PT85238B - Processo e sistema para a sequenciacao de adn - Google Patents

Description

ÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve a sequenciaçao de

ADN utilizando ADN marcado por um informador e, mais particularmente, um sistema baseado na fluorescência para detecçao da presença de energia radiante de diferentes espécies a seguir à separaçao no tempo e/ou no espaço, e os corantes fluores. centes associados ao processo. Estes corantes formam uma família de corantes fluorescentes intimaraente relacionados e distinguíveis. Descrevem-se os processos para proteger, activar e ligar estes corantes. Utiliza-se um conjunto de terminantes de cadeia de ADN marcados por fluorescência, preparados de acordo com a presente metodologia, para gerar fragmentos de se_ quência ADN marcados por fluorescência. Descreve-se também um sistema de detecçao fotométrica susceptível de detectar estes fragmentos durante a separaçao electroforética e de identificar o informador fluorescente associado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A sequenciaçao ADN é uma das técnicas analíticas fundamentais da moderna biologia molecular. 0 desenvolvimento de métodos seguros para a sequenciaçao conduziu a grandes avan ços no conhecimento da organizaçao da informação genética e tornou possível a manipulaçao de material genético (isto é, a engenharia genetica).

Existem dois processos gerais correntes para a se quenciaçao de ADN: o processo de degradaçao química de Maxam-Gilbert (A. M. Maxam e outros; ”Meth. in Enzym 65; 1980; p. 499-559) e o processo de terminação de cadeia de dideoxi de Sanger (F. Sanger e outros; Procjiat, Acad. Sei. USA; 74; 1977 p. 5463-5467). 0 aspecto comum a estas duas técnicas e a geraçao de um conjunto de fragmentos de ADN que se analisam por electroforese. As técnicas diferem nos processos utilizados pa_ ra a preparaçao desses fragmentos.

Com a técnica de Maxam-Gilbert, os fragmentos de ADN preparam-se por meio da clivagem química de base específica da porção de ADN que se pretende sequenciar. Λ porção de ADN que se pretende sequenciar é marcada primeiro no terminal 5' com P e depois divide-se em quatro porçoes. Cada porção é submetida a um conjunto diferente de tratamentos químicos des_ tinados a clivar o ADN em posiçoes adjacentes a uma dada base (ou bases). Como resultado, todos os fragmentos marcados terão a mesma terminação 5’ da porção de ADN original e possuirão terminações 3' definidas pelas posiç.oes de clivagem. Este tratamento efectua-se sob condiçoes que geram fragmentos de ADN de comprimentos convenientes para a separaçao por electrofore. se de gel.

Com a técnica de Sanger, os fragmentos de ADN sao produzidos por meio de cópia enzimática parcial (isto e, sintje se) da porção de ADN que se pretende sequenciar. Na versão mais comum insere-se a porção de ADN que se pretende sequenciar, utilizando técnicas normalizadas, numa porção de ADN grande, circular, de cadeia simples tal como o bacteriófago 1113. Este

proporciona o modelo para o processo de copia. Associa-se uma pequena porção de ADN com a sua sequência complementar a região do modelo imediatamente a montante da inserção para servir de têmpera ao modelo constituindo um sistema escorvador para a síntese. Na presença dos quatro trifosfatos de desoxir. ribonucleosidos naturais (TFdN’s), uma polimerase de ADI'! aumentará o sistema escorvador a partir de terminal 3' para prq porcionar uma cópia complementar do modelo na região de inser çao. Para proporcionar um conjunto completo de fragmentos de sequenciação efectuam-se quatro reacçoes em paralelo, contendo cada uma os quatro TFdN’s em conjunto com um terminante de trifosfato de didesoxirribonucleosido simples (TFddN), sendo um para cada base (adiciona-se TFdN marcado com P para proporcionar fragmentos marcados). Se se incorpora TFdM com a po. limerase a extensão da cadeia pode continuar. Se se escolhe o correspondente TFddN termina a cadeia. Ajusta-se a proporção entre TFddN e TFdN’s para gerar fragmentos de ADN de compri-

mentos apropriados. Deste modo, cada uma das quatro misturas reaccionais conterá uma distribuição de fragmentos com o mes. mo radical de didesoxinucleosido no terminal 3’ e ura terminal 5' definido pelo sistema escorvador.

Em ambos os processos, a informação da sequência de base que geralmente nao se pode determinar por métodos físicos, converte-se em informação sobre o comprimento da cadeia que se pode determinar. Esta determinação pode efectuar-se atra^ ves da separaçao electroforética. Em condiçoes extraordinárias (temperatura elevada, presença de ureia, etc.) os pequenos fra^ mentos de ADN migram como bastonetes rígidos. Se se utilizar

uma matriz de gel para a electroforese, os fragmentos de ADN, sao separados de acordo com a sua dimensão. A resolução de base simples necessária para a sequenciaçao pode obter-se normalmente a partir de fragmentos de ADN que contenham ate diversas centenas de bases.

Para se determinar uma sequência completa, submetem-se os quatro conjuntos de fragmentos produzidos de acordo com a metodologia de Maxam-Gilbert ou de Sanger, a uma electroforese em quatro quelhas paralelas. Isto origina a resolução espacial dos fragmentos ao longo do comprimento do gel. 0 modelo de fragmentos marcados transfere-se tipicamente para una película por auto-radiografia (isto é, produz-se una fotografia intercalando o gel e a película durante um certo periodo de tempo). A película revelada apresenta uma continuidade de bandas distribuídas entre as quatro quelhas, referida frequen. temente como uma escada de sequenciaçao. A escada interpreta-se observando visualmente a película (começando com os frag mentos pequenos de movimento mais rápido) e determinando a quje lha em que ocorre a banda seguinte para cada degrau da escada. Uma vez que cada quelha está associada com uma dada base (ou combinação de bases no caso do processo Maxam-Gilbert) , a progressão linear das funções das quelhas traduz-se, directamente, na sequência base.

Os processos de Sanger e Maxam-Gilbert para a sequenciaçao de ADN sao conceptualmente elegantes e eficazes mas sao operacionalmente difíceis e prolongados no tempo. A análise destas técnicas mostra que muitos destes problemas têm origem na utilização de um único radioisótopo informador.

Λ utilização de radioisótopos de curto período de vida, tal como o P, com actividade específica elevada e problemática quer sob o ponto de vista logístico quer sob o ponto de vista da saúde e da segurança. 0 semi-período de vida curta do

P, implica que as condiçoes essenciais do reagente sejam antecipadas diversos dias e que o reagente seja utilizado im_e diatamente. Una vez gerados, os fragmentos de sequenciação de ADN marcados, sao propensos à auto-destruiçao, devendo submeter-se imediatamente à análise electroforética. As grandes quantidades de gel de electroforese necessárias para conseguir uma separaçao de base simples originara grandes volumes de tamtao contaminado que devem ser eliminados correctamente. A auto-radiografia necessária para visualizar posteriormente os fragmentos de ADN marcados colocados no gel é ura processo lento ( sao frequentes as fotografias nocturnas ) e vem adicionar um tempo considerável à operaçao global. Finalraente, existem possíveis riscos de saude associados a utilização de tais radioisótopos potentes.

A utilização de apenas ura único informador para analisar a posição de quatro bases implica uma considerável complexidade operacional a todo o processo. Os passos químicos/ /enzimáticos devem processar-se era recipientes separados e a análise electroforética deve efectuar-se era quatro quelhas paralelas. As distorções de mobilidade induzidas terraicamente, originam imagens enviesadas dos fragmentos de ADN marcados (por exemplo, o efeito de aspecto favorável) as quais, por sua vez originam dificuldades de comparaçao das quatro quelhas. Estas distorções limitam frequentemente o número de bases que se podem interpretar num único gel.

Os tempos prolongados necessários para a obtenção de imagem auto-radiográfica associados a necessidade de se uti_ lizarem quatro quelhas paralelas obriga a um modo de visualização instantâneo. Uma vez que é necessária a resolução espacial simultânea de ura grande número de bandas torna-se forço, sa a utilização de grandes quantidades de gel que têm normalmente 40 cm ou mais de comprimento. Isto implica problemas adi. cionais: as grandes quantidades de gel sao difíceis de manusear e o processamento é lento adicionando mais tempo ao processo global.

Finalmente, existe um problema de interpretação ma. nual. A conversão de uma escada de sequenciaçao numa sequência de base é um processo propenso a erros e moroso, que exige a total atençao de um cientista altamente especializado. Têm sido feitas nuierosas tentativas para automatizar a interpretação

e na realidade existem diversos auxiliares mecânicos, mas o processo para interpretar uma sequência em gel e ainda meticuloso e lento.

Para contornar estes problemas pode pensar-se na

2 substituição da auto-radiografia com P, com algum sistema de detecção alternativo de um informador nao radioisotópico. Um tal sistema de detecção deverá sei' excepcionalmente sensível

- - 32 para alcançar uma sensibilidade comparável a do P; cada ban.

ó da no gel de sequenciaçao contem na ordem de 10 mole de ADN. Um dos métodos de detecção que é susceptível de alcançar este nivel de sensibilidade baseia-se na fluorescência. Os fragmentos de ADN podem ser marcados coe um ou vários corantes fluo7 rescentes. A excitaçao com uma fonte de luz apropriada originará uma emissão caracteristica do corante identificando desse modo a banda.

A utilização de um corante fluorescente, por oposição à marcaçao radioisótopica, permitirá a compreensão fácil do sistema de detecçao para esta aplicaçao particular. Por exejg pio, a utilização de quatro corantes fluorescentes diferentes distinguíveis com base em alguma caracteristica de emissão (por exemplo, o espectro, o período de vida, a polarizaçao) per_ mitirá ligar simplesmente uma dada etiqueta com os fragmentos de sequenciação associados com uma dada base. Com esta ligaçao estabelecida, os fragmentos poderão combinar-se e resolver-se numa unica quelha e a identificação da base poderá fazer-se directamente tendo em consideração a caracteristica de emissão escolhida.

i\ natureza de tempo real” da detecçao por fluores. cência permitirá uma observação rápida de um gel que contenha bandas resolvidas espacialmente (resolução no espaço) ou o po* *** * sicionamento num ponto unico do gel e detecçao das bandas a ine dida que elas vao passando sequencialmente através da zona de detecçao (resolução no tempo). Nao serão necessárias grandes preparações de gel. Além disso, um modo de detecçao de quelha única em tempo real será bastante sensível para transferên cia de dados e identificação de base completamente automatiza, dos.

Estão descritas diversas tentativas para desenvo.1 ver um sistema de sequenciação de ADN baseado na fluorescência.

Um sistema desenvolvido por um grupo do Califórnia Institute η

ο of Technology foi descrito por L. M. Smith, West German Pat. Appl. 3446635 Al (1984); L. E. Hood e outros, Vest German Pat. Appl. #DE 3501306 Al (1985); e L. M. Smith e outros, Nucleic Acids Research, 13 2399-2412 (1985). Conceptualmente es_ te sistema supera os problemas descritos na secção anterior, mas parece que os pormenores específicos da implementação tornam esta abordagem apenas parcialmente bem sucedida.

sistema Cal Tech utiliza quatro conjuntos de fragmentos de sequenciação de ADN, estando cada un marcado com um de quatro corantes fluorescentes. Descrevem-se dois conjuntos representativos dos corantes fluorescentes. Cada conjunto é constituído por corantes de, pelo menos, duas classes estru turais diferentes.

Os máximos de emissão estão espalhados por um gran-

de intervalo ·_ aproximadamente 100 nm) para facilitar a descriminaçao entre os quatro, mas infelizmente os máximos de absorção (excitaçao) também estão comparavelmente afastados. Isto torna muito difícil a excitaçao eficaz dos quatro corantes com uma única fonte monocromática e a detecção adequada das emissões resultantes.

Em contrapartida, a utilização de corantes com picos de absorçao muito próximos (e picos de emissão correspondeu, tes), para facilitar a eficiência de excitaçao, provoca outras dificuldades. Um sistema de detecção para a sequenciação ADI’ deve ser capaz de distinguir entre quatro espectros diferentes de emissão dos corantes no sentido de identificar individualmente os fragmentos marcados.Estas emissões sao nornalmente de intensidade muito baixa. Por conseguinte, o sistema de detecção

deve possuir un elevado grau de sensibilidade (melhor do que —16 mole de ADN por banda) e de selectividade, em conjunto cor.i meios para minimizar a luz desviada e o ruído de fundo no sentido de se conseguirem as desejáveis características de ren. dimento. 0 sistema também deve ser capaz de controlar frequente^ mente a área de detecção no sentido de evitar a perda de quaisquer fragmentos que migrem através do gel sem passar a janela de detecção. Um tal sistema de detecção deverá ser relativameii te barato para permitir múltiplos dispositivos de detecção num único instrumento sem afectar prejudicialmente o preço. Conhecem-se muitos dispositivos de detecção que utilizam a fluorescência no esquema de detecção. Um desses dispositivos está descrito em Quantitativo Fluorescence Analysis of Different Confor. mational Forms of DNA Bound to the Dye....and Separated by Eleç trophoresis by llaimski et al., Anal. Biochem. , 106,471-475 , 1980. Neste sistema de detecção por electroforese enche-se um tubo de vidro com gel de agarose para se separarem, os fragmentos de ADN relativamente grandes. Seguidamente utiliza-se un equipamento monocromático de observação como sistema de detecçao para a definição de cada ur.i dos fragmentos grandes. Sabe-se que os equipamentos monocromáticos de observação podem medir com precisão uma vasta gama de características espectrais; con tudo, perde-se muita luz devido à limitada capacidade do equipa mento monocromático e do seu sistema optico associado, para re. colher e dispersar a luz emitida. Estas técnicas de detecção limitam a fraeçao de luz que pode ser detectada e medida. Em consequência fica limitada a sua sensibilidade para aplicações de luz fraca. Além disso, a luz recolhida sequencialmente e nor

f * malmente ineficiente.

aparelho de detecçao descrito por Smith e outros (ver referências anteriores) utiliza uma série de filtros de interferência de banda estreita no sentido de seleccionar os comprimentos de onda que incidem sobre os fotodetectores simples ou múltiplos. Este tipo de sistema tem a vantagem de ser bastante simples e barato; contudo, apresenta deficiências substanciais. 0 sistema especifico descrito utiliza um fotómetro de filtro que pode utilizar múltiplos filtros permutáveis cor. un fotodetector ou múltiplos filtros estacionários com os detecç tores correspondentes. 0 primeiro destes dispositivos, um filtro rotativo com um detector único (ver Fig. 3 de Smith e outros), apresenta a desvantagem de limitar o período de tempo durante o qual se pode medir cada uma das regiões filtradas. 0 tempo para o detector deve ser partilhado coe os diversos filtros no sentido de distinguir entre os diferentes espectros de

emissão. 0	sistema de Smith e outros tem dificuldades opticas
adicionais	que nao referiremos aqui.
•	Surgem ainda problemas mais sérios com a utilização

de corantes que possuem diferentes cargas livres. 0 gel de sequenciaçao convencional descrito no estudo de Smith e outros ^!:Nucleic Acids Research” ilustra as quelhas-T produzidas pelos sistemas escorvadores marcados com cada um dos quatro corantes. É evidente que existem perturbações diferenciais significativas nas mobilidades electroforéticas. Um conjunto completo de fra£ mentos de sequenciaçao que suporte os quatro corantes apresenta «* — ra, quando combinado, considerável sobreposição e talvez mesmo desordem quando submetido a electroforese numa quelha simples.

Este efeito, combinado com o já referido grande intervalo de variaçao dinâmica na intensidade do sinal, torna dificil conseguir uma sequenciação de quelha simples, com este conjunto de corantes.

Finalmente, a metodologia utilizada para preparar ~ A os fragmentos de sequenciação marcados pela fluorescência cria condiçoes de sequenciação difíceis. Para a sequenciação de Maxam-Gilbert, os oligonucleótidos marcados na posição 5' estão ligados a fragmentos de ADN de cadeia dupla, de terminação aderente, produzidos por clivagem de restrição. Isto limita a sequenciação de fragmentos produzidos deste modo. Para a sequen. ciaçao de Sanger, utilizam-se como sistemas escorvadores olig£ nucleótidos marcados na posição 5'. Sao necessários quatro sis. temas escorvadores especiais. Para utilizar o novo sistema de vectores é necessário passar pelo processo complexo de sinteti. zaçao e de purificação de quatro novos sistemas escorvadores marcados com corante.

Uma segunda abordagem à automaçao da sequenciação de ADN nao marcado radioactivamente foi descrita por Ansorge. W., e outros, J. Biochem. Biophys. Methods, 13; 1986; p. 315-323:, na qual uma marca fluorescente simples se liga covalentemente ao terminal 5' de um sistema escorvador oligonucleotico de base 17. Faz-se reagir o sistema escorvador em quatro recipientes com o processo quimico de sequenciação do dideoxinucleótido normalizado que se modificou para omitir o nucleotido identifi.

cado radioactivamente, para produzir conjuntos de fragmentos de

ADN, de comprimento variável copiados enzimaticamente. Cada um dos quatro recipientes continha um terminante de cadeia de dide.

oxinucleótido correspondente a uma das quatro bases do ADN que permitiram a identificação de base terminal por separaçao electroforética convencional em quatro quelhas de gel. Cada fragmento transportou uma marca fluorescente de 5'-tetrametilrodamina que foi excitada por uni laser de ioes de argon passajn do através de toda a largura do gel. As emissões fluorescentes das bandas de ADN resolvidas passado algum tempo, captaram-se a partir das quatro quelhas com meios estacionarios separados para cada quelha, constituídos por um sistema óptico de imagem, aberturas de campo, guias de luz, agrupamentos de filtros e fotoraultiplicadores em serie.

Uma vantagem reivindicada para esta abordagem e a necessidade de menos partes em movimento no aparelho devido aos detectores estacionários que permitem o controlo contínuo das quelhas de gel. Este método de controlo, embora seja mais complexo do que o utilizado com uma quelha, oferece a vantagem de determinar a presença de uma banda marcada para identi. ficaçao da base em relaçao à ausência de bandas nas três quelhas restantes, melhorando a confiança na identificação. De facto, a utilização de uma única marca exige a utilização de quatro quelhas para identificação da base e o sistema tal como foi apresentado nao e susceptivel de uma maior simplificação para melhorar a capacidade ou sensibilidade do instrumento. 0 sistema também está limitado na precisão potencial pela necessidade de uma exacta disposição relativa das quelhas para uma unica análise de sequência.

As complexidades operacionais, tais como os gradientes térmicos e as impurezas do gel, podem falsear esta exactidao posicionai originando distorsoes locais do gel, as quais afectam as mobilidades da banda, o que, por sua vez, compromete as identificações da sequência de base.

A utilização de sistemas escorvadores marcados por Ansorge e outros e Smith e outros, também é inferior noutros aspectos. Continua a ser necessário efectuar as reacçoes de polimerização em recipientes separados. Todos os fragmentos de ADN têm de ser marcados quer sejam fragmentos de terminação genuína ou fragmentos estranhos. Isto é semelhante ao sistema existente em que efectivamente sao marcados todos os fragmentos que contêm nucleótidos de adenosina incorporados. Deste eo do, o modelo de sequenciação resultante manterá a maior parte dos produtos artificiais (por exemplo bandas falsas ou fantasmas, acumulações) encontrados nos métodos correntes.

Finalmente, Brumbaugh, J. A. e outros, no pedido de Patente Europeia n-. 85103155-9, publicada em 9 de Outubro de 1985, descreve um sistema e um processo para a marcaçao pojs

terior de cadeias de ADN que contêm, eventualmente nucleosidos previamente marcados. A marcaçao prévia pode ser conseguida por ligaçao covalente de biotina a um desejado nucleótido de terminação de cadeia, antes de o nucleótido ser utilizado numa modificação do método do Sanger de terminação de cadeia de ADN. Contudo, o nucleótido marcado previamente nao é detectável no sistema descrito. As cadeias de ADN marcadas previamente e preparadas em recipientes separados correspondentes as bases de ADN A,T,C, e G separaram-se por electroforese e depois expuseram-se a material de ligaçao complementar, normalmente a avidina, a qual possuía um fluoroforo tal como a fluorescelna covalentemente a ela ligada. 0 fluoroforo foi detectado e a pre sença do sinal foi relacionada com o recipiente particular ou gel/quelha correspondente a A, T, C, ou G originalmente preparados. Este processo de marcaçao a posteriori exige a preparaçao e subsequente separaçao electroforetica de cadeias de ADN marcadas em vasos e geles/quelhas separados, respectivamente. Nao existe nenhuma descrição de qualquer processo ou sistema susceptível de marcar diferencialmente cadeias de ADN no mesmo recipiente simultaneamente durante as reacções de um processo de terminação de cadeia, ou de diferenciar as marcas durante uma detecção de cadeia num único gel/quelha de um sistema de detecçao adequado.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção pretende superar muitas das desvantagens da técnica anterior. Ela engloba um sistema de se quenciaçao de ADN que possui muitas das caracteristicas de qua.

lidade desejadas sem apresentar grande parte das deficiências anteriormente apontadas. A presente invenção consiste num sistema para detectar a presença de energia radiante de diferentes espécies, normalmente de ADN marcado com um informador, a seguir a separaçao no tempo e/ou no espaço, e a identificação das espécies. 0 sistema engloba meios que reagem aos espectros das espécies para gerar um primeiro sinal que varia em amplitude, num primeiro sentido, em função da natureza das espécies,meios que reagem aos espectros das especies para gerar ur.i segundo sj_ nal que varia em amplitude, num segundo sentido diferente do primeiro em função da natureza das espécies, e meios que reagem

aos primeiro e segundo sinais para se obter um terceiro sinal correspondente a relaçao entre as funções do primeiro e do se^ gundo sinais, sendo a amplitude do terceiro sinal indicativa da identidade das espécies.

Os meios para gerar o primeiro e o segundo sinais podem incluir um filtro dicroico, com uma característica de transmissao/reflexao que varia em função do comprimento de on da, meios para orientar as emissões para o filtro, primeiro e segundo detectores posicionados, respectivamente, para receber as emissões transmitida e reflectida e para gerar o primeiro e o segundo sinais correspondentes as intensidades de cada uma. De preferência, o filtro dicroico possui uma característica de transiçao relativamente rápida da transmissão para a reflexão, a qual ocorre próximo do centro do espectro de emissão das espécies. Com o ponto de transiçao localizado proximo do centro, a variaçao de amplitude do terceiro sinal distribui-se mais uni formemente na gama dos espectros.

Normalmente, as espécies que se pretendem analisar sao fragmentos de ADN ou outras moléculas covalentemente marcadas com materiais fluorescentes que possuem espectros muito pouco separados. Estas moléculas estão normalmente contidas no gel da electroforese adaptado para as separar por dimensão, car ga, ou segundo outras propriedades físicas. 0 sistema engloba um laser ou outra fonte de energia radiante com um sinal de sa£ da compreendido na região de excitaçao do material fluorescente.

A porção emissora das espécies marcadas que se pre.

tende detectar, por exemplo um fragmento de ADN, pode ter a es.

trutura seguinte:

Β na qual n pode ser 2 ou 3 e Rj e R? representam um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo al. quilo inferior, alcoxi inferior ou ciano.

Também se descreve um processo para a detecçao da presença de energia radiante emitida por espécies diferentes, a seguir a separaçao no tempo e/ou no espaço, e determinação da identidade de cada uma de tais espécies emissoras, caracterizado pelos passos de obtenção das funções da energia end tida, a qual varia em sentidos diferentes, segundo os comprimentos de onda dos espectros pouco separados, e depois faz-se a divisão de tais funções sendo o cociente um indice indicatjí vo da identidade das especies. A função da energia emitida po. de obter-se fazendo passar a energia radiante através de um filtro dicroico com uma característica de transmissao/reflexao que varia em função do comprimento de onda.

Descreve-se um processo para a análise da sequência de ADN de acordo com uma modificação do método de Sanger de terminação de cadeia em que o terminante de cadeia suporta um informador. De préferência, o terminante de cadeia suporta um informador corado, preferencialmente um informador fluore_s cente. 0 terminante de cadeia pode ter qualquer uma das estrii turas seguintes

na qual (a) X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo θ

Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo ⁰¹¹ θΗ, ou (b) X e Y representam um grupo OH ou

B

na qual A pode representar um informador fluorescente que possua a estrutura:

t

na qual n representa 2 ou 3, e 1’^ e representam um átomo de hidrogénio ou de halogeneo ou um grupo alquilo inferior, alcoxi inferior, ou ciano, B representa uma base heterocíclica tal como uracilo, citosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-guanina, ou 7-deaza-hipoxantina em que as pirimidinas estão ligadas à parte açúcar através da posição e as de. azapurinas estão ligadas à parte açúcar através da posição N_o (numeraçao purina) e a linha ponteada representa, um ligante e eventualmente um espaçador (grupo de átomos) que unem a parte fluoresceii te (A), de preferência através de uraa ligacao ami. da, e a base heterocíclica (B) com a condição de, no caso de B representar uma pirimidina, o ligante está associado a posição 5 dessa pirimidina e se 3 representar uma deazapurina, o ligante está associado à posição 7 (numeraçao da purina) dessa deazapurina .

De acordo com outro aspecto da presente invenção proporciona-se um processo de análise de sequência de ADN, de acordo com o método de Sanger de terminação de cadeia, Eiodifi. cado pela presente invenção, em que cada um dos quatro terminantes de cadeia correspondentes as quatro bases suporta um identificador diferente que se pode distinguir. Deste modo, as quatro reacções de terminação de cadeia podem efectuar-se em recipientes separados e combinar-se antes da análise electroforética ou efectuar-se num único recipiente.

Os fragmentos de sequenciaçao de ADN combinados produzidos deste modo, podem submeter-se a separaçao electro.

forética simultânea numa única quelha. A excitaçao dos fragmentos que suportam os seus respectivos informadores, por uma única fonte de energia, origina a sua emissão característica, permitindo por isso a sua detecçao e identificação.

Escolhe-se o conjunto de quatro informadores de modo que todos sejam excitados eficazmente por uma fonte unica e possuam espectros de emissão que sejam semelhantes mas que sq possam distinguir. As perturbações diferenciais na mobilidade electroforética dos fragmentos de. ADN ligados sao pequenas. Este requisito pode satisfazer-se facilmente se os quatro informadores possuírem pesos moleculares, formas e cargas semelhantes.

Estes critérios podem conseguir-se com informadores que possuam partes fluorescentes com a estrutura:

na qual n é igual a 2 ou 3 e Π-, e representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogénCo ou um grupo alquilo inferior, alcoxi inferior, ou ciano. Tais informadores podem ser introduzidos através de intermediários protegidos e activados de estrutura:

na qual n é igual a 2 ou 3, R^ e R_? representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo inferior, alcóxi inferior, e alcóxi. R’’ representa um grupo alquilo, R’ representa um grupo alquilo ou arilo, e X representa um grupo facilmente eliminavel.

sistema e o processo da presente invenção tem a capacidade de distinguir, em tempo real, as diferenças de com primento de onda, relativamente pequenas, nos espectros de em is. sao, ao mesmo tempo que mantêm um grau de sensibilidade relativamente elevado. 0 sistema fornece aos detectores fotométricos uma porção elevada de luz utilizável. Finalmente, o sistema de detecçao proporciona um controlo continuo do gel que contem as espécies fluorescentes. Este aspecto reduz a possibilidade de originar dados incompletos que estão normalmente inerentes aos sistemas de detecçao de tipo intermitente. Todos os aspectos atrás referidos estão incluídos neste sistema único, por um preço relativamente baixo.

DREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção pode compreender-se melhor com a descrição pormenorizada seguinte em assoeiaçao com os gráficos e desenhos anexos que fazem parte desta memória descritiva, nos quais:

A Figura 1 é um diagrama de blocos parcial de ura sistema construído de acordo com a presente invenção, para a detecção da presença de energia radiante proveniente de fontes diferentes em que cada uma emite energia com comprimentos de onda diferentes mas muito proximos;

A Figura 2 é uma representação gráfica de um único gel de electroforese susceptível de ser utilizado no sistema da Figura 1;

A Figura 3 apresenta a afinidade da radiaçao de emissão do corante e das características de transmissão/reflexão do filtro dicroico utilizado no sistema da Figura 1;

A Figura 4 é um fluxograma dos diferentes passos de tratamento de dados utilizados para calcular o valor dos picos de emissão detectados;

A Figura 5 apresenta os sinais típicos do detector obtidos era função do tempo para as bases marcadas T, G, A e C:

A Figura 6 é um diagrama de blocos de um terminante de cadeia marcado por fluorescência; e

A Figura 7 apresenta a afinidade da radiaçao de emissão do corante e das bandas passantes dos dois filtros uti_ lizados para substituir o filtro dicroico.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Pode detectar-se a radiaçao de bandas de emissão muito próximas utilizando o sistema da presente invenção. E_s tas emissões muito próximas sao produzidas por espécies de informadores pre-seleccionados que estão irreversivelmente ligadas aos materiais que se pretendem analisar no sistema. Os informadores aceitáveis sao geralmente uma ou várias espécies escolhidas pela sua capacidade de emitir radiaçao num intervalo estreito de comprimentos de onda, normalmente num intervalo compreendido entre 50 e 100 nm, de preferência num intervalo entre 20 e 50 nm. De preferência, os máximos dos pi. cos devem estar afastados mais do que 2 nm.

Uma espécie de informador pode emitir energia em

mais do que um intervalo de comprimentos de onda, dependendo do modo de ligaçao aos materiais de interesse e das condiçoes de análise no sistema. Contudo, os informadores individuais com caracteristicas de emissão única no sistema escolhem-se por serem mais apropriados para emitir radiaçao no intervalo de comprimentos de onda que se pretende detectar. Seguidamente descrevem-se as espécies de informadores preferenciais.

Embora o sistema da presente invenção tenha ampla aplicabilidade, descrever-se-a apenas a aplicaçao particular da sequenciaçao de ADN.

Nesta forma preferencial da presente invenção, os fragmentos de sequenciaçao de ADN marcados com informador, pro_ duzem-se num único recipiente. 0 conteúdo desse recipiente, cadeias de ADN de comprimentos variáveis marcadas com informador, passam por um aparelho de electroforese para separaçao.

Para conseguir este objectivo, conforme se ilustra na figura 2, pode efectuar-se a electroforese com uma disposição adequada da placa 10 para electroforese, a qual possui uma espessu. ra entre 0,2 mm e 0,4 mm e entre 25 a 40 cm de comprimento. Quando apropriado podem utilizar-se outras dimensões. Esta pia. ca 10 possui um gel 11 adequado, normalmente 6 a 8a de poliacri. lamida intercalado entre suportes 12 de vidro ou de plástico. As placas (geles) preparam-se por um processo convencional.

Normalmente coloca-se a placa 10 num suporte em po. sição vertical com a extremidade superior da placa 10 prolongan. do-se para o interior de um recipiente 16 superior que contém uma solução tampao 24, prolongando-se a parte inferior para ura segundo recipiente 14 que também contém uma solução tampao 18. A solução tampao é qualquer tampao adequado: normalmente pode utilizar-se tris-borato-EDTA 0,1 í-l com pH 8,3. Deste modo, o tampao contacta o gel em ambas as extremidades da placa no sen tido de proporcionar o contacto eléctrico. Com esta disposição, podem colocar-se uma amostra de fragmentos de ADN marcados com informador com uma pipeta numa cavidade (nao apresentada) que se cria na parte superior do gel. Depois completa-se um circui. to eléctrico através dos terminais 20 nos recipientes 14 e 16. Ê necessário um potencial adequado para se obter a separaçao para os geles com esta espessura e comprimento particulares. 0 eléctrodo positivo fica localizado no extremo inferior da placa para provocar a migraçao descendente dos fragmentos de

ADN. Nestas condiçoes, uma vez que os fragmentos migram através do gel, separara-se espacialmente em bandas. A zona de dete£ çao localiza-se próximo da parte inferior da placa. Nesta zona,

irradiam-se os fragmentos com um feixe de laser 31 e ocorre a excitaçao/emissao, a medida que os fragmentos se movem através da zona.

Na Figura 1 apresenta-se uma disposição óptica para a irradiaçao da placa 10 de electroforese. 0 sistema da Fi gura 1 pode utilizar-se com qualquer sistema fluorescente ou de outro tipo informador para distinguir entre a medida de intensidade de bandas de radiaçao de emissão muito próximas. Contudo, conforme atras referido, no aspecto preferencial desta Patente para detectar as emissões de fragmentos de ADN marcados com informador, far-se-á a descrição das espécies informa^ doras que sao compostos fluorescentes. Isso inclui lagar 30 que se selecciona para proporcionar um comprimento de onda específico determinado em função dos comprimentos de onda de excitaçao das espécies informadoras excitáveis preferenciais utilizadas. Por exemplo, a fonte específica utilizada para os informadores fluorescentes aqui descritos é um laser de ioes de argon com um comprimento de onda de 488 nm e com ura diâmetro de 0,8 mm para o feixe de luz operado entre 25 e 40 mU aproximadamente. 0 feixe do laser passa através de uni filtro de excitaçao 32 e das lentes de focagem 33 que concentram o feixe num diâmetro de aproximadamente 0,2 mm na zona de detec çao da placa de electroforese 10.

filtro 32 selecciona-se de modo a evitar a passa, gem dos comprimentos de onda de excitaçao indesejáveis que poderiam eventualmente interferir com o processo de detecçao. Se a luz do laser fôr muito pura, pode omitir-se este filtro. 0 feixe de luz que atinge a placa excita o material marcado com informador, no caso corrente fragmentos de ADN marcados por fluorescência, à medida que migram através da zona de detecção provocando-lhes fluorescência em comprimentos de onda desviados do comprimento de onda de excitaçao. Embora os comprimentos de onda das emissões de pico caracteristicos dos corantes particulares adiante descritos, quando em solução livre, sejam 505, 512, 519 e 526 nm, deve notar-se que o sistema de detecção é capaz de descriminar comprimentos de onda associados com outrojs conjuntos de informadores com bandas de emissão muito próximas. Além disso, apesar de ser preferível uma fonte de laser, una vez que permite que apenas o mínimo de luz parasita colida cora a amostra, com um sistema óptico e filtraçao adequados, podem utilizar-se outras fontes de luz nao coerente tais como a lâm pada de arco de xenon.

A luz emitida pelas espécies fluorescentes capta-se com lentes de colimaçao 34 adequadaraente colocadas, as quais produzem um feixe de luz colimada para transmissão a um filtro dicroico 38 através de um filtro de emissão 36 para eliminar fundamentaliiiente toda a luz excepto a dos comprimentos de onda específicos caracteristicos da fluorescência. Utilizando este filtro, fica substancialmente filtrada toda a luz abaixo de 500 nm e acima de 560 nm, sendo transmitida a luz entre estes limites com uma eficiência superior a 50%.

De acordo com a presente invenção, o filtro de interferência dicroico 38 permite a este sistema distinguir entre espectros de emissão muito próximos. Este filtro orientase normalmente a 45° relativaraente ao feixe incidente. A luz que colide com este filtro ou será reflectida ou transmitida através do filtro. Para os máximos de emissão dos informadores fluorescentes, quando ligados aos fragmentos de ADN adiante descritos, noneadamente de 515, 524, 530 e 536 nm, escolhe-se o filtro 38 de modo a que possuam uma característica. de reflexao/transmissao apresentada na Figura 3. Pretende-se que o filtro dicroico 38 possua uma transiçao abrupta de trans. missao/reflexao 39 que esteja aproximadamente no centro das bandas de fluorescência que sao características destes quatro informadores. Ã medida que o espectro de fluorescência se desloca dos comprimentos de onda inferiores para os superiores, a proporção de luz transmitida em relaçao à reflectida diminui de modo contínuo. Uma vez que este filtro particular se esco

lheu para adaptar os informadores seleccionados para esta patente, um conjunto diferente de informadores necessitara de características de filtraçao diferentes.

A luz (reflectida ou transmitida) do filtro dicro£ co 33 passa através das respectivas lentes de focagem 40 para os respectivos detectores 42. De preferência, os detectores 42 sao tubos fotomultiplicadores. Sao conhecidos por possuírem um elevado grau de sensibilidade nas bandas espectrais com iji teresse. Em alternativa podem utilizar-se fotodíodos de silício ou outros detectores semelhantes. No caso vertente em que os detectores 42 estão colocados a uma distância pré-determinada próxima da zona de incidência, pode omitir-se a lente 34 de C£ limaçao. Quando se omite esta lente, pode definir-se a zona de incidência pela abertura que corresponde à area sensora deseja, da do detector 42, ou pode definir-se uma abertura por meios alternativos tais como uma fibra óptica de superfície facetada.

De modo semelhante, podem omitir-se as lentes de focagem se a área sensora do detector fôr suficientemente grande para captar directamente a luz disponível.

Ê evidente que a função do filtro dicroico 38 pode, preferencialmente, ser desempenhada por dois filtros separados de aberturas apropriadas colocados no percurso da luz emitida pela fonte para os detectores 42, em que cada filtro possui, em termos de transmissão, duas características de trans missão diferentes, isto é, qualquer uma das caracteristicas de reflexão ou de transmissão do filtro dicroico. Deste modo, os dois detectores 42 sao também dedicados às caracteristicas de transmissão e reflexão proporcionadas pelo filtro dicroico da descrição anterior, As bandas passantes destes dois filtros veân-se mais claramente na Figura 7 e identificam-se por filtro 1 e filtro 2. Verifica-se que as bandas passantes destes dois filtros se sobrepõem aproximadamente no centro das bandas de fluorescência caracteristicas dos quatro terminantes marcados com informador aqui utilizados a 515, 524, 530 e 536 nm.

Descreve-se um sistema deste tipo utilizando dois filtros no pedido de patente pendente de íbbertson e outros cujo teor se incorpora aqui como referência. Conforme descrito por Robert_ son e outros, coloca-se um par de módulos por cima e por baixo de um plano no qual o feixe de luz de excitaçao do informador faz o varrimento de diversas quelhas de um gel de electrofore se. Cada canal possui fragmentos de ADN marcados com informador. Cada módulo de detecçao é constituído por um tubo fotomuA tiplicador que possui uma area de entrada larga e um filtro selectivo de comprimento de onda separado colocado entre os seus PMT e as espécies fluorescentes no- gel.Estes filtros são filtros de interferência que possuem uma caracterlstica de banda de trans.

missão complementar que estimula a acçao do filtro dicroico.

Os filtros permitem que os PMT gerem sinais que variam em. amplitude em sentidos diferentes em função da natureza das espé cies. Um dos filtros deixa passar facilmente os comprimentos de onda inferiores da emissão e rejeita os comprimentos de onda superiores da emissão, enquanto o outro filtro faz precisamente o contrário. Podem utilizar-se filtros de transmissão com cada filtro de interferência para rejeitar a luz que incida segundo ângulos em relaçao ao eixo superiores a um ângulo pre-determinado. Grosso modo, os filtros de onda possuem características de transmissao/comprimento de onda complementares na região de emissão dos quatro corantes, observando-se os comprimentos de onda de transiçao proximo do centro dos espectros de energia radiante das espécies.

Os sinais eléctricos dos detectores 42 passam depois pelos respectivos pré-amplificadores 46 para os converso res analógico-digitais (A/D) 48 e dai para o sistema controlador 52. As funções do sistema controlador 52 podem ser de sempenhadas por um pequeno computador tal como um IBM PC. Uma das funções do sistema controlador 52, que se descreve com o fluxograma da Fig. 4, consiste em calcular o cociente das duas funções do sinal. 0 filtro dicroico 38 modula a intensidade dos sinais em cada uma das diferentes bandas de acordo com o comprimento de onda, isto é, para o detector de luz reflectida as emissões de comprimento de onda mais curto possuirão um valor inferior para a amplitude do sinal e as emissões de comprimento de onda superior possuirão uma amplitude superior. Deste modo, a medida que uma espécie de informador partX cular, isto é, um fragmento de ADN marcado por fluorescência, no aspecto preferencial da presente invenção, passa através da zona de detecçao permitindo a separaçao no espaço no gel 10, as suas emissões variaram em amplitude era função dos seus comprimentos de onda e também do tempo (devido ao movimento através do gel 10). Os sinais de luz de amplitude modulada convertem-se em sinais electricos e digitalizam-se para o pro^ cessamento conforme descrito. Após a conversão, calcula-se o cociente entre os sinais digitais da luz fluorescente reflectida e transmitida. Estes sinais digitais sao os que represen tam um pico no sinal de luz correspondente a um conjunto de fragmentos de ADN. Calcula-se o cociente entre os sinais correspondentes quer a altura do pico quer à área do pico. A amplitude do cociente entre os sinais e um indicador da identidade das espécies. A função W define-se como a relaçao entre

a intensidade do pico num detector e a intensidade do pico nou tro detector, por exemplo, a intensidade do pico no detectoi' de luz transmitida dividida pala intensidade do pico no dete.ç tor de luz reflectida. A amplitude da razao entre os sinais pa.

ra cada informador tende a distribuir-se em grupos ou aglome. rados que sao simplesmente indicadores de cada informador con forme se pode observar no Exemplo 10 ilustrativo que se segue.

Este procedimento de modulaçao de amplitude e de cálculo do cociente, quer se efectue com um filtro dicroico ou com filtros separados para gerarem dois sinais em que cada um varia em sentido diferente em resposta aos mesmos espectros das mesmas espécies ensaiadas, pode-se descrever matematicamente. Deste modo, o sinal eléctrico total (correspondente ao sinal de luz detectado) presente durante uma em.issao de pico de um informador, é constituído pelos componentes devido a luz desviada e dispersa, e também do sinal devido a própria fluorescência de cada um dos diferentes informadores. Durante a electroforese o sinal de fluorescência do informador pode distinguir-se de outros componentes de fundo porque os sinais de fluorescência variam no tempo e no espaço de um modo previ_ sível. Isto em contraste com o sinal de ruído de fundo que con tribui com um sinal relativamente constante, particularmente quando nao existe movimento relativo entre o detector e o gel. Numa configuração estacionária do detector e do gel, os sinaisde fluorescência variam no tempo devido ao movimento do informa-

dor através do gel. Em alternativa, o gel pode permanecer estacionário depois da electroforese, e o sistema de detecção pode mover-se relativamente ao gel ou vice-versa. Ainda noutra alternativa, o sistema de detecção pode mover-se enquanto ocor re a migraçao no gel.

Pode ver-se na Figura 5 uma representação do modo como os dois sinais de saida dos detectores variam er.i função do tempo. Cada par de picos na figura corresponde a ura conjunto diferente de fragmentos de ADN, o qual corresponde a sequência de bases que ocorrem na porção de ADN ensaiada. As porçoes en tre cada par de picos ficam limitadas a quatro grupos correspondendo cada um a uma base de ADN particular. Sao estes grupos de proporçoes que identificam a base particular T, C, A, ou G.

No sentido de melhorar a selectividade entre os informadores (determinada pelos valores de W)» deve optimizar-se a variaçao de W em todas as combinações das diversas emissões do informador fluorescente. Isto pode conseguir-se escolhendo um filtro dicroico ou os seus equivalentes, conforme atrás referido, com características de transmissao/reflexão que variam substancialmente nos diversos espectros de emissão do informador. Todavia, para um grupo de informadores mais pro. ximos, e preferível dispor de um filtro de transirão relativamente brusca a qual ocorra próximo do centro das emissões do informador, no sentido de distribuir uniformemente a variaçao de W para os diferentes espectros de emissão (Figura 3).

Essencialmente, este sistema proporciona uma sensibilidade de medida e uma selectividade invulgares. Com este sistema único dirige-se a luz eficientemente sobre os dois detectores intimamente ligados; e sao possíveis elevados níveis de sensibilidade e de selectividade num sistema fácil de uti-

lizar, compacto, e barato.

FLUXOGRAMA orgao de controle do sistema 52 converte os sjL. nais digitais recebidos dos conversores A/D 48 era informação da sequência ADN. Na maioria dos casos, isto sera feito por um computador executando programas em tempo real. Isto significa que se tratam os dados e se determina a informação da sequência concomitantemente com a aquisição dos dados sequenciais a partir dos detectores.

Conceptualmente a operaçao orgao de controle do sistema pode decompôr-se em três processos interactivos: obtenção dos dados ou entrada, análise dos dados, e saída. 0 processo é interactivo poi’ partilha dos dados e por partilha da informação temporal mantendo-os intervalados¹’ e evitando que interfiram entre si. Os pormenores do modo como estas in. teracçoes se efectuam dependem da liguagem e do equipamento informático escolhido e nao assumem aqui qualquer aspecto fun. damental.

A obtenção de dados e o seu tratamento efectuados deste modo podem compreender-se tomando como referência os flu. xogramas da Figura 4. Esta figura representa o método geral pe. lo qual a sequência de dados dos detectores sequenciais de ADN pode converter-se em sinais de saida, isto é, a sequência de ADN da amostra. A Figura 5 representa curvas hipotéticas da saída do detectoi' sequencial em função do tempo e ilustra algumas das variáveis utilizadas na descrição que se segue. Nesta discUssao definem-se os termos seguintes:

1. i é o índice do dado pontual de corrente que se está a obter. Este ponto obtém-se no tempo t (i) min.

2. k é o índice de dado pontual de corrente que está a ser processado. Este ponto corresponde ao dado obtido em t(k)min. Num esquema geral de tratamento de dados, k nao precisa de ser igji al a i, isto é, o tratamento de dados pode estar desfasado da obtenção de dados.

3. t(i) é uma ordenaçao de pontos temporais nos

	quais se obtiveram min significara que obteve 6,2 minutos	os dados. Exemplo: t(5)=6,2 o quinto dado pontual se após o inicio da experiência,
4.	R(i) é a ordenaçao	dos	dados	do	detector de re-
	flexão.
5.	T(i) e a ordenaçao	dos	dados	do	detector de
	transmissão.

6. J é uma contagem dos picos detectados.

7. I: é o número de dados pontuais sob um dado pico.

S. m é um índice dos pontos sob um pico definido quer era P.(i) ou T(i). ra=l no inicio de um pico; m=N no fim de um pico.

9. W é a função definida na secção anterior.

Obtenção de Dados

Apresenta-se ura processo geral de obtenção de dados no fluxograraa na parte esquerda da Figura 4.

afectaçao do índice i que indica o dado corrente programa aceita uma entrada que determina quanto obtido. 0 tempo a expe riência ira durar, isto e, o numero total de dados pontuais

Depois de se iniciar a ordenaçao da sequência de dados processo entra no ciclo de obtenção de dados conforme indicado na Figura 4. Os dados sao obtidos pelos detectores, digitalizados e ordenados nas sequências P.(i) e T(i) respecti vamente para os sinais reflectidos e transmitidos, obtido, res. pectivamente, no tempo t(i). (Para efeitos da presente discussão as duas leituras sao simultâneas). Festa altura, o índice i é incrementado e comparado com I_totaj. Se i e menor do que

I _d repete-se o ciclo de obtenção. Se i e igual a I. . , total ¹ total pára-se a experiência. Num esquema mais elaborado o programa pode determinar o fim automático da experiência medindo diver.

sos parâmetros funcionais (tais como a relaçao resolução de pico, ou incerteza em identificar sinal/ruído, as bases) em cada pico da experiência. Se uma combinação de nao fôr compatível com os critérios putador terminará a experiência. Os pre-estabelecidos o coeprimeiros dados de entra da sao os da sequência de dados dos detectores e armazena-se de dados 2(i) e T(i) que sao partilhadas entre os processos de obtenção e de análise de dados. Este método esta representado esquematicamente na

bora os dois programas corram independente e simultaneamente, deve transitar entre eles alguma informação de controlo no sentido de manter um ritmo apropriado. Por exemplo, nao se pode permitir que um programa de processamento ultrapasse os espaços de obtenção de dados porque iria então processar dados nao existentes.

Processamento de Dados algoritmo de processamento de dados representado na parte direita da Figura 4 e um exemplo de um esquema ge. ral para detectar e identificar as espécies marcadas com informador. Nao se pretende ènglobar tudo. Em vez disso, ilustra os aspectos primários que sao necessários ao desenvolvimento de um programa de analisador real.

Depois de se iniciar a afectaçao do índice k(dis-

tinto do índice i de obtenção de dados), o programa entra num ciclo simples que lê os dados R(k) e T(k) a partir das sequên. cias de dados ordenados proporcionados pelo processo de obten. çao. 0 programa pergunta então se o ponto de corrente está so bre um pico. Existem diversos algoritmos que podem determinar esta condição; os pormenores nao sao necessários aqui. 0 termo pico é considerado em sentido geral. Um pico em R sera geralmente acompanhado por um pico em T. Contudo, consoante a identidade do informador, os picos, nestes dois canais, podem diferir consideravelmente em intensidade. Todavia deverão co incidir no tempo. Por isso, para defenir um ”pico no tempo no.

de utilizar-se uma média ponderada dos dois sinais, o mais forte dos dois sinais, ou qualquer outra combinação de R(k) e T(k).

Se o ponto processado em curso nao está num pico, o índice k é incrementado e comparado com o indice i de aquisição. Se k for igual a a experiência esta acabada e pára o programa. Se k for menor do que i os dados pontuais se guintes sao trazidos das sequências R e T e executa-se nova mente o ciclo. Se k fôr igual a i significa que o processamen.

to de dados alcançou a obtenção de dados. Nesta situaçao, o programa de processamentos espera durante um curto periodo de tempo (normalmente um segundo) e ensaia novamente os valores de k e de i para que se possa retomar o processamento.

Se o ponto processado em curso estiver sobre um pico, o índice m é incrementado. 0 índice jn conta o número de pontos sob o pico em curso. Os valores R(k) e T(k) colocam-se em ordenações temporárias designadas Rpico(m) e Tpico(m) res pectivamente. Depois o programa verifica se o ponto em curso é o último ponto do pico (repetindo, existem algoritmos conhe eidos para esta determinação). Se nao fôr o ultimo ponto do pico, o controlo do programa regressa ao ciclo superior que incrementa k, compara o seu valor com o de i, e lê o par seguinte de dados das ordenações R e T.

Se o ponto em curso fôr o último ponto do pico, o contador de picos J é incrementado e o programa desenvolve-se no sentido de determinar a identidade do pico. 0 resultado é a identidade da base' seguinte na sequência de ADN. 0 programa calcula a função W para os picos em curso, conforme atras descrito, utilizando as ordenações Rpico(m) e Tpico(m) como dados de entrada. Cada base de nucleótido tera associada a ela um par de picos que proporciona uma característica 1'. Deste modo, bas£ ado no valor de W para este pico o programa faculta, como saída, a identidade A, T, C, G da base de ADN. 0 indice m do ponto do pico e as ordenações Rpico e Tpico sao colocadas a zero, e o programa regressa novamente ao ciclo superior de obtenção de dados indicado na Figura 1.

Métodos de Marcaçao na Sequenciação de ADN

A estratégia utilizada para ligar informadores a fragmentos de sequenciação de ADN no modelo de bases especifi ca e um aspecto crítico de qualquer sistema de sequenciação de ADN. Existem diversas abordagens possíveis possuindo cada uma vantagens e desvantagens inerentes.

Marcaçao do Sistema Escorvador

A abordagem anterior da marcaçao do sistema escor37 vador referido por Smith e outros tem a vantegem de se poder colocar o corante longe do ponto de origem, na extermidade 5' do sistema escorvador utilizando intermediários gerados nua sintetizador automático de oligonucleótido. Ê de se esperar muito fraca interferência com a extensão enzimática da cadeia a partir da posição 3'. Contudo, esta abordagem tem diversas desvantagens. Sao necessários quatro diferentes sist&nas escor vadores de oligonucleótido marcado com corante e a produção de fragmentos de sequenciação deve efectuar-se em quatro reacçoes separadas, complicando assim qualquer tentativa para auto.

matizar o processo global. A necessidade de sistemas escorvadores especiais reduz a flexibilidade relativainente a escolha do vector (modelo). Por exemplo, a utilização de sistemas escorvadores marcados torna difícil tirar as vantagens completas das estratégias para a sequenciação rápida de grandes quantidades de AD” contínuo (por exemplo, técnicas de percurso sobre o gene). Há uma desvantagem maior na área do rendimento. A abordagem de marcaçao do sistema escorvador origina que todos os fragmentos sejam-marcados - tanto os fragmentos de sequenciaçao genuínos como diversos fragmentos artificiais englo. barao a marca. Deste modo, manter-se-ao muitos dos inconveni entes encontrados na sequenciação convencional (bandas esbatidas, acumulações, etc.).

Marcaçao Posterior dos Fragmentos

Outra abordagem possível é um esquema de marcaçao posterior. Neste esquema a marcaçao do corante efectuar-se-a depois de se gerar a mistura de fragmentos de sequenciação.

/

Neste caso a vantagem consiste em poderem utilizar-se os protocolos normalizados (de Maxam-Gilbert ou de Sanger) até ao ponto de marcaçao dos fragmentos. A maior desvantagem consiste no facto de a marcaçao dever ser excepcionalmente selectiva. Uma vez que se pode esperar que a ligaçao do informador tenha um efeito incremental mensurável sobre a mobilidade elec troforética de um fragmento de sequenciaçao de ADN, é essenci al que este efeito seja constante para todos os fragmentos. A marcaçao múltipla destruiria a relaçao entre o comprimento da cadeia e a mobilidade electroforética e seria desastrosa.

Marcaçao do Terminante da Cadeia

De acordo com a presente invenção é preferível uma terceira abordagem, isto e, a marcaçao do terminante da cadeia de acordo com uma modificação do processo de Sanger de sequen. claçao de ADN. 0 método clássico de Sanger utiliza um sistema escorvador, um modelo de ADN, polimerase I de ADN (fragmento de Klenow), três desoxinucleótidos nao marcados e um desoxi nucleótido marcado radioactivamente, em quatro recipientes de reacçao cada um dos quais contendo um de entre quatro 2’, 3’ -didesoxinucleótidos, os quais correspondem às quatro bases de ADN (A,C,T,G). Criam-se condiçoes de reacçao apropriadas que permitam à polimerase copiar o modelo por adiçao de nu cleótidos a terminação 3' do sistema escorvador. Ocorrem si multâneamente muitas reacções era muitas cópias do sistema escorvador para produzir fragmentos de ADN de comprimento variá. vel contendo todas a marca radioactiva nos nucleótidos apropriados de cada fragmento, e que também terminam, irreversi velmente, num uos quatro didesoxinucleótidos. Este conjunto de fragmentos separa-se normalmente em quatro quelhas de gel de electroforese numa placa de poliacrilamida, correspondendo uma quelha a cada uma das quatro misturas reaccionais dos didesoxinucleótidos. Depois de se terem separado os fragmentos, coloca-se sobre o gel uma película foto-sensível, expÕe-se, em condiçoes apropriadas, e conclui-se sobre a sequência de ADN a partir da leitura do diagrama de bandas da película, conforme a ordem em que aparecem nas quatro quelhas a partir do fundo do gel.

