JP3432158B2 - 電気泳動方法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料 - Google Patents
電気泳動方法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
- C07K1/26—Electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、電気泳動方法、電
気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料に関し、特に
２種類以上の異なる発光波長域を持つ発光試薬で標識し
た試料を電気泳動によって分離して検出する電気泳動方
法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料に関す
る。
気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料に関し、特に
２種類以上の異なる発光波長域を持つ発光試薬で標識し
た試料を電気泳動によって分離して検出する電気泳動方
法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】蛍光発光測定装置、化学発光測定装置、
電気泳動装置、バイオチップ読取装置をはじめとして、
蛍光発光、化学発光、蛍光化学発光などの発光現象を利
用して試料の検出を行う種々の装置が知られている。２
種類以上の異なる発光波長域を持つ発光試薬を標識に用
いた試料をこれらの装置によって測定する場合、波長選
択性の高い干渉フィルタを用いて色分離して検出するの
であるが、発光試薬同士の発光波長域のオーバーラップ
から生じる目的としない発光試薬由来の光成分の光学フ
ィルタへの漏れ込み量を除去して検出する必要がある。
電気泳動装置、バイオチップ読取装置をはじめとして、
蛍光発光、化学発光、蛍光化学発光などの発光現象を利
用して試料の検出を行う種々の装置が知られている。２
種類以上の異なる発光波長域を持つ発光試薬を標識に用
いた試料をこれらの装置によって測定する場合、波長選
択性の高い干渉フィルタを用いて色分離して検出するの
であるが、発光試薬同士の発光波長域のオーバーラップ
から生じる目的としない発光試薬由来の光成分の光学フ
ィルタへの漏れ込み量を除去して検出する必要がある。
【０００３】２種類以上の異なる発光波長域を持つ発光
試薬を標識に用いた試料を、波長選択性の高い干渉フィ
ルタにより構成される光学フィルタを用いて分離検出す
る装置の例を図１に示す。発光試薬で標識された試料２
は、支持体１に担持されている。試料２を標識している
発光試薬から発せられた光は、第１集光レンズ３で集光
され、光学フィルタ４を通った後、第２集光レンズ５に
よって光電子増倍管６に集光され、検出される。光電子
増倍管６からの検出信号は増幅器７で増幅された後、ア
ナログ・デジタル変換回路８によってデジタル化され、
データ処理装置９で処理される。
試薬を標識に用いた試料を、波長選択性の高い干渉フィ
ルタにより構成される光学フィルタを用いて分離検出す
る装置の例を図１に示す。発光試薬で標識された試料２
は、支持体１に担持されている。試料２を標識している
発光試薬から発せられた光は、第１集光レンズ３で集光
され、光学フィルタ４を通った後、第２集光レンズ５に
よって光電子増倍管６に集光され、検出される。光電子
増倍管６からの検出信号は増幅器７で増幅された後、ア
ナログ・デジタル変換回路８によってデジタル化され、
データ処理装置９で処理される。
【０００４】図１の装置により、試料２の標識に用いた
発光試薬の発光波長域の光成分のみを透過する光学フィ
ルタ４を用いることにより、異なる発光波長域を持つ発
光試薬の光成分を除去することが可能である。発光波長
域の異なる２種類以上の発光試薬を標識に用いた試料か
ら各試料を分離検出することは、それぞれ分離検出した
い試料毎に、標識した発光試薬の発光波長域を透過する
光学フィルタ４を用意し、交換することで可能となる。
ところが、実際に使用される発光試薬は、その発光波長
域が他の発光試薬の発光波長域と重なるものが多く、特
に多くの発光試薬（３種類以上）を同時に標識に利用す
る場合には、発光波長域の重ならない発光試薬の組み合
わせを選択することが困難である。
発光試薬の発光波長域の光成分のみを透過する光学フィ
ルタ４を用いることにより、異なる発光波長域を持つ発
光試薬の光成分を除去することが可能である。発光波長
域の異なる２種類以上の発光試薬を標識に用いた試料か
ら各試料を分離検出することは、それぞれ分離検出した
い試料毎に、標識した発光試薬の発光波長域を透過する
光学フィルタ４を用意し、交換することで可能となる。
ところが、実際に使用される発光試薬は、その発光波長
域が他の発光試薬の発光波長域と重なるものが多く、特
に多くの発光試薬（３種類以上）を同時に標識に利用す
る場合には、発光波長域の重ならない発光試薬の組み合
わせを選択することが困難である。
【０００５】例として図２に、同時に利用される３種類
の蛍光色素が、５３２ｎｍの励起光によって励起された
際の発光波長パターンを示す。図の横軸１１は左側を短
波長側として波長を、図の縦軸１２は発光強度を表す。
１３は励起光を表し、１４は蛍光色素フルオレセイン
（fluorescein）の発光波長パターンを、１５は蛍光色
素ＴＭＲ（carboxy-tetramethyl-rhodamine）の発光波
長パターンを、１６は蛍光色素ＣＸＲ（carboxy-X-rhod
amine）の発光波長パターンを表す。図２に示されるよ
うに、一般に複数の発光試薬を標識に用いた場合、発光
波長域がオーバーラップするため、目的の発光試薬由来
の光成分のみを集めることを目的に用意された光学フィ
ルタにおいても、他の発光試薬由来の光成分が漏れ込ん
でしまうこととなる。
の蛍光色素が、５３２ｎｍの励起光によって励起された
際の発光波長パターンを示す。図の横軸１１は左側を短
波長側として波長を、図の縦軸１２は発光強度を表す。
１３は励起光を表し、１４は蛍光色素フルオレセイン
（fluorescein）の発光波長パターンを、１５は蛍光色
素ＴＭＲ（carboxy-tetramethyl-rhodamine）の発光波
長パターンを、１６は蛍光色素ＣＸＲ（carboxy-X-rhod
amine）の発光波長パターンを表す。図２に示されるよ
うに、一般に複数の発光試薬を標識に用いた場合、発光
波長域がオーバーラップするため、目的の発光試薬由来
の光成分のみを集めることを目的に用意された光学フィ
ルタにおいても、他の発光試薬由来の光成分が漏れ込ん
でしまうこととなる。
【０００６】図３に、図２において説明した３種類の蛍
光色素を用いた分離検出系において、蛍光色素ＣＸＲ由
来の光成分１６を集めることを目的とした光学フィルタ
の透過波長域１７に、蛍光色素ＴＭＲ由来の光成分１８
が漏れ込む様子が図示されている。複数の発光試薬を標
識に用いた分離検出における対象外発光試薬からの光成
分の漏れ込みは、例えば一次元電気泳動においては、本
来存在しないバンドが検出される、あるいは存在するバ
ンドがより強いバンドとして検出される原因となる。
光色素を用いた分離検出系において、蛍光色素ＣＸＲ由
来の光成分１６を集めることを目的とした光学フィルタ
の透過波長域１７に、蛍光色素ＴＭＲ由来の光成分１８
が漏れ込む様子が図示されている。複数の発光試薬を標
識に用いた分離検出における対象外発光試薬からの光成
分の漏れ込みは、例えば一次元電気泳動においては、本
来存在しないバンドが検出される、あるいは存在するバ
ンドがより強いバンドとして検出される原因となる。
【０００７】図４は、蛍光色素ＣＸＲの光成分を分離す
ることを目的とした光学フィルタへの蛍光色素ＴＭＲの
光成分の漏れ込みにより、光学フィルタを介した一次元
電気泳動の波形が変形される例を示す説明図である。Ｃ
ＸＲで標識した試料の一次元電気泳動パターン４１は２
つのピーク４４，４５を持つとする。また、ＴＭＲで標
識した試料の一次元電気泳動パターン４２は２つのピー
ク４６，４７を持つとする。ＣＸＲ由来の光成分を集め
る光学フィルタがＴＭＲ由来の光成分の一部を透過して
しまうとき、ＣＸＲで標識された試料がＴＭＲで標識さ
れた試料と近似の分子量を持つ場合は、ＣＸＲ検出用の
光学フィルタを通して得られる電気泳動パターン４３に
おいて同じ位置にピークが重なるため、ＣＸＲ由来の光
成分を集める光学フィルタを通して得られるピーク４８
は、本来のピーク４５に対して、ピーク４６からの漏れ
込みにより、より大きなピークとなる。また、ピーク４
７の様に、ＣＸＲで標識された試料と異なる分子量のＴ
ＭＲで標識された試料がある場合は、本来ピークの無い
位置４９に、ＣＸＲ由来の光成分を集める光学フィルタ
への、ピーク４７由来の光成分漏れ込みの結果としての
ピークが検出されてしまう。
ることを目的とした光学フィルタへの蛍光色素ＴＭＲの
光成分の漏れ込みにより、光学フィルタを介した一次元
電気泳動の波形が変形される例を示す説明図である。Ｃ
ＸＲで標識した試料の一次元電気泳動パターン４１は２
つのピーク４４，４５を持つとする。また、ＴＭＲで標
識した試料の一次元電気泳動パターン４２は２つのピー
