JPH04500516A - 赤色シフト―フタロシアニン及びテトラベンゾトリアザポルフィリン試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

赤色シフト−フタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリン試薬 技術の分野 本発明は、蛍光レポーター基、イメージング剤として、及び治療剤としても有用 なフタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリン試薬及びその誘導体に 関するものである。蛍光試薬は核酸配列分析、核酸プローブ及びハイブリダイゼ ーションアッセイ、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、イムノアッセイ、及び 蛍光イメージングに用いられる。この試薬は治療剤として光力学的用途にも用い られる。 発明の背景 蛍光化合物（発蛍光団）はイムノアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡 及びＤＮＡ塩基配列決定に広く用いられる。現在のところ、このようなアッセイ の感度は、使用できる発蛍光団のスペクトル特性のために制限されている。 特に、自動ＤＮＡ塩基配列分析は分子生物学において重要な手段となった。最も 成功する方法はサンガー（Ｓｒｎｇｅｒ）のジデオキシ鎖延長終止法で、５′　 −発蛍光団−標識プライマーまたは発蛍光団−標識ジデオキシヌクレオチド三リ ン酸を用いて一連のフラグメントを生成する。 生成したフラグメントを電気泳動によって分離する。酸素、発蛍光団、及び反応 条件を注意深く選択することによって、このような技術で配列決定され得るＤＮ Ａフラグメントの大きさは百の塩基からほぼ千の塩基にまで増えた。例えば、応 用バイオシステム社（ＡＢＩ）（＾ｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＢｓｆｅｍｓ　Ｉｎｃ ｏｒｐｏｒａｔｅｄ　）は、発蛍光団−標識プライマーを用いて１３時間以内に ＤＮＡのほぼ７００の塩基対区間を配列決定できると報告している。自動塩基配 列決定の進歩にもかかわらず、現在の技術では、Ｄ　Ｎ　Ａのキロベース及びそ れより長い塩基を一回で配列決定することはできない。この制限は、一部は、発 蛍光団の検出及び分解能によって生ずる。シグナル検出は、より理想的なスペク トル特性をもった発蛍光団の使用によって改善され得る。 最近、蛍光発光によって識別される種々の化学的に調節されたスクシニルフルオ レッセインをそれぞれもった４種類の鎖延長終止ヌクレオチドの新規の１組の使 用に基づ＜ＤＮＡ塩基配列決定系が報告された［プロパー（Ｐｒｏｂｅｒ、　Ｊ 、Ｍ、）ら、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　２３８巻３３６−３４１ページ、１９ ８フ；欧州特許出願第８７３０５８４８．１号］。 ケイ素ジヒドロキシフタロシアニンの電子特性に対するフルオロ及びシアノ基の 末端置換の影響がモデル化された［マークス（Ｍａｒｋｓ、　Ｔ、　１．　）ら 、Ｊ、＾ｍ、Ｃｈｅｗ　Ｓａｃ、１０９巻５９４３−５９４７．１９８７１゜親 ケイ素フタロシアニンの理論的吸収波長は６３７ｎｍと予想され、一方オクタシ アノー及びオクタフルオロ−誘導体は計算上、それぞれ６８５及び７５６ｎｍに 移動した。その報告には蛍光については何も記載されていない。 フタロシアニン巨大環にフェノキシ及び千オ７工２ノキシ置換基を導入すると、 可視部吸収スペクトルの長波長バンドが明らかな赤色シフトを起こすことが報告 されている［ルキャネツ（Ｌｕｋ７ａ＋＋ｅｉｔ、　Ｅ、　Ａ、　）及びデルカ チェワ（Ｖ、　Ｍ、　Ｄｅ＋ｋｘｃｈｅｖａ）　、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｃｈｅｍ、 　ＵＳＳＲ５０巻１８７４−１８７８゜１９８０３゜ 硫黄置換フタロシアニンは、酸素置換フタロシアニンに比べて、吸収がより大き く赤色シフトするといわれている。そしてどちらの場合にも、報告による。と、 ３−置換フタロシアニンの方が４−異性体より大きくシフトする。蛍光のデ・− 夕は報告されなかった。ルキャネツの報告で論じられている化合物のなかで、無 金属誘導体のみが可能性のある発蛍光団である。コバルト及び銅同族体は蛍光を 発しない。無金属フタロシアニンはここに記載の技術によって反応性または水溶 性になり得る。なぜならば無金属種はこれらの技術のあるもの、例えばクロロス ルフォン化には不安定であるからである。 アルミニウムフタロシアニンを、例えば核酸塩基配列分析、フローサイトメトリ ー、イムノアッセイ、または核酸プローブアッセイなどの同時多成分蛍光分析に 応用する場合、共通の励起波長と異なる発光波長をもち、各族のメンバー間の最 大スペクトル分解能をもつ結合可能の水溶性誘導体の族を合成することが必要で ある。ＤＮＡ塩基配列分析のためには、４種類のこのような発蛍光団が所望であ る。 理想的発蛍光団は５つの特徴を有する。すなわち、大きいモル吸収率をもった容 易にアクセスできる励起波長、高い蛍光量子収量、大きいストークのシフト（＞ ５０ｎｍ）、長波長における発光（６０ｈｍ以上）、及びシャープな発光プロフ ィル（半値全幅（ＦＷＨＭ）＜４０ｎｍ）である。 アルミニウムフタロシアニン（Ａｔ　Ｐｃ）は理想に近いスペクトル特性を有す る。アルミニウムフタロシアニンの３５θｎｍにお（ブる励起は６８５ｎｍにお ける発光を起こし、蛍光量子収量（φ、）は０．５８である［ブラントン（！１ ｅａｎｄＯｎ、　ｌ　ＩＩ、　）及びマジュ（Ｄ、Ｍａｄｇｅ　）　：　１．＾ ｖａｅ　Ｉ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　。 １０２巻！ｉ２−６５ページ、　１９８０１゜アルミニウムフタロシアニン（Ａ ＩＰｃ）は高度に共役した巨大環と三価のアルミニウム原子とから成る。親Ａｔ 　Ｐｃ発蛍光団の構造を下に示す。Ｌはりガントで、ＡＩ　Ｐｃが水中にあると きはＯＨである。三価アルミニウム原子は軸結合を提供し、これは凝集の減少に 役立ち、それによって溶液中の蛍光を増加させる。 １９８９年６月１４日提出の関連出願、米国特許出願第３６６゜９７１号におい て、本発明者は生化学的部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）に単量体として結合した水溶 性フタロシアニン化合物を開示した。治療的用途においては、アルミニウムフタ ロシアニンスルフォネートはコンドロールド殺細胞のために有効であることが確 認されているしペンフル（ＢｅＤ−Ｈｕｒ、　Ｅ、　）及びローゼンタール（１ ，Ｒｏｔｅｎｊｂｘｌ　）　；　Ｐｈｏｔｏｃｈｅ＠、Ｐ）ｏｔｏｂｉｏｌ、４ ２巻１２９−１３３ページ、　１９８５コ。フタロシアニンが他の光力学的作用 物質に比べて優れている点は、可視部スペクトルの赤色領域における大きいモル 吸収率である。大きいモル吸光係数はこれら赤色波長における組織の透過性と共 同して、より効率的な光透過を、したがって皮下悪性腫瘍のより効果的治療法を 提供する。 本発明によると、親代合物から赤色シフトしたアルミニウムフタロシアニン誘導 体は、さらに深く透過することができ、さらにより効果的な治療を可能にする。 たとえばプローブまたは抗体なこの生物学釣部部分に結合した誘導体は特異な細 胞集団を標的とすることができる。 テトラベンシトリアザポルフィリン（ここではＴＢＴＡＰと略記する）はフタロ シアニンと密接な関係があるしリンステッド（Ｌｉｎｓｔｅａｄ、Ｒ，Ｐ、）　 Ｊ、Ｃｂｅｍ、Ｓｏｃ、１８０９−１８２８ページ、　！９３９１゜唯一の構造 的差は、フタロシアニンの２０位の窒素が置換炭素に置き代わっていることであ る。これら化合物の置換誘導体は今日まで報告されていない。結合可能の（ｆｅ ｊｈｅｒａｂｌｅ）または水溶性の類似体も報告されていない。マグネシウム及 びパラジウムベンゾボルフィリンのスペクトル及びルミネッセント特性は報告さ れている［ソロヴエフ（Ｓｃｌｏｖｔマ、　Ｋ、　Ｎ、　）ら、Ｏｐｌ、　５ｐ ｅｅｌ＋ｏｓｃ、　２７巻２４−２９ページ、１９６９コ。アルミニウム、置換 、結合可能、または水溶性誘導体のいずれも論じられていない。 発明の概要 本発明の第１の面は、下記の式を有する、赤色シフト−水溶性フタロシアニン及 びテトラベンシトリアザポルフィリン（ＴＢＴＡＰ）を含む： 式中、ＭはＲ２，アルミニウム、ケイ素、燐、ガリウム。 ゲルマニウム、カドミウム、スカンジウム、マグネシウム、錫または亜鉛である 。各Ｒ０は−ｘｙｗ、−ｙｗ。 −Ｗまたは−Ｈから独立的に選択される。ＸはＣＲ，、Ｒ４であり、ここでＲ９ 及びＲ４は水素、アルキル（Ｃ。 −Ｃ２２が好ましい）、アリール（Ｃ６Ｃ１２が好ましい）、またはアラルキル （Ｃ６Ｃ１２が好ましい）から独立的に選択されるか、ま、たはＲ９及びＲ４が 一緒にカルボニル酸素であってもよい、或いはＸはフェニルか、酸素、窒素及び 硫黄から好適に選択されたヘテロ原子かのどちらかである。ＹはＸとＷとの間、 またはフタロシアニンのベンゾ環またはＴＢＴＡＰ巨大環とＷとの間を連結する 基である。Ｗは水溶性の基である。Ｒ２は生物学的実体、たとえば抗体、抗原、 ヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アビジン、ストレプトアビジンまた は膜プローブから成り、またはＲ２は生物学的実体に結合するのに適した反応性 または反応可能の基である。２はＮ１または−ＣＲである：ここでＲはＨまたは 有機基、たとえばアルキル（ＣＩ　Ｃ１２が好ましい）、アリール（０６Ｃ１２ が好ましい）、またはアラルキル（Ｃ６Ｃ１゜が好ましい）である。２が一〇Ｒ である場合、Ｒ１及びＲ２はＴＢＴＡＰの４個のベンゾ環のいずれに位置しても よい。 別の実施態様において、式Ｉのベンゾ環に位置するＲ２基はＲ３で定義され、Ｚ は−ＸＲ２であり、ここでＲ２は前記の通りである。こうしてこの実施態様では 、生物学的実体はベンゾ環上よりも巨大環のメソ炭素原子上に位置する。 式ｌのすべての実施態様において、結合基Ｙは長さ４原子以下であるのが好まし く、脂肪族、芳香族、ポリエン、アルキニル、ポリエーテル、ポリアミド、ペプ チド。 アミノ酸、ポリヒドロキシ、または糖官能基を含む。適した水可溶化基Ｗには、 −ＯＨ，−ＣＯ２Ｈ，−０ＣＨ２ＣＯ２Ｈ，ＰＯａ　’−，ＰＯｉ　−、Ｓｏｙ 　−、−８Ｏ２−、ＳＯ２ＣＩ　、　ＳＯ４’−、ＮＲ２、ＮＨＤ、−ＮＨＤ、 Ｄ２．または−Ｎ”　ＤｌＤ、Ｄ３があり、Ｄ、Ｄ、、Ｄ２．０３は独立的にア ルキル（好ましくはＣＩ　Ｃ１２’）、アリール（好ましくはＣ６Ｃｌ２）、ま たはアラルキル（好ましくはＣ６Ｃｌ２）である。帯電した種は対イオンを有す る。 好ましい実施態様において、Ｍはアルミニウム、各Ｒ，は−ｘｙｗ、ｘは酸素ま たは硫黄原子、Ｙはメチレン基、Ｗはカルボン酸、ｚは窒素、Ｒ２は−Ｘ−ＣＨ 。 Ｃ０２Ｈ’ｔ’ある。Ｒ，（７）置換は、巨大環の１．８，１５．２２位置（３ 異性体）または２，９．１６．２３位置（４異性体）におこる。フタロシアニン 及びテトラベンシトリアザポルフィリン環の位置のナンバリングについては図１ を参照されたい。 特に好ましい実施態様において、Ｍはアルミニウム、各Ｒ，は−ｘｙｗ、ｘは酸 素または硫黄原子、Ｙはフェニル、Ｗはスルフォネートまたはスルフオクロリド 、Ｚは窒素、モしてＲ２は一〇−フェニルースルフォネート、−〇−フェニルー スルフオクロリド、−８−フェニル−スルフォネート、または−８−フェニル− スルフォニルクロリドである。Ｒ１の置換は、巨大環の１．８，１５゜２２位置 （３異性体）または２．９．１６．２３位置（４異性体）におこる。 テトラベンシトリアザポルフィリン誘導体に関しては、好ましい実施態様は、Ｚ が水素かフェニル置換基で置換された炭素であることを除けば、上記の通りであ る。フェニルは、置換されていなくてもよいし、Ｃ，−Ｃ，アルキル、ハＤゲン （たとえばＣＩ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ）、　カルボキシ、ニトロ、または分子の蛍光ま たは水溶性を本質的には妨害しないその他の置換基のなかから選択された１−５ 個の、より好ましくは１−２個の置換基によって置換されてもよい。 Ｚが−ＣＲ２である場合、上に定めたように、巨大環の残りは４個のＲ，基を含 む。 二価金属（Ｍ）　、Ｃｄ、Ｍｇ及びＺｎでは、軸リガ：／ド（Ｌ）は存在しない 。三価の金属原子（Ｍ）　、ＡＩ　。 Ｇａ及びＳｃは少なくとも１つの軸リガンド（Ｌ）をもっている。四価の金属原 子（Ｍ）　、Ｓ　ｉ、Ｇｅ、Ｓｎは少なくとも２つの軸リガンド（Ｌ）をもって いる。燐（Ｍ）は１つか２つの軸リガンド（Ｌ）をもつ。 上記の試薬を用いて１つの分析物を検出するための試薬キットが、ＤＮＡ塩基配 列決定のためのキット及び方法とし、て提供される。溶液中の複数の分析物を同 時検出するために有用な、異なる生物学的実体に各々結合した主題の試薬を組み 合わぜて含む試薬キットも提供される。 本発明の第２の面は、ピラジンポルフィラジン、ビラジンテトラベニノ゛シトリ アザポルフィリン、ビリシンボルフィラジ二ノ、及びピリジンテトラベンゾトリ アザポルフィリンを含む。、：れらの化合物は、ベンゾ環の】−４が１窒素原子 （ピリジン誘導体）または２窒素原子（ピラジン誘導体）を含むことを除けば、 式Ｉと同じ構造である。ベンゾ環が１窒素原子を含むとき、３位置異性体及び４ 位置異性体の両方が可能である。ピラジン誘導体において、環１個につき２個の 窒素原子は概してベンゾ環の１．４位置をとるように配向される。４ベンゾ環す べてが１個か２個の窒素原子を含むのが好ましい。１−３のベンゾ環が１個の窒 素原子を含み（いずれも異性体）、３−１のベンゾ環が２１個の窒素原子を含む 混合誘導体も可能である。Ｒ１及びＲ２基はベンゾ環の炭素原子か窒素原子に結 合するが、ベンゾ環の炭素原子に結合した方が好ましい。Ｘがへテロ原子である 場合、−ｘｙｗは炭素に結合し、ＸがＣＲ）Ｒ４またはフェニルである場合、− ｘｙｗはベンゾ環の炭素原子（この方が好ましい）または窒素原子に結合する。 ここに述べる実施例１２及び１３は本発明の第２の面の化合物のうちの好ましい 化合物を説明する。その他の好ましい化合物は、本発明の第１の面の化合物とし て確認された好ましい化合物の類似物である。本発明の第２の面の化合物は上記 のフタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリンと同じ用途に用いられ る。 本発明の第３の面はＲ７がＲ１であることを除いて、上記式１を有するカチオン 性試薬に関する。Ｒ，、Ｘ及びＹは上記の通りである。Ｗは−Ｎ’　Ｄ、Ｄ２Ｄ 、である。ここでり、−Ｄ、は独立的に水素、ｃ＋　ＣＩ２アルキル、Ｃ６ＣＩ ２アラルキル、またはＣ６Ｃ３２アリール基で、或いは−Ｎ’　Ｄ、Ｄ、Ｄ、は ピリジニウム環を形成する。帯電し、た基は、それが試薬の蛍光または合成を実 質的に妨害し、ない限り、一般的対イオンと結合してもよい。これらの試薬は、 （染色したまたは標識をつけた）オリゴ−及びポリヌクレオチド、特にＤＮＡま たはＲＮＡ、に結合させて定性または定量測定するために便利に用いられる。 もう１つの面では、本発明は式Ｉの化合物の合成のための中間生成物を提供する 。たとえば、式１　ｃ）Ｒ，が生物学的実体に共有結合することができる基であ る。反応性または活性化可能の中間生成物が考えられる。Ｒ２は直接ベンゾ環に 結合してもよいし、ＸＹまたはＹ結合によってベンゾ環に結合してもよい。この ようなＲ２基としては、−８０２Ｃ１、−ＣＯ２Ｈ；−ｃｏｘ’　がある。 ここでＸ′は、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、またはイ ソチオシアネートなどの脱離基である。Ｒ２は、生物学的実体上の反応基と反応 するために、たとえばアミノ基のような核性部分であってもよい。