As modificaçoes ao método de Sanger, de acordo com a invenção, englobam a omissão do nucleotido marcado radioactivamente e a substituição dos 2’, 3'-didesoxinucleótidos nao marcados por terminantes de cadeia marcados com infor. mador. As misturas reaccionais conterão então fragmentos que estão irreversivelmente marcados nos seus terminais 3’ cora uei informador apropriado, correspondente a cada uma das quatro bases de ADN. Combinam-se as misturas reaccionais e separam-se por electroforese. A sequência deduz-se pela ordem de apa. recimento de informadores distintos associados cora cada fragmento, de acordo com os métodos da presente invenção.

rara delinear o âmbito estrutural e racional dos terminantes de cadeia marcados com identificador, aqui utilizados, é útil decompor a estrutura em cinco componentes ilus. trados esquematicamente na Figura 6. Por exemplo, um terminante de cadeia marcado por fluorescência contém (i) uma parte de trifosfato (ii) uma parte de açúcar, (iii) uma parte de base heterocíclica, (iv) uma parte de ligante, e (v) unia

mador” e conterão, normalmente parte de informador, era que o informador e um composto fluorescente.

Depois da descrição anterior e evidente que o ter_ no terminante de cadeia é genérico no processo de sequenciaçao de ADN com a metodologia de Sanger. 0 processo melhorado da presente invenção utiliza variedades mais especializadas de terminantes de cadeia que também têrn vantajosamente ligados a eles um informador. Estes novos compostos podem diferen. ciar-se dos terminantes de cadeia genéricos na medida em que estes últimos compostos contêm normalmente apenas as partes trifosfato (i), açúcar (ii) e base heterocíclica (iii) atras referidas. Os terminantes de cadeia da presente invenção sede cadeia marcados cora infor_ as cinco partes atras descri rao designados por terminantes tas

Parte de Trifosfato

II

II

-O-P-O-P-O-P--_' _ ι _ I

0 0

A parte de trifosfato ou de um composto análogo semelhante (por exemplo, alfa-tiotrifosfato) é uma funcionalidade obrigatória para qualquer substrato de enzima, de terminação de cadeia ou equivalente. Esta funcionalidade proporciona a maior parte da energia de ligaçao para o substrato e e o sitio actual da reacçao enzima-substrato.

Parte de Açúcar

A parte açúcar corresponde ao fragmento estrutu.

ral de 2'-desoxiribofuranose nos substratos de enzima natural.

Esta porçaoda molécula contribui para a identificação do enzima e ê essencial para manter as relações espaciais adequadas entre a parte trifosfato e a porção de base heterociclica. Uma exigência do terminante de cadeia quando a parte açúcar e uma ribofuranose, consiste era a posição 3' nao poder ter ura grupo hidroxi susceptível de ser subsquentemente utilizado pje la polimerase de ADN. 0 grupo hidroxi deve estar ausente, suba, tituído por outro grupo, ou ser inutilizado de qualquer outro modo. Em alternativa, pode utilizar-se um análogo de ribofura. nose, tal como a arabinose, para a parte açúcar. A técnica existente mostra que diversos fragmentos de furanose modifica, da podem servir para esta função incluindo: 2’, 3¹-didesoxi-β-D-ribofuranosilo, JJ-D-arabinof uranosilo, 3 ’-desoxi-J3-D-arabi nofuranosilo, 3'-amino-2', 3 '-dídesoxi-J3-D-ribof uranosilo , e

2', 3’-didesoxi-3’-fluoro -Ji-D -ribofuranosilo / F. Sanger e outros Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467 (1977); Z. G.

Chidgeavadze e outros, Muc. Acids Res., 12, 1671-1636 (1984);

e Z. G. Chidgeavadze e outros, FEBS Lett., 133, 275-27-3 (1985 b

Parte da Base Heterocíclica

A parte de base heterocíclica funciona como elemento crítico de identificação nos ácidos nucleicos que actu. am como aceitadores e dadores de uma ligaçao hidrogénio numa orientação espacial particular. Estes elementos de base sao essenciais para a incorporação do nucleótido apropriado orientado pelo modelo com a fidelidade necessária para a sequen. ciaçao exacta. Esta parte estrutural também suporta o informador. A técnica actual mostra que a posição 5 das pirinidinas e a posição 7 das purinas podem suportar mesmo um substi

Bale e outros tuinte relativamente volumoso sem interferência significativa com a ligaçao ou identificação global £ R. Μ. K.

Proc. Nat, Acad. Sei. USA,

as partes de base heterociclica preferenciais englobam: ura.

eilo, citosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-guanina, e 7-deaza

-hipoxantina. As 7-deaza-purinas nao naturais utilizam-se de modo que o informador se possa ligar sem adicionar uma carga livre à porção de base ou (fesestabilizar a ligaçao glicisidicaPor isso, as purinas naturais nao servem como partes de base heterócíclicas adequadas porque adquirem carga livre e degradara-se rapidamente após as reacçoes de alquilaçao normalmente utilizadas para preparar terminantes de cadeia marcada com informador. Além disso, podem utilizar-se outras bases heterocíclicas que possuam grupos funcionais semelhantes.

Parte Ligante

ligante pode ser simplesmente apenas um grupo amino ou uma cadeia com uma estrutura principal contendo át£ mos tais como carbono, azoto, oxigénio ou enxofre.

De preferência o ligante é um grupo alcinil-amino em que uma extremidade da ligaçao tripla esta ligada a una arai, na através de uma parte de di-radical substituído ou insubsti. tuído, representado pelo símbolo p de 1 a 20 átomos; a outra extremidade da ligaçao tripla está ligada covalenteraente a base heterocíclica na posição 5 para as pirimidinas ou na po. siçao 7 (numeraçao purina) para as 7-deaza-purinas. 0 átomo de azoto da amina do grupo alcinil-amino está ligado a um grupo funcional reactivo (por exemplo, carbonil) na marca fluorescente. 0 ligante nao deve interferir significativanente com a ligaçao ou incorporação pela polimerase do ADI!. A parte di-radical pocle ser alquileno (C|-C_?q), de cadeia linear, contendo eventualmente na cadeia ligações duplas, ligações triplas, grupos arilo ou hetero-átomos tais como azoto, oxigénio ou enxofre. Os hetero-átomos podem fazer parte dos grupos fun. cionais tais como os eteres, tio-eteres, esteres, aminas ou anridas, Os substituintes da parte di-radical podem englobai' átomos de cloro ou grupos alquilo (Cj-Cjg), arilo, ester, éter, amina, amida. De preferência, a parte di-radical é um grupo al. quileno (C^-Cjp) de cadeia linear; mais preferencialmente o di-radical é um grupo Uma descrição mais pormenorizada dos ligantes mais apropriados para serem utilizados nos ternii nantes de cadeia marcados com informador da presente invenção, pode encontrar-se no pedido de patente pendente de Hobbs e outros .

Parte Informador

A descrição anterior realça a utilidade de um meio

de detecção que esteja particularmente adaptado para medir espectros muito proximos, preferencialmente de um conjunto de informadores fluorescentes usados como espécies emissoras. Todavia, também se podem utilizar outras espécies que emitam radiaçao com espectros próximos, para marcar os fragmentos de ADN. Podem identificar-se diversos critérios para a selecçao de espécies de informadores apropriadas para realizar os procejs sos da presente invenção. Estes critérios englobam:

* excitaçao eficiente por uma fonte monocromática e uma resposta de emissão forte e perceptivel;

* presença de um grupo funcional quimicamente reactivo, susceptível de ligaçao covalente, directa ou indirectamente, com terminantes de cadeia de nucleótidos ou dos seus análogos?

massas relativamente pequenas para minimizar a pertur baçao das relações espaciais nos fragmentos de oligonucleótidos:

características de carga e dimensão semelhantes as de outros membros de um grupo ou conjunto escolhido de informadores seleccionados para diferenciação de terminantes de cadeia;

estabilidade num intervalo diversificado de preparações de amostras, condiçoes de pH para reacçao e separaçao de fragmentos, resistência iónica e temperatura, relativamente às características de detecção e propriedades fisicas;

propriedades que possuam um efeito nocivo mínimo na produção ou na separaçao de fragmentos de sequênciaçao de ADN.

Podem encontrar-se espécies de informadores adequadas eti diversas categorias de materiais que podem funcionar com as propriedades atras referidas. Dentre aqueles distinguem -se os cromoforos, fluoroforos, substâncias quimio-luminescentes, marcas de rotaçao rápida, e materiais densos em electroes. A detecção de cada uma destas espécies de materiais também po, de ser feita por meios diversificados. Por exemplo, as emissões das espécies fluorescentes podem detectar-se, conforme atras referido, por um processo que faça a diferenciação das distribuições espectrais. Mos sistemas de detecção fluorescentes alternativos, pode recorrer-se as propriedades das espécies tais como a polarizaçao e resolução temporal diferencial para identificar com exactidao fragmentos que possuam terminantes de cadeia de ADN marcados, correspondentes a cada base. Os meios de detecção escolhidos podem optimizar-se por métodos conhecidos para maximizar a relaçao sinal/ruído e para conseguir uma sensibilidade aceitável, minimizando os sinais parasitas ou ruído de fundo. As propriedades e vantagens, únicas da presente invenção, obtêm-se por associaçao dos mei. os de detecção apropriados com o terminante de cadeia identificada por informador, na sequenciação de ADN.

De modo semelhante, pode utilizar-se a fotometria convencional para detectar cromóforos consentâneos com as exigências dos informadores nos métodos da presente invenção. Podem seleccionar-se apenas quatro cromóforos, os quais também possuem propriedades fluorescentes, para serem incorporados

nos terminantes de cadeia no sentido de introduzir informadores detectáveis por meios diversos, incluindo a espectrofotometria de contagem de fotoes e de absorçao. Uni exemplo típico dos cromóforos que podem ser uteis é o 2,4-dinitro-fenol e os seus derivados.

Podem ocorrer substituições apropriadas em diferentes características de emissão perante um dado conjunto de condiçoes que sejam semelhantes, tornando possível a sua deteç. çao com o equipamento anteriormente descrito, apenas com ligei. ras modificações.

Os informadores luminescentes diferenciam-se dos informadores fluorescentes pelo período de tempo necessário para reemitirem a radiaçao incidente. Os informadores fluorescentes reemitem a energia incidente absorvida geralmente ao —8 —3 fim de um tempo compreendido entre 10 ~^J e 10 segundos. Com. fraquência também se utiliza o termo fosforescente para se fazer referência a compostos que sao luminescentes e, de un modo geral, os termos sao permutáveis. Estes compostos demo-

ram mais tempo a reemitir a energia incidente absorvida do que os compostos fluorescentes. Os informadores luminescentes típicos sao derivados do ácido 2,2'-di-hidroxi-bifenil-5,5’-di-acét ico por exemplo o ácido 2,2’-di-hidroxi-3

3'-dimetoxi-bifenil-5,5’-diacético,

2,2*-di-hidroxi-bifenil-5,5’-dialani na, 2,2’-di-hidroxi-bifenil-5,5’-dietil-amina, etc.

Outras espécies de informadores podem ligar-se co valentemente aos terminantes de cadeia para servirem de reagentes densos em electroes, tais como as partículas de ouro

coloidal. Estes materiais podem utilizar-se num sistema de formaçao de imagem susceptível de detectar pequenas variações nas propriedades de transmissão da luz incidente sobre uma quelha de gel de electroforese. As marcas de rotaçao rápida também se podem utilizar com detectores apropriados para de modo individual marcar cada terminante de cadeia proporcionando identificação da base. A complexidade dos meios de dete£ çao nestas situações pode exigir a simplificação de se manterem amostras separadas para cada terminante de cadeia identi ficado com informador, em vez de as combinar numa unica anos tra antes de a(s) submeter aos meios de separaçao.

Para um especialista na matéria é evidente que se

ρS·;

podem conceber meios apropriados para detectar uma combinação dos informadores atrás referidos para diferenciar os quatro terminantes de cadeia de nucleotido marcado com informador, num dado sistema. Isto aplica-se especialmente aos compostos ligados covalentemente aos terminantes de cadeia que possuam simultaneamente fortes propriedades de absorçao e de fluorescência. Todavia, pode utilizar-se qualquer combinação dos informadores anteriores que tenham sido escolhidos para serem utilizados de acordo com as propriedades desejáveis já descrji tas, em sistemas que possuam uma ordenaçao complementar de mei. os de detecçao.

No caso mais específico do aspecto preferencial da presente invenção, a parte fluorescente proporciona radiaçao emitida detectável após a excitaçao por absorçao de energia de uma fonte apropriada tal como um laser de ioes de argon, É desejável possuir um único informador fluorescente para cada base de ADN encontrada nas aplicações de sequenciação e, de um modo geral, é adequado um conjunto de quatro informadores fluorescentes distinguíveis.

Concebeu-se uma família de informadores úteis nos métodos de sequenciação de ADN da presente invenção especialmente com este objectivo, com base no corante 9-carboxi-etil-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanteno já conhecido. Conhecem-se outros corantes derivados deste composto. S. Biggs e outros, J.Chem Soc.¹¹; 123, (1923) p. 2934-2943 descrevem a preparaçao de diversos derivados de succinil-fluoresceína que se presume possuirem como substituintes átomos de bromo em duas ou quatro posiçoes (succinileosina) na estrutura do núcleo de resorci- 49

nol. Também se prepararam outros derivados tendo como substituintes grupos dinitro e tetranitro na succinil-fluoresfel·:

$tl

k,

ceína. Estes corantes prepararam-se, aparentemente, por processos mais simples e mais eficientes do que os processos ari teriores. Contudo, nao se descobriu nenhuma relaçao entre estes corantes e nao se efectuou nenhuma caracterizaçao significativa das suas propriedades físicas incluindo os seus espectros de emissão. Esta família de informadores fluoresceri tes úteis para a sequenciaçao de ADN pelos processos da presente invenção possui a estrutura geral iíft

B'

g-í·; '>

|Ç^L:

I na qual n é 2 ou 3 e Rj e R₂ representam átomos de hidrjo génio ou de halogéneo ou grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, ou ciano. Estes materiais preparam-se facilmente por condensação do anidrido succínico ou do anidrido glju tárico com o resorcinol adequadamente substituído no ácido metano-sulfónico. Isto constitui uma modificação do procedimento descrito por Biggs e outros para a preparaçao do composto as sociado.

P, Khanna e outros /^-Patente de invenção américa, na n^fl 4 481 136 (1984)J descreveram uma classe de compostos que engloba a estrutura £ quando o símbolo R₂ representa um grupo alquilo e o símbolo representa um átomo de hidrogénio, e a sua utilização na preparaçao de conjugados de antigenes fluorescentes. Apesar de se demonstrar a sua utilização individual em experiências imunológicas fluorescentes, nao há indicação de uma utilização que exija uma família de tais corantes ou de qualquer aplicaçao para a sequenciação de ADN.

Subentende-se que os corantes de xanteno sao susceptíveis de existirem em diversas formas diferentes, gera£ mente formas moleculares convertíveis umas nas outras. Estas formas, a seguir referenciadas pela sua origem (1_, n= 2, = « R₂ H) designam-se por formas quino- , delta-, espiro- , e leuco- . A forma observada numa dada situaçao determinar-se-á pela natureza dos símbolos n, R^, e R_2>epor condiçoes tais cjd mo a temperatura, poder solvente, pH, e forma de cristal. Por clareza e conveniência apenas se utilizará a forma quino- para designar e esboçar estruturas.

QUINODELTA51

As espécies fluorescentes efectivas são o di-aniao 2^ que deriva formalmente da forma quino-. Geralmente estas espécies predominam em soluções aquosas com pH superior a 7. 0 di-aniao derivado do corante original (n = 2, Rj = R₂ = H) está muito bem adaptado para ser excitado por um laser de ioes de argon que opera a 486 nm. Para um pH de 8,2 esta espécie apresenta um máximo de absorçao a 487 nm com um coeficiente de absorçao de 72 600 aproximadamente. A espécie emite a 505 nm com uma eficiência comparável à da fluoresceína (rendimento quântico de 0,9 aproximadamente).

Pode gerar-se um conjunto de quatro corantes flujo rescentes distintos por duçao de pequenas variações no máximo de emissão do cromóforo original através de variações na natureza dos substituintes representados pelos símbolos R|

2’

As pequenas diferenças correspondentes nos espectros de absorçao mantêm a excitaçao eficaz com um laser de ioes de árgon que opera a 486 nm. Limitando a escolha de R^ e R₂ a substituintes relativamente pequenos que nao transportem carga livre, é possível garantir que os efeitos diferenciais na mobilidade electroforética também sejam pequenos quando os corantes estiverem ligados aos fragmentos de ADN.

Um conjunto preferencial de tais corantes adequados para a sequenciaçao de ADN é: (estrutura jL, n=2;l) Rj = = R₂ = H, absorçao a 486 nm, emissão a 505 nm; 2) Rj - H, R₂ = CHg, absorçao a 494 nm, emissão a 512 nm; 3) R| CH^, R₂ = = H, absorçao a 500 nm, emissão a 519 nm; 4) Rj = R₂ = CH^, absorçao a 509 nm, emissão a 526 nm. 0 corante com o comprimento de onda de absorçao máximo apresenta uma eficiência de excitação de cerca de 50%. Estes quatro corantes detectam-se e distinguem-se facilmente em concentrações adequadas para a sequenciaçao de ADN.

Ligaçao do Corante aos Terminantes de Cadeia

A ligaçao covalente dos corantes de xanteno faz-se pelo grupo funcional ácido carboxílico através de uma li. gaçao amida com um grupo amina ligante. Ê útil a introdução de grupos de protecção química para bloquear os corantes numa forma adequada e para minimizar as reacções secundárias duraii te o acoplamento.

A reacção de um corante (1) com um anidrido de ácido alquílico ou arílico (R*) em piridina, seguida do tratamento com um álcool alquílico (R’’) em excesso proporciona um novo composto, o corante protegido (3) que suporta grupos aciloxi nas posições 3 e 6 e um grupo alcoxi (derivado do ál_ cool) na posição 9. Os compostos em que o grupo acilo é um acetilo e o grupo alcoxi é um grupo etoxi preparam-se facilmente e apresentam boa estabilidade, cristalinidade e solubi lidade orgânica. 0 tratamento rápido com amónia aquosa conceii trada regenera o corante livre.

Os corantes protegidos (3) podem acoplar-se às aini nas através do grupo carboxilo utilizando qualquer dos procedimentos normalizados. As ligações amida sao preferenciais por serem estáveis, fáceis de formar, e compatíveis com os sistemas aquosos. As espécies activas nestes procedimentos sao geralmente, um intermediário de estrutura 4. em que o símbolo -X representa um grupo facilmente eliminável.

Estas espécies activas geram-se e ligam-se normal, mente in situ, mas, em alguns casos, é possível isolar e purificar os produtos intermédios. Uma classe particularmente útil de intermediários activados isoláveis é a dos ésteres NHS 5 . Os compostos preparam-se facilmente tratando os coraii tes protegidos 2 ^com uma carbo-di-imida apropriada, tal como N ,N-diciclo-hexil-carbo-di-imida, ou preferencialmente cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida, na presença de N-hidroxi-succinimida. Sao compostos estáveis, al. tamente cristalinos que reagem facilmente com aminas primári. as e secundárias numa diversidade de dissolventes. 0 material com interesse que se pretende analisar no sistema da presente invenção contribui para as aminas primárias e secundárias. Normalmente estes materiais são de deoxinucleótidos ou os seus análogos que contêm as bases de pirimidina e deazapurina desejadas, úteis no protocolo de extensão de cadeia de ADN de Saii ger modificado.

Os ésteres NHS 5_ podem utilizar-se directamente para ligaçao a uma ampla variedade de aminas secundárias, A desprotecçao do produto, com amónia aquosa, proporciona um derivado £ de amina marcada com corante que apresenta uma iii tensidade de fluorescência completa.

acoplamento de um éster NHS 5_ às aminas primári as é rápida e fácil mas a desprotecçao origina geralmente uma

amina marcada que apresenta uma intensidade de fluorescência reduzida. Isto pode ser atribuído a um equilíbrio parcial en tre o produto fluorescente 7a e a forma de espiro-lactama nao fluorescente 7b. 0 grau de equilíbrio está dependente do dissolvente, pH, e da amina. Este problema pode minorar-se inses rindo um espaçador entre o corante e a amina. 0 espaçador pode ser seleccionado entre diaminas, diácidos, ou a partir de moléculas que suportam aminas secundárias e ácidos carboxílicos. Os espaçadores preferenciais contêm aminas reactivas que podem formar ligações amida com os grupos carboxilicos do corante. 0 espaçador está associado principalmente com os info.r madores, particularmente com os corantes fluorescentes, e a sua função consiste em remover a amina reactiva do corante no sentido de evitar a ciclizaçao que proporciona a espiro-lacta. ma. Também é consistente com a observação o facto de o espaçador afastar o corante ainda mais do sítio activo da polímerase de ADN. Este afastamento pode melhorar a incorporação de terminantes de cadeia marcados com informador nos fragmentos de ADN.

Em contrapartida, a ligaçao de um éster NHS 5 a uma amina secundária preferencial proporciona uma espécie que nao apresenta ciclizaçao apreciável para proporcionar a forma de espiro-lactama, mas que suporta um ácido carboxílico para activaçao e ligaçao da amina que interessa.

^{11 H}2^m* _____—-->

2) ΝΗ^ΟΗ

Por exemplo, pode construir-se um espaçador simples e eficaz a partir do aminoácido sarcosina. 0 acoplamento de um éster NHS (5) ao éster benzílico de sarcosina, seguida da eliminação do éster benzílico origina um ácido carboxílico da estrutura 8.. Tal como sucede com os próprios corantes protegidos (3.), também estes ácidos carboxílicos (8J se podem acoplar às aminas utilizando qualquer um dos diversos métodos normalizados. Repetindo, os ésteres NHS da estrutura 9_ podem ser isolados e sao particularmente úteis neste contexto.

acoplamento dos ésteres NHS 9. às aminas seguida de uma desprotecção no seio de amónia aquosa origina derivados de amina marcados com corante com a estrutura geral 10 os quais sao totalmente fluorescentes.

&

X z

Como regra geral, seria preferível conceber ou o_b ter um material com interesse que contivesse uma amina prima59 ria, o qual poderia ser conseguido com um espaçador apropriado. Pensa-se que a inserção de um espaçador evita as reacçoes de ciclizaçao. Podem utilizar-se aminas secundárias mas estas nao reagem tão rapidamente nem tão eficazmente como as aminas primárias.

A estrutura 11 é representativa de um terminante de cadeia marcado por fluorescência. Este material pode preparar-se por uma via convergente. Prepara-se 2’, 3’-didesoxiuridina a partir de 2’-desoxiuridina comercialmente disponível, em 5 passos /7^· E. Pfitzner e outros, J. Org. Chem., 29, 1508-1511 (1964)y. Prepara-se o 5’-trifosfato directamente por adaptaçao do procedimento em recipiente único de J. L. Ruth e outros, Mol. Pharmacol., 20, 415-422 (1981). Fixa-se um ligaii te 3-amino-l-propenil-l à posição 5 da base heterocíclica através de uma adaptação da sequência de reacções descritas por P. Langer e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 78,6633 (1981) e Patente Europeia 82301804.9 (1982). A reacçao de 5-(3-amino-l-propenil-l)-2*, 3’-didesoxiuridina-5’-trifosfato com o éster NHS £ (N = 2, ⁼ seguida pela desproteç.

çao por um tratamento rápido com amónia aquosa origina o novo terminante de cadeia 11 mar ceei o por fluorescência.

composto 11 pode substituir o ddTTF no protocolo de Sanger modificado. Um conjunto completo de quatro terminantes de cadeia pode ser constituído por 11 e por três análogos com diferentes partes fluorescentes e base heterocíclica. A preparaçao de três análogos para substituir os terminantes de cadeia restantes não marcados do protocolo de Sanger modifi cado implica a substituição da parte de base haterocíclica de (uracil) por citosina (em vez de ddCTF), 7-deaza-adenina (em vez de ddATF), e 7-deaza-guanina (em vez de ddGTF). A par.

te fluorescente pode alterar-se mudando os substituíntes aromáticos Rj e R₂ que representam ambos átomos de hidrogénio (ernll) respectivamente para, CH^ e átomo de hidrogénio , átomo de hidrja génio e CH^, ou dois grupos CH^. Os compostos preparam-se por vias semelhantes às descritas para 11.

Verificou-se que a substituição do ligante 3-amino-1-propenil-l por um ligante 3-amino-l-propinil-l proporciona

L

A terminantes de cadeia marcados com informador funcionalmente equivalentes que se podem preparar mais facilmente. A utilizaçao de um ligante propinilo permite a preparaçao de terminantes de cadeia marcados com informador mais estáveis e com rendimentos superiores aos preparados com o ligante propenilo. Outra vantagem consiste no facto de o ligante propinilo estar ligado mais selectivamente à região das bases nucleóti do do que o ligante propenilo.

Por conseguinte, os terminantes de cadeia marcados com informador preferenciais para utilização no método de ampliaçao da cadeia de Sanger modificado pela presente invenção sao 12, 13, 14, e 15.

- 62 -/

CH, CH,

z

« . ^d'

Além disso, é de esperar que o corante fluorescen te uma vez ligado covalentemente a uma base de deazapurina ou de pirimidina através de um ligante e eventualmente de um espaçador, o seu máximo de emissão nominal desviar-se-á no sentido de um comprimento de onda superior. De certo modo este efeito depende da natureza da base e das condições de medida do pH, resistência iónica, solvente, meio de separaçao, etc.

Em alternativa, um factor que parece não influenciar as caraç teristicas de emissão dos fluoroforos é a natureza dos núcleo^ sidos adjacentes nos fragmentos do ADN que contêm o terminante de cadeia marcado por fluorescência. Pensa-se que as emissões de um dado fluoroforo permanecem constantes quando o seu terminante de cadeia está enzimaticamente acoplado a qualquer

das pirimidinas e purinas próximas. Por exemplo, os terminantes de cadeia marcados com informador atrás descritos possuem fluoroforos que emitem nos máximos a 515 nm (12), 524 nm (14), 530 nm (13) , e 536 nm (15) após uma excitaçao a 488 nm. Sob condiçoes semelhantes de medida, estes fluoroforos em solução, no estado livre não ligados apresentavam um máximo de emissão nominal de 505 nm, 512 nm,5!9 iín e 526. m respectivamen te. Estes desvios nos máximos de emissão medem-se facilmente e determi. nam-se na experimentação de rotina. Por sua vez, a caracteri. zaçao desta distribuição dos máximos de emissão permite sele£ cionar a caracteristica de reflexão/transmissao pretendida do filtro dicroico ou do seu equivalente no sistema da presente invenção.

