JPH01180455A - Ｄｎａ塩基配列決定方法 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列決定方法

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JPH01180455A
JPH01180455A JP62166223A JP16622387A JPH01180455A JP H01180455 A JPH01180455 A JP H01180455A JP 62166223 A JP62166223 A JP 62166223A JP 16622387 A JP16622387 A JP 16622387A JP H01180455 A JPH01180455 A JP H01180455A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）標識ＤＮ
Ａを用いたＤＮＡ塩基配列決定に関し、さらに詳細に言
うと、この発明は、時間的及び／又は空間的分離に続く
異なる種からの放射エネルギーの存在を検出するための
蛍光系システムに関する。染料は近似するか識別可能な
蛍光染料である。これらの染料を保護し、活性化し及び
連結する方法か開示されている。この方法によりｍ製さ
れたｔｌｉｉの蛍光標識ＤＮＡ鎖ターミネータ−が蛍光
標識ＤＮＡａｉ基配列決定断片として採用される。電気
泳動分離の最中にこれらの断片を検出し、結合された蛍
光レポーターを同定することかてきる光学的検出システ
ムか記載されている。
ＤＮＡの塩基配列決定は、現代の分子生物学における基
礎的な分析技術である。ａ！基配、列決定の信頼できる
方法の開発によって、遺伝情報の組織化の理解か大幅に
発展し、遺伝材料の操作（即ち遺伝子工学）が可能にな
った。
ＤＮＡの塩基配列決定の方法は現在２つある。すなわち
、マキサム−ギルバート化学分解法（エイ・エム−７キ
サムら、Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙ■。
６５４９９−５５９　（１９８０）　）及びサンガージ
デオキシ鎖ターミネーション法（エフ・サンガーら、　
Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｊｌｓ八７へ　５４
６３−５４６７　、（１９７７））である。これらの２
つの方法において共通な特徴は。
電気泳動によって分析される１組のＤＮＡ断片を生成さ
せることである。これらの方法は、それらの断片を調製
するのに用いる方法か異なる。
マキサム−ギルバート法では、ＤＮＡ１片は、塩基配列
を決定すべきＤＮＡの塩基特異的化学的切断によって調
製される。塩基配列を決定すべきＤＮＡは先ず３ｔｐで
その５°末端をラベルされ、４つの部分に分けられる。
それぞれの部分は、特定の塩基に隣接する部位でＤＮＡ
を切断するように設計された異なる一連の化学処理を受
ける。その結果、全ての標識断片は元のＤＮＡと同じ５
′末端を有し、切断の部位によって決定される３°末端
を有する。この処理は、ゲル゛心気泳動による分離が便
利な大きさのＤＮＡ［片を生成するような条件下で行な
われる。
サンガー法では、ＤＮＡ断片は、塩基配列を決定すべき
ＤＮＡを部分的な酵素的複製（すなわち、合成）を介し
て生産される。葭も一般的な方法では、塩基配列決定す
べきＤＮＡは、標準的な方法により、バクテリオファー
ジＭ１３のような大きな円形の一本鎖ＤＮＡ中に挿入さ
れる。これは複製過程の鋳型となる。挿入物のすぐ上流
の鋳型領域に相補的な短いＤＮＡ断片が鋳型にアニール
され、合成のためのブライマーとして働く、４つの天然
のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ’　ｓ
）の存在下において、ＤＮＡポリメラーゼによってブラ
イマーが３゛末端から伸長され、挿入領域の鋳如の相補
的複製物が生産される。塩基配列決定断片の完全な１組
を生産するために、４つのｄＮＴＰ’　ｓを単一のジデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）ターミ
ネータ−を含む４つの反応か平行して行なわれる。　ｄ
ＮＴＰかポリメラーゼによって取り込まれるならば、鎖
の慎重は続行され得る。対応するｄｄＮＴＰが選択され
るならば、鎖は終結される。　ｄｄＮＴＰとｄＮＴＰ’
ｓとの比は、適当な長さのＤＮＡ断片を生成するように
：Ａｗ１される。４つの反応混合物のそれぞれは、従っ
て、３°末端に同じジデオキシヌクレオシド残基を有し
、プライマーによって規定される５°末端を有する。
両方の方法において、一般的に物理的方法によって直接
決定することかできない塩基配列情報か、測定すること
かてきる鎖の長さの情報に変換されている。この測定は
電気泳動分離によって行なわれる。変性条件下（高温、
尿素存在等）において、短いＤＮＡＰＪｒ片は固い棒と
して泳動する。
ゲルマトリックスか電気泳動のために採用されると、Ｄ
ＮＡ断片はそのサイズの順に並べられる。
塩基配列決定のために必要な単一塩基分解山は、数百塩
基以下の塩基を含むＤＮＡ断片について通常前られる。
完全な配列を決定するために、マキサム−ギルバート法
又はサンガー法において形成された４つの断片の組は、
４つの平行なレーンて電気泳動される。これにより、ゲ
ルの長さ方向に沿って断片が部分的に分離される一０標
識断片のパターンは通常、オートラジオグラフィーによ
ってフィルムに移される（すなわち、ゲルとフィルムと
を所定の時間挟むことによって露光される）、現像され
たフィルムは、４つのレーンの間に分配された連続的な
バンドを示し、これはしばしばシーフェンシングラダー
と呼ばれる。ラダーは可視的にフィルムを走査し、（短
く、迅速に移動する断片から始める）、ラダー上のそれ
ぞれのステップについて次のバンドか生じるレーンを決
定することによって読まれる。それぞれのレーンは特定
の塩基（又はマキサム−ギルバート法の場合には塩基の
組合せ）によって関連しているので、レーン割当の直線
的プログレッションは塩基配列を直接的に翻訳する。
サンガー法及びマキサム−ギルバート法は概念的に優雅
で有効であるが、操作的に困難で時間がかかる。これら
の方法を分析すると、多くの問題は単一の放射同位体レ
ポーターを用いることによってもたらされている。
３２ｐのような短命な放射性同位体を用いることは論理
的な観点並びに健康及び安全性の観点から問題である。
３２ｐの半減期は短いので、必要な試薬を数日前に予想
し、また、試薬を直ちに使用しなければならない、標識
ＤＮＡｔｌＪ基配列決定断片か生成されると、それらは
自己分解しやすいのて直ちに電気泳動分析にかけなけれ
ばならない。
単一の塩基分離に必要な大きな電気泳動ゲルは大量の八
ツファーが混入するので、これを適当に処分しなければ
ならない。引き続きゲル中の標識ＤＮＡ断片を可視化す
るために必要なオートラジオグラフィーは、ゆっくりと
した工程であり（−夜′露光か普通）、操作全体にかな
りの時間をつけ加える。最後に、このような強力な放射
性同位体を用いることによる健康への危険がある。
単一のレポーターを用いて４種類の塩基の位置を分析す
ることは全体の操作にかなりの操作的複雑さを与える。
化学／酵素工程は別々の容器内て行なわなければならず
、電気泳動分析は４つの平行なレーン中で行なわなけれ
ばならない、熱的に誘導される移動度の歪により、標識
ＤＮＡ断片の歪んだ像か得られ（例えばスマイル効果）
、これはひいては４つのレーンを比較することを困難に
する。これらの歪は単一のゲル上で読むことかできる塩
基の数をしばしば制限する。
オートラジオグラフィーでの映像化に必要な長い時間及
び４つの平行なレーンを用いる必要性の故に、可視化が
「スナップ撮影」的になる。多数のハンドを同時に空間
的に分離することが必要なので、通常４０ｃｍ又はそれ
以上の長さのゲルを用いることが必要になる。これによ
り追加的な問題がもたらされる。すなわち、大きなゲル
は取扱いか困難で、操作か緩慢であり、操作全体に要す
る時間か長くなる。
最後に、人手による解析の問題がある。シーフェンシン
グラダーを塩基配列に変換することは時間がかかり間違
い易い工程で、非常に熟練した科学者が全力集中するこ
とが必要である。読み取りを自動化する多くの試みがな
され、これを助けるいくつかの機械も存在するか、塩基
配列ゲルな解釈する工程はいまなお苦痛を伴い遅い工程
である。
この問題を処理するために、３！Ｐ／オートラジオグラ
フイーを他の非放射性のレポーター／検出システムに交
換することが考えられる。このような検出系は３１ｐの
感度に匹敵する程度に例外的な高感度を有していなけれ
ばならない、シーフェンシングゲル上のそれデれのバン
ドは１０−１６モルのオーダーのＤＮＡを含む、このレ
ベルの感度に到達することができる１つの方法は蛍光を
用いることである。ＤＮＡ断片はｌ又は２以上の蛍光染
料で標識することができる。適当な光源で染料を励起す
ることによって、染料から特徴的な発光が起き、バンド
を同定することができる。
放射性同位体ラベルに対し、蛍光染料を用いることによ
って、検出システムをより容易に変更することができる
０例えば、何らかの発光特徴（例えばスペクトル、寿命
１分極化）に基づいて、特定の塩基に関連した塩基並列
決定断片に特定の標識を特異的に結合することができる
。この結合を確立すると、断片はまとめられ、単一のレ
ーン上て解像され、塩基の割当は選択された発光特性に
基づいて行なわれ得る。
蛍光検出のリアルタイム性の故に、空間的に分離された
バンド（空間的解像）を含むゲルを迅速に走査すること
もできるし、ゲル上の単一の点上に注目して、その検出
領域を連続的に通過するバンドを検出することもできる
（時間的解像）。
大きなゲルは必ずしも必要ではない、さらに、リアルタ
イムの単一レーン検出モードは完全に自動化された塩基
割当及びデータ移動に非常に適している。
蛍光系ＤＮＡ塩基配列決定システムを開発しようとする
いくつかの試みが記載されている。カリフォルニア工科
大学のグループによって開発された１つのシステムかエ
ル・エム・スミスの西ドイツ特許出願第：Ｉ、４４６，
６３５＾１　（１９８４）　、エル・イー・フッドら、
西ドイツ特許出願第３，５０１．３０６＾１　（１９８
５）　、及びエル・エム・スミスら。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｈ
２３９９−２４１２（１９８５）に開示されている。こ
のシステムは上記セクションに記載した問題を処置する
ためのものであるが、その解決手段は部分的にしか成功
していない。
カリフォルニア工科大学のシステムは、４組のＤＮＡ塩
基配列決定断片を採用し、これらのそれでれは４種類の
蛍光染料の１つで標識されている。２つの代表的な組の
蛍光染料が記載されている。それデれの組は、少なくと
も２つの構造的に異なるクラスのものから誘導された染
料を含む。
発光の最大値は４つの間の識別を容易にするために大き
な領域（約１００　ｎｓ）に広がるが、不幸なことに吸
収（励起）最大値もまた比較的広がっている。このため
、単一の単色光類て全ての４つの染料を励起することが
困難であり、得られる発光を十分に検出することが困難
である。
対照的に、近接した吸光度ピークを有する（従って対応
する発光ピークも近接する）染料を用いて励起効率を高
めると他の問題が起きる。ＤＮＡ塩基配列決定のための
検出システムは個々の標識断片を同定するために４つの
異なる染料の発光スペクトルを識別することがてきなけ
ればならない、これらの発光は通常その強度が低い、従
って、検出システムは、高い感度（バンド当たりＩＱ−
１１１モル以上）及び選択性を有していなければならず
、さらに、所望の性能特性に合致するために、迷光及び
背景ノイズを最小化するための手段を有していなければ
ならない、システムはまた、検出窓を通ってゲルを泳動
するあらゆる断片を失うことを避けるために、検出領域
をしばしばモニターすることができなければならない、
このような検出システムは、単一の装置中にミルコスト
に影響を与えることなく複数の検出器を備えるために比
較的コスト効率が良くなければならない。
検出計画中に蛍光を用いる多くの検出＊ｉが知られてい
る。これらの装置の１つがナイムスキら、Ａｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｓ、、　１０６．４７１−４７５　１ＮＯ
。
”ＱｕａｎｔｉｔａＬｉｖｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒＤｉｆｆｅｒｅｎＬ　　Ｃ
ｏｎｆｏｒ＋＋＋ａＬｉｏｎａｌ　　Ｆｏｒｍｓ　　ｏ
ｆ　　ＤＮＡ　　Ｂｏｕｎｄｔｏ　　Ｌｈｅ　　Ｄｙｅ
、、、、ａｎｄ　　５ｅｐａｒａｔｅｄ　　ｂｙＥｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｌｌｉｓ”に記載されている。この
電気泳動検出システムでは、比較的大きなりＮＡ断片を
分離するために、ガラス管がアガロースゲルで満たされ
る０次に大きな断片のそれデれを規定するための検出シ
ステムとして走査モノクロメータ−が用いられる。走査
モノクロメータ−は広い領域のスペクトル特性を正確に
測定することかできることが知られている。しかしなが
ら、モノクロメータ−の限られたｍ力及びこれと共に用
いられ、発光光線を集めたり分散させたりする光学素子
の故に多くの光が失われる。これらの検出方法は感知さ
れ測定され得る光の割合を限定する。
従って、低い光か施される場合の感度が低い、さらに、
連続的に集められる光は通常非効率的である。
スミスら（上記参照）によって開示された検出装置は、
単一又は複数の光検出器上に入射する光の波長を選択す
るために一連の狭いハント緩衝フィルターを用いる。こ
の型のシステムはかなり単純で安価であるという利点を
有する。しかしながら、これは実質的な欠陥を有する。
記載されている具体的なシステムは、複数の互換フィル
ターでも用いることができる。１つの光検出器を有する
１つのフィルター光度計又は対応する光検出器を有する
複数の備え付はフィルターを使用する。
先ず、これらの装置のうち、単一の検出器を有する回転
フィルター（スミスらの第３図参照）は、それぞれのフ
ィルター領域を測定することがてきる時間を限定すると
いう欠点を有する。異なる発光スペクトルを識別するた
めに、検出時間は異なるフィルターによってシェアされ
なければならない、スミスらのシステムはここでは取扱
う必要のない追加的な光学的困難性を有する。
異なる正味チャージを有する染料を用いることによって
より深刻な問題が生じる。スミスらのＮｕｃｌｅｉ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈの論文に記載された従来の
シーフェンシングゲルは４つの染料のそれぞれによって
標識されたプライマーからつくられたＴレーンを示す、
電気泳動移動度に有意な差動！ｈｍが現われることは明
らかである。これらの４種類の染料を有する塩基配列決
定断片の完全な組を１つにすると、単一のレーンて電気
泳動した時にかなりの重複がみられ、そしておそらく順
序の入れ替さえ起きるであろう、この効果は、上述した
信号強度の大きな動的領域の問題と相まって、この染料
セットを用いて単一レーンでの塩基配列決定を行なうこ
とを困難にしている。
最後に、蛍光標識塩基配列決定断片を調製するために用
いられる方法論は困難な配列決定条件をもたらす、マキ
サム−ギルバート法ては、５゜標識オリゴヌクレオチド
が酵素的に、制限酵素切断によってつくられた接着末端
を有する二本鎖ＤＮＡに連結される。これにより、この
ようにして製造された塩基配列決定断片に制限が加えら
れる。サンガー法では、５”標識オリゴヌクレオチドか
プライマーとして用いられる。４つの特殊なプライマー
が必要である。新規なベクター系を用いるために、４つ
の新規な染料染色プライマーを合成し精製するという複
雑な工程を行なわなければならない。
一非放射標識ＤＮ／ｌ！基配列決定の自動化の第２の方
法は、アンソージ・ダブリュら、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、　　１３：３１５−：１２：ｌ　　（１９８６）
に開示されている。このプライマーは、放射標識ヌクレ
オチドを省略するように修飾された標準的なジデオキシ
ヌクレオチド塩基配列決定法に基づいて４つの容器中で
反応され、種々の長さの酵素的に複製されたＤＮＡ断片
の組が生成される。４つの容器のそれぞれは４つのＤＮ
Ａ塩基の１つに対応するジデオキシヌクレオチド鎖ター
ミネータ−を含んでおり、それによって４つのゲルレー
ンにおける従来の電気泳動分離から末端塩基を割り当て
ることができる。それでれの断片は、５°−テトラメチ
ルローダミン蛍光標識を有しており。
これはゲルの全幅を介して通過するアルゴンイオンレー
ザ−によって励起される。経時的に解像されたＤＮＡバ
ンドの蛍光発光は、映像化光学素子、視野透孔、光ガイ
ド、フィルターアセンブリー及び光電子倍増管を直列に
有する、それぞれのレーンに対する別々の据付型の手段
によって４つのレーンから集められる。
この方法によって主張される１つの利点は、据付型の検
出器の故に装置内の可動部品の数が少なく、それによっ
て４つのゲルレーンの連続的なモニタリングが可能にな
るということである。このモニタリング法は、１つのレ
ーンに対して用いられるものよりも複雑であるか、残り
の３つのレーンにおけるハントの不存在に比較しつつ標
識されたバンドの存在を検出することができるのて、塩
基割当の確実性が改善されるとされている。実際、単一
の標識を用いると塩基割当のために４つのレーンを用い
ることが必要になり、提供されたシステムはさらに単純
化したりその容量や出力を改善することかできない、こ
のシステムはまた。単一の配列分析のために忠実なレー
ン間の相対的位置付けが必要となるので、本来的に正確
性が低い、熱勾配のような操作的複雑さ及びゲル不純物
はこの位置的一体性を破壊して局所的なゲル歪を生み出
してバンド移動度に影響を与え、ひいては塩基配列決定
に悪影響を与え得る。
アンシークら及びスミスらの標識プライマーの使用は、
他の点においても劣っている。ポリメリゼーション反応
は別々の容器で行なわなければならない、全てのＤＮＡ
断片は、それか真正なターミネーション断片であっても
外来性の断片であっても標識される。これは、アデノシ
ンヌクレオチドを含む実質的に全ての断片か標識される
現存するシステムに類似している。従って、得られるシ
ークエンシンクパターンは、現在の方法において発生す
るほとんどのアーチファクト（例えばフォールス又はシ
ャドウハンド、パイルア・ンブ等）を有する。
最後に、１９８５年ｌθ月９０に発行された欧州特許出
願第８５１０３１５５．９号は、任意的に予め標識され
たヌクレオシドを含有するＤＮＡストランドを後標識（
ｐｏｓｔ−１ａｂｅｌｌｉｎｇ）するためのシステム及
び方法を開示する。予備標識は、ヌクレオチドかサンガ
ーＤＮＡ鎖終結法において用いられる前に所望の鎖終結
ヌクレオチドにビオチンを共有結合することによって行
なうことができる。しかしながら、予備標識されたンヌ
クレオチドは開示されたシステムにおいて検出可能では
ない、別々の容器内で調製された、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧの
ＤＮＡ塩基に対応するＤＮＡの予備標識されたストラン
ドは電気泳動的に分離され、共有結合されたフルオレッ
セインのような蛍光体を有する、相補的結合物質、通常
アビジンに対して露出される。蛍光体は検出され、信号
の存在は、元々調製されたＡ、Ｔ、Ｃ又はＧに対応する
特定の官憲又はゲルレーンに連関する。この後標識法は
、標識ＤＮＡの調製及び引き続く電気泳動分離を分離し
た容器及びゲルレーンでそれぞれ行なわなければならな
い。
鎖終結法の反応中に同じ容器内において同時に異なって
ＤＮＡストランドを標識することができる方法又はシス
テムも、適当な検出システムの単一のゲル／レーン中で
の検出中に異なって標識するシステム又は方法も全く開
示されていない。
この発明は従来技術の多くの欠点を克服することを目的
とする。これは上述した多くの欠陥な有することなく多
くの所望の性能特性を有するＤＮＡ塩基配列決定システ
ムを包含する。この発明は、時間的及び／又は空間的分
離の後に異なる種、通常レポーター標識ＤＮＡからの放
射エネルギーの存在を検出し、種を同定するためのシス
テムである。このシステムは種の本質の関数として第１
のセンスにおいて振幅が異なる第１の信号を発生するた
めの、種のスペクトルに対して反応的な手段と、種の本
質の関数として第１のセンスとは異なる第２のセンスに
おいて振幅か異なる第２の信号を発生するための、スペ
クトルに対して反応的な手段と、第１及び第２の信号の
関数の比に対応する第３の信号を得るための第１及び第
２の信号に対して反応的な手段とを有し、第３の信号の
振幅が種の同定を示す。
第１及び第２の信号を発生するための手段は、波長の関
数として変化する透過／反射特性を有する二色フィルタ
ーと１発光をフィルターに向けるための手段と、発射さ
れた光の透過光及び反・射光をそれぞれ受容し、そのそ
れぞれの強度に対応して第１及び第２の信号を発生する
ための第１及び第２の検出器とをＡ＠する。好ましくは
、二色フィルター特性は１種発光スペクトルの中央付近
て発生する透過から反射にわたる比ｉ的鋭い遷移を有す
る。中央に位置する遷移点においては。
第３の信号の振幅の変化はスペクトル全域にわたるより
も等しく分配される。
通常、分析される種は、近似するスペクトルを有する蛍
光物質で共有結合的に標識されたＤＮＡ断片又は他の分
子である。これらの分子は通常、その大きさ、電荷又は
他の物理的特性に従って分離できるように電気泳動ゲル
中に収容される。このシステムは、蛍光￥＠質の励起領
域内の出力を有するレーザー又は他の放射エネルギー源
を有する。
例えばＤＮＡ断片のような、検出すべき標識された種の
発光部分は次の構造を有する。
たたし、ｎは２又は３．Ｒ，及びＲ２は水素、低級アル
キル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す。
また、この発明は、近似したスペクトルの波長にわたっ
て異なるセンスにおいて変化する発射されたエネルギー
の関数を得るための工程と１種の同定を示す、これらの
関数の比を決定する工とを含む、時間及び／又は空間的
分離に続く、異なる種から発射された放射エネルギーの
存在を検出するための方法をも開示する０発射されたエ
ネルギーの関数は、波長の関数として変化する透過／反
射特性を有する二色フィルターに放射エネルギーを通す
ことによって得ることができる。
鎖ターミネータ−がレポーターを有する。サンガー鎖タ
ーミネーシ式ン法の修飾に従ったＤＮＡ塩基配列分析の
ための方法か記載されている。
好ましくは鎖ターミネータ−は着色された。さらに好ま
しくは蛍光レポーターを担持する。鎖ターミネータ−は
次の構造の１つであり得る。
ただし、（ａ）　ＸはＨ，Ｎ１１□若しくはハロゲン、
ＹはＨ，ＮＨ，、ＯＨ若しくはハロゲン又は（ｂ）　Ｘ
＝Ｙ＝Ｏ）Ｉである。
あるいは、 たたし、Ａは次の構造を有する蛍光レポーターであり得
る。
たたし、ｎは２又は３、Ｒ１及び１１２は水素、低級ア
ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示し
、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、７−
ゾアザグアニン又は７−ジアザヒボキサンチンのような
ペテロ環塩基であって、ピリミジンがＮ、位を介して糖
部分に結合し、デアザプリンはＮ９位（プリンナンバリ
ング）を介して糖部分に結合しているもの、破線は好ま
しくはアミド結合によって蛍光部分（＾）とヘテロ環（
Ｂ）とを連結するリンカ−及び任意的スペーサー（原子
群）を示し、Ｂがピリミンジンである場合にはリンカ−
はそのピリミジンの５−位に結合され、Ｂがデアザプリ
ンである場合にはリンカ−はそのデアザプリンの７−位
（プリンナンバリング）に結合されている。
この発明のもう１つの局面においては、４つの塩基に対
応する４つの鎖ターミネータ−が異なる識別可能なレポ
ーターを担持する、この発明によって修飾されたサンガ
ーの鎖終結法に従ってＤＮＡ塩基配列分析法が提供され
る。４つの鎖終結反応は、従って、異なる容器中で行な
われて電気泳動分析の前にまとめられるか、又は単一の
容器中で行なわれる。
１つにまとめられたＤＮＡ塩基配列決定断片は、単一の
レーン中で同時に電気泳動分離にかけることができる。
それぞれのレポーターを担持する断片を単一の光源で励
起することによって、特徴的な発光が起き、それによっ
て検出及び同定が可能になる。
４つのレポーターの組は、単一の光源によって効率的に
励起することができ、類似するが識別可能な発光スペク
トルを有するものが選択される。結合、されたＤＮＡ断
片の電気泳動移動度における示差的動揺は小さい、この
要件は一般的に、４つのレポーターが類似、の分子量、
形状及び電荷を有していれば満たされる。
これらの基準は、以下の構造を有する蛍光部分を持つレ
ポーターによって満たされる。
ただし、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は水素、低級アル
