個々の光子のレベル程度に低い光の検出を可能な
らしめる。像の例えば各々の映写像である各々の
点が目的物の点によつて発せられる光子の数に厳
密に比例する適当なデイジタル処理システムによ
つて、像が形成されることが出来る。この種のシ
ステムもしくは細胞の全部もしくは一部がレーザ
光線を通り過ぎて流動する流動システムを用い
て、100から目視で検出され得る1000以上までの
間の因子からの螢光物質に対する検出感度増強が
得られることが出来る。この増強は単一複写遺伝
子の螢光を検出するに充分である。 望ましい変性において、アリルアミン結合鎖手
を介してピリミヂン環のＣ−５位置に共有的に結
合されているビオチン分子を含むdUTPおよび
UTP類似物は合成されている。これらビオチン
化−ヌクレオチドは試験管内でのDNAおよび
RNAポリメラーゼの種々のものに対する効果的
な基質である。ビオチン置換体の低レベル（50分
子もしくはそれ以下／キロベース）を含んでいる
DNAは置換されていない対照DNAのそれから区
別することの出来ない変性、再合同、そして交配
特性を有する。 かくして本発明はまた染色体核型形成の方法を
提供する。この方法においては、変性されたポリ
ヌクレオチドが既知の遺伝子に相当しそして変性
ヌクレオチドを含む変性ポリヌクレオチドが調製
される。これらヌクレオチドは染色体デオキシリ
ボ核酸と交配せられ、生じた複合体は適当な條件
下において適当なポリペプチドと接触せしめら
れ、錯体を形成する。該ポリヌクレオチドは検出
可能な部分を含み、それ故に該錯体の位置は測定
が可能でありそして固有な遺伝子の位置はそれに
よつて固定される。 本発明の他の実施例はウラシル塩基のいくらか
が変性されてプローブを含むポリＵを用いるポリ
Ａ含有連鎖の検出を含む。更に他の実施例では
ｘ，ｙおよびｚのうちの二つが反応せしめられて
環状部分 を形成する環状変性ヌクレオチドを含む。 このような環状変性ヌクレオチドはそれから癌
もしくば腫瘍細胞を検出する方法として順次に用
いられる細胞表面上のホルモン受入れ位置の識別
のために用いられる。 最後に、腫瘍細胞は本発明によつて変性され、
例えばα−胎児蛋白質もしくは癌胚種抗原のよう
なポリペプチドの生成に関連するデオキシリボ核
酸遺伝子連鎖から合成され、その存在が特定の腫
瘍細胞に対する診断に役立つメツセンジヤーリボ
核酸と対をなすポリヌクレオチドの調製によつて
診断され得る。かくして交配複合体の交配および
検出は腫瘍細胞の検出のための方法を提供する。 以下の実施例は本発明の種々の様相を説明する
ためのものであるが、「特許請求の範囲」中に記
載されるよりも本発明の技術的範囲をより詳細に
如何なる方法においても制限する意図を有するも
のではない。 実施例１ および２ ビオチン化−UTPとビオチン化−dUTPの合
成 (a) 水銀化ヌクレオチドの調製 UTP（570mg，1.0ミリモル）もしくはdUTP
（554mg，1.0ミリモル）が0.1M酢酸ソーダバツフ
アーPH6.0の100ml溶解されそして酢酸水銀
（1.59gm，5.0ミリモル）が添加された。該溶液は
50℃で４時間加熱せられ、それから氷上で冷却さ
れた。塩化リチウム（392mg，9.0ミリモル）が添
加せられそして該溶液は酢酸エチルの等量によつ
て６回抽出せられて過剰のHgCl2を除去された。
該抽出過程の効率は４，４−ビス（ジメチルアミ
ノ）−チオベンゾフエノンを用いて有機層中の水
銀イオン濃度を測定することによつて監視された
（A.N.クリストフアー，アナリスト，94，392
（1969））。デール等（R.M.K.デール，D.C.ワー
ド，D.C.リビングストン，およびE.マーチン，核
酸研究．２，915〔1975〕）によつて述べられてい