A escolha do enzima de sintetização de ADN detejr minar-se-á normalmente pela estrutura específica do terminaii te de cadeia. Por exemplo, o composto 11 é insuficiente para proporcionar terminações específicas de sequência com o frag. mento Klenow do enzima I de polimerase de ADN, mas com a tranjs criptase inversa VMA ou com a polimerase do bacteriófago T7, obtêm-se terminações virtualmente idênticas às que se observam com ddTTF (conforme verificado utilizando a marcaçao convencional com P) em concentrações comparáveis.

As reacções de terminaçao/extensao de cadeia podem efectuar-se em recipientes separados ou num recipiente único conforme as circunstâncias (por exemplo, gama de term£ nações pretendido, grau de automatizaçao associado). 0 terminante de cadeia marcada com fluorescência e as concentrações de dNTF ajustam-se para proporcionar uma distribuição adequada de fragmentos de sequenciação. Os fragmentos de sequenciaçao de ADN marcados com fluorescência apresentam uma estabil_i dade superior à dos seus equivalentes marcados com P e pode fazer-se a sua análise por meio de electroforese imediatamente a seguir ou mais tarde, ao contrário dos fragmentos marcados 32 com P os quais se decompoem com o tempo.

Como contributo para ultrapassar muitas das desvantagens inerentes à técnica anterior, a abordagem de marcaçao de terminantes de cadeia da presenta invenção também é significativa na medida em que proporciona diversas vantagens operacionais. Acima de tudo, a marcaçao de terminante liga firmemente o informador associado ao resultado de terminação específica de base. Apenas os fragmentos de sequenciação de ADN resultantes de produtos finais de terminação genuina suportarão um informador. Isto elimina muitos dos inconvenientes observados na sequenciação convencional. Isto proporciona com pleta flexibilidade na escolha do vector de sequenciação vis.

to que nao estão implicados sistemas escorvadores especiais.

A automatização fica facilitada pelo facto de os informadores serem suportados pelos quatro terminantes de cadeia de baixo peso molecular da presente invenção, e de poderem ser introduzidos selectivamente numa reacçao única. Nao há desvantagens operacionais inerentes: com esta abordagem os problemas aparecem ao nível da concepção. Em geral, as polimerases de ADN sao de substrato altamente selectivo. Os quatro reagentes de terminação de cadeia marcados com informador devem ser coii seguidos cuidadosamente de modo a que os grupos de informadç) res associados nao interfiram excessivamente com o grau de fi delidade de incorporação.

potencial de elevado rendimento e diversas vaii tagens operacionais fazem da abordagem do terminante de cadeia marcado com informador um método superior para a preparaçao de fragmentos de sequenciação de ADN marcados com informador, através da metodologia de Sanger modificada.

Marcaçao do Sistema Escorvador

Apesar de os corantes descritos se utilizarem com maior vantagem para a preparaçao de terminantes de cadeia mar. cados por fluorescência, também se podem utilizar na abordagem da marcaçao do sistema escorvador. 0 rendimento superior destes materiais relativamente à detecção, descriminaçao e mo. bilidade electroforética fazem deste pedido de patente uma me. lhoria substancial do sistema de Smith e outros.

Na abordagem de Smith e outros, utilizou-se uma fosforamidite de nucleosido derivado de amina protegido, para preparar um 5’-amino-5’-desoxi-oligo-nucleótido utilizando um sintetizador automático. Purificou-se este material e depois ligou-se em reacções separadas nao automáticas a quatro corantes diferentes. Purifícaram-se os quatro oligo-nucleótidos ma£ cados com corante e utilizaram-se como sistemas escorvadores no protocolo de Sanger no qual se omitiu o usual desoxinucleótido marcado radioactivamente.

A disponibilidade dos derivados protegidos dos co rantes descritos nesta memória descritiva (por exemplo,3J permite conceber fosforamidites de nucleosidos que sao marcadas com os corantes protegidos. Quando utilizado num sintetizador automático, tal reagente permite a introdução simultânea final do informador fluorescente e do radical em 5’ permite eliminar a necessidade de efectuar uma

Esta vantagem ligaçao manual e uma purificação adicional.

Prepara-se um reagente de fosforamidite de nucleo-

sido marcado com corante protegido típico do modo seguinte.

Gera-se um éster NHS (.5) in situ e faz-se reagir com 5’-desoxi-5’-(metil-amino)-timidina para se obter um derivado 16 de nucleosido marcado com corante e protegido

A fosfitilaçao na posição 3’ utilizando técnicas normalizadas / Oligonucleotide

S^nthesis’’, Ed.,

M. J. Gait, IRL Press, Washington, D.C. (1984)7 proporcionou a correspondente fosforamidite 17.

Para preparar um oligo-nucleótido marcado com corante na posição 5’ que sirva como sistema escorvador escolhe-se um radical T no terminal 5’. A síntese automática efectua-se pela forma normal com a excepçao de se utilizar 17 como reagente da fosforamidite final. /T^ma vez que nao está presente qualquer grupo de protecção dimetoxi-tritilo (DMT) pode eliminar-se o tratamento final com ácido)/. 0 tratamento com amónia aquosa que liberta o oligo-nucleotido do suporte sólido também serve para desproteger o corante.

A desprotecçao fica completa depois do tratamento prolongado com amónia utilizado para desproteger as bases do nucleótido.

A electroforese normalizada em gel preliminar origina o oligo-nucleótido marcado com corante.

Esta abordagem nao evita os problemas inerentes a uma abordagem de marcaçao do sistema escorvador mas apresentará um rendimento superior ao dos sistemas escorvadores utiliza dos no sistema de Smith e outros. Os desvios diferenciais na mobilidade electroforética serão minimizados e a detecçao/des criminaçao é bastante melhorada, conforme descrito.

Outras Utilidades dos Corantes

Para além de serem úteis na marcaçao de terminantes de cadeia de ADN ou como sistemas escorvadores, estes corantes também sao geralmente úteis como informadores fluorescentes. Podem utilizar-se para marcar proteínas, haptenos, áci. dos ribonucleicos ou outras moléculas com interesse biológico para utilização em ensaios imunológicos, ensaios de ligaçao es pecífica, coloraçao histoquímica ou em quaisquer outras utiliza, ções que exijam a marcaçao fluorescente. A marcaçao destas subs tâncias consegue-se utilizando procedimentos conhecidos análogos aos anteriormente descritos para a marcaçao de aminas. Estas composições sao particularmente úteis quando é necessário mais do que um informador fluorescente numa dada aplicaçao, visto que se podem excitar eficientemente com uma única fonte de luz monocromática e detectar-se como informadores dis^inhos devido aos máximos de emissão desviados. Estas sao as mesmas

propriedades fluorescentes que fazem com que estes corantes sejam úteis como informadores na sequenciação de ADN. Estes corantes têm a vantagem adicional de se poderem ligar uns aos outros utilizando a mesma funcionalidade química, em vez das diversas funções geralmente necessárias com as fluorescefnas conhecidas.

Derivados de Nucleosido Acíclico

Embora os trifosfatos de 2’ , 3 ’-didesoxi-nucleosji do (ddNTP’s) se utilizem virtual e exclusivamente como terminantes de cadeia na sequenciação convencional com P, também se podem utilizar outros derivados de açúcar modificado confo£ me atrás referido. Estes materiais têm a desvantagem (de alguma forma partilhada pelos ddNTP) de serem de preparaçao relatji vamente difícil. Um conjunto eficaz de terminantes de cadeia que possuíssem um açúcar” menos complexo e de introdução mais fácil, seriam úteis simultaneamente na sequenciação convencional de ADN com P e na sequenciação baseada na fluorescência (com um informador fluorescente ligado à base heterocíclica).

No fármaco antivírico ”Aciclovir” (aciclo-guanosjí na) substitui-se o grupo 2’-desoxi-ribofuranosilo por um grupo 2-hidroxi-etoxi-metilo. 0 Aciclovir é metabolizado para propojr cionar in situ o trifosfato correspondente (AcyGTP). 0 AcyGTP está referenciado como sendo simultaneamente um inibidor comp£ tidor e nao competidor de diversas polimerases. Também é considerado, correntemente, como um substrato alternativo para terminação de cadeia para esses enzimas £~P. V. McGuirt e outros, Antimicrob. Agents and Chemother. 25, 507 (1984)/ mas ° /

'*W -70 seu componente inibidor possui uma analise complicada do comportamento do seu substrato. Uma vez que a actividade antivírica do Aciclovir se pode explicar pela sua capacidade para inibir selectivamente as polimerases dos vírus, nunca se cara£ terizou completamente a relaçao de processamento e os produtos derivados do AcyGTP. (Os correspondentes trifosfatos acíclicos de timidina, adenosina, e citidina foram referenciados mas as suas interacçoes com as polimerases estão ainda deficientemente caracterizadas). Em parte alguma da técnica conhecida se demonstra ou sugere que os trifosfatos de aciclo-nucleosido (AcyNTP) podem terminar a cadeia de polimerização de ADN com uma eficácia e fidelidade idêntica ã de compostos tais como os ddNTP. Em particular, nunca se referiu que algum AcyNTP propor, cionasse uma escada de sequenciação quando utilizado como potencial terminante de cadeia em experiências de sequenciação de

ADN.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, demonstrou-se que os trifosfatos de aciclo-nucleosido (AcyNTP) sao úteis como terminantes de cadeia na sequenciação de ADN pe. la metodologia de Sanger.

Isto demonstrou-se efectuando a sequenciação con32 vencional de Sanger ( P como informador de nucleotido) substituindo os ddNTP pelos AcyNTP. As escadas de sequenciação resultantes foram virtualmente idênticas, com a excepçao de ser

necessária uma concentração superior de AcyNTP (grosso modo 10 x) para se obter uma distribuição semelhante de fragmentos de ADN. Os AcyNTP foram eficazes simultaneamente com a polimerase I de ADN (fragmento de Klenow) e com a transcriptase inversa de AMV.

Os AcyNTP possuem a vantagem de se sintetizarem mais facilmente do que os ddNTP. Isto nao é um problema fundamental na sequenciação convencional mas é significativo quando se preparam terminantes de cadeia marcados com informador, estruturalmente complexos. A utilização do grupo 2-oxi-etoxi-m£ tilo como uma parte açúcar” (conforme anteriormente definido) simplifica amplamente a síntese do reagente ao mesmo tempo que mantém um rendimento aceitável.

PARTE EXPERIMENTAL

Os exemplos seguintes apresentam-se como ilustra, çao e nao como uma limitaçao.

Todas as temperaturas estão em graus Celsius. (25° significa a temperatura local ou ambiente). Todas as partes e percentagens nao estritamente especificadas sao em peso, excej) to para as misturas de líquidos para as quais sao em volume.

Utilizam-se as abreviaturas seguintes: DMF - dimetil-formamida; DMSO - dimetil-sulfóxido; NHTFA - grupo trifluoro-acetamido; BTEA - bicarbonato de trietil-amónio; Tris - tris-(hidroxi-me, til)-amino-metano; SF - sticcinil-fluoresceína; RMN - espectro de ressonância magnética nuclear; IV - espectro de infra vermelhos; UV - detecção ou espectro ultravioletas; CCF - crometo

grafia de camada fina em gel de sílica; CLPE - crometografia líquida de pressão elevada; CG - cromatografia em fase gasosa; pf - ponto de fusão; pf d - ponto de fusão com decomposição; pe - ponto de ebulição. Ao fazer-se referência aos dados sobre RMN, apresentam-se os desvios químicos em ppm e as constantes de acoplamento (J) apresentam-se em Hertz. Os pontos de fusão não foram corrigidos. As resinas de permuta de ioes lavaram-se com solventes orgânicos e aquosos apropriados antes de se utilizarem. A identidade de todos os compostos aqui descritos determinou-se por técnicas analíticas e de espectroscopia apropriadas, salvo quando especificado de outra forma, a purificação por cromatografia em gel de sílica efectuou-se conforme descrito por Still e outros, ”J. Org, Chem.”., 43 (1978) p. 2923-2926.

EXEMPLO I

Preparaçao de um intermediário de éster activado

por espagador marcado por fluorescência a 505 nm.

A. Preparaçao de 9-(carboxi-etilideno)-3,6-di-hidroxi-9H-xanteno (SF-505)

Colocou-se resorcinol (33,0 g; 0,300 mole) e anidrido succínico (30,0 g; 0,300 mole) num frasco de fundo redon. do e purificou-se com azoto. Adicionou-se ácido metano-sulfónico (150 ml) e agitou-se a solução a 65°C durante duas horas numa atmosfera de azoto. Adicionou-se, gota a gota, a mistura reaccional a água gelada (1 litro) agitada rapidamente, com adiçao simultânea de hidróxido de sódio aquoso a 50% para man ter o pH a 2,5 + 0,5. 0 produto que se obteve, sob a forma de um precipitado granulado, recolheu-se por filtraçao e lavou-se com água (3 x 100 ml) e depois com acetona (3 x 100 ml). Secou-se o produto ao ar e depois em vácuo (estufa de vácuo) a 110°C durante 18 horas para se obter um pó vermelho escuro (37,7 g; 88%).

Preparou-se uma amostra analítica dissolvendo 1,0 g de produto em 25 ml de HC1 0,3 N quente. 0 precipitado que se formou ao arrefecer removeu-se por filtraçao e éLiminou-se. AdjÍ cionou-se hidróxido de sódio aquoso diluído para elevar o pH para 1,25. 0 precipitado resultante recolheu-se por filtraçao, lavou-se com água, secou-se ao ar, e depois secou-se em vácuo sobre Ρ₂θ5 ^a 140°C durante 36 horas.

Análise: Calculado. £Ό(16)Η(12)0(5)7 C 67,60, H 4,26.

Encontrado: C 67,37, H 4,34, 0,52% de água (K-F). RMN (DMS0-d₆): (principalmente na forma de espirolactona) á 2,690 (t, J=8,6 hz, 2H); 3,070 (t, J=8,6 hz, 2H), 6,530 (d, J=l,8 hz, 2H); 6,676 (dd, J=8,7, 1,8 hz, 2H), 7,432 (d, J=8,7, 1,8 hz, 2H), 7,432 (d, J=8,7 hz, 2H), e 9,964 (s, 2H). Vis. abs. (pH 8,2; 50 mM aq Tris/HCl): max 486 nm (72,600).

B. Preparaçao de 9-(2-carboxi-etil)-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-505)

Adicionou-se SF-505 (29,3 g; 103mmole) a anidrido acético arrefecido com gelo (500 ml) seguindo-se depois a adiçao de piridina (100 ml). Agitou-se a mistura em gelo, durante 20 minutos, e depois adicionou-se durante 20 minutos a água g£ lada agitada rapidamente (7 litros). Bepois de se agitar du rante mais 30 minutos filtrou-se o produto intermédio, fez-se nova suspensão em água (4 litros) e agitou-se durante mais 30 minutos. Recolheu-se o sólido por filtraçao, dissolveu-se em etanol absoluto (1 litro) e fez-se o refluxo durante 45 minutos. Concentrou-se a solução num evaporador rotativo até se obter 200 ml que originaram a cristalizaçao. Recolheu-se o pro. duto por filtraçao, secou-se ao ar, e depois secou-se em vácuo para se obter microcristais côr de laranja clara (21,9 g ; 51%).

A recristalização no seio de cloreto de metileno/ ciclohexano originou microcristais incolores, pf: 142-143°C. Análise: Calculado. /~C(22)H(22)0(8)/ C 6,63.76, H 5,35. Encon. trado: C 63,58, H 5,39. RMN (DMSO-dg): í 1,035 (t, J=6,9 hz, 3H), 1,667 (m, 2H), 2,232 (m, 2H), 2,294 (s, 6H), 2,888 (q, J=6,9 hz, 2H), 7,0-7,1 (m, 4H), e 7,575 (d, J«9.1 hz, 2H).

C. Preparaçao de 9-(2-(N-succinimidil-oxi-carbonil)-etil)-

-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-9H-xanteno.

(Ac2EtSF-505-NHS)

Misturou-se Ac2EtSF-505 (10,4 g; 25,1 mmole) com cloreto de metileno (300 ml) e adicionou-se cloridrato de 1-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (9,70 g; 50,6 mmole) e N-hidroxi-succinimida (4,32 g; 37,5 mmole). Agitou-se a mistura durante uma hora a depois lavou-se com água (5 x 50 ml). As camadas aquosas combinadas extraíram-se com cloreto de metileno (50 ml) e as camadas orgânicas combinadas secaram-se sobre sulfato de sódio e removeram-se. A trituração no seio de etanol (75 ml) seguida de filtraçao e secagem no ar proporcionou o produto bruto na forma de um sólido amarelo claro (c. 10 g).

-75 Dissolveu-se este material em cloreto de metileno (50 ml) e adicionou-se ciclo-hexano (50 ml). Adicionou-se uma colher de chá de carvão vegetal, .filtrcú-se a mistura e dilui-se 0 produto com uma porção adicional de ciclo-hexano (100 ml). Recolheu-se por filtra, ção, secou-se no ar e depois no vácuo para proporcionar cristais incolores, (6,94 g; 54%).

Uma segunda cristalizaçã no seio de etanol proporcionou uma amostra analítica, p.f.: 162-165°C. Análise: Calculado. /G(26)H(25)N(l)0(10)_7 C 61,05, H, 4,95, N 2,74. Encontrado: C 60,78, H 5,01, K 2,65. RMN (DMSO-dg): éí 1,056 (t, J=7,0 hz, 5H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,295 (s, 6H), 2,757 (s, 4H), 2,922 (q, J=7,0 hz, 2H), 7,069 (m, 4H), e 7, 617 (p d, J=9,l hz, 2H).

D. Preparação de 9-(2-(N-metil-N-(benzil-oxi-car'bonil-metil) cart)oximido)etil)-5,6-di-acetoxi-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSE-505-Sar-0Bn)

A uma solução de éster benzilico de sarcosina (1,15 gj 6,51 mmole) em cloreto de metileno (50 ml) adicionou-se Ac2EtSE-5O5-NHS (2,58 gj 5,θ5 mmole) e uma solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% (5θ ml). Agitou-se a mistura de duas fases rapidamente durante 20 horas. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com 5 15 ml de água, secou-se sobre sulfato de só.

dio e concentrou-se até se obter 25 ml. Dilui-se a solução com ciclohexano, até se obter um volume de 150 ml, tratou-se com carvão egetal e reduziu-se para 75 ml sob uma corrente de azoto, proporcionando a precipitação do produto.

Decantou-se a parte sobrenadante e evaporou-se 0 resíduo em conjunto com o cloreto de metileno para se obter uma espuma in

- 76 color (1,70 g; 58%).

A secagem prolongada no vácuo proporcionou uma amostra analítica. Análise: Calculado. C(32)H(33)N(1)O(9)7 C

66,77, H 5,78, N 2,43. Encontrado: C 66,66, H 5,89, N 2,25.

RMN (DMSO-dg): (Apresenta uma mistura 5:2 de rotameros de li-

gaçao	amida)ó (maior	e menor)	1,	040 e 1,018	(t,	J=6,7 hz, 3H),
1,789	e 1,670 (m, 2H)	, 2,211	(m,	2H), 2,290	e 2	,276 (s, 6H),
2,713	e 2,695 (s, 3H)	, 2,893	(q.	J=6,7 hz,	2H),	3,963 (s, 2H),
5,075	e 5,039 (s, 2H)	, 7,044	(m,	4H), 7,324	(m,	5H), e 7,573 e
7,516	(p d, J=9,2 hz,	2H).
	* 0 sal p-tosilato	do	éster benzílico	de sarcosina
	(Adams Chemical C	o.)	extraíu-se	com	cloreto de m£
	tileno e	lavou-se	repetidamente	com	bicarbonato de

sódio aquoso a 5%, depois lavou-se com água, secou

-se sobre sulfato de sódio e removeu-se.

E. Preparaçao de 9-(2-(N-metil-N-(N¹-succinimidil-oxi-carbo- nil-metil)carboxamido)etil)-3,6-di—acetoxi-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-505-Sar-NHS)

A uma solução de Ac2EtSF-5O5-Sar-OBn (1,55 g;2,69 mmole) em etanol absoluto (60 ml) adicionou-se paládio em carvao a 10% (0,15 g). Agitou-se a mistura num balao de vidro sob pressão de hidrogénio durante 30 minutos. Removeu-se o catalisador por filtraçao e eliminou-se o etanol para se obter um re siduo xaroposo.

Dissolveu-se o resíduo em cloreto de metileno (85 ml) e adicionou-se N-hidroxi-succinimida (0,495 g;4,30 mmole) e cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imi.

da (1,12 g; 5,84 mmole) (4 x 25 ml). Concentrou-se a solução até 25 ml, diluíu-se até 175 ml com ciclo-hexano, tratou-se com carvão vegetal, e reduziu-se o volume para 75 ml sob uma corrente de azoto. 0 produto sólido recolheu-se por filtraçao, secou-se ao ar, e secou-se no vacuo para lor (0,97 g; 62%).

A evaporaçao em conjunto com seguida de secagem prolongada no vácuo a se obter um pó incocloreto de metileno,

40°C removeu os vestígios de ciclo-hexano e originou uma amostra analítica de um sólido amorfo. Análise: Calculado £~C(29)H(3O)N(2)O(11)7 C 59,79 H 5,19, N 4,81. Encontrado: C 59,37, H 4,62, N 4,62, 0,93% de água (K-F). RMN (DMSO-d^): (Apresenta uma mistura 4:1 de rota, meros de ligaçao amida.) 4 (maior e menor) 1,034 (t, J=6,9 hz, 3H), 1,827 e 1,935 (m, 2H), 2,223 (m, 2H), 2,289 (s, 6H), 2,758 (s, 4H), 2,779 e 2,824 (s, 3H), 2,888 (q, J=6,8 hz, 2H), 4,333 e 4,473 (s, 2H), 7,043 (m, 4H), e 7,587 (por d, J=9,l hz, 2H).

EXEMPLO 2

Preparaçao de um intermediário de éster activado por espagador marcado por fluorescência a 512 nm

A. Preparaçao de 4-metil-resorcinol

Dissolveu-se 2,4-di-hidroxi-benzaldeído (33,97 g;

0,246 mole) (recristalizado no seio de tolueno) em 2-propanol (3 litros) de qualidade adequada para espectroscopia, num fras. co de fundo redondo equipado com uma entrada de gás e uma saída para o gás libertado. Adicionou-se paládio em carvão a 10% (1,35 g) e depois adicionou-se ácido fosfórico (3 ml) e pulve rizou-se a mistura com azoto. A corrente de azoto foi substitu ida por hidrogénio e agitou-se a mistura rapidamente com arrefecimento em gelo. Decorridas 3 horas cessou a libertação de hidrogénio e removeu-se o catalisador por filtração. Separou-se o filtrado até 200 ml e adicionaram-se 200 ml de acetato de etilo. Lavou-se a solução com 4 x 200 ml de água e os extractos combinados e extraíram-se com acetato de etilo. Estes extractos orgânicos lavaram-se com água e as camadas orgânicas combinadas secaram-se sobre sulfato de sódio e separaram-se pa. ra se obter o produto na forma de um sólido cristalino incolor (29,95 g; 98%). p.f.: 106°C (Lit. 106-107°C /~J. C. Bell, W. Bridge, e A. Robertson, J. Chem. Soc., 1542-45 (1937)/). RMN (DMSO-d₆): i 1,961 (s, Me), 6,076 (dd, H-6, J//5.6/ = 8 hz, J /2,6/ = 2 hz), 6,231 (d, H-2), 6,760 (d, H-5) 8,867 (s, 0H), e 9,008 (s, 0H).

B. Preparaçao de 9-carboxi-etilideno-3,6-di-hidroxi-2,7-dímetil-9H-xanteno (SF-512)

Colocou-se 4-metil-resorcinol (25,8 g; 0,208 mole) e anidrido succínico (20,8 g; 0,208 mole) num frasco de fundo redondo e purificou-se o frasco com azoto. Adicionou-se ácido metano-sulfónico (150 ml) e aqueceu-se a solução a 65°C, numa atmosfera de azoto, durante duas horas. Adicionou-se, gota a gota, esta solução a 1 litro de água gelada fortemente agitada com a adição simultânea de hidróxido de sódio aquoso a 50 %, para manter o pH a 2,25 + 0,25. Recolheu-se o produto por centrifugação e lavou-se com água (3 x) e acetona (2 x). Secou-se o sólido ao ar, depois secou-se em vácuo a 110°C para se obter um pó côr de tijolo (24,1 g; 74%).

A purificação efectuou-se deixando que o acetato de etilo se dispersasse lentamente numa solução do produto em dimetil-sulfóxido. Recolheu-se o precipitado por filtraçao, secou-se ao ar, e depois secou-se em vácuo. RMN (DMSO-dg): (Apresenta uma forma delta pura em conjunto com uma mole de água e de dimetil-sulfóxido). é 2,124 (s, 6H), 3,421 (d, J«7,2 hz, 2H), 5,769 (t, J=7,2 hz, 1H); 6,512 (s, 1H), 6,573 (s, 1H); 7,295 (s, 2H), 9,681 (s, 1H), 9,825 (s, 1H), e 12,346 (bs, 1H). Vis. abs. (pH 8,2 aq Tris): max 493,5 nm.

C. Preparaçao de 9-carboxi-etil-3,6-di-acetoxi-2,7-dimetil-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-512)

Adicionou-se uma amostra de SF-512 (20,0 g; 64,0 mmole) a anidrido acético (350 ml), adicionando-se em seguida, piridina (80 ml). Agitou-se a solução durante uma hora e depois filtrou-se para eliminar os vestígios do corante que nao tinha reagido. Verteu-se o filtrado em 3,5 litros de água agitada rapidamente. 0 sólido intermediário recolheu-se por filtraçao, fez-se nova suspensão em 2 litros de água fria, agitou-se durante 15 minutos, depois recolheu-se e secou-se ao ar para se obter o produto intermédio de espirolactona (20,8 g). Dissolveu-se este produto em etanol absoluto (600 ml) e fez-se o refluxo durante 45 minutos. Tratou-se a solução com carvao vegetal e concentrou-se até 300 ml. Recolheu-se o produto por filtraçao, lavou-se com etanol frio (2 x 50 ml), secou-se ao ar, e depois secou-se em vácuo para se obter microcristais incolores (14,9 g; 53%). p.f.: 143°C. Análise: Calculado. [_ C(24)H (26)0(8)7 ^c 65,15, H 5,92. Encontrado: C 65,31, H 5,97. RMN

(DMS0-d₆): $ 1,027 (t, J=6,9 hz, 3H), 1,628 (m, 2H), 2,136 (s, 6H), 2,207 (m, 2H), 2,303 (s, 6H), 2,884 (q, 6,9 hz, 2H),

6,939 (s, 2H), e 7,417 (s, 2H).

D. Preparaçao de 9-(2-(N-succinimidil-oxi-carbonil)-etil)-3,6-di-acetoxi-2,7-dimetil-9-etoxi-9H-xanteno(Ac2EtSF-512-NHS)

A uma solução de Ac2EtSF-512 (9,42 g; 21,3 mmole) em cloreto de metileno (175 ml) adicionou-se N-hidroxi-succini. mida (3,62 g; 31,5 mmole), adicionando-se imediatamente a seguir cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (8,05 g; 42,0 mmole). Agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavou-se a mistura com água (4 x 100 ml), e extraíram-se os produtos aquosos da lavagem com cloreto de metileno (2 x 50 ml). Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio e removeram-se para se obter um óleo. Adicionou-se etanol absoluto e induziu-se a cristalização por nucleaçao. Recolheu-se o produto por filtraçao, secou-se ao ar, depois secou-se no vácuo para se obter microcristais côr de laranja clara (9,80 g; 85%).