ク４６，４７を持つとする。ＣＸＲ由来の光成分を集め
る光学フィルタがＴＭＲ由来の光成分の一部を透過して
しまうとき、ＣＸＲで標識された試料がＴＭＲで標識さ
れた試料と近似の分子量を持つ場合は、ＣＸＲ検出用の
光学フィルタを通して得られる電気泳動パターン４３に
おいて同じ位置にピークが重なるため、ＣＸＲ由来の光
成分を集める光学フィルタを通して得られるピーク４８
は、本来のピーク４５に対して、ピーク４６からの漏れ
込みにより、より大きなピークとなる。また、ピーク４
７の様に、ＣＸＲで標識された試料と異なる分子量のＴ
ＭＲで標識された試料がある場合は、本来ピークの無い
位置４９に、ＣＸＲ由来の光成分を集める光学フィルタ
への、ピーク４７由来の光成分漏れ込みの結果としての
ピークが検出されてしまう。
【０００８】従来は、この様な複数の発光試薬を標識に
用いた分離検出における、光学フィルタへの対象外発光
試薬由来の光成分漏れ込みによる不具合を解消する手段
として、漏れ込み量を計算し、測定値より除去するソフ
トウェア的手法を開発し、不具合の解消を図っていた。
すなわち、１つの発光試薬Ａで標識された試料のみが計
測点に存在する場所、または時間を経験的かつ任意に選
択し、そこにおける発光試薬Ａを対象とした光学フィル
タａを使って計測した測定値と、発光試薬Ａを対象とし
ない光学フィルタｂで測定した測定値より、発光試薬Ａ
の光成分の光学フィルタｂへの漏れ込み率Ｒabを算出
し、すべての測定点において、光学フィルタａにより計
測された測定値と漏れ込み率Ｒabからその測定点におけ
る光学フィルタｂへの漏れ込み量を算出し、これを光学
フィルタｂにより計測された測定値より減じることによ
り、発光試薬Ａ由来の光成分の光学フィルタｂへの漏れ
込みを除去していた。
用いた分離検出における、光学フィルタへの対象外発光
試薬由来の光成分漏れ込みによる不具合を解消する手段
として、漏れ込み量を計算し、測定値より除去するソフ
トウェア的手法を開発し、不具合の解消を図っていた。
すなわち、１つの発光試薬Ａで標識された試料のみが計
測点に存在する場所、または時間を経験的かつ任意に選
択し、そこにおける発光試薬Ａを対象とした光学フィル
タａを使って計測した測定値と、発光試薬Ａを対象とし
ない光学フィルタｂで測定した測定値より、発光試薬Ａ
の光成分の光学フィルタｂへの漏れ込み率Ｒabを算出
し、すべての測定点において、光学フィルタａにより計
測された測定値と漏れ込み率Ｒabからその測定点におけ
る光学フィルタｂへの漏れ込み量を算出し、これを光学
フィルタｂにより計測された測定値より減じることによ
り、発光試薬Ａ由来の光成分の光学フィルタｂへの漏れ
込みを除去していた。
【０００９】具体的な処理手順の例を図５、図６により
説明する。図５において、波形５１及び波形５２は、発
光波長域が異なり、また、オーバーラップしている２つ
の発光試薬Ａ及びＢにより、別々に標識された試料を同
時に一次元電気泳動し、これを発光試薬Ａ由来の光成分
の分離検出を目的とした光学フィルタａ及び発光試薬Ｂ
由来の光成分の分離検出を目的とした光学フィルタｂを
通して計測した測定値である。ここで、発光試薬Ａによ
り標識された試料５３が存在する時間、及び発光試薬Ｂ
により標識された試料が同じ時間に存在しないことが既
知であるとする。この試料５３は、光学フィルタａ及び
光学フィルタｂを通して真のピーク５５及び漏れ込みピ
ーク５６として計測される。また、発光試薬Ｂにより標
識された試料５４が存在する時間、及び発光試薬Ａによ
り標識された試料が同じ時間に存在しないことが既知で
あるとする。この試料５４は、光学フィルタｂ及び光学
フィルタａを通して真のピーク５８及び漏れ込みピーク
５７として計測される。
説明する。図５において、波形５１及び波形５２は、発
光波長域が異なり、また、オーバーラップしている２つ
の発光試薬Ａ及びＢにより、別々に標識された試料を同
時に一次元電気泳動し、これを発光試薬Ａ由来の光成分
の分離検出を目的とした光学フィルタａ及び発光試薬Ｂ
由来の光成分の分離検出を目的とした光学フィルタｂを
通して計測した測定値である。ここで、発光試薬Ａによ
り標識された試料５３が存在する時間、及び発光試薬Ｂ
により標識された試料が同じ時間に存在しないことが既
知であるとする。この試料５３は、光学フィルタａ及び
光学フィルタｂを通して真のピーク５５及び漏れ込みピ
ーク５６として計測される。また、発光試薬Ｂにより標
識された試料５４が存在する時間、及び発光試薬Ａによ
り標識された試料が同じ時間に存在しないことが既知で
あるとする。この試料５４は、光学フィルタｂ及び光学
フィルタａを通して真のピーク５８及び漏れ込みピーク
５７として計測される。
【００１０】ここで、発光試薬Ａに標識された試料５３
に着目した場合、発光試薬Ａ由来の光成分の光学フィル
タｂへの漏れ込み率は、ピーク５５のピーク成分６１
（光学フィルタａによる計測値におけるバックグラウン
ド値５９を超える測定値の体積）に対するピーク５６の
ピーク成分６２（光学フィルタｂによる計測値における
バックグラウンド値６０を超える測定値の体積）の割合
として算出する。また、発光試薬Ｂに標識された試料５
４に着目した場合、発光試薬Ｂ由来の光成分の光学フィ
ルタａへの漏れ込み率は、ピーク５８のピーク成分６４
（光学フィルタｂによる計測値におけるバックグラウン
ド値６０を超える測定値の体積）に対するピーク５７の
ピーク成分６３（光学フィルタａによる計測値における
バックグラウンド値５９を超える測定値の体積）の割合
として算出する。
に着目した場合、発光試薬Ａ由来の光成分の光学フィル
タｂへの漏れ込み率は、ピーク５５のピーク成分６１
（光学フィルタａによる計測値におけるバックグラウン
ド値５９を超える測定値の体積）に対するピーク５６の
ピーク成分６２（光学フィルタｂによる計測値における
バックグラウンド値６０を超える測定値の体積）の割合
として算出する。また、発光試薬Ｂに標識された試料５
４に着目した場合、発光試薬Ｂ由来の光成分の光学フィ
ルタａへの漏れ込み率は、ピーク５８のピーク成分６４
（光学フィルタｂによる計測値におけるバックグラウン
ド値６０を超える測定値の体積）に対するピーク５７の
ピーク成分６３（光学フィルタａによる計測値における
バックグラウンド値５９を超える測定値の体積）の割合
として算出する。
【００１１】従来、この漏れ込み率算出のために開発さ
れたソフトウェアにおいては、ユーザインターフェース
により、実測されたピークをコンピュータディスプレイ
上で確認し、ポインティングデバイスによりピーク範囲
を選択する機能が用意されている。図６は、ソフトウェ
アにより選択されたピーク範囲より、バックグラウンド
値を求める手順を図示する。図５におけるフィルタａに
よる測定値５１上の真のピーク６１を図６においてピー
ク７１とする。
れたソフトウェアにおいては、ユーザインターフェース
により、実測されたピークをコンピュータディスプレイ
上で確認し、ポインティングデバイスによりピーク範囲
を選択する機能が用意されている。図６は、ソフトウェ
アにより選択されたピーク範囲より、バックグラウンド
値を求める手順を図示する。図５におけるフィルタａに
よる測定値５１上の真のピーク６１を図６においてピー
ク７１とする。
【００１２】図６（ａ）に示すように、コンピュータデ
ィスプレイに波形や二次元イメージとして表示されたピ
ーク７１は、ポインティングデバイスによりその開始点
７２及び終了点７３が選択され、ピーク範囲７４が設定
される。ピーク範囲は、図６（ｂ）に示すように、経験
的に設定された幅７５及び幅７６だけピークの開始及び
終了方向へ向かって拡張され、光学フィルタａによる計
測値のバックグラウンド値５９算出のために拡張ピーク
範囲７７が設定される。
ィスプレイに波形や二次元イメージとして表示されたピ
ーク７１は、ポインティングデバイスによりその開始点
７２及び終了点７３が選択され、ピーク範囲７４が設定
される。ピーク範囲は、図６（ｂ）に示すように、経験
的に設定された幅７５及び幅７６だけピークの開始及び
終了方向へ向かって拡張され、光学フィルタａによる計
測値のバックグラウンド値５９算出のために拡張ピーク
範囲７７が設定される。
【００１３】図６（ｃ）に示すように、拡張ピーク範囲
７７における光学フィルタａの計測値の要素集合を同一
の計測値を持つ要素単位にまとめたヒストグラムを作成
すると、バックグラウンドを構成する測定値の山７９と
ピークを構成する測定値の山７８を持つグラフとなる。
バックグラウンドを構成する測定値の山７９は、低い値
を持つ測定値の集まりとして比較的はっきりとした山を
形成するため、ヒストグラムの低い値の側から見つかる
最初の山の頂点８０としてこれを求め、その値を光学フ
ィルタａによる計測値のバックグラウンド値Ｂaとす
る。同様に、拡張ピーク範囲７７における光学フィルタ
ｂの計測値の要素集合を同一の計測値を持つ要素単位に
まとめたヒストグラムを作成し、低い値の側から見つか
る最初の山の頂点における測定値を光学フィルタｂによ
る計測値のバックグラウンド値Ｂbとする。
７７における光学フィルタａの計測値の要素集合を同一
の計測値を持つ要素単位にまとめたヒストグラムを作成
すると、バックグラウンドを構成する測定値の山７９と
ピークを構成する測定値の山７８を持つグラフとなる。