るように水性溶液の一部分をとつてそれをヨウ素
化し、その後分光分析を行なうことによつて測定
せられたヌクレオチド水銀化の程度は通常90から
100％までの間であつた。水性層中の該ヌクレオ
チド生成物は酢酸エチル抽出の間に屡々濁るよう
になるのであるが、水冷エタノールの３倍量の添
加により沈澱せられそして遠心分離によつて集め
られた。沈澱物は冷純エタノールで二回、エチル
エーテルで一回洗滌せられ、そしてそれから風乾
せられた。かくして調製せられた水銀化ヌクレオ
チドは更なる精製を行なうことなくしてアリルア
ミン−ヌクレオチドの合成に用いられる。 (b) アリルアミン−dUTPおよびアリルアミン−
UTPの合成 水銀化ヌクレオチド（段階ａの）はPH5.0の
0.1M酢酸ソーダバツフアー中に溶解せられそし
て20ミリモル（267nｍで200OD／ml）に調節さ
れた。水性酢酸中の酢酸アリルアミンの新らしい
2.0モル溶液が1.5mlのアリルアミン（13.3ミリモ
ル）を8.5mlの氷冷4M酢酸にゆつくり添加するこ
とによつて調製せられた。中和されたアリルアミ
ンストツクの３ml（6.0ミリモル）かヌクレオチ
ド溶液の25ml（0.5ミリモル）に添加された。４
mlの水中に溶解されたK2PdCl4（163mg，0.5ミリ
モル）の一つのヌクレオチド相当量が添加せられ
て反応が開始された。パラヂウム塩（アルフアー
ベントロン）の添加において、反応容器の壁面に
生ずる金属（HgおよびPd）沈積物によつて溶液
は次第に黒色に変化した。18〜24時間室温に放置
した後、該反応混合物は0.45mm膜フイルター（ナ
ルゲン）を通して残存する金属沈澱物の殆んどを
除去した。該黄色液は５倍に希釈せられDEAE
−セフアデツクスTMA−25（Pharmacia）の100
mlカラムに適用された。PH5.0の0.1M酢酸ソーダ
の１カラム容量による洗滌の後、該生成物はPH８
〜９の酢酸ソーダもしくはPH7.5の重炭酸トリエ
チルアンモニウム塩のいづれかの１線型勾配
（0.1〜0.6モル）を用いて流出せしめられた。所
望の生成物は0.30と0.35M塩の間に流出する主
UV吸収部分中に存在した。スペクトル分析はこ
のピークが幾らかの生成物を含んでいることを示
し、最終的な精製はPH3.3の0.5MNH4H2PO4バツ
フアー（分析的分離）もしくはPH4.3の0.5M酢酸
トリエチルアンモニウム（予備分離）のいづれか
を用いてPartisil−ODS2のカラム上での逆層−
HPLCクロマトグラフイーによつて行われた。５
（３−アミノプロペン−１−イル）ウリヂン（ウ
リヂンのアリルアミンアダクト）の5′−トリホス
フエイトが該HPLCカラムから流出されるべき最
後の部分でありそしてこれらはいまだ特性付けさ
れていないけれども三種の夾雑物から明確に分離
せられた。これらヌクレオチドはプロトロNMR
元素分析によつて〔AA−dUTP
（C12H16N3O14P3Na4・1H2O）：理論値，Ｃ，
22.91；Ｈ，2.88；Ｎ，6.68；Ｐ，14.77.根拠値，
Ｃ，23.10；Ｈ，2.85；Ｎ，6.49；Ｐ，14.75.AA−
UTP（C12H16N3O15P3Na4・4H2O）：理論値，Ｃ
20.61；Ｈ，3.46；Ｎ，6.01；Ｐ，13.3.根拠値
Ｃ，20.67；Ｈ，4.11；Ｎ，5.39；Ｐ，13.54〕で
あるとスペクトル的にそしてクロマトグラフ的に
特徴付けられた。 (c) AA−dUTPまたはAA−UTPのビオチン化 ビオチン化−Ｎ−ハイドロキシサクシミドエス
テル（NHSB）は前述したように（H.ハイツマ
ンおよびF.M.リチヤーズ，米国自然科学学会会
報．71，3537〔1974〕），ビオチン（Sigma）から
調製せられた。AA−dUTP・H2O（63mg，0.1ミ