Preparou-se uma amostra analítica dissolvendo um grama em cloreto de metileno (10 ml) e adicionando ciclo-hexano (40 ml). 0 tratamento com carvao vegetal seguido de arrefecimento e nucleaçao induziu a cristalizaçao, originando um sólido cristalino incolor, p.f,: 159°C. Análise: Calculado. C (28)H(29)N(l)0(10)7 C 62,33, H 5,42, N 2,60. Encontrado: C 62,06, H 5,71, N 2,39. RMN (DMSO-d₆): á 1,053 (t, J=6,9 hz, 3H), 2,149 (s, 6H), 2,304 (s, 6H), 2,1-2,4 (m, 4H), 2,747 (s, 4H),

2,920 (q, J=6,9 hz, 2H), 6,975 (s, 2H), e 7,464 (s, 2H).

E. Preparação de 9 - (2-(N-metil-N-(benzil-oxi-carbonil - metil) carboxamido)etil)-3,6-di-acetoxi-2,7-dimetil-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-512-Sar-0Bn)

A uma solução de éster benzílico de sarcosina (0,72 g; 4,02 mmole) em cloreto de metileno (25 ml) adicionou-se g; 3,21 mmole) e uma solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% (20 ml).Agitou-se rapidamente a mistura de duas fases durante 20 minutos. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com 3 x 15 ml de água, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se até 10 ml. Diluíu-se a

solução até 60 ml com ciclohexano, tratou-se com carvao vegetal e reduziu-se para 25 ml sob uma corrente de azoto originan. do-se a precipitação do produto. Decantou-se a parte sobrenadante e secou-se em vácuo o sólido incolor (1,44 g; 74%).

A recristalizaçao no seio de cloreto de metileno/ ciclo-hexano com tratamento com carvao vegetal , originou uma amostra analítica, p.f.: 150-152°C. Análise: Calculado. H(37)N(1)O(9)7 C 67,65 H 6,18 N 2,32. Encontrado: C 67,42 H 6,08 N 2,33. RMN (DMSO-d^): (Apresenta uma mistura 5:2 de rotameros de ligaçao amida) j (maior e menor) 1,049 e 1.008 (t, J=6,8 hz, 3H), 1,747 e 1,66 (m, 2H), 2,144 e 2,115 (s, 6H), 2,18 (m, 2H), 2,314 e 2,303 (s, 6H), 2,694 (s, 3H), 2,907 e

2,884 (q, J=6,8 hz, 2H), 3,961 (s, 2H), 5,075 e 5,016 (s, 2H),

6,960 e 6,917 (s, 2H), 7,430 e 7,396 (s, 2H), e 7,30 (m, 5H).

F. Preparaçao de Ç-^-CN-metil-N-C^-succinimidil-oxi-carbonil-metil)carboxamido)etil)-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-2,4,5,

7-tetra-metil-9H-xanteno (Ac2EtSF-512-Sar-NHS)

A uma suspensão de Ac2EtSF-512“Sar-0Bn (0,45 g;

0,745 mole) em etanol absoluto (20 ml), adicionou-se paládio em carvao a 10% (0,05 g). Agitou-se a mistura num balao de vidro sob pressão de hidrogénio durante 30 minutos. Eliminou-se o catalisador por filtraçao e eliminou-se o etanol para se obter um resíduo xaroposo.

Dissolveu-se este resíduo em cloreto de metileno (25 ml) e adicionou-se N-hidroxi-succinimida (0,129 g; 1,12 mmole) e cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (0,292 g; 1,52 mmole). Agitou-se a mistura durante minutos e depois lavou-se com água (3 x 15 ml). Secou-se a solução sobre sulfato de sódio, concentrou-se até 10 ml, diluíu-se até 40 ml com ciclohexano, tratou-se com carvao vegetal, e reduziu-se o volume até 20 ml sob uma corrente de azoto. Decan. tou-se a parte sobrenadante e submeteu-se o resíduo a uma segunda precipitação no seio, de cloreto de metileno, para se obter um pó incolor (0,27 g; 59%). Análise: Calculado. £~C(31) H(34)N(2)0(ll)7 C 60,98, H 5,61, N 4,59. Encontrado: C 60,28, H 5,71, N 4,40, 1,08% água (K-F). RMN (DMSO-dg): (Apresenta uma mistura 5:1 de rotameros próximo da ligaçao amida) ó (maior e menor) 1,043 (t, J=7,0 hz, 3H), 1,793 e 1,933 (m, 2H),

2,145 e 2,133 (s, 6H), 2,198 (m, 2H), 2,314 (s, 6H) 2,740 (s,

4H), 2,778 e 2,821 (s, 3H), 2,900 (q, J=7,0 hz, 2H), 4,334 e

4,469 (s, 2H), 6,960 e 6,925 (s, 2H), e 7,441 (s, 2H).

EXEMPLO 3

Preparaçao de um éster intermediário activado com espaçador marcado por fluorescência a 519 nm.

A. Preparaçao de 9-(2-carboxi-etilideno)-3,6-di-hidro- xi-4,5-dimetil~9H-xanteno (SF-519)

Colocou-se 2-metil-resorcinol (37,2 g; 0,300 mole) e anidrido succínico (30,0 g; 0,300 mole) num frasco de fundo redondo e purificou-se com azoto. Adicionou-se ácido metano-sulfónico (150 ml) e agitou-se a solução a 65°C durante 4 horas numa atmosfera de azoto. Adicionou-se a mistura reaccional, gota a gota, a água gelada (1 litro) agitada vigorosamente, com adiçao simultânea de hidróxido de sódio aquoso a 50%, para manter o pH a 6,0 + 0,5. 0 sólido finamente dividido recolheu-se por centrifugação e lavou-se com água (4 x 250 ml), fazendo de cada vez nova suspensão, égitando e eliminando a parte sobrenadante. Fez-se uma suspensão do produto bruto em água (1 litro) e adicionou-se hidróxido de sódio aquoso (a 50%), suficiente para elevar o pH para 10,2. Filtrou-se a solução e ajustou-se o pH do filtrado para 1,2 com ácido clorídrico concentrado. Recolheu-se o produto por centrifugação e lavou-se com água (3 x 350 ml) e acetona (3 x 250 ml) conforme atrás descri to. Fez-se uma mistura azeotrópica do sólido resultante com tolueno, recolheu-se por filtraçao, secou-se em vácuo a 110°C para se obter um pó côr de tijolo (24,6 g; 53%). Análise: Calculado. £C(18)H(16)0(5)7 C 69,22 H 5,16. Encontrado: C 68,95 H 5,30, 0,80% de água (K-F). RMN (DMSO-d^) (principalmente a fo£ ma delta): <£ 2,164 (s, 3H), 2,177 (s, 3H), 3,376 (d, J=7,l hz,

2Η), 5,749 (t, J=7,2 hz, 1H), 6,642 (d, J=8,8 hz, 1H), 6,672 (d, J=8,8 hz, 1H), 7,216 (d, J=8,5 hz, 1H), 7,227 (d, J=8,5 hz, 1H), 9,602 (bs, 1H), e 9,758 (bs, 1H). Vis. abs. (pH 8,2;

mM aq Tris/HCl) max 500 nm (69.800).

B. Preparaçao de 9-(2-carboxi-etil)-3,6-di-acetoxi~4,5-

-dimetil-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-519)

Adicionou-se SF-519 (15,0 g; 48,0 mmole) a anidrido acético (250 ml) e pulverizou-se o sólido. (0 tratamento com ultrasons é útil para dispersar o SF-519 altamente insolúvel). Arrefeceu-se a suspensão com gelo, adicionou-se piridina (50 ml) e agitou-se a mistura durante 20 minutos. Filtrou-se a solução e adicionou-se em corrente lenta mas estável a água gela da agitada rapidamente (4 litros). Depois de se agitar durante mais 20 minutos filtrou-se o produto intermédio, fez-se nova suspensão em água (3 litros) e agitou-se durante mais 25 minutos. Recolheu-se o sólido por filtração e secou-se ao ar. 0 produto intermédio seco dissolveu-se em etanol absoluto (600 ml) e fez-se o refluxo durante 1 hora. Concentrou-se a solução num evaporador rotativo, até se obterem 200 ml que originaram a cristalizaçao. Recolheu-se o produto por filtraçao, secou-se ao ar, depois secou-se em vácuo, para se obterem microcristais incolores (12,13 g; 57%).

Preparou-se uma amostra analítica por precipitação no seio de uma solução de cloreto de metileno com ciclohexano. RMN (DMSO-d₆): ó 1,033 (t, J=6,9 hz, 3H), 1,674 (m, 2H), 2,189 (s, 6H), 2,19 (m, 2H), 2,348 (s, 6H), 2,878 (q, J=6,9 hz, 2H), 7,006 (d, J=8,6 hz, 2H), e 7,399 (d, J=8,6 hz, 2H).

C. Preparação de 9-(2-(N-succinimidil-oxi-carbonil)-etil-3,6-di-acetoxi-4,5-dimetil-9~etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-519-NHS)

Misturou-se Ac2EtSF-519 (7,80 g; 17,6 mmole) com cloreto de metileno (175 ml) e adicionou-se N-hidroxi-succinimida (2,75 g; 23,9 mmole) e cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (7,00 g; 36,5 mmole). Agitou-se a mistura durante 90 minutos e depois lavou-se com água (5 x 100 ml). Extraíram-se as camadas aquosas combinadas, com cloreto de metileno (2 x 50 ml) e secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio e eliminaram-se. A tri^ turação com etanol (100 ml) seguida de filtraçao e secagem ao ar, originaram o produto sob a forma de um sólido amarelo claro (7,45 g; 78%).

Duas recristalizaçoes no seio de ciclohexano/cloreto de metileno com tratamento com carvao vegetal originaram uma amostra analítica, pf.: 164-165°C. Análise: Calculado. / C (28)H(29)N(1)0(10)7 C 62,33, H 5,42, N 2,60. Encontrado: C 62,17, H 5,47, N 2,48. RMN (DMSO-d₆): á 1,051 (t, J=7,0 hz, 3H), 2,4-

2,1 (m, 4H), 2,191 (s, 6H), 2,337 (s, 6H), 2,715 (s, 4H), 2,912 (q, J=7,0 hz, 2H), 7,015 (d, J=8,6 hz, 2H), e 7,429 (d, J=8,6 hz, 2H).

D. Preparação de 9-(2-(N-metil-N-(benziloxi-carbonil-metil) carboxamido)etíl)-3,6-di-acetoxi-4,5-dimetil-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-519-Sar-0Bn)

A uma solução de éster benzílico de sarcosina (0,557 g; 3,11 mmole) em cloreto de metileno (19 ml), adicionou-se

Ac2EtSF-519-NHS (1,30 g; 2,41 mmole) e uma solução aquosa de

- 86 - / / bicarbonato de sódio a 5% (15 ml). Agitou-se com rapidez a mi£ tura de duas fases durante 18 horas. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com 3 x 10 ml de água, secou-se sobre sulfato de sódio, e concentrou-se até 10 ml. Diluíu-se a solução até 40 ml com õiclohexano, tratou-se com carvao vegetal, e reduziu-se para 20 ml sob uma corrente de azoto que orji ginou a precipitação do produto na forma de um sólido viscoso. Decantou-se a parte sobrenadante e evaporou-se o resíduo com cloreto de metileno para se obter uma espuma incolor (0,97 g; 67%).

A secagem prolongada em vácuo originou uma amostra analítica. Análise: Calculado. £~C(34)H(37)N(1)0(9)/ C 67,65 H 6,18 N 2,32. Encontrado: C 67,43 H 6,37 N 2,32. RMN (DMSO-dg) (Apresenta uma mistura 5:2 de rotameros de ligação amida): ó (maior e menor) 1,044 e 1,020 (t, J=7,0 hz, 3H), 1,824 e 1,714 (m, 2H), 2,17 (m, 2H), 2,195 e 2,169 (s, 6H), 2,346 e 2,337 (s, 6H), 2,720 e 2,691 (s, 3H), 2,889 (q, J=7,0 hz, 2H), 3,959 e 3,988 (s, 2H), 5,073 e 5,048 (s, 2H), 7,000 e 6,954 (d, J=8,6 hz, 2H), e 7,45-7,25 (m, 7H).

E. Preparaçao de 9-(2-(N-metil-N-(N^t-succinimidil-oxl-carbonil-metil)carboxamido)etil)-3,6-di-acetoxi-4,5-dimetil-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-519-Sar-NHS)

A uma solução de Ac2EtSF-519-Sar-0Bn (1,35 g; 2,24 mmole) em etanol absoluto (50 ml) adicionou-se paládio em carvao a 10% (0,13 g). Agitou-se a mistura num balao de vidro sob pressão de hidrogénio durante 20 minutos. Eliminou-se o catalisador por filtraçao e eliminou-se o etanol para se obter um resíduo xaroposo.

Dissolveu-se este resíduo em cloreto de metileno (50 ml) e adicionou-se N-hidroxi-succinimida (0,39 g; 3,39 mmole) e cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (1,57 g; 8,19 mmole). Agitou-se a mistura durante 75 minutos e depois lavou-se com água (4 x 15 ml). Secou-se a solução sobre sulfato de sódio, concentrou-se até 25 ml, diluíu-se para 125 ml com ciclohexano, tratou-se com carvao vegetal e reduziu-se o volume para 50 ml sob uma corrente de azoto. Decantou-se a parte sobrenadante e extraíu-se o óleo remanescente com cloreto de metileno (5 ml) e adicionou-se, gota a gota, a ciclohexano agitado vigorosamente (75 ml) para se obter um pó incolor (0,587 g; 43%).

Para se obter uma amostra analítica extraíu-se uma porção do produto com doreto de metileno, secou-se sobre pene£ ros moleculares, evaporou-se sob uma corrente de azoto e fina£ mente secou-se com uma pistola de secagem a 48°C sobre pentÓ-

xido de fósforo, durante 20 horas. Análise: Calculado. C(31) H(34)N(2)O(11)7; C 60,98, H 5,61, N 4,59. Encontrado: C 60,15, H 5,71, N 4,51, água (K-F) 1,51%. RMN (DMSO-dg) (Apresenta uma mistura 4:1 de rotameros de ligação amida): & (maior e menor) 1,039 (t, J=6,9 hz, 3H), 1,841 e 1,945 (m, 2H), 2,19 (m, 2H),

2,194 (s, 6H), 2,345 (s, 6H), 2,767 e 2,744 (s, 4H), 2,778 e

2,825 (s, 3H), 2,888 (q, J=6,9 hz, 2H), 4,328 e 4,461 (s, 2H),

7,000 (d, J=8,6 hz, 2H), e 7,410 (d, J=8,6 hz, 2H).

EXEMPLO 4

Preparaçao de um éster intermédio activado com espaçador marcado por fluorescência a 526 nm

A, Preparaçao de 2,4-di-hidroxi-3-metil-benzaldeído

Adicionou-se oxi-cloreto de fósforo (80 ml; 0,86 mole) a uma mistura agitada de N-metil-formanilida (102 ml; 0,82 mole) em éter (250 ml). Agitou-se a mistura durante 1 ho. ra à temperatura ambiente e depois arrefeceu-se com gelo. Ad.i cionou-se 2-metil-resorcinol (Aldrich, 100 g; 0,81 mole) e dei xou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente enquanto se agitou durante a noite. 0 produto intermédio precipitado recolheu-se por filtraçao e lavou-se com éter (3x). Fez-se a hidrólise do produto intermédio por dissolução numa mistura de acetona (250 ml) e água (250 ml) e agitou-se durante 30 minutos. Adicionou-se água (2 litros), levou-se a mistura até à ebulição e depois deixou-se arrefecer tendo-se depositado um produto cristalino. Recristalizou-se este produto uma segunda vez no seio de água (4 litros), para se obter o produto puro (70 g; 572). p.f. 150°C (Lit. 152°-153°C W. Baker e outros, J. Chem. SocV, 1949; p. 2834-5/ RMN (DMSO-dg): í 1,973 (s, 3H), 6,551 (d, J=8,5 hz, 1H), 7,428 (d, J=8,5 hz, 1H), 9,703 (s, 1H), 10,745 (s, 1H), e 11,592 (s, 1H).

B. Preparaçao de 2,4-dimetil-resorcinol

Arrefeceu-se com gelo uma solução de 2,4-di-hidro xi-3-metil-benzaldeído (30,0 g; 197 mmole) com isopropanol (3 litros), num frasco de três bocas de 5 litros, adaptado com um agitador magnético. Adicionou-se ácido fosfórico (4 ml) e paládio em carvao a 10% e tratou-se a solução com azoto e depois com hidrogénio. Quando a libertação de gás ficou completa (ao fim de 1,5 horas), tratou-se a solução novamente com azoto e depois filtrou-se através de uma almofada de Celit^l· Eliminou-se o dissolvente, extraíu-se o resíduo com acetato de etilo, e lavou-se a solução resultante com água (4 x 100 ml). Os produtos de lavagem com água extrairam-se com acetato de etilo e as camadas orgânicas combinadas secaram-se sobre sulfato de sódio e eliminaram-se. A sublimação /795°, (0,05 torr),101325/ /760 x 0,05 N m^-^/ originou um sólido incolor (19,6 g; 72%). p.f. 107°-108°C (Lit. 108°-109°C Baker e outros, J. Chem.

Soc.. 1949; p. 2834-5/. RMN (DMSO-dg): á 1,969 (s, 3H), 2,037 (s, 3H), 6,220 (d, J=8,l hz, 1H), 6,637 (d, J=8,l hz, 1H), 7,929 (s, 1H), e 8,785 (s, 1H).

C. Preparaçao de 9-(2-carboxi-etilideno)-3,6-di-hidroxi-2,4,

5,7-tetra-metil-9H-xanteno (SF-526)

Colocou-se 2,4-dimetil-resorcinol (28,4 g; 0,205 mole) e anidrido succínico (20,0 g; 0,200 mole) num frasco de fundo redondo e purificou-se com azoto. Adicionou-se ácido metano-sulfónico (231 ml) e agitou-se a solução a 70°C durante horas numa atmosfera de azoto. Adicionou-se a mistura reaccional gota a gota, a uma mistura de hidróxido de sódio aquoso (95 g em 150 ml de água) e de gelo (3 litros) agitada vigorosamente. Adicionou-se ácido metano-sulfónico suficiente para ajustar o valor final do pH de 4,7 para 1,5. 0 solido resultan_ te recolheu-se por centrifugação e lavou-se fazendo a suspensão, agitando e decantando a partir da água (5 x 1,2 litros).

A suspensão final recolheu-se

depois secou-se numa estufa a por filtraçao, secou-se ao ar, 110°C durante 6 horas, para se obter um solido (30,6 g; 44%).

Uma côr de tijolo segunda precipitação no seio de uma solução alcalina, seguida de centrifugação e lavagem com água, originou uma amostra analítica. Análise: Calculado: £~C(16)H(12)0(5)/ C 70,57, H 5,92. Encontrado: C 70,39, H 6,00, 0,21% de água (K-F). RMN (DMSO-d^) (principalmente na forma de espirolactona): 2,172 (s, 12H), 2,508 (m, 2H), 3,342 (m, 2H), e 7,604 (s, 2H).

Vis. abs. (pH 8,2; 50 mM aq Tris/HCl): 509 nm (71.300).

D· Preparaçao de 9-(2-carboxi-etil)-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-2,4,5,7-tetra-metil-9H-xanteno (Ac2EtSF-526)

Adicionou-se SF-526 (25,2 g; 74 mmole) a anidrido acético arrefecido com gelo (450 ml), adicionando-se em seguida piridina (100 ml) e agitou-se a mistura com arrefecimento com gelo durante 150 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e depois adicionou-se, em corrente lenta e estável, a agua gje lada agitada rapidamente (7 litros). Depois de se agitar, durante mais 30 minutos, filtrou-se o produto intermédio, lavou-se com água, fez-se nova suspensão em água (4 litros) e agitou-se durante mais 30 minutos. Recolheu-se o solido por filespirolactona (28,9 g). Dissolveu-se uma porção deste produto intermédio (18,6 g) em etanol absoluto (1 litro) e fez-se o refluxo durante 90 minutos. Concentrou-se a solução num evaporador rotativo até 300 ml, o que originou a cristalizaçao. Re- 91 /

( colheu-se o produto por filtraçao, lavou-se com etanol, secou-se ao ar e depois secou-se em vácuo, para se obter microcristais incolores (11,6 g; 52%) com base na quantidade de produto intermédio utilizado.

A recristalizaçao no seio de cloreto de metileno/ Zoiclo-hexano e o tratamento com carvao vegetal originaram microcristais incolores, pf: 154°-155°C, Duas evaporações no seio de cloreto de metileno eliminaram os vestígios de ciclohexa. no para a análise. Análise; Calculado: /~C(2O)H(2O)O(52/ 6 7Q57, H 5,92. Encontrado: C 70,39, H 6,00, 0,21% de água (K-F). RMN (DMSO-d^) (principalmente na forma de espirolactona): b 2,172 (s, 12H), 2,508 (m, 2H), 3,342 (m, 2H), e 7,604 (s, 2H). Vis. abs. (pH 8,2; 50 mM aq Tris/HCl): 509 nm (71.300).

E. Preparaçao de 9-(2-(N-succinimidil-oxi~carboniT)-etil)-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-2,4,5,7-tetra-metil-9H-xanteno (Ac2EtSF-526-NHS)

Misturou-se Ac2EtSF-526 (4,70 g; 9,99 mmole) com cloreto de metileno (75 ml) e adicionou-se cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (3,10 g; 16,2 mmole) e N-hidroxi-succinimida (1,50 g; 13,0 mmole). Agitou-se a mis tura durante 90 minutos e depois lavou-se com água (4 x 50 ml).

As camadas aquosas combinadas extraíram-se com cloreto de me tileno (50 ml) e as camadas orgânicas combinadas secar«m-se sobre sulfato de sódio e removeram-se. A trituração no seio de etanol (75 ml), seguida por filtraçao e secagem ao ar, originaram o produto bruto na forma de um sólido amarelo claro (c. 4,7 g). Dissolveu-se este material em cloreto de metileno (50 ml) e adicionou-se ciclo-hexano (50 ml). Adicionou-se uma colher de chá de carvao vegetal, filtrou-se a mistura, e tratouse o produto com uma porção adicional de ciclohexano (25 ml).

Recolheu-se por filtraçao, secou-se ao ar, e secou-se em vácuo para se obterem cristais incolores (3,14 g; 55%).

Uma segunda precipitação, no seio de cloreto de metileno com ciclo-hexano, originou uma amostra analítica. Analise: Calculado: /7C(30)H(33)N(l)0(10)7; ^C θ3»⁴⁸» H 5,86, N 2,47. Encontrado: C 63,08, H 6,00, N 2,37. RMN (DMSO-d₆): á 1,058 (t, J=6,9 hz, 3H), 2,136 (s, 6H), 2,155 (s, 6H), 2,228 (m, 4H), 2,371 (s, 6H), 2,748 (s, 4H), 2,918 (q, J=6,9 hz, 2H), e 7,300 (s, 2H).

F. Preparaçao de 9-(2-(N-metil-N-(benziloxi-carbonil-metil)- carboxamido)etil)-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-9H-xanteno (Ac2EtSF-505-Sar-0Bn)

A uma solução de éster benzílico de sarcosina (0,72 g; 4,02 mmole) em cloreto de metileno (40 ml) adicionou-se Ac2EtSF-526-NHS (1,82 g; 3,21 mmole) e uma solução de bicarbonato de sódio aquoso a 5% (30 ml). Agitou-se vigorosamente a mistura de duas fases durante 20 horas. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com 4 x 15 ml de água, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se até 15 ml. Diluiu-se a solução até 100 ml com ciclohexano, tratou-se com carvao vegetal e reduziu-se para 50 ml sob uma corrente de azo to que originou a precipitação do produto. A filtraçao seguida pela secagem ao ar, originou um sólido incolor (0,96g; 47%).

A evaporaçao conjunta com o cloreto de metileno

-93 -./ seguida de secagem prolongada em vácuo originou uma amostra analítica. Análise: Calculado: para /~C(36)H(41)N(1)0(9)/ C 68,45, H 6,54, N 2,22. Encontrado: C 68,29, H 6,70, N 2,07. RMN (DMSO-dg) (Apresenta uma mistura 5:2 de rotameros de liga, çao amida): á (maior e menor) 1,049 e 1,027 (t, J=6,8 hz, 3H),

1,783 e 1,700 (m, 2H), 2,129 e 2,099 (s, 6H), 2,159 e 2,129 (s, 6H), 2,14 (m, 2H), 2,379 e 2,371 (s, 6H), 2,699 e 2,690 (s, 3H), 2,873 (q, J=6,8 hz, 2H), 3,958 e 3,976 (s, 2H), 5,075 e 5,019 (s, 2H), 7,266 e 7,233 (s, 2H), e 7,25-7,40 (m, 5H).

G. Preparaçao de 9-(2-(N-metil-N-(N^t-succinimidil-oxi-carbonil-metil)carboxamido)etil)-3,6-di-acetoxi-9-etoxi-2,4,5,7-tetra-metil-9H-xanteno (Ac2EtSF-526-Sar-NHS)

A uma solução de Ac2EtSF-526-Sar-0Bn (0,96 g; 1,52 mmole) em etanol absoluto (40 ml) adicionou-se paládio em carvao a 10% (0,10 g). Agitou-se a mistura num balao de vidro sob uma pressão de hidrogénio durante 30 minutos. Removeu-se o catalisador por filtraçao e eliminou-se o etanol para se obter

um resíduo xaroposo.

Dissolveu-se este resíduo em cloreto de metileno (40 ml) e adicionou-se N-hidroxi-succinimida (0,26 g; 2,26 mmole) e cloridrato de l-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbo-di-imida (0,59 g; 3,08 mmole). Agitou-se a mistura durante 30 minutos e depois lavou-se com água (4 x 15 ml). Secou-se a solução sobre sulfato de sódio, concentrou-se até 15 ml, diluiu-se para lOOml com ciclo-hexano, tratou-se com carvao vegetal, e reduziu-se o volume até 50 ml sob uma corrente de azoto. Recolheu-se o produto por filtraçao, secou-se ao ar, e secou-se em vácuo, para se obter microcristais incolores (0,573 g; 59%).

A evaporaçao conjunta com cloreto de metileno, seguida por secagem prolongada no vácuo a 40°C eliminou os vestígios de ciclo-hexano e originou uma amostra analítica sob a forma de um sólido amorfo. RMN (DMSO-dg): S 1,043 (t, J=6,7 hz, 3H), 1,82 (m, 2H), 2,130 (s, 6H), 2,157 (s, 6H), 2,15 (m, 2H), 2,378 (s, 6H), 2,748 (s, 4H), 2,778 (s, 3H), 2,891 (q, J=6,7 hz, 2H), 4,327 (s, 2H), e 7,275 (s, 2H).