キル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す、
このようなレポーターは、以下の構造式を有する。保護
され、活性化された中間体を介して導入することができ
る。
ただし、上式において、ｎは２又は３．Ｒ，及びＲ２は
Ｈ１低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン又はアル
コキシ基、Ｒｏ”はアルキル、Ｒｏはアルキル又はアリ
ール、Ｘは良好な離脱（ｌｅａｖｉｎｇ）　ｕである。
この発明のシステム及び方法は、比較的高い感度を維持
したまま発光スペクトルの比較的小さな波長差をリアル
タイムで識別する能力を有する。このシステムは光検出
器上に利用可能な光の大部分を分配する。最後に、この
検出システムは蛍光部を含むゲルの連続的なモニタリン
グを可能にする。この特徴により、間欠型の検出システ
ムにおいては通常木質的てあった、不完全なデータが誘
導される可能性が減少される。上述した全ての特徴は、
比較的低い製造コストでこのユニークなシステムに組み
込まれた。
極めて近接した発光バンドからの放射はこの発明のシス
テムを用いて検出することができる。
これらの近接した発光は、システムにおいて分析される
物質に不可逆的に結合した予め選択されたレポータ一種
から発つせられる。許容可能なレポーターは一般的に、
通常５０ないし１００ｎ−１好ましくは２０ないし５ｏ
ｎｓの狭い波長域にわたって発光することとができるｌ
又は２以上の種か選択される。好ましくは、最大ピーク
は２ｎ−未満にまで近づいていてはならない、１つのレ
ポータ一種は、物質への結合の態様及びシステム中での
分析条件に依存して、２以上の波長域で発光できるもの
であワてもよい、もつとも、固有の発光特性を有する個
々のレポーターが、検出すべき波長域において発光する
ためにより従来的に選択される。好ましいレポータ一種
は以下に記載する。
この発明は広い適用性を有するが、ＤＮＡ塩基配列決定
という特定の用途について記載する。
この発明のこの好ましい態様において、レポーター標識
ＤＮＡｊｆｉ基配列決定断片が単一の容器中で製造され
る。この容器の内容物、すなわち、レポーターで標識さ
れた種々の長さのＤＮＡ鎖は、分離のための電気泳動装
置を介して通過される。この目的のために、第２図に示
すように。
電気泳動は厚さ約０．２１ないし０．４ｍｍ　、長さ約
２５ないし４０ｃ■の適当な電気泳動板ｌＯにおいて行
なうことができる。他の寸法も適当に用いることかてき
る。この板１０は適当なゲルｌｌ、通常６％ないし８％
のポリアクリルアミドゲルを有し、ガラス又はプラスチ
ック支持体１２中に挟まれている。板（ゲル）は従来法
により調製される。
板ｌＯは通常、ホルダー中て直立して置かれる。板１０
の上端は、緩衝液２４を含む上部容器１６内に延び、下
方は、また緩衝液１８を含む第２の容器１４内に延びる
。！ａ衝液はいずれの適当な緩衝液であってもよく、通
常、　０．１Ｍ１−リスホウ酸ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，３
を用いることかてきる。このようにして、′ｓ衝液は、
緩衝液間の電気的接触を行なうために、両端部て板と接
する。この配列において、レポーター標！ｋＤＮＡ断片
は、ゲルの頂部に設けられた穴（図示せず）内にピペッ
トで入れられる。これにより、貯蔵容３１１４及び１６
中のターミナル２０を介する電気回路が完成する。この
特定の長さ及び厚みを有するゲルで分離を行なうために
適当なポテンシャル力へ必要である。陽極が板の下端に
位置し、ＤＮＡ断片を下向きに移動させる。これらの条
件下において、断片かゲル中を移動するにつれて、それ
らは空間的に分離されてノ＜シトになる。検出領域は板
底部近傍に位置する。この領域において、断片はレーザ
ー光線３１によって照射され、断片がこの領域を通過す
るに従って励起／発光が起きる。
電気泳動板ｌＯを照射するための光学的配置が第１図に
示されている。第１図のシステムは、近接した発光バン
ドの強度を識別し測定するために、い−ずれの蛍光又は
他の型のレポーターシステムにも用いることができる。
もつとも、上述したように、レポータ一種か蛍光化合物
である、レポーター標識ＤＮＡＨ片からの発光を検出す
るための好ましい用途について記載する。これは、好ま
しい励起可能な用いられるレポータ一種の励起波長の関
数として決定される特定の波長を提供するために選択さ
れるレーザー３０を含む０例えば、ここて開示する蛍光
レポーターに対して用いることかできる具体的な光源と
して、波長４８８ｎ−１光束の直径か０．８會−の、約
２５ないし４０ｍＷで操作されるアルゴニオンレーザー
を挙げることかできる。レーザー光線は励起フィルター
３２及び、電気泳動板ｌＯの検出領域において光束の直
径を約０．２ｍｓに絞る焦点化レンズ３３を通る。
フィルター３２は、検出工程を妨害する不所望の励起波
長をフロックするように選択される。
レーザー光線か非常に純粋であるならば、このフィルタ
ーは省略することがてきる。板に入る光線が、ここては
蛍光標識ＤＮＡ断片であるレポーター標識物質を励起し
、励起波長からシフトした波長の蛍光を発射せしめる。
特定の染料のピーク発光波長特性？後述するが、溶液中
に遊離の状態にある場合には、５０５，５１２．５１９
及び５２６ｎｍである。なお、検出システムは、近接す
る発光ハンドを有する他の組のレポーターの波長を識別
することもできる。さらに、レーザー光線は試料に入射
される外来性光が最小になるのて好ましい光源であるか
、適当なフィルター及び光学素子を用いると、キセノン
アークランプのような非コヒーレント光源を包含する他
の光源も用いることかできる。
蛍光種によって発っせられた光は適当に配置された平行
化レンズ３４によって集められる。平行化レンズ３４は
発光フィルター３６を介して二色フィルター３８に移し
て蛍光の特異的波長特性以外の実質的に全ての光を排除
するための平行光線を生みだす、このフィルターを用い
て、５００ｎ■未満及び５６０ｎ■を越える波長の光を
実質的に全て排除し、これらの波長の間にある波長を有
する光は５０％を越える効率て透過する。
この発明において、二色干渉フィルター３８によってこ
のシステムか非常に近接する発光スペクトル同志を識別
することが可能になる。これは通常、入射光線に対して
約４５度の角度に置かれる。このフィルターに入射する
光線はこのフィルターによって反射され又はこれを透過
する。ＤＮＡ＠片に結合された場合の蛍光レポーターの
発光ピークが５１５．．５２４，５３０及び５３６ｎｍ
である場合には、フィルター３８は第３１２１に示すよ
うな反射／透過特性を有する。Ｈ色フィルター３８は、
これら４つのレポーターに特徴的な蛍光ハントのほぼ中
央にある鋭い透過／反射遷移３９を有する。蛍光スペク
トルが低波長から高波長にシフトするにつれ、透過光対
反射光の比が連続的に減少する。この特定のフィルター
はこの用途に選択されたレポーターに対して選択された
ものであり、異なる組のレポータを用いる場合には、異
なるフィルター特性を有するものが必要になるてあろう
。
二色フィルター３８からの光（反射又は透過光）はそれ
ぞれの焦点化レンズ４０を通ってそれぞれの検出器４２
に至る。検出器４２は好ましくは光電子倍増管である。
これらは目的とするスペクトルバンド内で高い感度を有
するものとして知られている。あるいは、シリコンフォ
ト°ダイオード又は他の類似の検出器を用いることがて
きる。
検出器４２か平行化透孔から近い所定の距離だけ離れた
位置に置かれる場合には、平行化レンズ３４は省略する
ことができる。′このレンを省略する場合には１．集光
透孔は検出器４２の所望の感知領域に対応する開口を有
することによって規定され、又は、透孔は光学繊維フェ
ースプレートのような他の代替的手段によって規定する
こともてきる。同様に、焦点化レンズ４０は検出器の感
知領域か十分に広く、利用可能な光！直接集めることが
できる場合には省略することができる。
二色フィルター３８の機能はまた、好ましくは、２つの
フィルターと検出器４２へ発射された光源の光路に置か
れた透孔とによってもたらすことかできることか明らか
である。この場合に、それぞれのフィルターは２つの異
なる透過特性、すなわち、二色フィルターの反射又は透
過遷移特性を□有する。この様にして、２つの検出器４
２は上述した二色フィルターによって提供される透過及
び反射特性を与える。これら２つのフィルターの透過ハ
ンドは第７図により明瞭に示されており、同図中標識フ
ィルター１及びフィルター２である。これら２つのフィ
ルターの透過バンドは、ここで用いる５１５．５２４．
５３０及び５３６ｎ−の４つのレポーター標識ターミネ
ータ−に特徴的な蛍光ハントのほぼ中央で重複すること
が見られる。
２つのフィルターを用いるこの型のシステムは出願中の
ロバートソンらの出願中に記載されている。ロハートソ
ンらの出願に記載されているように、一対のモジュール
が、レポーター励起光線か電気泳動ゲル上の複数のレー
ンを走査する面の上と下に置かれる。それぞれのチャネ
ルはレポーター標識ＤＮＡ断片を含む。それぞれの検出
モジュールは広い入口領域及びそのＰＭＴとゲル中の蛍
光種との間に置かれた別の波長選択性フィルターを有す
る光電子倍増管を具備する。これらのフィルターは二色
フィルターの動作をシミュレートする相補的な透過バン
ド特性を有する干渉フィルターである。フィルターは、
種の本質の関数として異なる特性における異なる振幅を
有する信号をＰＭＴか発することを許す、１つのフィル
ターは低波長の発光をほとんど通し、高波長の発光を反
射するか、他方のフィルターはこの丁度逆を行なう、透
過フィルターをそれぞれの干渉フィルターについて用い
て所定の角度よりも大きな、軸からはずれた角度からの
光を排除することかできる。波長フィルターは、４つの
染料の発光領域において、はぼ相補的な透過対波長特性
を有し、種放射エネルギースペクトルの中央付近に透過
波長を有する。　　　　　　　　　　　　　　　　　）
検出器４２からの電気信号は次にそれぞれの１予備増幅
器°４６を通過してアナログ−デジタル（Ａ／Ｄ）変換
塁に至り、次にシステムコントローラー５２に至る。シ
ステムコントローラー５２の仕事はＩＢＭ　　ＰＣのよ
うな小さなコンピューターによって行なうことができる
。第４図のフローダイアグラムに記載されたシステムコ
ントローラー５２の機能は、２つの信号関数の比率を計
算することである。二色フィルター３８は、異なる波長
のバンドにおける信号をその波長に従って変調すること
である。すなわち、反射光検出器については、短い波長
の発光光線は小さな振幅の信号ｆ１を得、長い波長の発
光光線は大きな振幅を得る。従って、特定のレポータ一
種、すなわち、この発明の好ましい具体例においては蛍
光標識ＤＮＡ［１片かゲル１０中での空間的分離に続い
て検出領域を通過すると、その発光光線は波長及び時間
（ゲルｌＯ内の移動に基づく）の関数として異なる振幅
を有する。この振幅変調光信号は電気信号に変換され、
記載するプロセッシングのためにデジタルかされる。変
換後、デジタル信号は比率て示される。すなわち、反射
蛍光と透過蛍光の比率か得られる。これらのデジタル信
号は１組のＤＮＡ断片に対応する光信号のピークを表わ
すものである。ピーク高さ又はピーク領域に対応する信
号はその比率が表わされるのである。比率信号の大きさ
は種の同定を示すものである。関数Ｗは１つの検出器の
ピーク強度と他の検出器のピーク強度との比、例えば、
反射光線検出器のピーク強度によって除せられる透過光
線検出器のピーク強度である。それぞれのレポーターの
比率信号の大きさは、後述の実施例１Ｏにおいてわかる
ように、それぞれのレポーターを固有に示すグループ内
に入る傾向を有する。
この振幅変調及び比率化工程は、二色フィルターによる
場合も、同一の被検種からの同一のスペクトルに異なっ
て応答するそれぞれ異なる２つの信号を発生する別々の
フィルターを用いた場合でも、数学的に記載することか
できる。すなわち、レポーターピーク発光の際に存在す
る総電気信号（検出光信号に対応する）は発散光及び迷
走光に基づく成分並びに異なるレポーターのそれぞれか
らの蛍光に基づく信号とから成る。電気泳動中に、レポ
ーター蛍光信号は他の背景成分から識別することができ
る。なぜなら、蛍光信号は所定の態様で時間的及び空間
的に変化するからである。これは、特に検出器とゲルと
の間に相対的な移動がない場合に比較的一定の信号を発
する背゛景ノイズ信号と対照的である。ゲル及び検出器
を据付型に配置すると、蛍光信号はゲルを介するレポー
ターの移動により時間的に変化する。あるいは、ゲルは
電気泳動後固定されたままて、検出系をゲルに対して移
動させることもできるし、この逆もできる。さらにまた
、検出システムを、ゲル中での移動が起きている間に移
動させることもできる。
第５図には、２つの検出器出力信号が時間の関数として
変化する態様が示されている０図中のそれぞれのピーク
対は、被検ＤＮＡ中の塩基配列に対応する異なる組のＤ
ＮＡＩｔｌｒ片に対応する。それぞれのピーク対の比率
はそれぞれ特定のＤＮＡ塩基に対応する４つのグループ
の１つに入る。特定の塩基Ｔ、Ｃ，Ａ及びＧを同定する
のは、これらの比率グループ分けである。
レポーター間の感度（Ｗの値によって決定される）を改
善するために、異なる蛍光レポーターの全ての組合せに
おけるＷの変化を最適化しなければならない、これは、
異なるレポーター発光スペクトルにわたって実質的に変
化する透過／反射特性を有する二色フィルター又はその
上述した均等物を選択することによって達成される。し
かしながら、近接したレポーターについては、異なる発
光スペクトル（第３図）に対してＷの変化を均等に分配
するために、レポーター発光の中央付近に比較的鋭いフ
ィルター遷移を有するものを用いることが好ましい。
本質的に、このシステムは、稀有の測定感度及び選択性
能を提供する。このユニークなシステムにおいて、光は
２つの近接して結合された検出器に効率的に向けられる
。そして、安価でコンパクトで容易に使用てきるシステ
ムによって高い感度及び選択性を容易に得ることができ
る。
フローチャート システムコントローラー５２はＡ／Ｄコンバーターから
のデジタル信号をＤＮＡ塩基配列情報に変換する。はと
んどの場合、これはコンピューターによって実行される
プログラムによりリアルタイムで行なわれる。これは、
検出器からの生データを得るのと並行してデータが処理
され配列情報か得られることを、αＢ　４１．。
概念的には、システムコントローラーの操作は３つの相
互作用プロセス、すなわち、データ獲得すなわち入力、
データ分析及び出力、に分解することかできる。これら
のプロセスはデータを共有し、時間情報を共有すること
によって、プロセスを「工程内」に保持しこれらが互い
に妨害することを防止する。これらの相互作用がどのよ
うにして起きるかの詳細は選択された言語及びハードウ
ェアに依存し、ここては基本的な問題てはない。
このようにして行なわれるデータ獲得及び処理は第４図
のフローチャートを参照することによって理解すること
ができる。この図はＤＮＡシークエンサー検出器からの
生データを出力、すなわち、試料のＤＮＡ配列に変換す
ることかできる一般的な方法を示す、第５図は主検出器
出力対時間の仮想曲線を示し、以下に述べる変数のいく
つかを例示する。この諸論において、以下の用語を以下
のように定義する。
１、　　ｉは獲得される現在のデータポイントの指数で
ある。このポイントは時間ｔ（ｉ）分に得られる。
２、　　ｋは処理される現在のデータポイントの指数で
ある。このポイントはｔ（ｋ）分で取得されるデータに
対応する。一般的なデータ処理計画において、ｋはｉと
同一である必要はない。すなわち、データ処理はデータ
獲得よりも遅れていてよい。
３、　　ｔ（ｉ）はデータが獲得された時点のアレイで
ある０例：　ｔ　（５）−６，２分は、第５１目のデー
タポイントが、操作開始６．２分後に得られたことを意
味する。
４、　　Ｒ（＋）は反射検出器からのデータのアレイで
ある。
５、　　Ｔ（ｉ）は伝送検出器からのデータアレイであ
る。
６、　　Ｊは検出されたピークのカウントを示す。
７、　　Ｎは特定のピークを横切るデータポイントの数
を示す。
８、　　ｍはＲ（ｉ）又はＴ（ｉ）において規定された
ピークを横切るポイントの指数である。ピークの最初に
おいてｍ＝１、ピークの最後においてｍ＝Ｎである。
９、　　Ｗは上述のセクションで定義した関数である。
データ獲得 一般的なデータ獲得工程が第４図の左側のフローチャー
トによって示されている。現獲得データを示す指数ｉが
初期化される。プログラムはどれくらいの長さ操作か行
なわれるかを決定する入力、すなわち＊　　Ｉ　ｔａＬ
ａｌのデータポイントの総数を受容する。生データアレ
イＲ及びＴが初期化された後、処理は第４図に示す獲得
ループに入る。
データは検出器から読まれ、デジタル化され、時間ｔ（
ｉ）においてそれぞれ獲得されたＲ（ｉ）及びＴ（ｉ）
としてアレイ中に置かれる。（この議論の目的のために
２つの読みは同時的である。）この時点で、指数ｉは増
加され、Ｉ　ｔｏｔａｌと比較される。ｉか■１゜１１
．よりも小さい場合には、獲得ループが繰り返される。
ｉが■（。Ｌａｌと等しいならば操作は停止される。よ
り精密な計画においては、プログラムは、操作のそれぞ
れのピークにおいていくつかの性能パラメーター（信号
／ノイズ比、ピーク解像、又は塩基割当における不確実
性のようなもの）を測定することによって自動的に操作
の終了時点を知ることができる。これらの因子の組合せ
が予め設定された基準に合致することに失敗した場合に
は、操作はコンピューターによって停止される。−次デ
ータ入力は検出器からの生データであり、出力は、デー
タ獲得及び分析処理の間て共有されるデータアレイＲ（
ｉ）及びＴ（ｉ）中に貯蔵される。この計画は第４図に
模式的に示されている。２つのプログラムは独立的に同
時に走るか、適切なタイミングを維持するために、何ら
かのコントロール情報がこれらの間で通過されなければ
ならない０例えば、処理プログラムは獲得工程を引き次
いではならない、なぜなら、そうすることによって実存
しないデータを処理することを試みることになるかもし
れないからである。
データ処理 第４図の右側に示されるデータ処理アルゴリズムはレポ
ーター標識種を検出し同定する一般的な計画の例を示す
。これは全てを包含しているわけてはない、これは実際
の分析器プログラムを開発するために必要な主たる特徴
を例示しているたけである。
処理指数ｋ（獲得指数ｉとは区別される）を初期化した
後、プログラムは単純なループに入り、ここて獲得プロ
セスによって提供される生データアレイからのデータＲ
（ｋ）及びＴ（ｋ）が読まれる。プログラムは次に現時
点がピーク上か否かを問う、この条件を決定する多くの
アルゴリズムが存在し、その詳細はここては述べない。
「ピーク」という後は、一般的な意味を意味する。Ｒに
おけるピークは一般的Ｔにおけるピークに伴われる。し
かしながら、レポーターの同一性に依存して、これら２
つのチャネルにおけるピークはその強度かかなり異なる
かもしれない。
しかしながら、これらは時間的には一致する。
従って、２つの信号の荷重平均、２つの信号の強い方又
はＲ（ｋ）とＴ（ｋ）との他の組合せは時間における「
ピーク」を規定するのに用いることかてきる。
現処理ポイントかピーク上にない場合には、指数には増
加され、獲得指数ｉと比較される。ｋがＩ　ｔｏｔａｌ
と同一である場合には、操作は終りプログラムは停止す
る。ｋがｉよりも小さな場合には、アレイＲ及びＴから
次のデータポイントがもたらされ、ループが再び実行さ
れる。ｋがｉに等しいならば、それは処理がデータ獲得
に追いついたことを意味する。この場合には、処理プロ
グラムは短時間（通常１秒）待ち、処理が再び続行する
ことがてきるまてｋ及びｉの（４を試験する。
現処理ポイントかピーク上にあるならば、指ｆｉｍは増
加される。指数ｍは現ピークを横切るポイントの数を数
える。Ｒ（ｋ）及びＴ　（ｋ）値はＲｐｅａｈ（＋＊）
及びＴｐｅａｈ（ｍ）と呼ばれる一次的アレイ中に置か
れる。プログラムは次に現ポイントかピークの最終ポイ
ントかどうかを調べる（これを決定するのに公知のアル
ゴリズムか存在する）。
もしこれかピーク上の最終ポイントでない場合には、プ
ログラムコントロールはｋを増加し、その値をｉと比較
し、Ｒ及びＴアレイからデータの次の対を読むより上の
ループに戻る。
現ポイントがピーク上の最後の点であるならば、ピーク
カウンターＪか増加され、プログラムはピークの同一性
を決定するように進行する。その結果はＤＮＡ配列の次
の塩基の同一性である。
プログラムは１ン述したように現ピークについての関ａ
Ｗを入力データとしてアレイＲｐｅａｍ（１）とＴｐ、
、ａｂ（＠）を用いて計算する。それぞれのヌクレオチ
ド塩基は特徴的なＷを与える一対のピークを有する。従
って、このピークについてのＷの値に基づき、プログラ
ムは出力としてＤＮＡ塩ＭＡ。
Ｔ、Ｃ又はＧの同一性を与える。ピークポイント指数ｍ
及びアレイＲｔｅ□及びＴ　ｐｅａｋはＯにリセットさ
れ、プログラムは再び第１図に示す上部データ獲得ルー
プに入る。
ＤＮＡ塩基配列決定における標識方法 ＤＮＡ配列決定断片に塩基特異的にレポーターを結合す
るのに用いられる戦略は、あらゆるＤＮＡ配列決定シス
テムにおいて重要な特徴である。それぞれ木質的な利点
及び欠点を有する多くの方法がある。
プライマー標識 スミスらによって報告された成就部のプライマー標識方
法は、自動オリゴヌクレオチド合成器中で生成する中間
体を用いてプライマーの５°末端に染料を結合すること
ができるという利点を有する。酵素的な３′鎖伸長はほ
とんど起きないと予想される。しかしながら、この方法
は多くの欠点を有する。４つの異なる染料標識オリゴヌ
クレオチドプライマーか必要であり、配列決定断片の製
造を４つの別々の反応で行なわなければならず、従って
、プロセス全体を自動化しようとするあらゆる試みを複
雑化する。特定のプライマーが必要なので、ベクター（
１４型）の選択に関する柔軟性が減少する。例えば、標
識プライマーの使用は、大量の連続するＤＮＡを迅速に
配列決定するための戦略（例えば「ウオーキング・スル
ー・ザ・ジーン」法）の利点をフルに利用することを困
難にする。性能の領域にはより深刻な欠点が存在する。
プライマー標識法は全ての断片、すなわち、真正な配列
決定断片及び多くのアーチファクト的断片も標識される
ことになる。従って、多くのアーチファクト（シャドウ
ハンド、パイルアップ等）が従来の配列決定方法におい
て保持される。
断片後標識 もう１つの回部な方法は後標識討画である。
この計画ては、染料標識は配列決定断片の混合物を生成
した後に行なわれる。この方法の利点は標準的なプロト
コール（マキサム−ギルバート又は。
サンガー法）を断片の標識化の時点まて用いることがで
きるということである。主たる欠点は標識が例外的に選
択的てなければならないことである。レポーターを結合
することによってＤＮＡ配列決定断片の電気泳動移動度
に測定可能な増加効果をもたらすことが予想されるので
、この効果５は全ての断片について一定てなければなら
ない。複数標識は鎖長と電気泳動移動度との間の関係を
破壊するのて破滅的である。
鎖ターミネーター標識 この発［ＪＪては第３のアプローチか好まし、い。
すなわち、サンガーＤＮＡ配列決定法の修飾における鎖
ターミネーター標識法である。古典的なサンガー法ハ、
プライマー、ＤＮＡ＄４ｆｉ、ＤＮＡポリメラーゼｌ（
クレノーフラグメント）、並びに４つの塩基（Ａ、Ｃ，
Ｔ、Ｇ）に対応する４つの２’　、３’−ジデオキシヌ
クレオチドの１つをそれぞれ含む４つの反応容器中の３
つの非標識デオキシヌクレオチド及び１つの放射標識Ｄ
ＮＡを用いる。
プライマーの３°末端にヌクレオチドを加えることによ
ってポリメラーゼか鋳型を複製することを許す適当な反
応条件かつくり出される。多くのプライマーコピー上で
複数の反応が同時に起き、それぞれの断片中の適当なヌ
クレオチドにおいて放射標識を全て含む異なる長さのＤ
ＮＡ１１ｌＨ片を生成し、ＤＮＡの生成は４つのジデオ
キシヌクレオチドの１つによって非可逆的に終結される
。この断片の組は通常ポリアクリルアミド板電気泳動ゲ
ル上て４つのレーン中で分離される。この場合、１つの
レーンは４つのジデオキシヌクレオチド反応混合物のそ
れぞれに対応する。断片を分離した後、感光性フィルム
かゲル］二に置かれ、適当な条件下て露光され、ＤＮＡ
配列はゲルの低部からの４つのレーン中の外観によって
、フィルム上のハンドのパターンの読みから決定される
。
この発明に従った、サンガー法の修飾は、放射標識ヌク
レオチドを省略し、非標識２′、３−ジデオキシヌクレ
オチドのためのレポーター標識鎖ターミネータ−を置換
することである０反応混合物は、４つのＤ　Ｎ　Ａ塩ｕ
のそれぞれに対応する適当なレポーターてその３°末端
か非可逆的に標識された断片を含む。反応混合物は１つ
にまとめられ、電気泳動により分離される。配列はこの
発明の方法に貰って、それデれの断片か有する識別可能
なレポーターの外観の順序によって与えられる。
ここて用いられるレポーター標識鎖ターミネータ−の構
造的範囲及び合理性の輪郭を描くために、構造を第６図
に模式的に示すように５つの成分に分解することか有用
である。蛍光標識鎖ターミネータ−は、例えば、（ｉ）
三リン酸部分。
（ｉｉ）　ｒ糖」部分、（ｉｉｉ）ヘテロ環塩基部分、
（ｉｖ）リンカ一部分、及び（Ｖ）レポーターか蛍光化
