JPH05502371A

JPH05502371A - 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料

Info

Publication number: JPH05502371A
Application number: JP2513838A
Authority: JP
Inventors: ビー　ジョン　ベルゴット; バージン　チャケリアン; チャールス　アール　コンネル; ジェイ　スコット　イーデイ; ステベン　フング; エヌ　デービス　ハーシー; ジーリーリンダ; ステベン　エム　メンシェン; サム　エル　ウー
Original assignee: アプライド　バイオシステムズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1993-04-28
Anticipated expiration: 2012-09-03
Also published as: JP2649102B2; US5366860A; DE69024061T2; ATE131210T1; WO1991005060A3; WO1991005060A2; EP0496749B1; DE69024061D1; EP0496749A4; EP0496749A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料光里■薮麦公団本発明は一般に核酸の配列を決定するための方法に関するもので、さらに特に、ゲル電気泳動によって分離された同じ大きさに分類されたＤＮＡフラグメントを同定するためのローダミン染料の使用に関するものである。

ＤＮＡ配列を決定する能力は遺伝子の機能とコントロールを理解するためおよび分子生物学の基本技術の多くを応用するために非常に重要である。本来のＤＮＡは２個の鎖状ポリマー、またはヌクレオチドの連鎖からなる。各鎖はホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチドの鎖である。２つの連鎖は水素結合によって２つの連鎖のヌクレオチドの相補的塩基：チミジン（Ｔ）をもつデオキシアデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン（Ｃ）をもつデオキシグアノシン（Ｇ）、との間で水素結合によって逆平行の配向で共に保持されている。

現在ＤＮＡ配列決定には２つの基本的なアプローチがある；ジデオキシ・チェイン・ターミネータ−法、例えばサンガーら、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ、第７４巻、５４６３〜５４６７頁（１９７７）　、および化学分解方法、例えばマキサムら、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ、第７４ｊｔ！、５６０〜５６４頁（１９７７）。鎖末端方法は幾つかの方法で改良され、あらゆる一般に入手できる自動化ＤＮＡ配列決定機器として役に立っている。例えばサンガーら、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー、第１４３巻、１６１〜１７８頁（１９８０）　；シュライヤーら、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー、１１２９　ｔｋ、１６９〜１７２頁（１９７９）　；スミスら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１３巻、２３９９〜２４１２頁（１９８５）　；スミスら、ネイチャー、第３２１巻、６７４〜６７９頁（１９８７）　；プロパーら、サイエンス、第２３８巻、３３６〜３４１頁（１９８７）　、セクション■、メソフズ・イン・エンサイモロジー、第１５５巻、５１〜３３４頁（１９８７）　；チャーチら、サイエンス、第２４０　巻、１８５〜１８８頁（１９８８）　；　オヨ’Ｏ’コアネルら、バイオテクニクス、第５巻、３４２〜３４Ｂ頁（１９８７）。

鎖末端および化学分解方法は１またはそれ以上のセントの標識を付されたＤＮＡフラグメントの世代を必要とし、各々は共通の起源をもち各々は既知の塩基を末端とする。次にフラグメントの単数または複数のセットは大きさによって分離され配列情報を得る。両者の方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によって分離される。最も自動化されたＤＮＡ配列決定機器では、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、例えばスミスら（１９８７、上記）、あるいは末端ジデオキシヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロパーら（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分離のための同じゲルカラムに装填される。

フラグメントが分Ｎｉ！Ａ程の間に静置検出器を通過するときフラグメントによって放出される蛍光信号を分析することによって塩基配列は決定される。

異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入手することはこのようなりＮＡ配列決定システムでは主要な難点である。

第１に、有機蛍光染料に対する代表的な発光バンド半幅は約４０〜８０ナノメートル（ｎ　ｍ）であり可視スペクトルは約３５０〜４００ｎ鵬に過ぎないので、有意に重なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バンドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞれの蛍光効率が低すぎる場合ＤＮＡ配列決定のために未だ不通であるかも知れない。例えば、プリンゲルら、ＤＮＡ・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、１５〜２１頁（１９８８）には、増大したゲル荷重が低い蛍光効率を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つかの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収ハンドが広く分離することが多いので励起が難しくなる。

最も有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当する波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用する場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うように強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラグメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料およびリンカ−の電荷、分子量およびコンホメーションは接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるようにあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響してはならない。

最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作するために用いられる化学勧賞と相溶性がなければならない。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・チェイン・ターミネータ−は使用したポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を妨げてはならない。

これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけが、自動化ＤＮＡ配列決定におよび診断および分析の技術に使用できることが見出された、例えばスミスら（１９８５、上記）；プロパーら（上記）；フードら、ヨーロッパ特許出＠８５００９６０　；およびコンネルら（上記）。

上記の観点では、ＤＮＡ配列決定のような、多くの分析および診断の技術は、（１）物理化学的に類似のもの、（２）ゲル上の密に配置されたＤＮＡバンドのような空間的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）自動化ＤＮＡ配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、（４）広範囲の予備および手先のテクニックと共に使用するために影響を受けやすいもの、（５）その地上に挙げた多くの必要な条件を満足するもの、である新しいセットの蛍光染料の入手容易性によって有意に促進されるであろう。

１里Ω量！本発明は電気泳動により分離される異なる３“　−末端ヌクレオチドを有するＤＮＡフラグメントが異なるローダミン染料によって同定されるＤＮＡ配列決定の方法にある。特に、本発明は以下に定義したローダミン標識ヌクレオチドおよび本発明方法におけるそれらの使用を含む。本発明は一部は、ＤＮＡポリメラーゼ、特にＴａｇＤＮＡポリメラーゼによって成長ＤＮＡ鎖に容易に組み込まれる鎖末端ヌクレオチドに連結したスペクトル分析できるローダミン染料のセントの発見に基づ（ものである。ここで使用するように語「鎖末端ヌクレオチド」は、成長Ｄ　Ｎ　Ａ　１ＸにＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれた後は、さらにポリヌクレオチド鎖が伸長、または付加することを妨げるヌクレオチドまたはそのＷ４像体を指す。通常、このようなヌクレオチドの鎖末端性は糖部分の３°　ヒドロキシルの不在または改良に依存する。好ましくは、鎖末端ヌクレオチドは２ ’、３’−ジデオキシヌクレオチドである。

ここで使用するように染料のセントに関係する語「スペクトル分析できる」は、染料の蛍光放出バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシステムによって発生した蛍光信号に基づいて区別することができることを意味し、前記システムは米国特許４，２３０，５５８号、４．８１１，２１８号等、またはホイーレスら、フロー・シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・データ・アナリシス（アカデミツク・プレス・ニューヨーク、１９８５）の２１〜７６頁に３己載されたようなシステムが挙げられる。

本発明のローダミンを３゛　−末端ヌクレオチドに標識を付けるために用いるときはいつでも、本発明の重要な特徴は４種の染料によって作られたＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度への事実上回等の貢献である。この結果は、標識と隣接するヌクレオチドとの間の配座相互作用が主として標ｍＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変動性の原因であると信じられているので予期しないことである。染料標識プライマーが常に、染料は常にヌクレオチドの同し配列と相互に作用するので、電気泳動移動度において一層小さい変異性を生しることが期待されていた。しかし、本発明の一部は、３°　−標識ヌクレオチドをもつフラグメントが染料標識プライマーをもつ同等のフラグメントよりも電気泳動移動度において非常に小さい変異性をもつという発見である。

主里主昆縦広翌皿本発明のローダミン染料のスペクトル分析できるセントはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ１０−ダミン１１０　、およローダミン６Ｇから成り、これらは、それぞれ弐■〜■によって表される。全体にわたり、カラー・インデックス（アソシエーシヲン・オフ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、１９７１）炭素ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンチン構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９°　−フェニルの炭素を指す。

Ａは結合官能基に変換することができるカルボキシル、スルホニル、またはアミノのような基であり、そしてＢはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたはスルホニルであり、最も好ましくはカルボキシルである。

好ましくは、本発明のローダミン標識鎖末端ヌクレオチドは次式で表される：ＸＴＰ−Ｌ−Ｒ式中、ＸＴＰは鎖末端ヌクレオシドトリホスフェートであり；Ｒはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ５０−ダミン１１０、およびローダミン６Ｇから成る群れから選ばれたローダミン染料であり；およびＬはヌクレオシドトリホスフェートの塩基とローダミン染料との間の連結基である。

ＸＴＰは、組み込まれた後にさらに鎖が伸長することを妨げるのに用いられたＤＮＡポリメラーゼの天然のヌクレオシドトリホスフェートの類似体である。幾つかのこのような類似体は４種の天ヌクレオシドトリホスフェートの各々に対して入手でき、例えばホソブズら（上記）はリストを示している。好ましくは、ＸＴＰは２°、３°　−ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに好ましくは、ＸＴＰは２°、３゛　−ジデオキシ−７＝デアザアデノシントリホスフエート、２°、３°　−ジデオキシシチジントリホスフェート、２′、３゛　 −ジデオキシ−７−デアザグアノシン、２”　、３’　−ジデオキシウリジントリホスフェート、および２°、３°　−ジデオキシ−７−デアザイノシントリホスフェートから成る群れから選ばれる。ここで使用するように語「ジデオキシヌクレオシド」は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド類似体を含む。従来のナンバリングは、ヌクレオシドの塩基または糖の特定の炭素原子に例えばコーンバーブ、ＤＮＡレブリケーシッン（フリーマン、サンフランシスコ、１９８０）を引用するときはいつでも使用される。