バックグラウンドを構成する測定値の山７９は、低い値
を持つ測定値の集まりとして比較的はっきりとした山を
形成するため、ヒストグラムの低い値の側から見つかる
最初の山の頂点８０としてこれを求め、その値を光学フ
ィルタａによる計測値のバックグラウンド値Ｂaとす
る。同様に、拡張ピーク範囲７７における光学フィルタ
ｂの計測値の要素集合を同一の計測値を持つ要素単位に
まとめたヒストグラムを作成し、低い値の側から見つか
る最初の山の頂点における測定値を光学フィルタｂによ
る計測値のバックグラウンド値Ｂbとする。
【００１４】真のピーク成分６１の計算においては、図
６（ａ）で設定されたピーク範囲７４を対象として、同
範囲の光学フィルタａによる測定値より光学フィルタａ
による計測値のバックグラウンド値を引いた値を積算す
る。また、漏れ込みピーク成分６２の計算においては、
ピーク範囲７４を対象として、同範囲の光学フィルタｂ
による測定値より光学フィルタｂによる計測値のバック
グラウンド値を引いた値を積算する。こうして得られた
漏れ込みピーク成分６２を真のピーク成分６１で割った
ものを、発光試薬Ａの光学フィルタｂへの漏れ込み率Ｒ
abとする。同様の方法により、発光試薬Ｂの光学フィル
タａへの漏れ込み率Ｒbaを求めることができる。以上に
より求められたバックグラウンド値Ｂa，Ｂb及び漏れ込
み率Ｒab，Ｒbaを用いて、以下の〔数１〕及び〔数２〕
により、光学フィルタａによる計測値５１（Ｐa）及び
光学フィルタｂによる計測値５２（Ｐb）から、それぞ
れ発光試薬Ｂ及び発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分を除
去した値Ｔa，Ｔbを求める。
６（ａ）で設定されたピーク範囲７４を対象として、同
範囲の光学フィルタａによる測定値より光学フィルタａ
による計測値のバックグラウンド値を引いた値を積算す
る。また、漏れ込みピーク成分６２の計算においては、
ピーク範囲７４を対象として、同範囲の光学フィルタｂ
による測定値より光学フィルタｂによる計測値のバック
グラウンド値を引いた値を積算する。こうして得られた
漏れ込みピーク成分６２を真のピーク成分６１で割った
ものを、発光試薬Ａの光学フィルタｂへの漏れ込み率Ｒ
abとする。同様の方法により、発光試薬Ｂの光学フィル
タａへの漏れ込み率Ｒbaを求めることができる。以上に
より求められたバックグラウンド値Ｂa，Ｂb及び漏れ込
み率Ｒab，Ｒbaを用いて、以下の〔数１〕及び〔数２〕
により、光学フィルタａによる計測値５１（Ｐa）及び
光学フィルタｂによる計測値５２（Ｐb）から、それぞ
れ発光試薬Ｂ及び発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分を除
去した値Ｔa，Ｔbを求める。
【００１５】
【数１】
Ｐa＝（Ｔa−Ｂa）＋（Ｔb−Ｂb）×Ｒba＋Ｂa
【００１６】
【数２】Ｐb＝（Ｔa−Ｂa）×Ｒab＋（Ｔb−Ｂb）＋Ｂb
３種類以上の発光試薬及び対応する光学フィルタを用い
た発光試薬由来の測定値の分離測定においても、上記の
手法によりバックグラウンド値及び対象外光学フィルタ
への光成分の漏れ込み率を求めることができる。３種類
以上の発光試薬の対応する光学フィルタを通した測定値
の分離測定における、対象外の発光試薬由来の漏れ込み
光成分を除去した値の算出には、発光波長域が最もオー
バーラップする１組の発光試薬からの測定値に対し、前
記〔数１〕及び〔数２〕により漏れ込み光成分を除去す
る。次に、残った発光試薬のうちで、処理済み発光試薬
のいずれかに最もオーバーラップするものを選び、〔数
１〕及び〔数２〕により漏れ込み光成分を除去する。こ
の際、処理済み発光試薬については、先に漏れ込みを除
去した値ＴaもしくはＴbを新たにＰaもしくはＰbとして
計算する。
た発光試薬由来の測定値の分離測定においても、上記の
手法によりバックグラウンド値及び対象外光学フィルタ
への光成分の漏れ込み率を求めることができる。３種類
以上の発光試薬の対応する光学フィルタを通した測定値
の分離測定における、対象外の発光試薬由来の漏れ込み
光成分を除去した値の算出には、発光波長域が最もオー
バーラップする１組の発光試薬からの測定値に対し、前
記〔数１〕及び〔数２〕により漏れ込み光成分を除去す
る。次に、残った発光試薬のうちで、処理済み発光試薬
のいずれかに最もオーバーラップするものを選び、〔数
１〕及び〔数２〕により漏れ込み光成分を除去する。こ
の際、処理済み発光試薬については、先に漏れ込みを除
去した値ＴaもしくはＴbを新たにＰaもしくはＰbとして
計算する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】ところで、従来の方法
においては、真のピークとして選択すべきピークの選択
及びピーク範囲の設定には、上記手法に関する利用者の
理解とソフトウェア利用の熟練が要求され、また、常に
適当なバックグラウンド値及び漏れ込み率を得るために
は、均一な計測結果を得るために実験への熟練が必要と
された。真のピークとして選択するピークによって、ま
た、同一ピークにおいてもピーク範囲設定操作における
差異によって、異なるバックグラウンド値及び漏れ込み
率が算出されてしまうことは、法鑑定等、多色発光試薬
の分離測定を客観的な計測結果として利用すべき分野に
おいて問題であった。また、ピークの選択及びピーク範
囲の設定において利用者の操作を必要とする従来の方法
は、多色発光試薬の分離測定結果を利用した後処理を含
むシステム全体の自動化を妨げるものであった。本発明
は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもの
であり、複数の発光試薬を用いた色分離検出方法におい
て正確なバックグラウンド値及び漏れ込み率を自動的に
求める方法を提供することを目的とする。
においては、真のピークとして選択すべきピークの選択
及びピーク範囲の設定には、上記手法に関する利用者の
理解とソフトウェア利用の熟練が要求され、また、常に
適当なバックグラウンド値及び漏れ込み率を得るために
は、均一な計測結果を得るために実験への熟練が必要と
された。真のピークとして選択するピークによって、ま
た、同一ピークにおいてもピーク範囲設定操作における
差異によって、異なるバックグラウンド値及び漏れ込み
率が算出されてしまうことは、法鑑定等、多色発光試薬
の分離測定を客観的な計測結果として利用すべき分野に
おいて問題であった。また、ピークの選択及びピーク範
囲の設定において利用者の操作を必要とする従来の方法
は、多色発光試薬の分離測定結果を利用した後処理を含
むシステム全体の自動化を妨げるものであった。本発明
は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもの
であり、複数の発光試薬を用いた色分離検出方法におい
て正確なバックグラウンド値及び漏れ込み率を自動的に
求める方法を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の電気泳動方法では、分離測定のために試料
を標識した発光試薬と同じ発光試薬で標識された既知の
試料（マーカー試料）を用い、マーカー試料を測定対象
の試料と同一条件下に置いて電気泳動することで、マー
カー試料を分離測定装置で測定対象の試料と同時に分離
して測定する。マーカー試料は測定結果より容易に識別
可能であって、測定値の正確なバックグラウンド値を算
出することができる。このマーカー試料を用いること
で、発光試薬由来の光成分の対象外光学フィルタへの正
確な漏れ込み率を算出することができる。また、マーカ
ー試料の電気泳動バンド測定におけるバックグラウンド
値及び漏れ込み率は自動処理により算出することが可能
であり、漏れ込み光成分を自動除去した測定値を自動で
出力することができる。
に、本発明の電気泳動方法では、分離測定のために試料
を標識した発光試薬と同じ発光試薬で標識された既知の
試料（マーカー試料）を用い、マーカー試料を測定対象
の試料と同一条件下に置いて電気泳動することで、マー
カー試料を分離測定装置で測定対象の試料と同時に分離
して測定する。マーカー試料は測定結果より容易に識別
可能であって、測定値の正確なバックグラウンド値を算
出することができる。このマーカー試料を用いること
で、発光試薬由来の光成分の対象外光学フィルタへの正
確な漏れ込み率を算出することができる。また、マーカ
ー試料の電気泳動バンド測定におけるバックグラウンド
値及び漏れ込み率は自動処理により算出することが可能
であり、漏れ込み光成分を自動除去した測定値を自動で
出力することができる。
【００１９】すなわち、本発明の電気泳動方法は、複数
種類の発光試薬で標識された試料と既知の分子量を有す
る複数種類の分子を前記発光試薬で標識してなるマーカ
ー試料とを同時に電気泳動することを特徴とする。その
際、第１の発光試薬で標識されたマーカー試料からの発
光を、第１の発光試薬由来の光成分を分離検出するため
の光学フィルタを介して測定した測定値と、第２の発光
試薬由来の光成分を分離検出するための光学フィルタを
介して測定した測定値とを比較することにり、第１の発
光試薬由来の光成分の第２の光学フィルタへの漏れ込み