いくつかの実 施態様では、代わりにベンゾ環上の水溶性基Ｗが生物学的実体に結合する。式１ におけるその他の変形はここに定めたものと同じである。これらの化合物は、標 準的カップリング反応によって生物学的実体に結合する。一度結合したならば、 式Ｉに関連して定められたように、反応基の少なくとも一部はＹ′基となる。 図面の簡単な説明 図１は、フタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリン環の番号の付は 方を示す。 図２は、水中のアルミニウムフタロシアニンテトラスルフォネート、１、の吸収 及び発光スペクトルを示す。 図３は、水中のグリコール酸誘導体、２及び３、の吸収スペクトルの比較を示す 。 図４は、水中のグリコール酸誘導体、２及び３、の発光スペクトルの比較を示す 。 図５は、水性セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）中の２つのグ リコール酸誘導体、２及び３、の発光スペクトルの比較を示す。 図６は、水中の酸素置換アルミニウムフタロシアニンスルフォネート、４及び５ 、の吸収スペクトルの比較を示す。 図７は、水中の酸素置換アルミニウムフタロシアニンスルフォネート、４及び５ 、の発光スペクトルの比較を示す。 図８は、水中の硫黄置換アルミニウムフタロシアニンスルフォネート、６及び７ 、の吸収スペクトルの比較を示す。 図９は、水中の硫黄置換アルミニウムフタロシアニンスルフォネート、６及び７ 、の発光スペクトルの比較を示す。 図１０は、水中の酸素置換アルミニウムテトラベンシトリアザポルフィリンスル フォネート、８及び９、の発光スペクトルの比較を示す。 図１１は、水中の硫黄置換アルミニウムテトラベンシトリアザポルフィリンスル フォネート、１０及び１１、の発光スペクトルの比較を示す。 図１２は、水中のアルミニウムー２Ｏ−Ｈ−テトラベンシトリアザポルフィリン スルフォネート、１２、の吸収及び発光スペクトルを示す。 図１３は、水中のアルミニウムー２０−フェニル−テトラベンシトリアザポルフ ィリンスルフォネート、１３、の吸収及び発光スペクトルを示す。 図１４は、ＲＮＡ含有及び不含有の水中における無金属フタロシアニンカチオン 性発蛍光団、１４ａ１の発光スペクトルの比較を示す。 図１５は、ＲＮＡ含有及び不含有の水中における無金属フタロシアニンカチオン 性発蛍光団、１４ａ１の発光スペクトルの比較を示す。 図１６は、ＲＮＡ含有及び不含有の水中におけるアルミニウムフタロシアニンカ チオン性発蛍光団、１４ｂ。 の吸収スペクトルの比較を示す。 図１７は、ＲＮＡ含有及び不含有の水中におけるアルミニウムフタロシアニンカ チオン性発蛍光団、１４．ｂ。 の発光スペクトルの比較を示す。 図１８は、ＤＮＡ配列決定分析に適した４種類のアルミニウムフタロシアニンス ルフォネート、１．４．５、゛及び７の、水中における発光スペクトル比較を示 す。 本発明は、第１の面において、上の式■によって表される、赤色シフトした、水 溶性の、モノマーとして結合し得る誘導体の形の改良フタロシアニン及び関連試 薬を提供する。 式Ｉにおいて、ＭはＲ２であるか、または下記の金属のなかから選択されるニア ルミニウム、ケイ素、燐、ガリウム、ゲルマニウム、カドミウム、スカンジウム 、マグネシウム、錫及び亜鉛。各Ｒ２は−ｘｙｗ、−ｙｗ。 −Ｗまたは水素の中から独立的に選択される。ＸはＣＲ１Ｒ４であり、ここでＲ ３及びＲ４は水素、アルキル（好ましくはＣ，−Ｃ１□）、アリール（好ましく はＣ６Ｃｌ２）％またはアラルキル（好ましくはＣ６−Ｃ□２）から独立的に選 択されるか、またはＲ１及びＲ４が共にカルボニル酸素であってもよい。或いは Ｘはフェニルであるか、Ｘは酸素、窒素、硫黄、燐、ケイ素及びセレンの中から 選択されるヘテロ原子である。Ｙは結合基をあられし、Ｗは水可溶化基をあられ す。置換基Ｒ２は−Ａ。 −Ｙ’　Ａ、−ＸＡ及び−ＸＹ’　Ａの中から選択され、ここでＡはたとえば抗 体、抗体フラグメント、抗原、オリゴヌクレオチド、核酸プローブ、アビジン、 ストレプトアビジン、または膜プローブなどの生物学的実体をあられす。Ｒ２は 、ベンゾ環に直接結合するか、連結基、たとえば−Ｘ−アルキレン−１または− Ｘ−フェニレン−によって結合する反応性または活性化可能の基であってもよく 、ここでＸは上記のものである。ＺはＮまたはＣ−Ｒであり、ここでＲはＨｌま たはたとえばアルキル（好ましくはＣＩ　Ｃｌ２）、アリール（好ましくはＣ６ −Ｃ＋２）、またはアラルキル（好ましくはＣ６Ｃｌ２）などの有機基である。 Ｙ′は生物学的実体（Ａ）をフタロシアニンまたはテトラベンシトリアザポルフ ィリン巨大環に結合させる結合基である。ヌクレオチドまたはそれらの誘導体を 含む生物学的実体は概して三リン酸化合物であるが、−リン酸及びニリン酸化合 物も用いられる。 Ｚは窒素原子であるか、水素、アルキル（好ましくはＣｉ　−Ｃ＋２）　、アリ ール（好ましくはＣ６Ｃｌ２）、またはアラルキル（好ましくはＣ６Ｃ１，２） 基で置換された炭素である。別の実施態様において、Ｚは−ＣＲ２である。この 場合巨大環のベンゾ環上の変わり得る基は総てＲ１基である。すなわちＲ２はＴ ＢＴＡＰのベンゾ環よりもメソ炭素に結合するらしい。好ましい実施態様におい て、Ｍはアルミニウム、各Ｒ３は−ｘｙｗ、ｘは酸素または硫黄、Ｙはメチレン 、Ｗはカルボキシレート、Ｚは窒素、Ｒ２は、ＸＹ結合の方法でベンゾ環に結合 した活性化可能のまたは反応性基である。Ｒ２は好ましくは−ＸＹ−活性化可能 基であり、ここではＸはＯで、Ｙはメチレン、活性化可能基は−Ｃｏ２Ｈである 。 特に好ましい実施態様において、Ｍはアルミニウム、各Ｒ１は−ｘｙｗ、ｘは酸 素か硫黄、Ｙはフェニル、Ｗはスルフォネ−１・またはスルフォニルクロリド、 Ｒ２はＸＹ結合によってベンゾ環に結合した活性化可能または反応性基で、２は 窒素である。こわらの誘導体は四置換アルミニウムー７りロシアニンと呼ばれる 。Ｒ２は好ましくは−ＸＹ反応性基で、ここでＸ　ｉ！　ＯまたはＳ、Ｙはフェ ニル、そ

【、て反応性基は−ｓｏ、ｃ＋ｃフェニル環の１゛ルト、メタ、または バラ位に位置する）である。 同様に好ま［２い実施態様は、Ｚが水素またはフェニルＶ４？基をもった炭素で あるこ、とを除けば全く上記と間じものである。これらの誘導体は四置換テトラ ベンシトリアザポルフィリンと呼ばれる。使用する合成法により、これら化合物 のいくつかは、混合物、特に異性体混合物または異なる数の可溶化基をもった化 合物の混合物と【。 て生ずる。このような混合物は本発明の範囲内である。 総てのフタロシアニン１ｔ３５０ηｍ付近の紫外領域では共通の吸収波長をもっ ているが、可視部の吸光度は置換基に依存する。フタロシアニンの可撓部吸収マ キシマムの赤色シフトは、式ｌのＸに酸素（エーテル）及び硫黄（チオエーテル ）で末端置換したときに最大になる。硫黄置換は酸素置換に比べて蛍光発光をよ り大きく赤色シフトさせる。そして３つの位置の置換（１，８，１５゜２２異性 体）は４異性体（２，９，１６，２３異性体）より大きいシフトを起こす。吸収 スペクトルに認められる傾向は蛍光スペクトルに見いだされるものである。その 傾向はテトラベンシトリアザポルフィリンの吸収及び発光マキシマムにも見いだ される。これらの考察から、好適試薬群は、２．３または４個のへテロ原子も考 えらねるとはいえ、最低１個のＸがヘテロ原子であるものである。 置換基Ｗは、好ましくは１０−６Ｍ以下の濃度で、試薬に水溶性を与える。その 水溶性は温度約４℃（たとえばフローサイトメトリーに用いる場合）乃至約１０ ０℃（たとえば遺伝子プローブに用いる場合は６７℃）にわたって保持される。 また、Ｗはモノメリズムを最大にするように、言い換えれば水溶液中の発蛍光団 の凝集を最低にするように選択される。発蛍光団の凝集は蛍光を消失させ、従っ てプローブの感度を制限し、そのためアッセイ環境におけるその利用は制限され る。モノメリズムは以下に、より詳細に論じられる。帯電による反発は凝集を抑 制するから、Ｗは中性よりも帯電している方が好ましい。しかしながら、Ｗは非 特異的結合を促進してはならない。そこで核酸の配列決定の場合にはＷ基はマイ ナスに帯電し、て（Ｗはたとえばスルフォネート）マイナスに帯電しでいるＤＮ ＡまたはＲＮＡへのイオン的吸引を避けるべきである。反対に、プラスに帯電し 、たフタロシアニジ誘導体（Ｗはたとえば四級アンモニウム）は、ＤＮＡ、ＲＮ Ａ及びその他のマイナスに帯電した細胞成分を選択的に染色すＳのに用いられる 。前記の考察によると、水可溶化基は−ＯＨ，−ポリ−ＯＨ，−Ｃｏ、Ｈ，−０ Ｃ）１２　ＣＯ２Ｈ，−−ＯＣＨＤ＋　ＣＯ：ｒ　Ｉ（、ＯＣＤ＋　Ｄ２　ＣＯ ２Ｈ，−ＰＯ４２−’、−ＰＯ３−、＝ＳＯ，−。 Ｓ　０２−　、　Ｓ　Ｏｓ　’−，＝　Ｓ　Ｏ□Ｃ１，＝Ｎ″Ｈ１／−ＮＨ２、 Ｎ”　Ｒ２Ｄ／　ＮＨＤ、　Ｎ’　ＨＤＩ　Ｄ２　／−ＮＤ、ＩＴ）２及び−Ｎ ″Ｄ、Ｄ、Ｄ、の中から選択することができる。ここでＤ−Ｄ、は個々にアルキ ル（好ましくはＣ，Ｃｌｚ）、アリール（好ましくはＣ６Ｃｌ２）、またはアラ ルキル（好ましくはＣｂ　Ｃ，１２）、アミノ酸（たとえば一般的な２０の天然 アミノ酸から選択されるもの）、またはペプチド（たとえば２−１ｏ残基をもつ もの）である。特にスルフォネート基（好ましくは、２゜３または４）は、広い ｐＨ範囲にわたって（２−１，２）分子を水溶性にする。他方、カルボン酸基は ｐＨに対してより敏感であり、水性系におけるその有用性及び挙動を制限する。 ｐＨ５以下ではカルボン酸基はイオン化せず、従って水溶性を制限する。スルフ ォン酸及びリン酸両方ともｐ　Ｈ２以下ではイオン化する。四級アンモニウム基 はｐＨの如何にかかわらずプラスに帯電する。帯電基は適当な対イオンと結合す る。その対イオンは必ずしも限定されず、化合物の合成またはそれらの好ましい 蛍光特性を妨害しない総ての公知の対イオンであってよい。 置換基Ｙは、Ｘを水可溶化基Ｗ１または反応性または活性化可能の基Ｒ２に連結 する原子群である。好ましい実施態様において、Ｙはメチレン（−ＣＨ２−）で ある。 しかしより長いアルキル、アリールまたはアラルキル鎖でもよい（好ましくはＣ ２Ｃｌ２）。より長い連結は水溶性に不都合な影響を与え、溶液中の凝集を高め 、蛍光を減退させる。そこで、好ましい実施態様では、Ｙは約７以下の炭素原子 を有する。その代わりに、連結Ｙが、水溶性もモノメリズムも増加させるように 、親水性であるか帯電するかしていてもよい。適した親水性スペーサ−とじては 、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアルコール、及び天然に生成する糖、ペプチ ド、及びヌクレオチドがある。特に好ましい実施態様においては、Ｙは、】の位 置にＸを、４の位置にＷをもった（バラ置換）フェニルである。 上記の条件下で、Ｙは、脂肪族、芳香族、混合脂肪族／芳香族官能基、ポリエン （シスまたはトランス）、混合ポリエン及び／または脂肪族及び／または芳香族 官能基、アルキニル、混合アルキニル及び／または脂肪族及び／または芳香族官 能基、脂肪族及び／または芳香族及び／またはアルケニル及び／またはアルキニ ル官能基によって結合したポリエーテル、ポリアミド、ペプチド。 アミノ酸、ポリヒドロキシ官能基、糖及びヌクレオチドの中から選択される。Ｙ の精細な性質は重要でなく、実際には水溶性または蛍光を容認し難い程は妨害せ ず、合成時に受け入れられる限り、どんなＹ基でもよい。置換基Ｒ１は−ｘｙｗ 、−ｙｗ、−ｗ及び水素の中から個々に選択される。好ましい一実施態様におい て、３個のＲ１基が総ｒ−ｘｙｗ、−ｙｗ、まｆニーパーｗ、特＋、：、　−ｘ 　ｙＷである。他の好ましい実施態様では、」個のＲ２が−ＸＹＷで他の２個が −ＹＷ、または−Ｗである。 置換基Ｒ７は巨大環に結合したたとえば抗原または抗体のような生物学的実体で ある。Ｒ２は活性化可能基または反応性基であってもよい。たとえばＲ２はＸま たはＸＹリンカ−によってベンゾ環に結合してもよいし、直接ベンゾ環に結合し てもよい。ここで論じられるいくつかの実施態様において、Ｒ２はＲ，であり、 その場合生物学的実体は発蛍光団に共有結合していない。その他の実施態様にお いて、Ｒ２はＴＢＴＡＰまたはここに記載されるその他のトリアザポルフィリン 誘導体のメソ炭素に結合し、巨大環のベンゾ環の残りの可変部は各々Ｒ７である 。代表的生物学的実体（Ａ）としては、天然または合成薬剤（治療薬及び乱用薬 ）、薬剤代謝物、代謝産物、ホルモン、ペプチド、ヌクレオチド（たとえばＡＴ Ｐ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ｔＪＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ ＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄｔＪ ＴＰ、及びそれらの誘導体）、神経伝達物質、酵素基質、ＤＮＡ＊たはＲＮＡプ ローブ、ＤＮＡまたはＲＮＡ　（オリゴ及びポリヌクレオチド）、ＤＮＡ／ＲＮ Ａバイブリド、ＤＮＡ／’Ｄ　Ｎ　Ａバイブリド、ＲＮＡ／ＲＮＡバイブリド、 増殖因子、抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）。 抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、血清蛋白質、ストレプトアビジ ン、アビジン、酵素、細胞小器官、細胞表面抗原、レセプター、リガンド結合蛋 白質または関連リガンド、膜プローブなどがある。蛍光部分（すなわち巨大環） は好ましくはモノマーとしてＲ２に結合し、蛍光を増加させる。生物学的実体の 詳しい性質は重要でない。生物学的実体への発蛍光団の結合が、結合物の有用性 を破壊しない限り、それは本発明の範囲内であると考えられる。 “膜プローブとは、好ましくは１０−３０の炭素原子を有する親油性有機部分を 意味する。好ましい実施態様において、膜プローブは長鎖炭化水素基である。炭 化水素基が、直鎖または分枝鎖である。或いは環状リングを含む飽和Ｃｏｏ　Ｃ ｓ。アルキル基であることが特に好ましい。膜プローブはＴＢＴＡＰのベンゾ環 またはメソ炭素に結合する。 生物学的実体をフタロシアニンに結合させる好まし５いリンカ−は、スルフォン アミド、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミン、 及び炭素−炭素結合である。この目的のためには、生物学的実体は末端アミノ、 カルボキシ、α、β−不飽和不飽和カルボニル−チオールフォニルクロリド、ま たはハライド基を、フタロシアニンへの結合のために持っていなければならない 。フタロシアニンは、これはこれで、対応する反応性基、たとえばカルボキシ、 アミノ、チオール。 α、β−不飽和カルボニル、スルフォニルクロリドまたはヒドロキシを持ってい なければならない。 生物学的実体Ａに対する結合鎖Ｙ’　（Ｒ２中の）は、一般的生物学的アッセイ で八を最適に識別するのに十分な長さを有する。たとえばアルケン、アセチレン 、環状、芳香族またはア“ミノ基を含む硬リンカ−の使用によって、フタロシア ニンまたはテトラベンシトリアザポルフィリンからのＡの置換をさらに高めるこ とができる。リンカ−Ｙ’　の一部と１２での親水性または帯電基の選択によっ て、フタロシアニンの水溶性も高められる。親水性スペーサーとしては、ポリエ ーテル、ポリアミン、ポリアルコール、及び天然によって生成する種、ペプチド 及びヌクレオチドがある。水溶液中での凝集を減らすためには、長い親水性結合 鎖は避けるべきである。下記は本発明の式ｌのいくつかの化合物の例証的実施態 様である。 アルミニウムフタロシアニンテトラグリコレート一実施態様において、本発明は 伴生（ｅｏｍｐａｎｉｏｎ　）水溶性アルミニウムフタロシアニン誘導体を提供 する。好ましい実施態様において、本発明は二種類のアルミニラムラ用・ラグリ コリ刀フタロシ了二ン異性体、２及び３、ヲ枦供する１、ぞｔ＋、、　９’　ｉ １アルミニウムフタロシアニン）　ＩＪスルフォネート（、−こては化合物１と する）！