Ｌはジデオキシヌクレオチドと染料との間の結合の長さと閘性を大きく変えることができるように幾らかの異なる形態に従う。

例えば本発明と共に使用できる幾つかの適当な塩基標識方法は、例えば、ギプソンら、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ、第１５巻、６４５５〜６４６７頁（１９８７）　；ゲベイエフら、ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ、第１５巻、４５１３〜４５３５頁（１９８７）　ｉハララムビジスら、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ、第１５１！、４８５６〜４８７Ｇ頁（１９８７）等に報告された。好ましくは、Ｌは本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３）エステルをジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導塩基と反応されて形成される。

この場合において、Ｌは、（１）ローダミンの５−または６−炭素と（２）ローダミンを結合する塩基の炭素との間の部分として使われる。好ましくは、Ｌは３ −カルボキシアミノ−１−プロピニルである。シトシン　チミン、およびアデニンのこのようなアルキルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドの合成はホップスらによるヨーロッパ特許出願番号８７３０５８４４．０およびここに引例として挙げるホップス、ジャーナル・オフ・オーガニック・ケミストリー、第５４巻、３４２０頁（１９８’９）によって教示される。簡単には、アルキニルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドは適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常はホップスら（上記）によって教示されているような５−ヨードピリミジンおよび７−ヨートー７−デアザブリンジオキシヌクレオシド）およびＣｕ　（１）をフラスコに入れ、空気を除くようにＡｒを吹き込み、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰ’ｄ（０）を添加して生成される。反応混合物を数時間、または薄層クロマトグラフィがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌することができる。保護されていないアルキニルアミンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を用いるシルカゲルでクロマトグラフ処理を行って単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用する場合、メタノール／塩化メチレンを反応混合物に添加し、強塩基性アニオン交換樹脂の重炭酸塩の形によって続ける。次にスラリーを約４５分間撹拌し、濾過し、追加のメタノール／塩化メチレンを用いて樹脂を洗うことができる。−緒に合わせた濾液を濃縮しメタノール− 塩化メチレングラディエンドを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られる。

上記参照によるアルキニルアミン誘導ジデオキシグアノシンは特に改良されたグアニン先駆勧賞（６−メドキシー２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を必要とし、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチルチオ−７−ジアザプリン、ＸＸから得られる。Ｘｘの６−クロロ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、ＸＸＸへの転換はロビングとノニル（ジャーナル・オフ・ヘテロサイクリック・ケミストリー、第１巻、３４頁（１９６４）　）に従い、続いてクロロ置換体をメトキサイド（還流メタノール中のナトリウム塩）を用いて置換しＸを生成する：好マしくは、ローダミンＮＨＳエステルを米国特許出願第０６／９４１．９８５号の教示に従って合成する。ローダミンＮＨＳエステルを合成する方法の重要な特徴は、（１）高収率の生成物を室温で生成するようにローダミン染料の５− または６−形態のエステル化のために存在する実質的に計真量のジーＮ−スクシンイミジルカーポネート（ＤＳＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を有する反応条件、および（２）反応体への転換逆行を妨げるように、好ましくは５以下のＩ）Ｋｍを有する酸性化合物を用いて新しく合成された生成物を処理することである。本発明の一般的な反応図は式■によって定義される：＋ＤＳＣ＋ＤＭＡＰ　−−→ 皿これらの方法は酸の形の５−または６−カルボキシローダミン（異性体の混合物として、または純異性体として）を当量のＤＳＣおよびＤＭＡＰの極性アプロチック溶媒の溶液を用いて反応させ、カルボキシル　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルを生成することからなる。適当な極性アプロチック溶媒はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）等を含む６ｊ！ｌも好ましくは、ＤＭＦは反応溶媒として用いられる。

異性体として混合されるＮＨＳエステルはさらに使用するために各異性体に分離することができる。最も好ましくは、試料を保存するために、酸の形の５−または６−カルボキシルローダミンをまず標準の分離技術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロジー、第２１巻、５６１頁（１９８４）によって各異性体に分離し、次いで各５−または６−カルボキシル異性体を上述のように反応されて、それぞれ、５−または６−カルボキシルＮＨＳエステルを形成し、これらを反応混合物から分離し、再び標準技術を用いる。