率を求める。そして、こうして求められた漏れ込み率を
用いて各発光試薬由来の光成分の計測値を補正する。
種類の発光試薬で標識された試料と既知の分子量を有す
る複数種類の分子を前記発光試薬で標識してなるマーカ
ー試料とを同時に電気泳動することを特徴とする。その
際、第１の発光試薬で標識されたマーカー試料からの発
光を、第１の発光試薬由来の光成分を分離検出するため
の光学フィルタを介して測定した測定値と、第２の発光
試薬由来の光成分を分離検出するための光学フィルタを
介して測定した測定値とを比較することにり、第１の発
光試薬由来の光成分の第２の光学フィルタへの漏れ込み
率を求める。そして、こうして求められた漏れ込み率を
用いて各発光試薬由来の光成分の計測値を補正する。
【００２０】マーカー試料の電気泳動によって形成され
た複数のバンドに対して、マーカー試料に含まれる分子
は分子量順に対応付けされる。前記漏れ込み率を求める
にあたっては、泳動方向にマーカー試料を測定した測定
波形からピーク範囲を除いた部分の平均を求め、これを
バックグラウンド値とするのがよい。本発明によるマー
カー試料は、異なる分子量を有する複数種類の分子と、
複数種類の発光試薬とを含み、同じ分子量を有する分子
には同じ発光試薬が標識されていることを特徴とする。
た複数のバンドに対して、マーカー試料に含まれる分子
は分子量順に対応付けされる。前記漏れ込み率を求める
にあたっては、泳動方向にマーカー試料を測定した測定
波形からピーク範囲を除いた部分の平均を求め、これを
バックグラウンド値とするのがよい。本発明によるマー
カー試料は、異なる分子量を有する複数種類の分子と、
複数種類の発光試薬とを含み、同じ分子量を有する分子
には同じ発光試薬が標識されていることを特徴とする。
【００２１】本発明によるマーカー試料は、また、それ
ぞれ異なる分子量を有する複数種類の分子からなるマー
カー群を複数含み、同一のマーカー群に属する分子には
同一の発光試薬が標識され、異なるマーカー群に属する
分子には異なる発光試薬が標識されていることを特徴と
する。 本発明によるマーカー試料は、また、電気泳動
したときに各々異なる泳動距離に重なることなく分配さ
れるような複数種類の物質を含み、前記複数種類の物質
は複数のグループにグループ分けされ、同一のグループ
に属する物質には同一の発光試薬が標識され、異なるグ
ループに属する物質には異なる発光試薬が標識されてい
ることを特徴とする。
ぞれ異なる分子量を有する複数種類の分子からなるマー
カー群を複数含み、同一のマーカー群に属する分子には
同一の発光試薬が標識され、異なるマーカー群に属する
分子には異なる発光試薬が標識されていることを特徴と
する。 本発明によるマーカー試料は、また、電気泳動
したときに各々異なる泳動距離に重なることなく分配さ
れるような複数種類の物質を含み、前記複数種類の物質
は複数のグループにグループ分けされ、同一のグループ
に属する物質には同一の発光試薬が標識され、異なるグ
ループに属する物質には異なる発光試薬が標識されてい
ることを特徴とする。
【００２２】本発明による電気泳動装置は、複数の発光
試薬で標識された試料が電気泳動する試料泳動部と、試
料を標識した複数の発光試薬を含む前述のマーカー試料
が電気泳動するマーカー電気泳動部とを備えることを特
徴とする。この電気泳動装置は、平板一次元電気泳動装
置、平板二次元電気泳動装置とすることもできるし、キ
ャピラリー電気泳動装置とすることもできる。
試薬で標識された試料が電気泳動する試料泳動部と、試
料を標識した複数の発光試薬を含む前述のマーカー試料
が電気泳動するマーカー電気泳動部とを備えることを特
徴とする。この電気泳動装置は、平板一次元電気泳動装
置、平板二次元電気泳動装置とすることもできるし、キ
ャピラリー電気泳動装置とすることもできる。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て、図面を参照して具体的に説明する。図７は、２種類
の発光試薬により標識した試料の平板ゲル電気泳動によ
る分離測定に、マーカー試料を用いた例を示す。図７
（ａ）は平板ゲル電気泳動支持体上での標識された試料
とマーカー試料の位置を示す図、図７（ｂ）は図７
（ａ）に示す電気泳動支持体を光学フィルタａを通して
測定した結果を示す図、図７（ｃ）は図７（ａ）に示す
電気泳動支持体を光学フィルタｂを通して測定した結果
を示す図である。
て、図面を参照して具体的に説明する。図７は、２種類
の発光試薬により標識した試料の平板ゲル電気泳動によ
る分離測定に、マーカー試料を用いた例を示す。図７
（ａ）は平板ゲル電気泳動支持体上での標識された試料
とマーカー試料の位置を示す図、図７（ｂ）は図７
（ａ）に示す電気泳動支持体を光学フィルタａを通して
測定した結果を示す図、図７（ｃ）は図７（ａ）に示す
電気泳動支持体を光学フィルタｂを通して測定した結果
を示す図である。
【００２４】図７（ａ）に示すように、平板ゲル電気泳
動における支持体（ゲル）１０１上には、マーカー試料
レーン１０２と、測定対象試料レーン１０３とが設定さ
れている。マーカー試料レーン１０２上では、発光試薬
Ａで標識したマーカーＡ（１０４）と発光試薬Ｂで標識
したマーカーＢ（１０５）とが分離されており、測定対
象試料レーン１０３上では、発光試薬Ａで標識した測定
対象試料Ａ（１０６）と、発光試薬Ｂで標識した測定対
象試料Ｂ（１０７）とが分離されて示されている。
動における支持体（ゲル）１０１上には、マーカー試料
レーン１０２と、測定対象試料レーン１０３とが設定さ
れている。マーカー試料レーン１０２上では、発光試薬
Ａで標識したマーカーＡ（１０４）と発光試薬Ｂで標識
したマーカーＢ（１０５）とが分離されており、測定対
象試料レーン１０３上では、発光試薬Ａで標識した測定
対象試料Ａ（１０６）と、発光試薬Ｂで標識した測定対
象試料Ｂ（１０７）とが分離されて示されている。
【００２５】支持体１０１を光学フィルタａを通して測
定すると、図７（ｂ）に示すように、支持体像１０８の
マーカー試料レーンに対応する箇所には、マーカーＡを
標識した発光試薬Ａ由来の光成分１０９と、マーカーＢ
を標識した発光試薬Ｂ由来の漏れ込み光成分１１０とが
現れる。また、支持体像１０８の測定対象試料レーンに
対応する箇所には、測定対象試料Ａを標識した発光試薬
Ａ由来の光成分１１１と、測定対象試料Ｂを標識した発
光試薬Ｂ由来の漏れ込み光成分１１２が現れる。図の左
側に、光学フィルタａを通した光測定値によるマーカー
レーンの測定波形１１３を示す。
定すると、図７（ｂ）に示すように、支持体像１０８の
マーカー試料レーンに対応する箇所には、マーカーＡを
標識した発光試薬Ａ由来の光成分１０９と、マーカーＢ
を標識した発光試薬Ｂ由来の漏れ込み光成分１１０とが
現れる。また、支持体像１０８の測定対象試料レーンに
対応する箇所には、測定対象試料Ａを標識した発光試薬
Ａ由来の光成分１１１と、測定対象試料Ｂを標識した発
光試薬Ｂ由来の漏れ込み光成分１１２が現れる。図の左
側に、光学フィルタａを通した光測定値によるマーカー
レーンの測定波形１１３を示す。
【００２６】同様に、支持体１０１を光学フィルタｂを
通して測定すると、図７（ｃ）に示すように、支持体像
１１４のマーカー試料レーンに対応する箇所には、マー
カーＡを標識した発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分１１
５と、マーカーＢを標識した発光試薬Ｂ由来の光成分１
１６とが現れる。また、支持体像１１４の測定対象試料
レーンに対応する箇所には、測定対象試料Ａを標識した
発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分１１７と、測定対象試
料Ｂを標識した発光試薬Ｂ由来の光成分１１８とが現れ
る。図の左側に、光学フィルタｂを通した光測定値によ
るマーカーレーンの測定波形１１９を示す。
通して測定すると、図７（ｃ）に示すように、支持体像
１１４のマーカー試料レーンに対応する箇所には、マー
カーＡを標識した発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分１１
５と、マーカーＢを標識した発光試薬Ｂ由来の光成分１
１６とが現れる。また、支持体像１１４の測定対象試料
レーンに対応する箇所には、測定対象試料Ａを標識した
発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分１１７と、測定対象試
料Ｂを標識した発光試薬Ｂ由来の光成分１１８とが現れ
る。図の左側に、光学フィルタｂを通した光測定値によ
るマーカーレーンの測定波形１１９を示す。
【００２７】ここで、マーカーＡは、電気泳動によりマ
ーカーレーン１０２の上部から下部にかけて適度に分配
されるべく、本例では４種類の既知の分子量を持つ試料
を発光試薬Ａで標識したものである。また、マーカーＢ
は、電気泳動によりマーカーレーン１０２の上部から下
部にかけて適度に分配されるべく、また、マーカーＡと
泳動距離が重ならない既知の分子量を持つ４種類の試料
を発光試薬Ｂで標識したものである。マーカーレーン１
０２で泳動される全てのマーカーは、泳動範囲にピーク
が現れる既知の分子量を持つよう選択する。