合物である場合にはレポータ一部分を含む。
上述の記載から、「鎖ターミネータ−」といいう語は、
サンガー法におけるＤＮＡ配列決定方法にとって包括的
なものである。この発明の改良された方法は、有利にレ
ポーターか結合されたより特異的な鎖ターミネータ−を
用いる。これらの新規な化合物は、一般的な鎖ターミネ
ータ−とは、ｖｋ者が上述したように三リン酸（ｉ）、
糖（ｉｉ）及びペテロ環塩基（ｉｉｉ）部分のみを有す
ることによって区別される。この発明の鎖ターミネータ
−は「レポーター標識鎖ターミネータ−」と呼ばれ、通
常上記した５つの部分を全て含む。
旦エユ」１皿力 三リン酸部分又は近似する類似体（例えばアルファーチ
オ三リン酸）はあらゆる酵素基質、鎖終結等にとって必
須的な官能部分である。この官能部分は基質に結合エネ
ルギーの多くを与え１Ｍ素−基賀反応が実際に起きる部
位である。
糖部分 Ｆ 「糖」部分は天然の酵素基質における２°−デオキシリ
ボフラノース構造断片に対応する。分子のこの部分は酵
素認識に寄手し、三リン酸部分とヘテロ環塩基部分との
間の適当な空間関係を維持するために必須的である。鎖
ターミネータ−の１つの要件は、糖部分がリボフラノー
スである場合に３°位かＤＮＡポリメラーゼによって引
き続き用いることかできる水酸基を有していてはならな
いことである。水酸基は存在してはならず、他の基によ
って置換するか又は他の方法により利用不可能にしなけ
ればならない、あるいは、アラビノースのようなりボフ
ラノース類似体を用いることか゛できる。現在、多くの
修飾フラノース断片がこの機能を果たすことが知られて
おり、これらは、２°、３°−ジデオキシ−β−Ｄ−リ
ボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３゛−デ
オキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３°−アミノ−
２°、３°−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、警
び２°、３°−ジデオキシ−３°−フルオロ−β−Ｄ−
リボフラノシルを包含する（エフ・サンガーら、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７
４．５４３６−５４６）（＋９７７）；　　ゼット・ジ
ー・チドゲアバチェら。
Ｎｕｃ　、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２．１６７１−
１６８６　（＋９８４）及びセット・シー・チドゲアハ
チェら、ＦＥＢＳ　ＬｅＬＬ、。
１８３、２７５−２７８　（１９８５））。
ヘテロ環塩基部分 ヘテロ環塩基部分は特定の空間的配位において水素結合
のアクセプター及びドナーとして働く核酸中の重要な認
識要素として機能する。これらの塩基要素は、正確な配
列決定に必要な高い忠実さをもって鋳型によって指導さ
れる適当なヌクレオチドの取り込みに必須的である。こ
の構造部分はまたレポーターを担持する。先行文献によ
り、ピリミジンの５位及びプリンの７位は全体的な結合
及び認識を有意に妨げることなく比較的大きな置換基を
担持することかできることがわかっている（アール・エ
ム・ケイ・ゾールら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７０．２２３８−２
２４２　（１９７３）　）　。
従って、好ましいヘテロ環塩基部分は、ウラシル、シト
シン、７−ジアザアデニン、７−ジアザグアニン及び７
−ジアザヒボキサンチンを包含する０人工の７−デアザ
プリンは塩基部分に純粋な電荷を与えることなく、又は
グリコシド結合を不安定にすることなくレポーターを結
合するために採用される。従って、天然のプリンは適当
なヘテロ環塩基部分としては働かない、なぜならこれら
は純粋電荷を獲得し、レポーター標識鎖ターミネータ−
をＷ４製するのに通常用いられるアルキル化反応の後に
急速に分解するからである。さらに、類似の官能基を有
する他のヘテロ環塩基も用いることができる。
リンカ一部分 リンカ−は単にアミノ基たけてあってもよいし、炭素、
窒素、酸素及びイオウのような原子を含む背骨を有する
鎖であってもよい。
リンカ−は好ましくは、三重結合の一端が１ないし２０
原子の置換又は非置換ジラジカル部分Ｒ１を介してアミ
ンに結合されたジアルキルアミノ基である。三重結合の
他端はピリミジンの５位又はプリンの７位（プリンナン
バリング）に共有結合により結合されている。アルキル
アミノ基のアミン窒素は蛍光ラベル上の反応性官能基（
例えばカルボニル基）に結合されている。リンカ−はＤ
ＮＡポリメラーゼによる結合及び取り込みを有意に妨害
してはならない、ジラジカル部分は、任意的に二重結合
、三重結合、アリール基又はＮ、０若しくはＳのような
ヘテロ原子を含む炭素数１ないし２０の直鎖状アルキレ
ンであってよい、ヘテロ原子は、エーテル、チオエーテ
ル、エステル、アミン又はアミドのような官能基の部分
であってよい、ジラジカル部分の上の置換基は、Ｃ１〜
Ｃｔａアルキル、アリール、エステル、エーテル、アミ
ン、アミド基及び塩素を包含する。好ましくは、ジラジ
カル部分は炭素数ｌないしｌＯの直鎖状アルキレンであ
り、最も好ましくは−ｃＨｔ−である。この発ＩＪ１の
レポーター標：ａ鎖ターミネータ−に用いるのに最も適
当なリンカ−についてのより詳しい記載は出願中のホブ
スらの出願中に見出される。
ｋＪ＝−タ：七１分 上述の開示では、好ましくは発光種として１組の蛍光レ
ポーターからの近似したスペクトルの測定に特に適合し
た検出手段の有用性を強調した。しかしながら、近似し
たスペクトルを有する放射を発射する他の種もまた用い
ることかできる。この発明の方法を実施するための適当
なレポータ一種を選択するためのいくつかの基準を挙げ
ることができる。これらの基準は以下のものを包□含す
る。
・　単色光源による効率的な励起及び強い、識別０■艶
な発光応答 ・　ヌクレオチド鎖ターミネータ−に直接的又は関節的
に共有結合することができる化学的に反応性の官能基の
存在 ・　オリゴヌクレオチド断片中での立体的関係を動揺さ
せることを最小化するための比較的小さなＹ！ｉ量 ・　鎖ターミネータ−の区別のために選択された基又は
レポーター組の他のメンバーと類似した電荷及び寸法特
性 ・　試料調製、反応及び断片分離条件における広範囲の
ｐｕ、イオン強度及び温度に対する物理的完全さ及び検
出特性の安定さ ・　ＤＮＡ配列決定断片の生成及び分離に対して最小の
悪影響を与える性質 適当なレポータ一種は上述の特性で機能することがてき
る物質のいくつかのカテゴリー中に見出すことかてきる
。それらは、発色体、蛍光体、化学発光体、スピンラベ
ル及び密電子材料を包含する。物質のこれらの種の検出
はまた、種々の手段によって達成することがてきる０例
えば、蛍光種発光は、上述したように、スペクトル分配
を区別化することによって検出することかできる。代替
的な蛍光検出システムては、分極化及びディファレンシ
ャル時間分離のような追加的な種の性質を、それぞれの
塩基に対応する標識ＤＮＡ鎖ターミネータ−を有する断
片を固有に同定するために採用することができる０選択
された検出手段は、公知の方法によって、信号−ノイズ
比を最大化することかてき、背景又は外来性信号を最小
化することによって許容可能な感度を達成することかて
きる。この発明の固有の性質及び利点は、ＤＮＡ配列決
定において適当な検出手段とレポーター標識鎖ターミネ
ータとを結合することによって達成することができる。
同様に、従来の光度測定もこの発明の方法のレポーター
の要件を満たす発色体を検出するために用いることがで
きる、蛍光性をも有していてよい４つの固有の発色体を
選択することがてき、これを鎖ターミネーター上に取り
込んで、吸光度測定及び光子係数分光光度計を包含する
種々の手段によって検出可能なレポーターを導入するこ
とがてきる。有用な発色体の典型的な例は２．４−ジニ
トロフェノール及びその誘導体である。適当な置換によ
り類似する一定の条件下における異なる発光特性をもた
らすことができ、それによって上述した装置をわずかに
修飾するだけで検出が可能になる。
ルミネッセントレポーターは再発光放射に必要な時間が
蛍光レポーターとは異なる。蛍光レポーターは通常、ｌ
ｏ−６ないし１０１秒のオーダーの吸収入射エネルギー
を再発光する。「リン光体」という語もしばしばルミネ
ッセントな化合物を示すために用いられ、これらの用語
は一般的に同義的に用いられる。これらの化合物は蛍光
化合物よりも、入射吸収エネルギーを再発光するのに時
間が長くかかる。典型的なルミネッセントレポーターは
、２，２°−ジヒドロキシビフェニル−５，５°−ジ酢
酸の誘導体、例えば２，２°−ジヒドロキシ−３，３°
−ジメトキシビフェニル−５，５−酢酸、２．２゛−ジ
ヒドロキシビフェニル−５，５°−ジアラニン、１，２
°−ジヒドロキシビフェニル−５，５−ジエチルアミン
等である。
コロイダル金粒子のような、電子過密°他剤として働く
追加的な種を共有結合的に鎖ターミネータ−に結合する
ことができる。これらの物質は、電気泳動ゲルレーンに
入射する光の透過性の小さな変化を検出することができ
る映像化システムに用いることがてきる。それぞれの鎖
ターミネータ−な固有にラベルして塩基割当を行なうた
めに、適当な検出器と共にスピン標識もまた用いること
かできる。これらの例における検出手段の複雑さの故に
、分離手段に試料をかける前に試料を１つにまとめるの
ではなく、試料をそれぞれのレポーター標識鎖ターミネ
ータ−について分離した試料を維持する単純化が必要と
なるかもしれない。
特定のシステムにおいて、４つのツレポーター標識ヌク
レオチド鎖ターミネータ−のさらなる区別化のために、
上述したレポーターの組合せを検出するための適当な手
段を容易につくることができることは当業者にとって明
らかであろう。
これは１強い蛍光及び吸光性゛を有する、鎖ターミネー
タ−に共有結合的に結合された化合物について特に適用
可能である。しかしながら、上述した所望の性質に応じ
て用いるために選択された上述のレポーターのあらゆる
組合せは、検出手段の相補的なアレイを有するシステム
中で用いることができる。
この発明の好ましい具体例におけるより具体的な例ては
、蛍光部分は、アルゴンイオンレーザ−のような適当な
光源からのエネルギーの吸収によって励起された後に、
検出可使な発光光線を与える。それぞれのＤＮＡＩ！！
基について固有の蛍光レポーターを有することか好まし
く、識別可能な４つの蛍光レポーターの組て一般的に十
分である。
この発明のＤＮＡ配列決定方法において有用なレポータ
ーの一群かこの目的のために特に発明され、これは公知
の染料９−カルボキシエチル−６−ヒトロキシー３−オ
キソ−３Ｈ−キサンチン系である。ニス・ビ・ングスら
は、Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、。
１２３、２９３４−２９４３　（１９２：ｌ）において
、レゾルシノール環構造中の２位又は４位（サクシニル
エオシン）にホウ素置換基を有すると推測されるいくつ
かのサクシニルフルオレッセイン誘導体の製造な面示し
ている。サクシニルフルオレッセイン上にジニトロ及び
テトラニトロ置換基を有する追加的な誘導体もまだ調製
された。これらの染料は明らかに以前の方法よりも単純
て効−Ｖ的な方法てあった。しかしながら、これらの染
料間の関係は開示されておらず、発光スペクトルを含む
それらの物理的特徴の有、ａな特徴づけも行なわれてい
ない。
この発明によってＤＮＡ配列決定するために有用である
とわかったこの群の蛍光レポーターは次の構造を有する
。
す１１ ただし、ｎは２又は３、Ｒ３及びＲ２はＨ１低級アルキ
ル、低級アルコキシ、ハロゲン又はシアノ基である。こ
れらの物質は、無水コハク酸又は無水グルタル酸を、メ
タンスルフォン酸中の適当な置換レゾルシノール中で縮
合することによって容易に製造することができる。これ
は、親化合物の製造についてビッグズらによって報告さ
れた方法の修飾である。
ビー・カーナらは、（米国特許第４，４８１，１３６号
）において、Ｒ，がアルキル基てＲ３がＨである場合の
構造１を含む化合物の群及びその蛍光抗原結合体の製造
における利用を開示した。蛍光免疫分析におけるその個
々の利用は開示されているが、ＤＮＡ配列決定にこれら
の染料の群を用いることを要求する有用性については何
も記載されていない。
キサンチン染料は、いくつかの異なる、一般的に互変的
な分子形態をとることができることか知られている。親
（１，ｎ＝２．ＲＩ＝Ｒ，＝Ｈ）について下記に示すこ
れらの形態は、キノ−、デルタ−、スピロ−１及びロイ
コ−形態として知られている。特定の状況下において観
察される形態は、ｎ、Ｒ＋及びＲ２の性質並びに温度、
溶媒、ｐｌ＋及び結晶形態のような条件によって決定さ
れる。明瞭性及び便利性のために、構造の命名及び図示
のためにキノ−形態のみを用いる。
キノ− デルタ υ スピロ− ロイコ 実際の蛍光種は、キノ−形態から形態的に誘導されるジ
アニオンスである。この種は７を越えるｐＨを有する水
溶液中で一般的に多数を占める。
親染料（ｎ＝２、ｌ、＝　Ｒ，＝　Ｈ）から誘導される
ジアニオンは、４８６ｎｍで操作されるアルゴンイオン
レーザ−によって励起するのに非常に適している。　ｐ
Ｈ８，２において、この種は４８７ｎｍに最大吸収を示
し、この場合の吸光係数は約７２，６００である。この
種はフルオレッセインの効率（量子効率的０．９）に匹
敵する効率を伴って５０５ｎｓで発光する。
ス ４つの識別可能な蛍光染料の組は、置換基Ｒ＋及びＲ２
を変えることによって親発色体の発光最大値に小さな変
化を導入することによって生成することかできる。吸光
スペクトルの対応する小さな相違は、４８６ｎ−で操作
されるアルゴンイオンレーザ−による効率的な励起を維
持するａ　ｌｌ及びＲ２を、純粋電荷を担持しない比較
的小さな置換基に限定して選択することにより、染料が
ＤＮＡＩｔｌｉ片に結合された場合の電気泳動移動度に
おける差別化効果が小さくなることを確保することがで
きる。
ＤＮＡ配列決定に適したこれらの染料の好ましいものは
、（構造１、ｎ＝″）　（１）　Ｌ　＝Ｒ２＝Ｈ１吸収
４８６ｎｍ、発光５０５　ｎｍ、　（２）　Ｒ＋＝　Ｈ
１Ｒ２＝　ＣＨｘ　、吸収４９４　ｎｍ、発光５１２ｎ
ｍ、（３）１＋＝　Ｃ１１ｉ　、　Ｒ２＝　Ｈ１吸収５
００ｎｓ、発光５１９ｎｓ、　（４）　Ｒ＋＝　１２＝
ＣＨ３，吸収５０９　ｎｓ、発光５２６ｎｓのものであ
る。最も長い波長に最大吸収を有する染料は約５０％の
励起効率を示す、これらの４つの染料はＤＮＡ配列決定
にとって適当な濃度において容易に検出し識別できる。
鎖ターミネータ−への９料の結合 これらのキサンチン染料の共有結合的連結は、リンカ−
のアミノ基とのアミド結合を介して、カルボン酸官崩を
介して行なわれる。染料を適当な形態にロックして連結
中の副反応を最小化するために化学保護基を導入するこ
とは有用である。
染料（１）をピリジン中でアルキル又はアリール酸無水
物（Ｒｏ）と反応させ１次いて過剰のアルキルアルコー
ル（Ｒ”）とで処理することにより、３位及び６位にア
シロキシ基を有し、９位にアルコキシ基（アルコールか
ら誘導される）を有する新規な保護された染料（３）が
得られる。アシル基がアセチルであり、アルコキシ基が
エトキシである化合物は製造が容易で良好な安定性、結
晶性及び有機溶解性を示す、濃縮アンモニア水で短時間
処理すると遊離の染料が再生成される。
２）　　Ｒ”０■ 互 保護染料（３）は多数の標準的操作の１つを用いてカル
ボキシル基を介してアミンに連結される。アミド結合か
好ましい、なぜならアミド結合は安定で形成するのか容
易で、水系に適合するからである。これらの操作におい
て活性な種は、−般的に−Ｘが良好な離脱基である構造
至の中間体である。
これらの活性種は通常その場て生成され連結されるか、
中間体を分離精製することかてきる場合もある。特に有
用な単離可能な活性化中間体の群はＮＨＳエステル互で
ある。これらの化合物は、保護された染料ユをＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドの存在下で、Ｎ、Ｎ−ジシクロへ
キシルカルボジイミド又は好ましくは１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・塩酸
塩のような適当なカルボジイミドとで処理することによ
りて容易に調製することができる。これらは安定で高度
に結晶性の化合物であり、種々の溶媒中で第１及び第２
アミンと明瞭に反応する。第１及び第２アミンは、この
発明のシステムにおいて分析される目的とする物質によ
って提供される。これらの物質は典型的には、修飾サン
ガーＤＮＡ鎖伸長プロトコールにおいて有用な所望のデ
アザプリン及びピリミジン塩基を含むジデオキシヌクレ
オチド又はその類似体である。
ＮＨＳエステル旦は、広範囲の第２アミンを連結するた
めに直接用いることができる。アンモニア水で生成物を
脱保護することによって、完全な蛍光強度を示す染料標
識アミン誘導体旦が得られる。
ＲＲ 旦 ＮＨＳエステル旦を第１アミンに結合することは迅速で
明瞭であるが、脱保護によって、蛍光強度を減少させる
標識アミンか通常つくられる。
これは、蛍光物質７ａの非蛍光スピロラクタム形態ｎへ
の部分的な平衡に起因する。平衡の程度は、溶媒、ｐＨ
及びアミンに依存する。この問題は染料とアミンとの間
にスペーサーを挿入することによって軽減することかて
きる。スペーサーはシアミン若しくはシアジッドから選
択することかてき、又は第２級アミン及びカルボン酸を
担持する分子から選択することかてきる。好ましいスペ
ーサーは染料のカルボキシル基とアミド結合を形成する
ことができる反応性アミンを含む。スペーサーは主とし
てレポーター、特に蛍光染料と関連し、これはスピロラ
クタム形態への環化な防止するために反応性アミンを染
料から移動させるように４１１ｍする。これはまた、ス
ペーサーがＤＮＡポリメラーゼ活性部位からより遠くに
染料を延ばす働きをするという観察と一致する。この伸
長はレポーター標ａ釦ターミネータ−のＤＮＡ断片への
取り込みを改善する。
対照的に、ＮＨＳエステル旦を好ましい第２級アミンに
結合すると、スピロラクタム形態への環化が見られない
が、活性化及び目的のアミンに連結するためのカルボン
酸を担持する種が得られる。
２）　　Ｎ１１４０１１ ｂ 例えば、単純て有効なスペーサーはアミノ酸ザルコシン
から構築することができる。ＮＨＳエステル５をザルコ
シンベンジルエステルに結合し、次いてベンジルエステ
ルを除去することによって、構造旦のカルボン酸が得ら
れる。保護された染料ユの場合と同様に、これらのカル
ボン酸８は、多くの標準的な方法のいずれか１つを用い
てアミンに結合することかできる。ここでもまた、構造
旦のＮＨＳエステルが単離可能て特に有用である。
ＮＨＳエステル９をアミンに結合し２次いでアンモニア
水中で脱保護することによって、完全に蛍光的な一般構
造１０のアミン誘導体か得られる。
２）　　Ｎ１１４０１１ １〇 一般的な規則として、適当なスペーサーて到達すること
ができる第１級アミンを含む目的の物質を設計し又は得
ることか好ましい。スペーサーを挿入することによって
環化反応か防１トされるものと信じられる。第２級アミ
ンを用いることもてきるが、第１級アミンと同しように
は迅速にかつ効率的に反応しない。
代表的な蛍光標識鎖ターミネータ−はｌ　”ｌである。
この物質は収束型の経路を介して構築することがてきる
。２°、３−ジデオキシウリジンか南限の２−デオキシ
ウリジンから５工程て調製される（ケイ・イー・フィッ
ツナーら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、。
２９、１５０８−１５１１　（１９６４））。５°−三
すン醜はジェイ・エル・ルースら、Ｍｏ１．　Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ、、　２０゜４１５−４２２　（１９８１）
の１容器法を採用することによって直接調製される。３
−アミノ−１−プロペン−１−イルリンカ−は、ビーー
ランガーら。
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、　７８．６６：１３　（＋９８１）及び欧州特許出願
第８２：１０１８０４．９　（１９８２）に記載された
一連の反応を採用することによりてヘテロ環塩基の５位
に結合される。　５−（：ｌ−アミノ−Ｉ−プロペン−
１−イル）−２°、３゛−ジデオキシウリジン−５−三
リン酸なＮＨＳエステル９　（Ｎ＝２、Ｒ，＝　Ｒ，＝
　Ｈ’）と反応させ、次いてアンモニア水て短時間処理
することによって、新規な蛍光標識釦ターミネーター上
ユか得られる。
−Ｍ 化合物１１は、修飾サンガープロトコールにおいてｄｄ
ＴＴＰを置換する。４つの鎖ターミネータ−の完全な組
は化合物１１と、異なるヘテロ環塩基及び蛍光部分を有
する３つの類似体とから成ることができる。修飾サンガ
ープロトコールの残った非標識鎖ターミネータ−を置換
するための３つの類似体の調製は、化合物上ユのヘテロ
塩基部分（ウラシル）をシトシン（ｄｄＣＴＰに対し）
。
７−ジアザアデニン（ｄｄＡＴＰに対し）又は７−ジア
ザグアニン（ｄｄＧＴＰに対し）で置換することを含む
、蛍光部分は、芳香族置換基Ｒ，及びＲ２を、両方とも
Ｈから、それぞれＣＨ３とＨ，ＨとＣ１１３，及び両方
ともＣｌ１ｚに変えることによって変えることがてきる
。化合物は、１１について記載されたのと類似する経路
を介して調製される。
３−アミノ−１−プロペン−１−イルリンカ−を３−ア
ミノ−１−プロピン−１−イルリンカ−で置換すること
によって、より容易に調製することができる機能的に均
等なレポーター標識鎖ターミネータ−が得られることが
わかった。プロピニルリンカ−を用いることにより、プ
ロペニルリンカ−を用いて製造されるものよりも安定な
レポーター標識鎖ターミネータ−がより高い収率で得ら
れる。もう１つの利点は、プロピニルリンカ−は、プロ
ペニルリンカ−よりも部位選択的にヌクレオチド塩基に
結合することができることである。
従って、この発明によって修飾されたサン朋細書の浄３
（内容に変更なし） ガー鎖伸長法において用いるのに好ましいレボ−び１５
である。
明細書のπ３−り内容に変更なし） 明細書の浄書（内容に変更な、） Ｇ さらに、螢光染料が一旦デアザプリン又はピリミジン塩
基にリンカ−及び任意的なスペーサーを介して結合され
ると、その正規の発光最大が幾分長波長側にシフトする
ことが予想される。この効果は、塩基の性質並びにｐＨ
１イオン強度、溶媒、分離媒体等のような測定条件にあ
る程度依存する。
あるいは、螢光体の発光特性に影響を与えるように思わ
れない１つの因子は、螢光標識鎖ターミネータ−を有す
るＤＮＡ断片中の隣接するヌクレオシドの性質である。
特定の螢光体の発光は、その鎖ターミネータ−がいずれ
の隣接するピリミジン又はプリンに酵素的に結合された
場合でも一定に保たれるように思われる。例えば、上述
したレポーター標識鎖ターミネータ−は、４８８ｎｍで
励起すると、５１５ｎｓ　（１２）、５２４ｎｓ　（１
４）、５３０ｎ−（脛）及び５３６ｒ＋ａｍ（１５）に
最大発光を有する。同様な測定条件下において、これら
の発光体は未結合の、溶液中で遊離の状態において、正
規の最大発光５０Ｓｎｓ、５１２ｎｍ、５１９ｎｓ、及
び５２６ｎｍをそれぞれ有する０発光最大のこれらのシ
フトは容易に測定することかでき、定型的な実験により
決定することかてきる。この最大発光のバラツキの特徴
づけにより、ひいてはこの発明のシステムにおける二色
フィルター又はその均等物の所望の反射／透過特性を選
択することかできる。
ＤＮＡ合成酵素の選択は、鎖ターミネータ−の特異的な
構造によって主に決定される。例えば、化合物上ユがＤ
ＮＡポリメラーゼＩｅｌＩ素のクレノーフラグメントで
配列特異的終結を与えるのに失敗し、ＡＭＶ逆転写酵素
又はバクテリオファージエフポリメラーゼで終結した場
合には、末端は、　ｄｄＴＴＰ″ｒ！観察されるもの（
従来の３２ｐラベルを用いて判定されるように）と実質
的に同一の末端を与える。
鎖伸長／終結反応は、状況（例えば所望の末端の範囲、
包含される自動化の程度）に応じて。
別々の容器内又は単一の容器内で行なわれる。蛍光標識
鎖ターミネータ−及びｄＮＴＰ濃度は配列決定断片の適
当な濃度を与えるように調節される。蛍光標識ＤＮＡ配
列決定断片は、その３２Ｐ標識対応物よりも大きな安定
性を示し、時間が経つと分解する３２ｐ標識断片と異な
り、直ちに又は後で電気泳動的に分析することができる
。
従来技術の多くの本来的な欠点を克服することに加え、
この発明はまた。多くの操作的利点を与えるので有意義
である。最も重要なことには。
ターミネータ−標識が塩基特異的終結態様でレポーター
に堅固に結合することがある。正規の終結から得られた
ＤＮＡ配列のみがレポーターを相持する。これにより、
従来の配列決定において観察された多くのアーチファク
トが排除される。これは配列決定ベクターの選択に完全
な柔軟性を与える。なぜなら、特定のブライマーか関与
してはいないからである。この発明の４つの低分子鎖タ
ーミネータ−によってレポーターか担持されているとい
う事実によって、自動化か容易に行なわれ、単一の反応
で選択的に導入することかてきる０本来的な操作的欠点
はない、このアプローチにおける問題はその設計段階に
