JPH07121239B2 - Ｄｎａ塩基配列決定方法 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列決定方法

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JPH07121239B2
JPH07121239B2 JP62166223A JP16622387A JPH07121239B2 JP H07121239 B2 JPH07121239 B2 JP H07121239B2 JP 62166223 A JP62166223 A JP 62166223A JP 16622387 A JP16622387 A JP 16622387A JP H07121239 B2 JPH07121239 B2 JP H07121239B2
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フランク・ワーデン・ホッブス・ジュニア
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イ−・アイ・デユポン・ドウ・ヌム−ル・アンド・カンパニ−
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、レポーター（reporter）標識DNAを用いたD
NA塩基配列決定に関し、さらに詳細に言うと、この発明
は、時間的及び／又は空間的分離に続く異なる種からの
放射エネルギーの存在を検出するための蛍光系システム
及びそれらに用いられる蛍光染料に関する。これらの染
料は近似するが識別可能な蛍光染料である。これらの染
料を保護し、活性化し及び連結する方法が開示されてい
る。この方法により調製された１組の蛍光標識DNA鎖タ
ーミネーターが蛍光標識DNA塩基配列決定断片として採
用される。電気泳動分離の最中にこれらの断片を検出
し、連結された蛍光レポーターを同定することができる
光学的検出システムが記載されている。
DNAの塩基配列決定は、現代の分子生物学における基礎
的な分析技術である。塩基配列決定の信頼できる方法の
開発によって、遺伝情報の組織化の理解が大幅に発展
し、遺伝材料の操作（即ち遺伝子工学）が可能になっ
た。
DNAの塩基配列決定の方法は現在２つある。すなわち、
マキサム−ギルバート化学分解法（エイ・エム・マキサ
ムら、Meth.in Enzym.65 499−559（1980）及びサン
ガージデオキシ鎖ターミネーション法（エフ・サンガー
ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74 5463−5467（197
7））である。これらの２つの方法において共通の特徴
は、電気泳動によって分析される１組のDNA断片を生成
させることである。これらの方法は、それらの断片を調
製するのに用いる方法が異なる。
マキサム−ギルバート法では、DNA断片は、塩基配列を
決定すべきDNAの塩基特異的化学的切断によって調製さ
れる。塩基配列を決定すべきDNAは先ず32Pでその５′末
端をラベルされ、４つの部分に分けられる。それぞれの
部分は、特定の塩基に隣接する部位でDNAを切断するよ
うに設計された異なる一連の化学処理を受ける。その結
果、全ての標識断片は元のDNAと同じ５′末端を有し、
切断の部位によって決定される３′末端を有する。この
処理は、ゲル電気泳動による分離が便利な大きさのDNA
断片を生成するような条件下で行なわれる。
サンガー法では、DNA断片は、塩基配列を決定すべきDNA
の部分的な酵素的複製（すなわち、合成）により生産さ
れる。最も一般的な方法では、塩基配列決定すべきDNA
は、標準的な方法により、バクテリオファージM13のよ
うな大きな円形の一本鎖DNA中に挿入される。これは複
製過程の鋳型となる。挿入物のすぐ上流の鋳型領域に相
補的な短いDNA断片が鋳型にアニールされ、合成のため
のプライマーとして働く。４つの天然デオキシリボヌク
レオシド三リン酸（dNTP）の存在下において、DNAポリ
メラーゼによってプライマーが３′末端から伸長され、
挿入領域の鋳型の相補的複製物が生産される。塩基配列
決定断片の完全な１組を生産するために、４つのdNTPと
単一のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）
ターミネーターを含む４つの反応が平行して行なわれ
る。dNTPがポリメラーゼによって取り込まれるならば、
鎖の伸長は続行され得る。対応するddNTPが選択される
ならば、鎖は終結される。ddNTPとdNTPとの比は、適当
な長さのDNA断片を生成するように調節される。４つの
反応混合物のそれぞれは、従って、３′末端に同じジデ
オキシヌクレオキド残基を有し、プライマーによって規
定される５′末端を有する。
両方の方法において、一般的に物理的方法によって直接
決定することができない塩基配列情報が、測定すること
ができる鎖の長さの情報に変換されている。この測定は
電気泳動分離によって行なわれる。変性条件下（高温、
尿素存在等）において、短いDNA断片は固い棒として泳
動する。ゲルマトリックスが電気泳動のために採用され
ると、DNA断片はそのサイズの順に並べられる。塩基配
列決定のために必要な単一塩基分解能は、数百塩基以下
の塩基を含むDNA断片について通常得られる。
完全な配列を決定するために、マキサム−ギルバート法
又はサンガー法において形成された４つの断片の組は、
４つの平行なレーンで電気泳動される。これにより、ゲ
ルの長さ方向に沿って断片が空間的に分離される。標識
断片のパターンは通常、オートラジオグラフィーによっ
てフィルムに移される（すなわち、ゲルとフィルムとを
所定の時間挟むことによって露光される）。現像された
フィルムは、４つのレーンの間に分配された連続的なバ
ンドを示し、これはしばしばシークエンシングラダーと
呼ばれる。ラダーは可視的にフィルムを走査することに
よって読まれ（短く、迅速に移動する断片から始め
る）、ラダー上のそれぞれのステップについて次のバン
ドが生じるレーンが測定される。それぞれのレーンは特
定の塩基（又はマキサム−ギルバート法の場合には塩基
の組合せ）に関連付けられているので、レーン割当の直
線的プログレッションは直接塩基配列に翻訳される。
サンガー法及びマキサム−ギルバート法は概念的に優雅
で有効であるが、操作的に困難で時間がかかる。これら
の方法を分析すると、多くの問題は単一の放射性同位体
レポーターを用いることによってもたらされている。
特有の高い活性を有する32Pのような短命な放射性同位
体を用いることは論理的な観点並びに健康及び安全性の
観点から問題である。32Pの半減期は短いので、必要な
試薬を数日前に予想し、また、試薬を直ちに使用しなけ
ればならない。標識DNA塩基配列決定断片が生成される
と、それらは自己分解しやすいので直ちに電気泳動分析
にかけなければならない。単一の塩基分離を達成するた
めに必要な大きな電気泳動ゲルは、汚染されたバッファ
ーを大量に生じるので、これを適当に処分しなければな
らない。引き続きゲル中の標識DNA断片を可視化するた
めに必要なオートラジオグラフィーはゆっくりとした工
程であり（一夜露光が普通）、操作全体にかなりが加わ
る。最後に、このような強力な放射性同位体を用いるこ
とによる健康への危険がある。
単一のレポーターを用いて４種類の塩基の位置を分析す
ることは全体の操作にかなりの操作的複雑さを与える。
化学／酵素工程は別々の容器内で行なわなければなら
ず、電気泳動分析は４つの平行なレーン中で行なわなけ
ればならない。熱的に誘導される移動度の歪により、標
識DNA断片の歪んだ像が得られ（例えばスマイル効
果）、これはひいては４つのレーンを比較することを困
難にする。これらの歪は単一のゲル上で読むことができ
る塩基の数をしばしば制限する。
４つの平行なレーンを用いる必要性の他に、オートラジ
オグラフィーでの画像化に必要な長い時間の故に、可視
化が「スナップ撮影」的になる。多数のバンドを同時に
空間的に分離することが必要なので、通常40cm又はそれ
以上の長さのゲルを用いることが必要になる。これによ
り付加的な問題がもたらされる。すなわち、大きなゲル
は取扱いが困難で、操作が緩慢であり、操作全体に要す
る時間が長くなる。
最後に、人手による解析の問題がある。シークエンシン
グラダーを塩基配列に変換することは時間がかかり間違
い易い工程で、非常に熟練した科学者が全力集中するこ
とが必要である。読み取りを自動化する多くの試みがな
され、これを助けるいくつかの機械も存在するが、塩基
配列ゲルを解釈する工程はいまなお苦痛を伴い遅い工程
である。
この問題を処理するために、32P/オートラジオグラフィ
ーを他の非放射性のレポーター／検出システムに交換す
ることが考えられる。このような検出系は32Pの感度に
匹敵する程度に例外的な高感度を有していなければなら
ない。シークエンシングゲル上のそれぞれのバンドは10
-16モルのオーダーのDNAを含む。このレベルの感度に到
達することができる１つの方法は蛍光を用いることであ
る。DNA断片は１又は２以上の蛍光染料で標識すること
ができる。適当な光源で染料を励起することによって、
染料から特徴的な発光が生じ、バンドを同定することが
できる。
放射性同位体ラベルに対し、蛍光染料を用いることによ
って、検出システムをより容易に変更することができ
る。例えば、何らかの発光特徴（例えばスペクトル、寿
命、分極化）に基づいて、特定の塩基に関連した塩基配
列決定断片に特定の目印を特異的に結合することができ
る。この結合が確立されると、断片を単一のレーンにま
とめ、かつ解像することが可能となり、塩基の割当を選
択された発光特性に基づいて直接行なうことができる。
蛍光検出のリアルタイム性の故に、空間的に分離された
バンド（空間的解像）を含むゲルを迅速に走査すること
もできるし、ゲル上の単一の点上に注目して、その検出
領域を連続的に通過するバンドを検出することもできる
（時間的解像）。大きなゲルは必ずしも必要ではない。
さらに、リアルタイムの単一レーン検出モードは完全に
自動化された塩基割当及びデータ移動に非常に適してい
る。
蛍光系DNA塩基配列決定システムを開発しようとするい
くつかの試みが記載されている。カリフォルニア工科大
学のグループによって開発された１つのシステムがエル
・エム・スミスの西ドイツ特許出願第3,446,635 Al（1
984）、エル・イー・フッドら、西ドイツ特許出願第3,5
01,306 Al（1985）、及びエル・エム・スミスら、Nucl
eic Acids Research,13 2399−2412（1985）に開示
されている。このシステムは上記セクションに記載した
問題を処置するためのものであるが、その解決手段は部
分的にしか成功していない。
カリフォルニア工科大学のシステムは、４組のDNA塩基
配列決定断片を採用し、これらのそれぞれは４種類の蛍
光染料の１つで標識されている。２つの代表的な蛍光染
料の組が記載されている。それぞれの組は、少なくとも
２つの構造的に異なるクラスのものから誘導された染料
を含む。
発光の最大値は４種類の染料の識別を容易にするために
大きな領域（約100nm）に広がるが、不幸なことに吸収
（励起）最大値もまた比較的広がっている。このため、
単一の単色光源で全ての４つの染料を励起することが困
難であり、得られる発光を十分に検出することが困難で
ある。
対照的に、近接した吸光度ピークを有する（従って対応
する発光ピークも近接する）染料を用いて励起効率を高
めると他の問題が起きる。DNA塩基配列決定のための検
出システムは、個々の標識断片を同定するために４つの
異なる材料の発光スペクトルを識別することができなけ
ればならない。これらの発光は通常その強度が低い。従
って、検出システムは、高い感度（バンド当たり10-16
モル以上）及び選択性を有していなければならず、さら
に、所望の性能特性に合致するように、迷光及び背景ノ
イズを最小化するための手段を有していなければならな
い。システムはまた、検出窓を通ってゲルを泳動するあ
らゆる断片を失うことを避けるために、検出領域をしば
しばモニターすることができなければならない。このよ
うな検出システムは、単一の装置中にミルコストに影響
を与えることなく複数の検出器を備えるために比較的コ
スト効率が良くなければならない。
検出系中に蛍光を用いる多くの検出装置が知られてい
る。これらの装置の１つがナイムスキら、Anal.Bioche
m.,106,471−475 1980,“Quantitative Flourescence
Analysis of Different Conformational Forms
of DNA Boundto the Dye…and Separated by El
ectrophoresis"に記載されている。この電気泳動検出シ
ステムでは、比較的大きなDNA断片を分離するために、
ガラス管がアガロースゲルで満たされる。次に、大きな
断片のそれぞれを明確にするための検出システムとし
て、走査モノクロメーターが用いられる。走査モノクロ
メーターは広い領域のスペクトル特性を正確に測定する