ーカーレーン１０２の上部から下部にかけて適度に分配
されるべく、本例では４種類の既知の分子量を持つ試料
を発光試薬Ａで標識したものである。また、マーカーＢ
は、電気泳動によりマーカーレーン１０２の上部から下
部にかけて適度に分配されるべく、また、マーカーＡと
泳動距離が重ならない既知の分子量を持つ４種類の試料
を発光試薬Ｂで標識したものである。マーカーレーン１
０２で泳動される全てのマーカーは、泳動範囲にピーク
が現れる既知の分子量を持つよう選択する。
【００２８】マーカーレーンの測定波形は、マーカーレ
ーン範囲の測定値を、縦方向の各位置すなわち電気泳動
による試料の移動距離において、横方向の測定値を平均
したものをグラフとしたものである。図８に、図７に示
したマーカーレーンの測定値１１３，１１９より、光学
フィルタａを通した光測定値のバックグラウンド値、光
学フィルタｂを通した光測定値のバックグラウンド値、
発光試薬Ａ由来の光成分の光学フィルタｂを通した光測
定値への漏れ込み率の算出、及び発光試薬Ｂ由来の光成
分の光学フィルタａを通した光測定値への漏れ込み率の
算出のためのフローチャートを示す。
ーン範囲の測定値を、縦方向の各位置すなわち電気泳動
による試料の移動距離において、横方向の測定値を平均
したものをグラフとしたものである。図８に、図７に示
したマーカーレーンの測定値１１３，１１９より、光学
フィルタａを通した光測定値のバックグラウンド値、光
学フィルタｂを通した光測定値のバックグラウンド値、
発光試薬Ａ由来の光成分の光学フィルタｂを通した光測
定値への漏れ込み率の算出、及び発光試薬Ｂ由来の光成
分の光学フィルタａを通した光測定値への漏れ込み率の
算出のためのフローチャートを示す。
【００２９】図９は、各光学フィルタを通して得られる
測定波形の自動ピーク認識で求められるピーク範囲から
得たバックグラウンド値算出に利用される範囲３０５を
示す。図７に示した光学フィルタａを通して得られる測
定波形１１３に対する自動ピーク認識によって、真のピ
ーク３０１及び漏れ込みピーク３０２が、また、図７に
示した光学フィルタｂを通して得られる測定波形１１９
に対する自動ピーク認識によって、真のピーク３０３及
び漏れ込みピーク３０４が得られる。これらの真のピー
ク３０１，３０３及び漏れ込みピーク３０２，３０４を
除いた測定波形の範囲がバックグラウンド値算出のため
に利用される。
測定波形の自動ピーク認識で求められるピーク範囲から
得たバックグラウンド値算出に利用される範囲３０５を
示す。図７に示した光学フィルタａを通して得られる測
定波形１１３に対する自動ピーク認識によって、真のピ
ーク３０１及び漏れ込みピーク３０２が、また、図７に
示した光学フィルタｂを通して得られる測定波形１１９
に対する自動ピーク認識によって、真のピーク３０３及
び漏れ込みピーク３０４が得られる。これらの真のピー
ク３０１，３０３及び漏れ込みピーク３０２，３０４を
除いた測定波形の範囲がバックグラウンド値算出のため
に利用される。
【００３０】図１０は、マーカーレーンに泳動するマー
カー情報と、測定波長から得られるピーク情報の照合の
仕組みを示す。発光試薬Ａで標識された４種類の試料
（マーカー）の分子量の集合４０３と発光試薬Ｂで標識
された４種類の試料（マーカー）の分子量の集合４０４
をマージした分子量の集合４０５を、各光学フィルタを
通して得られる測定波形の自動ピーク認識で求められる
ピークの集合４０６と一致させることにより、測定波形
上のピークの由来となるマーカー分子の分子量と、その
マーカーを標識している発光試薬の種類を特定すること
ができる。
カー情報と、測定波長から得られるピーク情報の照合の
仕組みを示す。発光試薬Ａで標識された４種類の試料
（マーカー）の分子量の集合４０３と発光試薬Ｂで標識
された４種類の試料（マーカー）の分子量の集合４０４
をマージした分子量の集合４０５を、各光学フィルタを
通して得られる測定波形の自動ピーク認識で求められる
ピークの集合４０６と一致させることにより、測定波形
上のピークの由来となるマーカー分子の分子量と、その
マーカーを標識している発光試薬の種類を特定すること
ができる。
【００３１】次に、図８のフローチャートに沿って本発
明によるバックグラウンド値、及び対象外発光試薬由来
光成分の漏れ込み率算出の方法を説明する。図８のステ
ップ２０１において、各光学フィルタを通した光測定値
によるマーカーレーンの測定波形１１３，１１９の形状
より、ピーク位置及びピーク範囲の認識を行う。ソフト
ウェアは、自動ピーク認識プログラムにより、測定デー
タに依存した経験値を元に平滑化した波形データを対象
として、ピーク成分の立ち上がりと終了の検出、頂点の
検出を行い、それぞれピーク範囲とピーク位置とする。
この際、各光学フィルタを通した光測定値には、対象外
発光試薬由来の光成分が漏れ込んでいるため、漏れ込み
量の多いピークに関しては、対象外発光試薬によるピー
クも認識される。図１０に示した測定波形１１３に対す
るピーク範囲４０１、及び測定波形１１９に対するピー
ク範囲４０２がステップ２０１において検出される各ピ
ークのピーク範囲である。
明によるバックグラウンド値、及び対象外発光試薬由来
光成分の漏れ込み率算出の方法を説明する。図８のステ
ップ２０１において、各光学フィルタを通した光測定値
によるマーカーレーンの測定波形１１３，１１９の形状
より、ピーク位置及びピーク範囲の認識を行う。ソフト
ウェアは、自動ピーク認識プログラムにより、測定デー
タに依存した経験値を元に平滑化した波形データを対象
として、ピーク成分の立ち上がりと終了の検出、頂点の
検出を行い、それぞれピーク範囲とピーク位置とする。
この際、各光学フィルタを通した光測定値には、対象外
発光試薬由来の光成分が漏れ込んでいるため、漏れ込み
量の多いピークに関しては、対象外発光試薬によるピー
クも認識される。図１０に示した測定波形１１３に対す
るピーク範囲４０１、及び測定波形１１９に対するピー
ク範囲４０２がステップ２０１において検出される各ピ
ークのピーク範囲である。
【００３２】次に、ステップ２０２において、各光学フ
ィルタを通した光測定値より得られたすべてのピークの
ピーク範囲の集合を求め、泳動距離でソートする。この
際、異なる測定波形より得られたピーク同士で、ピーク
範囲の重なるピークに関しては、同一のマーカー由来の
真のピークと漏れ込みによるピークのいずれかであると
し、いずれか一方のピーク範囲を採用する。こうして得
られたピーク範囲の数は、マーカーレーンで泳動された
全マーカーの数に一致する。ここで採用したピーク位置
及びピーク範囲は、真のピークのものであるか、漏れ込
みによるピークのものであるかは問わない。図１０に示
したピーク範囲の集合４０６がこれを示す。この時点
で、いずれの測定波形上のピークが真のピークであり、
他の測定波形上のピークが漏れ込みによるピークである
かを判定することはできない。本発明における光測定に
用いる測定装置によっては、図１における光電子増倍管
６を複数組有し、それぞれの感度が異なる場合もあるか
らである。
ィルタを通した光測定値より得られたすべてのピークの
ピーク範囲の集合を求め、泳動距離でソートする。この
際、異なる測定波形より得られたピーク同士で、ピーク
範囲の重なるピークに関しては、同一のマーカー由来の
真のピークと漏れ込みによるピークのいずれかであると
し、いずれか一方のピーク範囲を採用する。こうして得
られたピーク範囲の数は、マーカーレーンで泳動された
全マーカーの数に一致する。ここで採用したピーク位置
及びピーク範囲は、真のピークのものであるか、漏れ込
みによるピークのものであるかは問わない。図１０に示
したピーク範囲の集合４０６がこれを示す。この時点
で、いずれの測定波形上のピークが真のピークであり、
他の測定波形上のピークが漏れ込みによるピークである
かを判定することはできない。本発明における光測定に
用いる測定装置によっては、図１における光電子増倍管
６を複数組有し、それぞれの感度が異なる場合もあるか
らである。
【００３３】次に、ステップ２０３において、図１０に
おける発光試薬Ａにより標識された試料（マーカー）の
分子量の集合４０３、及び発光試薬Ｂにより標識された
試料（マーカー）の分子量の集合４０４をマージし、分
子量によりソートした集合４０５を得る。続くステップ
２０４では、ステップ２０２で求めた各ピーク範囲４０
６と、ステップ２０３で分子量によりソートされたマー
カーの集合を照合する。これにより、どのピーク範囲が
どの分子量のマーカー由来のものであるかを求めること
ができる。また、各分子量のマーカーをラベルしている
発光試薬を特定することで、各測定波形において、各ピ
ークが真のピークであるか、漏れ込みによるピークであ
るかを判定することができる。この手段により、従来は
測定値より人為的に判断していた真のピークの選択を自
動化することが可能となる。
おける発光試薬Ａにより標識された試料（マーカー）の
分子量の集合４０３、及び発光試薬Ｂにより標識された
試料（マーカー）の分子量の集合４０４をマージし、分
子量によりソートした集合４０５を得る。続くステップ
２０４では、ステップ２０２で求めた各ピーク範囲４０
６と、ステップ２０３で分子量によりソートされたマー
カーの集合を照合する。これにより、どのピーク範囲が