EXEMPLO 5

PREPARAÇÃO DE 5*-TRIFOSFATO DE 5-(3-AMIN0-l-PR0PINID-2* ^'-DIDESOXI-CITIDINA (5-AP3-ddCTP)

A. PREPARAÇÃO DE N-PROPARGIL-TRIFLUORO-ACETAMIDA(lâ)

Durante 1 hora adicionou-se, gota a gota, propargil-amina (24,79 g; 0,450 mole; Aldrich, 99%) a trifluoro-ac£ tato de metilo (69,19 g; 0,540 mole; 1,2 equivalentes Aldrich), a 0°C. Depois de se agitar durante mais 1 hora a 0°C, destilou-se numa coluna de Vigreaux de 15cm, para se obter 62,12 g (91%) de trifluoro-acetamida 18 sob a forma de um líquido incolor £”pe 68,5°-69,5°C a (11 x 101325/760 Nm^-2), 11 torij. Verificou-se que este material era homogéneo por RMN e por CG e que era pe£ mutável com material idêntico sob o ponto de vista da espectros, copia, preparado por acilaçao da propargil-amina com anidrido do ácido trifluoro-acético.

¹H-RMN (CDC1₃): 6,85 (largo s, 1H, NHTFA), 4,17 (dd, J=5,6 e 2,5, 2H, CH^, 2,35 (t, J=2,5, 1H, CH). IV (puro; cm¹): 3300 (N-H), 3095 e 2935 (C-H), 2130 (acetileno), 1720 (C=0), 1550 (N-H), 1430, 1365, 1160, 1040, 998, 918, 857, 829,

772, e 725.

B. PREPARAÇÃO DE 5-I0D0-2',3 *-DIDESOXI-CITIDINA (W

Durante 19 horas fez-se o refluxo de uma solução de 2’ , 3’-didesoxi-citidina (2,11 g; 10 mmole Raylo) e de acje tato de mercúrio (3,35 g; 10,5 mmole, Fisher) em 50 ml de metanol. A suspensão branca resultante diluiu-se com metanol (50 ml) e com dicloro-metano (100 ml). Adicionou-se iodo (3,05 g; 12 mmole) e agitou-se a suspensão a 25°C. Decorridas 4 horas adicionou-se a forma de base livre da resina AG3 X4A (20 ml, 38 meq, Bio-Rad) e fez-se borbolhar ácido sulfídrico na mis^ tura reaccional durante 15 minutos. Verificou-se a precipitação completa de mercúrio (II) por CCF. Filtrou-se a mistura reaccional através de um filtro que se lavou com uma mistura de metanol/dicloro-metano 1:1. Evaporou-se o filtrado sobre gel de sílica (10 g) e assim carregado colocou-se na parte superior de uma coluna de gel de sílica de 150g. A eluiçao com 5%, 10% e 20% de metanol em dicloro-metano originou 2,79 g (83%) de iodeto 19 sob a forma de um sólido cristalino incolor. Duas recristalizações no seio de água em ebulição, originaram após secagem no vácuo a 50°, prismas grandes, analiticamente puros (pf: d 178°C).

¹H-RMN (DMSO-dg): 8,50 (s, 1H, H6), 7,73 (largo s, 1H, -NH₂a), 6,53 (largo s, 1H, -NE^b), 5,86 (dd, J=6,5 e 2,1, 1H Hl’), 5,19 (t, 1H, 5'0H), 4,04 (m, 1H, H4’), 3,75 (ddd, J=12,l 5,2, e 2,9, 1H, H5’a), 3,53 (dt, J=12,l e 3,8, 1H, H5’b), e 2,3-1,7 (m, 4H, H2’ e H3’). Calculado para C_gH₁₂N₃O₃I: C 32,07¾

Η 3,59%, Ν 12,46%. Encontrado: C 32,05%, Η 3,80%, Ν 12,46%.

C. PREPARAÇÃO DE 5-(3-TRIFLU0R0-ACETAMID0-l-PR0PINIL)-2',

3’-DIDESOXI-CITIDINA (2fl) ;

PROCEDIMENTO GERAL PARA 0 ACOPLAMENTO DE AMINO-ALCINOS A

IODO-NUCLEOSIDOS

Carregou-se um frasco de três bocas de 50 ml com iodo-citidina 19 (770 mg; 2,00 mmole) e iodeto de cobre (76,2 mg; 0,400 mmole; 0,20 equivalente; Aldrich, Gold Label). Depois d_e se limpar o frasco com argon, adicionou-se dimetil-formamida seca (10 ml, Aldrich) para se obter uma solução de iodo-citidina 0,2 M que continha iodeto de cobre em suspensão. Com uma seringa adicionou-se N-propargil-trifluoro-acetamida (0,70 ml; 6,00 mmole; 3,0 equivalentes) e trietil-amina (0,56 ml;

4,00 mmole; 2,0 equivalentes, depositada sobre peneiros moleculares), Colocou-se tetraquis-(trifenil-fosfina)-paládio (0) (231 mg; 0,20 mmole; 0,10 equivalentes) dentro de um frasco numa caixa secs e adicionou-se à mistura reaccional. 0 iodeto de cobre dissolveu-se para se obter uma solução amarela que escureceu gradualmente ao fim de algumas horas. Permitiu-se que a reacçao prosseguisse até que a CCF indicou que o material de partida estava completamente consumido. Decorridas 4 horas diluiu-se a mistura reaccional com 20 ml de metanol/diclo. ro-metano 1:1 e adicionou-se resina de permuta de aniões forte mente alcalina sob a forma de bicarbonato (Bio-Rad AGI X8, 2,0 g; ca. 6 equivalentes). Depois de se agitar durante 15 minutos, aproximadamente cessou a libertação de gás. Decorridos 30 minutos, filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com

dicloro-metano/metanol 1:1. Os filtrados combinados concentra, ram-se rapidamente com um evaporador rotativo. (A eliminação da dimetil-formamida exigiu cerca de 10 minutos a 45°C e à pressão de 2 torr (2 x 101325/760 N m ). Purificou-se imediatamente o resíduo por cromatografia em 150 g de gel de sílica, utilizando metanol em diclorometano a 10%, 15% e 20%. A eliminação do dissolvente das fracçoes apropriadas, originou 651 mg (90%) de alcinil-amina 20 sob a forma de uma espuma cristalina amarelo claro que se verificou ser homogénea por CCF e RMN. Vje rificou-se por análise elementar que o produto de uma preparaçao :semelhante era um hemi-hidrato.

¹H-RMN (DMSO-dg): 9,96 (largo s, IH, NHTFA), 8,32 (s, IH, H6), 7,76 (largo s, IH, NH2a), 6,78 (largo s, IH, NH2b), 5,88 (dd, J=6,5 e 2,5, IH, Hl’), 5,13 (t, J=5,l, IH, 5‘0H), 4,28 (d, J=5,0, 2H, -CH2-), 4,04 (m, IH, H4’), 3,73 (ddd, J=12,0, 5,0 e 3,1, lH,H5'a), 3,53 (dt, J=12,l e 4,0, IH, H5’b), 2,3-1,7 (m, 4H, H2' e H3’). ¹⁹F-RMN (DMSO-dg): -74,0 (s). UV (MeOH): máximos a 238,5 (17.100) e 295,5 (9.300). Calculado para ^j^H^N^04F₃*l/2H₂0: C 45,53, H 4,37, N 15,17. Encontrado: C 45,56, H 4,52, N 15,26.

D. PREPARAÇÃO DE PIROFOSFATO DE TRIS-(TRI-N-BUTIL-AMÕNIO)

Dissolveu-se deca-hidrato de pirofosfato de tetra-sódio (4,46 g; 10 mmole) numa quantidade mínima de água (apro. ximadamente 50 ml) e fez-se passar através de uma coluna de resina AG50W X8 (malha de 100-200 mesh, leito de 4 x 10 cm) vertida em água. Eluiu-se a coluna com água e recolheu-se o eluente num frasco arrefecido com gelo até que o pH do eluente

se aproximasse da neutralidade. Adicionou-se tri-n-butil-amina (Aldrich Gold Label, 7,1 ml; 30 mmole) ao eluente e agitou-se vigorosamente as duas fases até que a amina se dissolveu. Lit) filizou-se a solução resultante. Evaporou-se o resíduo duas ve zes em conjunto com piridina seca e uma vez com dimetil-formamida seca. Dissolveu-se o resíduo em dimetil-formamida seca (10 ml) e armazenou-se a solução 1,0 M resultante (durante um mês) a 0°C, numa atmosfera de argon, até voltar a utilizar-se.

E. PREPARAÇÃO DE 5*-TRIFOSFATO DE 5-(3-AMIN0-l-PR0PINIL)-

-2',3'-DIDESOXI-CITIDINA (5-AP3-ddCTP).

PROCEDIMENTO GERAL PARA CONVERTER NUCLEOSIDOS DE ALCINIL-AMINO PROTEGIDOS NOS CORRESPONDENTES 5’-TRIFOSFATOS E

PARA ELIMINAR 0 GRUPO DE PROTECÇÃO DE TRIFLUORO-ACETILO.

Dissolveu-se o nucleosido alcinil-amino 20 (361 mg;

1,00 mmole) em fosfato de trimetilo (2,0 ml; Aldrich Gold

Label) enquanto se agitava, numa atmosfera de argon, num frasco seco em estufa. Arrefeceu-se a solução até -10°C e adicionou-se, com uma seringa, oxicloreto de fósforo (0,093 ml; 1,00 mmole, Aldrich Gold Label). Depois de se agitar a mistura reaccional a -10°C durante 30 minutos, adicionou-se uma segunda ali quota de oxicloreto de fósforo (0,093 ml; 1,00 mmole) e deixou-se a solução aquecer lentamente até 25°C com agitação. Adicionou-se hidróxido aquoso IN ãs aliquotas da mistura reaccional e fez-se a análise por CLPE. Quando a conversão, no correspondente mono-fosfato de nucleotido, estava no máximo (no caso presente 100 minutos após a segunda adiçao de oxicloreto de fósforo), adicionou-se, gota a gota, a mistura reaccional a uma

- 99 4 solução previamente arrefecida (-10°C) de pirofosfato de tris-(tri-n-butil-amónio) (6,0 ml da anterior solução 1,0 M em di. metil-formamida seca). Deixou-se a solução aquecer lentamente até 25°C enquanto se agitava numa atmosfera de argon. Decorridos 100 minutos adicionou-se lentamente a solução de reacçao a uma solução previamente arrefecida (0°C) de trietil-amina (1,4 ml) em água (20 ml). Agitou-se a solução durante 15 minu tos com arrefecimento em gelo e depois deixou-se em repouso durante a noite à temperatura aproximada de 2°C.

Eliminaram-se os produtos voláteis por evaporaçao

Λ no vácuo a 25°C e a 0,5 torr (0,5 x 101325/760 Nm ). Dissolveu-se novamente o residuo em agua (75 ml) e aplicou-se a uma coluna de DEAE-Sephadex A-25-120 (leito de 2,6 x 65 cm) que ha via sido equilibrado com: 1) pH 7,6; TEAB aquoso l,0M (300 ml), 2) bicarbonato de potássio aquoso 1,0 M(300 ml), e 3) pH 7,6; BTEA aquoso 0,1 M (300 ml). Eluiu-se a coluna com uma solução aquosa de BTEA de pH 7,6 de gradiente linear desde 0,1 Μ (1 li_ tro) até 1,0 Μ (1 litro). A coluna foi accionada a 100 ml/h enquanto se recolhiam fracçoes de 12 em 12 minutos. Controlou-se a eluição por absorvência a 270 nm (40 AUFS). 0 material pretendido surgiu com nitidez numa banda principal próximo do terminal do gradiente (Fracçoes 73-80). Combinaram-se as fracções que continham o produto, concentrou-se (temperatura inferior a 30°C), e evaporou-se, duas vezes, em conjunto com etanol absoluto. Extraíu-se o resíduo com água (20,4 ml) e liofilizou-se.

Extraíu-se o produto intermédio com água (12,5 ml) e adicionou-se hidróxido de amónia concentrado (12,5 ml). Após

100

agitação durante 3,5 horas, agitou-se a solução num aspirador de vácuo durante 2 horas para se eliminar o excesso de gás de amóniaco e depois liofilizou-se. Extraíu-se o resíduo com BTEA aquoso 0,1 M com pH 7,6 (10 ml) e aplicou-se a uma coluna de DEAE-Sephadex A-25-120 (leito de 1,6 x 55 cm) preparado con. forme descrito anteriormente. Eluíu-se a coluna enquanto se re colhiam fracções de 6 ml com o gradiente linear do BTEA desde 0,1 M (280 ml) até 1,0 M (280 ml). A eluiçao do produto apreseii tou um pico principal único. Combinaram-se as fracções que mais provavelmente continham o produto puro (# 39-45), concentraram-se (a uma temperatura inferior a 30°C), evaporaram-se em conjunto com etanol absoluto (2x) e extraíu-se com água (9,8 ml). Fez-se a análise da solução por absorçao de UV e por CLPE e depois liofilizou-se.

Uma solução diluída do produto apresentou máximos de absorção a 240 e a 293,5 nm em um Tris-tampao aquoso 50 nM com pH 8,2. Presumindo que o coeficiente de absorçao do produ to é igual ao do material de partida (9 300), a produção de

5-AP3-ddCTP, baseada na absorçao a 293,5 nm, foi de 0,32 mmole (32%). A CLPE (Zorbax SAX, fosfato de potássio aquoso 0,2 M com pH 6,5, controlado a 270 nm) do produto final apresentou fundamentalmente um pico único (>99%).

^XH-RMN (D20): 8,57 (s, 1H, H6), 6,03 (dd, J=6,4 e 1,6, 1H, Hl’), 4,42 (m, 2H, H4’ e H5’a), 4,18 (ddd, J-12, 5,5 e 3, 1H, H5’b), 4,036 (s, 2H, -CH2-), 2,5-1,9 (m, 4H, H2' e H3^f), mais os picos dos ioes contrários (trietil-amónio) ³¹P-RMN (D20): -9,02 (d, J=20, IP), -9,74 (d, J=20, IP), -21,37 (t, J=20, IP). UV (pH 8,2 Tris aq): máximos a 240 e 293^5 nm.

101

EXEMPLO 6

PREPARAÇÃO DE 5*-TRIFOSFATO DE 5-(3-AMINO-l-PR0PINIL)-2¹,3'-DIDESOXI-URIDINA (5-AP3-ddUTP)

A. PREPARAÇÃO DE 5-I0D0-2¹,3'-DIDESOXI-URIDINA (21)

Dissolveu-se didesoxi-uridina (2,122 g; 10,0 mmole) em 30 ml de metanol quente e, após arrefecimento até 25°C, adi. cionou-se mono-cloreto de iodo (4,06 g; 25mmole; 2,5 equivalejn tes Fisher) em metanol (20 ml), durante 5 minutos. Aqueceu-se a mistura reaccional de côr púrpura escura num banho a 50°C, numa atmosfera de azoto, durante 20 minutos e depois arrefeceu, -se imediatamente num banho de gelo e água. Depois de se deixar em repouso sem agitaçao, durante 165 minutos, recolheu-se por filtraçao o precipitado resultante e lavou-se com metanol frio (2 x 10 ml). A secagem em vácuo durante a noite, originou 2,232 g (66%) de iodeto 21 sob a forma de microcristais branco sujo. Utilizou-se este material, sem purificação, na reacçao seguinte, mas purificaram-se outras preparações por cromatogra^ fia ou por recristalizaçao no seio de metanol em ebulição (30 ml/g) para se obter agulhas brancas (pf com decomposição 160^o-164°C). 0 espectro RMN indicou que o precipitado bruto era homogéneo mas também que o protão 5’-hidroxilo era de pico bas. tante largo devido à permuta catalisada por vestígios de impurezas. Os materiais cromatografados ou recristalizados originaram espectros em que este protão era, conforme usual, um trjL pleto estreito.

^-RMN (DMSO-dg): 11,60 (largo s, IH, H3), 8,57 (s, IH, H6), 5,90 (dd, J=2,0 e, 6,6, IH, Hl'), 5,2 (largo s, IH,

5'0Η), 4,06 (m, ΙΗ, H4’), 3,75, e 3,53 (m, ΙΗ, H5’), 2,26, 2,02 e 1,84 (m, 4H, H2’ e H3’).

B. PREPARAÇÃO DE 5-l>TRIFUJORO-ACETAMIDO-l-PROPINIL)-2',3'-

-DIDESOXI-URIDINA (22)

Durante 3 horas fez-se o acoplamento de iodo-uridina 21 a N-propargil-trifluoro-acetamida seguindo o método geral apresentado no Exemplo 5C. A cromatogrãfia com um gradiente de 0-5% de metanol em dicloro-metano originou material que se verificou ser homogéneo por CCF, mas que era de difícil secagem. Depois de se evaporar o produto cromatografado diversas vezes em conjunto com clorofórmio e após secagem no vácuo, obtiveram-se 536,5 mg de nucleosido alcinil-amino 22 sob a fo£ ma de uma espuma branca. Verificou-se por CCF que este material era homogéneo e por RMN que era puro, com excepção de uma pequena quantidade de clorofórmio (39 mole; 66% de rendimento corrigido).

^-RMN (DMSO-d₆): 11,61 (s, ΙΗ, H3), 10,07 (t distorcido, 1H, NHTFA), 8,35 (s, ΙΗ, H6), 7,26 (s, 0,39H, CHC1₃), 5,89 (dd, J=6,6 e 3,2, 1H, Hl'), 5,15 (t, J=5,2, 1H, 5’0H),

4,22 (d largo, 2H, -CH2N-), 4,04 (hept-aparente, J=3,5, 1H,

H4'), 3,73, e 3,53 (m, ΙΗ, H5'), 2,26, 2,03 e 1,84 (m, 4H, H2' e H3'). CCF (dicloro-metano/metanol 95:5; duas eluiçoes, UV):

Iodeto de partida 21, R^=0,37; produto 22, 0,28; catalisadores,

0,95 e 0,80 mais riscas ligeiras.

C. PREPARAÇÃO DE 5'-TRIFOSFATO DE 5-(3-AMINO-l-PROPINIL)-

-2',3'-DIDESOXI-URIDINA (5-AP3-ddUTP, 22)

Converteu-se o nucleosido de alcinil-amino 22

103 (

(0,30 mmole) no correspondente trifosfato e eliminou-se o seu grupo trifluoro-acetilo seguindo o procedimento geral apresentado no Exemplo 5E. Após a adiçao da segunda aliquota de oxicloreto de fósforo, deixou-se a fosforilaçao evoluir durante 210 minutos. Presumindo que o coeficiente de absorçao do produto era igual ao do material de partida (13 000), o rendimento de trifosfato 23, baseado na sua absorção de UV a 291,5 nm foi de 18%.

EXEMPLO 7

PREPARAÇÃO DE 5¹-TRIFOSFATO DE 7-(3-AMINO-l-PROPINIL)-2'^'-DIDESOXI-GUANOSINA (7-AP3-ddc7GTP)

A. PREPARAÇÃO DE 6-MET0XI-2-METIL-TI0-9-(3,5-DI-0-p-T0LU0IL-

-2-DESOXI-ft-D-RIBOFURANOSIL)-7-DEAZAPURINA (M)

Secou-se, azeotropicamente, 6-metoxi-2-metil-tio-7-deazapurina (9,2 g; preparada de acordo com o processo de F.

Seela e R. Richter; Chem. Ber.; 111; 1978; p. 2925) por dissolução em 150 ml de piridina seca e por evaporaçao até à secagem a 30°-35°C. Fez-se uma suspensão deste material em 450 ml de açetonitrilo seco à temperatura ambiente, numa atmosfera de azoto, e adicionou-se hidreto de sódio (2,16 g de uma suspensão a 60% em óleo), com agitaçao. Decorridos 45 minutos, adicionou-se l-cloro-2-desoxi-3,5-di-0-p-toluoil-o<-D-ribofuranose (18,6 g, preparado de acordo com o processo de M.Hoffer; Chem. Ber.; 93; 1960; p. 2777), em três porçoes iguais, durante um período de 20 minutos. Depois de se agitar a mistura reaccional durante mais 45 minutos, ã temperatura ambiente, adji

104

cionou-se ácido acético (1 ml) e dicloro-metano (300 ml). FijL trou-se a mistura por sucção através de uma almofada de filtra, gem e evaporou-se o filtrado até à secagem. Dissolveu-se o resíduo em benzeno e lavou-se esta solução com água (2x) e com uma solução salina (lx). Após a secagem da camada orgânica sobre sulfato de sódio e após a evaporaçao, dissolveu-se o resíduo em metanol (400 ml) e deixou-se cristalizar, para se obter 19,24 g (73,8%) do produto ribossilado 24 sob a forma de cristais incolores (p.f. 106°-107°C).

¹H-RMN (CDC1₃, 360 MHz): 2,42 (s, 3H, toluoil-CH₃),

2,44 (s, 3H, toluoil-CH₃), 2,64 (s, 3H, SCH₃), 2,70 e 2,89 (m, 2H, H2’), 4,08 (s, 3H, 0CH₃), 4,56, (m, 1H, H3'), 4,65 (m, 2H, H5'), 5,74 (m, 1H, H4’), 6,44 (d, J=4, 1H, H7), 6,77 (dd, J=8 e 6, 1H, Hl’), 7,05 (d, J=4, 1H, H8) e 7,25 e 7,95 (m, 8H, toluoil-H).

A recristalização de uma amostra do material anterior, no seio de metanol contendo uma pequena quantidade de d.i cloro-metano, originou cristais com p.f. 109°-110°C.

B. PREPARAÇÃO DE 6-MET0XI-2-METIL-TI0-9-(2-DES0XI-p4)-RIB0-

FURAN0SIL)-7-DEAZAPURINA (25)

Fez-se o refluxo de uma suspensão de éster 24 (19 g) e de resina de permuta de anioes fortemente alcalina, sob a forma de hidróxido (38 g de Rexyn 201) em 600 ml de metanol, durante 1,5 horas numa atmosfera de azoto. Filtrou-se por sucção a suspensão quente, para se eliminar a resina e evaporou-se o filtrado até à secagem. Dissolveu-se o resíduo sólido em éter (450 ml) e, decorridos 10 minutos, filtrou-se a solução

105

através de uma almofada de filtraçao, para eliminar uma pequ£ na quantidade de uma impureza corada. Fez-se a nucleaçao da solução com cristais do produto desejado, obtidos numa reacçao anterior, e deixou-se em repouso durante a noite a 25°C. 0 diol cristalino 25 recolheu-se por filtraçao e concentrou-se o licor mae, para se obter uma segunda colheita. Cada colheita foi cui. dadosamente lavada com éter e secou-se, para se obter um total de 8,43 g (78,0%) de diol 25, sob a forma de cristais incolores (p.f. 129°-130°C).

^H-RMN (DMSO-d₆, 360 MHz): 2,21 e 2,55 (m, 2H, H2'), 2,56 (s, 3H, SCH₃), 3,53 (m, 2H,H5'), 3,82 (m, 1H, H3’), 4,02 (s, 3H, OCH₃), 4,36 (m, 1H,H4’), 4,90 (t, J=5,5, 1H, 5’0H), 5,30 (d, J»5,5, 1H, 3ΌΗ), 6,48 (d, J=4, 1H, H7), 6,55 (dd, J=8 e 6, 1H, Hl’), 7,48 (d, J=4, 1H, H8).

A recristalizaçao de uma amostra deste material, no seio de dicloro-metano contendo uma pequena quantidade de metanol, originou cristais com p.f. 130°-131°C.

C. PREPARAÇÃO DE 6-MET0XI-2-METIL-TI0-9-(5-0-TRIFENIL-METIL-

-2-DESOXI-ft-D-RIBOFURANOSIL)-7-DEAZAPURINA (24)

Secou-se azeotropicamente o diol 25 (7,2 g) fazeii do a sua dissolução em piridina seca e evaporando a solução até à secagem a 35°C. Dissolveu-se o resíduo em piridina seca (100 ml) e adicionou-se cloreto de trifenil-metilo (8,0 g), trietil-amina (4,0 ml), e 4-(dimetil-amino)-piridina (300 mg). Depois de se aquecer a mistura reaccional a 65°C, numa atmosfera de azoto, durante 30 minutos, efectuou-se uma segunda adi. çao de cloreto de trifenil-metilo (1,0 g) e manteve-se o aque

- 106 /

Λ qr cimento durante 16,5 horas. Depois de arrefecer, concentrou-se a mistura reaccional e repartiu-se o resíduo entre diclorometano e água. Extraíu-se a camada aquosa com diclorometano e lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com ácido clorídrico 0,3 N, com bicarbonato de sodio aquoso e com uma solução salina. Após a secagem, sobre sulfato de sódio e a concentração, purificou-se o produto bruto por cromatografia em gel de sílica com 0%, 1%, 1,5% e 2% de metanol em diclorometano, para se obter 12,1 g (94,5%) de éter mono-tritílico 26 sob a ίοχ ma de um produto vidrado incolor.

^-RMN (CDC1₃, 300 MHz): 2,58 (s, 3H, SCH₃), 2,42 e 2,62 (m, 2H, H2'), 3,37 (m, 2H, H5'), 4,04 (m, 1H, H3’), 4,08 (s, 3H, 0CH₃), 4,60 (m, 1H, H4'), 6,40 (d, J=4, 1H, H7), 6,68 (t aparente, J=7, 1H, Hl'), 7,00 (d, J=4, 1H, H8), 7,27 e 7,43 (m, 15H, trietil-H).

Estes dados obtiveram-se a partir de uma porção diferente do produto 26, preparada conforme atrás descrito.

D. PREPARAÇÃO DE 6-MET0XI-2-METIL-TI0-9-(5-0-TRIFENIL-

-METIL-2,3-DIDESOXI-ft-D-RIBOFURANOSIL)-7-DEAZAPURINA..(27)

Agitou-se, a 25°C, uma solução de éter tritílico (12,1 g), 4-dimetil-amino-piridina (9,2 g) e cloro-tiono-carbonato de fenilo (7,5 ml, Aldrich) em diclorometano seco (220 ml), durante 2 horas, numa atmosfera de azoto. Uma vez que a análise por CCF indicou que a reacçao estava incompleta, ad£ cionou-se cloro-tiono-carbonato de fenilo (4,0 ml) e agitou-se a mistura reaccional durante wds l hora. Diluiu-se a solução com

diclorometano (280 ml) e lavou-se, sequencialmente, com ácido clorídrico 0,5 N (500 ml), com hidróxido de sódio 0,5 N (500 ml), e com uma solução salina. Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se até à secagem.

Dissolveu-se o tionocarbonato bruto resultante, em tolueno seco (350 ml) e adicionou-se azo-iso-bis-butiro-n£ trilo (350 mg) e hidreto de tri-n-butil-estanho (10 ml), Aqwe ceu-se a solução resultante a 100°-105°C durante 10 minutos. Depois de arrefecer diluiu-se a solução com um pouco de éter e agitou-se com fluoreto de potássio aquoso a 10% (350 ml). Filtraram-se as duas camadas através de uma almofada de filtra gem (para se eliminar um sedimento escuro) e fez-se a separação. Lavou-se a camada orgânica com hidróxido de potássio 0,75 N e com uma solução salina, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do óleo resultante em gel de sílica com dicloro-metano/éter 1:1 e depois com dicloro-metano, originou 9,93 g (84,5%) de didesoxi-nucleosido 27 sob a forma de um sólido incolor (p.f. 122°-124°C).