ことができることが知られている。しかしながら、モノ
クロメーターの限られた能力及びこれと共に用いられ、
発光光線を集めたり分散させたりする光学素子によって
多くの光が失われる。これらの検出方法は感知され測定
され得る光の割合を限定する。従って、低い光が施され
る場合の感度が低い。さらに、連続的に集められる光は
通常非効率的である。
スミスら（上記参照）によって開示された検出装置は、
単一又は複数の光検出器上に入射する光の波長を選択す
るために一連の狭いバンド干渉フィルターを用いる。こ
の型のシステムはかなり単純で安価であるという利点を
有する。しかしながら、これは実質的な欠陥を有する。
記載されている具体的なシステムは、１つの光検出器と
共に複数の互換フィルターを用いるか、あるいは複数の
光検出器と共にそれに対応する複数の備え付けフィルタ
ーを用いることができるフィルター光度計を使用する。
先ず、これらの装置のうち、単一の検出器を有する回転
フィルター（スミスらの第３図参照）は、それぞれのフ
ィルター領域を測定することができる時間が限定される
という欠点を有する。異なる発光スペクトルを識別する
ために、検出時間を異なるフィルターによってシェアし
なければならない。スミスらのシステムはここでは取扱
う必要のない追加的な光学的困難性を有する。
異なる正味チャージを有する染料を用いることによって
より深刻な問題が生じる。スミスらのNuclei Acids R
esearchの論文に記載された従来のシークエンシングゲ
ルは４つの染料のそれぞれによって標識されたプライマ
ーからつくられたＴレーンを示す。電気泳動移動度に有
意な差動揺動が現われることは明らかである。これらの
４種類の染料を有する塩基配列決定断片の完全な組を１
つにすると、単一のレーンで電気泳動した時にかなりの
重複がみられ、そしておそらく順序の入れ替え起きるで
あろう。この効果は、上述した信号強度の大きな動的領
域の問題と相まって、この染料セットを用いて単一レー
ンでの塩基配列決定を行なうことを困難にしている。
最後に、蛍光標識塩基配列決定断片を調製するために用
いられる方法論は困難な配列決定条件をもたらす。マキ
サム−ギルバード法では、５′標識オリゴヌクレオチド
が酵素的に、制限酵素切断によってつくられた接着末端
を有する二本鎖DNAに連結される。これにより、塩基配
列決定される断片が、このようにして製造された断片に
制限される。サンガー法では、５′標識オリゴヌクレオ
チドがプライマーとして用いられる。４つの特殊なプラ
イマーが必要である。新規なベクター系を用いるため
に、４つの新規な染料染色プライマーを合成し精製する
という複雑な工程を行なわなければならない。
非放射標識DNA塩基配列決定の自動化の第２方法は、ア
ンソージ・グブリュら、J.Biochem.Biophys.methods,1
3:315−323（1986）に開示されている。このプライマー
を、放射標識ヌクレオチドを省略するように修飾された
標準的なジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法に基づ
いて４つの容器中で反応させ、種々の長さの酵素的に複
製されたDNA断片の組を生成させる。４つの容器のそれ
ぞれは４つのDNA塩基の１つに対応するジデオキシヌク
レオチド鎖ターミネーターを含んでおり、それによって
４つのゲルレーンにおける従来の電気泳動分離から末端
塩基を割り当てることができる。それぞれの断片は、
５′−テトラメチルローダミン蛍光標識を有しており、
これはゲルの全幅を介して通過するアルゴンイオンレー
ザーによって励起される。経時的に解像されたDNAバン
ドの蛍光発光は、画像化光学素子、視野透孔、光ガイ
ド、フィルターアセンブリー及び光電増倍管を直列に有
する、それぞれのレーンに対する別々の据付型の手段に
よって４つのレーンから集められる。
この方法によって主張される１つの利点は、据付型の検
出器の故に装置内の可動部品の数が少なく、それによっ
て４つのゲルレーンの連続的なモニタリングが可能にな
るということである。このモニタリング法は、１つのレ
ーンに対して用いられるものよりも複雑であるが、残り
の３つのレーンにおけるバンドの不存在に比較しつつ標
識されたバンドの存在を検出することができるので、塩
基割当の確実性が改善されるとされている。実際、単一
の標識を用いると塩基割当のために４つのレーンを用い
ることが必要になり、提供されたシステムはさらに単純
化したりその容量や出力を改善することができない。こ
のシステムはまた、単一の配列分析のために忠実なレー
ン間の相対的位置付けが必要となるので、本来的に正確
性が低い。熱勾配のような操作的複雑さ及びゲル不純物
はこの位置的一体性を破壊して局所的なゲル歪を生み出
してバンド移動度に影響を与え、ひいては塩基配列決定
に悪影響を与え得る。
アンソージら及びスミスらの標識プライマーの使用は、
他の点においても劣っている。ポリメリゼーション反応
は別々の容器で行なわなければならない。全てのDNA断
片は、それが真正なターミネーション断片であっても外
来性の断片であっても標識される。これは、アデノシン
ヌクレオチドを含む実質的に全ての断片が標識される現
存するシステムに類似している。従って、得られるシー
クエンシングパターンは、現在の方法において発生する
ほとんどのアーチフファクト（例えばフォールス又はシ
ャドウバンド、パイルアップ等）を有する。
最後に、1985年10月９日に発光された欧州特許出願第85
103155.9号は、任意的に予めマークされたヌクレオシド
を含有するDNA鎖を後標識（post−labelling）するため
のシステム及び方法を開示する。予備マーキングは、ヌ
クレオチドがサンガーDNA鎖終結法において用いられる
前に所望の鎖終結ヌクレオチドにビオチンを共有結合す
ることによって行なうことができる。しかしながら、予
備マーキングされたヌクレオチドは開示されたシステム
において検出可能でない。別々の容器内で調製された、
Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのDNA塩基に対応するDNAの予備マーキ
ングされた鎖は電気泳動的に分離され、フルオレッセイ
ンのような蛍光体が共有結合した相補的結合物質、通常
アビジンに対して露出される。蛍光体が検出され、この
信号の存在が、元々調製されたＡ、Ｔ、Ｃ又はＧに対応
する特定の容器又はゲルレーンに関連付けられる。この
後標識法は、マークされたDNAの調製及び引き続く電気
泳動分離を別々の容器及びゲルレーンでそれぞれ行なわ
れなければならない。鎖終結法の反応中に同じ容器内に
おいて同時にDNA鎖を区別して標識することができる方
法又はシステムも、適当な検出システムの単一のゲル／
レーン中で検出中に標識を分別するシステム又は方法も
全く開示されていない。
この発明は従来技術の多くの欠点を克服することを目的
とする。これは上述した多くの欠陥を有することなく多
くの所望の性能特性を有するDNA塩基配列決定システム
を包含する。この発明は、時間的及び／又は空間的分離
の後に異なる種、通常レポーター標識DNAからの放射エ
ネルギーの存在を検出し、種を同定するためのシステム
である。このシステムは種の本質の関数として第１のセ
ンスにおいて振幅が変化する第１の信号を発生するため
の、種のスペクトルに応答する手段と、種の本質の関数
として第１のセンスとは異なる第２のセンスにおいて振
幅が変化する第２の信号を発生するための、スペクトル
に応答する手段と、第１及び第２の信号の関数の比に対
応する第３の信号を得るための第１及び第２の信号に応
答する手段とを有し、第３の信号の振幅が種の同定を示
す。
第１及び第２の信号を発生するための手段は、波長の関
数として変化する透過／反射特性を有する二色フィルタ
ーと、発光をフィルターに向けるための手段と、発射さ
れた光の透過光及び反射光をそれぞれ受容し、そのそれ
ぞれの強度に対応して第１及び第２の信号を発生するた
めに第１及び第２の検出器とを具備する。好ましくは、
二色フィルター特性は、種発光スペクトルの中央付近で
発生する透過から反射にわたる比較的鋭い遷移を有す
る。中央近傍に位置する遷移点においては、第３の信号
の振幅の変化はスペクトル全域にわたってより等しく分
配される。
通常、分析される種は、近似するスペクトルを有する蛍
光物質で共有結合的に標識されたDNA断片又は他の分子
である。これらの分子は通常、その大きさ、電荷又は他
の物理的特性に従って分離できるように電気泳動ゲル中
に収容される。このシステムは、蛍光物質の励起領域内
の出力を有するレーザー又は他の放射エネルギー源を有
する。
例えばDNA断片のような、検出すべき標識された種の発
光部分は次の構造を有する。
ただし、ｎは２又は３、R1及びR2は水素、低級アルキ
ル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す。
また、この発明は、近似したスペクトルの波長にわたっ
て異なるセンスにおいて変化する放射されたエネルギー
の関数を得るための工程と、種の同定を示す、これらの
関数の比を決定する工程とを含む、時間及び／又は空間
的分離に続く、異なる種から放射された放射エネルギー
の存在を検出するための方法をも開示する。放射された
エネルギーの関数は、波長の関数として変化する透過／
反射特性を有する二色フィルターに放射エネルギーを通
すことによって得ることができる。
鎖ターミネーターがレポーターを有する、サンガー鎖終
結法の修飾に従ったDNA塩基配列分析のための方法が記
載されている。好ましくは鎖ターミネーターは着色され
たレポーター、さらに好ましくは蛍光レポーターを担持
する。鎖ターミネーターは次の構造の１つであり得る。
ただし、（ａ）ＸはＨ、NH2若しくはハロゲン、Ｙは
Ｈ、NH2、OH若しくはハロゲン、又は（ｂ）Ｘ＝Ｙ＝OH
である。
あるいは ただし、Ａは次の構造を有する蛍光レポーターであり得
る。
ただし、ｎは２又は３、R1及びR2は水素、低級アルキ
ル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示し、Ｂ
はウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、７−デア
ザグアニン又は７−デアザヒポキサンチンのようなヘテ
ロ環塩基であって、ピリミジンがN1位を介して糖部分に
結合し、デアザプリンはN9位（プリンナンバリング）を
介して糖部分に結合しているもの、破線は好ましくはア
ミド結合によって蛍光部分（Ａ）とヘテロ環（Ｂ）とを
連結するリンカー及び任意的スペーサー（原子群）を示
し、Ｂがピリミンジンである場合にはリンカーはそのピ
リミジンの５−位に結合し、Ｂがデアザプリンである場
合にはリンカーはそのデアザプリンの７−位（プリンナ
ンバリング）に結合している。
この発明のもう１つの局面においては、４つの塩基に対
応する４つの鎖ターミネーターが異なる識別可能なレポ
ーターを担持する、この発明によって修飾されたサンガ
ーの鎖終結法によるDNA塩基配列分析法が提供される。
４つの鎖終結反応は、従って、異なる容器中で行なわれ
て電気泳動分析の前にまとめられるか、又は単一の容器
中で行なわれる。
１つにまとめられたDNA塩基配列決定断片は、単一のレ
ーン中で同時に電気泳動分離にかけることができる。そ
れぞれのレポーターを担持する断片を単一の光源で励起
することによって、特徴的な発光が生じ、それによって
検出及び同定が可能になる。
４つのレポーターの組は、単一の光源によって効率的に
励起することができ、類似するが識別可能な発光スペク
トルを有するものが選択される。結合されたDNA断片の
電気泳動移動度における示差的動揺は小さい。この要件
は一般的に、４つのレポーターが類似の分子量、形状及
び電荷を有していれば満たされる。
これらの基準は、以下の構造を有する蛍光部分を持つレ
ポーターによって満たされる。
ただし、ｎは２又は３、R1及びR2は水素、低級アルキ
ル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す。こ
のようなレポーターは、以下の構造式を有する、保護さ
れ、活性化された中間体を介して導入することができ
る。
ただし、上式において、ｎは２又は３、R1及びR2はＨ、
低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン又はアルコキ
シ基、Ｒ″はアルキル、Ｒ′はアルキル又はアリール、
Ｘは良好な離脱（leaving）基である。
この発明のシステム及び方法は、比較的高い感度を維持
したまま発光スペクトルの比較的小さな波長差をリアル
タイムで識別する能力を有する。このシステムは光検出
器上に利用可能な光の大部分を分配する。最後に、この
検出システムは蛍光種を含むゲルの連続的なモニタリン
グを可能にする。この特徴により、間欠型の検出システ
ムにおいては通常本質的であった、不完全なデータが誘
導される可能性が減少される。上述した全ての特徴は、
比較的低い製造コストでこのユニークなシステムに組み
込まれた。
極めて近接した発光バンドからの放射はこの発明のシス
テムを用いて検出することができる。これらの近接した