Ｊ対して赤色にシフトシた発光バンドを有する９、千トラカッｌ、ボッ 酸Ｘ導体はこ０）実施例１に示さｔ１６ｊ′ｉ法で製造されるっ２・−）υつフ ど・′ロシアニンの唯一・の差は、巨大にｉ　、ｈのグリコリルＭ、　（−０Ｃ Ｈ２Ｃ○２１４）の結合ｆｆｆ置である。２，９゜１１３＋２３位画の＃、）換 は２を与え、Ｌ　８．１５．２２４）漣；”換は３４与える１２こわらの誘導（ 本ｒ−あるカッ１．ボン酸基は、水溶性さ、化、ｉ舌Ｉｉ−刀を生物学的実体ｌ こ結合さ七る反応’ｊ’）；、　’ｆ、＃’Ｑ　ｊべとを択供゛吋゛る１、２及 び３に結合ψ゛る代表的生物学的天体は、抗原、抗体または抗体フラグメント、 レセプター、細胞小器官、蛋白質、Δ−とえばアビジン及びストトプトアビジン 、酵素基質、膜ブワーブ、ヌご゛レオヂド及び、これ！三）の誘導体、核酸ブ０ −ブ、及び核酸である。。 ｔ２　；＋び３の水中（、おける吸収スペクトルを図３に示動。 両化合物共、紫外部において共通の励起波長を有シ（３５ｈＦｌ）　、モル吸光 度は約１０．　ＤＤＤである。図４１こおいて示すように、この２つの化合物の 発光の最大値は区別され、２では発光波長７０４ｎｍで、３では７２７■である 。蛍光の量子収量は、２及び３で、それぞれ０．５５及び０．４３である。 ２つの発蛍光団のスペクトル分解能は、環境の影響を受ける。図５はセチルトリ メチルアンモニウムプロミド（０，ＯＨＭ　ＣＴＡＢ）水溶液中の２及び３の発 光スペクトルを示す。３０発光スペクトルはほとんど変化しないが、２では７１ ６ｒ＋＋ｎへ劇的赤色シフトが起こる。 償も好ま１．い実施態様において、本発明は四種類の新規の水溶液、結合性アル ミニウムフタロシアニン−ベースの発蛍光団の一族を提供する。この族は２絹の 異性体的アルミニウムフタロシアニン誘導体から成る。発蛍光団各組の発光は特 異的で、他のものと区別することができ、総てが１に対して赤色側にシフトして いる。 第〕−絹の発蛍光団はテトラフェノギシ画換アルミニウムフタロシアニンである 。４−フェノキシフタロニトリルからフタロシアニンを形成すると、２．９．１ ６．２３−フェノキシ置換フタロシアニンが生ずる。３−フェノキシフタロニト リルを用いた同様な反応は、　１．　８゜３、５．２２−［換フタロシアニンを 生成する。アルミニウム・挿入後、これらの誘導体をクロロスル“）すン酸てダ ニ理オ゛ると、生物学的実体、たとえば抗原、抗体また（−抗体フジグメン）・ 、■ノー腎！ブター１細胞小器官、アビジン及びスト１．／ブトフビジソのよう な蛋白質、酵素基質、膜プローブ、、ｘ；’ｔノオ千ド及びそれらの誘導体、核 酸プローブ、及び核酸に結合する反応性スルフ嗜ニルクＤリド銹導体が生ずる。 スルフォニルクロリドの、スルフォン酸・＼の加水分解により、水溶性同族体が 生成ずろ。スルフォン化テトラフェノキシアルミニウムフタロシアニン、４及び ５、の水中における吸収スペクトルを図６に示す。 発光スペクトルは図７に示ｆ。＝４及び５の合成並びにこれらのスベク）・ル特 性の表を実施例２に記す。 竿２組の発蛍光団はテトラチオフエノキシ置換アルミニウムフタロシア、°−ン でめる１、−」１記のように、４−チオノ；ノキシククロニトリルは２，９，１ ６．２３−置換フタロシアニ、二ノを提供し５．３−千オフエノキシフクロ二〜 トリルは１．、　８．　１５．　２２−Ｗ換異性体を与える。アルミニウム挿入 後、これらの誘導体をクロロスルフォン酸で処理すると、生物学的実体への結合 に有用な反応性の化合物が生成する。加水分解は高度に水溶性のスルフォネート を生成する。スルフォン化テトラチオフェノキシアルミニウムフタロシアニン、 ６及び７、の水中における吸収スペクトルを図８に示す。発光スペクトルを図９ に示す。６及び７の合成並びにこれらのスペクトル特性の表を実施例２に記す。 これらの化合物を上記の反応性または活性化可能のＲ２基に結合させて、ＤＮＡ 塩基配列法定を含む種々の目的のために使用できる結合物を別の好ましい実施態 様においては、テトラベンシトリアザポルフィリン（ＴＢＴＡＰ）系から誘導さ れる４種類の新規の発蛍光団の第２群が示される。これらの発蛍光団は、リング 系の２０の位置のみがフタロシアニン４−７と異なる。フタロシアニンでは、位 置２０は窒素原子であり、テトラベンシトリアザポルフィリンでは位置２０は置 換炭素である（式Ｉにおいて、Ｚは、フタロシアニンではＮであり、テトラベ〉 ・シトリアザポルフィリンではＣＲである）。この実施態様において、２０位置 の炭素はフェニルで置換されている。 最も好ましい実施態様において述べたように、４種類のアルミニウムＴＢＴＡＰ 発蛍光団の群は２組の酸素及び硫黄位置異性体から成る。４−フタロニトリル、 すなわち４−フェノキシフタロニトリル、３−フェノキシフタロニトリル、４− チオフェノキシフタロニトリル、及び３−チオフェノキシフタロニトリルの各々 と、ベンジルマグネシウムプロミドとを反応させると、アルミニウムで金属化さ れ、スルフォン化されると化合物８−１．１をそれぞれ与えるＴＢＴＡＰリング 系が生ずる。アルミニウムー２０−フェニルテトラベンシトリアザポルフィリン の製法及びそれらのスペクトル特性の表を実施例３に記す。 アルミニウムテトラフェノキシＴＢＴＡＰ誘導体の発光スペクトルを図１０に示 す。同様にテトラチオフェニル誘導体の発光スペクトルを図１１に示す。アルミ ニウムフタロシアニンの場合のように、ＴＢＴＡＰ硫黄同族体は酸素一対応物に 対して赤色側にシフトし、１，８゜１５．２２異性体は２．　９．　６．　２３ −異性体に比較し。 て赤色側にシフトする。 ２種類の新規、水溶性のアルミニウムテトラベンシトリアザポルフィリンについ ても述べる。これらの化合物はフタロニトリルから誘導され、従って置換されて いない。メチルマグネシウムプロミドとフタロニトリルとの反応に続いてアルミ ニウムを挿入すると、アルミニウムー２Ｏ−Ｈ−ＴＢＴＡＰが生成する。同様に ベンジルマグネシウムプロミドをフタロニトリルと反応させた後、アルミニウム を挿入すると、アルミニウムー２０−フェニル−ＴＢＴＡＰが生成する。これら の誘導体を両方とも、クロロスルフォン酸処理によって、生物学的実体上の反応 基（たとえば−ＯＨ，−ＮＨ２，−３Ｈ）と反応するようにした。反応性スルフ ォニルクロリドの加水分解は対応スルフォネートアルミニウムー２Ｏ−Ｈ−ＴＢ ＴＡＰスルフォネート、１２．及びアルミニウムー２０−フェニル−Ｔ　Ｂ　Ｔ 　Ａ、　Ｐスルフォネート、１．３．を与える。水中の１２及び１３の吸収及び 発光スペクトルをそれぞれ図１２及び１３に示す。製法及びスペクトルのまとめ を実施例４に記す。 ２種類の新規のカチオン性フタロシアニン、１４ａ及び１４ｂ、も記す。負に摺 電した水溶性アルミニウムフタロシアニン誘導体の他に、正に帯電した誘導体が ある。 前述のカルボキシル化及びスルホン化フタロシアニンとは異なり、トリメチルア ンモニウム官能化フタロシアニンは、その大きい水溶性にもかかわらず、水中で は蛍光を発しないことが判明した。吸収スペクトルを調べると、高度の凝集があ ることがわ力じた。だが我々は、アニオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウ ム、ＳＤＳ、一般的濃度、約０．０１Ｍ）の存在下でカチオン性発蛍光団の解凝 集が起こることを見いだした。解凝集にともなって、蛍光発光の増加が起こった 。凝集発蛍光団溶液をＲＮＡと接触させると、同様な蛍光増加が起こった。水中 における、及びＲＮＡ存在下での１４ａ及び１４ｂの吸収並びに発光スペクトル を図１４１図１５１図１６及び図１７に示す。１４ａ及び１４ｂの製法並びにＲ ＮＡ結合実験は実施例５に記載した。 本発明の第２の面においては、式Ｉのベンゾ環の１−４個が１個または２個のＮ 原子を含むフタロシアニ〉及びテトラベンシトリアザポルフィリン ている。ベンゾ環に２個のＮ原子が含まれるとき、それらは概してビラジシ関係 にある（すなわちベンゾ環の１。 ４位ｆｌり。フタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリン　ピリジン ／ピラジン誘導体が両方とも考えられるが、式ＩのＺがＮであるのが好まし，い 。Ｒ，がメソ炭素に結合し、その場合には巨大環のベンゾ環の各々は７，そこに 結合したＲ，基を有する。 ３５ｂｍ　ｌごおける励起によって誘起されるアルミニウム・フタロシアニンの トリスルフォネート誘導体、１、の蛍光の波長（６ｇ５ｎａ　）は、生理的溶液 中の内因性発蛍光団の発光より赤色側にシフトする。１の赤色発光波長はこの発 蛍光団のｆｉ　ｔ）重要な利点の１つである。発光は内因性発蛍光団のそれ（４ ００・−６００ｎｍ　：）からずっとシフトするから、、バックグラウンドが減 少する。バックグラウンドの減少はより高いシグナル対バ・・・フグラウンド比 及びより大きい感度をもたらす。この利点は、励起波長のところに吸収がある限 り、ｖＪＩｔ１′！される場所にかかわらず実現する。１の、３２５ｎｍ　（ヘ リウムカドミウムＬノーザー）、、約３５０ｎｍ　（Ｈｇランプ源またはアルゴ ニ／・イオニ・・レーザー）、または６３３ｎｍ　（ヘリラムネオニ／レーザー ）、または６７０ｎｍ　（ダイオードレーザ−）における励起は、６８５ｎＩｌ ｌにおける発光を起こす。 】を３２５ｎｍ及び約３５０１１ｍｌにおいて励起すると、３０［ｔｎｉ以上の ストークスシフトをもった発光が起こる。このストークスシフトはバックグラウ ンドをより減少さゼ、感度をより高める。蛍光測定は、たった１０−１″′Ｍの 濃度のアルミ、−ウムフタロジ−ｙ−：、　；叫・リスＪ１．フォネート１でも 検出可能であることを示［、ていで）。直線グイ＋ミック１ｙ：、ジ研究（ｌｉ ｎｅａ＋　ｄｙｒｌａｍｉｃ　ｔａｎｇｅ　ｓ！ｎｄｙ）は、９０以、ｊ−の適 用可能範囲、並びにフルオレ上１′ン及びローダミンＢに比較し５て優ねた検出 耐昇を明らかｉ：Ｊた。１の赤色発光は、大きいストークスシフトの利点と一緒 になって、シグナル対バ・ソクグ”７　＋′７ンド比をフル第１・・・セインの それΣ、ミ比較しく″！ＤＯ倍増加さ→＋る。 同時多成分蛍光分析、たと（６ば核酸塩基配列分析、７０−ザイトメトリー、イ ム、ノア・ソセイ４　または核酸ブし一ブアッセイにこ４１らの試薬・を利用す るためには、誘導体の一族の形成が必要である。、パねらの誘導体は水溶性で、 共通の励起波長をもっていなけ第１ばならず、しかも異なる波長で発光ｊ９．な ければならない。また、各誘導体の発光バンド幅は狭く　［半値全幅（ＦＷＨＭ ）＜４０ｎｍ］、−族の他のメンバーから分解可能でなければならない。 特にアルミニウムフタロシアニン（Ａｔ　Ｐｃ）−ベースの発蛍光団は、これら 総ての用途に現在用いられている色素に優る利点をいくつか有する。 第１に、ＡｌＰｃ誘導体の発光スペクトルはより小さいバックグラウンド干渉を 受ける。レイリー、チンダル。 またはラマン散乱に帰せられる干渉は、大きいスト−クスシフトにより及びフタ ロシアニンの長波長発光特性に、：、す５．１００分の］にも減少し得る（〉約 ３００ｎｍ　）。アルミ、−ウノ、２７りロシアニンは、内因性蛍光（４００− ６０ｈｍ　）より遥かＪこ離れた赤色領域（＞６８０！１ｍ　）で発光する。こ れに対し、で、核酸塩基配列分析、フローサイトメトリー。 イムノア・Ｉサイ及び核酸プローブアッセイのために現在Ｔ％販されでいるフル オレセイン及びローダミン誘導体は、２Ｏ−−４０ｎＩｌ！のストークスシフト をもつに過ぎず、５５０１’１ｍ以下の波長で発光する。 第２に、アルミニウムフタロシアニン−ベースの発蛍光団では発光波長マキシマ ムの間隔がより大きい。公知のフルオレセイン族の発光マキシマムの範囲はたっ た２１１ｍで、各色素間の一般的分離幅は６ＩＩＩ１１である。これに刻し、て 、フタロシアニングループは約５０ｎｍの間隔をもち、グループのメンバー間の 平均分離幅は１５ｎ＋ｎ以上である。 第３に、アルミニウムフタＯシアニンーベースの発蛍光団はシャープな発光バン ドを有する。フルオレ七インーベースの色素の半値全幅は約３２　３７　ｎｏ＋ の範囲で、顕著な赤色テールを有する。これに比して、フタロシアニン−へ・− ・スの発蛍光団は約２２１−３０ｎのバンド幅をもち（７は例外で、ＦＷＩイＭ ＝３９＋＋ｍ）、赤色テールもほとんどない。 要するに、これら特性の総てのために、アルミニウムフタロシアニン−ベースの 発蛍光団は、多成分系分析において核酸塩基配列分析、フローサイトメ）・リ− ６イムノアッセイ、及び核酸プローブアッセイに使用するのに理想的な候補であ る。概１．’［この可能性を実現オるためには、ア７トミニウムフタロジアニン ーベースの発蛍光団は千ツマ−として結合しなければならない。 核酸塩基配列分析のために選択された７１種傾のアルミニウムフタロシアニ、・ ・スルフォネート（１，４，５，７）の発光スペクトルを図１８に示す。 」１記のように、フタロシアニン及び］”ＢＴＡＰの蛍光発光は、発蛍光団を凝 集さぜるよりむしろモノマーにすることによって増加する。水溶液中の金属フタ ロシアニン及びＴ　Ｂ　Ｔ　Ａ　Ｐのモノメリズムの程度は、金属の関数である 。軸リガンドをもつことができない二価の金属は連なり易く、低いモノメリズム をあられしがちである。 三価以上の金属は、軸リガンドのため凝集しにくい、そのため溶液中でより多く の蛍光を発する。従って蛍光試薬のために最も好ましい金属はアルミニウム、ガ リウム。 カスンジウム、ケイ素、ゲルマニウム、及び錫である。 磁気共鳴・イメージング用途のために適した金属フタロシアニン及びＴＢＴＡＰ はたとえば鉄、マンガン、及びガド１１ニウムなどの常磁性体金属をもつ。ここ でそれら金属は３＋の酸化状態にある。 放射性イメージング及び治療的用途に適した金属フタロシアニン及びＴＢＴＡＰ は、たとえば銅、コバルト。 ガリウム、及びテクネチウムのような金属の放射性同位元素をもつ。放射性核種 はガンマ放出体であり、敏感な１゛メージングブローブである。 １９８９年６月１４日提出の米国特許第３６６、９７１号との関連において、我 々はこれらの化合物の分光学的特性（最大紫及び赤吸収ピークの相対的高さの点 ）とそれらの相対的量子収量との間に実験的関連性があることを発見した。 アルミニウムフタロシアニンスルフォネート研究の初期において、我々は紫の吸 収が凝集状態、従って発光収量と無関係であることを認めた。それに対して、赤 吸収バンドにおける変化によって凝集の始まりを辿ることができた。概して我々 は、Ａ（赤）／Ａ（青）比が相対的量子収量の減少につれて低下することを見い だした。また、蛋白質結合色素の挙動はより低い相対的量子収量の方ヘシフトす るが、溶液中の遊離色素に非常によく平行している。量子収量のこのシフトまた は減少は多分、凝集の抑制よりも蛋白質環境の疎水性によるものである。 本発明のフタロシアニン結合物の、モノマー結合物に関する最も好ましい実施態 様は、Ａ（赤）／Ａ（青）≧２を有する。このような結合物は方法３によって容 易に製造される（下記参照）。 好ましくは主題の結合物のＡ（赤）／Ａ（青）比が≧１．７５でなければならな い。このような結合物は方法２によって容易に製造される。 約１．５と１．７５との間のＡ（赤）／Ａ（青）比をもち、ある目的に適してい るフタロシアニン結合物は比較的限られた感度をもち、従って有用でない。 本発明のフタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリン結合物は、それ らのモノマー結合及びＡ（赤）／Ａ　（青）比に関して類似の傾向を示す。しか しながら本発明において開示されたいくつかの種は、水溶液中でモノマーとして 、遥かに強い青眼光度をもち（たとえば化合物４）、あるものは赤吸光度の減少 を示す（たとえば化合物１２）。その結果、最も好ましい結合方法は、発蛍光団 によって、１．４乃至２，０の範囲のＡ（赤）／Ａ（青）を与える。モノマー結 合物の代表的製法を以下に記す。これらの方法はアルミニウムフタロシアニンで 示されているが、これらの方法は、ここに開示されるその他のフタロシアニン及 びテトラベンシトリアザポルフィリンにも適用できることは当然である。