^-RMN (CDC1₃, 360 MHz): 2,10, 2,33, e 2,43 (m, 4H, H2' e H3’), 2,60 (s, 3H, SCHg), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,08 (s, 3H, OCH₃), 4,29 (m, 1H, H4'), 6,36 (d, J=3,7, 1H, H7), 6,53 (dd, J=7 e 4, 1H, Hl’), 7,09 (d, J=3,7, 1H, H8), 7,25 e 7,45 (m, 15H, tritil-H).

E. PREPARAÇÃO DE 7-IODQ-6-METOXI-2-METIL-TIO-9-(5-O-

-TRIFENIL-METIL-2,3-DIDES0XI-ft-D-RIB0FURAN0SIL)-7-DEAZAPURINA (28)

Adicionou-se N-iodo-succinimida (10,0 g) a uma s£ /

108

luçao da deazapurina 27 (9,9 g) em dimetil-formamida seca (550 ml). Depois de se agitar, no escuro, numa atmosfera de azoto, durante 16 horas, adicionou-se bicarbonato de sódio aquoso a 10% (2,5 ml) e concentrou-se a mistura reaccional no vácuo a 50°C, para se obter um volume de 100 ml. Repartiu-se esta solução entre água e acetato de etilo. Lavou-se a camada orgânica com hidro-sulfito de sódio aquoso a 5% e com uma solução salina, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto ligeiramente impuro em gel de sílica com dicloro-metano, originou 11,68 g (95,6%) do iodeto 28, sob a forma de um produto sólido vidrado incolor.

^-RMN (CDC1₃, 300 MHz): 2,06, 2,24, e 2,41 (m, 4H, H2’ e H3 ’ ) , 2,58 (s, 3H, SCH₃), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,10 (s, 3H, OCH₃), 4,29 (m, ΙΗ, H4'), 6,47 (dd, J=6 e 4, 1H, Hl’), 7,19 (s, ΙΗ, H8), 7,30 e 7,46 (m, 15H, tritil-H).

Estes dados obtiveram-se a partir de uma porção diferente de 28, preparado conforme anteriormente descrito.

F. PREPARAÇÃO DE 7-IODO-2-METIL-TIO-9-(5-O-TRIFENIL-METIL-

-2,3-DIDES0XI-^-D-RIB0FURAN0SIL)-7-DEAZAPURI-4-0NA (2£)

Preparou-se tio-cresolato de sódio adicionando metóxido de sódio (1 equivalente) a uma solução de tio-cresol em metanol e evaporando depois até à secagem. Fez-se o refluxo de uma mistura de éter metílico 28 (4,0 g) tio-cresolato de sódio (4,0 g) e hexa-metil-fosforamida (10 ml) em tolueno seco (150 ml), numa atmosfera de azoto, durante 4,5 horas. Depois de arrefecer repartiu-se a mistura entre acetato de etilo e água. Lavou-se a camada orgânica com água e com uma solução sa.

109 lina, secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se até à secagem. A cromatografia do produto bruto resultante em gel de sílica com metanol em dicloro-metano a 0% e 2% , originou

3,80 g (97,0%) de deazapurinona 29, sob a forma de um sólido vidrado incolor.

^-RMN (CDClg, 360 MHz): 2,05, 2,25, e 2,42 (m, 4H, H2’ e H3’), 2,60 (s, 3H, SCHg), 3,30 (m, 2H, H5’), 4,28 (m, IH, H4‘), 6,40 (dd, J=7 e 4, IH, Hl’), 7,05 (s, IH, H8), 7,30 e 7,46 (m, 15H, tritil-H), 10,00 (s largo, IH, Hl).

G. PREPARAÇÃO DE 7-I0D0-5'-O-TRIFENIL-METIL-2*,3’-DIDESOXI-7-DEAZAGUANOSINA (3Ú)

Adicionou-se ácido meta-cloro-peroxi-benzóico (1,23 g; 85%; Aldrich) a uma solução agitada de éter tiometílico 29 (3,6 g) em diclorometano seco (150 ml), a 0°C numa atmosfera de azoto. Decorridos 15 minutos, removeu-se o banho de arrefecimento e manteve-se a agitaçao a 25°C durante 40 minutos. Lavou-se esta solução em bicarbonato de sódio aquoso e com uma solução salina e secou-se sobre sulfato de sódio. Adicionou-se metanol (dois por cento em volume) e fez-se passar a solução resultante através de uma estreita para remover as impurezas polares almofada de gel de sílica,

Dissolveu-se o sulfóxido bruto resultante (3,07 g) em dioxano (40 ml) e colocou-se numa bomba revestida com vidro. Adicionou-se amónia (10,0 g) e aqwe ceu-se a mistura a 100°C, durante 2 horas, numa autoclave. Eva. porou-se a solução resultante até à secagem. Dissolveu-se o resíduo em dicloro-metano (20 ml) e filtrou-se através de uma almofada de filtragem. Adicionou-se metanol (40 ml) à solução e, ao arrefecer, cristalizaram 1,57 g de um produto incolor.

110

Evaporou-se o licor-mae e purificou-se por cromatografia líqui da de pressão média em gel de sílica com metanol em dicloro-metano a 52 para se obter mais 328 mg de produto, sob a forma de cristais incolores. A produção total de deazaguanosina foi de 1,90 g (55,42).

¹H-RMN, (CDClg, 300 MHz): 2,05, 2,23, e 2,35 (m, 4H, H2’ e H3’), 3,29 (m, 2H, H5’), 4,26 (m, 1H, H4‘), 5,90, (s largo, 1H, NH₂), 6,24 (dd, J=7 e 4, 1H,H1'), 6,90 (s, 1H, H8), 7,30 e 7,46 (m, 15H, tritil-H) 10,90 (s largo, 1H, Hl). A recristalizaçao de uma amostra deste material no seio de metanol/dicloro-metano, originou cristais de p.f. 201°-203°C.

H. PREPARAÇÃO DE 2’,3’-DIDESOXI-7-IODO-7-DEAZAGUANOSINA (Jl)

Agitou-se uma solução de éter tritílico 30 (1,7 g) em ácido fórmico (12 ml), à temperatura ambiente, durante 10 minutos. Depois evaporou-se rapidamente a suspensão amarela resultante, até à secagem no vacuo a 30°C. A cromatografia do

resíduo em gel de sílica com metanol em dicloro-metano a 52, e 102, originou 940 mg de um sólido incolor. A trituração deste sólido no seio de éter contendo um pouco de dicloro-meta.

no, originou 838 mg (81,02) de nucleosido 31, sob a forma de cristais incolores.

¹H-RMN (DMS0-d₆, 360 MHz): 1,95, 2,09, e 2,26 (m, 4H, H2’, e H3’), 3,48 e 3,54 (m, 2H, H5’), 3,98 (m, 1H, H4 ’ ) , 4,90 (t largo, J=5, 1H, 5’0H), 6,08 (m, 1H, Hl’), 6,32 (s lar go, 2H, NH₂), 7,12 (s, 1H, H8), 10,46 (s largo, 1H, Hl).

111 y

I. PREPARAÇÃO DE 7-(3-TRIFLUORO-ACETAMIDO-l-PROPINIL)-2', *-DIDESOXI-7-DEAZAGUANOSINA (Λ2)

Durante 2,25 horas fez-se o acoplamento de iodeto (376 mg; 1,00 mmole) a N-propargil-trifluoro-acetamida, pje lo método geral apresentado no Exemplo 5C. 0 produto e o material de partida não se distinguiram por CCF, pelo que se fez o controlo da reacçao por HPLC de fase inversa (10 cm ODS, 1 ml/minuto, gradiente variando desde 100% de água até 100% de metanol durante 5 minutos, depois 100% de metanol, com detecção UV a 280 nm; iodeto de partida 31, 5,49 minutos; produto 32, 5,75 minutos; produto intermédio 6,58 minutos). 0 produto bru. to era fracamente solúvel em dicloro-metano, pelo que se concentrou, no seio de uma solução de dicloro-metano/metanol sobre 5 g de gel de sílica, antes de se carregar a coluna de cro matografia. A eluiçao com metanol em diclorometano a 2%, 5%, 7% e 10%, originou 300 mg (78%) de nucleosido de alcinil-amino 32, sob a forma de um sólido amarelo.

¹H-RMN (DMSO-dg, 360 MHz): 1,96, 2,08, e 2,28 (m, 4H, H2’ e H3’), 3,47 e 3,55 (m, 2H, H5’), 3,99 (m, 1H,H4'), 4,22 (s largo, 2H, -CH₂-), 4,90 (t, J=5, 1H, 5'0H), 6,09 (dd, J=6 e 4, 1H, Hl’), 6,33 (s largo, 2H, NH₂), 7,30 (s, 1H, H8), 10,05 (s largo, 1H, NHTFA), 10,50 (s largo, 1H, Hl), ^-desligado ¹³C-RMN (DMSO-dg): 155,5 (q, J=36,5, trifluoro-acetil-carbonilo), 157,8, 153,1 e 149,9 (C2, C4 e C6), 122,6 (C8), 115,9 (q, J=288, CF3), 99,4 e 97,5 (C7 e C5), 84,2 e 77,4 (acetilénico), 83,2 e 81,0 (Cl’ e C4'),

62,9 (C5’), 29,7 (propargílico), 31,8 e 25,8 (C2* e C3’). Estes 13 dados C-RMN obtiveram-se a partir de uma porção diferente de

112

C

32, preparado conforme anteriormente descrito.

J. PREPARAÇÃO DE 5*-TRIFOSFATO DE 7-(3-AMINO-l-PROPINIL)-2¹,3'-DIDESOXI-7-DEAZAGUANOSINA (7-AP3-ddc7GTP)

Converteu-se o nucleosido de alcinil-amino 32, (0,90 mmole) no correspondente 5’-trifosfato e, posteriormente, eliminou-se o grupo protector trifluoro-acetilo, seguindo o procedimento geral apresentado no Exemplo 5F. Após a segunda adiçao do oxicloreto de fósforo, agitou-se a mistura reaccional durante mais 165 minutos. Admitindo um coeficiente de absorção para o produto igual ao do material de partida (11 900), o rendimento de 7-AP3-ddc7GTP, baseado na sua absorçao a 272,5 nm, foi de 18%.

EXEMPLO 8

PREPARAÇÃO DE 5*-TRIFOSFATO DE 7-(3-AMIN0-l-PR0PINIL)-2¹,3 *-DIDES0XI-7-DEAZA-ADEN0SINA (7-AP3-ddc7ATP)

A. PREPARAÇÃO DE 2'-ACETOXI-3'-BR0M0-5'-(2-ACET0XIIS0BUTIRID-ADENOSINA (11)

Durante 15 minutos, adicionou-se brometo de 2-ace^ toxi-isobutirilo (19,5 ml; 150 mmole;5 equivalentes, preparado de acordo com o processo de Russell e outros; J. Am. Chem. Soc.; 95; 1973; p. 4016-4030), a uma suspensão de tubercidina (7-deaza-adenosina, 6,66 g, 25,0 mmol, Sigma) em acetonitrilo seco (250 ml Aldrich). 0 sólido em suspensão dissolveu-se em

113 cerca de 5 minutos e agitou-se a mistura reaccional numa atmos. fera de azoto, durante 22 horas, a 25°C. Adicionou-se a mistura reaccional a uma solução de hidrogeno-fosfato de dipotássio (43,55 g; 300 mmole, 6 equivalentes) em água (400 ml). Depois de se agitar durante 30 minutos, extraíu-se a mistura reaccional com acetato de etilo (1 x 400 ml e 2 x 200 ml). Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de magnésio e evaporaram-se até à secagem, para se obter 14,73 g (11,8%) de

uma espuma branca. Este material era de pureza superior a 95% e uma mancha ligeiramente alargada por CCF (com detecção UV), mas o espectro RMN mostrou que estavam presentes um produto principal e pelo menos um produto secundário. 0 espectro RMN era consistente com o facto de o produto principal ser bromo

-acetato 33.

^H-RMN (DMSO-d^) para o componente principal 33: 8,08 (s, 1H, H2), 7,34 (d, J=3,7, 1H, H8), 7,12 (s largo, 2H, NH₂), 6,70 (d, J=3,7, 1H, H7), 6,32 (d, J=3,8, 1H, Hl’), 5,61 (dd, J=2,4 e 3,8, 1H, H2’), 4,89 (dd, J=2,4 e 4,5, 1H, H3’), 4,43 (m, 1H, H4’), 4,35 (dd, J=12 e 4, 1H, H5’a), 4,29 (dd, J»12 e 7, 1H, H5'b), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 3H, OAc), e 1,49 (s, 6H, 2CH₃).

B. PREPARAÇÃO DE 2 *,3'-DIDES0XI-2', 3'-DIDE-HIDR0-7-DEAZA-

ADENOSINA (M)

Preparou-se o par zinco-cobre lavando rapidamente (tempo total decorrido de cerca de 10 minutos) pó de zinco (20 g, Mallinkrodt) com ácido clorídrico 1 N (3 x 50 ml), água (2 x 50 ml), sulfato de cobre a 2% (2 x 50 ml), água (4 x 50 ml),

- 114/-rj-

etanol (3 x 50 ml) e éter (2 x 50 ml). Durante cada lavagem agitou-se o pó de zinco num funil vidrado até ficar em suspensão e removeu-se o produto da lavagem por sucção, enquanto se minimizava a exposição do zinco ao ar. Secou-se o par em vá cuo, durante 30 minutos. Dissolveu-se o anterior bromo-acetato bruto (14,63 g) em dimetilformamida seca (150 ml, Aldrich)

e eliminou-se cerca de 25 ml de dissolvente com um evaporador rotativo /~45°C; a 2 torr 2 x 101325/760 N m . Adicionou-se o par zinco-cobre recentemente preparado (14,63 g, aproximadamente 9 equivalentes) e agitou-se a suspensão resultante, numa atmosfera de azoto a 25°C. Conforme a qualidade do par zinco-cobre, esta reacçao pode apresentar um período de indução e/ou uma taxa variável, pelo que se deixou a reacçao evoluir até que a CCF (diclorometano/metanol/hidróxido de amónia con centrado 90:9:1; material de partida R^=0,45 e para os produtos Rf=0,39 e 0,36) indicou que o material de partida tinha sjL do completamente consumido. No caso corrente a reacçao comple-

tou-se em menos de 15 minutos. Decorridos 100 minutos, adicionou-se, à mistura reaccional cuidadosamente, bicarbonato de sódio aquoso saturado (75 ml), durante 10 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional através de um filtro que se lavou com metanol (2 x 50 ml). Evaporaram-se os filtrados combinados até à secagem e repartiu-se o resíduo entre água (150 ml) e acetato de etilo (150 ml). Extraíu-se a camada aquosa com acetato de etilo (2 x 100 ml) e secaram-se os extratos orgânicos combinados sobre sulfato de magnésio, concentraram-se, e secaram

-se no vácuo durante 1 hora.

Dissolveu-se em metanol (100 ml) o produto semi115

Λ

-sólido laranja escuro resultante e depois adicionou-se água (25 ml) e resina Rexyn 201 (29 g; 4,3 meq/g; 5 equivalentes, na forma de hidróxido). Fez-se o refluxo da mistura reaccional durante 210 minutos, 0 controlo por CCF (diclorometano/metanol/ /hidróxido de amónia concentrado 85:13:2: éster intermediário, R^=0,49; produto final 34, 0,24) indicou que a reacçao tinha cessado rapidamente apos 70% de conversão, isto é, decorridos

165 minutos, e adicionou-se mais 29 g de resina. Sem arrefecer eliminou-se a resina por filtraçao e lavou-se com diclorometano/metanol 1:1 (2 x 75 ml). Evaporaram-se os filtrados combinados até à secagem e recristalizou-se o sólido púrpura resultante no seio de isopropanol em ebulição (150 ml) para se obter 3,778 g de olefina 34 sob a forma de agulhas branco sujo (p.f. 205°-206°C). Obteve-se uma segunda colheita de 0,631 g (agulhas púrpura ténue, p.f. 202°-203°C) por concentração dos licores mae até 25 ml. Verificou-se que ambas as colheitas (total de 4,409 g; 76%) eram homogéneas por CCF e puras por RMN com excepçao de um ligeiro vestígio de isopropanol.

^H-RMN (DMSO-dg): 8,07 (s, IH, H2), 7,15 (d, J=3,6, IH, H8), 7,12 (s largo, IH, Hl'), 7,01 (s largo, 2H, NH₂), 6,57 (d, J=3,6, IH, H7), 6,43 e 6,02 (d largo, J=6,0, IH cada, H2’ e H3’), 4,95 (t, 0==6,5, IH, 5’0H), 4,79 (m, IH, H4’), e 3,52 (m, 2H, H5’).

C. PREPARAÇÃO DE 2 ' , 3 '-DIDES0XI-7-DEAZA-ADEN0SINA (35.)

Encheu-se uma garrafa de Parr de 450 ml com olefi na 34 (3,80 g), etanol (76 ml), paládio em carvao a 10% (380 mg, Aldrich) e hidrogénio a 40 psi (40 x 6,89 x 10 Pascal).

116

Depois de se agitar durante 4,67 horas a 25°C tinham sido absor. vidas 14,5 psi (14 ,5x6,89x10 Sscál ) de hidrogénio e cessara a libertação deste gás. A cromatografia em camada fina (duas eluiçoes com diclorometano/metanol/hidróxido de amónio concen trado 85:13:2 ; material de partida 34, 0,45; produto 35, 0,48) indicou a conversão completa num novo produto unico activo sob ultra-violetas. Removeu-se o catalisador por filtraçao num fil^ tro e lavou-se com etanol. A eliminação do dissolvente do fil trado e a secagem no vácuo durante a noite originaram 3,98 g (104%) de didesoxi-nucleosido 35 sob a forma de uma espuma branca. 0 espectro RMN indicou que o produto era homogéneo com excepçao da presença de 8% em peso de etanol (rendimento corrigido de 96%). Porçoes semelhantes deste material resistiram à cristalização e tornaram-se extremamente higroscópicas na se. cagem azeotrópica com dissolventes anidros. Por isso armazenoui -se este material em vácuo durante aproximadamente uma semana e utilizou-se quando o espectro RMN indicou que o material coii tinha 5% em peso de etanol. A falta de cristalinidade e as ca. racterísticas espectrais observadas para este produto estão de acordo com as descritas anteriormente por Robins e outros; Can. J. Chem.”; 55, 1977; p. 1259.

^-RMN (DMSO-dg): 8,04 (s, ΙΗ, H2), 7,33 (d, J=3,6, ΙΗ, H8), 6,97 (s largo, 2H, NH^, 6,56 (d, J=3,6, ΙΗ, H7), 6,34 (dd, J=5,2 e 6,4, 1H, Hl’), 4,96 (t, J=5,6, 1H, 5’0H) 4,33 (t, J=5,l, 0,43H, etanol 0H), 4,04 (m, ΙΗ, H4’), 3,4-3,6 (m, 2,86H, H5' e etanol CH₂), 2,33, 2,21 e 2,02 (m, 4H, H2’ e H3'), e 1,06 (t, J=7,0, 1,3H, etanol CH₃).

/

117

D· PREPARAÇÃO DE 7-IODO-2*,3'-DIDESOXI-7-DEAZA-ADENOSINA (36.)

Aqueceu-se uma solução, agitada mecanicamente, de didesoxi-nucleosido 35, 95% puro (2,95 g; 11,96 mmole), acetato de sódio anidro (4,13 g; 50,3 mmole, 4 equivalentes) e acetato de mercúrio (3,81 g; 11,95 mmole; 1,00 equivalentes; Fisher, 99,9%) em água (190 ml), numa atmosfera de azoto a 65°C, durante 2 horas. Depois de se arrefecer para 25°C a suspensão branca de mercúrio resultante, adicionou-se iodo (4,79 g; 18,9 mmole; 1,6 equivalentes) e acetato de etilo (190 ml). Decorrida 1 hora tinha sido consumido o produto mercurial em suspensão e permanecia uma solução púrpura límpida. Decorridas 2 horas adi cionou-se sulfito de sódio (6,35 g) e desapareceu a côr púrpura. Depois de se agitar durante 30 minutos fez-se borbulhar suavemente ácido sulfídrico na mistura reaccional durante 15

minutos. Precipitou-se o sulfureto de mercúrio (um coloide pre. to) e o iodeto 36 (um pó branco). A precipitação completa do mercúrio (II) verificou-se por CCF controlando o desaparecimeri to de uma das duas principais manchas activas sob a acçao de ultra-violetas. Filtrou-se a mistura reaccional através de um filtro e separou-se em duas camadas

Lavou-se o filtro com ace tato de etilo em ebulição (9 x 100 ml) até que a CCF indicou que já nao se extraía mais produto. Lavou-se cada extracto de acetato de etilo com a camada aquosa. As camadas de acetato de etilo combinadas secaram-se sobre sulfato de magnésio e evaporou-se até à secagem. 0 sólido bruto resultante tornou-se vermelho por exposição ao ar. Dissolveu-se este material em diclo rometano/metanol 3:1 (100 ml) e adicionou-se a forma de base livre de uma resina de permuta de anioes fracamente alcalina

(5,0 g; BioRad AG3 X4A, 2,9 meq/g seca). Fez-se borbulhar ácido sulfídrico na solução vermelha durante 10 minutos e eliminou-se a côr vermelha. Eliminou-se uma turvaçao ligeira aquecendo rapidamente e filtrou-se imediatamente a solução através de uma almofada de 2 cm (15 g) de gel de sílica. Eluiu-se o gel de sílica com mais diclorometano/metanol 3:1 (100 ml). Ad£ cionou-se gel de sílica (50 g) ao filtrado e fez-se borbulhar ácido sulfídrico durante 10 minutos. Removeu-se o dissolvente desta mistura com um evaporador rotativo e secou-se o gel de sílica por evaporaçao conjunta com clorofórmio (200 ml). Com este gel de sílica carregou-se rapidamente uma coluna de gel de sílica (500 g) a qual havia sido desgaseifiçada com uma co£ rente de azoto. A eluição, numa atmosfera de azoto, com metanol em dicloro-metano a 5% (6 litros) e 10% (4 litros), originou 2,92 g (64%) de iodeto 36 sob a forma de um pó branco e 456

mg (7,5%) de 7,8-di-iodo-2’,3’-didesoxi-7-deaza-adenosina de polaridade inferior. A recristalizaçao do produto principal no seio de acetato de etilo em ebulição (200 ml), originou 2,626 g de agulhas brancas (p.f. 158°-160°C). A concentração dos li_ cores mae para 10 ml, originou uma segunda colheita de 0,391 g de agulhas vermelho claro (p.f. 156°-158°C). Ambas as colhei tas se apresentaram homogéneas de acordo com o espectro RMN e com a CCF e em conjunto apresentaram um rendimento global de 64% a partir da olefina 34.

^-RMN (DMSO-d₆): 8,09 (s, IH, H2), 7,67 (s, IH,

H8), 6,65, (s largo, 2H, NH₂), 6,34 (dd, J=^ e '6,8, IH, Hl’), 4,95 (t, J=5,5, IH, 5*0H), 4,04 (hept aparente, J=3,5, IH, H4*),

3,59 e 3,49 (m, IH, H5’), 2,30, 2,28 e 2,00 (m, 4H, H2’ e H3’).

119

E. PREPARAÇÃO DE 7-(3-TRIFLU0RQ-ACETAMID0-l-PR0PINIL)-2’,

3¹-DIDESOXI-7-DEAZA-ADENOSINA (32)

Durante 90 minutos fez-se o acoplamento de iodeto (720,3mg ; 2,00 mmole) com N-propargil-trifluoro-acetamida, seguindo o processo normalizado apresentado no Exemplo 5C. A cromatografia com metanol em dicloro-metano a 7%, originou 705,8 mg (92%) de produto 37 na forma de um pó branco sujo que se verificou ser homogéneo, de acordo com o espectro RMN e por CCF. A recristalizaçao no seio de acetato de etilo em ebulição (10 ml), originou 372 mg de microcristais brancos (p.f. 169°-171°C).

^-RMN (DMSO-dg): 10,1 (t distorcido, 1H, NHTFA), 8,10 (s, 1H, H2), 7,78 (s, 1H, H8), 6,0-7,5 (s muito largo, NH₂), 6,34 (dd, J=4,5 e 7,0,lH, Hl’), 4,98 (t, J=5, 1H,5’OH), 4,31 (s ligeiramente alargado, 2H, -CH₂N-), 4,10 (hept aparente, J=3,5, 1H, H4’), 3,60, e 3,40 (m, 1H, H5’), 2,37, 2,18 e 2,00 (m, 4H, H2’ e H3’). CCF (diclorometano/metanol/hidróxido de amónia concentrado 90:9:1 ; UV): iodeto de partida 36, Rf= =0,36; produto 37, R^=0,26).

F. PREPARAÇÃO DE 5’-TRIFOSFATO DE 7-(3-AMIN0-l-PR0PINIL)-

-2',3’-DIDES0XI-7-DEAZA-ADEN0SINA (7-AP3-ddc7ATP)

Converteu-se o nucleosido alcinil-amino 37 (1,00 mmole) no correspondente 5¹-trifosfato e eliminou-se o grupo trifluoro-acetilo, de acordo com o processo geral descrito no Exemplo 5E. Após a adiçao da segunda aliquota de oxi-cloreto de fósforo, agitou-se a solução durante 120 minutos. Presumindo um coeficiente de absorçao para o produto igual ao do mate120 rial de partida (12 700), o rendimento em 7-AP3-ddc7ATP, baseado na absorçao a 279,5 nm, foi de 40%.

^-RMN (D₂0): 7,97 (s, 1H, H2), 7,80 (s, 1H, H8), 6,33 (m, ΙΗ,ΗΓ), 4,44 (m, 1H,H4’), 4,27 (m, 1H, H5’a), 4,14 (m, 1H, H5’b), 4,11 (s largo, 2H, -CH₂-), 2,6-2,0 (m, 4H, H2’ *31 e H3 ’),mais'os picos (trietil-amónio) do iao contrário. P-RMN (D₂0): -8,59 (d largo, J=20, IP), -9,56 (d, J=20, IP), e -21,38 (m, IP). UV (pH 8,2 Tris aq): máximos a 238 e 279,5 nm.