おいて生しる。−般的に、ＤＮＡポリメラーゼは高度に
基質特異的である。４つのレポーター標識鎖終結他剤は
、結合されたレボータニ基が、塩基取り込みの程度又は
忠実さを過度に妨害しないように慎重に設計されなけれ
ばならない。
高い性能ポテンシャル及び多くの操作上の利点により、
レポーター標識鎖ターミネーター法か、修飾サンガー法
を介してレポーター標識ＤＮＡ配列決定断片を調製する
ための方法として優れたものとなる。
プライマー標識 ここて記載した染料は、蛍光標識鎖ターミネータ−の調
製において最も有利に用いられるか、これらはまたブラ
イマー標識アプローチニオいても用いることができる。
検出、識別及び電気泳動移動度に関するこれらの物質の
優れた性能により、この出願か、スミスらのシステムの
実質的な改良となる。
スミスらの方法ては、保護された、アミノ誘導ヌクレオ
シトフオスフオラミジト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉ
ｔｅ）か、自動合成器を用いて５°−アミノ−５゛−デ
オキシオリゴヌクレオチドを調製するために用いられる
。この物質は、精製され、次いて別々の非自動的反応に
おいて４つの異なる染料に結合される。４つめ染料標識
オリゴヌクレオチドは精製され１通常の放射標識デオキ
シヌクレオチドを省略したサンガープロトコールにおい
てプライマーとして用いられる。
この出願において記載された染料の保護された誘導体（
例えば互）の利用可能性により、保護された染料て標識
されたヌクレオシドフォスフォラミジトを設計する“こ
とが可能になる。自動合成器中で用いた場合には、この
様な試薬は、最終の５°残基及び蛍光レポーターを同時
に導入することを可能にする。この利点により１手動的
結合及び余分な精製を行なう必要性が排除される。
典型的な保護された。染料標識ヌクレオシトフォスフォ
ラミジト試薬は、次のようにして構築することができる
。ＮＨＳエステル旦をその場て生成し、５°−デオキシ
−５°−（メチルアミノ）チミジンと反応させることに
よって、保護された染料標識ヌクレオシド銹導体上上が
得られる。標準的な方法を用いて３°亜リン酸化を行な
うと、対応するフォスフオラミジト１７が得られる。
ブライマーとして働く５°−染料標識オリゴヌクレオチ
ドを構築するために、５゛末端がＴ残基を有する配列が
選択される。上ユが最終的な７オスフオラミジト試薬と
して用いられる□ことを除き、自動化合成が通常通行な
われる（ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基が存在し
ないので、最後の酸処理は省略することができる）、固
体支持体からオリゴヌクレオチドを放出するアンモニア
水での処理はまた、染料を脱保護化する働きをする。
脱保護は、ヌクレオチド塩基を脱保護するために用いら
れる延長されたアンモニア処理に続いて完了する。標準
的なプレパラティブゲル電気泳動により染料標識オリゴ
ヌクレオチドがもたらされる。
この方法論はプライマー標識方法論において固有の問題
を回避しないか、スミスらのシステムに用いられるブイ
ライマーよりも優れた性能を提供する。電気泳動度の区
別的シフトは最小化され、検出／区別は上述のように、
大いに改良される。
他の染料有用性 ＤＮＡ鎖ターミネータ−を標識するのに有用なたけてな
く、これらの染料は蛍光レポーターとして一般的に有用
であると予想される。これらはタンパク質、バブテン、
リボ核酸又は他の分子のような、免疫分析、特異的結合
分析１組織化学染色若しくは蛍゛光標識を必要とする他
の用途に用いるのに興味がある生物学的分子を標識する
のに用いることができる。これらの物質の標識は、アミ
ンの標識について上述したのと類似する公知の方法を用
いることによって行なうことができるものと思われる。
これらの組成物は特定の用途において２以上の蛍光レポ
ーターが必要な場合に特に有用であると予想される。な
ぜなら、これらは、単一の単色光源によって効率的に励
起することかでき、そのシフトされた発光最大の故に・
区、別可能なレポーターとして検出することができる。
これらは、これらの染料をＤＮＡ配列決定のレポーター
として有用としたのと同じ蛍光性である。これらの染料
は、公知のフルオレッセインにおいて一般的に必要な、
異なる官能基を用いるのてはなく、同一の化学的官能性
を用いることによって結合することかできるというさら
なる利点を有する。
非環状ヌクレオシド誘一体 従来の一３２ｐ配列決定において、２°、３°−ジデオ
キシヌクレオシト三リン酸（ｄｄＨＴＰ’　ｓ）は鎖タ
ーミネータ−として実質的に排他的に用いられるが、上
述したように、他の糖修ｆｓ誘導体もまた用いることか
できる。これらの物質は、製造するのか比較的困難であ
るという欠点を有する（　ｄｄＮＴＰ’　ｓについても
幾分そうである）、より単純てより容易に導入すること
ができる糖を有する鎖ターミネータ−の有効な組が、従
来の”Ｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定及び蛍光系配列決定（蛍
光レポーターがヘテロ環塩基に結合されている）の両方
において有用であろう。
抗ウイルス剤アシクロバー（アシクログアノシン）にお
いて、２−ヒドロキシエトキシメチル基が２′−デオキ
シリボフラノシル基に置換されている。アシクロバーは
対応する三リン酸（ＡｃｙＧＴＰ）にその場で代謝され
る。　ＡｃｙＧＴＰは種々のポリメラーゼに対する競合
的又は非競合的阻害剤として知られている。それはまた
、広くこれらの酵素の鎖終結代ｆ！基質であるか（ピー
・ライ・マクガートら、八ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇ
ｅｎｔｓ　ａｎｄＣｈｅｍｏＬｈｅｒ、　２５．５０７
　（１９８４））　、その阻害的成分はその基質の行動
の正しい分析を複雑にした。アシクロバーの抗ウィルス
活性は選択的にウィルスポリメラーゼを阻害するその能
力によって説明され得るので、ＡｃｙＧＴＰの処理速度
及びそれによって得られる生産物は完全には特徴づけら
れていない。（チミジン、アデノシン及びシトシンの対
応する非環状三リン酸は報告されているか、それらとポ
リメラーゼとの相互作用はより以上に特徴づけられてい
ない、）従来技術において、非環状ヌクレオシド三リン
酸（八ｃｙＮＴＰ’　ｓ）がＤＮＡの重合を、　ｄｄＮ
ＴＰ’ｓのような化合物の効率及び忠実さと同程度に鎖
終結することは全く知られていない。
さらに詳細に言うと、ＡｃｙＮＴＰが、ＤＮＡ配列決定
実験において潜在的な鎖ターミネータ−として用いられ
た際にシーフェンシングラダーをもたらすということは
報告されていない。
この発明の他の局面において、非環状ヌクレオシド三リ
ン酸（＾ｃｙＮＴＰ’ｓ）はサンガー法によるＤＮＡ配
列決定における鎖ターミネータ−として有用であること
が示された。
これは、ｄｄＮτＰ’ｓに代えて八ｃｙＮＴＰ’　ｓを
用いて、従来のサンガー配列決定（３２Ｐヌクレオチド
レポーター）を行なうことによって示された。得られた
シーフェンシングラダーは同様なりＮＡｐｌｙ片のバラ
ツキを得るためにより高い濃度の（約１０倍）　Ａｃｙ
ＮＴＰが必要であるということを除き、実質的に同一で
ある。　ＡｃｙＮＴＰ’ｓはＤＮＡポリメラーゼ■（ク
レノーフラグメント）及びＡＭＶ逆転写酵素の両方に対
して有効であった。
八ｃｙＮＴＰ’　ｓは、　ｄｄＮＴＰ’ｓよりも容易に
合成てきるという利点を有する。これは従来の配列決定
における主たる問題てはないか、構造的に複雑なレポー
ター標識鎖ターミネータ−か調製される場合には有意義
である。２−オキシエトキシメチル基を糖部分（先に定
義した）として用いることによって、許容可能な性詣を
維持しながら試薬合成か大幅に単純化された。
す 以下の実施例は例示のために記載されたものであり、限
定的なものてはない。
全ての温度は摂氏で表わされている（室温は２５度を意
味する）、他に明示かない限り、液体の混合物を除き（
これは体積基準）、全ての部及び％は重量基準である。
次の略記を採用した。
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ＝ジメチルス
フホキシト、ＮＨＴＦＡ＝）−リフルオロアセトアミド
基、Ｔ　Ｅ　Ａ　Ｂ　＝　炭酸水漏トリエチルアンモニ
ウム、　Ｔｒｉｓ＝　）リス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、ＳＦ＝スクシニルフルオレッセイン、ＮＭＲ
＝核磁気共鳴スペクトル、ＩＲ＝赤外吸収スペクトル、
ＵＶ＝紫外スペクトル又は検出、ＴＬＣ＝シリカゲル上
での薄層クロマトグラフィー、ａＣ＝ガスクロマトグラ
フィー、ｍｐ＝融点、ｍｐｄ＝分解を伴う融点、ｂｐ＝
沸点。
ＮＭＲデータを記載するにあたり、化学シフトはｐｐｍ
で示し、結合定数Ｊはヘルツで示した。全ての融点は補
正していない、イオン交換樹脂は使用前に適当な水性溶
媒及び有機溶媒で洗った。ここて記載する全ての化合物
の同一性は、適当なスペクトル的及び分析的手法により
確立された。他に断りかない限り、シリカゲル上でのク
ロマトグラフィーによる精製は、スチルら、　Ｊ、　Ｏ
ｒｇ、　Ｃｈｅ■、。
４３、２９２３−２９２６　（１９７８）に従った。
よ」目１１ ５０５ｎｓ蛍光標識スペ一サー活性化エステル中間体の
調製 Ａ、９−　（カルボキシエチリデン）−３，６−シヒド
ロキシー９■−キサンチン（ＳＦ−５０５）のＷ製しゾ
ルシノール（３３，０ｇ、　０．３００モル）と無水コ
ハク酸（３０，０ｇ、０．３（１０モル）とを丸底フラ
スコに入れ、窒素でパージした。メタンスルホン酸（１
５０ｉ＋１）を加え、溶液を６５℃で２時間窒素雰囲気
下でかくはんした０反応混合物を、激しくかきまぜてい
る氷冷水（１Ｍ）に−滴づつ加え、これと同時に５０％
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを２．５±０．５に
保持した０粒状の沈殿として現われた生成物をろ過して
集め、水（３Ｘ　１００■ｌ）で洗い１次にアセトン（
３ｘ　１００ｍ１）て洗った。生成物を空気乾燥し、次
いでｌｌＯｏＣて１８時間真空乾燥（真空炉）すると、
暗赤色の粉末（３７，７ｇ、　８８％）が得られた。
１．０ｇの生成物を熱い０．３Ｎ　１（Ｃ１２’Ｓｍｌ
に溶解することによって分析試料を調製した。冷却する
ことによって形成された沈殿をろ過によって除き捨てた
。薄い水酸化ナトリウムを加えてｐ）Ｉを１．２５に上
げた。得られた沈殿をろ過によって集め、水ですすぎ１
、空気乾燥し、　Ｐ２Ｏ５上で１４０℃で３６時間真空
乾燥した。
元素分析二計算値［（：（１６９［１２）０（５）１　
Ｃ６７，６０゜ＩＩ　４．２６゜ 実測値：Ｃ６，：１７．Ｈ４，３４，０，５２％水（Ｆ
−Ｋ）、　　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ　）：（殆どスピ
ログラム型）６２．６９０（ｔ、　Ｊ＝８．６　ｈｚ、
　２８）；　３．０７０（ｔ、　Ｊ−８，６ｈｚ、　２
１１）。
６．５３０（ｄ、　　ＪＪ、８　　ｈｚ、　　２Ｈ）、
　　６．６７６（ｄｄ、　　Ｊ＝８．７゜１．８　　ｈ
ｚ、　　　２Ｈ）、　　　７．４３２（ｄ、　　　Ｊ　
ｌ１８．７．　　１．８　　ｈｚ　　２１１）。
Ｔｒｉｓ／ｊｌｃＩ）：最大４８６ｍｎ（７２，６００
゜８、　９−（２−カルボキシエチル）−３，６−ジア
セドキシー９−エトキシ−９■−キサンチン（Ａｃ２Ｅ
ｔＳＦ−５０５）の調製 ５Ｆ−５Ｏ５（２９，３ｇ、　１０：ｌ　ｍ５ｏｌ）を
氷冷無水酢酸（５００ｓ＋１）に加え５次にピリジン（
１００ｍｌ）を加えた。混合物を水中で２０分かきまぜ
１次に氷冷水（了見）に迅速にかきまぜながら２０分間
にわたって加えた。さらに３０分間かきまぜた後、中間
生成物をろ過し、水（４見）に再懸濁し、さらに３０分
間かきまぜた。固体をろ過によって集め、絶対エタノー
ル（１１）に溶解し、４５分間還流した。この溶液を回
転蒸発＝上で２００ｍ１に蒸留すると結晶化した。生成
物をろ過によって集め、空気乾燥し１次いで真空乾燥し
て薄オレンジの微結晶（２１，９ｇ、　５Ｈ）を得た。
塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶すると、無色
の微結晶が得られた。
１１、Ｐ−：　１４２−１４：１℃０元素分析：　Ｃａ
１ｃ。
［Ｃ（２２）Ｈ（２２）０（８）１　Ｇ　６，６３．７
６、　Ｈ５，：＋５．実測値：Ｃ６３，５８，１（５，
３９，ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）：　δ１．０３５　（
ｔ、　Ｊ−６，９ｈｚ、３Ｈ）、　　１．６６７　　（
ｊ　　２８）、２．２３２°ｍ、２Ｈ）、２゜２９４　
（ｓ、６１１）、　２．８８８（ｑ、　Ｊ＝６．９　ｈ
ｚ、　２Ｈ）、　７．０−７．１（ｍ、４Ｈ）、　７．
５７５　（ｄ、Ｊ−９，１ｈｚ、２Ｈ）。
Ｃ，９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニル
））−エチル−３，レジアセトキシ−９−エトキシ−９
）１−キサンチン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５Ｏ５−ＮＨ３）
の製造Ａｃ２ＥｔＳＦ−５０５（１０，４ｇ、　２５．
１　ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３００ｍｌ）及び１−
（３−ジメチル−アミノプロピル）−３−エチルカルボ
ジイミド・塩酸塩（９，７０ｇ、　５０．６　ｓｍｏｌ
）と混合し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４，３２
ｇ、　３７．５膳■ｏｌ）を加えた。
この混合物を１時間かきまぜ、水（５ｘ　５０ｍ１）て
洗った。１つにまとめた水層を塩化メチレン（５０ｍｌ
）て逆抽出し、プールした有機層を硫酸ナトリウム上で
乾燥し、引きはがした。エタノール（７５ｍ＋）でつき
砕き、ろ過し、空気乾燥すると、淡黄色の固体として粗
生成物が得られた（約１０ｇ）、この物質を塩化メチレ
ン（５０ｍｌ）に溶解し、シクロヘキサン（５０ｍｌ）
を加えた。スプーン１杯のチャコールを加え、混合物を
ろ過し、生成物を追加的なシクロヘキサン（１００ｍｌ
）てつき崩した。ろ過による回収、空気乾燥及び真空乾
燥により無色の結晶（６，９４ｇ、５４ｚ）か得られた
。
エタノールからの第２の結晶化によって分析試料が得ら
れた。
禦、ｐ、：　１６２−３℃９元素分析：計算値　。
［Ｃ（２６）Ｈ（２５）Ｎ（１）０（１０）Ｉ　　Ｃ６
０，７８，Ｈ５，０１，Ｎ２．６５．　ＩＩ、　４．９
３．　Ｎ　Ｚ、７４．実測値：　Ｃ６０，７８゜ＩＩ　
　５．０１．Ｎ　　２．６５．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、
）：　　δ　１．０５６　　（ｔ。
Ｊ！７．Ｏｈｚ、３１１）、２．４−２．１　　（ｉ＋
、４Ｈ）、２．２９３　　（ｓ。
６Ｈ）、　　２．７５７　　（ｓ、　　４Ｈ）、　　２
．９２２　　（Ｑ、Ｊ−７，Ｏｈｚ、　　２Ｈ）。
７．０６９　　（ｍ、　　４１１）、　　７．６１７　
　（ｐ　ｄ、　　ＪＩＩ９．１　　ｈｚ、２Ｈ）。
０　、９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−＜ベンジロキシカ
ルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６−
ジアセドキシー９−エトキシ−９１１−キサンチン（Ａ
ｃ２ＥＬＳＦ−５０５−３ａｒ−ＯＢｎ）の調製 塩化メチレン（５０ｍｌ）中のザルコシンベンジルエス
テル”　（１，１：ｌ　ｇ、　６．１３５ｓｏｌ）にＡ
ｃ２ＥｔＳＦ−５０５−ＮＨ３（２，５８ｇ、　５．０
５　ｔｓｏｌ）及び５％炭酸水素ナトリウム水溶液（３
０ｍｌ）を加えた。この２相混合物を２０時間激しくか
きまぜた０層を分離し、有機層を３　ｘ　ｌＳｍ１の水
て洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、２５ｍ１に濃縮し
た。この溶液をシクロヘキサンで１５０１に希釈し、チ
ャコール処理し、窒素気流下で７５１に濃縮すると生成
物か沈殿した。上清をデカンテーションにより除き、残
渣を塩化メチレンと共蒸発させると無色の泡（１，７０
ｇ、　５８％）が得られた。
激しく真空乾燥すると分析試料か得られた。
本ザルコシンベヌジルエステルｐ−）シレート塩（アダ
ムス・ケミカル・カンパニー）を塩化メチレンに取り、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液で繰り返し洗い１次いで
水て洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピング
した。
Ｅ　、　９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ’−スクシ
ンイミジロキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エ
チル）３．６−ジアセドキシー９−エトキシ−９Ｈ−キ
サンチン（Ａｃ２ＥｔｓＦ−５０５−りａｒ−ＮＨ３）
の製造Ａｃ２ＥＴＳＦ−５０５−３ａｒ−ＯＢｎ　（１
，５５ｇ、　２．６９５ｓｏｌ）の絶対エタノール（６
０ｍｌ）溶液に１０％のカーボン上パラジウムを加えた
。この混合物を水素の風船圧力下で３０分間かきまぜた
。触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッピン
グするとシロップ状の残渣が得られた。
この残渣を塩化メチレン（８５ｍｌ）に溶解し、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（０，４９５ｇ、　４゜：１０
ｍ５ｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチル−カルボジイミド・塩酸塩（１，１２ｇ、　
５．８４ｍ５ｏｌ）を加えた（４　ｘ　２５　ｍｌ）　
、この溶液を２５ｍ１に濃縮し、シクロヘキサンで１７
５１に希釈し、チャコール処理し、窒素気流下て７５１
１に濃縮した。固体生成物をろ過によって集め、空気乾
燥し、真空乾燥すると無色の粉末（０，９７ｇ、　６２
％）か得られた。
塩化メチレンと共蒸発し、４０’Ｃて激しく真空乾燥す
ると痕跡量のシクロヘキサンか除去され、非晶質固体と
して分析試料か得られた。
元素分析：計算値：　ＩＣ（３２）Ｈ（’：１３）Ｎ（
１）Ｏ（９０Ｇ６６．７７、　ＩＩ　５．７８．　Ｎ　
２．４３．実測値：　Ｃ６６，６６、Ｉｔ５８．８９．
　Ｎ　２．２５．　ＮＭＲ（ＤＩＳＯ−ｄ６）：　（ア
ミド結合ロータマーの　５：２混合物を示す、）δ　（
主および副）　１．０４０および１．Ｑ１８　（ｔ、　
Ｊ＝６．７　ｈｚ、　３１１）。
１．７８９　１．６７０　（ｊ　２Ｈ）、　２．２１１
　　（ＩＩ、　２ｔｌ）、　　２．２９０と２．２７６
　　（ｓ、　　６８）、　　２．７１３と　２．６９５
　（ｓ、　　３１１）、　　２．８９３（ｑ、　Ｊ＝６
．７　ｈｚ、　２Ｈ）、　３．９６３　（ｓ、　２１１
）、　５．０７５と５．０：＋９　　（ｓ、　　２Ｈ）
、　　７．４４　　（ｍ、　　４８）、　　７．コ２４
　　（ｍ、　　５１１）。
７．５７３　７．５１６　（ｐ　ｄ、　Ｊ−７，２ｈｚ
、　２１１）。
及ム亘ユ ５１２　ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体
２．４−ジヒドロキシベンシルアルデヒト（３３，９７
ｇ、　０．？４６５ｏｌ）　（トルエンから再結晶した
）を、ガス入口と泡立て出口とか嵌合された丸底フラス
コ中て３文の分光グレードの２−プロパツールに溶解し
た。カーボン１１０％パラジウム（１，３５ｇ）を加え
、次いで３ｔｌのリン酸を加え、混合物を窒素てパージ
した。窒素流を水素に代え、混合物を水冷しながら激し
くかきまぜた。３時間後、水素の取り込みか完了し、触
媒をろ過によって除去した。ろ液をストリッピングして
２００１にし、２００１の酢酸エチルを加えた。溶液を
４ｘ２００１の水で洗い、１つにまとめた抽出物を酢酸
エチルで逆拙出した。これらの有機抽出物を水で洗い、
１つにした有機層を硫酸ナトリウム上て乾燥し、ストリ
ッピングすると無色の結晶固体（２９，９５ｇ、　９８
りとして生成物か得られた。
Ｍ、Ｐ、：　１０５℃　（Ｌｉｔ、　１０６−１０７℃
【ジェイ・シー・ベル、ダブりニー・ブリッジ、および
ニー・ロハートソン、Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、　
１５４２−４５（１９３７）］、ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ
ｓ）：　δ　１．９１ｒｌ　（ｓ、　Ｍｅ）。
６．０７６　（ｄｄ、　Ｈ−６，Ｊ［Ｓ、６］　＝　８
　ｈｚ、　　Ｊ［２，６］　＝　２ｈｚ）、６．２３１
　　（ｄ、Ｈ−２）、６．７６０　　（ｄ、Ｉｔ−５）
　　８．８６７（ｓ、　　ＯＨ）、　　（１，［ｌ［１
８（ｓ、０１１）。
８．９−カルボキシエチリデン−３，６−ジヒドロキ２
二りと一区ｌｊ二Ｌ」±］コＬ乙ヱ詠」μ上」１八化星
１４−メチルレゾルシノール（２５，８ｇ、　０．２０
８■０１）と無水コハク酸（２０，８ｇ、　０．２０８
　ｍｏｌ）を丸底フラスコに入れ、フラスコを窒素でパ
ージした。１５０ｍ１のメタンスルホン酸を加え、溶液
を窒素下で６５℃まで２時間加熱した。溶液を１１の、
激しくかきまぜられた氷冷水に一滴づつ加え、これと同
時に５０％の水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを２
．５±０．５に維持した。生成物を遠心によって集め、
水で３回、アセトンで２回洗った。固体を空気乾燥し、
次に１１０℃て真空乾燥すると、レンガ、赤色の粉末が
得られた（２４．１ｇ、７４駕）。
酢酸エチルをゆっくりと生成物のジメチルスルフオキシ
ド溶液中に拡散させることによりて生成を行なった。沈
殿をろ過によって集め、空気乾燥し、真空乾燥した。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｓ）：　（ｔモルの水及びジメチ
ルスルホキシドと共に純粋なデルタ型を示す、）　６２
．１２４　（ｓ、６＋１）、　、：１．４２１　（ｄ、
　Ｊ−７，２ｈｚ、　２Ｈ）、５．７６９（ｔ、　Ｊ＝
７．２　ｈｚ、　ＩＨ）：　６．５１２　（ｓ、　ＩＨ
）、　６．５７３　（ｓ、。
Ｉｆｆ）：　７．２９５　（ｓ、　２Ｈ）、　９．６８
１　（ｓ、　ＩＩＩ）、　９．８２５　（ｓ。
ＩＨ）、　　１２１４６　（ｂｓ、　ＩＨ）、　　可視
吸光、　（ｐｈ　ａ、ｚａｑ　Ｔｒｉｓ）：最大４９３
．５　ｎｍ。
Ｃ，９−カルボキシエチル−３，６−ジアセドキシー２
．７−シメチルー９−エトキシ−９１１−キサンチン（
Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２）の３ｇ製 ５Ｆ−５１２（２０，０ｇ、　６４．０　ｍ５ｏｌ）の
試料を３５０１の無水酢酸に加え、次いて８０１のピリ
ジンを加えた。これを１時間かきまぜ、ろ過して痕跡量
の未反応染料を除去した。ろ液を３．５文の激しくかき
まぜられている水に注いだ、固体の中間体をろ過によっ
て集め、２文の冷水に再懸濁し、１５分間かきまぜ、次
いて再び集め、空気乾燥するとスピロラクトン中間体（
２０，８ｇ）が得られた。これを６００１の絶対エタノ
ールに溶解し、４５分間還流した。溶液をチャコール処
理し、３００ｍ１に濃縮した。生成物をろ過によって集
め、冷たいエタノールですすぎ（２ｘ　５Ｇｍｌ）、空
気乾燥し１次いて真空乾燥すると無色の微結晶か得られ
た（１４．９ｇ、　５３％）　。
Ｍ、Ｐ、：　１４３℃０元素分析：　計算値：ＩＣ（２
４）＋１（２６）Ｏ（８）Ｉ　Ｃ６５，１５，Ｈ５，９
２，実測値：Ｃ６５、：ＩＩ、　Ｈ５，９７，ＮＭＲ（
ＤＭＯ３−ｄａ）：　ａ　　１．０２７　（ｔ、　Ｊ＝
６．９　ｈｚ、３Ｈ）、　１．６２８　（ｍ、　２ｔｌ
）、　２．１３６　（ｓ、６１１）。
２．２０７　（ｓ、２Ｈ）、　２．３０３　（ｓ、　６
１１）、　２．８８４　（ｑ、　６．９ｈｚ、　２１１
）、　６．９３９　（ｓ、　２Ｈ）、　７．４１７　（
ｓ、　２１１）。
Ｄ　、　９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシヵルボ
ニル）−エチル）−：ｌ、６−ジアセドキシー２．７−
シメチルー９−エトキシ−９Ｈ−キサンチン（＾ｃ２Ｅ
ＬｓＦ−５１２−ＮＩＩＳ）の調製Ａｃ２ＥｔＳＦ−４
１２（９，４２ｇ、　２１．３５ｓｏｌ）の塩化メチレ
ン（１７５ｍｌ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（：１．６２　ｇ、　３１．５　ｍｍｏｌ）を加え、直
ちに１−（：ｌ−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミド　・　塩酸塩（Ｒ，ｎへ　ワ　　Ａ）
　ｎ　−一へ１）　ルｈ「盲÷　ｔ、７　　の溶液を室
温て２時間かきまぜた、この混合物を水で洗い（４ｘ　
１０１１０１ｌ、水性洗清を塩化メチレンで逆抽出した
（２　ｘ　５０　ｍｌ）　、　１つにまとめた有機層を
硫酸ナトリウム上て乾燥し、ストリッピングして油状物