発光は、システムにおいて分析される物質に不可逆的に
結合した予め選択されたレポーター種から発っせられ
る。許可可能なレポーターは一般的に、通常50ないし10
0nm、好ましくは20ないし50nmの狭い波長域にわたって
発光することができる１又は２つ以上の種が選択され
る。好ましくは、最大ピークは2nm未満にまで近づいて
いてはならない。１つのレポーター種は、物質への結合
の態様及びシステム中での分析条件に依存して、２以上
の波長域で発光できるものであってもよい。もっとも、
固有の発光特性を有する個別のレポーターが、検出すべ
き波長域において発光するためにより従来的に選択され
る。好ましいレポーター種は以下に記載する。
この発明は広い適用性を有するが、DNA塩基配列決定と
いう特定の用途について記載する。
この発明のこの好ましい態様において、レポーター標識
DNA塩基配列決定断片が単一の容器中で製造される。こ
の容器の内容物、すなわち、レポーターで標識された種
々の長さのDNA鎖を電気泳動装置に通して分離させる。
この目的のために、第２図に示すように、電気泳動は厚
さ約0.2mmないし0.4mm、長さ約25ないし40cmの適当な電
気泳動板10において行なうことができる。他の寸法も適
当に用いることができる。この板10は適当なゲル11、通
常６％ないし８％のポリアクリルアミドゲルを有し、ガ
ラス又はプラスチック支持体12中に挟まれている。板
（ゲル）は従来法により調製される。
板10は、通常ホルダーに垂直に置かれる。板10の上端
は、緩衝液24を収容する上部容器16内に延び、下方は、
また緩衝液18を収容する第２の容器14内に延びる。緩衝
液はいずれの適当な緩衝液であってもよく、通常、0.1M
トリスホウ酸EDTA、pH8.3を用いることができる。この
ようにして、緩衝液は、緩衝液間の電気的接触を行なう
ために、両端部で板と接する。この配列において、レポ
ーター標識DNA断片は、ゲルの頂部に設けられた穴（図
示せず）内にピペットで入れられる。これにより、貯蔵
容器14及び16中のターミナル20を介する電気回路が完成
する。この特定の長さ及び厚みを有するゲルで分離を行
なうために適当なポテンシャルが必要である。陽極が板
の下端に位置し、DNA断片を下向きに移動させる。これ
らの条件下において、断片がゲル中を移動するにつれ
て、それらは空間的に分離されてバンドになる。検出領
域は板底部近傍に位置する。この領域において、断片は
レーザー光線31によって照射され、断片がこの領域を通
過することによって励起／発光が起きる。
電気泳動板10を照射するための光学的配置が第１図に示
されている。第１図のシステムは、近接した発光バンド
の強度を識別し測定するために、いずれの蛍光又は他の
型のレポーターシステムにも用いることができる。もっ
とも、上述したように、レポーター種が蛍光化合物であ
る、レポーター標識DNA断片からの発光を検出するため
の好ましい用途について記載する。これは、用いられる
励起可能な好ましいレポーター種の励起波長の関数とし
て決定される特定の波長を提供するために選択されるレ
ーザー30を含む。例えば、ここで開示する蛍光レポータ
ーに対して用いることができる具体的な光源として、波
長488nm、光束の直径が0.8mmの、約25ないし40mWで操作
されるアルゴンイオンレーザーを挙げることができる。
レーザー光線は励起フィルター32及び、電気泳動板10の
検出領域において光束の直径を約0.2mmに絞る集束レン
ズ33を通る。
フィルター32は、検出工程を妨害する不所望の励起波長
をブロックするように選択される。レーザー光線が非常
に純粋であるならば、このフィルターは省略することが
できる。板に入る光線が、ここでは蛍光標識DNA断片で
あるレポーター標識物質を励起し、励起波長からシフト
した波長の蛍光を発射せしめる。特定の染料のピーク発
光波長特性を後述するが、溶液中に遊離の状態にある場
合には、505、512、519及び526nmである。なお、検出シ
ステムは、近接する発光バンドを有する他の組のレポー
ターの波長を識別することもできる。さらに、レーザー
光線は試料に入射する外来性光が最小になるので好まし
い光源であるが、適当なフィルター及び光学素子を用い
ると、キセノンアークランプのような非コヒーレント光
源を包含する他の光源も用いることができる。
発光種によって発っせられた光は適当に配置された平行
化レンズ34によって集められ。平行化レンズ34は、蛍光
の特異的波長特性以外の実質的に全ての光を排除するた
めに、発光フィルター36を介して二色フィルター38まで
透過させる光の平行光線を生みだす。このフィルターを
用いることにより、500nm未満及び560nmを越える波長の
光は実質的に全て排除され、これらの波長の間にある波
長を有する光は50％を越える効率で透過する。
この発明において、二色干渉フィルター38によってこの
システムが非常に近接する発光スペクトル同志を識別す
ることが可能になる。これは通常、入射光線に対して約
45度の角度に置かれる。このフィルターに入射する光線
はこのフィルターによって反射され又はこれを透過す
る。DNA断片に結合された場合の蛍光レポーターの発光
ピークが515、524、530及び536nmである場合には、フィ
ルター38は第３図に示すような反射／透過特性を有す
る。二色フィルター38は、これら４つのレポーターに特
徴的な蛍光バンドのほぼ中央にある鋭い透過／反射遷移
39を有する。蛍光スペクトルが低波長から高波長にシフ
トするにつれ、透過光反射光の比が連続的に減少する。
この特定のフィルターはこの用途に選択されたレポータ
ーに対して選択されたものであり、異なる組のレポータ
ーを用いる場合には、異なるフィルター特性を有するも
のが必要になるであろう。
二色フィルター38からの光（反射光又は透過光）はそれ
ぞれの集束レンズ40を通ってそれぞれの検出器42に至
る。検出器42は好ましくは光電子増倍管である。これら
は目的とするスペクトルバンド内で高い感度を有するも
のとして知られている。あるいは、シリコンフォトダイ
オード又は他の類似の検出器を用いることができる。検
出器42が集束透孔から近い所定の距離だけ離れた位置に
置かれる場合には、平行化レンズ34は省略することがで
きる。このレンズを省略する場合には、集光透孔は検出
器42の所望の感知領域に対応する開口を有することによ
って規定され、又は、透孔は光学繊維フェースプレート
のような他の代替的手段によって規定することもでき
る。同様に、集束レンズ40は検知器の感知領域が十分に
広く、利用可能な光を直接集めることができる場合には
省略することができる。
二色フィルター38の機能はまた、好ましくは、２つのフ
ィルターと検出器42へ発射された光源の光路に置かれた
透孔とによってもたらすことができることが明らかであ
る。この場合に、そのそれぞれのフィルターは２つの異
なる透過特性、すなわち、二色フィルターの反射又は透
過遷移特性を有する。この様にして、２つの検出器42は
上述した二色フィルターによって提供される透過及び反
射特性を受ける。これら２つのフィルターの透過バンド
は第７図により明瞭に示されており、同図中標識フィル
ター１及びフィルター２である。これら２つのフィルタ
ーの透過バンドは、ここで用いる515、524、530及び536
nmの４つのレポーター標識ターミネーターに特徴的な蛍
光バンドのほぼ中央で重複することが見られる。
２つのフィルターを用いるこの型のシステムは継続中の
ロバートソンらの出願中に記載されている。ロバートソ
ンらの出願に記載されているように一対のモジュールが
面の上と下に置かれ、この面ではレポーター励起光線が
電気泳動ゲル上の複数のレーンを走査する。それぞれの
チャネルはレポーター標識DNA断片を含む。それぞれの
検出モジュールは広い入口領域及びそのPMTとゲル中の
蛍光種との間に置かれた別々の波長選択性フィルターを
有する光電子増倍管を具備する。これらのフィルターは
二色フィルターの動作をシミュレートする相補的な透過
バンド特性を有する干渉フィルターである。フィルター
は、種の本質の関数として異なる特性における異なる振
幅を有する信号をPMTが発することを許容する。１つの
フィルターは低波長の発光をほとんど通し、高波長の発
光を反射するが、他方のフィルターはこの丁度逆を行な
う。透過フィルターをそれぞれの干渉フィルターと共に
用いて所定の角度よりも大きな、軸からはずれた角度か
らの光を排除することができる。波長フィルターは、４
つの染料の発光領域において、ほぼ相補的な透過対波長
特性を有し、種放射エネルギースペクトルの中央付近に
透過波長を有する。
検出器42からの電気信号は次にそれぞれの予備増幅器46
を通過してアナログ−デジタル（A/D）変換器に至り、
次にシステムコントローラー52に至る。システムコント
ローラー52の仕事はIBM PCのような小さなコンピュー
ターによって行なうことができる。第４図のフローダイ
アグラムに記載されたシステムコントローラー52の機能
は、２つの信号関数の比率を計算することである。二色
フィルター38は、異なる波長のバンドにおける信号をそ
の波長に従って変調することである。すなわち、反射光
検出器については、短い波長の発光光線は小さな振幅の
信号値を得、長い波長の発光光線は大きな振幅を得る。
従って、特定のレポーター種、すなわち、この発明の好
ましい具体例においては蛍光標識DNA断片がゲル10中で
の空間的分離に続いて検出領域を通過すると、その発光
光線は波長及び時間（ゲル10内の移動に基づく）の関数
として異なる振幅を有する。この振幅変調光信号は電気
信号に変換され、記載されるプロセッシングのためにデ
ジタル化される。変換後、デジタル信号は比率で示され
る。すなわち、反射蛍光と透過蛍光の比率が得られる。
これらのデジタル信号は１組のDNA断片に対応する光信
号のピークを表わすものである。ピーク高さ又はピーク
領域のいずれかに対応する信号が比率が表わされる。比
率信号の強度は種の同定を示すものである。関数Ｗは１
つの検出器のピーク強度と他の検出器のピーク強度との
比、例えば、反射光線検出器のピーク強度によって除せ
られる透過光線検出器のピーク強度である。それぞれの
レポーターの比率信号の強度は、後述の実施例10におい
てわかるように、それぞれのレポーターを固有に示すグ
ループ内に入る傾向を有する。
この振幅変調及び比率化工程は、二色フィルターによる
場合でも、同一の被検種からの同一のスペクトルに異な
っても応答するそれぞれ異なる２つの信号を発生する別
々のフィルターを用いた場合でも、数学的に記載するこ
とができる。すなわち、レポーターピーク発光の際に存
在する総電気信号（検出光信号に対応する）は散乱光及
び迷光に基づく成分並びに異なるレポーターのそれぞれ
からの蛍光に基づく信号とから成る。電気泳動中に、レ
ポーター蛍光信号は他の背景成分から識別することがで
きる。なぜなら、蛍光信号は所定の態様で時間的及び空
間的に変化するからである。これは、特に検出器とゲル
との間に相対的な移動がない場合に比較的一定の信号を
発生する背景ノイズ信号と対照的である。ゲル及び検出
器を据付型に配置すると、蛍光信号はゲルを介するレポ
ーターの移動により時間的に変化する。あるいは、ゲル
は電気泳動後固定されたままで、検出系をゲルに対して
移動させることもできるし、この逆もできる。さらにま
た、検出システムを、ゲル中での移動が起きている間に
移動させることもできる。
第５図には、２つの検出器出力信号が時間の関数として
変化する態様が示されている。図中のそれぞれのピーク
対は、被検DNA中の塩基配列に対応する異なる組のDNA断
片に対応する。それぞれのピーク対の比率はそれぞれ特
定のDNA塩基に対応する４つのグループの１つに入る。
特定の塩基Ｔ、Ｃ、Ａ及びＧを同定するのは、これらの
比率グループ分けである。
レポーター間の選択性（Ｗの値によって決定される）を
改善するために、異なる蛍光レポーターの全ての組合せ
におけるＷの変化を最適化しなければならない。これ
は、異なるレポーターの発光スペクトル全域にわたって
実質的に変化する透過／反射特性を有する二色フィルタ
ー又はその上述した均等物を選択することによって達成
される。しかしながら、近接したレポーターについて
は、異なる発光スペクトル（第３図）に対してＷの変化
を均等に分配するために、レポーター発光の中央付近に
比較的鋭いフィルター遷移を有するものを用いることが
好ましい。
本質的に、このシステムは、稀有の測定感度及び選択性
能を提供する。このユニークなシステムにおいて、光は
２つの近接して連結された検出器に効率的に向けられ
る。そして、安価でコンパクトで容易に使用できるシス
テムによって高い感度及び選択性を容易に得ることがで
きる。
フローチャート システムコントローラ52はA/Dコンバーターからのデジ
タル信号をDNA塩基配列情報に変換する。ほとんどの場
合、これはコンピューターによって実行されるプログラ
ムによりリアクタイムで行なわれる。これは、検出器か
らの生データを得るのと並行してデータが処理され配列
情報が得られることを意味する。
概念的には、システムコントローラーの操作は３つの相
互作用プロセス、すなわち、データ獲得すなわり入力、