EXEMPLO 9

Processo Geral de Acoplamento para a Preparaçao de um Terminante de Cadeia Marcado por Fluorescência

Preparaçao de um Terminante T: 5-(SF-505-Sar-AP3) ddUTP

Extraíu-se a amina 5-(AP3)ddUTP (60 micromole) do Exemplo 6C com água (0,300 ml) e diluiu-se com DMF (0,600 ml). Adicionou-se uma solução de reagente de corante de marcaçao Ac2EtSF-505-Sar-NHS (72 mg; 126 micromole) do Exemplo 1E, em DMF (0,600 ml), e agitou-se a mistura a 50°C durante 4 horas. Adicionou-se amónia aquosa concentrada (1,5 ml), tapou-se o frasco hermeticamente, e manteve-se o aquecimento a 50°C duran. te 20 minutos. Diluiu-se a solução vermelha resultante até 60 ml com água e aplicou-se a uma coluna de DEAE-Sephadex A-25-120 (leito de 1 x 35 cm) que tinha sido equilibrada com TEABaquoso 2,0 M de pH 7,7 (50 ml) e depois com TEAB aquoso 0,2 M de pH 7,7 (50 ml). Eluiu-se a coluna com TEAB aquoso de pH 7,7

de gradiente linear: desde 0,2 M (150 ml) até 2,0 M (150 ml). O processamento da coluna efectuou-se a 100 ml/hora, recolhen. do-se as fracções de 3 em 3 minutos. Fez-se o controlo do elu. ente por absorçao a 510 nm (40 AUFS). Fez-se primeiro a eluiçao das bandas de dois sub-produtos inferiores seguindo-se a banda do produto mais forte com resolução próximo da linha de base. Combinaram-se as fracções que se admitiu conterem prodii to puro e extraíram-se (T <30°C), fez-se a evaporaçao conjunta com etanol absoluto (3x), e depois extrairam-se com um pequeno volume de água (5,2 ml). Analisou-se a solução por absorçao na zona do visível (pH 8,2 tris-tampao aquoso 50 mM) e liofilizou-se. Uma solução diluída do produto apresentou o máximo de absorçao a 491 nm. A produção, calculada admitindo o coeficiente de absorçao do corante livre (72 600), foi de 31 micromoles (51%). Prepararam-se também compostos de terminante de cadeia marcada por fluorescência, de acordo com o procedimento geral descrito. A nomenclatura da Tabela 1 representa o espaça-

dor marcado por fluorescência (por exemplo SF-512-Sar) e os ma. teriais ligantes de didesoxi-nucleotido (AP3-ddNTP) que se pre pararam nos exemplos anteriores e se combinaram de acordo com o procedimento geral, para preparar novas composiçoes uteis para a sequenciação de ADN.

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EXEMPLO 10

Sequência parcial de Base ADN do Bacteriófago M13, Utilizando um Protocolo de Elongaçao de Cadeia de Sanger Modificado, com Terminantes de Cadeia Marcados por Fluorescência

A. Reacções de Elongaçao de Cadeia de ADN Modificado.

Em cada um de quatro tubos de plástico Eppendorf de 1,5 ml colocou-se uma quantidade de 3 microgramas do modelo de bacteriófago M13 mp 18 ADN (New England Biolabs; 0,25 pg/pl) e 60 pg (-40) de sistema escorvador (New England Biolabs; 7,5 jug/jul). Depois aqueceu-se cada tubo, durante 2 minutos, num banho de água em ebulição e arrefeceu-se imediatamen te sobre gelo húmido, durante 5 minutos. Após 1 impulso de rç> taçao de 1 segundo num micro-centrifugador, à temperatura am biente, adicionou-se a cada tubo e misturou-se 8 jil de 1 tampao de 5x a reacçao (tris-HCl 0,3 M, pH 8,3; NaCl 0,375 M; MgC^ 37,5 mM; ditio-treitol 2,5 mM) , 10 pl de 1^0 da pureza do reagente, 1 pl de uma solução contendo os trifosfatos de adenosina, timidina, citosina, e guanosina a 25 pM cada (Pha£ macia), e 1 pl de transcriptase inversa (vírus da mieloblasto se das aves: New England Nuclear; 15 unidades/pl). Incubaram-se os tubos a 37°C durante 10 minutos. Adicionaram-se aos qua. tro tubos 4 pl de soluçoes 200 pM dos terminantes de cadeia marcados por fluorescência do Exemplo 9; um tubo recebeu 7-(SF505-Sar-AP3)ddc7GTP, outro recebeu 7-(SF512-Sar-AP3)ddc7ATP, outro recebeu 5-(SF519-Sar-AP3)ddCTP, e o quarto recebeu

124

5-(SF526-Sar-AP3)ddTTP. Incubaram-se os tubos a 42°C durante minutos. Preparou-se uma mistura de 22 pl a partir de cada um dos quatro tubos e fez-se passar através de uma coluna de rotaçao 5-25 Select-D (Superior 5—»Superior 3; Philadelphia), a qual tinha sido lavada previamente com 1^0 da qualidade do reagente, para se separar os terminantes de cadeia marcados por fluorescência não incorporada nas cadeias de ADN alonga das marcadas por fluorescência, na mistura lheu-se o efluente da coluna e secou-se em uma quantidade de 0,5 ml de etanol a 70% e reaccional. Recovacuo. Adicionou-se fez-se rodar o tubo durante 5 segundos. Depois centrifugou-se o tubo durante minutos num micro-centrifugador, secou-se em vacuo a massa de ADN, e /25 mM de fez-se nova suspensão com 10 jil de formamida a 95%/ EDTA. Aqueceu-se o tubo a 65°C durante 7 minutos num banho de da amostra de água e, com uma micro-pipeta, colocaram-se 10 jil

8% pré-condicit)

ADN sobre uma poli-acrilamida a nada: bis (19 :1) gel (15 cm x 40 cm x 0,35 mm) contendo ureia

8,3M e tampao lx

TEAB. Fez-se a electroforese da amostra a 27 watts conforme a seguir descrito em B.

B· Electroforese da Cadeia de ADN Marcada por Fluorescência pre-condicionamento do gel consistiu na exposji çao do gel a uma corrente contínua de 27 watts (aproximadamen te 2 000 volts) durante cerca de 30 minutos antes da amostra ali ser colocada. Durante este período, a temperatura da superfície do gel estabilizou a 49°C.

Durante a electroforese o gel vertical foi irradiado por um laser de ioes de argon (Modelo Omnichrome 532)

125

numa região 28 cm abaixo da origem da carga da amostra. Fez-se passar os raios laser através de um filtro de riscas de 488 nm (Barr Associates) o que impediu que outros comprimentos de onda atingissem o gel. A corrente final do laser sobre a superfície do gel foi de 35 mW com um diâmetro aproximado de 1 mm.

A detecção das emissões fluorescentes a partir das cadeias de ADN marcadas por fluorescência conseguiu-se com dois tubos fotomultiplicadores (TFM; Hamamatsu R1612) com uma tensão de -950 V cada. Os filtros selectivos dos comprimentos de onda (Barr Associates) colocaram-se entre as emissões fluo, rescentes e os dois TFM, de modo que um filtro associado a um TFM permitiu a passagem de emissões no intervalo compreendido entre 496 e 528 nm enquanto o outro filtro, associado com o segundo TFM permitia a passagem de emissões compreendidas no intervalo 522 e 553 nm. Além disso colocou-se uma abertura de recepção de fibra óptica (Incom) no percurso da luz entre as emissões fluorescentes e os filtros selectivos dos comprimentos de onda, para limitar o meio ângulo de detecção para um valor inferior a 22° aproximadamente. Os sinais de cada TFM foram digitalizados separadamente após a pre-amplificaçao e obtiveram-se dados de ambos os TFM simultaneamente, de 5 em segundos. Armazenaram-se os dados digitalizados num ficheiro sequencial, por meio do equipamento de controlo do sistema (Hewlett-Packard 9000, Modelo 20).

C. Sequência Parcial do Bacteriófago M13

Os dados derivados das·emissões fluorescentes, du

126 rante a electroforese das cadeias de ADN M13 mp 18 marcado por fluorescência, analisaram-se de acordo com métodos conhe eidos. Como ilustração apresenta-se, na Tabela 2, uma sequên. cia parcial de nucleosido.

Tabela 2

Sequência Parcial do Nucleosido de M13 mp 18

Numero

Proporção

Base

Nucleosido (em peso)

0,14

0,90

0,19

0,78

0,75

0,80

0,75

0,35

1,88

0,89

0,32

1,88

1,92

0,33

0,36

0,81

1,89

T

0,16

- 127

Os dados mostram claramente que se deduz um intervalo de proporçoes distinto e estreito correspondente a cada um dos quatro nucleosidos no ADN de M13 mp 18.

EXEMPLO 11

A. Preparaçao de l-(2-hidroxi-etoxi-metil)-5-iodocitosina (5-IAcyC)

Fez-se o refluxo de uma mistura de l-(2-hidroxi-etoxi-metil)-citosina (AcyC) (1,85 g; 10,0 mmole) e acetato de mercúrio (3,35 g; 10,5 mmole) em metanol (50 ml) e cloreto de metileno (100 ml). Adicionou-se iodo (3,05 g; 12,0 mmole) e agitou-se a mistura durante 1 hora. Adicionou-se a forma de base livre da resina AG3x4 (38 meq) e fez-se borbulhar ácido sulfídrico na solução durante 15 minutos. Eliminaram-se os sólidos por filtraçao e colocou-se o filtrado sobre gel de s lica (10 g). Com a sílica carregou-se uma coluna de gel de s lica (4 x 25 cm) e eluiu-se com cloreto de metileno/metanol num gradiente por passos (20:1—> 10:1 —> 5:1). A evaporaçao, seguida de secagem em vácuo, originou um sólido incolor (1,73 g; 56%).

A recristalização no seio de etanol a 95% originou material analiticamente puro. p.f. 172°C. Análise: Calculado: C(7)H(10)N(3)0(3)I(l)7 C 27,03, H 3,24, N 13,51. Encontrado: C 27,08, H 3,41, N 13,51. UV (MeOH): max 292,5 (5.300). RMN (DMS0-d₆): delta 3,481 (m, 4H), 4,659 (t, J=5 hz, 1H), 5,070 (s, 2H), 6,665 (s largo, 1H), 7,869 (s largo,

1H), e 8,107 (s,lH).

128 •t

Β. Preparaçao de l-(2-hidroxi-etoxi-metil-5-(3-trifluoro-acetamido-l-propinil)-citosina (5-(TFA-AP3) AcyC)

Submeteu-se l-(2-hidroxi-etoxi-metil)-5-iodocitosina (311 mg; 1,00 mmole) ao procedimento geral de acoplamento descrito no Exemplo 9. A cromatografia intermitente em gel de silica (3 x 20 cm), eluindo com cloreto de metileno/metanol num gradiente por passos (20:1 —> 10:1 —5:1), originou o prç> duto sob a forma de uma espuma amarelo ténue (77,4 mg, 23%). ¹H-RMN (DMS0-d₆): 3,472 (s largo, 4H), 4,276 (d, J=5,0 hz, 2H), 4,653 (t largo, J=4,5 hz, IH), 5,091 (s, 2H), 6,925 (s largo, IH), 7861 (s largo, IH), 8,037 (s, IH), e 9,964 (s largo, IH).

C. Preparaçao de l-(2-hidroxi-etoxi-metil)-5-(3-amino-l-propinil)-citosina

Converteu-se em trifosfato o grupo hidroxilo da parte açúcar do nucleosido alcinil-amino (5-(TFA-AP3) AcyC) (0,167 mmole) e removeu-se o grupo trifluoro-acetilo, seguindo o prq cedimento geral apresentado no Exemplo 5E. Após a adiçao da segunda aliquota de oxicloreto de fósforo, deixou-se a fosf£ rilaçao evoluir durante 75 minutos. Admitindo um coeficiente de absorçao para o produto igual ao do material de partida (7 790), o rendimento em trifosfato, baseado na sua absorçao de UV a 291 nm, foi de 21%.

EXEMPLO 12

Preparaçao de um Derivado de Timidina Marcado com um

Corante Protegido (R^=Rn=H)

A. Preparaçao de 5¹-desoxí-5*-(metil-amino)-timidina

129

Colocou-se 5'-0-(jj~tolueno-sulf onil)-timidina (19,8 g; 50 mmole) numa caldeira, na qual se condensou a mono-metil-amina (250 g). Vedou-se o recipiente e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 3 dias. Arrefeceu-se o recipX ente, abriu-se e deixou-se evaporar a mono-metil-amina. 0 conteúdo remanescente do vaso removeu-se por lavagem com água. Fez-se passar a solução aquosa por uma coluna (6,5 x 20 cm) de resina de permuta de ioes AG50Wx8 (forma H⁺). Lavou-se a coluna com água até os produtos de lavagem ficarem neutros. De; pois fez-se a eluição do produto com hidróxido de amónia aquo^ so IN. Eliminou-se o eluente e fez-se a cromatografia do sólji do resultante numa coluna (6,5 x 20 cm) de gel de sílica com cloreto de metileno/metanol/hidróxido de amónia aquoso conceii trado (85:13:2) como dissolvente de eluição. Verteram-se as fracções que continham o produto, depois extraiu-se com água e liofilizou-se. 0 produto era um sólido amorfo amarelo claro (8,81 g; 69%). (Nao foi possível obter uma análise de combustao satisfatória para este material). (c=l,0 em água):

+25,9 graus IV (KBr): cm^-1 1693, 1472, 1273, 1076. RMN (DMSO-d₆): Ã 1,790 (s, 3H), 2,051 (ddd, 13,4, 6,3, 3,5 hz, IH), 2,142 (dt, 13,4, 6,9 hz, IH), 2,314 (s, 3H), 2,658 (d, 5,5 hz, 2H), 3,775 (td, 5,3, 3,2 hz, IH), 4,171 (dt, 6,3, 3,2 hz, IH), 6,134 (t, 6,9 hz, IH) e 7,639 (s, IH).

B. Acoplamento

Agitou-se o produto do Exemplo 1B (4,14 g; 10,0 mmole), N-hidroxi-succinimida (1,21 g; 10,5 mmole) e N,N’-diciclo-hexilcarbo-di-imida (3,09 g; 15,0 mmole) em cloreto de metileno se130 co (100 ml) à temperatura ambiente durante 1 hora. Arrefeceu-se a mistura com gelo e removeu-se o precipitado resultante por filtração. Lavou-se o resíduo com 50 ml de cloreto de me^ tileno gelado. Os filtrados combinados adicionaram-se a uma suspensão do produto de (A) (2,68 g; 10,5 mmole) em etanol absoluto (300 ml). Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 90 minutos, verteu-se a mistura reaccional, extraíu-se com 100 ml de cloreto de metileno e extraíu-se com 2 x x 100 ml de água. Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de sódio e verteu-se. Com o resíduo carregou-se uma coluna (6,5 x x 30 cm) de gel de sílica em solução de cloreto de metileno e fez-se a eluição da coluna com cloreto de metileno/etanol 20:1. Controlou-se a eluiçao por cromatografia de camada fina em gel de sílica com cloreto de metileno/metanol 10:1. Retive^ ram-se as fracçoes que continham o produto puro enquanto se fazia nova cromatografia das fracçoes mistas. Recolheram-se as soluçoes combinadas de produto puro e removeram-se os vestigios de dissolvente por secagem intensa em vácuo para se obter o produto na forma de uma espuma espessa amarelo claro (3,97 g; 61%). (Nao foi possível obter uma análise de combustão satisfatória para este solido amorfo). (c=0,96 em etanol):

+50,8°. IV (KBr): cm¹ 1768, 1691, 1610, 1490, 1420, 1205, e

1150. FAB-MS (matriz de tio-glicerol) m/e 606 (M-CH^CK^O). RMN (DMSO-dg): (Apresentou uma mistura 3:1 de isómeros rotati. vos próximo da ligaçao da amida terciária recentemente forma da). £ (principal e secundário) 1,038 (m, 3H), 1,780 e 1,800 (m, 2H), 1,78 (m, 2H), 2,04 (m, 2H), 2,23 (m, 2H), 2,291 (s, 6H), 2,683 e 2,711 (s, 3H), 2,895 e 2,859 (q, 6 hz, 2H), 3,5

131

-3,2 (m, 2H), 3,805 e 3,57 (m, 1H), 4,032 e 3,98 (m, 1H),

5,249 e 5,295 (d, 3,6 hz, 1H), 6,116 e 6,012 (t, 6,9 hz, 1H),

7,1-6,9 (m, 4H), 7,467 e 7,185 (s, 1H), 7,6-7,5 (m, 2H) e 11,275 e 11,332 (s, 1H).

EXEMPLO 13

Preparaçao de uma Fosforamidite de Nucleosido

Marcado com Corante Protegido (R^=Rq=H)

Extraiu-se com benzeno o produto do Exemplo 11 (2,61 g; 4,00 mmole), congelou-se e liofilizou-se. Adicionou-se cloreto de metileno seco (32 ml), di-isopropil-etil-amina seca (2,8 ml; 16 mmole) e cloreto de N,N-di-isopropil-metil-fosfonamida (1,15 ml; 5,9 mmole) pela ordem apresentada e agX tou-se a mistura resultante, numa atmosfera de argon, durante 15 minutos. Adicionou-se a mistura reaccional a uma mistura previamente agitada de acetato de etilo (160 ml) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (80 ml), agitou-se e separaram-se as camadas. Lavou-se a camada orgânica com 2 x 80 ml de cloreto de sódio aquoso saturado, secou-se sobre sulfato de sódio, e verteu-se. Fez-se a cromatografia do resíduo numa coluna (4 x 20 cm) de gel de sílica com cloreto de metileno/ac£ tato de etilo/trietil-amina 45:45:10 como dissolvente de eluiçao. Fez-se o controlo do eluente por cromatografia de camada fina em gel de sílica com o mesmo solvente. Recolheram-se as fracções que continham o produto e eliminaram-se os vestígios de dissolvente por secagem intensa no vácuo, para se obter o produto sob a forma de uma espuma viscosa amarelo claro, (2,89g).

132 espectro RMN P do produto apresentou uma mistura de quatro produtos resultantes do isomerismo rotativo proximo da ligaçao da amida terciária (6:1) e do diasteromerismo proximo do fojs foro trivalente (1:1). (0 espectro também revelou uma contami. naçao de 13% em peso pelo ácido N,N-di-isopropil-metil-fosfona midoso. Este material nao interferiu com a utilização do produto para a síntese de oligonucleotidos). Rendimento corrigido: 77%. ³¹P RMN (CDC1₃): S 147,81 e 146,99 (s, principal) e 148,18 e 147,75 (s, secundário).

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES . (.....

   ί

   1,- Sistema para a detecçao da presença de energia radiante emitida a partir de diferentes espécies a seguir à separaçao no tempo e/ou no espaço e determinar a identidade de tais espécies, caracterizado por incluir: meios responsivos aos espectros das espécies para gerar um pri. meiro sinal que varia em amplitude, num primeiro sentido, como uma função da natureza das espécies, meios responsivos aos espectros das espécies para gerar um segundo sinal que varia em amplitude, num segundo sentido diferente do primeiro, como uma função da natureza das espécies, e meios responsivos aos primeiro e segundo sinais para se obter um terceiro sinal que corresponde à relaçao das funções do prji meiro e segundo sinais, sendo a amplitude do terceiro sinal indicativa da identidade de cada espécie.
2. 2, - Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as espécies serem fragmentos de ADN covalentemente marcados com informadores susceptíveis de emitir energia radiante e que incluem meios adaptados à separaçao de fragmentos de ADN.
3. 3, - Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizado por os informadores terem a estrutura na qual n=2 ou 3 e R^ e R₂ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo inferior, alc£ xi inferior ou ciano.
4. 4. - Sistema de acordo comareivindicação 3, caracteri zado por os fragmentos de ADN terem informadores com ligações covalentes aos seus radicais terminais 3’ que foram introduzidos como resultado de terminação da cadeia.
5. 5. - Sistema de acordo coms reivindicação 4, caracterizado por também se incluir um laser que tem um comprimeii to de onda compreendido na região de excitaçao dos diferentes informadores.
6. 6, - Sistema de acordo come reivindicação 2, caracterizado por os fragmentos de ADN terem informadores com ligações covalentes aos seus radicais terminais 3’ que foram intro, duzidos como resultado de terminação da cadeia.
7. 7, - Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por os meios para gerar o primeiro e o segundo sinais in-

   135 cluirem: meios que têm características de primeira e segunda transmissão, as quais variam como uma função do comprimento de onda, para transmissão dos espectros, sendo os meios de transmissão e as espécies relativamente posicionáveis para dirigir tais emissões aos meios de transmissão, primeiro e segundo detectores posicionáveis para receber respectivamente a primeira e a segunda emissões transmitidas e que geram o primeiro e o segundo sinais que correspondem às intensidades de cada e indicam a sua presença.
8. 8. - Sistema de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a característica do dispositivo ter uma transiçao da primeira para a segunda características de transmissão a qual é centrada aproximadamente a meio dos espectros de emissão dos informadores.
9. 9. - Sistema de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os meios de transmissão serem um filtro dicróico.
10. 10. - Sistema de acordo com a reivindicação 7, caracte. rizado por incluir meios adaptados à separaçao de fragmentos de ADN ou outras moléculas covalentemente marcadas com informadores.
11. 11. - Sistema de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os informadores terem uma parte de emissão com estrutura

    136 na qual n=2 ou 3, e de hidrogénio ou de

    R| e R₂ representam, cada um, halogéneo ou um grupo alquilo inferior, um átomo alcóxi inferior ou ciano.

    Método para detectar a presença de energia radi ante emitido por diferentes espécies, a seguir à separaçao no tempo e/ou no espaço e determinar a identidade de cada espé cie que emite espectros, caracterizado pelo facto de se obter funçoes da energia emitida que varia em diferentes de acordo com a natureza das espécies e relacionar çoes, sendo a relaçao indicativa da identidade das sentidos tais funespecies.
12. 13, - Método de acordo com a reivindicação 12, caracte. rizado por os diferentes sentidos consistirem em amplitudes de emissão maiores ou menores.
13. 14. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado pelo facto de se obter as funções fazendo passar a ener gia radiante emitida através de um dispositivo com uma carac

    137 teristica de transmissao/reflexao que varia em função do com primento de onda e por o dispositivo ser um filtro dicroico.
14. 15, - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as espécies serem fragmentos de ADN covalentemeji te marcados com informadores.
15. 16. - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os informadores terem a estrutura na qual n=2 ou 3 e Rj e representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo inferior, alco xi inferior ou ciano.
16. 17,- Método de acordo com a reivindicação 16, caracte rizado por os fragmentos de ADN terem informadores ligados aos seus radicais terminais 3’ que foram introduzidos como resultado de terminação da cadeia.
17. 18,- Processo para a análise da sequência de ADN por elongação da cadeia, caracterizado por se fazer reagir um mo. delo templato de ADN contido num vector de sequenciação ade quado, um corante (iniciador), uma polimerase, uma primeira mistura de nucleotidos de ADN ou dos seus análogos e uma segun da mistura de terminantes de cadeia marcados por informadores que correspondem a nucleotidos de ADN ou os seus análogos para produzir fragmentos de ADN que têm informadores com ligações

    138 covalentes aos seus radicais terminais 3’ introduzidos como resultado de terminação da cadeia, e analisar os fragmentos assim produzidos relativamente a presença de informadores, identificando por este meio a sequência de ADN.
18. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac. terizado por os informadores serem seleccionados no grupo que consiste em cromóforos, fluoróforos, materiais luminescentes, marcadores por rotaçao de electrões e materiais densos em eleç troes.
19. 20, - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac terizado por os fluoroforos terem a estrutura na qual n=2 ou 3 e R| e R₂ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo inferior, alcoxi inferior ou ciano.
20. 21,- Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado por a ligaçao dos informadores aos terminantes cadeia se realizar por meio de uma ligaçao de amida.

    de

    139
21. 22.- Processo de acordo com a reivindicação 18, caraç terizado por o terminante de cadeia marcada por informador iii cluir uma base heterocíclica e por a ligaçao do informador ao terminante de cadeia se realizar através da base heterocíclica.
22. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caraça terizado por se interpor um ligante e um espaçador opcional entre o informador e a base heterocíclica.
23. 24, - Processo de acordo com a reivindicação 22, caraç terizado por o terminante de cadeia marcada por informador ser um composto com a estrutura na qual X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo amino e

    Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo OH ou NH₂ ou X=Y=OH ;

    B representa uracilo, citosina, 7-deaza-ademina, 7-deaza-guanina ou 7-deaza-hipo-xantina em que as pirimidinas estão ligadas à parte açúcar através da posição Np as purinaseas deazapurinas estão ligadas à parte açúcar através da posição Ng (numeraçao de purina das deazapurinas); e

    140

    A representa um fluoróforo com a estrutura na qual n=2 ou 3 e R^ e R₂ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo inferior, alcoxi inferior ou ciano; e a linha tracejada representa um ligante e um espaçador opcional ou um grupo unindo B e A com a condição de se B representar uma pirimidina a ligaçao se encontrar na posição 5 da pirimidina e se B representar uma deaza. purina a ligaçao se encontrar na posição 7 daquela deazapurina (numeraçao de purina).
24. 25,- Processo de acordo comg reivindicação 23, caracterizado por o terminante de cadeia marcada por informador ser um composto com a estrutura na qual B representa uracilo, citosina, 7-deaza-ademina,

    141

    7-deaza-guanina ou 7-deaza-hipo-xantina em que as pirimidinas estão ligadas na posição Ν_χ e as purinas se encontram ligadas à parte açúcar através da posição Ν_χ, as pirimidinas e as deestao ligadas à parte açúcar através da posição N_g azapurinas (numeraçao de purina das deazapurinas) e A representa um fluoróforo que tem a estrutura na qual n=2 ou 3 e e R₂ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo inferior, alcoxi inferior ou ciano;

    e a linha traoejada representa um ligante e um espaçador opciq nal unindo B e A com a condição de se B representar uma pirimidina a ligaçao se encontrar na posição 5 daquela pirimidina e se B representar uma deazapurina, a ligaçao se encontrar na posição 7 daquela deazapurina (numeraçao de purina).
25. 26,- Processo de acordo com a reivindicação 18, carajc terizado por a segunda mistura conter quatro terminantes de ca. deia marcada por informadores, suportando cada um deles um iii formador distinguível diferente, para produzir fragmentos de

    142

    ADN marcados.
26. 27. - Processo de acordo com a reivindicação 26, carajç terizado por os informadores distinguíveis serem fluoroforos.
27. 28. - Processo de acordo com a reivindicação 26, carac: terizado por se separar simultaneamente os fragmentos de ADN marcados.
28. 29. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caraç. terizado por se combinarem os fragmentos de ADN marcados antes da separaçao.
29. 30. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caraç. terizado por todas as quatro reacçoes de terminação da cadeia ocorrerem num recipiente único.
30. 31. - Processo para a determinação de uma sequência de base de ADN, caracterizado pelo facto:

    de se ligar um informador diferente a um terminante de cadeia para cada base, de se preparar fragmentos de ADN marcados por um método de te£ minaçao de cadeia modificada, de se separar os fragmentos de ADN de acordo com o tamanho e de se detectar o informador para cada fragmento de ADN, identificando-se assim a base terminal 3’.
31. 32. - Processo para a preparaçao de compostos de forniu la geral

    143 na qual n=2 ou 3 e Rj e R₂ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alqui^ lo inferior, alcoxi inferior ou ciano, R’ representa um grupo alquilo ou arilo e R’¹ representa um grupo alquilo, caracterizado pelo facto de se tratar 3-hidroxi-6-oxo-9-carb£ xi-alquil-6H-xantenos com um anidrido de ácido· carboxilico no seio de piridina e, em seguida, de se tratar com um álcool.
32. 33.- Método de análise de sequência de ADN de acordo com o método de terminante de cadeia que utiliza nucleotidos de dideoxi de terminação de cadeia, caracterizado por se incluir o passo da substituição de um composto que tem a estru tura

    144 na qual B representa 1-uracilo, 1-citosina, 1-timina, 9-adeni^ na, 9-guanina ou 9-hipoxantina para os nucleotídos de dideoxi de terminação de cadeia.