リモル）もしくはAA−UTP・4H2O（70mg，0.1
ミリモル）がPH8.5の0.1Mホウ酸ソーダバツフア
ーの20ml中に溶解せられ、そしてジメチルフオル
ムアルデヒドの２ml中に溶解せられたNHSB
（34.1mg，0.1ミリモル）が添加された。反応混合
物は４時間室温に放置されそしてそれからPH7.5
の0.1MTEABによつて予備平衡化されている
DEAE−セフアデツクスTMA−25の30mlカラム
上に直接負荷された。該カラムはTEABの400ml
線型勾配（0.1〜0.9M）によつて流出された。
0.55と0.65M TEAB間に流出したビオチン化−
dUTPもしくはビオチン化−UTPを含む区画は
メタノール存在下でロータリーエバポレーシヨン
によつて脱塩せられそして水に再溶解された。
時々若干濁つた溶液が得られた。ある種の
TEAB溶液中の夾雑物の故であるこの濁りは0.45
mmフイルターを通して過することによつて除去
された。長期間の貯蔵に対しては、該ヌクレオチ
ドはDowex TM50（Na+型）の存在中で該溶液
を短時間撹拌することによつてソーダ塩に変換さ
れた。過の後、該ヌクレオチドは冷エタノール
の３倍量の添加によつて沈澱せしめられ、エチル
エーテルで洗滌せられ、水酸化ソーダペレツト上
で真空乾燥せられ、そして−20℃でデシケーター
中にて貯蔵された。直接の使用に対しては、該ヌ
クレオチド溶液はPH7.5のトリス−HCl中に
20mMとされそして最終ヌクレオチド濃度を
5mMに調節される。ストツク溶液は−20℃にて
凍結貯蔵される。 該bio−dUTPおよびbio−UTP生成物の元素
分析は次の結果を得る。Bio−dUTP
（C22H30N5O18P3S1Na4・1H2O）．理論値；Ｃ，
29.80；Ｈ，3.38；Ｎ，7.89；P.10.47；S.3.61.根拠
値；Ｃ，30.14H，3.22；Ｎ，7.63；Ｐ，10.31；
Ｓ，3.70..Bio−UTP（C22H30N5O19P3S1Na4・
3H2O）：理論値；Ｃ，29.15；Ｈ，3.19；Ｎ，
7.45；Ｐ，9.89；Ｓ，3.41.根拠値；Ｃ，28.76；
Ｈ，3.35；Ｎ，7.68；Ｐ，9.81；Ｓ，3.32. PH7.5におけるbio−dUTPとbio−UTPのスペ
クトル性質〔λmax，289nｍ（ε＝7100）；
λmax，240nｍ（ε＝10700）；λmin，262nｍ
（ε＝4300）〕はピリミヂン環と共役する一つの外
環二重結合の存在を反映している。エタノール性
硫酸中のＰ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド
で処理するビオチン定量分析に用いられる方法
（D.B.マコーミツクおよびJ.A.ルース，生化学分
析．，34，326，1970）を行なつた時、これらヌク
レオチドはまた強い陽性反応を示す。しかしなが
ら、これらはもはやAA−dUTPおよびAA−
UTP出発物質の特徴的反応であるニンヒドリン
反応を示さない。 実施例３および４ ビオチン化−CTPとビオチン化−dCTPの合成 CTPとdCTPは本質的には実施例１に記述した
ように(a)水銀化され、(b)アリルアミンと反応せら
れ、(c)NHS−ビオチンでビオチン化された。
CTP（56.3mg，0.1ミリモル）もしくはdCTP（59.1
mg，0.1ミリモル）がPH5.0の0.1M酢酸ソーダバツ
フアーの20ml中に溶解せられそして酢酸水銀
（0.159gm，0.5ミリモル）が添加された。該溶液
は50℃で４，５時間加熱せられそれから氷上で冷
却せられた。塩化リチウム（39.2mg，0.9ミリモ
ル）が添加せられそして該溶液は酢酸エチルで６
回抽出せられた。水性層中の該ヌクレオチド生成