好ましくは、新しく合成されたローダミンＮＨＳエステルを揮発性の、ｐ　Ｋ　ａ　＜　５のを機可溶性酸、およびさらに好ましくは、揮発性の、ｐＫ、＜１の有機可溶性ｆＩＩ】、例えばＨＣＩまたはＨＢｒのメタノール溶液、または最も好ましくは、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。

本発明に使用するためのローダミン染料の若干の異性体混合物は市販品として入手することができ、例えばモレキュラー・ブローブス・インコーポレーテンド（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）　、および他のものは米国特許２，２４２，５７２　；２，１５３，０５９　；３，８２２．２７０　；　３．９３２，４１５；および４，００５，０９２　Ｆの技術に従って合成でき、これらすべては参照文献に加えられる。

本発明のローダミンは、Ｗ１４Ｏの物理化学的な性質、例えば太きさ、配座、電荷、疎水性等を有するポリヌクレオチドの一連の接近した間隔のバンドまたはスポットが線状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のような、生物化学的分離方法に姿ねられたポリヌクレオチドの種類を同定するために特に良く適している。ここで使用するように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物理化学的性質に基づいたポリヌクレオチドの空間的配置または凝集を含む。通常のバンドはゲル電気泳動によって染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じる。

好ましくは、本発明に従って同定されたポリヌクレオチドの種類は、対応が４種の可能な末端塩基と４種のスペクトル分析できる染料との間に確立されるように末端ヌクレオチド語において定義される。特に、ポリヌクレオチドの種類はＤＮＡ配列のチェイン・ターミネータ−法の関係において生し、この方法は染料−ポリヌクレオチドの共役体をゲル電気泳動によって大きさに従って分離する０例えばゴールドおよびマシューズ、上述した；リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実際のアプローチ（ＩＲＬブレス・リミテッド、ロンドン、１９８１）　；またはオスターマン、プロティンと核酸の研究方法、第１巻（スブリンガーーベルラク、ヘルリン、１９８４）。好ましくはゲルのタイプは約２〜２０パーセントの間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはストランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６５巻、２９９〜３０５頁（１９８０）の「９８％ホルムアミドまたは７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲルにおける低分子量ＤＮＡおよびＲＮＡの分別」；マニアチスら、バイオケミストリー、第１４巻、３７８７〜３７９４頁（１９７５）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による小さい二重鎖および一重鎖ＤＮＡ分子の鎖長決定」；およびマニアチスら、モレキュー・クローニング：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、ニューヨーク、１９８２）　１７９〜１８５頁によって与えられる。従って、これらの参照文献を参考として組み込まれる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、ｐＨ１温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成；それらが−重鎖かまたは二重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知れない。好ましくは、ポリヌクレオチド鎖の伸長の間にデオキシイノシントリホスフェートを、電気泳動中のいわゆる「バンド圧縮」を避けるためデオキシグアノシントリホスフェートの代わりに用いる。例えば、ミルスら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミク・サイエンシーズ、第７６巻、２２３２〜２２３５（１９７９）。例として、約１０〜５００塩基の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する＝１９部対１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作られ、４８パーセント（重量／容量）尿素を用いて、ｐＨ８，３（２５℃で測定した）にてトリス−ポレートＥＤＴＡ！！ｌ衝液に形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは約５０ ℃にて実施される。

ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共役体は標準手段、例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチドはアルゴンイオンレーザ−によって発生したレーザー光、特に、アルゴンイオンレーザ−の４８８〜５１４　ｎｎの発光ラインによって発光される。

これらのラインで同時にレーザー用として使える幾つかのアルゴンイオンレーザ −は市販品として入手できる、例えばシオニクス社（サニイベール、ＣＡ）モデル２００１等。

本発明の重要な特徴はＤＮＡ配列決定方法における鎖伸長のために使用されるＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明の方法として使用されるポリメラーゼは、マンガンまたはマグネシウム緩衝液を用いたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、イニスらによって記載された、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サイエンシーズ、第８５ｔｋ、　９４３６〜９４４０頁（１９８８）　；およびマンガン緩衝液を用いたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、デーバーらによって記載された、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サイエンシーズ、第８６巻、４０７６〜４０８０　頁（１９８９）　、から成る群から選ばれる。一般に、未知の配列を含む一重鎖ＤＮＡ鋳型は標準技術によって、例えばアプライド・バイオシステムズ・モデル３７０ＡＤＮＡ配列決定システムのためのマニュアルに記載されているようなＭ　１３ｍｐ１８において調製される。