質にした。絶対エタノールを加え、ひっかくことによっ
て結晶化を誘導した。生成物をろ過によって集め、空気
乾燥し、次いで真空乾燥することにより、薄オレンジ色
の微結晶（９，８０ｇ。
８５ｚ）が得られた。
１ｇの生成物を１０＋＋＋１の塩化メチレン中に溶解し
、４０ｍ１のシクロヘキサンを加えることによって分析
試料を調製した。チャコール処理し、冷却し、ひっかい
て結晶化を誘導すると、無色の結晶固体が得られた。
Ｍ、Ｐ、：　１５９℃０元素分析：計算値、　［Ｃ（２
８）Ｈ（２９）Ｎ（１）Ｏ（１Ｇ）Ｉ　Ｃ６２，３３，
Ｈ５，４２，ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）：　δ１．０５
：ｌ　　（ｔ、　　Ｊ＝６．９　　ｈｚ　　：ｌＨ）、
　　２．１４９　　（ｓ、　　６１１）。
２、：１０４　（ｓ、　６１１）、　２．１−２．４　
（ｍ、　４Ｈ）、　２．７４７　（ｓ。
４Ｈ）、　２．９２０　（ｑ、　Ｊ！６．９　ｈｚ、２
Ｈ）、　６．９７５　（ｓ、　２１（）。
７．４６４　（ｓ、　２）１）。
Ｅ　、　９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシ
カルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６
−ジアセドキシー２．７−シメチルー９−エトキシ−９
１１−キサンチン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２−３ａｒ−
ＯＢｎ）の調製ザルコシンベンジルエステル（０，７２
ｇ、　４．０２■ｏｌ）の塩化メチレン（２５ｍｌ）溶
液にＡｃ２ＥｔＳＦ−５１２−ＮＨ３（１，７３ｇ、　
　：１．２１　　ｗ＋５ｏｌ）　　Ａｃ２ＥｔＳＦ−５
１２−ＮＩＩＳ（１，７３ｇ、　：１．２１　ｍｍｏｌ
）及び５％炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍｌ）を加え
た。この２層混合物を２０時間激しくかきまぜた０層を
分離し、有機層を３ｘＩＳｍｌの水で洗い、硫酸ナトリ
ウム上で乾燥し、１０ｍ１に濃縮した。溶液をシクロヘ
キサンて６０１に希釈し、チャコール処理し、窒素気流
下で２５ｍ１に濃縮すると、生成物の沈殿か得られた。
上清をデカンテーションし、無色固体を真空乾燥した（
１２．４４　ｇ、　７４％）。
塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶し、チャコー
ル処理して分析試料を得た。
Ｌｐ、：　１５．０−２℃０元素分析：計算値、　［Ｃ
（３４）！＋（３７）Ｎ（１）０（９）Ｉ　Ｃ６７，６
５Ｈ６，１８Ｎ　２．３２．　　実測値：Ｃ６７，４２
ＩＩ　６．０８　Ｎ　２．３：１．　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ
−ｄａ）　：　（アミド結合ロータマーの５＝２の結合
を示す、）　δ　（主および副）　１．０４９　１．０
０８　（ｔ、　Ｊ−６，８ｈｚ、　３１１）。
１．７４７　　１．６６　　（ｍ、　　２Ｈ）、Ｉ　　
２．１４４　　２．１１５　　（ｓ、　　６１１）。
２．１８　　（ｓ、　　２１１）　　２．３１４　２．
３０３　　（ｓ、　　６Ｈ）、　　２．６９４（ｓ、　
３Ｈ）、　２．９０７　２．１１８４　（ｑ、　ＪＩ−
６；、８ｈｚ、　２Ｈ）。
３．９６１　（ｓ、　　３１１）、　　５．０７５　５
．０１６　（ｓ、　２Ｈ）、　６．９６０６．９１７　
　（ｓ、　　２Ｈ）、　　７．４３０　７．：１９［ｉ
　　（ｓ、　　２８）、　　７．３０（ｍ、　５Ｈ）、
　　Ｆ、　９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ’−スク
シンイミジル−オキシカルボニルメチル）カルボキサミ
ド）エチル）−：ｌ、６−ジアセドキシー９−エトキシ
−２，４，５，７−テトラメチル−９Ｈ−キサンチン（
Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２−３ａｒ−ＮＨ３）の調製Ａｃ
２ＥｔＳＦ−５１２−３ａｒ−ＯＢｎ　（０，４５ｇ、
　０．７４５　ｍｏｌ）の絶対エタノール（２０ｍｌ）
溶液に１０％のカーボン上パラジウム０．０５ｇを加え
た。今後物を水素の風船圧力下で３０分間かきまぜた。
触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッピング
してシロップ状の残渣を得た。
この残液を２５−１の塩化メチレンに溶解し、Ｎ＝ヒＦ
ｏキシスクシンイミド（０，＋２９　ｇ、　１．１２ｓ
ｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルーカルボジイミド・塩酸塩（０，２９２ｇ、　１
．５２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０分間かきまぜ
、水で洗ワた（３　ｘ　ｉｓ■ｌ）、溶液を硫酸ナトリ
ウム上で乾燥し、１０１に濃縮し、シクロヘキサンで４
０１に希釈し、チャコール処理し、窒素気流下で２０■
１に濃縮した。上清なデカンテーションによって除き、
残渣を塩化メチレンから再沈殿させて無色の粉末を得た
（０．２７　ｇ、　４９％）　。
元素分析二計１１Ｉ値、　［Ｃ（３１）Ｈ（３４）Ｎ（
２）０（１１）Ｉ　Ｃ６０，９８，ＩＩ　５．６１．　
Ｎ　４．５９．　　実測値：　Ｃ６０，２８，ＩＨ５，
７１，Ｎ　４．４０．１．０８＄　　水（Ｋ−Ｆ）、　
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：　（アミド結合の５：ｌ混
合物を示す、）　δ（主および副）　１．０４３　（ｔ
、　Ｊｌ−７，Ｏｈｚ、　：１ｌＩ）、　１．７９：１
１．９３：ｌ　（ｍ、　２Ｈ）、　２．：１１４；　（
ｓ、　６８）、　２．７４０　（ｓ。
４１１）、　２．７７８　２．８２１　（ｓ、　３Ｈ）
、　２．９００　（ｑ、　Ｊ＝７．Ｏｈｚ、　２１１）
、　４．３３４　４．４６９　（ｓ、　２Ｈ）、　６．
９６０　６．９２５（ｓ、　２０Ｈ，７，４４１（ｓ、
　２Ｈ）。
実施例３ ５１９　ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体
Ａ、９−（２−カルボキシエチリデン）−：ｌ、６−シ
ヒドロキー／／−４，５−ジメチＪｌｚ−９Ｈ−キサン
チン（ＳＦ−５１９）（７）調２−メチルレゾルシノー
ル（：１７．２　ｇ、　０．３００ｍｏｌ）と無水コＡ
り＃（３０，０ｇ、　０１００　ｍｏｌ）とを丸底フラ
スコに入れ、窒素でパージした。１５０１のメタンスル
ホン酸を加え、溶液を窒素雰囲気下で６５℃で４時間か
きまぜた０反応混合物を。
激しくかきまぜられている氷冷水（ｉｌｌ）に−滴づつ
入れ、同時に５０％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐ
Ｈを６．０±０．５に維持した。細かく分割された固体
を遠心によって集め、水ですすぎ（４ｘ２５０　ａｔ）
、そのつと再懸濁し、遠心し、上清を捨てた。粗生成物
をｉｆＬの水に懸濁し、十分な５０％水酸化ナトリウム
水溶液を加えて９１１を１０．２に上げた。溶液をろ過
し、ろ液のｐＨを濃ＨＣＩで１．２にした。生成物を上
述のように遠心によって集め、水ですすぎ（３ｘ　３５
０−■）、アセトンですすいた（３　ｘ　２５０■り、
得られた固体をトルエンと共に共沸し、ろ過によって集
め、１１０℃で真空乾燥してレンガ赤色の粉末を得た（
２４．６　ｇ、　５３％）　。
元素分析：計算値、　ｔｃ（１８９）Ｈ（１６）０（５
）］　Ｃ６９，２２）１５．１６．　　実測値：　Ｃ６
，８，９５Ｈ５，３０，０，８０＄　　水（Ｋ−Ｆ）、
　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　（殆どデルタ型）：６２
．１６４　　（ｓ、　　　３Ｈ）、　　２．１７７　　
（ｓ、　　　：ｌｌ量）、　　　１３７６　　（ｄ。
Ｊ−７，１ｈｚ、　２Ｈ）、　５．７４９　（ｔ、　Ｊ
−７，２ｈｚ、　ＩＨ）。
６．６４２　（ｄ、　Ｊ＝８．８　ｈｚ、ＩＨ）、　６
．６７２　（ｄ、　ＪＩＩ８．８　ｈｚ。
１ｔｌ）、　　７．２１６　　（ｄ、　　Ｊ＝８．８５
　　ｈｚ、　　ＩＨ）、　　７．２２７　　（ｄ、　　
Ｊ−８，５ｈｚ、　ＩＨ）、　９．６０２　（ｂｓ、　
ＩＨ）、　９．７５８（ｂｓ、　１ｌｌ）。
可視吸光（ｐｈ　８．２；　５０ｍＭ　ａｑ　Ｔｒｉｓ
／１（ＣＩ）最大５００■ｎ　（８９，８００） ８．９−（２−カルボキシエチル）−３，６−ジアセド
キシー４．５−ジメチル−９−エトキシ−９Ｈ−キサン
チン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９）の調製 ５Ｆ−５１９（１５，０ｇ、　４８．０　ｍ５ｏｌ）を
２５０１の無水酢酸に加え、固体を粉砕した。（高度に
不溶性の５Ｆ−５１９を分散させるのに超音波処理が有
用である。）懸濁液を氷冷し、５０＠ｌのピリジンを加
え、混合物を２０分間かきまぜた。溶液をろ過し、激し
くかきまぜられている４Ｊｌの氷冷水にゆっくりと、し
かしながらしっかりとした流れとして加えた。さらに２
０分間かきまぜた後、中間生成物をろ過し、３党の水に
再ａＩＲし、さらに２５分間かきまぜた。固体をろ過に
よって集め、空気乾燥した。乾燥した中間体を６００１
の絶対エタノールに溶解し、１時間還流した。溶液を回
転蒸発器上で２００ｍ１に濃縮すると結晶化した。
生成物をろ過によって集め、空気乾燥し１次いで真空乾
燥すると無色の微結晶が得られた（１２．１３ｇ、　５
７％）。
塩化メチレンからシクロヘキサンで沈殿化することによ
り分析試料を調製した。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：　δ　　１．０３３　　（
ｔ、　　ＪＩＩ６．９　　ｈｚ、　　コＨ）。
１．６７４　（ｓ　２Ｈ）、　２．１８９　（ｓ、　６
Ｈ）、　２．１９　（＋ｓ、　２■）。
２．３４８　　（ｓ、　　６Ｈ）、　　２．８７１１　
　（ｑ、Ｊ電６．９　　ｈｚ、　　２Ｈ）。
７．００６　（ｄ、　Ｊ＝８．６　ｈｚ、　２Ｈ）、　
７．９３３　（ｄ、　Ｊ−８，６ｈｚ。
２■）。
Ｃ、’１−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル−３，６−ジアセドキシー４．５−ジメチ
ル−９−エトキシ−９日−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ
−５１９−ＮＨ３）の調製Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９（７
，８０ｇ、　１７．６ｍｍｏｌ）を１７５１の塩化メチ
レンと混合し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２，７
５ｇ、　２３．９　ｇａｏｌ）と１−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩（
７，００ｇ、　３６．５　ｇａｏｌ）を加えた。この混
合物を９０分間かきまぜ、水で洗った（５　ｘ　１００
ｍ１）　、　１つにまとめた水性層を塩化メチレンで逆
抽出しく２　ｘ　５０ｍ１）、プールした有機層を硫酸
ナトリウム上で乾燥し、ストリッピングしたｌｏｏｍｌ
のエタノールでつき崩し、ろ過し、空気乾燥して、淡負
色の固体を得た（７．４５ｇ、　７［）。
シクロヘキサン／塩化メチレンから２回再結晶し、チャ
コール処理することによって分析試料を得た。
補、ｐ、：　１６４−５℃６元素分析：　計算値。
（Ｃ（２８）Ｈ（２９）Ｎ（１）０（１０）Ｉ　　Ｃ＆
２．３コ、　　１　５．４２　　Ｎ２．６０．実測値：
　Ｃ６２，１７，Ｈ５，４７，Ｎ　２．４Ｂ、　Ｎ）Ｉ
Ｒ（ＤＭＳＯ−ｄａ：　　δ　１．０５１　（ｔ、　Ｊ
＝７．Ｏｈｚ、　３Ｈ）、　２．４−２．１ｍ（ｉ＋、
　　４８）、　　２．１９１　　（ｓ、　　６Ｎ）、　
　２．３３７　　（ｓ、　　６Ｈ）。
２、フＩｓ　　（ｓ、　　４Ｈ）、　　２．９１２　　
（ｑ、　　Ｊ＝７．ロ　ｈｚ、　　２１１）。
７．０１５　　（ｄ、　　Ｊ＝８．６　　ｈｚ、　　２
Ｈ）、　　７．４２９　　（ｄ、　　Ｊ−８，６ｈｚ、
２Ｈ） Ｄ、　９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカ
ルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６−
ジアセドキシー４．５−イヌチル−９−アセトキシ−９
Ｈ−キサンチン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９−３ａｒ−Ｏ
Ｂｎ）の調製１９−１の塩化メチレン中のザルコシルベ
ンジルエステル（Ｏ，５５７ｇ、　３．１１　ｍｍｏｌ
）の溶液に、Ａｃ２ＥｔｓＦ−５１９−ＮＨ３（１，コ
Ｏｇ、　２．４１　ｍ５ｏｌ）及び１５ｍ１の５％炭酸
水素ナトリウム水溶液を加えた。この２層混合物を１８
時間激しくかきまぜた０層を分離し、有機層を３　ｘ　
１０ｍ１の水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ｆｏ
ｗｌに濃縮した。溶液をシクロヘキサンて４０１に希釈
し、チャコール処理し、窒素気流下で２０１に濃縮して
ねばついた固体として生成物の沈殿を得た。上清をデカ
ンテーションで除き、残液を塩化メチレンと共に共蒸発
させて無色の泡（０，９７ｇ、　６７Ｘ）を得た。
激しく真空乾燥することによって分析試料を得た。
元素分析：計算値、　［Ｃ（３４）Ｈ（３７）Ｎ（１）
０（９）］（：　６７．６５１１６．１８　Ｎ　２．３
２．実測値：　Ｃ６７，４３Ｈ６，３７Ｎ　２．３２．
　８ＩＲ（ＤＭＳＯ−ｄｓ）　（アミド結合ロータマー
の５：２混合物を示す、）：　δ　（主および副）１、
［１４４１，０２０（ｔ、　Ｊ寧７．Ｏｈｚ、　３Ｂ）
、　１．８２４　１．７１４（ｓ、　　２Ｈ）、　　２
゜１７　（纏、　　２Ｈ）、　　２．１９５　　２．１
６９　　（ｓ。
６Ｈ）、　２．３４６　２．３３７　（ｓ、＋　６１１
）、　２．７２０　２．６９１（ｓ、　　３Ｈ）、　　
２．８８９　　（ｑ’、　　Ｊ＝７．Ｏｈｚ、　　２Ｈ
）、　　３．９５９３．９８８　（ｓ、　　２Ｈ）、　
５．０７３　５．０４８　（ｓ、　２Ｈ）、　７．００
０６．９４５　（ｄ、　Ｊ＝８．６　ｈｚ、　２１）、
　７．４５−７．２５　（ｍ、　７Ｈ）。
Ｅ、　）−（２−（２−Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ’−スク
シンイミジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド
）エチル）−３，６−ジアセト−オキシー４．５−ジメ
チル−９−エトキシ−９Ｈ−キサンチン（Ａｃ２ＥｔＳ
Ｆ−５１９−３ａｒ−ＮＨ３）の製造 ＾ｃ２ＥｔＳＦ−５１９−３ａｒ−ＯＢｎ　（１，３５
ｇ、　２．２４　ｍｍｏｌ）の絶対エタノール（Ｓ（１
＝１）溶液に１０％カーボン上パラジウムを加えた。こ
の溶液を水素の風船圧力下で２０分間かきまぜた。触媒
をろ過によりて除き、エタノールをストリッピングして
シロップ状の残渣を得た。
この残渣な５０ｍ１の塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（０，３９ｇ、　３．３９　ａｍ
ｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチル−カルボジイミド・塩−塩（１，５７ｇ、　８．
１９ｍ５ｏｌ）を加えた。この混合物を７５分間かきま
ぜ、水で洗った（４　ｘ　Ｉｓ　ｍｌ）、この溶液を硫
酸ナトリウム上で乾燥し、２５１に濃縮し、シクロヘキ
サンで１２５ｍ１に希釈しチャコール処理し、窒素気流
下て５０１に濃縮した。上清をデカンテーションし、残
留した油状物質を５１の塩化メチレンに取り、激しくか
きまぜられた７５１のシクロヘキサンに一滴づつ加えて
無色の粉末を得た（０．５８７ｇ、　４３％）　。
分析試料を得るために、生成物の一部を塩化メチレンに
取り、モレキュラーシーブ上で乾燥し、窒素気流下で蒸
発させ、最後に五酸化リン上で４８℃で乾燥乳鉢中で乾
燥した。
明細吉の浄♂（内容に変更なし） 元素分析　計算値（Ｃ（３１）Ｉ（（３４）Ｎ（２）　
０（１１））　　：Ｃ８０，９８Ｈ５，６１，Ｎ４．５
９゜実値：　Ｃ８０，１５Ｈ５，７１Ｎ　４．５１　　
水（Ｋ−Ｐ）４．６９１．５１％　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−
ｄＢ’）　　（７ミド結合ロータマーの４＝１混合物を
示す）：δ（主及び副）１．０３９　　（ｔ　、　Ｊ−
６，９ｈｚ、　８Ｈ）　、　１．８４１　ａｎｄ　１．
９４５（＋ｅ、　２Ｈ）、　２．１９（ｍ、　２Ｈ）、
　　２．１９４（ｓ、　６Ｈ）。
２．３４５　（ｓ　、　８Ｂ）　、　２．７６７　ａｎ
ｄ　２．７４４　　（ｓ　、　４Ｈ）　。
２．７７８　ａｎｄ　ＳＦ、Ｊ１２５　　（ｓ　、　３
Ｈ）　、　２．８８８　　（ｑ　、　Ｊ−８，９ｈｚ、
　２Ｈ）　、　４．３２８　ａｎｄ　４．４６１　　（
ｓ　、　２１１）　。
７．０００　　（ｄ　、　Ｊ−８，８ｈｚ、　２Ｎ）　
、　ａｎｄ　７．４１０　　（ｄ　。
Ｊ＝８．８　ｈｚ、　２Ｈ）　。
実施例４ ５２６　ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体
の調製 Ａ、２．４−ジヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒ
ドの調製 リンオキシクロリド（８０ｍｌ、　０．８６鳳ｏ１）を
かきまぜられているＮ−メチルホルムアミド（１０２ｍ
ｌ。
０．８２　ｍｏｌ）のエーテル（２ＳＯｍｌ）溶液に加
えた。混合物を室温で１時間かきまぜ、次いて水中で冷
却した。２−メチルレゾルシノール（アルドリッチ、１
００　ｇ、　０．８１　ｍｏｌ）を加え、この混合物を
一夜かくはんしながら室温まで昇温させた。沈殿した中
間生成物をろ過によって集め、エーテルで３回すすいだ
、この中間体を２５０１のアセトンと２５０１の水の混
合物中で溶解することによって加水分解し、３０分間か
きまぜた。２Ｊｌの水を加え、混合物を沸凰させ、放冷
して結晶性生成物を被着させた。これを４Ｊｌの水から
再結晶させて純粋な生成物を得た（７０ｇ、　５ｉｔ）
。
Ｍ、ｐ、　　１５０・Ｃ（Ｌｉｔ。
１５２−３”Ｃ（Ｗ、Ｂａｋｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、２８３４−５ＩＨ）、　　１０．
７４５　　（ｓ、　　ＩＨ）、ａｎａ　　１１．ｓ９２
　　（ｇ、　　１Ｂ）。
Ｂ、２．４−ジメチルレゾルシノールの調製２．４−ジ
ヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒド（３０，０ｇ
、　１９７　ｍｍｏｌ）のイソプロパツール（３皇）溶
液をマグネティックスタラ−を含む５文の３首フラスコ
中で氷冷した。４１のリン酸と１０％カーボン上パラジ
ウムとを加え、溶液を先ず窒素で、次いて水素でパージ
した。取り込みが完了したと判定された時点（約１．５
時間）で溶液を再び窒素でパージし、次いでセライト（
登録商標）でろ過した。溶媒をストリッピングで除き、
残渣を酢酸エチルに取り、得られた溶液を水で洗りた（
４　ｘ　１００■ｌ）、水洗液を酢酸エチルで逆抽出し
、１つにまとめた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、
ストリッピングしだ、昇華（９５℃、０．０５トル）す
ると無色固体が得られた（１９．６　ｇ、　７２２）　
。
Ｍ、Ｐ、１０７−ａ・Ｃ（Ｌｉｔ。
１０ｇ−１０９”ｃ　［Ｌ　Ｂａｋｅｚ　＠ｔ　ａｌ、
、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　２８３４−５Ｃ，
９−（２−カルボキシエチリデン）　−，３、６−ジヒ
ドロキ−／−２，４，５，７−−ｉ？トラメチ）ｂ−９
Ｈ−キサン７−ン（ｓｒ−５２６）の調 ２．４−ジメチルレゾルシノール（２８，４ｇ、　０．
２０５ｍｏｌ）と無水コハク酸（２０，Ｏｇ、　０．２
００　ｍｏｌ）を丸底フラスコに入れ、窒素でパージし
た。２３１ｉ＋１のメタンスルホン酸を加え、溶液を窒
素雰囲気下で７０℃で２０時間かきまぜた０反応混合物
を激しくかきまぜられている水酸化ナトリウム水溶液（
１，５０ｍ１の水中に９５ｇ）と氷（３１）との混合物
に一滴づつ加えた。十分なメタンスルホン酸れた固体を
遠心によって集め、遠心し、水からデカントした（５　
Ｘｌ、２１）。最終的な懸濁液をろ過によって集め、空
気乾燥し、１１０℃で６時間炉中で乾燥してレンガ赤色
の固体（３０，６ｇ、　４４％）を得た。
アルカリ性溶液から再結晶させ、遠心し、水洗して分析
試料を得た。
Ａｎａｌ：Ｃａｆｅ、　［Ｃ（１Ｂ）Ｈ（１２）Ｏ（５
）］Ｃ７０，５７。
Ｈ５，９２，Ｐｏｕｎｄ　：　Ｃ７０，３９、Ｈ８，０
０，０，２１ｇｖａｔｅｒ（Ｋ−Ｆ）、　ＮＭＲ（ＤＭ
ＳＯ−ｄ６）　　（はぼスピロラクトン型）：６２．１
７２　　（ｓ　、　　１２Ｈ）　、　２．５０８　　（
ｍ　。
２Ｈ）　、　３．３４２　　（ｍ　、　２Ｈ）　、　ａ
ｎｄ　７．８０４　　（ｓ　、　２Ｈ）　。
Ｖｌｓ、　ａｂｓ、　　（ｐＨ８，２：５０ｇＭａｑＴ
ｒｌｓ／ＩＩｃＩ　”）　　：５０９　ｎｍ　（７１，
３００）　。
Ｄ、　９−（２−カルボキシエチル）−３，６−ジアセ
ドキシー９−エトキシ−２，４，５，７−テトラメチル
−９Ｈ−キサンチン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２８）の調製
５Ｆ−５２６（２５，２ｇ　、　７４　ｓ＋ｍｏｌ）を
４５０　ｍｌの水冷無水酢酸に加え、次いで１００１の
ピリジンを加え、混合物を氷冷しながら１５０分間かき
まぜた０反応混合物をろ過し１次いでゆっくりと。
しっかりした流れとして、７１の激しくかきまぜられて
いる氷冷水に加えた。さらに３０分間かきまぜた後、中
間生成物をろ過し、水で洗い、４１の水中に再懸濁し、
さらに３０分間かきまぜた。
固体をろ過によって集め、空気乾燥して２８．９　ｇの
スピロラクトン中間体を得た。この中間体（１８，６ｇ
）の一部を１１の絶対エタノールに溶解し、９０分間還
流した。この溶液を回転蒸発器上で３００１に濠縮する
と結晶した。生成物をろ過によって集め、エタノールて
すすぎ、空気乾燥し１次いで真空乾燥すると無色の微結
晶が得られた（１１．６　ｇ、用いた中間体の量を基準
として５２％）。
塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶させ、チャコ
ール処理を行なうことによって無色の微結晶か得られた
。
Ｈ５，９２，Ｐｏｕｎｄ：　　Ｃ７Ｇ、３９．Ｈ８，０
０，０，２１ｇ　　ｗａｔｅｒ（Ｋ−Ｆ）　、　ＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−ｄ６”）　　（はとんどスピロラクトン型
）：６２．１７２（ｓ　、　１２Ｈ）　、　２．５０８
　　（ｓ　。
２Ｈ）　　、　　３．３４２　　（ｍ　、　　２Ｈ）　
　、　　ａｎｄ　　７．８０４　　（ｓ　、　　２Ｈ）
　　。
Ｖｌｓ　、　　ａｂｓ　、　　（ｐＨ８，２：５０　ｍ
Ｍ　ａｑ　Ｔｒｌｓ／ＨＣＩ　　）　　：５０９　　ｎ
ｍ　（７１，３００）。
Ｅ、　９−（２−（Ｎ−スクシニンイミジロキシヵルボ
ニル）−エチル）−３，８−ジアセトキシ−９−エトキ
シ−２，４，５，７−）ジメチル−９１１−キサンチン
（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６−ＮＨ３）の−製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６（４，７０ｇ、　９．９９ｉｓ
ｏｌ）を７５１の塩化メチレン及び１−（３−ジメチル
−アミノプロピリル）−３−エチルカルボジイミド拳塩
酸塩（ＬｌＧｇ。
ｌＢ、２ｍｍｏｌ）と混合し、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（１，５０ｇ、　１３．０　ｇａｏｌ　）を加え
た。この混合物を９０分間かきまぜ、水で洗った（４　
Ｘ５０ｍ１）。
１つにまとめた水性層を５０１の塩化メチレンで逆抽出
し、プールした有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ス
トリッピングした。７５−１のエタノールと共につき崩
し、ろ過し、空気乾燥すると淡黄色の固体として粗生成
物が得られた（約４−７ｇ）　＊この物質を５０ｍ１の
塩化メチレンに溶解し、５０ｍ１のシクロヘキサンを加
えた。茶さじ１杯のチャコールを加え、この混合物をろ
過し、生成物をさらなる２５−１のシクロヘキサンに取
った。ろ過によりて回収し、空気乾燥し、真空乾燥する
と無色の結晶が得られた（３．１４　ｇ、　５５％）　
。
シクロヘキサンを含む塩化メチレンから再沈殿すること
によって分析試料を得た。
Ｆ　、　９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシ
カルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６