データ分析及び出力、に分解することができる。これら
のプロセスは、プロセスの「歩調を合わせ」、これらが
互いに妨害することを防止するデータの共有、及び時間
情報の共有によって相互作用する。これらの相互作用が
どのようにして起きるかの詳細は選択された言語及びハ
ードウェアに依存し、ここでは基本的な問題ではない。
このようにして行なわれるデータ獲得及び処理は第４図
のフローチャートを参照することによって理解すること
ができる。この図はDNAシーケンサー検出器からの生デ
ータを出力、すなわち、試料のDNA配列に変換すること
ができる一般的な方法を示す。第５図は検出器生出力対
時間の仮想曲線を示し、以下に述べる変数のいくつかを
例示する。この議論において、以下の用語を以下のよう
に定義する。
1. ｉは獲得される現在のデータポイントの指数であ
る。このポイントは時間ｔ（ｉ）分に得られる。
2. ｋは処理される現在のデータポイントの指数であ
る。このポイントはｔ（ｋ）分で取得されるデータに対
応する。一般的なデータ処理計画において、ｋはｉと同
一である必要はない。すなわち、データ処理はデータ獲
得よりも遅れていてよい。
3. ｔ（ｉ）はデータが獲得された時点のアレイであ
る。例:t（５）＝6.2分は、第５番目のデータポイント
が、操作開始6.2分後に得られたことを意味する。
4. Ｒ（ｉ）は反射検出器からのデータアレイである。
5. Ｔ（ｉ）は透過検出器からのデータアレイである。
6. Ｊは検出されたピークのカウントを示す。
7. Ｎは特定のピークを横切るデータポイントの数を示
す。
8. ｍはＲ（ｉ）又はＴ（ｉ）において規定されたピー
クを横切るポイントの指数である。ピークの最初におい
てｍ＝１、ピークの最後においてｍ＝Ｎである。
9. Ｗは上述のセクションで定義した関数である。
データ獲得 一般的なデータ獲得工程が第４図の左側のフローチャー
トによって示されている。現獲得データを示す指数ｉが
初期化される。プログラムはどれくらいの長さ操作が行
なわれるかを決定する入力、すなわちデータポイントの
総数Itotalを受容する。生データアレイＲ及びＴが初期
化された後、処理は第４図に示す獲得ループに入る。デ
ータは検出器から読まれ、デジタル化され、時間ｔ
（ｉ）においてそれぞれ獲得されたＲ（ｉ）及びＴ
（ｉ）としてアレイ中に置かれる。（この議論の目的の
ために２つの読みは同時的である。）この時点で、指数
ｉが増加し、Itotalと比較される。ｉがItotalよりも小
さい場合には、獲得ループが繰り返される。ｉがItotal
と等しいならば操作は停止される。より精密な計画にお
いては、プログラム、操作のそれぞれのピークにおいて
いくつかの性能パラメーター（信号／ノイズ比、ピーク
解像、又は塩基割合における不確実性のようなもの）を
測定することによって自動的に操作の終了時点を知るこ
とができる。これらの因子の組合せが予め設定された基
準に合致することに失敗した場合には、操作はコンピュ
ーターによって停止される。一時データ入力は検出器か
らの生データであり、出力は、データ獲得及び分析処理
の間で共有されるデータアレイＲ（ｉ）及びＴ（ｉ）中
に保存される。この計画は第４図に模式的に示されてい
る、２つのプログラムは独立的に同時に走るが、適切な
タイミングを維持するために、何らかのコントロール情
報がこれらの間で受け渡されなければならない。例え
ば、処理プログラムは獲得工程に先行してはならない。
なぜなら、そうすることによって実存しないデータを処
理することを試みることになるかもしれないからであ
る。
データ処理 第４図の右側に示されるデータ処理アルゴリズムはレポ
ーター標識種を検出し同定する一般的な計画の例を示
す。これは全てを包含しているわけではない。これは実
際の分析器プログラムを開発するために必要な主たる特
徴を例示しているだけである。
処理指数ｋ（獲得指数ｉとは区別される）を初期化した
後、プログラムは単純なループに入り、ここで獲得プロ
グラムによって提供される生データアレイからのデータ
Ｒ（ｋ）及びＴ（ｋ）が読まれる。プログラムは次に現
時点がピーク上か否かを問う。この条件を決定する多く
のアルゴリズムが存在し、その詳細はここでは述べな
い。「ピーク」という語は、一般的な意味を意味する。
Ｒにおけるピークには、一般に、Ｔにおけるピークが伴
なう。しかしながら、レポーターの同一性に依存して、
これら２つのチャネルにおけるピークはその強度がかな
り異なるかもしれない。しかしながら、これらは時間的
には一致する。従って、２つの信号の荷重平均、２つの
信号の強い方又はＲ（ｋ）とＴ（ｋ）との他の組合せは
時間における「ピーク」を規定するのに用いることがで
きる。
現処理ポイントがピーク上にない場合には、指数ｋは増
加され、獲得指数ｉと比較される。ｋはItotalと同一で
ある場合には、操作は終りプログラムは停止する。ｋが
ｉよりも小さい場合には、アレイＲ及びＴから次のデー
タポイントがもたらされ、ループが再び実行される。ｋ
がｉに等しいならば、それは処理がデータ獲得に追いつ
いたことを意味する。この場合には、処理プログラムは
短時間（通常１秒）待ち、処理が再び続行することがで
きるまでｋ及びｉの値を試験する。
現処理ポイントがピーク上にあるならば、指数ｍは増加
される。指数ｍは現ピークを横切るポイントの数を数え
る。Ｒ（ｋ）及びＴ（ｋ）値はRpeak（ｍ）及びT
peak（ｍ）と呼ばれる一次的アレイ中に置かれる。プロ
グラムは次に現ポイントがピークの最終ポイントかどう
かを調べる（これを決定するのに公知のアルゴリズムが
存在する）。もしこれがピーク上の最終ポイントでない
場合には、プログラムコントロールはｋを増加し、その
値をｉと比較し、Ｒ及びＴアレイからのデータの次の対
を読む、より上のループに戻る。
現ポイントがピーク上の最終の点であるならば、ピーク
カウンターＪが増加され、プログラムはピークの同一性
を決定するように進行する。その結果はDNA配列の次の
塩基の同一性である。プログラムは上述したように現ピ
ークについての関数Ｗを入力データとしてアレイRpeak
（ｍ）とTpeak（ｍ）を用いて計算する。それぞれのヌ
クレオチド塩基は特徴的なＷを与える一対のピークを有
する。従って、このピークについてのＷの値に基づき、
プログラムは出力としてDNA塩基Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧの同
一性を与える。ピークポイント指数ｍ及びアレイRpeak
及びTpeakは０にリセットされ、プログラムは再び第１
図に示す上部データ獲得ループに入る。
DNA塩基配列決定における標識方法 DNA配列決定断片に塩基特異的にレポーターを結合する
のに用いられる戦略は、あらゆるDNA配列決定システム
において重要な特徴である。それぞれ本質的な利点及び
欠点を有する多くの方法がある。
プライマー標識 スミスらによって報告された上述のプライマー標識方法
は、自動オリゴヌクレオチド合成器中で生成する中間体
を用いてプライマーの５′末端に染料を結合することが
できるという利点を有する。酵素的な３′鎖伸長はほと
んど起きないと予想される。しかしながら、この方法は
多くの欠点を有する。４つの異なる染料標識オリゴヌク
レオチドプライマーが必要であり、配列決定断片の製造
を４つの別々の反応で行なわなければならず、従ってプ
ロセス全体を自動化しようとするあらゆる試みを複雑化
する。特定のプライマーが必要なので、ベクター（鋳
型）の選択に関する柔軟性が減少する。例えば、標識プ
ライマーの使用は、大量の連続するDNAを迅速に配列決
定するための戦略（例えば「ウォーキング・スルー・ザ
・ジーン」法）の利点をフルに利用することを困難にす
る。性能の領域にはより深刻な欠点が存在する。プライ
マー標識法は全ての断片、すなわち、真正な配列決定断
片及び多くのアーチファクト的断片も標識されることに
なる。従って、多くのアーチファクト（シャドウバン
ド、パイルアップ等）が従来の配列決定方法において保
持される。
断片後標識 もう１つの可能な方法は後標識計画である。この計画で
は、染料標識は配列決定断片の混合物を生成した後に行
なわれる。この方法の利点は標準的なプロトコール（マ
キサム−ギルバート又はサンガー法）を断片の標識化の
時点まで用いることができるということである。主たる
欠点は標識が例外的に選択的でなければならないことで
ある。レポーターを結合することによってDNA配列決定
断片の電気泳動移動度に測定可能な増加効果をもたらす
ことが予想されるので、この効果は全ての断片について
一定でなければならない。複数標識は鎖長と電気泳動移
動度との間の関係を破壊するので破滅的である。
鎖ターミネーター標識 この発明では第３のアプローチが好ましい。すなわち、
サンガーDNA配列決定法の修飾における鎖ターミネータ
ー標識法である。古典的なサンガー法は、４つの反応容
器において、プライマー、DNA鋳型、DNAポリメラーゼＩ
（クレノーフラグメント）、３つの非標識デオキシヌク
レオチド及び１つの放射標識DNAを用い、各々の反応容
器は、４つの塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）に対応する４つの
２′,3′−ジデオキシヌクレオチドの１つをそれぞれ含
む。プライマーの３′末端にヌクレオチドを加えること
によってポリメラーゼが鋳型を複製することを許す適当
な反応条件がつくり出される。多くのプライマーコピー
上で複数の反応が同時に起き、それぞれの断片中の適当
なヌクレオチドにおいて放射標識を全て含む異なる長さ
のDNA断片を生成し、DNAの生成は４つのジデオキシヌク
レオチドの１つによって非可逆的に終結される。この断
片の組は通常ポリアクリルアミド板電気泳動ゲル上で４
つのレーン中で分離される。この場合、１つのレーンは
４つのジデオキシヌクレオチド反応混合物のそれぞれに
対応する。断片を分離した後、感光性フィルムがゲル上
に置かれ、適当な条件下で露光され、DNA配列はゲルの
低部からの４つのレーン中の外観によって、フィルム上
のバンドのパターンの読みから決定される。
この発明に従った、サンガー法の修飾は、放射標識ヌク
レオチドを省略し、非標識２′,3′−ジデオキシヌクレ
オチドのためのレポーター標識鎖ターミネーターを置換
することである。反応混合物は、４つのDNA塩基のそれ
ぞれに対応する適当なレポーターでその３′末端が非可
逆的に標識された断片を含む。反応混合物は１つにまと
められ、電気泳動により分離される。配列はこの発明の
方法に従って、それぞれの断片が有する識別可能なレポ
ーターの外観の順序によって与えられる。
ここで用いられるレポーター標識鎖ターミネーターの構
造的範囲及び合理性の輪郭を描くために、構造を第６図
に模式的に示すように５つの成分に分解することが有用
である。蛍光標識鎖ターミネーターは、例えば、（ｉ）
三リン酸部分、（ii）「糖」部分、（iii）ヘテロ環塩
基部分、（iv）リンカー部分、及び（ｖ）レポーターが
蛍光化合物である場合にはレポーター部分を含む。
上述の記載から、「鎖ターミネーター」という語は、サ
ンガー法におけるDNA配列決定方法にとって包括的なも
のである。この発明の改良された方法は、有利にレポー
ターが結合されたより特異的な鎖ターミネーターを用い
る。これらの新規な化合物は、一般的な鎖ターミネータ
ーとは、後者が上述したように三リン酸（ｉ）、糖（i
i）及びヘテロ環塩基（iii）部分のみを有することによ
って区別される。この発明の鎖ターミネーターは「レポ
ーター標識鎖ターミネーター」と呼ばれ、通常上記した
５つの部分を全て含む。
三リン酸部分 三リン酸部分又は近似する類似体（例えばアルファ−チ
オ三リン酸）はあらゆる酵素基質、鎖終結等にとって必
須的な官能部分である。この官能部分は基質に結合エネ
ルギーの多くを与え、酵素−基質反応が実際に起きる部
位である。
糖部分 「糖」部分は天然の酵素基質における２′−デオキシリ
ボフラノース構造断片に対応する。分子のこの部分は酵
素認識に寄与し、三リン酸部分とヘテロ環塩基部分との
間の適当な空間関係を維持するために必須的である。鎖
ターミネーターの１つの要件は糖部分がリボフラノース
である場合に３′位がDNAポリメラーゼによって引き続
き用いることができる水酸基を有していてはならないこ
とである。水酸基は存在してはならず、他の基によって
置換するか又は他の方法により利用不可能にしなければ
ならない。あるいは、アラビノースのようなリボフラノ
ース類似体を用いることができる。現在、多くの修飾フ
ラノース断片がこの機能を果たすことが知られており、
これらは、２′,3′−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３′−デオキシ−
β−Ｄ−アラビノフラノシル、３′−アミノ−２′,3′
−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、及び２′,3′
−ジデオキシ−３′−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシ
ルを包含する（エフ・サンガーら、Proc.Nat.Acad.Sci.