同様に、プライマーを鋳型に結合する、アニーリング反応は、標準プロトコールによって行われている。異なる大きさに分類したＤＮＡフラグメントを発生する伸長反応は、本発明のローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよび使用した特定のＤＮＡポリメラーゼに対して最も効果的にする。

１施■ 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。試薬の濃度、温度、および他の種々のパラメータの値は単に本発明を例示するためのものであり、それを制限的に考えるためのものではない。

実施例１．６−ＴＭＲ−ＮＨ３６−ＴＭＲＭをカラムクロマトグラフィーによって５−および６−ＴＭＲ酸異性体の混合物から分離した。８．８２ｍｇの６−ＴＭＲ酸と１０．５ｍｇのＤＳＣを０．５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中にアルゴン下に溶解した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解したＤＭＡＰの０．５モル溶液０．０９ｍ１を一滴ずつ添加した。

室温で２時間後、混合物を５０１１のクロロホルムに入れ、１：１のブラインと水の溶液を用いて３回洗浄した。クロロホルムを蒸発させて残渣を２０ｇのシルカゲルカラム（３００：３０：８の塩化メチレンとメタノールと酢酸溶離液）で精製した。約０．４のＲｆの両分を乾燥するまで蒸発させ、酢酸塩として８．６Ｂの６−ＴＭＲ−ＮＨ３を生成した。

実施例２．５−ＴＭＲ−ＮＨ３５−ＴＭＲ−ＮＨ３を、実施例１に記載したように、２＋１１の乾燥ＤＭＦ中、８２．３ｍｇの５−ＴＭＲ酸、７５＋ｗｇのＤＳＣ，２＋ｗｌの０．５モルＤＭＡＰのＴＨＦ溶液０．７０ＩＩｌから調製した。

実施例３．６−ＲＯＸ−ＮＨ３６−ＲＯＭ酸をカラムクロマトグラフィーによって５−および６−酸異性体の混合物から分離した。４６．２ｍｇの６−ＲＯＭ酸および５５ｍｇのＤＳＣを２ｍｌの乾燥ＤＭＦ中にアルゴン下に溶解し、０゜５モルのＤＭＡＰのＴＨＦｔｆＩ液０．４５＋ｗｌを一滴ずつ添加した。室温で１，５時間後、混合物を１００ｍ１のクロロホルムに入れ、１：１のブラインと水の溶液を用いて４回洗浄した。

クロロホルムを蒸発させて残渣を４０ｇのシルカゲルカラム（３００：３０：８の塩化メチレンとメタノールと酢酸？８離液）上で精製した。約０．５のＲｆの両分を乾燥するまで蒸発させ、酢酸塩として５６．４＋ｗｇの５−ＲＯＭ−ＮＨ３を生成した。

実施例４．５−ＲＯＸ−ＮＨ３５−ＲＯＸ−ＮＨ３を実施例３に記載したように、１．０＠ｌの乾燥ＤＭＦ中、２７．４ｍｇ（７）　５−　ＲＯＭ酸、３０．２ｍｇノＤ　Ｓ　Ｃ、０，５モルのＤＭＡＰのＴＨＦ溶液０．２４謡！から調製した。

実施例５　、ロー　ミンＮＨＳエスールの　な　入ａ）実施例３からのＱ、４４１１ｇの６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨＳエステルおよび０．０１モルのエタノールアミンのメタノール溶液８０μＩを混合した。反応混合物とアセトニルおよび０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ−７，０）の逆相ＨＰＬＣは、生成物が７０％のＸ−ローダミン酸および３０％のＸ−ローダミンＮＨＳエステル（エタノールアミンを用いたその反応から６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンのエタノールアミドとして観察された）から成っていることを示した。

ｂ）実施例３からのＱ、１５ｍｇの６−カルポキシーＸ−ローダミンＮＨＳエステルを１０ｋｌのクロロホルムに溶解した；クロロホルム溶液を０．５モルの重炭酸ナトリウムを用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、０，１１の酢酸で処理し、乾燥するまで蒸発させた。０．３５ｍｇの生成物をａ）と同様に正確に処理した；逆相ＨＰＬＣは２０％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および８０％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨ３エステルを示した。

Ｃ）酢酸の代わりにトリフルオロ酢酸を用いた以外は、実施例３からの０．１５ｍｇの６−カ！レボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨＳエステルをｂ）と同様に正確に処理した。０．１抛ｇの得られた固体をａ）と同様に正確に処理した；逆相ＨＰＬＣはく５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および〉９５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮ）（Ｓエステルを示した。