実施例 ６は、赤色シフト−アルミニウムフタロシアニンの反応型とストレプトアビジン との結合を記載する。 方法１：第１の方法において、アルミニウムフタロシアニンは結合リンカ−によ って大きい分子に結合する。 結合リンカ−は小さい二官能性有機分子である。結合リンカ−は２−１２原子の 長さである。結合リンカ−は長さ７−１２原子で、立体障害があるのがより好ま しい。 長い、立体障害のある結合鎖は、アルミニウムフタロシアニンが生物学的実体か ら置換され、また大きい分子上の個々のアルミニウムフタロシアニン部分が互い に置換されることを保証する。方法２及び３に関しては結合リンカ−法が用いら れる。 方法２ニアルミニウムフタロシアニンは、凝集しない有機化合物、たとえばＤＭ Ｆ、を含む水溶液の使用の下に大きい分子に結合する。解凝集剤の使用が、アル ミニウムフタロシアニンが凝集状態でよりもモノマーとして確実に結合すること を助ける。 方法３：第３の方法では、発蛍光団を非凝集性溶液中であらかじめインキュベー トし、次いで発蛍光団をＤＭＦのような凝集しない有機溶媒を含む水性溶媒中で 大きい分子に結合させることによって、アルミニウムフタロシアニンを大きい分 子に結合させる。予備的インキュベーションは、非凝集性溶媒中で結合させる前 にアルミニウムフタロシアニンの反応性誘導体をジメチルフォルムアミドと、３ ０℃で１時間混合することによって好適に行われる。非凝集性溶媒中での結合の 前に、非凝集性有機溶媒（たとえばＤＭＦ）中で発蛍光団を予備的インキュベー トすることは、フタロシアニン及びポルフィリンを含めた蛍光種とのモノマー結 合物生成のためのこの種の方法の最初の開示である。 本発明の第３の面において、式Ｉで表わされ、但しＲ２＝ＸＹＷ、Ｒ，、Ｘ、及 びＹは上記の通りで、Ｗ＝−Ｎ″ＤＩ　Ｄ２　Ｄｉであり、ここでり、−Ｄ３は 独立的にＨ，アルキル、アラルキル、またはアリールであり、またはＷはビリジ シ基である、カチオン性フタロシア、ニン及びテトラベンシトリアサポルフィリ ン誘導体が開示されている。Ｄ、−Ｄｓは好適にはＨ，Ｃ＋　Ｃ：＋ｏアルキル １ｃ６ｃ１２アラルキルまたはＣ６Ｃ１２アリールである。これらの化合物の対 イオンは、安定で、合成可能であり、水溶性及び好まし、いスペクトル特性を妨 害しないものならよい。例証的負の対イオンはＩ、Ｂｒ、Ｃ１゜Ｆ、硼酸塩など である。例証的圧の対イオンはＣａ’。 Ｍｇ’　、Ｎａ−、Ｋ”　、四級アンモニウムなどである。 これらの化合物を用いて、概ねＤＮＡまたはＲＮＡに対する非特異的結合によっ て、ＤＮＡ及びＲＮＡを検出する。ＤＮＡまたはＲＮＡに結合した化合物の蛍光 測定は、標漁的蛍光測定成分によって行われる。 開示された試薬の使用 概して、本発明の第１及び第２の面の試薬は、標的物質、特に分析物に特異的に 結合し得る結合パートナ−（またはリガンド）と組み合わせて用いられる。ひと たび結合パートナ−が分析物または関心の標的に特異性に結合したならば、試薬 （この分野ではレポーター基と呼ばれる）は蛍光測定によって検出され、分析物 の存在及び／″または量が確認される。レポーター基は結合ノ々−トナーに共有 または非共有結合し、分析物と結合ツク−トナーとが相互作用し結合する前に結 合しても、後に結合してもよい。 、一実施態様において、レポーター基は、結合／＜−）＋、−と分析物とが相互 作用し結合する前に結合ツク−トナーに共ｔｉｆｆｉ結合する。もう」つの実施 態様においては、結合パートナ−を分析物と相互作用並びに結合さヒ、結合後、 ［７・ポーター基が結合パートナ−１こ共有または非共有結合する。たとえば結 合パートナ−はビオヂン部分と結合し２、レポーター基はアビジン及びス）・レ ブトアビジンに結合する。その他の特異的結合対を用いて結合、＜　トナーとレ ボ−９−基とを連結することもできる。 結合パートナ−７・″分析物対として、下記が代表的、好適実施態様である・ ・核酸プローブまたはプライマー（たとえば５−・＋０．０００の核酸塩基をも つＤＮＡまたはＲＮＡ）／］本本機標的ＤＮＡたはＲＮＡ ・酵素／′基質 ・抗体／抗原（遊離、または、他の構造たとえば細胞などに結合） ・ＤＮＡまたは蛋白質結合蛋白質／ＤＮＡまたは蛋白質 ・レクチン／炭水化物 ・リガンド／リガンド結合蛋白質 上の実施例において、結合パートナ−及び分析物の細かい性質は比較的重要でな い。必要なことは、結合パートナ−及び分析物が互いに特異的に結合でき、ここ に記載される試薬が、分析物に結合する前でも後でも、また共有結合によるか、 第２の特異的結合対、たとえばアビジン：ビオチン、ストシ〆ブトアビジン：ビ オチン、及びマルトース結合蛋白質：マルトースのようなしっかりと結合する一 対によって、結合パートナ−に結合することだけである。 また別の好ましい実施態様において、１種類以上の分析物が、本発明の検出法に よる種々の試薬に各々結合した相当数の結合パートナ−を用いて、同時に確認さ れる。 これら種々の試薬は、分離検出のためには、実質上型ならない発光スペクトルを もつことが必要である。ある特定のアッセイに用いられる異なる試薬の組み合わ せは、総てが同じ一般的種類のものであるか（たとえばフタロシア、＝ン類また はＴＢＴＡＰ）　、またはいくつかのび薬の種類の混合物（たとえばフタロシア ；ン及びＴＢＴＡＰ）である。蛍光マキシマムは異なる波長に１．好ましくは最 低約７＋ｖ離れて、あられれなければならない。 い＜−、ノかの蛍光試薬を同時使用する場合には、発蛍光団は定量のために容易 に識別され、或いは比率法によって定量可能でなｌ、すればならない。 サンガーＤＮＡ塩基配列決定法では、配列決定プライマーが５′末端でアミノ基 で変形されるか、４個のジデオ片ジヌクレオチドの各々を４蛍光試薬の各々で標 識する。 ニアｉ：ｌ・・−サ・イトメトリーでは、ｓ’ｉｎ胞のあるづブセ・・１１・に よ−・て表現４される細胞Ａ面抗原が蛍光試薬及び抗体または抗体；フラグメン トで直接または間接に標識される。標識され、定量される細胞サブヤッ）・の数 は、用いられる特異的蛍光標識の数に１．よって決まる。 イムノアッセイでは、使われる蛍光試薬の数の、８々が異なる抗原、抗体または 抗体フラグメントに結合する。 たとえば同時甲状腺イムノア・ソセイテストパネルは、トリョードチロニン（Ｔ ３）を第１の蛍光試薬で、チロキシン（Ｔ４）を第２の蛍光試薬で、抗甲状腺刺 激ホルモン（ａｎｔｉ　−Ｔ　Ｓ　Ｈ）を第３の蛍光試薬で標識することによっ て行われる。 プローブアッセイでは、異なる核酸プローブに種々の数の蛍光試薬を結合させて 同時プローブ分析を行う。単一ハイブリダイゼーション段階の結果として検出さ れるプローブの数は、用いる蛍光試薬の数によって決まる。 好ましい実施態様では、第１及び第２の面の試薬を用いて核酸分子またはフラグ メントの塩基配列決定を行う。 ＤＮＡ塩基配列分析の最も一般的アプローチは、サンガーのジデオキシヌクレオ ヂド塩基配列決定法である。単一レーン−ゲルＤＮＡ塩基配列分析では、４種類 のアルミニウムフタロシアニン誘導体の一族が必要である。これら誘導体を用い て、塩基配列決定プライマーかまたは４ジデオキシヌク’＞−□オチド（ｄｄＮ ＴＰ’　ｓ）の各々を標識化する。驚くべきことに、関連化合物は、ＤＮＡを分 解し、得る一重項酸素を生成することがわかっているとはいえ、これらの化合物 は分解せずにＤＮＡの塩基配列決定に有効に用いられる。 標識プライマー戦略においては、単一のプライマーを４種類の蛍光標識の各々で 標識する。各標識化ブライマ−１鋳型、塩基配列決定酵素、ジデオキシヌクレオ チド（ｄＮＴＰ’　ｓ）及び４種のｄｄＮＴＰのうちの１つで、４つの別々のサ ンガー塩基配列決定反応が行われる。ひとたび伸展及び終止が完了すると、４反 応物はプールされ、塩基配列決定ゲルの単一レーン上におかれる。各伸展プライ マーは４つのｄｄＮＴＰの１つで打ち切られ、４色素の１つで標識化され、その 後ゲルから直接出る蛍光発光を走査することによって塩基配列が決定される。 別法として、標識化プライマーよりもむしろジデオキシヌクレオチドのような標 識チェーンターミネータ−が用いられる。この方法を用いると、４塩基配列決定 反応の総てが単一の容器で行われ、その後配列決定ゲルの単一レーン上におかれ る。 本試薬に含まれる巨大環は、塩基配列決定のために従来用いられている反応フル オレセインまたはローダミン試薬より大きく、相対的により平らである。その結 果、本発明の発蛍光団標識プライマーが塩基配列決定酵素と相い容れるかどうか は予想できなかった。塩基配列決定用発蛍光団を開発する会社の研究者たちは、 配列決定プライマー及びフラグメントの配列決定酵素との相容性並びに電気泳動 的移動性両方に問題があると予測した。実験的に、発蛍光団標識プライマーは配 列決定酵素と相い容れることがわかった。そして色素標識プライマー及び配列決 定フラグメントの電気泳動的移動性はアミノ変形プライマーまたは配列決定フラ グメントのそれと著Ｌ　＜は異ならない。 フタロシアニン標識プライマーの総て、及び２０−Ｈ及び２０−フェニルＴＢＴ ＡＰ標識プライマーは類似の電気泳動的移動性をもつことがわかっている。これ は、種々のフルオレセイン及びローダミン標識プライマーがかなり異なる移動性 をもつことを考えると特に、予想外の結果であった。プライマーの一様な移動性 は、フラグメントの一様な移動性を示唆する。これは配列決定操作及び分析を著 しく簡単にする。なぜならば複雑な実験的補正ファクター及び等式を広範囲にま たは全く使用しなくてすむからである。 本発明は、分析物のアッセイ実施、ＤＮＡ／Ｒ，ＮＡ染色、ＤＮＡ塩基配列決定 などのためにここに開示された試薬を含むキットをも提供する。そのキットは概 して本発明の試薬容器を１つ以上含み、必要または所望の場合はその他の化学物 質、対照などを含んでもよい。たとえば、Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列決定キットには、 ここに開示されたフタロシアニンまたはテトラベンシトリアザポルフィリン部分 に結合した鎖延長終止剤ジデオキシヌクレオチドの容器４本、その他にデオキシ ヌクレオチド、特にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの容器、ＤＮＡ ポリメラーゼの容器、鋳型ＤＮＡの容器及びプライマーＤＮＡの容器があるのが 好ましい。標識化鎖延長終止剤ジデオキシヌクレオチドはそれらの蛍光発光スペ クトルが見分けられるように、すなわちほとんど重ならないように選択される。 “はとんど重ならない”とは、発光スペクトルにおける発光マキシマムの波長が 、最低７　＋＋＋ｎ。 より好ましくは最低的１１０−２０ｎ離れていることを意味する。 別のＤＮＡ塩基配列決定キットは発蛍光団標識プライマー（本発明の試薬）の容 器；デオキシヌクレオチド、たとえばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ の容器；鎖延長終止剤の容器、たとえばｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、 ｄｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰの容器；及びＤＮＡポリメラーゼの容器を含む。 １つ以上の細胞型または異なる細胞サブセット上の異なるマーカーをフローサイ トメトリーを用いて同時検出するためには、スペクトルマキシマムが分離してい る２種類以上の試薬が必要である。重ならない発光マキシマムをもつ少なくとも ２種類の発蛍光団を使用すると、ユーザーは二色分析を行うことができる。二色 以上、の分析は、概ｊ２て、蛍光試薬または色素に間接（たとえば介在ビオヂ： ・：アビジン結合）または１接（すなわち共有結合）に結合する名、細胞型に特 異的な抗体を用いて細胞サブセットを標識化することによって行われる。 Ａ、　Ｉ　Ｄ　Ｓ試薬は、リンパ球を含む末梢血液サンプル中の２つのＴ細胞サ ブセットを同時分析することによって行われる。ヘルパーＴ細胞（１つの色）対 サプレッサＴ細胞（第２の色）の、２・１以外の比は、ＡＩＤＳ感染症のインジ ケータである。臨床的症状との関連において、この二色分析はＡＩＤＳ診断に用 いられる（実施例１６参照）。 多成分イムノアッセイを用いて２つ以上の分析物の同時検出ができる。コスト及 び時間を考えると、これは多くの臨床的使用において好ましい方法となる。各分 析物または各分析物に特異的な抗体が異なる蛍光色素で標識される場合、１つの 患者サンプルを用いて、一連の治療薬、乱用薬、感染症薬剤、ホルモン、または これらの組み合わせを検出することができる。 多成分プローブアッセイにより感染症病原体、癌、及び遺伝的異常を発見するこ とができる。多くの作用物質及び異常の検出に使用できるプローブライブラリー があるから、共通の波長で励起されるできるだけ多くの発蛍光団が所望である。 この用途では、病原体、癌、または遺伝的異常（出生時の欠陥または遺伝的疾患 を含む）と関連した染色体領域に特異的な各プローブは異なる発蛍光団で標識さ れる。本発明の試薬により処理または発見可能の癌は必ずしも制限されず、治療 薬または診断薬が開発されている総ての癌は、ここに記載の適した発蛍光団を用 いて治療または診断し得る。ここに開示された特に第１及び第２の面の試薬は、 標準法を用いる光力学的治療にも使用することができる（実施例１５参照）。 下記の実施例は、本発明の詳細な説明し、熟練せる当業者がこれを作り使用する のを助けるためのものである。 下記の実施例は、これに関する特許によって与えられる開示または保護の範囲を 決して制限するものではない。 実施例１ 一百換フタロニド′ノルから構成される装置換−フタロシアニンは必然的に、４ 種類の異性体生成物から成る分離不能の混合物である。この生成したフタロシア ニンは環化過程におけるフタロニトリルの配向性の差から生ずる。４−置換フタ ロニトリルの環化は２，９，１６．２３−四置換フタロシアニン並びに他の３種 類の四置換異性体、すなわち２，９．１６，２４；２，１０．１６゜２４；及び ２．　９．　１７．　２４異性体を生成せしめる。 同様に、３−１１１換フタロニトリルの環化は、対応するｌ。 ８．１５．２２−四置換フタロシアニンを、他の３種類の四置換誘導体、１，８ ．１５，２５；１．１１．１５゜２５；１．ｓ、１８．２５異性体と共に生成す る。これを確認した我々は、簡単のために、３−置換フタロニトリルから構成さ れる四置換フタロシアニンをＬ　８．１５．２２と呼び、４−置換フタロニトリ ルから誘導されるフタロシアニンを２．９，１６．２３と呼ぶことにする。巨大 環の位置の番号は図１を参照されたい。 四置換アルミニウムフタロシアニンは一置換フタロニトリルから作られる。３− または４−ニトロフタロニトリルからニトロを酸素または硫黄求核原子で置換す ると、対応フタロニトリルがよい収率で得られる。ニトロ置換のために用いられ る酸素または硫黄試薬はフタロシアニンに水溶性と結合性を与える。或いはこれ ら必要な特性を与えるためにさらに手を加えてもよい。たとえばヒドロキシ酢酸 及びチオ酢酸などの試薬は適した官能基をもったフタ［１ニトリルを直接提供す る（ＸはＯまたはＳ。 ＹはＣＨ２、ＷはＣ０２Ｈ）。別法として、テトラオキシまたは子トラチオ置換 フタロシアニンをたとえばブロム酢酸、メチルのようなアルキル化剤で処理して 完全に官能化されたフタロシアニンを得ることができる。 ４−ニトロフタロニトリルをジメチルフォルムアミド中でネオペンチルアルコー ル及び炭酸カリウムで処理す率で得られる。そのフタロニトリルをメタノール中 でアンモニウムと反応させ、その後Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノエタノール中で還 流することによって、対応ジイミノイソインドリンから無金属の２．９，１６． ２３−ナトラネ１ペントキシフタロシアニンが４０％の収率で得られた［レズノ フ（Ｌｅｚｌｌｌｏｆｆ、　Ｃ，Ｃ，）ら、Ｃｇｎ。Ｊ、Ｃｂｅｍ、　５３巻６ ２３−６３１　ページ、１９８５］。 ２．９．１６．