USA,74,5436−5467（1977）；ゼット・ジー・チドゲア
バチェら、Nuc.Acids Rea.,12,1671−1686（1984）及
びゼット・ジー・チドゲアバチェら、FEBS Lett.,183,
275−278（1985））。
ヘテロ環塩基部分 ヘテロ環塩基部分は特定の空間的配位において水素結合
のアクセプター及びドナーとして働く核酸中の重要な認
識要素として機能する。これらの塩基要素は、正確な配
列決定に必要な高い忠実さをもって鋳型によって指導さ
れる適当なヌクレオチドの取り込みに必須的である。こ
の構造部分はまたレポーターを担持する。先行文献によ
り、ピリミジンの５位及びプリンの７位は全体的な結合
及び認識を有意に妨げることなく比較的大きな置換基を
担持することができることがわかっている（アール・エ
ム・ケイ・デールら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,70,2238
−2242（1973））。従って、好ましいヘテロ環塩基部分
は、ウラシル、シトシン、７−デアザアアデニン、７−
デアザグアニン及び７−デアザヒポキサンチンを包含す
る。人工の７−デアザプリンは塩基部分に純粋な電荷を
与えることなく、又はグリコシド結合を不安定にするこ
となくレポーターを結合するために採用される。従っ
て、天然のプリンは適当なヘテロ環塩基部分として働か
ない。なぜならこれらは純粋電荷を獲得し、レポーター
標識鎖ターミネーターを調製するのに通常用いられるア
ルキル化反応の後に急速に分解するからである。さら
に、類似の官能基を有する他のヘテロ環塩基も用いるこ
とができる。
リンカー部分 リンカーは単にアミノ基だけであってもよいし、炭素、
窒素、酸素及びイオウのような原子を含む背骨を有する
鎖であってもよい。
リンカーは好ましくは、三重結合の一端が１ないし20原
子の置換又は非置換ジラジカル部分R1を介してアミンに
結合されたジアルキルアミノ基である。三重結合の他端
はピリミジンの５位又はプリンの７位（プリンナンバリ
ング）に共有結合により結合されている。アルキルアミ
ノ基のアミン窒素は蛍光ラベル上の反応性官能基（例え
ばカルボニル基）に結合されている。リンカーはDNAポ
リメラーゼによる結合及び取り込みを有意に妨害しては
ならない。ジラジカル部分は、任意的に二重結合、三重
結合、アリール基又はＮ、Ｏ若しくはＳのようなヘテロ
原子を含む炭素数１ないし20の直鎖上アルキレンであっ
てもよい。ヘテロ原子は、エーテル、チオエーテル、エ
ステル、アミン又はアミドのような官能基の部分であっ
てもよい。ジラジカル部分の上の置換基は、C1〜C16ア
ルキル、アリール、エステル、エーテル、アミン、アミ
ド基及び塩素を包含する。好ましくは、ジラジカル部分
は炭素数１ないは10の直鎖上アルキレンであり、最も好
ましくは−CH2−である。この発明のレポーター標識鎖
ターミネーターに用いるのに最も適当なリンカーについ
てのより詳しい記載は継続中のホブスらの出願中に見出
される。
レポーター部分 上述の開示では、好ましくは発光種として１組の蛍光レ
ポーターからの近似したスペクトルの測定に特に適合し
た検出手段の有用性を強調した。しかしながら、近似し
たスペクトルを有する放射を発射する他の種もまた用い
ることができる。この発明の方法を実施するための適当
なレポーター種を選択するためのいくつかの基準を挙げ
ることができる。これらの基準は以下のものを包含す
る。
・単色光源による効率的な励起、及び強く、識別可能な
発光応答 ・ヌクレオチド鎖ターミネーターに直接的又は間接的に
共有結合することができる化学的に反応性の官能基の存
在 ・オリゴヌクレオチド断片中での立体的関係を動揺させ
ることを最小化するための比較的小さな質量 ・鎖ターミネーターの区別のために選択された基又は一
組のレポーターの他のメンバーと類似した電荷及び寸法
特性 ・試料調製、反応及び断片分離条件における広範囲のp
H、イオン強度及び温度に対する物理的完全さ及び検出
特性の安定さ ・DMA配列決定断片の生成及び分離に対する悪影響を最
小にする性質 適当なレポーター種は上述の特性で機能し得る物質のい
くつかのカテゴリー中に見出すことができる。それら
は、発色体、蛍光体、化学発光体、スピンラベル及び電
子高密度材料（electron dense material）を包含す
る。物質のこれらの種の検出はまた、種々の手段によっ
て達成することができる。例えば、蛍光種発光は、上述
したように、スペクトル分配を区別化することによって
検出することができる。代替的な蛍光検出システムで
は、分極化及び時間差分離（differential time−reso
lution）のような追加的な種の性質を、それぞれの塩基
に対応する標識DNA鎖ターミネーターを有する断片を固
有に同定するために採用することができる。選択された
検出手段は、公知の方法によって、信号−ノイズ比を最
大化することができ、背景又は外来性信号を最小化する
ことによって許容可能な感度を達成することができる。
この発明の固有の性質及び利点は、DNA配列決定におい
て適当な検出手段とレポーター標識鎖ターミネーターと
を結合することによって達成することができる。
同様に、従来の光度測定もこの発明の方法のレポーター
の要件を満たす発色体を検出するために用いることがで
きる、蛍光性をも有していてよい４つの固有の発色体を
選択することができ、これを鎖ターミネーター上に取り
込んで、吸光度測定及び光子計数分光光度計を包含する
種々の手段によって検出可能なレポーターを導入するこ
とができる。有用な発色体の典型的な例は2,4−ジニト
ロフェノール及びその誘導体である。適当な置換により
類似する一定の条件下における異なる発光特性をもたら
すことができ、それによって上述した装置をわずかに修
飾するだけで検出が可能になる。
ルミネッセントレポーターは再発光放射に必要な時間が
蛍光レポーターとは異なる。蛍光レポーターは通常、10
-8ないし10-3秒のオーダーの吸収入射エネルギーを再発
光する。「リン光体」という語もしばしばルミネッセン
トな化合物を示すために用いられ、これらの用語は一般
的に同義的に用いられる。これらの化合物は蛍光化合物
よりも、入射吸収エネルギーを再発光するのに時間が長
くかかる。典型的なルミネッセントレポーターは、2,
2′−ジヒドロキシビフェニル−5,5′−ジ酢酸の誘導
体、例えば2,2′−ジヒドロキシ−3,3′−ジメトキシビ
フェニル−5,5′−酢酸、2,2′−ジヒドロキシビフェニ
ル−5,5′−ジアラニン、2,2′−ジヒドロキシビフェニ
ル−5,5′−ジエチルアミン等である。
コロイダル金粒子のような、電子高密度試薬として働く
追加的な種を共有結合的に鎖ターミネーター結合するこ
とができる。これらの物質は、電気泳動ゲルレーンに入
射する光の透過性の小さな変化を検出することができる
映像化システムに用いることができる。それぞれの鎖タ
ーミネーターを固有にラベルして塩基割当を行なうため
に、適当な検出基と共にスピン標識もまた用いることが
できる。これらの例における検出手段の複雑さの故に、
分離手段に試料をかける前に試料を１つにまとめるので
はなく、試料をそれぞれのレポーター標識鎖ターミネー
ターについて分離した試料を維持する単純化が必要とな
るかもしれない。
特定のシステムにおいて、４つのレポーター標識ヌクレ
オチド鎖ターミネーターのさらなる区別化のために、上
述したレポーターの組合せを検出するための適当な手段
を容易につくることができることは当業者にとって明ら
かであろう。これは、強い蛍光及び吸光性を有する、鎖
ターミネーターに共有結合的に結合された化合物につい
て特に適用可能である。しかしながら、上述した所望の
性質に応じて用いるために選択された上述のレポーター
のあらゆる組合せは、検出手段の相補的なアレイを有す
るシステム中で用いることができる。
この発明の好ましい具体例におけるより具体的な例で
は、蛍光部分は、アルゴンイオンレーザーのような適当
な光源からのエネルギーの吸収によって励起された後
に、検出可能な発光光線を与える。それぞれのDNA塩基
について固有の蛍光レポーターを有することが好まし
く、識別可能な４つの蛍光レポーターの組で一般的に十
分である。
この発明のDNA配列決定方法において有用なレポーター
の一群がこの目的のために特に発明され、これは公知の
染料９−カルボキシエチル−６−ヒドロキシ−３−オキ
ソ−3H−キサンテン系である。エス・ビッグスらは、J.
Chem.Soc.,123,2934−2943（1923）において、レゾルシ
ノール環構造中の２位又は４位（サクシニルエオシン）
にホウ素置換基を有すると推測されるいくつかのサクシ
ニルフルオレッセイン誘導体の製造を開示している。サ
クシニルフルオレッセイン上にジニトロ及びテトラニト
ロ置換基を有する追加的な誘導体もまた調製された。こ
れらの染料は明らかに以前の方法よりも単純で効率的な
方法であった。しかしながら、これらの染料間の関係は
開示されておらず、発光スペクトルを含むそれらの物理
的特徴の有位な特徴づけも行なわれていない。この発明
によってDNA配列決定するために有用であるとわかった
この群の蛍光レポーターは次の構造を有する。
ただし、ｎは２又は３、R1及びR2はＨ、低級アルキル、
低級アルコキシ、ハロゲン又はシアノ基である。これら
の物質は、無水コハク酸又は無水グルタル酸を、メタン
スルフォン酸中の適当な置換レゾルシノール中で縮合す
ることによって容易に製造することができる。これは、
親化合物の製造についてビッグズらによって報告された
方法の修飾である。
ピー・カーナらは、（米国特許第4,481,136号）におい
て、R2がアルキル基でR1がＨである場合の構造１を含む
化合物の群及びその蛍光抗原結合体の製造における利用
を開示した。蛍光免疫分析におけるその個々の利用は開
示されているが、DNA配列決定にこれらの染料の群を用
いることを要求する有用性については何も記載されてい
ない。
キサンチン染料はいくつかの異なる、一般的に互変的な
分子形態をとることができることが知られている。親
（１、ｎ＝２、R1＝R2＝Ｈ）について下記に示すこれら
の形態は、キノ−、デルタ−、スピロ−、及びロイコ−
形態として知られている。特定の状況下において観察さ
れる形態は、ｎ、R1及びR2の性質並びに温度、溶媒、pH
及び結晶形態のような条件によって決定される。明瞭性
及び利便性のために、構造の命名及び図示のためのキノ
−形態のみを用いる。
実際の蛍光種は、キノ−形態から形態的に誘導されるジ
アニオン２である。この種は７を越えるpHを有する水溶
液中で一般的に多数を占める。親染料（ｎ＝２、R1＝R2
＝Ｈ）から誘導されるジアニオンは、486nmで操作され
るアルゴンイオンレーザーによって励起するのに非常に
適している。pH8.2において、この種は487nmに最大吸収
を示し、この場合の吸光係数は約72,600である。この種
はフルオレッセインの効率（量子効率約0.9）に匹敵す
る効率を伴って505nmで発光する。
４つの識別可能な蛍光染料の組は、置換基R1及びR2を変
えて親発色体の発光最大値に小さな変化を導入すること
によって生成することができる。吸光スペクトルの対応
する小さな相違は、487nmで操作されるアルゴンイオン
レーザーによる効率的な励起を維持する。R1及びR2を、
純粋電荷を担持しない比較的小さな置換基に限定して選
択することにより、染料がDNA断片に結合された場合の
電気泳動移動度における差別化効果が小さくなることを
確保することができる。
DNA配列決定に適したこれらの染料の好ましものは、
（構造１、ｎ＝２、１）（１）R1＝R2＝Ｈ、吸収486n
m、発光505nm、（２）R1＝Ｈ、R2＝CH3、吸収494nm、発
光512nm、（３）R1＝CH3、R2＝Ｈ、吸収500nm、発光519
nm、（４）R1＝R2＝CH3、吸収509nm、発光526nmのもの
である。最も長い波長に最大吸収を有する染料は約50％
の励起効率を示す。これらの４つの染料はDNA配列決定
にとって適当な濃度において容易に検出し識別できる。
鎖ターミネーターへの染料の結合 これらのキサンテン染料の共有結合は、カルボン酸の官
能性を介して、リンカーのアミ基とのアミド結合によっ
て行なわれる。染料を適当な形態にロックして結合中の
副反応を最小化するために化学保護基を導入することは
有用である。
染料（１）をピリジン中でアルキル又はアリール酸無水
物（Ｒ′）と反応させ、次いで過剰のアルキルアルコー
ル（Ｒ″）とで処理することにより、３位及び６位にア
シロキシ基を有し、９位にアルコキシ基（アルコールか
ら誘導される）を有する新規な保護された染料（３）が
得られる。アシル基がアセチルであり、アルコキシ基が