物は冷エタノールの３倍量の添加によつて沈澱せ
られ、該沈澱物は純エタノール、エチルエーテル
で洗滌せられ、そしてそれから乾燥せられた。こ
れら生成物は夫々AA−CTPおよびAA−dCTP
の合成のために更なる精製を行なうことなくして
用いられた。該水銀化ヌクレオチドはPH5.0の
0.1M酢酸ソーダバツフアーの中に溶解せられそ
して10mM（275nｍにおいて920D／ml）の濃度に
調節せられた。2.0M酢酸アリルアミンストツク
（実施例１に述べたと同様に調製せられた）の0.6
ml（1.2ミリモル）がヌクレオチド溶液（0.1ミリ
モル）の10mlに添加せられ次いで1.0mlのH2Oに
溶解せられたヌクレオチド溶液（0.1ミリモル）
K2PdCl4（32.6mg，0.1ミリモル）が添加された。
室温で24時間放置した後、該溶液は0.45mm膜を通
して過を行ない金属沈澱物を除去した。該液
は５倍に希釈されそしてPH7.5の50mM TEABに
よつて予備平衡化されたDEAE−セフアデツクス
Ａ−25の50mlカラム上に負荷された。該ヌクレオ
チド生成物はPH7.5の500ml線型勾配（0.05〜
0.6M）の応力によつて分別された。所望の生成
物は0.28と0.38M塩の間に流出する主UV吸収部
分中に存在した。集められた試料はロータリーエ
バポレーシヨンによつて脱塩せられ、PH4.2に
0.5M酢酸トリエチルアンモニウム中に溶解され、
そして最終的な精製は0.5M酢酸トリエチルアン
モニウムを流出液として用いてPartisil ODS−
２のカラム上でHPLCクロマトグラフを行うこと
によつて達成せられた。適当な区画が集められ凍
結真空乾燥せられ、そして生成物はH2O中に溶
解せられた。該ヌクレオチドはDowexTM50
（Na+型）の存在において短時間撹拌することに
よつてNa+塩に変換せられた。Dowexレジンを
除去するための過後、ヌクレオチドは冷エタノ
ールの３倍量の添加によつて沈澱せられた。該沈
澱物はエーテルで洗滌されそしてそれから風乾せ
られた。分析結果：AA−dCTP
（C12H17N4O13P3Na4・2H2O）；理論値，Ｃ，
22.29；Ｈ，2.63；Ｎ，8.67，Ｐ，14.40.根拠値Ｃ，
22.16；H.2.89；N.8.77；Ｐ，14.18.AA−CTP
（C12H17N4O14Na4・2H2O）；理論値Ｃ，21..75；
Ｈ，2.57；Ｎ，8.46；Ｐ，14.01.根拠値，Ｃ，
22.03；Ｈ，2.47；Ｎ，8.69；Ｐ，13.81；PH8.0の
0.1Mホウ酸塩バツフアー中のスペクトル性質，
λmax301nｍ（ε＝6400），λmin271nｍ（ε＝
3950）λmax250nｍ（ε＝9700）．AA−dCTPお
よびAA−CTPの双方共に陽性ニンヒドリン試験
を示した。 AA−CTP（6.6mg，0.01ミリモル）もしくはAA
−dCTP（6.4mg，0.01ミリモル）がPH8.5の0.1Mホ
ウ酸ソーダバツフアーの５ml中に溶解せられ、そ
してジメチルホルムアミドの0.2ml中に溶解せら
れているNHS−ビオチン（3.4mg．0.01ミリモル）
が添加された。室温で４時間放置後、該試料はPH
7.5のTEABの150ml線型勾配（0.1〜0.9M）を流
出液として用いてDEAE−セフアデツクスＡ−25
の10mlカラム上でクロマトグラフにかけられた。
0.50と0.60M TEAB間に流出したビオチン化−
CTPもしくはビオチン化−dCTPを含む区画は集
められ、ロータリーエバポレーシヨンによつて脱
塩せられ、そしてPH7.5の0.02Mトリス−塩酸バ
ツフアー中で5mMの最終濃度に調節された後、−
20℃で凍結された。該生成物はエタノール性硫酸
中にてｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドに
よつてビオチンに対する強い陽性反応を示すが、
ニンヒドリンによるスプレー時には第一級アミン
に対する陰性反応を示す。これら生成物の更なる
構造的特徴づけは現在進行中である。 実施例５および６ イミノビオチン化−UTPおよびイミノビオチ
ン化−dUTPの合成 イミノビオチンハイドロブロマイトは前述した
ようにしてビオチンから調製された（K.ホフマ
ン，D.B.メルビールおよびV.duビグニード，生
化学雑誌，141，207−211，1941；K.ホフマンお
よびA.E.アキセルロツド，同上．，187，29−33，
1950）．イミノビオチンのＮ−ハイドロキシサク
シニミド（NHS）エステルはNHS−ビオチンの
合成のために先に記述された原案（H.ハイツマ
ンおよびF.M.リチヤーズ，米国自然科学学会誌，
71，5537，1974）を用いて調製せられた。実施例
１（ｂ部）において詳細に説明されたようにして
AA−UTP（7.0mg，0.01ミリモル）もしくはAA
−dUTP（6.3mg，0.01ミリモル）が調製せられPH
8.5の0.1Mホウ酸ソーダバツフアーの５ml中に溶
解せられ、ジメチルホルムアミドの0.5ml中に溶
解せられたNHS−イミノビオチン（3.5mg，0.01
ミリモル）が添加された。該反応混合物は室温で
12時間放置されそしてそれからPH7.5の0.05M
TEABで予備平衡化されたDEAE−セフアデツ
クスＡ−25の10mlカラム上に直接負荷された。該
カラムはTEABの150ml線型勾配（0.05〜0.6M）
によつて流出された。0.35と0.40M TEAB間に
流出したイミノビオチン−UTPもしくはイミノ
ビオチン−dUTPを含む区画はメタノール存在に
おけるロータリーエバポレーシヨンによつて脱塩
せられ、H2O中に溶解せられた。アリルアミン
−ヌクレオチドアダクトの少量を不純分として含
む該生成物はニンヒドリン試験において弱い陽性
を示した。最終的な精製はアビヂン−セフアロー
ズ上の親和性クロマトグラフイーによつて行われ
た。PH8.5のホウ酸ソーダバツフアー中にて0.1M
にせられた不純生成物の区画はアビジン−セフア
ローズの５mlカラムに適用されそして同じバツフ
アーの25mlによつて洗滌せられた。カラムはそれ
からPH4.0の50mM酢酸アンモニウムで洗滌せら
れ、それは鋭いピークで所望のイミノビオチン−
ヌクレオチド生成物を流出した。該ヌクレオチド
は冷エタノールの３倍量の添加によつて沈澱せら
れ、エチルエーテルで洗滌せられ、水酸化ソーダ
ペレツト上で真空乾燥せられ、−20℃のデシケー
ター中で保存せられた。生成物はスペクトルおよ
びクロマトグラフ的性質のみならず元素分析によ
つても特徴付けられた。 実施例７および８ NAGE−UTPおよびNAGE−dUTPの合成 アリル（３−アミノ−２−ハイドロキシ−）プ
ロピルエーテル、NAGEと省略されるが、アリ
ルグリシジルエーテル（Age）（アルドリツチケ
ミカルカンパニーから得られた）から調製せられ
た。Age（84ミリモル）の10mlが9M水酸化アンモ
ニウムの50mlにゆつくり（蒸気よけフード中に
て）添加されそして該混合物は６時間室温で放置
せしめられた。過剰のアンモニアが減圧下ロータ
リーエバポレーシヨンによつて除去せられて粘ち
ような黄色油を得た。プロトンNMRによるこの
生成物の分析はそれが要求せられる構造を有して
いることを示した。５−水銀−dUTP（0.1ミリモ
ル）もしくは５−水銀−UTP（0.2ミリモル）が
PH5.0の0.2M酢酸ソーダバツフアーの２〜４ml中
に溶解され、使用に先立ちPH5.0に酢酸で調節さ
れたNAGEの16倍モル過剰量が添加せられた。