２３〜テトラネオペントキシフタロシアニンの金属化は塩化メチ レン中で１０モル当量の上りメチルアルミニウムで処理することによって実現す る。 室温で８時間以内に円滑な変換がおこる。生成物を酸性水性抽出操作によっＣ分 離し、アルミニウムヒドロキシ−２，９，：１．６．　２３−テトラネオペント キシフタロシアニンをほとんど定量的に得る。 ネオペンチル基の分離は、レズノフらがＰｈｏｊｏｃｈｅｍ、　ｐｈａｉａｂｉ ｏｌ、４６巻、９５９　９６３ページ、　＋９１１７、に概ね開示したように、 ベンゼン中で三臭化ホウ素との反応によって起こる。分解生成物であるアルミニ ウムヒドロキシ−２，９，１６，２３−テトラヒドロキシフタロシアニンは用途 の広い中間体で、種々のアルキル化剤で処理されて、テトラアルフキシ置換フタ ロシアニン−族を提供する。 テトラヒドロキシ誘導体をブロム酢酸メチル及び炭酸カリウム（それぞれ４０モ ル当量）で、還流メタノール中でアルキル化すると、テトラメチルエステル誘導 体が得られる。このアルキル化生成物は、（１，５Ｍメタノール性水酸化カリウ ム溶液中で加熱することによって、直接加水分解されてテトラカルボン酸になる 。アルミニウムヒドロキシ−２，９，１６，２３−テトラグリコリルフタロシア ニン２は、酸性水溶性から沈澱によつ分離された。 アルミニウムフタロシアニン−１，８，１５，２２−テトラグリコリルフタロシ アニン、３、の合成は、２について述べたものと同様である。 水中での吸収及び発光スペクトルを図３及び図４にそれぞれ示す。２異性体の発 光スペクトルに与えるセチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）の効 果を図５について示す。 下の表は、水中における１、２．及び３のスペクトルデータの比較である。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量１　６７３ｎｍ　６８３　０．６０ ２　６９２　７０４　０．５５ ３　７２０　７２７　（１，４３ 実施例２ 実施例２には、四置換−酸素及び硫黄置換アルミニウムフタロシアニンスルフォ ネートについて記す。実施例２０４種類の四置換試薬は一置換フタロニトリルか ら作られる。下記は、４種類のアルミニウムフタロシアニン−ペースの試薬グル ープの製法の詳細な説明である。フタロシアニンの製法、フタロシアニンの金属 化、反応性フタロシアニン生成、及び水溶性フタロシアニン生成の各部に分けて 述べる。各部では、４つの試薬の族の１つのメンバーについて詳細な方法を記し 、その後他の３試薬に関する方法についてコメントする。処理法の違いは総ては っきり明記した。 フタロシアニンの製法 ３−メチル−１−ブタノール１０の１中４−フェノキシフタロニトリル１．　Ｏ Ｋ　（４，５５ｍｍ）に、リチウム３−メチル−１−ブタノキシド５ｍ１（アル コール５ｅｌにリチウム金属１０ｍｇを溶解することによって作る）を加えた。 生成した溶液を窒素下で還流しながら６時間加熱した。真空下で溶媒を除去し、 粗生成物を塩化メチレン５０ｍＩ中に取った。その溶液をＩＮ塩酸水溶液３−５ ００１１部分で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過、濃縮した。それから 生成物を塩化メチレン１０ｍ１に再溶解し、メタノール１００ｍ１の添加によっ て沈澱させた。濾過によって生成物を集め、メタノール５００＋＋＋ｌで洗い、 真空乾燥した。 生成物（０，６０ｍｎ＋、　５２％）は青色粉末として分離された。 スペクトル特性を下記の表に示す。 ２、　９．　１６．　３２−テトラチオフェニルフタロシア三２ 上記と同様の方法で、４−チオフェニルフタロニトリルから、２．９．１６．２ ３−テトラチオフェニルフタロシアニンが５１％の収率で生成した。スペクトル 特性を下記の表に示す。 １、　８．　１５．　２２−テトラチオフェニルフタロシア玉乞 上記と同様の方法で、３−チオフェニルフタロニトリルから１．　８．　１５． 　２２−テトラチオフェニルフタロシアニンが８７９６の収率で生成した。この 場合、生成物は塩化メチレンから、メタノール添加せずに沈澱させて分離した。 次の表は、上記のように製造した無金属フタロシアニンの吸収及び発光の波長を まとめたものである。スペクトルは塩化メチレン溶液として記録された。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量２、９．１６．２３オキシ　７００ｎｍ 　７Ｑ５＋＋ｍ　０．２５！、　１１．１５．２２オキシ　７］６　７２３　０ ．Ｈ２、９，＋６．２３チオ　７＋１　７１９　０．４０１、８．１５．２２チ オ　７２３　７３８　０．２６フタロシアニンの金属化 乾燥塩化メチレン２００ｍ１中２．　９．　１．６．　２３−テトラフェノキシ フタロシアニン５００ｔｇ　（Ｑ、６ｈｍ）の溶液に、窒素下、室温で、２．０ Ｍ）リメチルアルミニウムートルエン溶液１０当量、３．０ｍｌ　（６，０ｍｍ 　）を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、それから蒸留水１０１の 注意深い添加によって、次いでＩＮ塩酸水溶液によって反応を鎮めた。その後溶 液を分離し、有機層を１Ｎ塩酸水溶液３−２０ｆｆ＋１部分で洗った。塩化メチ レン溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固させる。生成物、アルミニウ ムヒドロキシ−２，９，１６，２３−テトラフェノキシフタロシアニンは青色固 体として分離された（０．２５ｍ１．４１％）。スペクトル特性を下記の表に示 す。 アルミニウムヒドロキシ−１，８，１５，２２−テトラ上記と同様の方法でアル ミニウムヒドロキシ−１，８゜１５．２２−テトラフェノキシフタロシアニンを 合成し、そのスペクトルデータを表に示した。 上記と同様の方法で、アルミニウムヒドロキシ−２゜９．１６．２３−テトラチ オフェニルフタロシアニンを合成し、そのスペクトルデータを下記の表に示した 。 上記と同様の方法で、アルミニウムヒドロキシ−１゜８．１５．２２−テトラチ オフェニルフタロシアニンを合成し、そのスペクトルデータを表に示した。 下記の表は、上記のように製造したアルミニウムフタロシアニンの吸収及び発光 の波長及び相対的量子収量をまとめたものである。スペクトルはジメチルホルム アミド中で記録した。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量２、９．　＋６．２３オキシ　６８（ｌ ｎｍ　６１ｔ６ｎｍ　Ｏ，５ｉ１．８，１５゜２２オキシ　７０１　７０３　０ ．２５２、９．　ＩＬ　２３チオ　６８７　６９６　０．４６１、　ｌｌ、　１ ５．２２チオ　７１３　７２２　０ＪＯジメチルホルムアミド５０１中２．９， １６．２３−テトラフェノキシフタロシアニン２．５ｇ　（２，８ｍｍ　）の溶 液に、アルミニウムアセチルアセトネート１０当量、９．Ｏｇ（２８，０ｍｍ） を加えた。室温で１時間撹拌後、溶液をメタノール５００ｍ１で希釈し、粗生成 物を濾過により集め、メタノール５００１で洗い、真空中で乾燥した。アルミニ ウムアセチルアセトネー）−２，９，１６，２３−テトラフェノキシフタロシア ニン、１．７ｇ　（１，８４ｍｍ、６６％）が青色粉末として分離された。スペ クトルデータを下記の表に示した。 上記と同様の方法で、アルミニウムアセチルアセトネート−１，８，１５，２２ −テトラフェノキシフタロシアニンが収率５９％で製造された。スペクトルデー タを下記の表に示した。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量２、９．　＋６．２３オキシ　６８０ｎ ｍ＋　６８６ｎｍ　Ｏ，２７１、８，１５，２２オキシ　６９７　７０１　０． ２０アルミニウムヒドロキシ−２，９，１６，２３−テトラフェノキシフタロシ アニン９６ｍｇ　（０，１０４ｍｍ　）に、クロロスルフォン酸１゜Ｏｍｌを加 えた。混合物を撹拌して溶解せしめ、アルゴン下で密封し、あらかじめ平衡化し た１００℃のオイル浴中に浸した。溶液を１００℃で１時間撹拌し、０℃に冷や し、粗反応混合物を氷１０ｇに徐々に加えることによって反応を抑えた。固体生 成物を濾過によって集め、蒸留水２−２−２Ｏ部分及びジエチルエーテル２−２ −２Ｏ部分で洗った。それから固形物をフラスコに移し、ジエチルエーテル２０ １中で微粒子にまで粉末化し、濾過により集め、ジエチルエーテル２−２０ｍ！ 部分で洗い、真空下で乾燥した。アルミニウムヒドロキシ−２，９，１６，２３ −テトラフェノキシフタロシアニンスルフォニルクロリドが８９％収率で分離さ れた。スペクトルデータを下記の表に示す。 反応温度が７０℃であること以外は上記と同様な方法で、アルミニウムヒドロキ シ−１，８，１５，２２−テトラフェノキシフタロシアニンスルフォニルクロリ ドが５４％収率で分離された。スペクトルデータを下記の表反応温度が１００℃ であること以外は上記と同様な方法で、アルミニウムヒドロキシ−２，９，１６ ，２３−テトラチオフェニルフタロシアニンスルフォニルクロリドが定量的に分 離された。スペクトルデータを下記の表に反応温度８０℃であること以外は上記 と同様な方法で、アルミニウムヒドロキシ−１，８，１５，２２−テトラチオフ ェニルスルフタロシアニンスルフォニルクロリドが７３％収率で分離された。ス ペクトルデータを下記の表に示す。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量２．９、＋６，２３オキシ　６８４ｎｍ 　６９３＋＋ｍ　Ｏ，４１１，８、＋５．２２オキシ　７０４　７０８　０．＋ ４２、９．１６．２３チオ　６９７　７０３　０．３８１、８．　＋５．２２チ オ　７１５　７２４　０．１？水溶性フタロシアニンの生成 蒸留水１０ｍ１中アルミニウムヒドロキシ−２，９，１６，２３−テトラフェノ キシフタロシアニンスルフォニルクロリド１０ｍｇの溶液を室温で４８時間激し く撹拌した。生成した溶液を濃縮乾固し、アルミニウムヒドロキシ−２，９，１ ６，２３−テトラフェノキシフタロシアニンスルフォネート、４、を定量的に得 た。水中の４の吸収及び発光スペクトルを図６及び図７にそれぞれ示した。スペ クトルデータは下記の表に示す。 上記と同様な方法でアルミニウムヒドロキシ−１，８゜１５．２２−テトラフェ ノキシスルフォネート、５、が定量的に分離された。水中の５の吸光度及び発光 スペクトルを図６及び図７にそれぞれ示す。スペクトルデータを下記の表に示す 。 上記と同様な方法で、アルミニウムヒドロキシ−２゜９．１６．２３−テトラチ オフェニルフタロシアニンスルフォネート、６、が定量的に分離された。水中の ６の　゛吸収及び発光スペクトルを図８及び図９にそれぞれ示す。 スペクトルデータを下記の表に示す。 上記と同様な方法で、アルミニウムヒドロキシ−】。 ８．１５．２２−テトラチオフェニルフタロシアニンスルフォネート、７、が定 量的に分離された。水中の７の吸収及び発光スペクトルを図８及び図９にそれぞ れ示す。 スペクＩ・ルデータを下記の表に示す。 上記のように製造された、水中の酸素及び硫黄置換アルミニウムフタロシアニン スルフォネート誘導体の吸収及び発光マキシマムの波長を下記の表にまとめた。 化合物Ｎｏ、　フタロシアニン　吸収　発光　量子収量４　２．９．＋６．２３ オキシ　６８５ｎｍ　６９フｎｍ　Ｏ，４９５＋、８．Ｉ５．２２オキシ　７０ ７　７１７　（１，２０６２，９，１６，２３チオ　６９５　１０８　０．２ｇ ７　！、８．１５．２２チオ　７１９　７３３　０．１０水溶性アセチルアセト ネートフタロシアニンスルフォネートを、対応する軸ヒドロキシ化合物について 上に記されたように、アルミニウムアセチルアセトネート−２゜９．１６．２３ −及び１．　８．　１５．　２２−テトラフェノキシフタロシアニンから製造し た。水中の吸収及び発光波長並びに量子収量を下の表に記す。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量２、９．１６．２３オキシ　Ｇ４ｌｎｍ 　６８１１ｎｍ　Ｏｌ［３１、８，＋５．２２オキシ　６６５　７０６　０．［ １２６アセチルアセトネ一ト結合アルミニウムフタロシアニンスルフォネートに ついて上にまとめたスペクトルデータは、対応するヒドロキシ誘導体のデータと は著しく対照的である。アセチルアセトネートの蛍光発光の波長はそのヒドロキ シ同族体に比較して、おおざっばに１０ｎｍだけ青色側にシフトする。６８４＋ ＋ａ＋で発光する親アルミニウムフタロシアニンスルフォネートと共に用いると き、青色シフトは多成分分析にお（プるその有用性を制限する。 多成分分析のために理想的な発蛍光団族は、スペクトル的に分解できる発光バン ドを有する。 軸アセチルアセトネートをもつ２，９．１６．２３異性体の６８８ｎｍにおける 発光は、親の発光波長６８４ｎｍにあまりに近過ぎて、効果的には分解されない 。より重要なことは、アセチルアセトネートの蛍光量子収量が、発蛍光団として のその利用性が著しく損なわれる点まで劇的に減少することである。 上記の理由により、アルミニウムフタロシアニンスルフォネートの好ましい実施 態様は、アセチルアセトネートリガンドよりも軸ヒドロキシリガンドを用いる。 実施例３ 四置換−酸素及び硫黄置換アルミニウムを実施例３に示す。実施例３の４種類の 四置換試薬は一置換フタロニトリルから製造される。下記は４種類のアルミニウ ムテトラベンシトリアザポルフィリン−ペース試薬の一族の製法の詳細な説明で ある。説明は、テトラベンシトリアザポルフィリンの製法、金属化、反応性誘導 体生成、水溶性誘導体生成の４部に分けて行う。各部では詳細な操作法と、それ に続く他の３試薬のための操作法に関するコメントが述べられている。操作法の 違いははっきり明記されている。 テトラベンシトリアザポルフィリンの製法乾燥テトラヒドロフラン４ｍｌ中４− フェノキシフタロニトリル１．００ｇ　（４，５９ｍｍ）の溶液に乾燥ジエチル エーテル１０１を加えた。混合物を０°に冷やし、ジエチルエーテル中１．０Ｍ ベンジルマグネシウムクロリド４．ｂｌ（４，６ｍｌ　、１．０当量）を加えた 。混合物をアルゴン下、室温で２時間撹拌した。その後混合物を濃縮乾固し、紫 色の残渣をキノリン２５ｍ１で希釈し、２００−２１０°で４時間撹拌した。溶 媒を真空下で蒸留した。生成残留物を、氷酢酸３０ｍ１と共に９０°で２時間撹 拌することにより処理した。反応混合物を塩化メチレンＨＯｍ！で希釈し、最初 に炭酸ナトリウム飽和水溶液３−３−２部０部分で、次に５％Ｖ／Ｖ塩酸水溶液 ２００＋ｎｌで洗った。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し５、濃縮し た。粗反応生成物をシリカゲルを用いてクロマトグラフィーにかけ、クロロホル ムで溶出した。所望の生成物を含むフラクションを合一し、濃縮し、さらに２回 シリカゲルでクロマトグラフィーを行い、ヘキサン中８５％クロロホルムで溶出 し、２０−フェニル−２，９，１６，２３−テトラフェノキシテトラベンゾトリ アザポルフィリン２０４ｍｇ　（１９％）が濃青緑色固体として得られた。シリ カ薄層クロマトグラフィーを行い、ヘキサン中６５％塩化メチレンで溶出すると Ｒｆ＝０．５４を有する均質な生成物が得られた。スペクトルデータを下記の表 に示す。 上記と同様な方法で、３−フェノキシフタロニトリルを、キノリン中で４０時間 加熱後２０−フェニル−１゜８．１５．２２−テトラベンシトリアザポルフィリ ンに変換した。生成物は、シリカゲル上でクロマトグラフィーを行い、塩化メチ レンで溶出し、その後場化メチ！ノンニヘキサン（１：　１）溶液から結晶化す ることによって精製された。生成物は、シリカ上でＲｆ＝０．６０をもち、塩化 メチレンで溶出される深緑色固体として収率６％で分離された。スペクトルデー タを下記の表に示す。 上に２０−フェニル−２，９，１６，２３−チｌ＝−ラフエノキシテトラペンゾ トリアザボルフイリンについて述べた方法と同様な方法で、４−チオフェニルフ タロニド・リルを、キ、ノリン中で２０時間加熱後、２０−フェニル−２，９， １６，２３−テトラチオフェニルベンシトリアサポルフィリンに変換した。