エトキシである化合物は製造が容易で良好な安定性、結
晶性及び有機溶解性を示す。濃縮アンモニア水で短時間
処理すると遊離の染料が再生成される。
保護染料（３）は多数の標準的操作の１つを用いてカル
ボキシル基を介してアミンに結合される。アミド結合が
好ましい。なぜならアミド結合は安定で形成するのが容
易で、水系に適合するからである。これらの操作におい
て活性な種は、一般的に−Ｘが良好な脱離基である構造
４の中間体である。
これらの活性種は通常その場で生成されて結合される
が、中間体を分離精製することができる場合もある。特
に有用な単離可能な活性化中間体の群はNHSエステル５
である。これらの化合物は、保護された染料３をＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドの存在下で、N,N−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド又は好ましくは１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・塩酸
塩のような適当なカルボジイミドとで処理することによ
って容易に調製することができる。これらは安定で高度
に結晶性の化合物であり、種々の溶媒中で第１及び第２
アミンと完全に反応する。第１及び第２アミンは、この
発明のシステムにおいて分析される目的とする物質によ
って提供される。これらの物質は典型的には、修飾サン
ガーDNA鎖伸長プロトコールにおいて有用な所望のデア
ザプリン及びピリミジン塩基を含むジデオキシヌクレオ
チド又はその類似体である。
NHSエステル５は、広範囲の第２アミンに結合させるた
めに直接用いることができる。アンモニア准で生成物を
脱保護することによって、完全な蛍光強度を示す染料標
識アミン誘導体６が得られる。
NHSエステル５を第１アミンに結合することは迅速で完
全であるが、脱保護によって、通常、標識アミンの蛍光
強度が減少する。これは、蛍光物質7aの非蛍光スピロラ
クタム形態7bへの部分的な平衡に起因する。平衡の程度
は、溶媒、pH及びアミンに依存する。この問題は染料と
アミンとの間にスペーサーを挿入することによって軽減
することができる。スペーサーはジアミン若しくは二酸
から選択することができ、又は第２級アミン及びカルボ
ン酸を担持する分子から選択することができる。好まし
いスペーサーは染料のカルボキシル基とアミド結合を形
成することができる反応性アミンを含む。スペーサーは
主としてレポーター、特に蛍光染料と関連し、これはス
ピロラクタム形態への環化を防止するために反応性アミ
ンを染料から移動させるように機能する。これはまた、
スペーサーがDNAポリメラーゼ活性部位からより遠くに
染料を延ばす働きをするという観察と一致する。この伸
長はレポーター標識鎖ターミネーターのDNA断片への取
り込みを改善する。
対照的に、NHSエステル５を好ましい第２級アミンに結
合すると、スピロラクタム形態への環化が見られず、活
性化及び目的のアミンへの結合のためのカルボン酸を担
持する種が得られる。
例えば、単純で有効なスペーサーはアミノ酸ザルコシン
から構築することができる。NHSエステル５をザルコシ
ンベンジルエステルに結合し、次いでベンジルエステル
を除去することによって、構造８のカルボン酸が得られ
る。保護された染料３の場合と同様に、これらのカルボ
ン酸８は、多くの標準的な方法のいずれか１つを用いて
アミンに結合することができる。ここでもまた、構造９
のNHSエステルが単離可能で特に有用である。
NHSエステル９をアミンに結合し、次いでアンモニア水
中で脱保護することによって、完全に蛍光的な一般構造
10のアミン誘導体が得られる。
一般的な規則として、適当なスペーサーで到達すること
ができる第１級アミンを含む目的の物質を設計し又は得
ることが好ましい。スペーサーを挿入することによって
環化反応が防止されるものと信じられる。第２級アミン
を用いることもできるが、第１級アミンと同じようには
迅速にかつ効率的に反応しない。
代表的な蛍光標識鎖ターミネーターは11である。この物
質は収束型の経路を介して構築することができる。
２′,3′−ジデオキシウリジンが市販の２′−デオキシ
ウリジンから５工程で調製される（ケイ・イー・フィッ
ツナーら、J.Org.Chem.,29,1508−1511（1964））。
５′−三リン酸はジェイ・エル・ルースら、Mol.Pharma
col.,20,415−422（1981）の１容器法を採用することに
よって直接調製される。３−アミノ−１−プロペン−１
−イルリンカーは、ピー・ランガーら、Proc.Nat.Acad.
Sci.USA,78,6633（1981）及び欧州特許出願第82301804.
9（1982）に記載された一連の反応を採用することによ
ってヘテロ環塩基の５位に結合される。５−（３−アミ
ノ−１−プロペン−１−イル）−２′,3′−ジデオキシ
ウリジン−５′−三リン酸をNHSエステル９（Ｎ＝２、R
1＝R2＝Ｈ）と反応させ、次いでアンモニア水で短時間
処理することによって、新規な蛍光標識鎖ターミネータ
ー11が得られる。
化合物11は、修飾サンガープロトコールにおいてddTTP
を置換する。４つの鎖ターミネーターの完全な組は化合
物11と、異なるヘテロ環塩基及び蛍光部分を有する３つ
の類似体とから成ることができる。修飾サンガープロト
コールの残った非標識鎖ターミネーターを置換するため
の３つの類似体の調製は、化合物11のヘテロ塩基部分
（ウラシル）をシトシン（ddCTPに対し）、７−デアザ
アデニン（ddATPに対し）又は７−デアザグアニン（ddG
TPに対し）で置換することを含む。蛍光部分は、芳香族
置換基R1及びR2を、両方ともＨから、それぞれCH3と
Ｈ、ＨとCH3、及び両方ともCH3に変えることによって変
えることができる。化合物は、11について記載されたの
と類似する経路を介して調製される。
３−アミノ−１−プロペン−１−イルリンカーを３−ア
ミノ−１−プロピン−１−イルリンカーで置換すること
によって、より容易に調製することができる機能的に均
等なレポーター標識鎖ターミネーターが得られることが
わかった。プロピニルリンカーを用いることにより、プ
ロペニルリンカーを用いて製造されるものよりも安定な
レポーター標識鎖ターミネーターがより高い収率で得ら
れる。もう１つの利点は、プロピニルリンカーは、プロ
ペニルリンカーよりも部分選択的にヌクレオチド塩基に
結合することができることである。
従って、この発明によって修飾されたサンガー鎖伸長方
において用いるのに好ましいレポーター標識鎖ターミネ
ーターは12、13、14及び15である。
さらに、蛍光染料が一旦デアザプリン又はピリミジン塩
基にリンカー及び任意的なスペーサーを介して結合され
ると、その正規の発光最大が幾分長波長側にシフトする
ことが予想される。この効果は、塩基の性質並びにpH、
イオン強度、溶媒、分離媒体等のような測定条件にある
程度依存する。あるいは、発光体の発光特性に影響を与
えるように思われない１つの因子は、蛍光標識鎖ターミ
ネーターを有するDNA断片中の隣接するヌクレオシドの
性質である。特定の蛍光体の発光は、その鎖ターミネー
ターがいずれの隣接するピリミジン又はプリンに酵素的
に結合された場合でも一定に保たれるように思われる。
例えば、上述したレポーター標識鎖ターミネーターは、
488nmで励起すると、515nm（12）、524nm（14）、530nm
（13）及び536nm（15）に発光最大を有する。同様の測
定条件下において、これらの発光体は未結合の、溶液中
で遊離の状態において、正規の最大発光505nm、512nm、
519nm、及び526nmをそれぞれ有する。発光最大のこれら
のシフトは容易に測定することができ、定型的な実験に
より決定することができる。同様に、この発光最大のバ
ラツキの特徴づけにより、この発明のシステムにおける
二色フィルター又はその均等物の所望の反対／透過特性
を選択することができる。
DNA合成酵素の選択は、鎖ターミネーターの特異的な構
造によって主に決定される。例えば、化合物11は、DNA
ポリメラーゼＩ酵素のクレノーフラグメントでは配列特
異的終結を与えるのに失敗し、AMV逆転写酵素又はバク
テリア ファージT7ポリメラーゼを用いて焼結した場合
には、末端は、ddTTPで観察されるもの（従来の32Pラベ
ルを用いて判定されるように）と実質的に同一の末端を
与える。
鎖伸長／終結反応は、状況（例えば所望の末端の範囲、
包含される自動化の程度）に応じて、別々の容器内又は
単一の容器内で行なわれる。蛍光標識鎖ターミネーター
及びdNTP濃度は配列決定断片の適当な濃度を与えるよう
に調節される。蛍光標識DNA配列決定断片は、その32P標
識対応物よりも大きな安定性を示し、時間が経つと分解
する32P標識断片と異なり、直ちに又は後で電気泳動的
に分析することができる。
従来技術の多くの本来的な欠点を克服することに加え、
この発明はまた、多くの操作的利点を与えるので有意義
である。最も重要なことには、ターミネーター標識が、
結合したレポーターを塩基特異的終結現象と密接に関連
付ける。正規の終結から得られたDNA配列のみがレポー
ターを担持する。これにより、従来の配列決定において
観察された多くのアーチファクトが排除される。これは
配列決定ベクターの選択に完全な柔軟性を与える。なぜ
なら、特定のプライマーが関与してはいないからであ
る。この発明の４つの低分子鎖ターミネーターによって
レポーターが担持されているいという事実によって、自
動化が容易に行なわれ、単一の反応で選択的に導入する
ことができる。本来的な操作的欠点はない。このアプロ
ーチにおける問題はその設計段階において生じる。一般
に、DNAポリメラーゼは高度に基質特異的である。４つ
のレポーター標識鎖終結化剤は、結合されたレポーター
基が、塩基取り込みの程度又は忠実さを過度に妨害しな
いように慎重に設計されなければならない。
高い性能ポテンシャル及び多くの操作上の利点により、
レポーター標識鎖ターミネーター法が、修飾サンガー法
を介してレポーター標識DNA配列決定断片を調製するた
めの方法として優れたものとなる。
プライマー標識 ここで記載した染料は、蛍光標識鎖ターミネーターの調
製において最も有利に用いられるが、これらはまたプラ
イマー標識アプローチにおいても用いることができる。
検出、識別及び電気泳動移動度に関するこれらの物質の
優れた性能により、この出願が、スミスらのシステムの
実質的な改良となる。
スミスらの方法では、保護された、アミノ誘導ヌクレオ
シドフォスフォラミジト（phosphoramidite）が、自動
合成器を用いて５′−アミノ−５′−デオキシオリゴヌ
クレオチドを調製するために用いられる。この物質は、
精製され、次いで別々の非自動的反応において４つの異
なる染料に結合される。４つの染料標識オリゴヌクレオ
チドは精製され、通常の放射標識デオキシヌクレオチド
を省略したサンガープロトコールにおいてプライマーと
して用いられる。
この出願において記載された染料の保護された誘導体
（例えば３）の利用可能性により、保護された染料で標
識されたヌクレオシドフォスフォラミジドを設計するこ
とが可能になる。自動合成器中で用いた場合には、この
様な試薬は、最終の５′残基及び蛍光レポーターを同時
に導入することを可能にする。この利点により、主導的
結合及び余分な精製を行なう必要性が排除される。
典型的な保護された、染料標識ヌクレオシドフォスフォ
ラジミド試薬は、次のようにして構築することができ
る。NHSエスエル５をその場で生成し、５′−デオキシ
−５′−（メチルアミノ）チミジンと反応させることに
よって、保護された染料標識ヌクレオシド誘導体16が得
られる。標準的な方法を用いて３′亜リン酸化を行なう
と、対応するフォスフォラミジト17が得られる。
プライマーとして働く５′−染料標識オリゴヌクレオチ
ドを構築するために、５′末端がＴ残基を有する配列が
選択される。17が最終的なフォスフォラミジト試薬とし
て用いられることを除き、自動化合成が通常通り行なわ
れる（ジメトキシトリチル（DMT）保護基が存在しない
ので、最後の酸処理は省略することができる）。固体支
持体からオリゴヌクレオチドを放出するアンモニア水で
の処理はまた、染料を脱保護化する働きをする。脱保護
は、ヌクレオチド塩基を脱保護するために用いられる延
長されたアンモニア処理に続いて完了する。標準調製電
気泳動により染料標識オリゴヌクレオチドがもたらされ
る。
この方法論はプライマー標識方法論における固有の問題
を回避しないが、スミスらのシステムに用いられるプラ
イマーよりも優れた性能を提供する。電気泳動度の区別
的シフトは最小化され、検出／区別は上述のように、大