実施例６．Ｒ６０□７−ゾアザー２’、３’−ジー゛オキシアデノシントリホスフェート（ｄｄＡ−５Ｒ６Ｇ）の上記のようにして得られた２、０μモルの７− （３”−アミノ−１“−プロピニル）−７−ジアザ−２’、３’−ジデオキシアデノシントリホスフエート（凍結乾燥した）に、１００μｌのＤＭＦ、３１１ｇの５−ローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステルおよび５０／Ｊｌの１．０Ｍトリエチルアンモニウムカーボネートをｐ　Ｈ８，９５で添加する。

これを渦巻撹拌し室温でそのまま終夜放置した。

次いで混合物をＡＸ−３００２２０Ｘ４．６ｍｍの７ミクロンカラム上で１分間につき１．５＋ｓｌの流速でＨＰＬＣによる精製をした。最初の溶出液は、６０％のＯ，１Ｍトリエチルアンモニウムカーボネート、ｐＨ７，０，４０％のＣ８３ＣＮであり、６０％の０．２　Ｍ　トリエチルアンモニウムカーボネート、ｐ　Ｈ７，５，４０％のＣ）ｌｆｆｃＮへの線勾配で４０分かけた。溶媒は収集生成物から真空下に蒸発させて除去した。残渣を０．０１Ｍ　）リエチルアンモニウムアセテートｐ　Ｈ７，０に溶解し、定置した。

実施例７．ＲＯＸ　２’、３’−ジー゛オキシシチジントリホスフェ）　（ｃ！ｄＣ−６ＲＯＭ）　０：）”　’１５０μｌの水に溶解した３、６μモルの５− （３”−アミノ−１”−プロピニル）−２’、３’〜ジデオキシシチジントリホスフエート（上記のように得られた）に、６０μｍのＤＭＳＯに溶解した５ｍｇの６−ローダミンＸ−ＮＨＳエステルおよび５０．ｉ　の１．０ＭトリエチルアンモニウムカーボネートｐＨ８，９５を添加した。これを渦巻撹拌し室温でそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。

実施例８．Ｒ１１０−２’、３’−ジデオキシイノシントリホスフェート（ｄｄＧ−５Ｒ１１０）の骨上記のようにして得られた１、３　μモルの７−（３”−アミノ−１゛−プロピニル）−７−ジアザ−２′、３’−ジデオキシグアノシントリホスフエート（凍結乾燥した）に１００　μｌのＤＭＦ、４ｍｇの５−ローダミン１１０−ＮＨＳエステル、および１００Ｉｉｌ　の１．０Ｍ）リエチルアンモニウムカーボネートｐ　Ｈ８，９５を添加した。

これを渦巻撹拌し室温にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。

実施例９．ＴＭＲ２’、３′−ジデオキシチミジントリホスフェート　ｄｄＴ− ６部ＭＲ）のｆ１上記と同様にして得られた１５０μＩのＨ２Ｏに溶解した３、１μモルの５−（３°゛−アミノ−Ｉ　ＩＩ−プロピニル）−２′、３′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、１５０μｌのＤＭＦ、１００μｌの１．０ＭトリエチルアンモニウムカーボネートＥ）Ｈ８，９５、および４−ｇの６−ＴＭＲ−ＮＨＳエステルと共に混合した。これを渦を撹拌し室温にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。