クロ ロホルムで溶出する最初のクロマトグラフィー後、所望生成物を含むフラクショ ンを合一し、２回シリカ上で再クロマトグラフィーにかけ、ヘキサン中５５％ク ロロホルムで溶出した。シリカ上でＲｆ＝０．７２を有し、ヘキサン中６５％塩 化メチレンで溶出された生成物は深緑色固体として収率２】１％で分離された。 スペクトルデータを下記の表に示す。 上に２０−フェニル−１，８，１５，２２−テトラフェノキシテトラベンゾトリ アサポルフィリンについて述べた方法と同様な方法で、３−チオフェニルフタロ 二Ｆ・リルを２０−フェニル−ｊ−＋　ｓ、１５．　２２−テトラチオフェニル テトラベンゾトリアザボルフィリンに変換した。最初のシリカ−クロマトグラフ ィー及び塩化メチレンによる溶出後、生成物をさらに２回クロマトグラフィーに かけ、ヘキサン中５０％塩化メチレンで溶出した。 さらに塩化メチレン・ヘキサン（１：　１）溶液から結晶化することによって精 製すると、生成物が深緑色固体とし、て収率１１％で得られた。ヘキサン中６５ ％塩化メチレンで溶出するシリカ薄層クロマトグラフィーでは、Ｒｆ＝０．７０ を示した。スペクトルデータを下記の表に示す。 上記の方法で製造された酸素及び硫黄置換２０−フェニルテトラベンシトリアザ 、ポルフィリン誘導体の吸収のデータを下の表に記す。 テトラベンシトリアザポルフィリン　吸収２．９．１６．２３オキシ　６５６． ６９４ｎｍ１、８．　］　５．２２オキシ　６７６、７１２ｎｍ２、９．　＋６ ．２３チオ　６６６、７０４ｎｍ１．８．１５．２２チオ　６９４．７２８ｎｍ テトラベンシトリアザポルフィリン金属化フィリン 塩化メチＬｚン１５ｍ１中２０−フェニル２．　９．　＋６゜２３−テトラベン シトリアザポルフィリン２Ｈｍ　（０，２０９ｍｍ）の溶液に、２．［１Ｍ）− リメチルアルミニウム（４，００ｍｍ。 １ｇ当量）−トルエン溶液２．０ｍｌを０°で加えた。混合物を室温で２時間撹 拌した。その後混合物を０６に冷やし、蒸留水１ｍｌを注意深く滴下した。混合 物を１０分間撹拌し、１０％Ｖ／Ｖ塩酸水溶液２ｍｌを滴下した。反応混合物を ５分間撹拌し、１０％Ｖ　／’　Ｖ塩酸水溶液２０ｍ１で処理（７，１時間撹拌 した。その混合物を塩化メチレン５０「１で希釈し、５％Ｖ　／′Ｖ塩酸水溶液 ５０ｍ１で洗った。 有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、、濃縮すると、アルミニウムヒド ロ４シー２０−フェニル−・２，９゜１６．２３−テトラフェノキシテトラベン ゾトリアサポルフィリン１８３ｍｇ　（８８％）が深青緑色固体として得ら上記 と同様の方法で、アルミニウムヒドロキシ−２０−フェニル−１，８，１５，２ ２−テトラフェノキシテトラベンゾトリアザポルフィリンが９０％収率で分離さ れた。アルミニウムヒドロキシ−２０−フェニル−２゜９．１６．２３−テトラ チオフェニルテトラベンゾトリアザポルフィリン 上記と同様の方法で、アルミニウムヒドロキシ−２０−フェニル−２，９，１６ ，２３−テトラチオフェニルテトラベンゾトリ７サボルフイリンが９６％収率で 分離上記と同様の方法で、アルミニウムヒドロキン−２０・フェニル−１，８， １５，２２−子トラチオフェニルヂトラベンゾトリアザボルフイリンが９７％収 率で分離された。 アルミニウム軸メチル誘導体−塩化メチレン溶液の吸収波長、及びテトラヒドロ フラン中の軸ヒドロキシ誘導体の発光波長を下表に示す。量子収量はテトラヒド ロフラン中で測定された。 ＴＢＴＡＰ　吸収　発光　量子収量 ２゜９．　＋６．２３オキシ　６５６．６９４ｎｍ　６９０＋＋＋ｎ　Ｃ１，４ ０１、８，１５，２２オキシ　６７６、　Ｙｉ２　７０４　ｅ、　２５２、９． １６．２３チオ　６６６．７１）４　７０１　［１，Ｈｌ、　８．１５．２２チ オ　６９４，７２８７２２　１１１．１９反応性テトラベンシトリアザポルフィ リンの生成４種類の四置換アｌトミニウムヒドロキシ−２０−フェニル−テトラ ベンシトリアザポルフィリンのスルフ寸ニルクロリド誘導体が、実施例２におい て対応するアルミニウムフタロシアニンについて記したように、クロロスルフ噌 ン酸処理によって合成された。 水溶性テトラベンシトリアザポルフィリンの生成上記スルフォニルクロリド誘導 体を実施例２において対応するアルミニウムフタロシアニンについて記したのと 同様な方法で加水分解すると、４種類の水溶性子ルミ＝、ラムヒドロキシ−２（ ］−］フェニルーテトラベンゾトリ了ザボルフィリンスルフォネートが得られた 。４テ）・）ベンゾトリアザボル：フでリンの水中における吸収及び発光波長を 量子収量と共に記す。８．　９．　１０．　１１の発光スペクトルは図１０及び 図１１にそれぞれ示した。 ８　２．９．１６．２３オキシ　６６４．６９２ｎｍ　６９５ｎ＋ｎ　Ｏ，４３ ９＋、８．＋５，２２オキシ　５°１６，７Ｎ　７ｉ１　０．２２１０　２．９ ．］６．２３チオ　６９０．７＋３　７１７　ｆｌ、＋４１１　１．８．］５， ２２チオ　６９ｉ、７１５　７２８　０．０６実施例４ ア、ルミニウムテトテベンゾトリアザボルフィリンスルフォネ−Ｉ−の製法 ２０位が水素、または７　、ｘニル、（そわぞれ１２．１３）で置換されたアル ミ−ラムテトラベン・シトリアザポル″アイリンスルフォネ・・−１・を実施例 ４に示した。これらの水溶性、反応性誘導体はアルミニウムフタロシア二ン人ル フ寸ネ−１に似た挙動特性を示し７、アルミニウムテトラベンシトリアサボルフ １′リンの光学特性を有する。 下記はこ１＋ら化合物のバフ法の詳細な説明である。この説明は、テトラベンシ トリアザポルクイリンの製法、金属化１、反応性’Ｔ　Ｂ　Ｔ　Ａ　Ｐの製法、 水溶性ＴＢＴＡＰの製法の４部に分けて記載される。各部において、２〇−水素 誘導体についての詳細な方法ど、２０−フェニル誘導体の方法のコメントが述べ られる。 テトラベンシトリアザポルフィリンの製法ジエチルエーテル２５ｍ１中フタロニ トリル５．０ｇ　（３９，１ｎｕｎ）の懸濁液に、ジエチルエーテル中３．０Ｍ メチルマグネシウムプロミド１，１当量、１４．３＋＋＋ｌ　（４３，０ｍｍ） を滴下した。生成溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。真空下でエーテルを除 去し、キノリン２５ｍ１を加えた。反応溶液を窒素下、１６時間２００°に加熱 した。その溶液を冷やし、塩化メチレンＩして希釈すると、粗生成物が沈澱した 。粗生成物を濾過によって集め、ソックスレー抽出器で、抽出液が無色になるま でメタノールで抽出した。 生成物（ソックスレー残留物）は青色固体２．９５ｇ　（５，４８ｍｍ、５６％ ）として分離された。スペクトルデータを下表に示す。 マグネシウム−２０−フェニルーテトラベンゾドリアザボルフィリン 上記と同様の方法で、マグネシウム２０−フェニルテトラベンシトリアザポルフ ィリンを製造した。生成物は、キノリン反応混合物を蒸留水５００１で希釈する ことによって分離された。粗生成物を濾過によ一フて集め、真空乾燥した。生成 物をシリカ上クロマトグラフィー及びヘキサン：テトラヒドロフラン（１：　１ ）による溶出によって精製した。スペクトルデータを下表に示す。上記のように 製造したマグネシウムテトラベンゾトリアザポルフィリン誘導体のテトラヒドロ フラン中における吸収の波長を下表に示す。 ＴＢＴＡＰ　吸収 ２０　Ｈ６４５，６６５ｎｍ ２０−Ｐｈ　６４８．ｆｉ７０ ２０−Ｈ−テトラベンシトリアザポルフィリントリフルオロ酢酸１０ｍ：中マグ ネシウムー２０−Ｈ−テトラベンシトリアザポルフィリン１．　ｏｇ　（１，８ ６ｍｍ）の溶液を１６時間撹拌した。その溶液を蒸留水１００ｍ１で希釈し、濾 過によって固体を集めた。生成物を蒸留水５００１１１　。 メタノール５Ｈｍｌで洗い、真空乾燥した。２Ｏ−Ｈ−テトラベンシトリアザポ ルフィリン２８０ｍｇ　（０，５４ｍｍ、　２９％）が青色固体として分離され た。スペクトルデータを下表に示す。 ２０−フェニル−テトラベンシトリアザポルフィリン酢酸１０ｍ１中マグネシウ ム−２０−フェニル−テトラベンシトリアサポルフィリン１．　Ｏｇ　（１，６ ３ｍｍ）の溶液を還流しながら１時間加熱した。その溶液を冷やし、蒸留水１０ （１ｍｌで希釈した。生成物を濾過によって簗め、蒸留水５００　ｍｌで洗い、 真空乾燥した。２０−フェニル−テトラベンシトリアザポルフィリンｌｌ５ｍｇ 　（０，２２ｍ１．１４％）が青色固体として分離された。スペクトルデータを 下表に示す。 上記のように製造したテトラベンシトリアザポルフィリン誘導体のテトラヒドロ フラン中における吸収の波長を下表に示す。 ＴＢＴＡＰ　吸収 ２０−８　６４０．６８２ｎｍ ２０−　Ｐ　ｈ　６４３．６８４ｎｍ テトラベンシトリアザポルフィリンの金属化キノリン５Ｉｌｌｌ中２Ｏ−Ｈ−テ トラベンシトリアザポルフィリン１００ｍｇ　（０，１９５ｍ＋ｎ　）の溶液を １０当量の三塩化アルミニラｌ、２６０ｍｇ　（１，９５ｍｍ）で処理した。溶 液を２時間２００°に加熱し、冷やし、塩化メチレン］Ｏｈｌで希釈し、た。沈 澱生成物を濾過によって集め、塩化メチレン５００ｍ１で洗った。アルミニウム ー２Ｏ−Ｈ−テトラベンシトリアサポルフィリン８５ｍｇ　（０，１５ｍｍ、　 ７６％）が紫色固体とし、て分離された。スペクトルデータを下表に示１゜塩化 メチレン２０ｍ１中２０−フェニル・−テトラベンシトリアザポルフィリンＩ］ ５ｍｇ　（０，２２４ｍｍ　）に２．ＯＭ）リメチルアルミニウムートルエン溶 液１０当量、１．１２ｍ１（２，２４ｍｚ）を加えた。その溶液を窒素下、室温 で２時間撹拌し、それから注意深く蒸留水１ｍｌ、次いで１Ｎ塩酸水溶液１ｍｌ を加えて反応を鎮めた。有機相をＩＮ塩酸水溶液３−３−２Ｏ部分で抽出１−１ 硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。アルミニウムー２０−フェニル−テトラベ ンシトリアザポルフィリン８５ｍｇ　（０，１５！Ｉ１ｍ、　５３％）が青色固 体として分離された。スペクトルデータを下表に示す。上記のように製造したア ルミニウムテトラベンシトリアザポルフィリンのジメチルホルムアミド中の吸収 及び発光波長並びに量子収量を下表に示す。 ＴＢＴＡＰ　吸収　発光　量子収量 ２０−Ｈ６４９，６７０＋＋ｍ　６７２ｎｍ　０．６９２０−Ｐｈ　６５６．６ ８＋　６８０　０５６反応性テトラベンシトリアサポルフィリンの生成アルミニ ウムー２Ｏ−Ｈ−テトラベンシトリアザボルフクロロスルフォン酸５　ｍｌｌ中 座ルミニウム−２ＯＨ−・チトラベシゾ）・リアザポルフィリン１５ＤＩｌ＋ｇ 　（（１，２Ｂ＋ｃｍ）　（７）溶液を窒素Ｆ、　１５ｆｌ　’で２時間加熱し た。混合物を冷やし７、氷５ｇ上で注意深く反応を鎮めた。生成物を濾過に−２ っで集め１、蒸留水２０１ｎｉ、ジエ千ルエーテノＬｉｎｌ１ＭＩＩで洗い、真 空乾燥した。？）１−ミーラム−２０−Ｈ−クトラーく：２シトリアげボルフＣ リンス２′１こ７オニルリロリド１８０ｍｇ　（０，１８９ｍｙ、７３％）が青 色粉末として分離された１、スベクトク１．・データを下表に示す。 アルミ、ニウム−２０−Ｔ’、ニルー÷トラベンシトリアザポルフィリンスルフ ォニルクロリド 上記と同様の方法で、アルミニラｌ、−２０−フェニル−テトラベンゾトリフ′ ザポルフィリンスルフォニルクロリドが７２％収量で分離された。スペクトルデ ー々を下表に示す。 上記のように製造されたアルミニ？ツム子トラベンブｊ・リアザポルフィ＋１シ スルフすニルクロリド誘導体のシイチルホルムアミド中の吸収の波長を下表に示 す。 ＴＢＴＡＰ　吸収 ２０−　Ｈ６５５，６７７１１１１１ ２０−−Ｐ　）１　６；）７゜６８３ 水溶性テトうベンシトリアザポルフィリンの生成蒸留水５．０１Ｉｌｌ中アルミ ニウム〜２０−　Ｈ−テトラベンｌｆ　トリアザボルフ、イリンスル７バーニル クｒ］リド９６町、の溶液を室温で４８時間撹拌した。貞空下で濃縮すると、ア ルミニウムー７Ｑ・１（・−テトラベノゾトリ了ザボルフィリ゛・・スルフす、 モ・−トが定量的に得られた。水中の吸収及び発光、スベＰ７トルを図３−２に ｉ７ζｔ′。スベクｌ□　）Ｌ　％−−タを下表に示す１、 上記た同様の方法で、アル［ニウム−９Ｑ〜）ｙニル−テトラベン゛ｌトシ１ア ザポルＴフイｊｌンスルフォネートが定量的に分離された１、水中の吸収及び発 光スペクト）１を図ｊ３に示す。スペク）・ルデー々を下表に示す。 上記のように製造されたアルミニウムテトラベンシトリアサポルフィリンスルフ ォネートの水中における吸収及び発光の波長を下表に示すう量子収量も含める。 Ｔ　Ｂ　Ｔ　Ａ　Ｐ　吸収　発光　量子収量２０−　Ｈ６４９，６６７ｎｍ　６ ７２ｎｍ　０．６７２０−Ｐｈ　６５３．６７２　６８ｉ　１１．５９実施例５ フタロシアニン四級アンモニウム誘導体の製法典型的カチオ、ノ性フタロシアニ ンを実施例５どｌｌ、て示す。実施例５の誘導体は次の条件の式Ｉを満足する。 すなわちＭはＲ２またはアンモニウム、各Ｒ４は−ＸＹＷ。 Ｘは酸素、Ｙはエチ１ノン（Ｃｌ４２　ＣＨ２）　、Ｗはトリメチルアンモニウ ムヨウ化物、Ｚは窒素、Ｒ１，は−ＸＹＷ、−ＹＷまたは−Ｗである。正に帯ｉ ｉｔ、た四置換フタロシアニンが一置換フタロニトリルから製造される。 フタロシアニン前駆物質、４−ジメチルアミ２ノコ４タノキシフタロニトリル、 を４−ニトロフタロニトリルのニトロを２−ジメチルアミノエタノ−・ルて置換 することによって製造（、た。ジイミノイソインドリンの形成及びそれに続く環 化により、熱金属−四置換フタロジアニンが生成した。ヨウ化メチルでアミノ基 を１７！１１級化した。アルミニウムトリアセチルアセトネートで処理すること によりアルミニウムを挿入した。アルミニウムフタロシアニンを水溶性にするた めに、ヨウ化メチルでアルキル化し、四級アンモニウム化合物１．４　ｂを作っ た。 図１４に示した１４ａの水中における吸収スペクトル信、はぼ完全な凝集を示す 。蛍光呈子収量は０，０１以下である。しかしながらＲＮＡ　（トルラ酵母）！ Ｉｌ；ｌ在下では、強い特異的結合相互作用がおこり、それは発蛍光団の解凝集 に通ずる。ＲＮＡ存在下における１４ａの吸収スペクトルを示す図１４は七ツマ ・−・−フタロシアニンを示唆し５でいる。図１５で一溶液の発光スペクトルを 比較する。 ＲＮＡ結合による１４ａの蛍光増加は４５０倍である。 マルミニウム誘導体の対応する吸収及び発光スペクトルをそれぞれ図１６及び図 １７に示す。Ｒ１−ＩＡによる蛍光増加斉ｉは３４０である。ウシ血清アルブミ ンの存在下では１４ａでも］４１）でも蛍光増加側は肥められなかった。 上記のように作られた無金属−並びにアルミニウムーフタロシアニン誘導体のス ペクトルデータを干゛表に示す。 ＲＮＡ存在下における蛍光の波長及び発蛍光団の蛍光増加を示す。吸収のデータ は、発蛍光団ｆす５ＸｉＯ−ｅ′、ＲＮＡ　（）ルラ酵母）濃度１．０ｍｇ　／ ｍｌで記録された。蛍光データはこれらの溶液で１００倍希釈で得られたっフタ ロシアニン　ＲＮＡ存在下における　蛍光増加発光波長 無金属　７２０ｎｍ　４５０ アルミニウム　７０５　３４０ カチオン性フタロシアニンの他の特異的実施態様は、式Ｉにおいて、Ｍ、Ｒ，、 及びＲ２が上記の通りで、Ｘ＝−ＣＨ２−１Ｙ＝−ＣＨ，ＣＨ２−及びＷ＝ニジ エチルメチルアンモニウムある。対イオンはヨウ化物である。 実施例６ 発蛍光団ストレプトアビジン結合物の製法共有結合型ストレプトアビジン発蛍光 団結合物を実施例６として示す。赤色シフト−アルミニウムフタロシアニン誘導 体の反応性型、そのスルフォニルクロリドをこれまでに開示されたものと同様な 方法によって、ストレプトアビジンに結合させる［シンプル（Ｓｅｈｉｎｄｅｌ ｅ、　Ｄ、　Ｃ，）ら、単量体フタロシアニン試薬（Ｍｏｎ＋＋ｍｅ＋ｉｅ　Ｐ ｈ！ｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　Ｒｅｇｇｅｌｓ　）　、米国特許出願筒３６６、 ９７１号、！９Ｈ］。 下記はその製法の詳細な説明である。実施例はストレプトアビジンへの結合を明 確に述べているが、その他の蛋白質も同じ方法によって結合し得る。 