いに改良される。
他の染料有用性 これらの染料は、DNA鎖ターミネーターを標識するのに
有用なだけでなく、蛍光レポーターとして一般的に有用
であると予想される。これらは、免疫分析、特異的結合
分析、組織化学染色若しくは蛍光標識を必要とする他の
用途に用いられるタンパク質、ハプテン、リボ核酸又は
生物学的に興味のある他の分子を標識するのに用いるこ
とができる。これらの物質の標識は、アミンの標識につ
いて上述したのと類似する公知の方法を用いることによ
って行なうことができるものと思われる。これらの組成
物は特定の用途において２以上の蛍光レポーターが必要
な場合に特に有用であると予想される。なぜなら、これ
らは、単一の単色光源によって効率的に励起することが
でき、そのシフトされた発光最大の故に区別可能なレポ
ーターとして検出することができる。これらは、これら
の染料をDNA配列決定のレポーターとして有用としたの
で同じ蛍光性である。これらの染料は、公知のフルオレ
ッセインにおいて一般的に必要な、異なる官能基を用い
るのではなく、同一の化学的官能性を用いることによっ
て結合することができるというさらなる利点を有する。
非環状ヌクレオシド誘導体 従来の32P配列決定において、２′,3′−ジデオキシヌ
クレオシド三リン酸（ddNTP）は鎖ターミネーターとし
て実質的に排他的に用いられるが、上述したように、他
の糖修飾誘導体もまた用いることができる。これらの物
質は、製造するのが比較的困難であるという欠点を有す
る（ddNTPについても幾分そうである）。より単純でよ
り容易に導入することができる糖を有する鎖ターミネー
ターの有効な組が、従来の32PDNA配列決定及び蛍光系配
列決定（蛍光レポーターがヘテロ環塩基に結合されてい
る）の両方において有用であろう。
抗ウイルス剤アシクロバー（アシクログアノシン）にお
いて、２−ヒドロキシエトキシメチル基が２′−デオキ
シリボフラノシル基に置換されている。アシクロバーは
対応する三リン酸（AcyGTP）にその場で代謝される。Ac
yGTPは種々のポリメラーゼに対する競合的又は非競合的
阻害剤として用いられている。それはまた、広くこれら
の酵素の鎖終結代替基質であるが（ピー・ブイ・マクガ
ートら、Antimicrob.Agents and Chemother.25,507
（1984））、その阻害的成分はその基質の行動の正しい
分析を複雑にした。アシクロバーの抗ウイルス活性は選
択的にウイルスポリメラーゼを阻害するその能力によっ
て説明され得るので、AcyGTPの処理速度及びそれによっ
て得られる生産物は完全には特徴づけられていない。
（チミジン、アデノシン及びシトシンの対応する非環状
三リン酸は報告されているが、それらとポリメラーゼと
と相互作用はより以上に特徴づけられていない。）従来
技術において、非環状ヌクレオシド三リン酸（AcyGTP）
が、DNAの重合を、ddNTPのような化合物の効率及び忠実
さと同程度に鎖終結することは全く知られていない。さ
らに詳細に言うと、AcyNTPが、DNA配列決定実験におい
て潜在的な鎖ターミネーターとして用いられた際にシー
クエンシングラダーをもたらすということは報告されて
いない。
この発明の他の局面において、非環状ヌクレオシド三リ
ン酸（AcyNTP）はサンガー法によるDNA配列決定におけ
る鎖ターミネーターとして有用であることが示された。
これは、ddNTPに代えてAcyNTPを用いて、従来のサンガ
ー配列決定（32Pヌクレオチドレポーター）を行なうこ
とによって示された。得られたシークエンシングラダー
な同様なDNA断片のバラツキを得るためにより高い濃度
の（約10倍）AcyNTPが必要であるということを除き、実
質的に同一である。
AcyNTPはDNAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）
及びAMV逆転写酵素の両方に対して有効であった。
AcyNTPは、ddNTPよりも容易に合成できるという利点を
有する。これは従来の配列決定における主たる問題では
ないが、構造的に複雑なレポーター標識鎖ターミネータ
ーが調製される場合には有意義である。２−オキシエト
キシメチル基を糖部分（先に定義した）として用いるこ
とによって、許容可能な性能を維持しながら試薬合成が
大幅に単純化された。
実験 以下の例は例示のために記載されたものであり、限定的
なものではない。
全ての温度は摂氏で表わされている（室温は25度を意味
する）。他に明示がない限り、液体の混合物を除き（こ
れは体積基準）、全ての部及び％は重量基準である。次
の略記を採用した。DMF＝ジメチルホルムアミド、DMSO
＝ジメチルスルホキシド、NHTFA＝トリフルオロアセト
アミド基、TEAB＝炭酸水素トリエチルアンモニウム、Tr
is＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、SF＝ス
クシニルフルオレセイン、NMR＝核磁気共鳴スペクト
ル、IR＝赤外吸収スペクトル、UV＝紫外スペクトル又は
検出、TLC＝シリカゲル上での薄層クロマトグラフィ
ー、GC＝ガスクロマトグラフィー、mp＝融点、mp ｄ＝
分解を伴う融点、bp＝沸点。NMRデータを記載するにあ
たり、化学シフトはppmで示し、結合定数Ｊはヘルツで
示した。全ての融点は補正していない。イオン交換樹脂
は使用前に適当な水性溶媒及び有機溶媒で洗った。ここ
で記載する全ての化合物の同一性は、適当なスペクトル
的及び分析的手法により確立された。他に断りがない限
り、シリカゲル上でのクロマトグラフィーによる精製
は、スチルら、J.Org.Chem.,43,2923−2926（1978）に
従った。
例 １ 505nm蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の調製 A. ９−（カルボキシエチルデン）−3,6−ジヒドロキ
シ−9H−キサンテン（SF−505）の調製 レゾルシノール（33.0g,0.300モル）と無水コハク酸（3
0.3g,0.300モル）とを丸底フラスコに入れ、窒素でパー
ジした。メタンスルホン酸（150ml）を加え、溶液を65
℃で２時間窒素雰囲気下で撹拌した。反応混合物を、激
しくかきまぜている氷冷水（1L）に一滴づつ加え、これ
と同時に50％水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを2.5±
0.5に保持した。粒状の沈殿として現われた生成物をろ
過して集め、水（３×100ml）で洗い、次にアセトン
（３×100ml）で洗った。生成物を空気乾燥し、次いで1
10℃で18時間真空乾燥（真空炉）すると、暗赤色の粉末
（37.7g,88％）が得られた。
1.0gの生成物を熱い0.3N HCl 25mlに溶解することに
よって分析試料を調製した。冷却することによって形成
された沈殿をろ過によって除き捨てた。薄い水酸化ナト
リウムを加えてpHを1.25に上げた。得られた沈殿をろ過
によって集め、水ですすぎ、空気乾燥し、P2O5上で140
℃で36時間真空乾燥した。
元素分析：計算値［Ｃ（16）Ｈ（12）Ｏ（５）］C67.6
0,H4.26.実測値:C6.37,H4.34,0.52％ 水（Ｋ−Ｆ）． NMR（DMSO−d6）（殆どスピログラム型）：δ2.690（t,
J＝8.6hz,2H）,3.070（t,J＝8.6hz,2H）,6.530（d,J＝
1.8hz,2H）,6.676（dd,J＝8.7,1.8hz,2H）,7.432（d,J
＝8.7,1.8hz,2H）,9.964（S,2H）． 可視吸収（pH8.2;50mM aq Tris/HCl）：最大486nm（7
2,600）． B. ９−（２−カルボキシエチル）−3,6−ジアセトキ
シ−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−505）の
調製 SF−505（29.3g,103mmol）を氷冷無水酢酸（500ml）に
加え、次にピリジン（100ml）を加えた。混合物を氷中
で20分かきまぜ、次に氷冷水（7L）に迅速にかきまぜな
がら20分間にわたって加えた。さらに30分間かきまぜた
後、中間生成物をろ過し、水（4L）に再懸濁し、さらに
30分間かきまぜた。固体をろ過によって集め、絶対エタ
ノール（1L）に溶解し、45分間還流した。この溶液を回
転蒸発器上で200mlに蒸留すると結晶化した。生成物を
ろ過によって集め、空気乾燥し、次いで真空乾燥して薄
オレンジの微結晶（21.9g,51％）を得た。
塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶すると、無色
の微結晶が得られた。
M.P.:142−143℃． 元素分析：計算値［Ｃ（22）Ｈ（22）Ｏ（８）］C63.7
6,H5.35.実測値:C63.58,H5.39. NMR（DMSO−d6）：δ1.035（t,J＝6.9hz,3H）,1.667
（m,2H）,2.232（m,2H）,2.294（s,6H）,2.888（q,J＝
6.9hz,2H）,7.0−7.1（m,4H）,7.575（d,J＝9.1hz,2
H）． C. ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル））−エチル−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−9
H−キサンテン（Ac2EtSF−505−NHS）の製造 Ac2EtSF−505（10.4g,25.1mmol）を塩化メチレン（300m
l）及び１−（３−ジメチル−アミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミド・塩酸塩（9.70g,50.6mmol）と混
合し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（4.32g,37.5mmo
l）を加えた。この混合物を１時間かきまぜ、水（５×5
0ml）で洗った。１つにまとめた水層を塩化メチレン（5
0ml）で逆抽出し、プールした有機層を硫酸ナトリウム
上で乾燥し、引きはがした。エタノール（75ml）でつき
砕き、ろ過し、空気乾燥すると、淡黄色の固体として粗
生成物が得られた（約10g）。この物質を塩化メチレン
（50ml）に溶解し、シクロヘキサン（50ml）を加えた。
スプーン１杯のチャコールを加え、混合物をろ過し、生
成物を追加的なシクロヘキサン（100ml）につき崩し
た。ろ過による回収、空気乾燥及び真空乾燥により無色
の結晶（6.94g,54％）が得られた。
エタノールからの第２の結晶化によって分析試料が得ら
れた。
M.P.:162−３℃． 元素分析：計算値［Ｃ（26）Ｈ（25）Ｎ（１）Ｏ（1
0）］C61.05,H4.93,N2.74.実測値:C60.78,H5.01,N2.65. NMR（DMSO−d6）：δ1.056（t,J＝7.0hz,3H）,2.4−2.1
（m,4H）,2.293（s,6H）,2.757（s,4H）,2.922（q,J＝
7.0hz,2H）,7.069（m,4H）,7.617（ｐ d,J＝9.1hz,2
H）． D. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−5
05−Sar−OBn）の調整 塩化メチレン（50ml）中のザルコシンベンジルエステル
＊（1.13g,6.13mmol）にAc2EtSF−505−NHS（2.58g,5.0
5mmol）及び５％炭酸水素ナトリウム水溶液（30ml）を
加えた。この２相混合物を20時間激しくかきまぜた。層
を分離し、有機層を３×15mlの水で洗い、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、25mlに濃縮した。この溶液をシクロヘキ
サンで150mlに希釈し、チャコール処理し、窒素気流下
で75mlに濃縮すると生成物が沈澱した。上清をデカンテ
ーションにより除き、残渣を塩化メチレンと共蒸発させ
ると無色の泡（1.70g,58％）が得られた。
激しく真空乾燥すると分析試料が得られた。
元素分析：計算値［Ｃ（32）Ｈ（33）Ｎ（１）Ｏ
（９）］C66.77,H5.78,N2.43.実測値:C66.66,H5.89,N2.
25 NMR（DMSO−d6）：（アミド結合回転異性体の5:2混合物
を示す）δ（主および副）1.040および1.018（t,J＝6.7
hz,3H）,1.789および1.670（m,2H）,2.211（m,2H）,2.2
90および2.276（s,6H）,2.713および2.695（s,3H）， 2.893（q,J＝6.7hz,2H）,3.963（s,2H）,5.075および5.