−ジアセドキシー９−エトキシ−９１１−キサンチン（
Ａｃ２ＥｔＳＦ−５Ｏ５−３ａｒ−ＯＢｎ）の・製 ザルコシンベンジルエステル（０，７２ｇ、　４．０２
ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（４０ｍｌ）溶液に、　Ａｃ
２ＥｔＳＦ−５２６−ＮＨＳ　（１，８２ｇ、　３．２
１　ｍ５ｏｌ）と３０−鳳の５％炭炭水水素ナトリウム
加えた。この２相混合物を２０時間激しくかきまぜた０
層を分離し、有ＩａＰＪを４ｘ　Ｉｓ　ｓｏｌの水で洗
い、硫酸ナトリウム上て乾燥し、１５１１に濃縮した。
この溶液を１００１のシクロヘキサンて希釈し、チャコ
ール処理し、窒素気流下て５０１に濃縮すると生成物の
沈殿が得られた。ろ過し、空気乾燥すると無色の固体が
得られた（０．９６　ｇ、　４７２）　。
塩化メチレンと共に共蒸発し１次いで激しく真空乾燥す
ることによって分析試料を得た。
（Ｃ（３６）Ｈ（４１）Ｎ（１）Ｏ（９）］　ＧＣ６Ｂ
、４５．　Ｈ６，５４，Ｎ　２．２２゜Ｗｏｕｎａ＝　
　Ｃ６Ｌ２９．　Ｈ６，７０，Ｎ　２．．０７．　　）
ＪＭＲ（ＤＭＳＯＪ６）０、９−（２−（Ｎ−メチル−
Ｎ−（Ｎ’−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル
）カルボキサミド）エチル）＝３．６−ジアセドキシー
９−エトキシ−２，４，５，７−テトラメチル−９■−
キサンチン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６−８ａｒ−ＮＨ３
）の調製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６−３ａｒ−ＯＢｎ　（０，９６
ｇ、　１．５２　ｍ５ｏｌ）の絶対エタノール（４０ｍ
ｌ）溶液に０．１０　ｇの１０％カーボン上パラジウム
を加えた。この混合物を水素の風船圧力下で３０分間か
きまぜた。触媒をろ過によりて除き、エタノールイなス
トリッピングして除くとシロップ状の残渣が得られた。
この残液を４０１の塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ヒトロ
シキスクシンイミド（０，２６ｇ、　２．２６ｇａｏｌ
）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ル−カルボジイミド・塩酸塩（０，５９ｇ、　：１．０
８−ｍｏｌ）を加えた。この混合物を３０分間かきまぜ
、水て洗った（４　ｘ　１５　ｍｌ）　、溶液を硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、１５１に濃縮し、シクロヘキサン
で１００１に希釈しチャコール処理し、窒素気流下で５
０１１に濃縮した。生成物をろ過によって集め、空気乾
燥し、真空乾燥すると無色の微結晶が得られた（０．５
７３　ｇ、　５９２）。
塩化メチレンと共に共蒸発し、４０°Ｃて十分に真空乾
燥すると痕跡量のシクロヘキサンが除かれ、非晶質の固
体として分析試料が得られた。
５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２°、３°−ジ
デオキシシチジン５°−三リン酸（５−ＡＰ３−ｄｄＣ
ＴＰ）の調Ａ、Ｎ−プロパラグリドリフルオロアセトア
ミド（Ｌりの調製 プロバラグリアミン（２４，７９ｇ、　０．４５０モル
。
アルドリッチ、９９％）をトリフルオロ酢酸メチル（６
９，１９ｇ、　０．５４０モル、１．２　ｅｑ、アルト
リ・ンチ）に１時間にわたって０℃で一滴づつ加えた。
０℃でさらに１時間かきまぜた後、１５ｃｍのビグレア
ークスカラムを介して蒸留すると、無色の液体として６
２．１２　ｇのトリフルオロアセトアミド１８が得られ
た。この物質はＮＭＲ及びＧＣにおいて均質であり、プ
ロバラグリアミンを無水トリフルオロ酢酸でアシル化す
ることによって調製された分光光学的に同一の物質と互
換的に用いた。
（Ｎ−Ｈ）、　１４３０．１３６５．１１６０．１０４
０．９９８．９１８．８５７．８２９゜フ７２．　　ａ
ｎｄ　　７２５゜ ８．５−イオドー２°、３°−ジデオキシシチジン（ロ
）の調製 ２°、３′−ジデオキシシチジン（２，１１ｇ、　１０
ｍｍｏｌ、レイロ−）及び酢酸第二水銀（３，３５ｇ。
１０．５　ｇａｏｌ、フィッシャー）の５０ｍ１メタノ
ール溶液を１９時間還流した。得られた白色の懸濁液を
５０１のメタノール及び１００ｍ１のジクロロメタンで
希釈した。ヨウ素（３，０５ｇ、　１２　ｇ＋５ｏｌ）
を加え、懸濁液を２５℃でかきまぜた。４時間後、遊離
塩基形態にあるＡＣ３Ｘ４Ａ樹脂（２０ｍｌ、　３８　
ｍｅｑ。
へイオラト）を加え、硫化水素を１５分間バブルした。
水銀（ｎ）の完全な沈殿をＴＬＣによって確認した０反
応物をフィルターエイトを介してろ過し、このフィルタ
ーエイトをｌ＝１メタノール−ジクロロメタンで洗った
。ろ液Ｌｏｇをシリカゲル上で蒸発させ、これを１５０
ｇのシリカゲルカラムの頂部においた。５％、１０％、
及び２０％メタノールジクロロメタン溶液で溶離すると
、無色の結晶固体として２．１９ｇ　（８３％）のヨウ
素化物１９か得られた。沸膳水か６２回再結晶し、５０
℃で真空乾燥すると、大きな分析的に純粋なプリズム（
−Ｐ：　ｄ　１７８℃）が得られた。
ＩＨ，Ｓ’ＯＨ）、　　４．０４　　（ｍ、　　ＩＨ，
Ｈ４’）、　　３．フＳ　　（ｄａｄ、　　Ｊ、１２．
ｌ、　　５．２゜ａｎｄ　　２．９．　１Ｍ、Ｈ５’ａ
）、　　３．５３　（ａｔ、　　Ｊ＝１２．ｌ　　ａｎ
ｄ　　３．８．　　ＩＨ。
Ｈ５’ｂ）、ａｎｄ　　２．３−１．７　（ｍ、４Ｈ，
Ｈ２’　　ａｎｄ　Ｈ３’）、　　Ｃａ１ｃｕｌａｔｅ
ｄＣ，５−（３−トリフルオロアセトアミド−ｌ−プロ
ピニル）−２°、３１−ジデオキシシチジン（２０）の
調製アミノアルキレンのヨウ素化ヌクレオシドへの結合
の一般的手法 ５０１の３首フラスコにヨウ素化シチジン１９　（７７
０１ｇ、　２．００　ｍ５ｏｌ）及びヨウ化第−銅（７
６，２ｍｇ、　０．４００　＊＋ｍｏｌ、　０．２０１
！Ｑ、；アルドリッチ、ゴールトラベル）を入れた。フ
ラスコをアルゴンでフラフシュした後、乾燥ジメチルホ
ルムアミド（１０ｍｌ、アルドリッチ）を加えると、懸
濁されたヨウ化第−銅を含むヨウ素化シチジンの０．２
Ｍ溶液が得られた。Ｎ−プロバラジル−トリフルオロア
セトアミド（０，７０■１．６．００５ｓｏｌ、　３．
０ｅｑ）及びトリエチＪレアミン（０，５６ｍｌ、　４
．００　ｍｍｏｌ。
２、Ｏｅｑ、モレキュラーシーブ上に貯蔵）を注射器を
介して加えた。テトラキス（トリフェニルホスフィン）
パラジウム（０）　（２３１鶴ｇ、０．２０　ｍ５ｏｌ
。
ｏ、ｌｏ　ｅｑ）を乾燥箱中のガラスとン中で計量し、
反応混合物に加えた。ヨウ化第−銅を溶解すると、黄色
の溶液が得られ、これは数時間かけて徐々に暗色になっ
た。ＴＬＣにより、出発物質が完全に消費されたことが
確認されるまで反応を進行させた。４時間後１反応物を
２０　ｍ−１のｌ：ｌメタノール−ジクロロメタンで希
釈し、強塩基性アニオン交換樹ＩＩＩ　Ｏ＜イ：ｔ　５
１’　、　ＡＧＩＸ８．２．０　ｇ、約６　ｅｑ、）の
炭酸水素型を加えた。約１５分間かきまぜると、ガスの
発生が止まった。３０分後２反応混合物をろ過し、樹脂
をｌ：１ジクロロメタン−メタノールで洗った。１つに
したろ液牙回転蒸発器で急速に濃縮した。（ジメチルホ
ルムアミドを除去するのに、４５℃、２トルで約１０分
間かかった。）残渣を直ちに１５０ｇのシリカゲル上で
。
１０％、１５％、及び２０％メタノールジクロロメタン
溶液を用いたクロマトグラフィーにより精製した。適当
な両分から溶媒を除去すると、６５１ｍｇ（９０％）の
アルキルアミン２０が薄黄色結晶性泡として得られ、こ
れはＴＬＣ及びＮＭＲにおいて均質であった。同様な調
製工程からの生成物は、元素分析によりヘミハイドレー
トであることが確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯＪ　）：　９．９６　（ｂｒｏ
ａｄ　ｓ、　ＩＨ。
（ｌ〕、１００）ａｎｄ　　２９５．５　　（９，３０
０）、　　　Ｃａ１ｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｚＤ、トリス
（トリス−Ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の調製 ビロリン酸四ナトリウム・ｌＯ水塩（４，４６ｇ。
１０　ｍｓ＋ｏｌ）を最小量の水（約５０■ｌ）に溶解
し、水に注がれｔ＝　ＡＧＬＯＷ　Ｘ８４＃脂（１００
−２００メツシユ、４ｘ　１０　ｃｖ＊ベツド）カラム
を通した。カラムを水で溶離し、溶離された液をその９
Ｈが中性に近づくまで水冷フラスコ中に回収した。トリ
ー〇−ブチルアミン（アルドリッチゴールトラベルし、
７，１鳳１．３０ｍ５ｏｌ）を溶離された液に加え、全
てのアミンが溶解されるまで２相を激しくかくはんした
。（すられた溶液を凍結乾燥した。残渣を無水ピリジン
で２回共蒸発し、無水ジメチルホルムアミドで１回共蒸
発した。残液を１０ｍ１の無水ジメチルホルムアミドに
溶解し、得られた１、０　Ｍ溶液を、使用時まて（１力
月）アルゴン下で０°Ｃで貯蔵した。
Ｅ、５−（：ｌ−アミノ−１−プロピニル）−２°、３
°−ジデオキシシチジン５′−三リン酸（５−ＡＰ３−
ｄｄｃｔＰ）の調製、保護されたアルキルアモノヌクレ
オシドをその対応する２°−三リン酸に転化し、トリフ
ルオロアセチル保護基を除去するための一般的手法アル
キルアミノヌクレオシド２０　（：１６１ｍｇ。
１．００■−００をリン酸トリメチル（２，０＠亀、ア
Ｊレドリッチゴールトラベル）にアルゴン下でかきまぜ
から、炉で乾燥したフラスコ内て溶解した。この溶液を
一１Ｏ℃に冷却し、リンオキシクロリド（０，０９３ｍ
ｌ、　１．００　ｇａｏｌ、アルドリッチゴールトラベ
ル １０℃で３０分間かきまぜた後、第２のリンオキシクロ
リド（０．０９３　ｓＬ　１．（１０　ｍｍｏｌ）を加
え，溶液をかきまぜならら２５℃までゆっくりと昇温さ
せた．反応混合物の一部をＩＮ水酸化物水溶液で冷却し
．ＨＰＬＣで分析した．対応するヌクレオチド−リン酸
への転化が最大である時に（この場合，第２のリンオキ
シクロリトノ添加から１００分後）、反応混合物を予め
一ｌＯ℃に冷却したトリス（トリス−ｎ−ブチルアンモ
ニウム）ピロリン酸溶液（上述の１．０　Ｍ無水ジメチ
ルホルムアミド溶液６．０　ｍｌ）に−滴づつ加えた．
溶液をアルゴン下でかきまぜなからゆつくりと２５℃ま
で昇温させた．１００分後、反応溶液を予め０℃に冷却
したトリメチルアミン（１．４　’ｍｌ）の水（ｆＯｍ
＋）溶液にゆっくりと加えた。溶液を氷冷しながら１５
分間かきまぜ、約２℃で一夜放置した。
２５℃、０．５トルでの真空蒸発によって揮発物を除去
した．残渣を再び７５１の水に溶解し。
１）ｐ１１７．６、１．０滅　ＴＥＡＲ水溶液（３００
ｍｌ）　　、　　２）１．Ｏ　Ｍ炭酸水素カリウム水溶
液　（：１００　ｍｌ）　、及び：ｌ）ｐＨ７、６，　
０．Ｉ　Ｍ　ＴＥＡＢ水溶液（：１００ｍｌ）で予め平
衡化されたＤＥＡＥ−セファデックスＡー２５ー１２０
カラム（２．６　ｘ　６５　ｃ■ベツド）に架けた．カ
ラムをｐｕ７．６のＴＥＡＲ水溶液の０．１　Ｍ　（１
文）から１．０　Ｍ　（１文）の直線勾配て溶離した，
１２分毎に両分を回収しながら、カラムを１００ｍｌ／
ｈで操作した。溶離は２７０ｎｍ　（４０　ＡＵＰＳ）
の吸光度によって監視した．所望の物質は，勾配の終末
付近に、良く分離された主なバンドとして溶離された．
生成物含有画分をプールし、濃縮しく　３　０　”Ｃ未
満において）、絶対エタノールと共に２回共蒸発した．
残渣を２０．４　ｍｌの水に取り，、凍結乾燥した。
この中間生成物を１２．５ｍｌの水に取り、１２．５ｍ
ｌの濃水酸化アンモニウムを加えた．３．５時間かきま
ぜた後，溶液をアスピレータ−で吸引しながら２時間か
きまぜて過剰のアンモニア−ガスを除去し、次いで凍結
乾燥した．残渣を９１（７．６のＱ．Ｉ　ＭＴＥＡＢ水
溶液１水溶液１濱 衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５−１２０　
（１．６　ｘ５５　５ｍベツド）に取った．カラムをＴ
ＥＡＢの０．１　Ｍ（’２８０’　ｍｌ）から１．０　
Ｍ　（２８０　ｍｌ）の直線勾配で，６１づつ画分を回
収しながら溶離した．生成物は単一の主たるピークとし
て溶離した。純粋生成物を含むと見積られる両分（＠３
９−４５）をプールし、濃縮しく３０°Ｃ未満）、絶対
エタノール（Ｚｘ）と共に共蒸発し、９．８■ｌの水に
取った。この溶液をＵＶ吸収及びＨＰＬＣで分析し、凍
結乾燥した。
生成物の希溶液は、　ｐＨ８，２の５０　ａＭＴｒｉｓ
ｌｉ衝液中で、２４０ｎ■及び２９３．５ｎ■に吸収極
大を示した。生成物の吸光係数が出発物質のそれ（９３
００）と同一であると仮定すると、２９：１．５Ｈｍで
の吸光度を基準とする５−ＡＰ３−ｄｄＣＴＰの収量は
０．３２　＋ｓｗｏｌ（：１２％）であった、最終生成
物のＩＩＰＬｃ　（シー八ツクＸ　ＳＡＸ、　０．２１
　ｐＨ５，５’）ンｍｆＪ　リ’）ム水溶液、２７０ｎ
■てのモニタリング）において、本質的に単一のピーク
（〉９９％）が認められた。
Ｈ５’ａ）、、　　４．ｌｆｌ　　（ｄａｄ、　　Ｊ−
１２，５，５ａｎｄ　　３．　　ＩＨ，Ｈ５・ｂ）、　
　４．０３６ａｔ　　２４０　　ａｎｄ　　２９１５　
　ｎｎ。
友ｉｆＬ旦 ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’、３°−ジ
ブオキシラ’）　シン５°−三リン酸（５−ＡＰ３−ｄ
ｄＵＴＰ）　（７）調製Ａ、５−ヨードー２°、３−ジ
デオキシウリジン（２１）の調製 ジデオキシウリジン（２，１２２ｇ、　１０．０−層ｏ
１）を３０ｍ１の温メタノールに溶解し、２５℃に冷却
した後、−塩化ヨウ素（４，０６ｇ、　２５　ｍ５ｏｌ
、　２．５　ｅｑ。
フィッシャー）のメタノール（２０園１）溶液に５分間
にわたって加えた。暗い紫色の反応混合物を窒素下で５
０°Ｃの水浴中で２０分間加熱し１次いで直ちに氷水槽
中で冷却した。かきまぜずに１６５分間放置した後、得
られた沈殿をろ過によって集め、冷メタノールで洗った
（２　ｘ　１０　ｍｌ）−一夜真空乾燥すると２．２３
２　ｇ　（６Ｈ）のヨウ素化物主ユが灰色がかった白色
の微結晶として得られた。この物質をさらに精製するこ
となく次の反応で用いたか、他の沈殿はクロマトグラフ
ィー又は沸騰メタノールからの再結晶（：ｌＯｍｌ／ｇ
）で精製して、白色の針状結晶（■ｐ　ｄ　１６Ｇ−１
６４℃）を得た。ＮＭＲにより、粗沈殿は均質であるこ
とが示されたが、また５°−ヒドロキシプロトンは痕跡
量の不純物によって触媒される交換の故に非常に幅広で
あった。クロマトグラフィー処理した又は再結晶した物
質のスペクトルは、このプロトンが通常、鋭い三重線で
あることを示した。
３．７５．　ａｎｄ　３．５３　（ｍ、　ＩＬ　Ｉｓ’
）、　２．２６．２．０２　ａｎｄ　１．６４　（ｍ。
４Ｈ，Ｈ２’ａｎｄ　Ｈ３’）。
Ｂ　、　５−（３−）リフルオロアセトアミド−１−プ
ロピニル）−２°、３°−ジデオキシウリジン（■）の
調製実施例５Ｃの一般的方法に従って、ヨウ素化ウリジ
ン２１をＮ−プロパルジルトリフルオロアセトアミトに
３時間かけて結合した。０〜５％メラフイーにより、Ｔ
ＬＣにおいて均質であるが乾燥させることが困難な物質
が得られた。この生成物をクロロホルムと数回共蒸発し
、真空乾燥すると、５３Ｂ、５鵬ｇのアルキニルアミノ
ヌクレオシド２２が白色泡として得られた。この物質は
ＴＬＣにおいて均質であり、少量のクロロホルムを含む
ことを除いてＮＭＲにおいて純粋であった（３９ｓｏ１
％、補正収率６６％）。
ｌＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄＢ）：　１１．８１（ｓ　
、　　ＬＨ，　Ｈａ）　。
１Ｇ．（１７　　（デソーテッド　ｔ　、　ＩＨ，　Ｎ
ＨＴＰＡ）、　８．３５（ｓ　、　　ＩＨ．　Ｈｅ）　
、　７．２８　（ｓ　、　０．８９Ｈ　、　ＣＤＣｌ２
）　。
５、８９　（ｄｄ．Ｊ＝６．８　ａｎｄ　８．２．ＬＨ
　、旧’　）　、　５．１５（ｔ　。
Ｊ−５．２　　、　　ＬＨ．　　５°　ＯＨ　　）　　
、　　４．２２　　（ｂｒｏａｄ　　ｄ　　、　　２Ｈ
。
−ＣＨ２Ｎ−）　、　４．０４　（ａｐｐａｒｅｎｔ　
ｈｅｐｔ　、　Ｊ−３．５　、’ＩＨ。
Ｈ４°）　、　３．７Ｌ　ａｎｄ　Ｌ５Ｂ　（ｍ　、　
ＩＨ，　Ｈ５°）　、　２．２Ｂ。
２、０３　ａｎｄ　１．８４　　（ｓ　、　４Ｈ，　Ｈ
２°ａｎｄ　Ｈ３°）。
ＴＬＣ（９５　；　５ジクロロメタン−メタノール）２
溶離ｖｖ）出発コラ素化物２１　　Ｒ，−０．３７：生
成物２　２　０．２８　：触媒０．９５及び０．８０及
びわずかにＣ．５−（３−アミノ−１−プロピニル）−
２°，コ１ージデオキシウ！ｊジ：ｚ５’−　ＥＩＪン
酸（５−ＡＰ３−ｄｄＵＴＰ，　２３）の調製 ０、３０　ｓ■ｏｆのアルキルアミノヌクレオシド２２
を対応する三リン酸に転化し、そのトリフルオロアセチ
ル基を実施例５Ｅの一般的手法に従って除去した．第２
のリンオキシクロリドを加えた後，リン酸化を２１０分
間進行させた。生成物の吸光係数が出発物質のそれ（１
３０００）と等しいと仮定すると，王リン酸２３の、２
９１．５ｎｓにおけるＵｖ吸光に基づく収率は１８％で
あった。
裏ム亘１ ７−（３−アミノ−ｌ−プロピニル）−２°，３°，−
ジデオキシグアノシン５°−三リン酸（７−＾Ｐ３ーｄ
ｄｃ７ＧＴＰ）の調製 Ａ．６−メドキシー２−メチルチオ−９−（３，Ｓ，−
ジ−ローｐ−トルイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル）−７−デアザプリン（２りの調製 エフ・シーラとアール・リッチャ−、Ｃｈｅ＋ａ。
Ｂｅｒ．、　１１１．　２９２５　（１９７８）の手法
に従って，６−メドキシー２−メチルチオ−７−デアザ
プリン９．２ｇを調製し、これを無水ピリジン１５０１
中に溶解して共沸的に乾燥し、３０〜３５℃で蒸発乾固
した．この物質を室温下で窒素下で４５０ｍｌの無水ア
セトニオジル中に懸濁し、水酸化ナトリウム（２．１６
　ｇの油中６０％懸濁液）をかきまぜながら加えた。
４５分後、ｌ−クロロ−２−デオキシ３．５−ジー０−
ｐ−　）ルイルーαートリボルラノース（１８．６ｇ，
エム・ホラファー、Ｃｈｗｅｍ．　Ｂｅｒ．、　９３．
　２７７７　（１９６０））に従って調製）を２０分間
にねたうて，３回に均等に分けて加えた．反応混合物を
さらに４５分かきまぜた後、１１の酢酸及び３００１の
ジクロロメタンを加えた．混合物を、フィルターエイト
を介して吸引ろ過し，ろ液を蒸発乾固した．残渣をベン
ゼンに溶解し、この溶液を水で２回洗い、塩水で１回洗
った．有機層を硫酸ナトリウム上で蒸発させた後、残渣
な４００１のメタノールに溶解し，結晶化させると、無
色の結晶（ｍｐ；１［１’６−１０７”Ｃ）　トシテ１
９．２４ｇ（７３．８Ｋ）　（１）リボシル化生１＆物
２４が得られた．　　　　　　　　　′この物質の試料
を少量のメタノールを含むジクロロメタンから再結晶さ
せると融点１３０−１３１℃の結晶が得られた。
Ｃ．６−メドキシー２−メチルチオ−９−（５−０−ト
リフェニルメチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル）−７−デアザプリン（！りの調製ジオール２　５
　（７．２　ｇ）を無水とリジンに溶かして共沸的に乾
燥し，この溶液を３５℃で蒸発乾固した．残渣をｌｏｏ
ｍｌの無水リジンに溶解し、ａ．ｏｇのトリフェニルメ
チルクロリド、４．０１１のトリエチルアミン、３００
■ｇの及び４−（ジメチルアミノ）ピリジンを加えた０
反応混合物を窒素下で６５℃で３０分間加熱した後、　
１．０　ｇの第２のトリフェニルメチルクロリドを加え
、１６．５時間加熱を続けた。冷却後、反応混合物をａ
Ｃｔ、、残渣をジクロロメタンと水との間で分配した。
水層をジクロロメタンで抽出し、１つにまとめた有ａ層
を０．３Ｎ塩酸、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩水で
洗った。硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した後粗生成
物を、シリカゲル上で０％、１％、１．５ｚ、及び２％
のメタノールジクロロメタン溶液を用いてクロマトグラ
フィーすると、無色のガラスとしテ１２．１　ｇ（９４
，５％）　（１）−ｆ：）　）　！Ｊ　ｆ）Ｌｔ：ｔ−
−チル２６が得られた。
（ｍ、　　１１（ＩＩ　Ｈ４’）、　　６．４０　　（
ｄ、　　Ｊ−４，ＩＨ，Ｈ７）、　　６．６１１　　（
ａｐｐａｒｅｎｔｔ、　Ｊ−７，１Ｈ，８１’）、　７
．００　（１，Ｊ−４，ＬＨ，Ｈ８）、　７．２７　ａ
ｎｄ？、４：ｌ　（ｍ、　ＩＳＨ，ｔｒｉｔｙｌ　Ｈ）
。
Ｄ、６−メドキシー２−メチルチオ−９−（５−０−ト
リフェニルメチル−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボ
フラノシル）−７−デアザプリン（Ｕ）のｍ製１２．１
　ｇのトリチルエーテル２６．９．２ｇの４−ジメチル
アミノピリジン、及びフェニルクロロチオカルボネート
（７，５ｍｌ　、アルドリッチ）の無水ジクロロメタン
（２２０ｍｌ）溶液中を２５℃で２時間窒素下でかきま
ぜた。ＴＬＣ分析が反応の完了を示したのて４．０１の
フェニルクロロチオノカルボネートを加え、反応混合物
をさらに１時間かきまぜた。この溶液を２８０ｍ１のジ
クロロメタンで希釈し、次いで５００　ｍ１７７）０．
５　Ｎ塩醋、ｓｏ。
ｍｌの０．５Ｎ塩酸及び塩水で洗った。有機層を硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、蒸発乾固した。
得られた粗チオカーボネートを３５０ｍ１の無水トルエ
ンに溶解し、３５０■ｇのアゾイソビスブチロニトリル
とｆｏａｌの水酸化トリー〇−ブチルスズを加えた。得
られた溶液をＺｏｏ−１０５℃で１０分間加熱した。冷
却後、溶液を少量のエーテルで希釈し、３５０１の１０
％フッ化カリウム水溶液と共に振盪した。２層をフィル
ターエイトを介してろ過して暗いスラッジを除去し、分
離した。有ａ層を０．７５Ｎの水酸化カリウムと塩水で
洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。得られた
油をシリカゲル上でｌ＝１ジクロロメタン−エーテルで
、次いでジクロロメタンでクロマトグラフィーすると、
９．９３　ｇ（８４，５％）のジデオキシヌクレオシド
２７が無色の固体（融点１２２〜１２４℃）として得ら
れた。
８４’）、　　６．３６　　（ｄ、　　！、３．７．　
　ＩＨ，Ｈ））、　　６．５３　　（ｄ１５．　　Ｊ、
）　ａｎｄ　４゜１Ｂ、　Ｈ１’）、　７．０９　（ｄ
、　Ｊ−３，７，ｌ）ｉ、　）１Ｂ）、　７．２５　ａ
ｎｄ　７．４５　（ｍ。
ＩｓＨ，ｔｒｉｔｙｌ　Ｈ）。
Ｅ、７−ヨートー６−メトキシー２−メチルチオ−９−
（５−０−トリフェニルメチル−２，３−ジデオキシ−
β−〇−リボフラノシル）−７−デアザプリン（挫）の
調製Ｎ−ヨードスクシンイミド（１０，０ｇ）を９．９
ｇのデアザプリンの無水ジメチルホルムアミド（５５゜
ｍｌ）溶液に加えた。暗所にて窒素下で１６時間かきま
ぜた後、　２．５　鳳ｌの１０％炭酸水素ナトリウム溶
液を加え、反応混合物を真空下で５０℃て１００ｍ１ま
で濃縮した。この溶液を水と酢酸エチルとの間で分配し
た。有機層を５％水酸化ナトリウム水溶液及び塩水で洗
い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。この僅かに
不純な生成物をシリカゲル上でジクロロメタンを用いて
クロマトグラフィーすると、無色のガラス状固体として
１１、［ｉ８ｇ（９５，５り　（Ｄヨ’７素化物２８が
得られた。
８４’）、６．４７　　（ａｄ、Ｊ−６ａｎａ　４．　
　ＩＨ，Ｈ１’）、７．１９　　（ｓ、ＩＨ。
８１１）、　　７．３０　　ａｎａ　　７．４６　　（
ｍ、　　１５Ｂ、　　　ト＋７９７ｂ　　Ｈ）。
Ｆ、７−ヨートー２−メチルチオ−９−（５−０−トリ
フェニルメチル−２，３−ジデオキシ−β−トリボフラ
ノシル）−７−ジアザプリー４−オン（２９）の調製１
当量のメトキシナトリウムなチオクレゾールのメタノー
ル溶液に加え、蒸発乾固することによってトリクレゾー
ル酸ナトリウムを調製した。
４．０ｇのメチルエーテル■、４．０ｇのチオクレゾー
ル酸ナトリウム及び１０ｍ１のへキサメチルフォスフォ
ラミドの無水トルエン（１５０ｍ１）中溶液を窒素下で
４．５時間還流した。冷却後、混合物を酪酸エチルと水
との間で分配させた。有機層を水及び塩水で洗い、硫酸
ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固した。得られた粗生成
物をシリカゲル上で、０％および２％メタノールジクロ
ロメタン溶液を用いてクロマトグラフィーに架けると、
無色のガラス状固体として３．８（ｌ　ｇ（９７，０１
）のデアザプリン２９か得られた。
（ｍ、　　２Ｈ，１（Ｓ’）、　　４＋２８　　（ｍ、
　　ＩＨ，Ｈ４’）、　　６．４０　　（ｄａ、　　Ｊ
−７ａｒｏ５　　ａ。
ＩＨ，Ｈ１’）、７．０５　　（ｓ、ＬＨ，Ｈｅ）、７
．３０　ａｎｄ　７．４６　　（ｍ、　　１ｓＨ。
ト１１牛ｉ　　　Ｈ）、　　１０．００　　（４’九ム
　　ｓ、　　ＬＨ，Ｈｌ）。
０．７−イオドー５°−〇−トリフェニルメチル−２°