実施例１０．０−　ミン　ジー゛オキシヌクレオチドおよびＴａ　ＤＮＡボリメー−ゼとマグネシウム　゛いる旦五人父凰立梶実施例６〜９において調製されたローダミン標識ジデオキシヌクレオチドを使用して、アプライド・バイオシステムス（フォスター市、ＣＡ）モデル３７０Ａ自動化ＤＮＡシーケンサ−を用いる鎖末端配列決定のＤＮＡフラグメントに標識を付した。この製造業者のプロトコール（参照、ユーザー・ブレタン・ＤＮＡシーケンサ−・モデル３７０、発行第２号、１９８７年８月１２日）をＭ１３ｗｐ１８−重鎖鋳型を得るために続けた。（このＭ１３自身は試験配列としテ使った）、Ｍ１３ユニバーサルブライマーを用いた。次の溶液を調製した：　５　Ｘ　Ｔａｑ　Ｍｇ緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＣＩ　ｐ　Ｈ８，５，５抛−のＭｇＣ１ｚ　、　２５０ｍＭのＮａＣ１）　；染料−ターミネータ−ミックス（２，７８ＭのｄｄＧ−５Ｒ１１０，９，００ＭＭのｄｄＡ−５１？６Ｇ、　２１６．０８ＭのｄｄＴ−６７ＭＲ１および５４．Ｏｐ　Ｍ　）ｄｄｅ−６ＲＯＸ）　；およびｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ミｙ　クス（５００ＭＭのｄｒＴＰ、　１００μＭのｄＡＴＰ、　１００／Ｊ　ＭのｄＴＴＰ、および１００μＭのｄＣＴＰ）。アニール反応は、マイクロ遠心管に３．６μｍの５Ｘ　Ｔａｑ　Ｍｇ緩衝液、０．４ｐモルのＤＮＡ鋳型、０．８　ｐモルのプライマー、および容量１２．０μｍまでの水を一緒にして行われた。混合物を５５〜６５℃にて５〜１０分間イ分間インキトベート０〜３０分かけて４〜２０℃の温度までゆっくり冷却し、次いで一度遠心分離して濃縮物を集め、混合し、氷上に置いた。混合物に次に１．０μｌのｄＮＴＰミックス、２．０　μｌの染料−ターミネータ−ミックス、４ユニツトのＴａｑポリメラーゼ、および容量ｔＳ、Ｏμｍまでにする水を添加した。混合物を３０分間６０℃にてインキュベートし、次いで氷上に置き、２５．０μｍ０１０ａ＋ＭのＥＤＴＡｐＨ８，０と一緒にして反応物を終わらせた。混合物中のＤＮＡを次にスピンカラム（例えば１ｍｌのセファデックスＧ−５０カラム、例として５プライムから３プライムまでのセレクト−Ｄ、ウェスト・チェスター、ＰＡ）で精製し、エタノール沈澱をした（４μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐ　Ｈ５，２および１２０／７１の９５％エタノールを添加し、氷上で１０分間インキュベートし、１５分間遠心分離を行い、上澄液をデカントして排出し、７０％エタノールに懸濁し、攪拌し、遠心分離を１５分間行い、上澄液をデカントして排出し、真空遠心分離機で５分間乾燥することによって）。沈澱したＤＮＡを次に５部の脱イオンホルムアミドおよび１部の５０−一のＥＤＴＡ　ｐＨ８，０から成る溶液３μｌに再懸濁させて完全に渦を撹拌をした。ゲル上に装填する前に、混合物を９０℃にて２分間インキュベートしてＤＮＡを変性させた。４５０塩基以上のＭ１３プラスミドを集めてモデル３７０Ａ自動化シーケンサ−の塩基コーリングルーチンによって同Ｔ７ＤＮＡボリメー−ゼとマンガン　−゛　いる旦Σ人回死丘灰実施例１０と同様に配列決定反応を行ったが、（１）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの代わりに修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ（登録商標５ｅｑｕｅｎａｓｅ　、米国のバイオケミカル社から入手できる）を使用する、例えばタボールら、プロシーディンング・オフ電ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ、第８６巻、４０７６〜４０８０頁（１９８９）および第８４巻、４７６７〜４７７１頁（１９８７）、および（２）　５Ｘ　Ｔａｑ　Ｍｇｌ！！衝液の代耐液に５ＸＴ７　’Ｍｎ１ｌ衝液（１耐液ｍＭのトリス−ＣＩ　ｐ　Ｈ７，５，７５ｄのイソクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ　ＭｎＣ１ｚ、２５０ｍＭのＮａＣ１）を使用し、染料−ターミネーターミソクスは１．８μＭのｄｄＧ−５Ｒ１１０，５，４９ＭのｄｄＡ−５Ｒ６Ｇ。

５．８９ＭのｄｄＴ−６Ｔ門Ｒ１および９．０９ＭのｄｄＣ−６Ｒ咋から成り、ｄＮＴＰミックスは７５０９ＭのｄｌＴＰ、　１５０９ＭのｄＡＴＰ、　１５０９ＭのｄＴＴＰ、および１５０９ＭのｄＣＴＰから成り、伸長反応は３７℃にて１０分間Ｔａ　ＤＮＡポリメラーゼとマンガン　′　いｉ旦凡人父丑盆梶実施例１０と同様に配列決定反応を行ったが、５ＸＴａｑＭｇ緩衝液の代わりに５ＸＴａｑＭｎｗ７に耐液（１００ｍＭのトリス−Ｃ１ｐＨ７，５，７５ｍＭのイソクエン酸ナトリウム、ｉｏｍＭ　ＭｎＣ１ｚ、２５０Ｉの塩化ナトリウム）を使用し、染料−ターミネーターミソクスは、３．６９ＭのｄｄＧ−５Ｒ１１０，２，７９Ｍのｄｄ＾−５Ｒ６Ｇ、４３．２μＭのｄｄＴ−６ＴＭＲ１および２８．８　ｐ　Ｍ　ノｄｄＣ−６ＲＯＸがら成った。４５０塩基以上ノＭ１３プラスミドを集めて、モデル３７０　Ａ自動化シークエンサーの塩基コーリングルーチンによって同定した。