最終的な反応容量（4.3および8.4ml）は夫々43お
よび42mMのヌクレオチド濃度を有する。
K2PdCl4の一当量（0.1もしくは0.2ミリモル）が
反応を開始するために添加せられた。室温で18時
間放置の後、該反応混合物は0.45μmM膜を通し
て過せられ、該試料は５倍に希釈せられ、そし
て酢酸ソーダの線型勾配（0.1−0.6M）を用いて
DEAE−セフアデツクスＡ−25のカラム上にクロ
マトグラフされた。UVスペクトルと
PartisilODS−２上の特徴的なHPLC流出様相に
よつて判定せられるのであるが、所望の生成物を
含む区画は集められ、希釈せられ、そして更にPH
8.5の重炭酸アンモニウムの浅薄勾配（0.1〜
0.5M）を用いたDEAE−セフアデツクス上での
再クロマトグラフイーによつて精製せられた。こ
れらの條件下において、該NAGE−dUTP（また
はNAGE−UTP）の大部分が残存する不純物か
らきれいに分離されることが出来た。ヌクレオチ
ドが凍結真空乾燥されそしてD2O中に再溶解され
たのみにプロトンNMRスペクトルがこの精製の
段階で得られた。元素分析に対して、該生成物は
ソーダ塩型に変換された。典型的な分析結果は次
の通り：Nage−dUTP（C15H22N3O16P3Na4・
2H2O），理論値，Ｃ，24.99；Ｈ，3.63；Ｎ，
5.83； Ｐ，12.88 根拠値，Ｃ，25.39；Ｈ，3.71；Ｎ，5.63； Ｐ，12.88 実施例 ９ ラベルされたDNA鎖の用途 核型分類 (a) 約100から200のクローンを人間遺伝子貯蔵庫
から選ぶ。上記のようにしてそれらを標識付け
し、そして各々のクローンについて可視的にも
しくは低光レベルビデオシステムによつて交配
の位置を決定する。特有な連鎖遺伝子に相当す
るこれらクローンに対してこれは特殊なヒト染
色体中のクローン化されたDNAの位置を測定
する。各々の染色体について幾つかのクローン
を得る。これらラベルされたクローンの各々は
特殊な染色体を識別するために用いられること
が出来る。これらはまた46個の染色体の各々を
22個の常染色体対の一つもしくはＸ染色体もし
くはＹ染色体であるとして識別するために結合
して用いられ得る。ラベルされたクローンの一
組を染色体と交配せしめることによつて、クロ
ーンの該組とそれらの位置とが可視化され得そ
して特殊な色で螢光を発するであろう。ラベル
されたクローンの第二組はそれから使用せられ
て第二螢光染料と反応せしめられ得る。同様な
過程が何回か繰返えされ得る。かくして、もし
所望なれば染色体の各々の上に異なつたしかし
固有な位置において細胞DNAと結び付けられ
ている螢光ラベルの幾組かを有することが出来
る。これらラベルは可視的もしくはコンピユー
ター化された自動核型分類のために用いられる
ことが出来た。 (b) 自動核型分類のために、各々の染色体上のラ
ベルした位置の数に相当するスポツトの組を見
出すことによつて46個の染色体の各々の大体の
位置はクローンの一組を用いて識別せられ得
る。かくして染色体が更なる分析にまで手を拡
げるに適するかどうかを測定することがデイジ
タル化された像のコンピユーター分析によつて
可能となる。もしこれらが手を拡げるに適して
いるならば、各々の上のラベルされたスポツト
の位置および分散によつて個々の染色体の各々
を識別することがコンピユーター分析を用いて
可能となる。 螢光スポツトが各々の染色体上の固有な位置に
配置され得ると云う事実を用いて、このような標
識のない場合よりははるかに効果的にマニユアル
もしくは自動的な核型分類のいずれかを行なうこ
とが可能となる。 遺伝的欠陥の診断 例えば23番のような特殊な染色体に固有的に結
合しているクローンを選択することによつて、例