どの分子量のマーカー由来のものであるかを求めること
ができる。また、各分子量のマーカーをラベルしている
発光試薬を特定することで、各測定波形において、各ピ
ークが真のピークであるか、漏れ込みによるピークであ
るかを判定することができる。この手段により、従来は
測定値より人為的に判断していた真のピークの選択を自
動化することが可能となる。
【００３４】各測定波形において、真のピークが判定可
能となるため、ステップ２０５において、ステップ２０
２でひとまとめにした全ピークについて、真のピークを
含む測定波形でのピーク認識の結果を元に、真のピーク
位置とピーク範囲を得る。すなわち、図９におけるピー
ク範囲３０１及びピーク範囲３０３が真のピークのピー
ク範囲となる。次に、ステップ２０６において、各測定
波形１１３，１１９より、ステップ２０５で求めた各ピ
ークのピーク範囲のデータを除き、残りの範囲について
測定値の平均を取る。図９に示した範囲３０５がこの範
囲となる。こうして得られた値を、各光学フィルタを通
した光測定値におけるバックグラウンド値Ｂa，Ｂbとす
る。この残りの範囲３０５の測定値は、どの発光試薬由
来の光成分も影響を及ぼしていないことが明らかであ
る。この手段により、従来は人為的な選択により取得す
る値にばらつきが出ていたバックグラウンド値の計算
を、マーカーレーンの測定波形算出と自動ピーク認識プ
ログラムに与えるパラメータにより、客観的で再現性あ
る形で求めることが可能となる。
能となるため、ステップ２０５において、ステップ２０
２でひとまとめにした全ピークについて、真のピークを
含む測定波形でのピーク認識の結果を元に、真のピーク
位置とピーク範囲を得る。すなわち、図９におけるピー
ク範囲３０１及びピーク範囲３０３が真のピークのピー
ク範囲となる。次に、ステップ２０６において、各測定
波形１１３，１１９より、ステップ２０５で求めた各ピ
ークのピーク範囲のデータを除き、残りの範囲について
測定値の平均を取る。図９に示した範囲３０５がこの範
囲となる。こうして得られた値を、各光学フィルタを通
した光測定値におけるバックグラウンド値Ｂa，Ｂbとす
る。この残りの範囲３０５の測定値は、どの発光試薬由
来の光成分も影響を及ぼしていないことが明らかであ
る。この手段により、従来は人為的な選択により取得す
る値にばらつきが出ていたバックグラウンド値の計算
を、マーカーレーンの測定波形算出と自動ピーク認識プ
ログラムに与えるパラメータにより、客観的で再現性あ
る形で求めることが可能となる。
【００３５】続くステップ２０７において、各測定波形
１１３，１１９において、ステップ２０５において求め
た全ピーク範囲について、バックグラウンド値を基準と
したピークの体積を求め、ステップ２０８において、各
測定波形毎に、発光試薬毎のピーク体積を積算する。ス
テップ２０９において、各発光試薬を対象とした光学フ
ィルタを通して得られた測定波形におけるピーク体積の
積算値で、対象外の光学フィルタを通して得られた測定
波形におけるピーク体積の積算値を割った値を計算し、
漏れ込み率Ｒab，Ｒbaとする。この手法により、従来、
人為的に選択したピークとピーク範囲を元に算出してい
た漏れ込み率を客観的に算出することが可能となった。
また、この手法により、漏れ込み率算出の自動化が可能
となった。この方法は、泳動範囲の開始、中間、終了位
置における測定値を考慮した手法であり、泳動範囲全体
に有効な漏れ込み率の算出が可能となった。
１１３，１１９において、ステップ２０５において求め
た全ピーク範囲について、バックグラウンド値を基準と
したピークの体積を求め、ステップ２０８において、各
測定波形毎に、発光試薬毎のピーク体積を積算する。ス
テップ２０９において、各発光試薬を対象とした光学フ
ィルタを通して得られた測定波形におけるピーク体積の
積算値で、対象外の光学フィルタを通して得られた測定
波形におけるピーク体積の積算値を割った値を計算し、
漏れ込み率Ｒab，Ｒbaとする。この手法により、従来、
人為的に選択したピークとピーク範囲を元に算出してい
た漏れ込み率を客観的に算出することが可能となった。
また、この手法により、漏れ込み率算出の自動化が可能
となった。この方法は、泳動範囲の開始、中間、終了位
置における測定値を考慮した手法であり、泳動範囲全体
に有効な漏れ込み率の算出が可能となった。
【００３６】こうして求めた各光学フィルタを通した光
測定値におけるバックグラウンド値Ｂa，Ｂb、及び発光
試薬由来の光成分の対象外光学フィルタへの漏れ込み率
Ｒab，Ｒbaを用い、前述の〔数１〕〔数２〕を用いる従
来の方法により、対象外の発光試薬由来の光成分を除去
した測定値を算出する。この方法によると、各光学フィ
ルタを通した光測定値におけるバックグラウンド値、及
び発光試薬由来の光成分の対象外光学フィルタへの漏れ
込み率の客観的な算出とともに算出の自動化が可能とな
ったことにより、対象外の発光試薬由来の光成分を除去
した測定値の自動算出、及び同測定値を用いた客観的な
データ解析、並びにデータ解析の自動化が可能となっ
た。
測定値におけるバックグラウンド値Ｂa，Ｂb、及び発光
試薬由来の光成分の対象外光学フィルタへの漏れ込み率
Ｒab，Ｒbaを用い、前述の〔数１〕〔数２〕を用いる従
来の方法により、対象外の発光試薬由来の光成分を除去
した測定値を算出する。この方法によると、各光学フィ
ルタを通した光測定値におけるバックグラウンド値、及
び発光試薬由来の光成分の対象外光学フィルタへの漏れ
込み率の客観的な算出とともに算出の自動化が可能とな
ったことにより、対象外の発光試薬由来の光成分を除去
した測定値の自動算出、及び同測定値を用いた客観的な
データ解析、並びにデータ解析の自動化が可能となっ
た。
【００３７】図１１は、本発明の方法の有効性を示す図
である。３種類の蛍光色素、Fluorescein，ＴＭＲ，Ｃ
ＸＲで標識されたサンプルを同時に電気泳動し、それぞ
れ５０５ｎｍ，５８５ｎｍ，６５０ｎｍの波長域を特異
的に透過する光学フィルタを介して３枚の画像を得、目
的外の色素由来の光成分（漏れ込み光成分）を除去する
処理を行った。図１１（ａ）は５８５ｎｍ波長域を特異
的に透過する光学フィルタを介して得られた未加工の画
像である図１１（ｂ）は、図１１（ａ）の画像から、従
来の方法により求めた漏れ込みパラメータを用いて、漏
れ込み光成分を除去した画像である。また、図１１
（ｃ）は、図１１（ａ）の画像から、本発明の方法で求
めた漏れ込みパラメータを用いて、漏れ込み光成分を除
去した画像である。図１１（ｂ）に示した従来法で処理
した画像には、ＣＸＲ由来の光成分の除去不足Ａ、及び
Fluorescein由来の光成分の過剰な除去Ｂが見られる
が、本発明の方法で処理した図１１（ｃ）の画像には、
こうした状況はみられず、本発明の方法が有効であるこ
とが示された。
である。３種類の蛍光色素、Fluorescein，ＴＭＲ，Ｃ
ＸＲで標識されたサンプルを同時に電気泳動し、それぞ
れ５０５ｎｍ，５８５ｎｍ，６５０ｎｍの波長域を特異
的に透過する光学フィルタを介して３枚の画像を得、目
的外の色素由来の光成分（漏れ込み光成分）を除去する
処理を行った。図１１（ａ）は５８５ｎｍ波長域を特異
的に透過する光学フィルタを介して得られた未加工の画
像である図１１（ｂ）は、図１１（ａ）の画像から、従
来の方法により求めた漏れ込みパラメータを用いて、漏
れ込み光成分を除去した画像である。また、図１１
（ｃ）は、図１１（ａ）の画像から、本発明の方法で求
めた漏れ込みパラメータを用いて、漏れ込み光成分を除
去した画像である。図１１（ｂ）に示した従来法で処理
した画像には、ＣＸＲ由来の光成分の除去不足Ａ、及び
Fluorescein由来の光成分の過剰な除去Ｂが見られる
が、本発明の方法で処理した図１１（ｃ）の画像には、
こうした状況はみられず、本発明の方法が有効であるこ
とが示された。
【００３８】
【発明の効果】本発明によると、発光波長の異なる複数
の発光試薬を光学フィルターによって分離測定する際
に、１つの発光試薬由来の光成分が、その発光試薬の分
離検出を目的としない光学フィルタへ漏れ込む量を、客
観的な観測データを元に自動的に計算し、漏れ込みを除
去した測定値を出力することが可能となる。
の発光試薬を光学フィルターによって分離測定する際
に、１つの発光試薬由来の光成分が、その発光試薬の分
離検出を目的としない光学フィルタへ漏れ込む量を、客
観的な観測データを元に自動的に計算し、漏れ込みを除
去した測定値を出力することが可能となる。
【図１】複数種類の発光試薬を標識に用いた試料を分離
検出する装置の一例の概略図。
検出する装置の一例の概略図。
【図２】複数の発光試薬の発光波長パターンがオーバー
ラップする例を示す図。
ラップする例を示す図。
【図３】光成分分離を目的とした光学フィルタへの他の
光成分の漏れ込みの説明図。
光成分の漏れ込みの説明図。
【図４】目的とする以外の光成分の漏れ込みにより測定
波形が変形される例を示す図。
波形が変形される例を示す図。
【図５】漏れ込み率計算のための説明図。
【図６】バックグラウンド値計算の方法を説明する図。
【図７】２種類の発光試薬で標識した試料の平板電気泳
動パターンを２種類の光学フィルタを通して光測定した
結果を示す図。
動パターンを２種類の光学フィルタを通して光測定した