、３゜−ジデオキシ−７−デアザグアノシン（３０）の
調製メタ−クロロパーオキシ安息香酸（１，２３ｇ。
８５％、アルドリッチ）を０℃で窒素下で、　３．５ｇ
のメチルチオエーテル且のい無水ジクロロメタン（１５
０ｍｌ）中溶液にかきまぜながら加えた。１５分後、冷
却槽を外し、かくはんを２５°Ｃて４０分間継続した。
この溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩水で洗い、
硫酸ナトリウム上で乾燥した。
メタノール（２体積％）を加え、得られた溶液をシリカ
ゲルの短いプラグに通して極性不純物な除明細書の浄吉
（内容に変更なし） 去した。得られた粗スルホキシド（３，０７ｇ）を４０
−１のジオキサンに溶解し、ガラス内張ボンベに入れた
。１０．０ｇのアンモニアを加え、混合物をオートクレ
ーブ中で１００℃で２時間加熱した。
得られた溶液を蒸発゛乾固した。残渣を２０１１６ジク
ロロメタン中に溶解し、フィルターエイドを介してろ過
した。４０１のメタノールを溶液に加え、冷却すると、
１．５７ｇの無色生成物が結晶した。母液を蒸発し、シ
リカゲル上で５％メタリールジクロロメタン溶液を用い
て中圧液体クロマトグラフィーにかけると、無色結晶と
してさらに３２８膳ｇの生成物が得られた。デアザグア
ノシン３０の総収量は１．９０ｇ　（５５，４％）であ
った。
’１１−ＮＭＲ、（ＣＤＣ１３、３◎ＯＭＨｚ）　　ｓ
　２．０５．２０２３゜ａｎｄ　　２．３５　（ｓ　、
４Ｈ，Ｈ２°　ａｎｄ　　Ｈ！１°）、　　８．２９　
（ａ　、　　２Ｈ。
Ｈ５°）、４．２８　（−、ＩＨ，Ｈ４°）、　　５．
９０．　　（ｂｒｏａｄ　ｓ　　。
ＩＨ，ＮＯ３）　、　６．２４　（ｄｄ、Ｊ−７ａｎｄ
　４．　ＬＨ，旧゛）。
６．９０　（ｓ　　、　　ＩＨ，Ｈ８）、７．８０　　
ａｎｄ　　７．４８　　（ｓ　　、１５Ｈ。
トリチル　Ｉ（）　ｌＯ，９Ｑ　　（幅広ｓ　、　ＩＩ
Ｉ、旧）。
この試料をメタノール−ジクロロメタンから再結晶させ
るとａｐ　２０１〜２０３℃の結晶が得られた。
Ｈ，２°、３°−ジデオキシ−７−ヨートー７−デアザ
グアノシン（３１，）の調製 トリチルエーテルｌ旦（１，７ｇ）のギ酸（１２■ｌ）
溶液を室温で１０分間かきまぜた。得られた黄色の懸濁
液を真空下で３０℃で急速に蒸発乾固した。
残渣をシリカゲル上で５％、７％及び１０％メタノール
ジクロロメタン溶液を用いてクロマトグラフィーに架け
ると、９４０鳳ｇの有色固体が得られた。この固体を、
少量のジクロロメタンを含むエーテルと共に突き崩すと
無色結晶として８３８ｍｇ（８１，Ｏｇ）のヌクレオシ
ド１ユが得られた。
１　、７−（３−トリフルオロアセトアミド−■−プロ
ビニル）−２°、３°−ジデオキシ−７−デアザクアノ
シン（昇）の調製 ヨウ素化１１１３１　（３７６ｔｓｇ、　１．００　ｍ
ｍｏｌ）を実施例５Ｃの一般的手法によって２．２５時
間てＮ−プロバラシルトリフルオロアセトアミドに結合
した。
生成物と出発物質とかＴＬＣによって識別不能てあった
のて１反応は逆相ＨＰＬＣ（（１０ｃｍ　ＯＤＳ、　１
ｍｌ／分、１００％水から１００％メタノールまでの５
分間にわたる勾配、次いで１００％メタノール。
２８０ｎｍでのＵＶ検出：ヨウ素化物３１から出発して
５．４９分−生成物基、５．７５分；中間体６．５８分
）によってモニターした。粗生成物はジクロロメタンに
あまり溶けなかったのて、クロマトグラフィーカラムに
架ける前に、５ｇのシリカゲル上に、ジクロロメタン−
メタノール溶液から濃縮した。２％、５％、７％、及び
１０％メタノールジクロロメタン溶液で溶離すると、黄
色の固体として３００墓ｇ　（７８％）のアルキルアミ
ノヌクレオシド３２か得られた。
１４９．９　（Ｃ２，Ｃ４ａｎｄ　Ｃ６）、　１２２．
６　（Ｃｌｌ）、　ｌｌｓ、９　’（ｑ、　Ｊ−２１１
８゜ＣＦコ）、　　９９．４　　ａｎａ　　９フ、５　
　（Ｃ）　ａｎｌ　　Ｃ５）、　　８４．２　　ａｎｄ
　７７．４Ｃ３’）、　　　’ この凰コＣ−ロＲデータは上述のようにしてｒ１４製さ
れり異する３２のバッチから得られた。
Ｊ、７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２°、コ゛
−ジデオキシ−７−デアザグアノシン５°−三すン鹸（
７−ＡＰ３−ｄｄｃ７ＧＴＰ）の調製 ０．９０ｍｍｏｌのアルキルアミノヌクレオシドを対応
する５°三リン酸に転化し、トリフルオロアセチル保護
基を実施例５Ｆの一般的手法に従って除去した。第２の
リンオキシクロリドを加えた後。
反応混合物をさらに１６５分間かきまぜた。生成　物の
吸光係数が出発物質のそれ（１１９０Ｇ）と等しいと仮
定すると、　７−ＡＰ３−ｄｄｃ７ＧτＰの収率は、そ
の２７２．５　ｎｓの吸光度に基づき１８％であった。
実１目１旦 ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２°、３゛−ジ
デオキシ−７−デアザアデノシン５′三リン酸（７−Ａ
Ｐ：１−ｄｄｅ７ＡＴＰ）の調製 Ａ、　　２°−アセトキシイソブチルブロミト（１９，
５ｍｌ、　１５０　ｇａｏｌ、　５ｅｑ、　　ルッセル
ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ。
Ｓｏｃ、、　９５．４０１６−４０３０（１９７３）の
手法に従って調製した）を無水アセトニトリル（２５０
ｍｌ、アルドリッチ）中に懸濁されたチュバーシジン（
７−ジアザアデノシン、６．６６　ｇ、　２５．０　ｍ
５ｏｌ、シグマ）に１５分間にわたって加えた。懸濁さ
れた固体は約５分間て溶け、反応混合物を窒素下で２５
℃で２２時間かきまぜた。反応混合物をリン酸水素二カ
リウム（４３，５５ｇ、　３００　＋＊ｍｏｌ、　６　
ｅｑ）の４００ｍ１水溶液に加えた。３０分間かきまぜ
た後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した（１　ｘ　４
００ｍ１及び２　ｘ　２００１）、１つにまとめた有機
層を硫酸マグネシウム上て乾燥し、蒸発乾固すると１４
．７３ｇ（１１８％）の白色泡か得られた。この物質は
、ＴＬＣにおいて、僅かに幅広の９５％以上のスポット
（ＵＶ検出）て明細書の浄δ（内容に変更なし） あるが、ＮＭＲでは１つの主生成物と少なくとも１つの
副産物が存在した。ＮＭＲスペクトルは、主生成物がブ
ロモアセテート３３であることと一貫していた。
”Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄＢ）　　（主成分３３に対
する）８．０８　（ｓ　、　Ｉｌｌ　１１２）　、　７
．３４　（ｄ　、　Ｊ−３，７、ＬＨ。
Ｈ８）　、　７．１２　（ｂｒｏａｄ　ｓ　、　２Ｈ，
Ｎｉ１２）　＋’　６．７０　（ｄ　。
Ｊ−３゜？　　、　　ＬＨ，１１７）　　、　　６．３
２　　（ｄ　　、　　Ｊ−３，８、ＬＨ，旧°）。
５．６１　（ｄｄ、　Ｊ＝２．４　ａｎｄ　３．８　、
　ＬＨ，８２’）、　４．８９　（ｄｄ。
Ｊ−２，４ａｎｄ　４．５　、　ＩＨ，Ｈ３°）、　４
．４３　（ｍ　、　１）１．　Ｈ４°）。
４．３５　（ｄｄ、　Ｊ−１２ａｎａ４．　ＩＨ，）１
５°ａ　）　、　４２９　　（ｄｄ。
Ｊ−１２ａｎｄ　７．　ＩＨ，Ｈ５°ｂ　）　、２．０
８　（ｓ　、３Ｈ９ＯＡｃ）。
２．００（ｓ　、　３）１．０Ａｃ）、　ａｎｄ　１．
４９（ｓ　、　８Ｈ，２ＣＨ３）Ｂ、　２°、３°−ジ
デオキシ−２°、３゛−ジデヒドロ−７−ジアザアデノ
シン（３４）の調製 亜鉛ダスト（２０ｇ、マリンクロット）をＩＮ塩酸（３
Ｘ５０ｍ１）　、水（２ｘ５ｈｌ）、２％硫酸第二銅（
２Ｘ　５０ｍ１）　、水（４Ｘ５０ｍ１）　、　エタノ
ール（３Ｘ　５０ｍ１）及びエーテル（２Ｘ　５０ｍ１
）で迅速に（全時間的約ｌＯ分）に洗うことによって亜
鉛−銅結合体を新たに調製した。それデれの洗称におい
て、亜鉛ダストを、これが懸濁されてるまでフリットろ
うと中でかきまぜ、洗液は亜鉛を空気にさらすことを最
小限に抑えながら吸引除去した。
上述の粗ブロモアセテート（１４，６３ｇ）を１５０１
の無水ジメチルホルムアミド（アルドリッチ）中に溶解
し、回転蒸発器（４５’Ｃ，２トル）で約２５ｍ１の溶
媒を除去した。新鮮な亜鉛−銅結合体（１４，６：Ｉｇ
、約９　ｅｑ）を加え、得られた懸濁液を２５℃で窒素
下でかきまぜた。亜鉛−銅結合体の品質に応して、この
反応は誘導期間及び／又は異なる速度を有するので、反
応はＴ　Ｌ　Ｃ（９０：９：１ジクロロメタン−メタノ
ール、濃水酸化アンモニウム；出発物質Ｒｆ　−０，４
５、生成物Ｒ，＝０．３９及び０．３６）により出発物
質か完全に消費されたことが示されるまで続けた。この
場合１反応は１５分内に完了した。１００分後、飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液７５１１を反応混合物に１０分
間にわたって慎重に加えた０反応混合物をフィルターエ
イトを介してろ過し、フィルターエイトをメタノールて
洗った（２　ｘ　５（１ｍ１）、１つにまとめたろ液を
蒸発乾固し、残渣を水（ＩＳＯｍｌ）と酢酸エチル（Ｉ
ＳＯｍｌ）との間で分配した。水層を酢酸エチルで抽出
しく２ｘ　１００ｍ１）　、　　１つにまとめた有機抽
出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮し、１時間真
空乾燥した。
得られた暗オレンジ半固体を１００１のメタノールに溶
解し１次いで２５１１の水及びレキシン２θｌ樹脂（２
９ｇ、　４．３　ｓｅｑ／ｇ、　５　ｅｑ水酸化物型）
を加えた０反応混合物を合計２１０分間還流した。　Ｔ
　Ｌ　Ｃ（８５：１３：２ジクロロメタン−メタノール
、ＩＩ水水化化アンモニウム中間体エステルＲｒ・０．
４９；最終生成物と、０．２４）による監視により、約
７Ｃ％転化した時点て反応が急速に停止したことが示さ
れた。そのため１６５分後にさらに２９ｇの樹脂を加え
た。冷却することなく、樹脂をろ過によって除き、、１
：１ジクロロメタン−メタノール（２ｘ　７５　ｍｌ）
で洗った。１つにまとめたろ液を蒸発乾固し、得られた
紫色の固体を沸騰イソプロパツール１５０１から再結晶
すると、灰色がかった白色の針状結晶（ｓｐ　２０５−
２０６℃）として３゜７７８ｇのオレフィン３４が得ら
れた。母液を２５−１に濃縮することによりて第２の０
．６３１ｇ（薄紫針状結晶■ｐ２０２−２０：ｌ　’Ｃ
）の生成物が得られた。
６．４３　ａｎｄ　６．０２　（ｂｒｏａａ　ａ、　Ｊ
、６．０．　ＩＨｅａｃｈ、　１２・ａｎａＨ３’）。
Ｃ，２°、３°−ジデオキシ−７−デアザアデノシン（
！りの′調製 ４５０１のバールボトルに３．８０　ｇメオレフイン３
４，７６１のエタノール、３８０ｍｇのいカーボン上１
０％パラジウム及び４０　ｐｓｉの水素を入れた。２５
℃で４．６７時間振盪した後、　１４．５ｐｓｉの水素
が吸着され、水素の取り込みは終了した。ＴＬＣ（８５
：１３：２ジクロロメタン−メタノール、濃水酸化アン
モニウム）で２回溶離；出発物質旦、　０．４５；生成
物且、　０．４８）により、単一の紫外線活性新規生成
物に完全に転化されたことが示された。触媒をフィルタ
ーエイトを介してろ過によって除去し、エタノールで洗
外した。ろ液から溶媒を除去し、−夜真空乾燥すること
によって白色泡として３．９８ｇ　（１０４％）のジデ
オキシヌクレオシト３５が得られた。ＮＭＲにより、生
成物は、８重量％のエタノールを含むことを除いて均質
であることが示された（９６％補正収量）、この物質の
同様なバッチは結晶化しにくく、無水溶媒で共沸的に乾
燥すると極め〜て吸湿性の物質になった。従って、この
物質を約１週間真空下で貯蔵し、ＮＭＲにより５重量％
以下のエタノールが含まれることか示された後に用いた
。この生成物についてａ察された結晶性の欠如及びスペ
クトル特性は、先にロビンソンら、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃ
ｈｅｗ、、　５５゜１２５９　’（１９７７）によって
示されたものと一致していた。
Ｄ、７−ヨード−２゛、３−ジデオキシ−７−デアザア
デノシン（旦）の調製 純度９５％のジデオキシヌクレオシト３５（２，９５ｇ
、　１１．９６　ｍｍｏｌ）の機械的にかくはんされて
いる溶液、無水酢酸ナトリウム（４，１３ｇ、　５０．
３ｍａ＋ｏｌ、４ｅｑ）及び酢醜第二水ｊＩ（３，８１
ｇ、　１１．９５ｍ＋ｎｏｌ、　１．００　ｅｑ、　　
フィッシャー、９９．９＄）の水（１９０＊Ｉ）溶液を
窒素下で６５℃で２時間加熱した。得られた水銀含有物
質の白色懸濁液を２５℃に冷却した後、ヨウ素（４，７
９ｇ、　１８．９蘭醜ｏ１゜１．６ｅｑ）と酢酸エチル
（１９０＊Ｉ）とを加えた。１時間後、懸濁された水銀
含有物質が消費され、透明な紫色の溶液か残った。２時
間後、６．：ｌＳｇの亜硫酸ナトリウムを加え、紫色が
消失した。３０分間かきまぜた後、硫化水素ガスをゆっ
くりと反応混合物中に１５分間バブルした。硫化第二水
ｍ＜黒色コロイド）及びヨウ素化物３６（白色粉末）が
反応混合物から沈殿した。水銀（ｎ）の完全な沈殿はＴ
ＬＣによって２つの主たるＵＶ活性スポットの１つか消
えることをモニタリングすることによって分析した０反
応混合物をフィルターエイトを介してろ過し、２つの層
に分離した。フィルターエイトを、ＴＬＣがさらなる生
成物が抽出されないことを示すまで沸騰酢酸エチルで洗
った（９ｘ　１０Ｇ　＋＊ｌ）。それぞれの酢酸エチル
抽出物を水層で洗った。１つにまとめた酢酸エチル層を
硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾固した。得られた
粗固体は空気に触れると赤くなった。この物質を３＝１
ジクロロメタン−メタノ−Ｊしく１００ｍ１）に溶解し
、遊離塩基型の弱いアニオン交換樹脂（５，０ｇ、バイ
オラドＡＧ３　Ｘ４Ａ、　２．９　ｍｅｑ／ｇ乾燥）を
加えた。硫化水素を赤い溶液中に１０分間バブルすると
、赤色か消えた。短時間暖めることによってわずかな曇
りを除き、溶液をシリカゲルの２ｃｍプラグ（１５ｇ）
を介して迅速にろ過した。シリカゲルをさらなる３：ｌ
ジクロロメタン−メタノール（１００１）で溶離した。
シリカゲル５０ｇをろ液に加え、硫化水素を１０分間バ
ブルした。溶媒をこの混合物から回転蒸発器で除き、シ
リカゲルを２００１のクロロホルムと共蒸発させること
によって「乾燥」させた、このシリカゲルを、窒素気流
で予め脱ガスしたシリカゲルカラム（５００ｇ）上に迅
速に架けた。窒素下で５％（６文）及び１０％（４ＩＬ
）メタノールジクロロメタン溶液で溶離すると、白色粉
末として２．９２　ｇ（６４％）のヨウ素化物３６及び
より極性の小さな４５６　ｍｇ（７，５りの７．８−シ
ョート−２°、３゛−ジデオキシ−７−デアザアデノシ
ンが得られた。主生成物を２００＊Ｉの沸騰酢酸エチル
から蒸発させると２．６２６ｇの白色針状物（ｓｐ　１
５８−１６０℃）が得られた。母液を１０−１に濃縮す
ると、薄赤色の針状物として第２の生成物が０．３９１
ｇ得られた（■ｐ　１５６−１５８°Ｃ＞　、両方の収
穫物はＮＭＲおよびＴＬＣにおいて均質であり、オレフ
ィン３４からの合計収率は６４％であった。
Ｅ、７−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピ
ニル）−２’−３−ジデオキシ−７−デアザデノシン３
７の調製 ヨウ素化物（７２０，３ｍｇ、２．００　ｇａｏｌ）を
９０分かけてＮ−プロバラジルトリフルオロアセトアミ
トに実施例５Ｃの方法により連結した。ジクロロホルム
中７％メタノールでクロマトグラフィーを行なうと、７
０５．８ｍｇ　　（９２χ）の生成物３７か灰色がかっ
た白色の粉末として得られた。これはＮＭＲ及びＴＬＣ
により、均質であることがわかった。洲巳酢酸エチル（
１０ｍｌ）から再結晶させると、３７２■ｇの白色結晶
（融点１６９−ｉ７１　”Ｃ）が得られた。
２．３７．２．１８　ａｎｄ　２．００　（ｍ、　４Ｈ
，８２’　ａｎｄ　）！］’）、　　ＴＬＣデオキシ−
７−ジアザアデノシン５°−ニリン酸（７−Ａｒ１−ｄ
ｄｃ７ＡＴＰ　）の調製 アルキルアミオンヌクレオシド３７　（１，００ｍｍｏ
ｌ）を対応する５°三リン酸に転化し、トリフルオロア
セチル基を実施例５Ｅの一般的手法に従って除去した。
第二のリンオキシクロリドを加えた後、溶液を１２０分
間かきまぜた。生成物の吸光係数が出発物質のそれ（１
２７０Ｇ）と等しいと仮定すると、２７９．５ｎｍの吸
光度に基づ＜　７−Ａｒ１−ｄｄｃ７ＡＴＰの収率は４
０％であった。
ｌＨ−ＮＭＲ（Ｈ２０）　：　７．９７　（ｓ、１１ｌ
、Ｈ２）　、７．８０（ｓ、ＬＨ，Ｈ８）、Ｂ、３３　
（ｓ＋　　、　　ＩＨ，■’）、４−４４　（ｍ　　＋
ＬＨ，Ｈ４°）、　　４０２７　（ｍ　　、　　Ｉｎ、
　　１１５°ａ）　　、　　４．１４　（ｍ　　、　　
ｉｌｌ。
オン（トリエチルアンモニウム）ビーク３’　Ｐ−ＮＭ
Ｒ（Ｈ２０）　：　−８，５９（ｂｒｏａｄ　ｄ　、　
Ｊ−２０，ＩＰ）　、　−９，５６（ｄ　、　Ｊ−２０
，ＩＰ）　、　ａｎｄ　−２１，３８（ｍ　、　ＩＰ）
　、　ＵＶ（ｐＨ８，２ａｑ　　Ｔｒｌｓ）：　　ｍａ
ｘｌｍａ　　ａｔ　　２３ｇ　　ａｎｄ　　２７９．５
　　ｎｍ実施例９ 光標識鎖ターミネータ−をｍ節するための一般的結合操
作 Ｔ−ターミネータ−；　５−（ＳＦ−５−５−３ａｒ−
Ａｒ１）ｄｄＵＴＰの調製 実施例６Ｃから（７）　７　ミン５−（Ａｒ１）ｄｄＵ
ＴＰ　（６０ルモル）を０．３００ｍ１の水に取り、０
．６００ｍ１のＤＭＦて６釈した。実施例ＩＥからの染
料標識剤Ａｃ２ＥｔｓＦ−５０５−３ａｒ−ＮＩＩＳ　
（７２ｍｇ、　１２６　マイクロモル）のＤ　Ｍ　Ｆ　
（０，６００ｍ１）溶液を加え、混合物を５０℃で４時
間かきまぜた。１．５１の濃アンモニア水な加え、フラ
スコにしっかりと栓をし、５０℃で２０分間加熱を継続
した。得られた赤い溶液を水で希釈し６０１にし、予め
２．０　Ｍ　ｐＨ７，７ＴＥＡＲ水溶液（５ｈ＋）及び
次いて０．２　Ｍ　ｐＨ７，７ＴＥＡＲ水溶液（５ｈｌ
）て平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡＡ−２５−
１２０（ｌに３５　ｃｔａベツド）カラムに架けた。カ
ラムをＴＥＡＲ水溶液ｐＨ７，７の直線勾配で溶離した
（０．２Ｍ（ＩＳＯ＋＊ｌ）→２．ＯＭ　（１５ｈｌ）
　）。カラムは１００ｍ１／時間て操作し、３分毎に画
分を回収した。溶離された液を５１０ｎｍにおける吸光
度により監視した（４０　ＡＩＪＦＳ）、　２つのより
少量の副産物ハンドか先ず溶離され、次いでベースライ
ンに近いレゾリュージョン（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）て
強いバントが溶離された。純粋な生Ｊ＆物を含むと見積
られる両分をプールし、３０℃未満でストリップし、絶
対エタノールと共に３回共蒸発し、少１（５，２ｍ１）
の水に取った。この溶液を可視吸光度によって分析しく
ｐＨ８，２，５０５Ｍ　ａｑ　Ｔｒｉｓ緩衝液）、凍結
乾燥した。
生成物の薄溶液は４９１ｎ■に吸収最大を示した。
遊離の染料吸光係数（７２６００）から計算した収量は
３１マイクロモル（５１％）であった。
追加的な蛍光標識鎖ターミネーター化合物を開示した一
般的手法に従って調製した。第１、表に転ける命名は上
述の実施例において：ｇＩ製され、＜ＤＮＡ配列決定に
有用な新規組成物を調製する一般的な手法により結合さ
れた蛍光標識スペーサー（例えば５Ｆ−５１２−３ａｒ
）及びジデオキシヌクレオチドリンカー（’Ａｐｊ−ｄ
ａＮｒｐ）を示す。
法　　　　　　　１ 舛 ／／／ Σ　　Σ　　ツ　　Σ　　Σ　　　　　　Σ宋ｆ４Ｎｌ
且 蛍光標識鎖ターミネータ−を用いた、修飾サンガー鎖伸
長プロトコールによるへクテリオファー３ＩＬｇのバク
テリオファージＭ１３■ｐ　１８　ＤＮＡ鋳型にューイ
ングランドバイオラブス；　０．２５＃Ｌｇ／ルｌ）と
６０　＃Ｌｇ　（−４０）ブライマー（二ニーイングラ
ントハイオラブス７．５　ｊＬｇ／ＪＬｒを４つの１゜
５ｍｌエッペンドルフプラスチック管のそれでれに入れ
た。それぞれのチューブを沸騰水中で２分間加熱し、湿
った氷上で５分間直ちに冷却した。室温で１秒パルスス
ピンの微遠心を行なった後、８ｇ＋の５ｘ反応緩衝液（
０，３Ｍ　Ｔｒｉｓ−８０１％ｐＨ８，：ｌ；０．２７
５　Ｍ　ＮａＣｌ；　３７．５　ｍＭ　Ｍｇ（：ｌｘ；
　２．５ｍＭジチオスレイトール）、ｌＯ終ｌの試薬グ
レート１１１Ｏ１ｌ終ｌの、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ及
びＧＴＰ含有（それぞれ２５ｐＭ）溶液、並びに１終１
の逆転写酵素（鳥ミニロブラストシスウィルス１ニュー
イングランドニュークリアー；　ｌｓｍ位／ｐ＋）をそ
れぞれのチューブに入れ、混合した。チューブを３７℃
て１０分間インキュベートした。実施例９の蛍光標識鎖
ターミネータ−の２００ｐＭ溶液４ａｔを４つのチュー
ブに加えた。１つの管が’−（ＳＦ５０Ｓ−３ａｒ−Ａ
ｒ１）ｄｄｃ７ＧＴＰ、他の管か？−（ＳＦ５１２−３
ａｒ−Ａｒ１）ｄｄｅ７ＡＴＰ、他の管が５−（ＳＦＳ
１９−３ａｒ−Ａｒ１）ｄｄｅＴＰ、及び他の管が５−
（ＳＦ５２６−３ａｒ−Ａｒ１）を受容した。管を４２
℃で３０分間インキュベートした。４つの管のそれぞれ
からの２２ｐ＋の混合物を準備し、予め試薬グレードの
水で洗った５−２５セレクト−Ｄスピンカラム（５プラ
イム→３プライム：フィラデルフィア）を通過させて取
り込まれなかった蛍光標識鎖ターミネータ−を蛍光標識
された、伸長されたＤＮＡストランドから分難した。カ
ラムの溶離物を回収し、真空乾燥した。
７０％エタノールを０．５１加え、管を５秒間遠心した
０次に管をマイクロ遠心基中て５分間遠心し、ＤＮＡベ
レットを真空乾燥し、９５％ホルムアミド−２５ｍＭＥ
ＤＴＡに再懸濁した。管を６５℃に７分間水浴中て加熱
し、ｌ０ＰＩのＤＮＡ試料を予めコンディショニングし
たポリアクリロアミド（８，：１Ｍ尿素及びＩ　ｘ　Ｔ
ＥＡＢＩ衝液を含むビス（１９：ｌ）ゲル（１５ｃｍ　
ｘ　４０　ｃｍ　ｘ　００３５　ａｍ）上にマイクロピ
ペットで滴下した。試料を２７ワツトで下記Ｂに記載し
たようにして電気泳動した。
Ｂ、蛍光標識ＤＮＡストランド電気泳動ゲルを２７ワツ
トの連続的電力（約２０００ボルト）に約３０分間、試
料を載せる前にさらすことによってゲルを予備コンディ
ショニングした。この間にゲルの表面温度を４９℃で安
定化した。
電気泳動中に、アルゴンイオンレーザ−（オムニクロム
、モデル５３２）によって垂直なゲルを、試料充填ウェ
ルの下２８ｃｍの領域を照射した。レーザーを４８８ｎ
ｍのラインフィルター（ハーアソシエート）を通し、そ
れによって他の波長かゲル内に入ることを排除した。ゲ
ル表面における最終的なレーザー出力は３５ｍＷて直径
的ｌ■１であった。
蛍光標識ＤＮＡストランドからの蛍光発光の検出は、２
つの光電子倍増管（ＰＭＴ；へママッＲ１６１２）によ
って−９５０ボルトのバイアスをかけて行なった。波長
選択フィルター（バーアソシエイツ）を蛍光発光と２つ
のＰＭＴの間に置いた。
この場合、ｌとのＰＭＴと連関した１つのフィルターは
４９６ないし５２８ｎｍの範囲の発光光線を通過させ、
一方、第２のＰＭＴと連関した他方のフィルターは５２
２ないし５５３ｎｍの範囲の発光光線を通過するように
選択した。さらに、繊維光学フェースプレート（インコ
ム）集光透孔を蛍光発光と波長選択フィルターとの間の
光路上に置き、約２２度未満の検出半角を制限した。予
備増幅した後、それぞれのＰＭＴからの信号を別々にデ
ジタル化し、データは両方のＰＭＴから同時に５秒毎に
得られた。デジタル化したデータを連続的データファイ
ルにシステムコントローラー（ヒユーレット−バラカー
ト９０００．モデル２０）を用いて貯蔵した。
Ｃ，バクテリオファージ１１３部分品列決定蛍光標識Ｍ
１３腸ｐ１８ＤＮＡストランドから電気泳動中の蛍光発
光から誘導されたデータを公知の方法により分析した０
例示のために、部分的なヌクレオシド配列を第２表に示
す。
ｗＳｚ表 Ｍ１３　ｍｐ　１８　　の部分的ヌクレオシド配列決定
塩基 数　　　ヌクレオシド　　　比率 ３　　　　　７　　　　　　０、１４ ４　　　　　　Ｇ　　　　　　　Ｏ，９０５Ｔ　　　　
　　　９．１９ ６　　　　　　Ａ　　　　　　　Ｏ，７８７Ａ　　　　
　　　Ｏ，７５ ８Ａ　　　　　　　０．８Ｇ ９　　　　　　Ａ　　　　　　　０．７５１［Ｉ　　　
　　　ＣＯ，３５ ＩＩ　　　　　　Ｇ　　　　　　　１．８８１２　　　
　　　Ａ　　　　　　　Ｏ，８９１３ＣＯ，３２ １４Ｇ　　　　　　　１．８８ Ｉｓ　　　　　　Ｇ　　　　　　　１．９２１６　　　
　　　　　　　　ＣＯ，３コ１７　　　　　　ＣＤ、３
６ １８　　　　　　Ａ　　　　　　　Ｏ，８１１９Ｇ　　
　　　　　１．８９ ２０　　　　　　Ｔ　　　　　　　Ｏ，１６このデータ
は、Ｍ１３■ｐｌａＤＮＡ中の４つのヌクレオシドのそ
れぞれに対応する。狭い、明瞭な比率の範囲を明確に示
している。
実施例１１ Ａ、！−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−ヨウ
素化シトシン（５−ＩＡｃｙＣ）の調製 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）シトシン（ＡＣ
３１Ｇ）（１，８５ｇ、　１０．０５ｓｏｌ）と酢酸第
２水銀（３，３５ｇ、　１０．５　ｇａｏｌ）の混合物
を５０１１のメタノール及びｌｏｏｍｌの塩化メチレン
中で還流した。ヨウ素（３，０５ｇ、　１２．０　ｍｍ