フエ２／キシフタロシアニンスルフォニルクロリドのストアルミニウムヒドロキ シ−２，９，１６，２３−テトラフェノキシフタロシアニンスルフォニルクロリ ド固体、１５、０ｍｇに、乾燥ジメチルホルムアミド３００μｍを加えた。 その溶液をあらかじめ平衡化された３０℃の乾燥済においた。１時間後、反応性 発蛍光団を含むジメチルホルムアミド溶液２０μｍを、ｐＨが９．０に調節され 、ジメチルホルムアミド３０μｌを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム−リン酸緩 衝食塩液１８５μｍ中ストレプトアビジン１、Ｉ５Ｂに４℃で一滴づつ加えた。 １時間後、保存剤として０，０２％アジ化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナ トリウム−リン酸緩衝食塩液中１．０ｍｇ／ｍｌリジン溶液２５０μＩを加える ことによって、反応を鎮めた。４℃で３０分間撹拌後、０．０２％アジ化ナトリ ウムを含むリン酸緩衝食塩液中でセファデックスＧ−５０上、サイズ排除クロマ トグラフィーを行って結合物を精製〔１，た。結合物のスペクトルデータを下記 の表に示す。 上記と同様の方法で、アルミニウムヒドロキシ−１゜８．１５．２２−テトラフ ニノギシフタロジアニンスルフォニルクロリドをストレプトアビジンに結合させ た。 結合物のスペクトルデータを下表に示ｔ。 １時間のインキュベーションの代わりに３０℃で３０分間イコノキュベーシジン することを除けば上記と同様の方法で、？ルミニウムヒドロキシー１．　８．　 １５．　２２−テトラフェノキシフタロシアニンスルフォニルクロリドをスト！ 、・ブトアビジンに結合させた。結合物のスペクトルデータを下表に示す。上記 のように作られた、００２％アジ化ナトリウム含有のリン酸緩衝食塩液中の発蛍 光団ストし・ブトアビジン結合物の吸収及び発光波長を下表６Ｊ示ず。発蛍光団 対ストレプトアビジン比（Ｆ　／’　Ｐ　）は、２８０＋ｖにおける蛋白質の吸 収を３５０ｎｍにおける発蛍光団の吸収に対し、て比較することによって定めら れた。報告されせた量子収量は１発蛍光団あたりのものである１、ヱータロシ７ ＝＞　＠ｅ　七Ｆ／Ｐ　量子収量２、９．１６．２３オキシ　６Ｄｎｍ　６９８ ｎｍ　３．７　０．３５１、ε、　＋５．２２オキシ　７０４　７］８　２．４ 　０，１３１、８．１５．２２チオ　７＋９　７２９　３．６　０．０３実施例 ７ 発蛍光団標識化核酸プライマー 共有結合型発蛍光団標識核酸プライマーの製法を実施例７に記す。赤色シフト− アルミニウムフタロシアニン誘導体の反応型、スルフォニルクロリド、を上記と 同様の方法で核酸プライマーに結合させた（シンプルら、単量体フタロシアニン 試薬；米国特許出願筒３６６、９７１号、＋９８９）。下記はその製法の詳細な 説明である。 アルミニうムヒドロキジ−２，９，１６，２３−テトラフェノキシフタロシアニ ンで標識されたＭｌ、３ｍｐｉ８（−２１，）普遍的塩基配列決定プライマー０ ．５Ｍ炭酸水素ナトリウム１０．５Ｍ炭炭酸ナトリフ１１１）　ｉ（を９，０に 調節）２０μｍ中、０．０２２　メＩｍｏｌアミノヘキサンＲＪｆ’Ｆ、Ｍｌ　 ３ｐｐｌ　８　（−２１）　、５’　ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧｃ”ＣＡ（こ Ｔｊ）’、普遍的塩基配列決定プライマーの撹拌溶液に、１２μｍジメヂジメチ ルホルムアミド中１ｍＢアルミニウムヒドロキシー２．　９．　１．６．　２３ −テトラフェノキシフタロシアニンスルフォニルクロリドを加えた。暗所、室温 で一晩撹拌後、標識化プライマーを、サイズ排除クロマトグラフィ・−（セファ デックスＧ−５０）及びその後のポリアクリルアミ、ドゲル電気泳動によって精 製した。標識化プうイマーのスペク（・ルデータを下表に示す。 ”ごルミニウムヒドロキシ−１，８、ｉ　５　＋　２ｉ＋　’−テトラフェノキ シフタロジアニン標識Ｍ　１３ｎ＋ｐｌ　８　（−２ｉ　）普遍的塩基配列決定 プライマー 上ｄ己、と同様の力９位で、このプライマ・−をア刀・ミニウムピドロキＡ／− １，８゜’ｔ５ｔ）化２−テトラフＪ、ツキＳ、・フタロシアニンスルフォニル クロリド７′標識化した。プラー１′マーは、エタノール沈澱及びその後のポリ ”Ｌ′グリル下ミドゲル電気泳動によって精製された。標識化プライマーのスペ クトルデータを下表に示す。 上記のように作りれたアルミニウムフタロシアニン標識プライマーの、０１Ｍ酢 酸トリメチルアミ゛７＋溶液中の吸収及び発メ′、波長並びに量子収量を下表に 示す。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量２、９．１６．２３オキシ　６８４ｎｍ 　６９６ｎｍ　Ｏ，３！１１、８．　＋５．２２オキシ　７０４　７１５　０． ＩＦＩ実施例８ 、上記の２０−ｉ換テトラベンシトリアサポルフィリン（ＴＢＴＡＰ）は、フタ ロシアニンのように、蛍光分析用試薬として有用である。ＴＢＴＡＰ系の特殊な 一特性は、２０位置の置換基である。ＴＢＴＡＰの製法（実施例３及びｆ１参照 ）において用いられるグリニヤール試薬の正しい選択によっ”７、反応性２〇− 置換バが合成される。ゲリＪ、７ヤール試薬は選択された官能基を含むがまたは 選択さ２もだその基をさらに変形する、”二とができる。生成した２、　０−ｉ ｔ？換ＴＢＴＡＰは反ｔｃ：性で、−自′能基をもＲ７として特に有用な反応基 は、生物学的実体・〜、の効率的結合を可能にする。好ま１、い反応基は、特に 、スルフ寸；ルクロリド、カルボ；・酸及び誘導体３アミノ、イソチオシアネー ト、”、−レイミド、及びイミデートである。 有用な一官能性反応性ＴＢＴＡＰ試薬の例は、２０位にイソチオシアネート、ま たはＮ−ヒドロキジスクジミドエステル部分をもつものである。それらの試薬は 種々の用途、たとえば、イム７ノー「ツ七イ、核酸塩基配列決定、核酸プローブ アッセイ、フローサイトメトリーまたは選択的官能化に有用である。選択的官能 化の例として、イソチオシアネート誘導体は、エドマン分解法を用いる蛋白質塩 基配列決定分析における蛍光試薬として役立一つ。 発蛍光団のインチオシアネ−１・部分は固相に固定された（Ｃ末端）、配列決定 すべきペプチドのＮ末端に結合する。ペプチドの分解後、発蛍光団標識化末端ア ミノ酸がベブ羊ドから分離する。発蛍光団標識化アミノ酸はその後固定ペプチド から切り離され、アミノ酸が同定される。 残るペプチド（１つのアミノ酸残基だけ短くなっている）の新しいＮ末端で次の 周期が始まる。この操作の繰り返しにより、問題のペプチドのアミノ酸残基の配 列順序が決定される。たとえばフタロシアニン及びＴＢＴＡＰなどの高度に蛍光 を発する試薬は蛋白質塩基配列決定分析の検出限界を改善１１、より少量の蛋白 質の培基配列順序決定を可能にする。高感度の発蛍光団の利点は、はんの痕跡量 の珍しい蛋白質を分析する場合に特ζご適ｊ、でいる。 実施例９ ＴＢＴＡＰ環系の２〇−置換基は、ＴＢＴＡＰの所望の光学特牲をっくり出１． ！：うに設計される。上の実施例２及び３に詳述した周込環の置換では、吸収及 び発光波長は２０位の置換基の選択によ、って操作される。電子供与基は吸収及 び蛍光波長両方とも赤色側にジフトさせると考えられる。一方電子受容基は青免 側ヘジフトさせるき考えられる。 たきえばトリフルオロメチル（ＣＦ　：４　）及びペルフルオロフェニル（Ｃ６ Ｆ、）などのフッ素化２〇−置換ＴＢ　Ｔ　Ａ　Ｐ誘導体は、市販の１　、　１ 　、　１−トリフ“ルオロ＝２−プロ（コータン及び２．　３．　４．　５．　 ６−ペンタクロベンジルプロミドからそれぞれ作られる。電子受容置換基をもつ これらのコ”ＢＴＡＰは、教化合物より青色の波長で光を吸収及び発光すると予 想される。 実施例１０ 置換フェニル基をもつフタロシアニン及びテトラベンゾｊ・リアザポルフィリン 誘導体 実施例２及び３によ−って記載された四置換フタロシアニン及びテトラベンゾ） ・リアサボルフィリンは、未置換のフェノキシまたはチオフェニルフタロニトリ ルから構成される四置換フェノキシまたはチオフェニルフタロニトリルも合成さ れ環化されて、対応フタロシアニンまたはテトラベンシトリアザポルフィリン系 になる。これら変形誘導体は親日置換化合物の光学特性を微調整する。 たとえば、３−　（４−フルオロフェノキシ）フタロニトリルは、３−フェノキ シフタロニトリルを生成する方法と同様な方法で、４−フルオロフェニルを３− 二トリルフタ口ニトリルで処理することによって合成される。 フルオロ置換フタロニトリルを環化してフタロシアニンまたはＴＢＴＡＰにする と、その非フッ素化親化合物とはわずかに異なる種が生成する。 多くの置換フェノール及びチオフェノールが知られている。上記の方法によりテ トラフェノキシ−及びテトラチオフェニルフタロシアニン及びＴＢＴＡＰの多く の置換誘導体が作られる。 実施例１１ へ置換フタロシアニン及びテトラベンシトリアザポルフィリンは実施例２及び３ に記載の一置換フタロニトリルからの四置換フタロシアニン及びＴＢＴＡＰの製 法と同様な方法により、二置換フタロニトリルから作られる。 へ置換誘導体は置換基の位置により広く分類される。対称的フタロシアニン及び ＴＢＴＡＰは３，６−及び４゜５−二置換フタロニトリルから誘導される。３， ４−及び３，５−二置換フタロニトリルはこれらより対称的でなく、合成がより 難しい。３．６−及び４，５−二置換フタロニトリルから誘導されるオクタオキ シ及びオクタチオフタロシアニンが報告されている［３，６−オクタオキシコウ イトウキーウイツ（ＷＨｋｉ！ｖｉｃｚ、２．）ら、材料科学ＴＪ　（Ｍａｔｅ ｒｉａｌｓ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＩＩ）　、１巻、３９−４５ページ（１９７６） 　、　４．　５−オクタオキシ：ハナック（Ｈａｎａｃｋ、Ｍ、）ら、Ｉｎｏｒ ｇ、Ｃｈｅｍ、、２３巻、＋０６５−１０７１ページ（１９８４）。３，６−及 び４．５−オクタチオ：ルーキャネッツ（Ｌｏｋ’Ｂｎｅｔｔ、Ｅ、Ａ、）ら、 １．　Ｏｒｇ、　Ｃｂｅｍ、υＳＳＲ，１４巻、＋０４６−１９５１ページ（１ ９７８）　］。硫黄置換誘導体は酸素置換同族体より大きい波長で吸収する。下 表にアルミニウム３，６−オクタメトキシ及び４．５−オクタメトキシフタロシ アニンのスペクトル特性を示す。吸収及び発光波長並びに量子収量はジメチルホ ルムアミド溶液中で記録された。 フタロシアニン　吸収　発光　量子収量３．６−オクタメトキシ　？３９ｎｍ　 ７４８ｎｗ　Ｏ，０２４，５−オクタメトキシ　６７２　６７８　０．２１３． ６−メトキシ誘導体は著しい赤色シフトを示す。 しかしながら、蛍光量子収量は低い。４，５−メトキシ誘導体は実際に青色側に シフトし、蛍光発光をより多く保持する。これら誘導体は両方とも、実施例１で 異性体アルミニウムテトラネオペントキシフタロシアニンについて記載したもの と完全に同じ方法によって、さらに処理されて水溶性及び反応性試薬となる。４ 個の硫黄置換基及び４個の酸素置換基から成るへ置換誘導体も上記の実施例に記 載したように作られる。これらの誘導体は、酸素及び硫黄置換基両方で置換され たフタロニトリル、たとえば３−チオフェニル−５−フェノキシフタロニトリル から作られる。この例におけるフェニル基はフェニル以外のものでもよく、置換 基の位置も変わり得る。これらの混合誘導体の光学特性は、オクタオキシ及びオ クタチオ同族体の中間であると期待される。 ４．５−へ置換炭素誘導体も作られる。４．　５−ｉｆ置換基ベンゾ環である場 合、その系はナフタロシアニンとして知られるものである。これら高度に共役し た誘導体は、そのフタロシアニン対応物に比して約１１００ｎ赤色側にシフトシ ている［ヴオグラ−（Ｖｏｇｌｅｒ、＾、）及びカンケリー（Ｈ，Ｋｕｎｋｅｌ ｙ　）　、ＩｎｏＢａｎｉｅａ　Ｃｈｉｍｉｅａ　Ａｃｔｌ、４４巻、＋２０９ −Ｌ２］０　（＋９８０）　］。ジメチルホルムアミド中におけるアルミニウム フタロシアニン及びナフタロシアニンクロリドのスペクトル特性を下表に示す。 吸収　発光　量子収量 フタロシアニン　６７１ｎｍ　６７２ｎｍ　Ｏ，６０ナフタロシアニン　７６８ ＋＋ｍ　７７０ｎｍ　０．１１実施例１２ ピラジンポルフィラジン ピラジンポルフィラジンは構造的にフタロシアニンに非常によく似ている［リン ステッド（Ｌｉｎｔｌｅａｄ、Ｒ，Ｐ、　）ら、Ｊ、　Ｃｈｅａ、　Ｓｏｃ、　 ９１１−９２２ページ（１９３７）コ。フタロシアニンは、巨大環に結合した４ 個のベンゾ環をもち、ピラジンポルフィラジンは４個のピラジン（］、］４−ジ アザベンゼン環をもつ。 テトラ−及びオクタフェニルピラジンポルフィラジンを処理して反応性及び水溶 性アルミニウム誘導体にするのが実施例１２の目的である。５−フェニルまたは ５．６−シフエニルビラジンー２．３−ジニトリルの環化はポルフィリン巨大環 を生成する。キノリン中で塩化アルミニウムで金属化すると、対応するアルミニ ウム誘導体が生成する。クロロスルフォン酸で処理すると反応性中間体が生成し 、これを加水分解すると水溶性のアルミニウムピラジンポルフィリンスルフ埼ネ ートが生成Ｉ、た。 水中のアルミニウム誘導体及びオクタフェニルピラジンポルフィラジンスルフォ ネートのスペクトルデータを下表に示す。 ピラジンポルフィラジン　吸収　発光　量子収量テトラフェニル（ｐ　Ｈ１０） 　６４１ｎｍ　６４７ｒ＋ｍ　０．７１オクタフエニル　６５１　６５４　ｆｌ 、９５実施例１３ ピラジンポルフィラジン ピリジンポルフィラジンは構造的にフタロシアニンと密接に関係がある［リンス テッド（Ｌｉ＋＋５ｌｅａｄ）ら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｅ、　９１１−９２２ ページ、１９３７］　、構造的に、フタロシアニンのベンゾ環をピリジンに代え ると、ピリジンポルフィラジンが得られる。 これらの誘導体は２．３・〜ジシアノピリジンまたは３゜４−ジシアノピリジン から作られる。２，３−ジシアノピリジンを環化すると３−ピリジンポルフィラ ジンが生じ、３，４−ジシアノピリジンは４−ピリジンポルフィラジンを与える 。ビラジンボル−フイラジンのように、ピリジンポルフィラジンはフクロシアニ ンに比べて青色にシフトした波長で吸収を示し、３−ピリジン異性体は４−ピリ ジンボルフイラジンに比ｌ１．て青色にシフトする。 キノリンを塩化アルミニウムで金属化してアルミニウム誘導体を得た。 実施例２及び３にそれぞ１１示したフタロシアニン及びテトラベンシトリアザポ ルフィリンについて開発された酸素及び硫黄置換法を適用すると、アノＬミニウ ムビリジンボルフィラジンの各々に対する試薬の一族が生成する。 実施例１４ イメージング及び放射性核種試薬 本発明の試薬は有機金属化合物であり、非常に多種類の金属が結合し得る。開示 された巨大環状理系は、画像解析及び治療的用途、たとえば磁気共鳴イメージン グ、放射性核種イメージング及び放射性薬物製造に有用な種々の金属を効率的に キレート化することができる。これらの用途のために有効な金属は巨大環に挿入 され、問題の部位に向けられる。金属担持試薬の標的への到着は、問題の部位に よるその試薬の自然的選択的取り込み、試薬と結合し、問題の部位に存在する抗 原に向かう抗体、試薬と結合したＤＮＡの一本鎖フラグメ：／ト、試薬と結合し 膜プローブまたはその他の配布メカニズムによる。 磁気共鳴画像造影剤のために有用な常磁性金属には、ガドリウム、マンガン及び 鉄がある。 核医学の分野は、診断的目的のために放射性同位元素、普通はガンマ−放射同位 元素を利用する。銅６７、テクネチウム９９、コバルト５７、及びガリウム６７ の放射性金属錯化合物が診断的並びに治療的に放射性医薬物として用いられてい る。 本発明の試薬は、その金属結合能のために上記の用途に有用である。また、本発 明の生物学的結合物は上記の用途のためのターゲティング剤として役立つ。 放射性核種によって治療できる代表的悪性腫瘍は、白血病１卵巣癌、リンパ腫、 乳癌、骨髄腫、腎臓癌、肝臓癌及び直腸癌などである。 