結果を示す図。
【図８】光学フィルタを通した測定値のバックグラウン
ド値及び対象外発光試薬由来の光成分の漏れ込み率計算
のためのフローチャート。
ド値及び対象外発光試薬由来の光成分の漏れ込み率計算
のためのフローチャート。
【図９】バックグラウンド値及び漏れ込み率算出方法を
説明するための図。
説明するための図。
【図１０】マーカー情報とマーカーレーンのピークの照
合を説明するための図。
合を説明するための図。
【図１１】本発明の方法の有効性を示す図。
１…支持体、２…試料、３…第１集光レンズ、４…光学
フィルタ、５…第２集光レンズ、６…光電子増倍管、７
…増幅器、８…アナログ・デジタル変換回路、９…デー
タ処理装置、１３…励起光、１４…フルオレセインの発
光波長パターン、１５…ＴＭＲの発光波長パターン、１
６…ＣＸＲの発光波長パターン、１７…光学フィルタの
透過波長域、１８…ＴＭＲ由来の光成分の漏れ込み、４
１…ＣＸＲで標識した試料の電気泳動パターン、４２…
ＴＭＲで標識した試料の電気泳動パターン、４３…光学
フィルタを通して得られるＣＸＲで標識した試料の電気
泳動パターン、５１，５２…測定波形、５３…発光試薬
Ａにより標識された試料、５４…発光試薬Ｂにより標識
された試料、５５…真のピーク、５６…漏れ込みピー
ク、５７…漏れ込みピーク、５８…真のピーク、５９，
６０…バックグラウンド値、７１…ピーク、７２…開始
点、７３…終了点、７４…ピーク範囲、７７…拡張ピー
ク範囲、８０…頂点、１０１…支持体、１０２…マーカ
ー試料レーン、１０３…測定対象試料レーン、１０４…
発光試薬Ａで標識したマーカー、１０５…発光試薬Ｂで
標識したマーカー、１０６…発光試薬Ａで標識した測定
対象試料、１０７…発光試薬Ｂで標識した測定対象試
料、１０９…発光試薬Ａ由来の光成分、１１０…発光試
薬Ｂ由来の漏れ込み光成分、１１１…発光試薬Ａ由来の
光成分、１１２…発光試薬Ｂ由来の漏れ込み光成分、１
１３…マーカーレーンの測定波形、１１５…発光試薬Ａ
由来の漏れ込み光成分、１１６…発光試薬Ｂ由来の光成
分、１１７…発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分、１１８
…発光試薬Ｂ由来の光成分、１１９…マーカーレーンの
測定波形、３０１…真のピーク、３０２…漏れ込みピー
ク、３０３…真のピーク、３０４…漏れ込みピーク、３
０５…バックグラウンド測定範囲、４０１，４０２…ピ
ーク範囲、４０３…発光試薬Ａにより標識された試料
（マーカー）の分子量の集合、４０４…発光試薬Ｂによ
り標識された試料（マーカー）の分子量の集合、４０５
…分子量によりソートした集合、４０６…ピーク範囲の
集合
フィルタ、５…第２集光レンズ、６…光電子増倍管、７
…増幅器、８…アナログ・デジタル変換回路、９…デー
タ処理装置、１３…励起光、１４…フルオレセインの発
光波長パターン、１５…ＴＭＲの発光波長パターン、１
６…ＣＸＲの発光波長パターン、１７…光学フィルタの
透過波長域、１８…ＴＭＲ由来の光成分の漏れ込み、４
１…ＣＸＲで標識した試料の電気泳動パターン、４２…
ＴＭＲで標識した試料の電気泳動パターン、４３…光学
フィルタを通して得られるＣＸＲで標識した試料の電気
泳動パターン、５１，５２…測定波形、５３…発光試薬
Ａにより標識された試料、５４…発光試薬Ｂにより標識
された試料、５５…真のピーク、５６…漏れ込みピー
ク、５７…漏れ込みピーク、５８…真のピーク、５９，
６０…バックグラウンド値、７１…ピーク、７２…開始
点、７３…終了点、７４…ピーク範囲、７７…拡張ピー
ク範囲、８０…頂点、１０１…支持体、１０２…マーカ
ー試料レーン、１０３…測定対象試料レーン、１０４…
発光試薬Ａで標識したマーカー、１０５…発光試薬Ｂで
標識したマーカー、１０６…発光試薬Ａで標識した測定
対象試料、１０７…発光試薬Ｂで標識した測定対象試
料、１０９…発光試薬Ａ由来の光成分、１１０…発光試
薬Ｂ由来の漏れ込み光成分、１１１…発光試薬Ａ由来の
光成分、１１２…発光試薬Ｂ由来の漏れ込み光成分、１
１３…マーカーレーンの測定波形、１１５…発光試薬Ａ
由来の漏れ込み光成分、１１６…発光試薬Ｂ由来の光成
分、１１７…発光試薬Ａ由来の漏れ込み光成分、１１８
…発光試薬Ｂ由来の光成分、１１９…マーカーレーンの
測定波形、３０１…真のピーク、３０２…漏れ込みピー
ク、３０３…真のピーク、３０４…漏れ込みピーク、３
０５…バックグラウンド測定範囲、４０１，４０２…ピ
ーク範囲、４０３…発光試薬Ａにより標識された試料
（マーカー）の分子量の集合、４０４…発光試薬Ｂによ
り標識された試料（マーカー）の分子量の集合、４０５
…分子量によりソートした集合、４０６…ピーク範囲の
集合
フロントページの続き
(72)発明者 山本 顕次
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウェアエンジニアリング株
式会社内
(72)発明者 伊藤 敏明
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウェアエンジニアリング株
式会社内
(72)発明者 吉井 淳治
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウェアエンジニアリング株
式会社内
(56)参考文献 特開 平４−204151（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−281191（ＪＰ，Ａ)
特開 平10−19804（ＪＰ，Ａ)
特開 平11−23532（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−52809（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−300696（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−60698（ＪＰ，Ａ)
特表2000−503774（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 27/447
G01N 27/91
G01N 27/78
G01N 27/64
Claims (9)
- 【請求項１】 複数種類の発光試薬で標識された試料
と、既知の分子量を有する複数種類の分子を同じ種類の
分子は同じ種類の発光試薬で標識するようにして前記複
数種類の発光試薬で標識してなるマーカー試料とを、別
々のレーンで同時に電気泳動することを特徴とする電気
泳動方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の電気泳動方法において、
第１の発光試薬で標識されたマーカー試料からの発光
を、第１の発光試薬由来の光成分を分離検出するための
光学フィルタを介して測定した測定値と、第２の発光試
薬由来の光成分を分離検出するための光学フィルタを介
して測定した測定値とを比較することにより、前記第１
の発光試薬由来の光成分の前記第２の光学フィルタへの
漏れ込み率を求めることを特徴とする電気泳動方法。 - 【請求項３】 請求項２記載の電気泳動方法において、
前記漏れ込み率を用いて各発光試薬由来の光成分の計測
値を補正することを特徴とする電気泳動方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の電気泳動方法において、
マーカー試料の電気泳動によって形成された複数のバン
ドに対して、前記マーカー試料に含まれる分子を分子量
順に対応付けすることを特徴とする電気泳動方法。 - 【請求項５】 請求項２記載の電気泳動方法において、
泳動方向に前記マーカー試料を測定した測定波形からピ
ーク範囲を除いた部分の平均を求め、これをバックグラ
ウンド値とすることを特徴とする電気泳動方法。 - 【請求項６】 異なる分子量を有する複数種類の分子
と、複数種類の発光試薬とを含み、同じ分子量を有する
分子には同じ発光試薬が標識されていることを特徴とす
るマーカー試料。 - 【請求項７】 それぞれ異なる分子量を有する複数種類
の分子からなるマーカー群を複数含み、同一のマーカー
群に属する分子には同一の発光試薬が標識され、異なる
マーカー群に属する分子には異なる発光試薬が標識され
ていることを特徴とするマーカー試料。 - 【請求項８】 電気泳動したときに各々異なる泳動距離
に重なることなく分配されるような複数種類の物質を含
み、前記複数種類の物質は複数のグループにグループ分
けされ、同一のグループに属する物質には同一の発光試
薬が標識され、異なるグループに属する物質には異なる
発光試薬が標識されていることを特徴とするマーカー試
料。 - 【請求項９】 複数の発光試薬で標識された試料が電気
泳動する試料泳動部と、前記試料を標識した複数の発光
試薬を含む請求項６〜８のいずれか１項記載のマーカー
試料が電気泳動するマーカー電気泳動部とを備えること
を特徴とする電気泳動装置。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34547698A JP3432158B2 (ja) | 1998-12-04 | 1998-12-04 | 電気泳動方法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料 |