ｏｌ）を加え、混合物を１時間かきまぜた。遊離液型の
ＡＧ３ｘ４樹脂（３８ｍｅｑ）を加え、溶液を硫化水素
で１５分間バブルした。固体をろ過によって除き、ろ液
をｌｏｇのシリカゲル上にストリッピングした。このシ
リカをシリカゲルカラム（４ｘ　２５　ｃｍ）に載せ１
段勾配塩化メチレン／メタノール（２０：１→１０：１
→５：１）で溶離した。蒸発させ真空乾燥させると無色
固体（１，７３ｇ、　５６％）が得られた。
９５％エタノールから再結晶させると、分析的に純粋な
物質が得られた。
Ｍ、ｐ、：　　１７２・Ｃ，Ａｎａｌ：Ｃａ１Ｃ，ｔｃ
ｔフ）Ｉｆ（１０）Ｎ（３）Ｏ（コ）Ｉ（１）］　　　
Ｃ２フ、０３．　　Ｈ３，２４，Ｎ１コ、５１．　　　
Ｆｏｕｎｄ：　　Ｃ２フ、Ｏｅ、　　Ｈ３，４１，Ｎ　
　１３．ｓｌ、　　　υＶ　　（ＭｅＯＨ）：ｍａｗ　
２９２．５　　（Ｓ、３００）、　　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ
Ｊ６）：　ｄ＠１１ａ　３．４１Ｂｌ　（ｍ。
４Ｈ）、４．６５９　　（ｔ、Ｊ−５ｈｚ、ＩＨ）、５
．０７０°（ｓ、２Ｈ）、、６．６６５　　（ｂｓ。
ＩＨ）、　フＪ６９　　（ｂｇ、　　ＩＭ）、　　ａｎ
ｄ　　８．１０７　（ｓ、　　ＩＨ）。
８．１−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３
−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニル）シトシ
ン（５−（ＴＦＡ−ＡＰ３）ＡｃｙＣの調製１−（２−
ヒドロキシエトキシメチル）−５−ヨウ素化シトシン（
３１１ｍｇ、　１．００　ｍｍｏｌ）を実施例９で開示
した一般的な結合方法に供した。シリカゲル（３ｘ　２
０　ｃ■）上ての７ラツシユクロマトグラフイーにおい
て、段勾配塩化メチレン／メタノール（２０：１→１ｏ
ｌｌ→５：１）で溶離すると、薄黄色の泡として生成物
が得られた（７７．４　ｍｇ、　２３り　。
’）１−Ｎ門Ｒ（ｆ）パｓｇ−Ｊｔ’）’−３＋４７２
　　（ｂ＠、　　４Ｈ）、　　４．２７６　　（ｄ、　
　Ｊ−５，Ｏｈｚ、　　２Ｈ）、　　４．６５コ　（ｂ
ｔ。
Ｊ−４，５ｈｚ、　　ＩＨ）、　　５．０９１　　（ｓ
、　　２８）、　　６．９２５　　（ｂａ、　　ＬＨ）
、　　７８６１（ｂ載　１１１）、　　ａ、ｏユフ　（
ｇ、　　ＩＨ）、　　卸１１　９．９６４　　（ｂｇ、
　　ＩＨ）。
Ｃ，１−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３
−アミノ−１−プロピニル）シトシンの調製アルキニル
アミノヌクレオシド（５−（ＴＦＡ−ＡＰ３）ＡｃｙＣ
）　（０，１６７ｇａｏｌ）の糖部分の水酸基を実施例
５Ｅの一般的方法に従りて三リン酸に転化し、トリフル
オロアセチル基を除去した。第２のリンオキシクロリド
を加えた後、７５分間リン酸化を進行させた。生成物の
吸光係数が出発物質のそれ（７，７９０）に等しいと仮
定すると、２９１ｎｍにおけるυＶ吸収に基づく三リン
酸の収率は２１％でありた。
蓑ＪｊＬＬヱ 保護された染料（ＲＩ＝　ｌａ！Ｈ）で標識されたチミ
ジン７導体の調製 Ａ、５°−デオキシ−５°−（メチル−アミノ）−チミ
ジン）の３１製 ５’−０−（ｐ−）ルエンスルフォニル）チミジン（１
９，８ｇ、　５０　ｍｅａｌ）をモノメチルアミン（２
５０ｇ）か濃縮された圧力容器中に入れた。容器を封止
し、室温に３日間放置した。容器を冷却し、開き、モノ
メチルアミンを蒸発させた。容器内に残留したものを水
ですすぐことによりて除去した。
ＡＣ３（ｌＷｘｌｓイオン交換樹脂（旧型）のカラム（
６，５ｘ２０　ｃｍ）にこの水溶液を通した。カラムを
洗炸液か中性になるまて水て洗った。生成物を次にＩＮ
水酸化アンモニウム水溶液で溶出した。溶出物をストリ
ッピングし、得られた固体をシリカゲルのカラム（６，
５ｃｍｘ　２０　ｃｍ）上でクロマトグラフィーに架け
、溶離液としては塩化メチレン／メタノール／濃水酸化
アンモニウム水溶液（８５：ｌ：ｌ：２）を用いた。生
成物含有画分をストリップし、水に取り、凍結乾燥した
。生成物は薄黄色の非晶質固体（８，８１ｇ、　６９％
）てあった、満足できる燃焼分析はこの物質については
得られなかった。
Ｂ、ｕ 実施例ＩＢからの生成物（４，１４ｇ、　１０．０＊ｍ
ｏｌ）　、　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１，２１
ｇ。
１０．５　ｍｍｏｌ）及びＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカ
ルボジイミド（３，０９ｇ、　１５．０　ｇａｏｌ）を
１００ｍ１１７）無水塩化メチレン中で室温下で１時間
かきまぜた。混合物を水中で冷却し、得られた沈殿をろ
過によって除去した。残液を５０ｓｌの冷却塩化メチレ
ンですすいだ、１つにまとめたる液を、１つの流れとし
て、Ａからの生成物（３００ｍｌの絶対エタノール中２
．６８　ｇ、　１０．５　ｇａｏｌ）の懸濁液に加えた
。室温で９０分間かきまぜた後、反応混合物をストリッ
ピングし１００＋１の塩化メチレンに取り、２　ｘ　１
００１の水で洗った。有機層を硫酸ナトリウム上て乾燥
し、ストリッピングした。残渣を塩化メチレン溶液とし
てシリカゲルのカラム（６，５ｘ　３０　Ｃｍ）に架け
、カラムを２０：ｌ塩化メチレン／エタノールて溶離し
た。溶離は、１０：１塩化メチレン／エタノール中てシ
リカゲル上でＴＬＣによって監視した。
純粋な生成物を含む両分を保持し、混合された両分は再
びクロマトグラフィーに架は扉、Ｍ粋生成物の溶液を１
つにまとめ、ストリッピングし、痕跡量の溶媒を十分な
真空乾燥によって除き、薄黄色の堅固な泡としての生成
物を得た（３．９７　ｇ。
６１％）、　　（この非晶質固体については満足のでき
る燃焼分析を行なうことができなかった。
ａｇｅ）、　　　６　　’（１’ＬＡ’ｌ／”ｌ’ｊ　
　　　　　　）　　１．０３８　　（ｍ、　　コＨ）、
　　１．７８０　　ａｎｄｌ、８ｏｏ　　（ｍ、　　２
Ｈ）、　　１．７Ｂ　　（ｎ＞、２Ｈ）、２．０４　　
（ｍ、２Ｂ）、　　２．２３　　（ｍ。
２Ｈ）、２．２９１　　（ｓ、　　６Ｈ）、　　２．６
８３　　ａｎｄ　　２．７１１　　（ｓ、　　３Ｈ）、
２Ｊ９Ｓ　　ａｎｄ２．８５９　　（ｑ、　　６　　ｈ
ｚ、　　２Ｈ）、　　３．５−３．２　　（ｍ、　　２
Ｈ）、　　３．８０５　　ａｎｄ　３．５７（ｍ、　　
ＩＨ）、　　４．０３２　　ａｎｌ　　３．９８　　（
ｍ、１Ｆり、５．２４９　　ａｎｄ　　５．２９５　　
（ｄ。
３．６　ｈｚ、　　ＩＨ）。６．１１６　ａｎｌｌ　６
．０１２　　（ｔ、　　６．ｓ　ｈｚ、　　ＩＨ）、　
　７．１−６．９（ｍ、　　４１）、　　７．４６フ　
ａｎａ　１．ＬＢＳ　　（ｓ、　　ＬＨ）、　　７．６
−７．５　　（ｍ、　　２Ｂ）　　ａｎｄｌｌ、２フＳ
　　ａｎｄ　１１．３３２　　（ｓ、　　ＩＨ）。
衷ｆｉ６ｉＭ１克− 保護された、染料（Ｒ１＝　Ｒｔ＝　Ｈ）標識ヌクレオ
シドフオスフォラミジトの調製 実施例１１からの生成物（２，６１ｇ、　４．００■ｍ
ｏｌ）をベンゼンに取り、凍結し、凍結乾燥した。３２
１の無水塩化メチレン、無水ジイソプロピルエチルアミ
ン（２，８ｍｌ、　’１７ｓｍｏ’ｌ）及びＮ、Ｎ−ジ
イソブロピルメチルフォスプアミダスクロリド（１’、
’１５ｍ１．５．９　ｍｓｏ’ｌ）を゛この順序に加え
、得られた混合物をアルゴン雰囲気下て１５分かきまぜ
た。
反応混合物を予め振盪された１６０ｍ１の酢酸エチルと
８０１の炭酸水素ナトリウム水溶液との混合物に加え、
振盪し、層を分離した。有機層を８０１の飽和塩化ナト
リウム水溶液８０ｍ１で２回洗い、硫酸ナトリウム上て
乾燥し、ストリップした。残渣をシリカゲルカラム（４
ｘ　２０ｃｍ）−Ｆでクロマトクラフィーに架け、溶離
溶媒としては４５：４５：１０塩化メチレン／酢酸エチ
ル／トリエチルアミンを用いた。溶離物を同じ溶媒中で
シリカゲル上のＴＬＣにより監視した。生成物を含む両
分をストリップし、痕跡量の溶媒を十分な真空乾燥によ
って除くと薄黄色の堅固な泡（２，８９ｇ）として生成
物が得られた。生成物の”Ｐ　　ＮＭＲは、第三アミド
結合の周りの回転アイツメリズム（６：ｌ）及び３価の
リンの周りのジアセロメリズム（１：１）に起因する４
つの生ｒ＆物の混合物を示した。（スペクトルはまた、
１３重量％のＮ、Ｎ−ジイソブロビルメチルフォスフオ
ラミダスアシッドによる混入をも示した。この物質は、
オリゴヌクレオチド合成のための生成物の使用を妨げな
かった。） 補正収率；７７％、　”Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）；
δ１４７．８１及び１４６．９９　（ｓ、主）並びに１
４８．１８及び１４７．７５　（ｓ、副）
【図面の簡単な説明】
第１図は、それぞれ異なるが近似する波長の発光エネル
ギーを発する異なる光源からの放射エネルギーの存在を
検出するための、この発明に従って構築されたシステム
の部分ブロック、部分タイアクラムレイアウトを示す図
、 第２図は第１図のシステムに用いるこおがてきる単一の
電気泳動ゲルを模式的に示す図。 第３図は第１図のシステムに用いるられる染料発光光線
と二色フィルターの透過／反射特性との関係を示す図、 第４図は検出された発光ピークを評価するために用いら
れるデータ処理工程のフロータイアグラム、 第５図は、標識された塩基Ｔ、Ｇ、Ａ及びＣについて、
時□間の関数として得られた典型的な検出器信号を示す
図。 第６図は蛍光標識鎖ターミネータ−のブロックダイアグ
ラム、 第７図は二色フィルターに代えて用いられる２つのフィ
ルターの染料発光放射とバスバレドとの関係を示す図で
ある。 ｌＯ・・・板、１２・・・プラスチック支持体、１８．
２４・・・緩衝液

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）時間的及び／又は空間的分離の後に異なる種から
    の発射される放射エネルギーの存在及びそれらの種の同
    一性を検出するためのシステムであって、 種の性質の関数として第１のセンスにおいて大きさが異
    なる第１の信号を発生するための、種のスペクトルに応
    答的な手段と、 種の性質の関数として、第１のセンスとは異なる第２の
    センスにおいて大きさが異なる第２の信号を発生するた
    めの、種のスペクトルに対して応答的な手段と、 第１及び第２の信号の関数の比率に対応する第３の信号
    であって、その大きさがそれぞれの種の同一性を示すも
    のを得るための、第１及び第２の信号に対して応答的な
    手段とを具備するシステム。
  2. （２）前記種は、放射エネルギーを発することができる
    レポーターで共有結合的に標識されたＤＮＡ断片であり
    、ＤＮＡ断片を分離するための手段を含む特許請求の範
    囲第１項記載のシステム。
  3. （３）前記レポーターは下記構造を有する特許請求の範
    囲第２項記載のシステム。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す）
  4. （４）ＤＮＡ断片は、鎖終結現象によって導入された３
    ′末端残基にそのレポーターを共有結合している特許請
    求の範囲第３項記載のシステム。
  5. （５）異なるレポーターの励起領域内にある出力波長を
    有するレーザーを含む特許請求の範囲第４項記載のシス
    テム。
  6. （６）ＤＮＡ断片は、鎖終結現象によって導入された３
    ′末端残基にそのレポーターを共有結合している特許請
    求の範囲第２項記載のシステム。
  7. （７）前記第１及び第２の信号を発生するための手段は
    、 波長の関数として変化する第１及び第２の透過特性を有
    する、スペクトルを透過するための手段であって、種か
    らの発光が導かれるように配置され得るものと、 第１及び第２の透過発光光線をそれぞれ受容するように
    配置することができ、それらの強度に応じた第１及び第
    ２の信号を発生し、それぞれの種の存在を示す第１及び
    第２の検出器とを有する特許請求の範囲第１項記載のシ
    ステム。
  8. （８）装置特性は、第１の透過特性から第２の透過特性
    への遷移点を、レポーターの発光スペクトルのほぼ中間
    付近に有する特許請求の範囲第７項記載のシステム。
  9. （９）透過手段は二色フィルターである特許請求の範囲
    第８項記載のシステム。
  10. （１０）共有結合的にレポーターで標識されたＤＮＡ断
    片又は他の分子を分離する手段を含む特許請求の範囲第
    ７項記載のシステム。
  11. （１１）前記レポーターは下記構造の発光部分を有する
    特許請求の範囲第１０項記載のシステム。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す）
  12. （１２）時間的及び／又は空間的分離の後に異なる種か
    らの発射される放射エネルギーの存在及びスペクトルを
    発光するそれらの種の同一性を検出するための方法であ
    って、 種の性質に応じて種々のセンスにおいて異なる発光エネ
    ルギーの関数を得る工程と、 種の同一性を示す、これらの関数の比率を求める工程と
    を含む方法。
  13. （１３）異なるセンスは大小の発光振幅から成る特許請
    求の範囲第１２項記載の方法。
  14. （１４）前記関数は、波長の関数として変化する透過／
    反射特性を有する装置に発光放射エネルギーを通過させ
    ることによって得られ、該装置は二色フィルターである
    特許請求の範囲第１３項記載の方法。
  15. （１５）前記種はレポーターで共有結合的に標識された
    ＤＮＡ断片である特許請求の範囲第１２項記載の方法。
  16. （１６）前記レポーターは下記構造を有する特許請求の
    範囲第２項記載のシステム。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す）
  17. （１７）ＤＮＡ断片は、鎖終結現象によって導入された
    ３′末端残基にそのレポーターを共有結合している特許
    請求の範囲第３項記載のシステム。
  18. （１８）適当な塩基配列決定用ベクター、プライマー、
    ポリメラーゼ、ＤＮＡヌクレオチド又はその類似体の第
    １の混合物、及びＤＮＡヌクレオチド又はその類似体に
    対応するレポーター標識鎖Ａ鋳型を反応させて鎖終結現
    象によってその３′末端に導入された残基に共有結合的
    に連結されたレポーターを有するＤＮＡ断片を調製する
    工程と、このようにして調製されたＤＮＡ断片について
    レポーターの存在を調べ、それによってＤＮＡ塩基配列
    を決定する工程とを含む、鎖伸長によるＤＮＡ塩基配列
    決定方法。
  19. （１９）レポーターは、発色体、蛍光体、リン光体、ス
    ピン標識及び電子過密物質から成る群より選ばれる特許
    請求の範囲第１８項記載の方法。
  20. （２０）前記蛍光体は次の構造を有する特許請求の範囲
    第１９項記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す）
  21. （２１）レポーターの鎖ターミネーターへの結合はアミ
    ド結合によって行なわれる特許請求の範囲第１８項記載
    の方法。
  22. （２２）レポーター標識鎖ターミネーターはヘテロ環塩
    基を含み、レポーターの鎖ターミネーターへの結合は該
    ヘテロ環塩基を介して行なわれる特許請求の範囲第１８
    項記載の方法。
  23. （２３）リンカーと任意的なスペーサーがレポーターと
    ヘテロ環塩基との間に置かれる特許請求の範囲第２２項
    記載の方法。
  24. （２４）レポーター標識鎖ターミネーターは▲数式、化
    学式、表等があります▼ （ただし、ＸはＨ、ＮＨ＿２、又はハロゲン、ＹはＨ、
    ハロゲン、ＯＨ、又はＮＨ＿２、あるいはＸ及びＹは共
    にＯＨを示し、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザア
    デニン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサ
    ンチンを示し、ピリミジンはＮ＿１位を介して糖部分に
    連結され、プリンとデアザプリンはＮ＿９位を介して糖
    部分に連結される）で示される構造を有する化合物であ
    り、 Ａは ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す） で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂでデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる、特許請求の範囲第２２項記載の方法。
  25. （２５）レポーター標識鎖ターミネーターは▲数式、化
    学式、表等があります▼ （ただし、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニ
    ン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサンチ
    ンを示し、ピリミジンはＮ＿１位を介して糖部分に連結
    され、プリンとデアザプリンはＮ＿９位を介して糖部分
    に連結される） で示される構造を有する化合物であり、 Ａは ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す） で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂでデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる、特許請求の範囲第２３項記載の方法。
  26. （２６）第２の混合物は、それぞれ異なる区別可能なレ
    ポーターを担持する４種類のレポーター標識鎖を含む特
    許請求の範囲第１８項記載の方法。
  27. （２７）区別可能なレポーターは蛍光体である特許請求
    の範囲第２６項記載の方法。
  28. （２８）標識ＤＮＡ断片を同時に分離する工程を含む特
    許請求の範囲第２６項記載の方法。
  29. （２９）標識ＤＮＡ断片は分離の前に結合される特許請
    求の範囲第２８項記載の方法。
  30. （３０）全ての４つの鎖終結反応は単一の容器内で行な
    われる特許請求の範囲第２６項記載の方法。
  31. （３１）異なるレポーターをそれぞれの塩基の鎖ターミ
    ネーターに結合する工程と、 修飾鎖終結法によって標識ＤＮＡ断片を調製する工程と
    、 寸法に基づいてＤＮＡ断片を分離する工程 と、 それぞれのＤＮＡ断片についてのレポーターを検出し、
    それによって３′末端塩基を同定する工とを含むＤＮＡ
    の塩基配列決定方法。
  32. （３２）以下の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、（ａ）ｎは２又は３、Ｒ＿１はＨ、低級アル
    キル、フッ素、塩素、ヨウ素、低級アルコキシ又はシア
    ノ基、Ｒ＿２はハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基
    、あるいは（ｂ）ｎは２又は３、Ｒ＿１は低級アルキル
    、フッ素、ヨウ素、低級アルキル、シアノ基、Ｒ＿２は
    Ｈ又は低級アルキル基、あるいは （ｃ）ｎは２又は３、Ｒ＿１は臭素、Ｒ＿２は低級アル
    キル、フッ素、塩素、ヨウ素、低級アルキル又はシアノ
    基、あるいは （ｄ）ｎは２、Ｒ＿１は塩素、Ｒ＿２はＨ又は低級アル
    キル基、あるいは （ｅ）ｎは３、Ｒ＿１は臭素、Ｒ＿２はＨ又は臭素を示
    す）
  33. （３３）下記の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基
    、Ｒ′ははアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基
    を示す）
  34. （３４）３−ヒドロキシ−６−オキソ−９−カルボキシ
    アルキル−６Ｈ−キサンテンをピリジン中で無水カルボ
    ン酸で処理し、次いでアルコールで処理する工程を含む
    、特許請求の範囲第３３項記載の化合物の製造方法。
  35. （３５）下記の構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基
    、Ｒ′ははアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基
    、Ｘは良好な離脱基を示す）
  36. （３６）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基
    、Ｒ′ははアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基
    、Ｘは良好な離脱基を示す）
  37. （３７）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ＸはＨ、ＮＨ＿２、又はハロゲン、ＹはＨ、
    ハロゲン、ＯＨ、又はＮＨ＿２、あるいはＸ及びＹは共
    にＯＨを示し、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザア
    デニン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサ
    ンチンを示し、ピリミジンはＮ＿１位を介して糖部分に
    連結され、プリンとデアザプリンはＮ＿９位を介して糖
    部分に連結される、Ａは ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す） で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂでデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる）
  38. （３８）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニ
    ン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサンチ
    ンを示し、ピリミジンはＮ＿１位を介して糖部分に連結
    され、プリンとデアザプリンはＮ＿９位を介して糖部分
    に連結される） で示される構造を有する化合物であり、 Ａは ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素、低
    級アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を
    示す） で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂでデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる）
  39. （３９）下記構造を有する化合物。 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ＿１及びＲ＿２はＨ、低級
    アルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基、
    Ｒ′はアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基、Ｒ
    ＿４はＨ又は３価のリン部分、Ｂはヘテロ環塩基を示す
    ）
  40. （４０） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｂは（ジデオキシ鎖終結ヌクレオチドのため
    の１−ウラシル、１−シトシン、１−チミン、９−アデ
    ニン、９−グアニン、又は９−ヒポキサンチンを示す） の構造式で示される化合物を置換する工程を含む、ジデ
    オキシ鎖終結ヌクレオチドを用いた鎖ターミネーター法
    によるＤＮＡ塩基配列決定方法。
  41. （４１）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素又はメチル基を示す
    ）（４２）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素又はメチル基を示す
    ）（４３）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素又はメチル基を示す
    ）（４４）下記構造を有する化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿１及びＲ＿２は水素又はメチル基を示す
    ）
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