え染色体が中期において濃縮されていない場合に
おいてすらも細胞中の特殊な染色体の複写の数を
数えることが可能である。かくして三倍体染色体
21の胎児期の診断のために胎児の細胞が得られた
時には診断は例え染色体が中期において濃縮され
ていない場合においてすらもなされ得る。もし必
要とあれば、ラベルの二組、即ち染色体23に対し
て固有的である一つとそしていくらかの他の染色
体に対する一つとが用いられ得る。異なつた色で
あろう該二つのラベルの比率を各々の細胞におい
て測定することによつて、染色体23番の異常数を
示す細胞を識別することが可能である。この手順
は低光レベルビデオシステムによるスライド上
で、またはレーザ賦活を用いる流動チトメーター
システムにおいてのいづれかを用いることが出来
る。 微生物検出および識別 上記のようなDNAの固有鎖のラベル付けは
個々のバクテリアの識別と計数を可能にする。
DNAの特殊断片が交配されている個々のバクテ
リアを識別するために、感度は単一ラベルされた
構造が検出される程度でなければならない。これ
は低光レベルビデオシステムおよび像のコンピユ
ーター総和を用いて、もしくは光像を強化するた
めのいくらかの他の装置を用いて達成され得る。
流動システムはまたもし感度が充分大きくされる
ならば用いられ得る。もしスライド上のバクテリ
アが不動化せられるならば、これらの位置は見出
されかような螢光スポツトの数は数えられること
が出来る。これは利用される特殊クローンで交配
され有るDNAを含むこれらバクテリアのすべて
を計数することを提供するであろう。もしクロー
ンが特殊な系列もしくはバクテリアに対して固有
であるとして選択されるならば、その系列の生物
の数が数えられ得る。加うるに、特殊な遺伝子が
識別されているいかなる抗生物質耐性も抗生物質
耐性遺伝子中に含まれているDNA鎖をプローブ
として用いる同様な方法において特徴付けられる
ことが出来る。加うるに、一個またはそれ以上の
抗生物質耐性遺伝子を含んでいる耐性プラスミド
に対して固有的である探査子が用いられ得る。
個々のバクテリアに加えて、もしそれらが小さな
スポツト中に位置付けせられそれ故にスポツト中
の交配されたDNAに対して固有な全螢光が測定
され得るならば特殊系列のバクテリア細胞の集団
が検出せられそしてそれらの数が定められる。こ
の方法においては特殊DNA連鎖を含んでいる生
物の数はバクテリアの混合体において測定され得
る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式 ここに、Ｂは糖部分のC1′−位置に共有的に結
    合されたピリミジン部分を表し、そして、それは
    ピリミジンのN1−位置で結合し、Ａはビオチン
    およびイミノビオチンからなる群から選ばれた部
    分を表し、点線はＢとＡとを結合する連結基を表
    し、該連結基は該ピリミジンの５−位置に結合
    し、かつ、Ｂに関連してα−位置に存するオレフ
    イン結合を含み、 そして、ｘ，ｙおよびｚの各々は、 Ｈ−，HO−，【式】 【式】または 【式】を表し、かつｘ，ｙ およびｚのうち、いずれか一つがホスフエイト含
    有基である、 を有する化合物。 ２ Ｂはウラシルまたはシトシンである特許請求
    の範囲第１項に記載の化合物。 ３ 前記連結基は−C2H−NH−部分を含む特許
    請求の範囲第１項に記載の化合物。 ４ 前記連結基は、−CH＝CH−CH2−NH−お
    よび−CH＝CH−CH2−Ｏ−CH2−CH（OH）−
    CH2−NH−からなる群から選ばれる特許請求の
    範囲第１項に記載の化合物。
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