| US09/452,854 US6533913B1 (en) | 1998-12-04 | 1999-12-02 | Electrophoresis method, electrophoresis device, and marker sample used for the same |
| DE69942083T DE69942083D1 (de) | 1998-12-04 | 1999-12-03 | Verfahren für die Elektrophorese |
| EP99124236A EP1006357B1 (en) | 1998-12-04 | 1999-12-03 | Method for electrophoresis |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34547698A JP3432158B2 (ja) | 1998-12-04 | 1998-12-04 | 電気泳動方法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000171440A JP2000171440A (ja) | 2000-06-23 |
| JP3432158B2 true JP3432158B2 (ja) | 2003-08-04 |
Family
ID=18376858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34547698A Expired - Fee Related JP3432158B2 (ja) | 1998-12-04 | 1998-12-04 | 電気泳動方法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6533913B1 (ja) |
| EP (1) | EP1006357B1 (ja) |
| JP (1) | JP3432158B2 (ja) |
| DE (1) | DE69942083D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10302591B2 (en) | 2006-07-21 | 2019-05-28 | Life Technologies Corporation | Sharply resolving labeled protein molecular weight standards |
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|---|---|---|---|---|
| US20020155455A1 (en) * | 2000-08-11 | 2002-10-24 | Invitrogen Corporation | Highly homogeneous molecular markers for electrophoresis |
| US20040014082A1 (en) * | 2000-08-11 | 2004-01-22 | Invitrogen Corporation | Highly homogeneous molecular markers for electrophoresis |
| AU2003211133A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Invitrogen Corporation | Highly homogeneous molecular markers for electrophoresis |
| WO2005030981A2 (en) * | 2003-09-25 | 2005-04-07 | Invitrogen Corporation | Homogeneous populations of molecules |
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| TWI409454B (zh) * | 2007-08-13 | 2013-09-21 | Netbio Inc | 用於核酸分析之整合微流體系統 |
| WO2010121643A1 (en) * | 2009-04-20 | 2010-10-28 | Agilent Technologies, Inc. | Identifying calibration markers in multiple detection channels |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4507233A (en) * | 1981-04-22 | 1985-03-26 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Colored molecular weight marker |
| NZ215967A (en) * | 1985-05-01 | 1988-05-30 | Commw Serum Lab Commission | Composition of peptides of known weight for determining weight of unknown peptide |
| CA1340806C (en) * | 1986-07-02 | 1999-11-02 | James Merrill Prober | Method, system and reagents for dna sequencing |
| US5307148A (en) * | 1990-04-05 | 1994-04-26 | Hitachi, Ltd. | Fluorescence detection type electrophoresis apparatus |
| US5221454A (en) * | 1992-01-31 | 1993-06-22 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay |
| US5284559A (en) * | 1992-06-16 | 1994-02-08 | Rhode Island Hospital | Preparative electrophoresis device and method |
| US5677196A (en) * | 1993-05-18 | 1997-10-14 | University Of Utah Research Foundation | Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays |
| US5525516B1 (en) * | 1994-09-30 | 1999-11-09 | Eastman Chem Co | Method for tagging petroleum products |
| JPH1073569A (ja) * | 1996-08-30 | 1998-03-17 | Oriental Yeast Co Ltd | 蛋白の測定 |
| EP0963435B1 (en) * | 1997-01-08 | 2008-05-28 | Invitrogen Corporation | Methods for production of proteins |
-
1998
- 1998-12-04 JP JP34547698A patent/JP3432158B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-12-02 US US09/452,854 patent/US6533913B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-03 EP EP99124236A patent/EP1006357B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-03 DE DE69942083T patent/DE69942083D1/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10302591B2 (en) | 2006-07-21 | 2019-05-28 | Life Technologies Corporation | Sharply resolving labeled protein molecular weight standards |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| JP2000171440A (ja) | 2000-06-23 |
| US6533913B1 (en) | 2003-03-18 |
| EP1006357A3 (en) | 2003-05-02 |
| EP1006357A2 (en) | 2000-06-07 |
| DE69942083D1 (de) | 2010-04-15 |
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