実施例１５ 改良光力学的治療（Ｐ　Ｄ　Ｔ）試薬 ＰＤＴ試薬（光増感剤）は癌組織に選択的に受け取られ、可視光を照射すると活 性化される。活性化された光増感剤は多分−重積酸素の発生によって、それらの 近辺の細胞を殺す［スパイクス（Ｓｐｉｋｅｓ、１．Ｄ、　）　、　Ｐｈｏｌｏ ｅｈｅｍ、Ｐ）ｏｉｏｂｉｏｌ、４３巻６９１−９６６ページ、　１９８６コ。 本発明の試薬は従来の技術に比べて２つの利点をもつ。第１の利点は開示された 試薬の吸収が赤色領域に深く寄っていることである。第２は、これらの試薬をそ の生物学的結合物によって標的に向かわせることができる。 大きいモル吸光度を持ち、深部赤色領域で吸収するフタロシアニン及びＴＢＴＡ Ｐは、より多くの組織の治療を可能にする。現在ＰＤＴ試薬は、それらの比較的 青色の吸収動態のため、活性光の浸透深さが限られている。 ヒト組織は近赤外部ではほとんど透過性であるから、この領域で吸収するＰＤＴ 剤は最も有効である。赤色シフトし、たフタロシアニン及びＴＢＴＡＰは、現在 用いられている青色吸収性増感剤では影響を受けない組織に、近づくことができ る。 光増感剤を標的に向かわせることは、ＰＤＴの重要な面である。今日、光増感剤 の腫瘍組織に対する自然的選択性は、最も一般的には、配布メカニズムに因って いる。 本発明の試薬は、それらが生物学的実体、たとえば抗体またはオリゴヌクレオチ ドに結合するために、光力学的治療を必要とする部位を捜し出し、そこに結合す ることができる。これらの深部赤色吸収性フタロシアニン及びＴＢＴＡＰを、癌 組織または癌関連抗原に向かう抗体（または抗原結合抗体フラグメント）に結合 させると、その光活性化剤を癌のところに効率的に配達することができる。別法 として、赤色吸収フタロシアニン及びＴＢＴＡＰをＤＮＡの一本鎖フラグメント にカップリングすると、ｘｎｔｉ−ＳｅＩｌ［ｅオリゴヌクレオチドまたはＤＮ Ａプローブをターゲティング剤として用いることができる。 その他のターゲティング法は、前述のように試薬を膜プローブに共有結合させる ことである。 本試薬を用いてＰＤＴによって治療できる代表的悪性腫瘍は、膀胱癌、皮膚癌（ メラノーマ）、食道癌、脳腫瘍、その他の実質腫瘍などである。 実施例１６ フタロシアニンベースの発蛍光団を用いるＡＩＤＳテストのための二色系の典型 例は次のようである。フタロシアニン（Ｉ）で標識した抗ＣＤ４　（ヘルパーＴ 細胞特異的モノクローナル抗体）、ここでＲ２は抗体−８０２−１Ｚ＝Ｎ、２つ のＲ，基は一８ｏ、−５３番目のＲ１基は水素である（色素ｌ）、及びフタロシ アニン（Ｉ）で標識した抗ＣＤ８　（サプレッサーＴ細胞特異的モノクローナル 抗体）、ここでＲ２は抗体−８０２−フェニル−〇、各Ｒ１は−ｘｙｗ、　ここ でｘ＝ｏ、ｙ＝フェニル。 Ｗ＝−ＳＯ，−０Ｒ２及びＲ２基は１．　８．　１５．　２２の位置にある。３ 異性体、色素■を末梢血液リンパ球と共にインキュベートする。インキュベート 後、抗ＣＤ４−色素ＩはヘルパーＴ細胞に結合し、抗ＣＤ８−色素■はサプレッ サーＴ細胞に結合する。ヘルパーＴ細胞はある波長で発光する発蛍光団（色素■ ）で標識され、サプレッサーＴ細胞は別の波長（ヘルパーＴ細胞の波長とは分離 され、かつ赤色にシフトした波長）で発光する発蛍光団（色素■）で標識される 。細胞の各サブセットは、２種類の発蛍光団を識別できる光学フィルターを備え たフローサイトメータを用いて同時に定量できる。 本発明を好ましい実施態様及び典型的実施例によって説明したが、熟練せる当業 者は、上述の明細書を読んだ後、ここに示される試薬、方法及びキットに、種々 の変化、等価物への置換及びその他の変更を加えることができる。従って、ここ に特許証によって保証される保護は１、添付の請求の範囲及びその等価物によっ てのみ制限されるものである。 国際調査報告 １＋ｌｊ＋Ａ軒４Ｍ１１１ｃａ１４＋１−＋Ｎ＠、、−、、、、、、＾１ｐ＾−

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる試薬であって、式中、 ＭはＨ２，アルミニウム，ケイ素，燐，ガリウム，ゲルマニウム，カドミウム， スカンジウム，マグネシウム，錫，及び亜鉛から成る群から選択され、各Ｒ１は 独立的に−ＸＹＷ，−ＹＷ，−Ｗ，または水素であり、 Ｘは酸素，窒素，硫黄，燐，ケイ素またはセレン、またはＸはＣＲ３Ｒ４で、こ こでＲ３及びＲ４は水素，アルキル，アリール，またはアラルキルから独立的に 選択されるか、またはＲ３及びＲ４は共にカルボニル酸素を形成し、またはＸは フェニルであり、 ＹはＸとＷとの結合基であり、 Ｗは水溶性基であり、 Ｒ２は−Ａまたは−Ｙ′Ａで、ここで−Ａは生物学的実体で、Ｙ′は試薬と−Ａ との結合基であり、またはＲ２は反応性または活性化可能の基であり、Ｚは窒素 または−ＣＲでここで−Ｒは水素，アルキル，アリール，またはアラルキルであ る、 赤色シフト水溶性試薬。
2. ２．ＹがＣ１−Ｃ７の飽和または不飽和、直鎖、分枝、または環状炭化水素部分 である請求項１記載の試薬。
3. ３．Ｙがポリエーテル，ポリアミン，ポリアルコール，糖，ペプチド，またはヌ クレオチドである請求項１記載の試薬。
4. ４．Ｗが−ＯＨ，−ＣＯ２Ｈ，−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ，−ＰＯ４２＋，−ＰＯ３− ，−ＳＯ３−，−ＳＯ２−，−ＳＯ２Ｃｌ，−ＳＯ４２−，−ＮＨ２，−ＮＨＤ ，−ＮＨＤ１Ｄ２，または−Ｎ＋Ｄ１Ｄ２Ｄ３であり、ここでＤ，Ｄ１，Ｄ２及 びＤ３は独立的にＣ１−Ｃ１２アルキル，Ｃ６−Ｃ１２アリール，またはＣ６− Ｃ１２アラルキルである請求項１記載の試薬。
5. ５．ＹがＣ１−Ｃ３アルキレンで、Ｗがスルフォネートまたはカルボキシレート である請求項１記載の試薬。
6. ６．巨大環の１，８，１５及び２２位置の１−４箇所で−ＸＹＷが置換された請 求項５記載の試薬。
7. ７．巨大環の２，９，１６，２３位置の１−４箇所で−ＸＹＷが置換される請求 項５記載の試薬。
8. ８．Ｍはアルミニウム、少なくとも一つのＲ１が−ＸＹＷ、ＸはＯまたはＳ、Ｗ はスルフォネートまたはスルフォニルクロリド、Ｚは窒素である請求項１記載の 試薬。
9. ９．Ｙがフェニルである請求項８記載の試薬。
10. １０．Ｒ２に結合した、アルミニウムフタロシアニン−１，８，１５，２２−テ トラグリコール酸またはアルミニウムフタロシアニン−２，９，１６，２３−テ トラグリコール酸を含んで成る請求項１記載の試薬。
11. １１．Ｒ２に結合した、 ２，９，１６，２３−テトラフェノキシアルミニウムフタロシアニン、 １，８，１５，２２−テトラフェノキシアルミニウムフタロシアニン、 ２，９，１６，２３−テトラチオフェニルアルミニウムフタロシアニン、または １，８，１５，２２−テトラチオフェニルアルミニウムフタロシアニン を含んで成る請求項１記載の試薬。
12. １２．Ｒ２に結合した、 ２，９，１６，２３−テトラフェノキシアルミニウム−２０−フェニルテトラベ ンゾトリアザポルフィリン、１，８，１５，２２−テトラフェノキシアルミニウ ム−２０−フェニルテトラベンゾトリアザポルフィリン、２，９，１６，２３− テトラチオフェニルアルミニウム−２０−フェニルテトラベンゾトリアザポルフ ィリン１，８，１５，２２−テトラチオフェニルアルミニウム−２０−フェニル テトラベンゾトリアザポルフィリン、を含んで成る請求項１記載の試薬。
13. １３．ＡがＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＴＴＰ，ＬＴＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄｄＡＴＰｄｄＣＴＰｄｄＧＴＰ，ｄｄＴＴＰ ，ｄｄＵＴＰ， 及びそれらの誘導体，オリゴヌクレオチド，及びポリヌクレオチドから成る群か ら選択されるヌクレオチドである請求項１記載の試薬。
14. １４．請求項１記載の異なる試薬を含む複数の容器を含んで成るＤＮＡ塩基配列 決定用キットであって、それら異なる試薬は共通の励起波長と、異なる最大発光 波長をもつことを特徴とするキット。
15. １５．４種類の試薬を含み、各Ｒ２基は異なるヌクレオチド，デオキシヌクレオ チド，またはジデオキシヌクレオチドから成る請求項１４記載のキット。
16. １６．上記試薬が請求項１０記載の試薬から成る請求項１５記載のキット。
17. １７．上記試薬が請求項１１記載の試薬から成る請求項１５記載のキット。
18. １８．鎖延長阻害法によるＤＮＡ塩基配列決定法であって、ＤＮＡセグメント， プライマー，ポリメラーゼ，ＤＮＡヌクレオチドまたは上記ポリメラーゼによっ て活性化されるそれら誘導体の第１の混合物、及びレポーター基に結合した鎖延 長終止剤の第２の混合物を組み合わせて、上記レポーター基で標識したＤＮＡフ ラグメントを生成し、上記ＤＮＡフラグメントを分離し、それによってＤＮＡ配 列を決定することから成る方法において、レポーター基として請求項１記載の試 薬を用いることから成る方法。
19. １９．上記レポーター基が請求項１０記載の試薬から成る請求項１８記載の方法 。
20. ２０．上記レポーター基が請求項１１記載の試薬から成る請求項１８記載の方法 。
21. ２１．試薬のＲ２置換基がｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＴＴＰ， ｄｄＵＴＰ，及びこれらの誘導体のなかから選択される鎖延長終止剤から成る請 求項１８記載の方法。
22. ２２．分析物を、レポーター基で標識した少なくとも一つの結合パートナーと特 異的に結合させることによって一つの以上の分析物を検出する方法において、上 記分析物の少なくとも一つを請求項１記載の試薬から成る結合パートナーと特異 的に結合させることから成る方法。
23. ２３．上記分析物がＤＮＡ，ＲＮＡ，細胞またはウィルス，抗原，酵素，酵素基 質または酵素インヒビターである請求項２２記載の方法。
24. ２４．Ｙ′がビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン結合を含 む請求項２２記載の方法。
25. ２５．上記結合パートナーがオリゴヌクレオチドプローブで、上記分析物が、上 記プローブが特異的に結合し得るＤＮＡ分子である請求項２２記載の方法。
26. ２６．複数の分析物と、それに結合する複数の結合パートナーとを含み、複数の 結合パートナーの各々には、識別し得る最大蛍光波長を有する異なる試薬が結合 する請求項２２記載の方法。
27. ２７．上記試薬の最大蛍光波長の最小距離が約７ｎｍである請求項２６記載の方 法。
28. ２８．上記分析物が、上記結合パートナーの少なくとも一つが結合し得る一つ以 上の細胞である請求項２２記載の方法。
29. ２９．ＲＮＡまたはＤＮＡを含むサンプルを下記の式を有する試薬と接触させる ことから成るＲＮＡまたはＤＮＡ検出法であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ＭはＨ２，アルミニウム，ケイ素，燐，ガリウム，ゲルマニウム，カドミ ウム，スカンジウム，マグネシウム，錫及び亜鉛から成る群から選択され、各Ｒ １は独立的に−ＸＹＷ，−ＹＷ，−Ｗ，または水素であり、 Ｘは酸素，窒素，硫黄，燐，ケイ素，またはセレン、またはＸはＣＲ３Ｒ４で、 ここでＲ３及びＲ４は水素，アルキル，アリール，またはアラルキルから独立的 に選択され、またはＲ３及びＲ４は共にカルボニル酸素を形成し、またはＸはフ ェニルであり、 ＹはＸとＷとの結合基であり、 各Ｗは水溶性で、最低一つのＷは−Ｎ＋Ｄ１Ｄ２Ｄ３で、ここでＤ１−Ｄ３のそ れぞれは水素，アルキル，アリール，またはアラルキルから独立的に選択される か、または−Ｎ＋Ｄ１Ｄ２Ｄ３はピリジニウム基であり、Ｚは窒素、または−Ｃ Ｒで、ここで−Ｒは水素，アルキル，アリール，またはアラルキルであり、これ によって上記試薬が上記ＲＮＡまたはＤＮＡに非特異的に結合し、上記結合試薬 による蛍光発光を検出するようになしたことを特徴とするＲＮＡまたはＤＮＡ検 出法。
30. ３０．癌にかかった患者を光力学的療法を用いて治療する方法で、光増感剤の有 効量を患者に与え、その癌を、上記光増感剤によって吸収される光で照射する方 法において、上記光増感剤として請求項１記載の試薬を用いることから成る方法 。
31. ３１．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる試薬であって、式中、 ＭはＨ２，アルミニウム，ケイ素，燐，ガリウム，ゲルマニウム，カドミウム、 スカンジウム，マグネシウム，錫及び亜鉛から成る群から選択され、 各Ｒ１は独立的に−ＸＹＷ，−ＹＷ，−Ｗ，または水素であり、 Ｘは酸素，窒素，硫黄，燐，ケイ素，またはセレン、またはＸはＣＲ３Ｒ４で、 ここでＲ３及びＲ４は水素，アルキル，アリール，またはアラルキルから独立的 に選択されるか、またはＲ３及びＲ４は共にカルボニル酸素を形成し、またはＸ はフェニルであり、ＹはＸとＷとの結合基であり、 Ｗは水溶性基であり、 Ｒ２は−Ａまたは−Ｙ′Ａで、ここで−Ａは生物学的実体で、Ｙ′は試薬と−Ａ との結合基であり、Ｚは窒素、または−ＣＲで、ここで−Ｒは水素，アルキル， アリール，またはアラルキルであり、そして上記の式に記されているベンゾ環ａ ，ｂ，ｃ，及びｄの少なくとも一つがピリジンまたはピラジン環である、 赤色シフト水溶性試薬。
32. ３２．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる試薬であって、式中、 ＭはＨ２，アルミニウム，ケイ素，燐，ガリウム，ゲルマニウム，カドミウム、 スカンジウム，マグネシウム，錫及び亜鉛から成る群から選択され、 各Ｒ１は独立的に−ＸＹＷ，−ＹＷ，−Ｗ，または水素であり、 Ｘは酸素，窒素，硫黄，燐，ケイ素，またはセレン、またはＸはＣＲ３Ｒ４で、 ここでＲ３及びＲ４は水素，アルキル，アリール，またはアラルキルから独立的 に選択されるか、またはＲ３及びＲ４は共にカルボニル酸素を形成し、またはＸ はフェニルであり、ＹはＸとＷとの結合基であり、 Ｗは水溶性基であり、そして Ｚは−Ｃ−Ｒ２で、ここでＲ２は−Ａまたは−Ｙ′Ａ、ここで−Ａは生物学的実 体で、Ｙ′は試薬と−Ａとの結合基であり、またはＲ２は試薬の蛍光または生物 学的試薬の生物学的活性をほとんど損なうことなく生物学的実体に結合するのに 適した反応性または活性化可能の基である、 赤色シフト水溶性試薬。
33. ３３．請求項１記載の試薬の一つで標識化されたＡとしての４種ジデオキシヌク レオチドの各々と、塩基配列決定酵素と、塩基配列決定プライマーと、４種デオ キシヌクレオチドの各々と、４種ジデオキシヌクレオチドの各々とから成るＤＮ Ａ塩基配列決定用キット。
34. ３４．ＡがＤＮＡ塩基配列決定プライマーである請求項１記載の試薬の一つと、 塩基配列決定酵素と、４種デオキシヌクレオチドの各々と、４種ジデオキシヌク レオチドの各々とから成るＤＮＡ塩基配列決定用キット。
35. ３５．Ａとしての４種ジデオキシヌクレオチドの異なる一つ、塩基配列決定酵素 、塩基配列決定プライマー、４種デオキシヌクレオチドの各々、及び４種ジデオ キシヌクレオチドの各々に結合せる請求項１記載の異なる試薬をそれぞれ含む複 数の容器から成るＤＮＡ塩基配列決定用キット。
36. ３６．Ａとして塩基配列決定プライマー、塩基配列決定酸素、４種デオキシヌク レオチドの各々、４種ジデオキシヌクレオチドの各々に結合せる請求項１記載の 異なる試薬をそれぞれ含む複数の容器から成るＤＮＡ塩基配列決定用キット。
37. ３７．ＤＮＡセグメント、４種レポーター基標識プライマーの一つ、ポリメラー ゼ、ＤＮＡヌクレオチドまたは上記ポリメラーゼで活性化可能のそれら誘導体の 第１の混合物、及び鎖延長終止剤の第２の混合物を組み合わせて上記レポーター 基によって標識されたＤＮＡフラグメントを生成し、上記フラグメントを分離し 、それによってＤＮＡ塩基配列を決定する鎖延長阻害法によるＤＮＡ塩基配列決 定法において、請求項１記載の少なくとも一つの試薬を用いて上記レポーター基 の少なくとも一つを提供することから成る方法。