前述の本発明の好適例の開示は説明と解説のために示した。この開示された正確な形に本発明を網羅または制限するものではなく１．多くの改変および変形が上述の教示の観点から可能であることは明らかである。これらの例は本発明の原理およびその実際の応用を最良に説明するために選択され記載されたものであり、これによって当該技術分野における他の熟練者が予期された特定の用途に適合するように種々の具体化および種々の改変において本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲によって明確にするつもりである。

国際調査報告、ｒＴｌｌｌ（ｏｎ／「）１１６５喝＋１１−１１１が１ｈｌＡＣり１Ｃ１１１く〉ｒ−Ｎ（ＩＰ（：＝１１１バ” 、＞９０１０５５６５

Claims

【特許請求の範囲】

１．異なる３′−末端ジデオキシヌクレオチドを有するポリヌクレオチドをＤＮＡ配列決定のチェインターミネーション法において識別する方法において、この方法が：第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレオチドの混合物を形成し、第１の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキシアデノシンを有し、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群から選ばれる第１の染料を用いて標識を付され；第２の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキシシチジンを有し、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群から選ばれる第２の染料を用いて標識を付され；第３の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキシグアノシンを有し、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群から選ばれる第３の染料を用いて標識を付され；第４の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキシチミジンを有し、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群から選ばれる第４の染料を用いて標識を付され；混合物中の各種類のポリヌクレオチドが巽なる染料を用いて標識を付されており；同じ大きさに分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成するように混合物中のポリヌクレオチドをゲル上に電気泳動によって分離し；ゲル上のバンドを照明ビームを用いて発光させ、この照明ビームは染料に蛍光を生じさせることが出来；そしてバンド中のポリヌクレオチドの種類を染料の蛍光または吸収スペクトルによって同定する、工程から成るポリヌクレオチドの識別方法。
２．前記３′−末端ジデオキシアデノシンが２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンであり、前記第１の染料が結合基のためにその７炭素原子に結合しており；前記３′−末端ジデオキシシチジンが２′，３′−ジデオキシシチジンであり、前記第２の染料が結合基のためにその５炭素原子に結合しており；前記３′−末端ジデオキシグアノシンが２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれ、前記第３の染料が結合基のためにその７炭素原子に結合しており；前記３′− 末端ジデオキシチミジンが２′，３′−ジデオキシウリジンであり、前記第４の染料が結合基のためにその５炭素原子に結合している特許請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記結合基が３−カルボキシアミノ−１−ポロビニルであり、前記２′，３ ′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン、および２′，３′−ジデオキシ−７− デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンの、７炭素原子を、前記第１および第３の染料の５または６炭素原子に、それぞれ結合し、前記ジデオキシシチジンおよび前記ジデオキシウリジンの５炭素原子を前記第２および第４の染料の５または６炭素原子に、それぞれ結合している特許請求の範囲第２項記載の方法。
４．さらにプライマーから複数のポリヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって、ジデオキシアデノシソトリホスフェート、ジデオキシシチジントリホスフェート、ジデオキシグアノシントリホスフェート、およびジデオキシチミジントリホスフェートの存在で伸長し、前記第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレオチドを形成する工程を含む特許請求の範囲第３項記載の方法。
５．前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる特許請求の範囲第４項記載の方法。
６．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンがローダミン１１０の５炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。
７．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンがローダミン１１０の５炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。
８．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミン１１０の５炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′ ，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合し、前記２′，３′ −ジデオキシウリジンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。
９．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミン１１０の５炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２ ′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。
１０．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合し、前記２′，３′ −ジデオキシウリジンがローダミン１１０の５炭素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。
１１．次の群から選ばれるローダミン標識化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ１は５−および６−カルボキシローダミンＸ、５−および６−カルボキシローダミン６Ｇ、５−および６−カルボキシローダミン１１０、および５− および６−カルボキシテトラメチルローダミンから成る群から選ばれ、Ｒ２はトリホスフェート、１−チオトリホスフェート、または１０〜６００塩基のポリヌクレオチドである。）発明の詳細な説明