039（s,2H）,7.044（m,4H）,7.324（m,5H）,7.573およ
び7.516（ｐ d,J＝9.2hz,2H）． ＊ ザルコシンベンジルエステルｐ−トシレート塩（ア
ダムス・ケミカル・カンパニー）を塩化メチレンに取
り、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で繰り返し洗い、次
いで水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピ
ングした。
E. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシンイ
ミジロキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エチ
ル）3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−9H−キサンテ
ン（Ac2EtSF−505−Sar−NHS）の製造 Ac2EtSF−505−Sar−OBn（1.55g,2.69mmol）の絶対エタ
ノール（60ml）溶液に10％パラジウム付着カーボンを加
えた。この混合物を水素の風船圧力下で30分間かきまぜ
た。触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッピ
ングするとシロップ状の残渣が得られた。
この残渣を塩化メチレン（85ml）に溶解し、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（0.495g,4.30mmol）及び１−（３
−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイ
ミド・塩酸塩（1.12g,5.84mmol）を加えた（４×25m
l）。この溶液を25mlに濃縮し、シクロヘキサンで175ml
に希釈し、チャコール処理し、窒素気流下で75mlに濃縮
した。固体生成物をろ過によって集め、空気乾燥し、真
空乾燥すると無色の粉末（0.97g,62％）が得られた。
塩化メチレンと共蒸発し、40℃で激しく真空乾燥すると
痕跡量のシクロヘキサンが除去され、非晶質固体として
分析試料が得られた。
元素分析：計算値［Ｃ（29）Ｈ（30）Ｎ（２）Ｏ（1
1）］C59.79,H5.19,N4.81.実測値:C59.37,H4.62,N4.62,
0.93％水（Ｋ−Ｆ）． NMR（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の4:1混合物を
示す。）：δ（主および副）1.034（t,J＝6.9hz,3H）,
1.827および1.935（m,2H）,2.223（m,2H）,2.289（s,6
H）,2.758（s,4H）,2.779および2.824（s,3H）,2.888
（q,J＝6.8hz,2H）,4.333および4.473（s,2H）,7.043
（m,4H）,7.587（per d,J＝9.1hz,2H）． 例 ２ 512nm蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の調製 A. ４−メチルレゾルシノールの調製 2,4−ジヒドロキシベンジルアルデヒド（33.97g,0.246m
ol）（トルエンから再結晶した）を、ガス入口と泡立て
出口とが嵌合された丸底フラスコ中で3Lの分光グレード
の２−プロパノールに溶解した。10％パラジウム付着カ
ーボン（1.35g）を加え、次いで3mlのリン酸を加え、混
合物を窒素でパージした。窒素流を水素に代え、混合物
を氷冷しながら激しくかきまぜた。３時間後、水素の取
り込みが完了し、触媒をろ過によって除去した。ろ液を
ストリッピングして200mlにし、200mlの酢酸エチルを加
えた。溶液を４×200mlの水で洗い、１つにまとめた抽
出物を酢酸エチルで逆抽出した。これらの有機抽出物を
水で洗い、１つにした有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥
し、ストリッピングすると無色の結晶固体（29.95g,98
％）として生成物が得られた。
M.P.:106℃（Lit.106−107℃［ジェイ・シー・ベル、ダ
ブリュー・ブリッジ、およびエー・ロバートソン、J.Ch
em.Soc.,1542−45（1937）］． NMR（DMSO−d6）：δ1.961（s,Me）,6.076（dd,H−6,J
［5,6］＝8hz,J［2,6］＝2hz）,6.231（d,H−２）,6.76
0（d,H−５）,8.867（s,OH）,9.008（s,OH）． B. ９−カルボキシエチリデン−3,6−ジヒドロキシ−
2,7−ジメチル−9H−キサンテン（SF−512）の調製 ４−メチルレゾルシノール（25.8g,0.208mol）と無水コ
ハク酸（20.8g,0.208mol）を丸底フラスコに入れ、フラ
スコを窒素でバージした。150mlのメタンスルホン酸を
加え、溶液を窒素下で65℃まで２時間加熱した。溶液を
1Lの、激しくかきまぜられた氷冷下に一滴づつ加え、こ
れと同時に50％の水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを
2.5±0.5に維持した。生成物を遠心によって集め、水で
３回、アセトンで２回洗った。固体を空気乾燥し、次に
110℃で真空乾燥すると、レンガ赤色の粉末が得られた
（24.1g,74％）。
酢酸エチルをゆっくりと生成物のジメチルスルフォキシ
ド溶液中に拡散させることによって生成を行なった。沈
殿をろ過によって集め、空気乾燥し、真空乾燥した。
NMR（DMSO−d6）（１モルの水及びジメチルスルホキシ
ドと共に純粋なデルタ型を示す。）：δ2.124（s,6H）,
3.421（d,J＝7.2hz,2H）,5.769（t,J＝7.2hz,1H）:6.51
2（s,1H）,6.573（s,1H）,7.295（s,2H）,9.681（s,1
H）,9.825（s,1H）,12.346（bs,1H）． 可視吸光． （pH 8.2 aq Tris）：最大493.5nm. C. ９−カルボキシエチル−3,6−ジアセトキシ−2,7−
ジメチル−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−5
12）の調製 SF−512（20.0g,64.0mmol）の試料を350mlの無水酢酸に
加え、次いで80mlのピリジンを加えた。これを１時間か
きまぜ、ろ過して痕跡量の未反応試料を除去した。ろ液
を3.5Lの激しくかきまぜられている水に注いだ。固体の
中間体をろ過によって集め、2Lの冷水に再懸濁し、15分
間かきまぜ、次いで再び集め、空気乾燥するとスピロラ
クトン中間体（20.8g）が得られた。これを600mlの絶対
エタノールに溶解し、45分間還流した。溶液をチャコー
ル処理し、300mlに濃縮した。生成物をろ過によって集
め、冷たいエタノールですすぎ（２×50ml）、空気乾燥
し、次いで真空乾燥すると無色の微結晶が得られた（1
4.9g,53％）。
M.P.:143℃． 元素分析：計算値［Ｃ（24）Ｈ（26）Ｏ（８）］C65.1
5,H5.92.実測値:C65.31,H5.97. NMR（DMSO−d6）：δ1.027（t,J＝6.9hz,3H）,1.628
（m,2H）,2.136（s,6H）,2.207（m,2H）,2.303（s,6
H）,2.884（q,J＝6.9hz,2H）,6.939（s,2H）,7.417（s,
2H）． D. ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル）−3,6−ジアセトキシ−2,7−ジメチル−
９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−512−NHS）
の調製 Ac2EtSF−412（9.42g,21.3mmol）の塩化メチレン（175m
l）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（3.62g,31.5m
mol）を加え、直ちに１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩（8.05g,42.0
mmol）を加えた。この溶液を室温で２時間かきまぜた。
この混合物を水で洗い（４×100ml）、水性洗液を塩化
メチレンで逆抽出した（２×50ml）。１つにまとめた有
機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピングして
油状物質にした。絶対エタノールを加え、ひっかくこと
によって結晶化を誘導した。生成物をろ過によって集
め、空気乾燥し、次いで真空乾燥することにより、薄オ
レンジ色の微結晶（9.80g,85％）が得られた。
1gの生成物を10mlの塩化メチレン中に溶解し、40mlのシ
クロヘキサンを加えることによって分析試料を調製し
た。チャコール処理し、冷却し、ひっかいて結晶化を誘
導すると、無色の結晶固体が得られた。
M.P.:159℃． 元素分析：計算値［Ｃ（28）Ｈ（29）Ｎ（１）Ｏ（1
0）］C62.33,H5.42,N2.60.実測値:C62.06,H5.71,N2.39. NMR（DMSO−d6）：δ1.053（t,J＝6.9hz,3H）,2.149
（s,6H）,2.304（s,6H）,2.1−2.4（m,4H）,2.747（s,4
H）,2.920（q,J＝6.9hz,2H）,6.975（s,2H）,7.464（s,
2H）． E. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−2,7−ジメチル−９−エトキシ−9H−キサン
テン（Ac2EtSF−512−Sar−OBn）の調製 ザルコシンベンジルエステル（0.72g,4.02mmol）の塩化
メチレン（25ml）溶液にAc2EtSF−512−NHS（1.73g,3.2
1mmol）Ac2EtSF−512−NHS（1.73g,3.21mmol）及び５％
炭酸水素ナトリウム溶液（20ml）を加えた。この２層混
合物を20時間激しくかきまぜた。層を分離し、有機層を
３×15mlの水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、10ml
に濃縮した。溶液をシクロヘキサンで60mlに希釈し、チ
ャコール処理し、窒素気流下で25mlに濃縮すると、生成
物の沈殿が得られた。上清をデカンテーションし、無色
固体を真空乾燥した（12.44g,74％）。
塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶し、チャコー
ル処理して分析試料を得た。
M.P.:150−２℃． 元素分析：計算値［Ｃ（34）Ｈ（37）Ｎ（１）Ｏ
（９）］C67.65,H6.18,N2.32.実測値:C67.42,H6.08,N2.
33. NMR（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の5:2の結合を
示す。）：δ（主および副）1.049および1.008（t,J＝
6.8hz,3H）,1.747および1.66（m,2H）,2.144および2.11
5（s,6H）,2.18（m,2H）,2.314および2.303（s,6H）,2.
694（s,3H）,2.907および2.884（q,J＝6.8hz,2H）,3.96
1（s,2H）,5.075および5.016（s,2H）,6.960および6.91
7（s,2H）,7.430および7.396（s,2H）,7.30（m,5H）． F. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシンイ
ミジル−オキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エ
チル）−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−2,4,5,7−
テトラメチル−9H−キサンテン（Ac2EtSF−512−Sar−N
HS）の調製 Ac2EtSF−512−Sar−OBn（0.45g,0.745mol）の絶対エタ
ノール（20ml）溶液に10％パラジウム付着カーボン0.05
gを加えた。混合物を水素の風船圧力下で30分間かきま
ぜた。触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッ
ピングしてシロップ状の残渣を得た。
この残渣を25mlの塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（0.129g,1.12mol）及び１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド
・塩酸塩（0.292g,1.52mmol）を加えた。混合物を30分
間かきまぜ、水で洗った（３×15ml）。溶液を硫酸ナト
リウム上で乾燥し、10mlに濃縮し、シクロヘキサンで40
mlに希釈し、チャコール処理し、窒素気流下で20mlに濃
縮した。上清をデカンテーションによって除き、残渣を
塩化メチレンから再沈殿させて無色の粉末を得た（0.27
g,49％）。
元素分析：計算値［Ｃ（31）Ｈ（34）Ｎ（２）Ｏ（1
1）］C60.98,H5.61,N4.59.実測値:C60.28,H5.71,N4.40,
1.08％ 水（Ｋ−Ｆ）． NMR（DMSO−d6）（アミド結合の5:1混合物を示す。）：
δ（主および副）1.043（t,J＝7.0hz,3H）,1.793および
1.933（m,2H）,2.145および2.133（s,6H）,2.198（m,2
H）,2.314（s,6H）,2.740（s,4H）,2.778および2.821
（s,3H）,2.900（q,J＝7.0hz,2H）,4.334および4.469
（s,2H）,6.960および6.925（s,2OH）,7.441（s,2H）． 例 ３ 519nm蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の調製 A. ９−（２−カルボキシエチリデン）−3,6−ジヒド
ロキシ−4.5−ジメチル−9H−キサンテン（SF−519）の
調製 ２−メチルレゾルシノール（37.2g,0.300mol）と無水コ
ハク酸（30.0g,0.300mol）とを丸底フラスコに入れ、窒
素でパージした。150mlのメタンスルホン酸を加え、溶
液を窒素雰囲気下で65℃で４時間かきまぜた。反応混合
物を、激しくかきまぜられている氷冷水（11）に一滴づ
つ入れ、同時に50％水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
を6.0±0.5に維持した。細かく分割された固体を遠心に
よって集め、水ですすぎ（４×150ml）、そのつど再懸
濁し、遠心し、上清を捨てた。粗生成物を11の水に懸濁
し、十分な50％水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを1
0.2に上げた。溶液をろ過し、ろ液のpHを濃HClで1.2に
した。生成物を上述のように遠心によって集め、水です
すぎ（３×350ml）、アセトンですすいだ（３×250m
l）。得られた固体をトルエンと共に共沸し、ろ過によ
って集め、110℃で真空乾燥してレンガ赤色の粉末を得
た（24.6g,53％）。
元素分析：計算値［Ｃ（18）Ｈ（16）Ｏ（５）］C69.2
2,H5.16.実測値:C68.95,H5.30,0.80％ 水（Ｋ−Ｆ）． NMR（DMSO−d6）（殆どデルタ型）：δ2.164（s,3H）,
2.177（s,3H）,3.376（d,J＝7.1hz,2H）,5.749（t,J＝
7.2hz,1H）,6.642（d,J＝8.8hz,1H）,6.672（d,J＝8.8h
z,1H）,7.216（d,J＝8.5hz,1H）,7.227（d,J＝8.5hz,1
H）,9.602（bs,1H）,9.758（bs,1H）． 可視吸光（pH8.2;50mM aq Tris/HCl）最大500nm（89,
800） B. ９−（２−カルボキシエチル）−3,6−ジアセトキ
シ−4,5−ジメチル−９−エトキシ−9H−キサンテン（A
c2EtSF−519）の調製 SF−519（15.0g,48.0mmol）を250mlの無水酢酸に加え、
固体を粉砕した。（高度に不溶性のSF−519を分散させ
るのに超音波処理が有用である。）懸濁液を氷冷し、50
mlのピリジンを加え、混合物を20分間かきまぜた。溶液
をろ過し、激しくかきまぜられている4Lの氷冷水にゆっ
くりと、しかしながらしっかりとした流れとして加え
た。さらに20分間かきまぜた後、中間生成物をろ過し、
3Lの水に再懸濁し、さらに25分間かきまぜた。固体をろ
過によって集め、空気乾燥した。乾燥した中間体を600m
lの絶対エタノールに溶解し、１時間還流した。溶液を
回転蒸発器上で200mlに濃縮すると結晶化した。生成物
をろ過によって集め、空気乾燥し、次いで真空乾燥する
と無色の微結晶が得られた（12.13g,57％）。
塩化メチレンからシクロヘキサンで沈殿化することによ
り分析試料を調製した。
NMR（DMSO−d6）：δ1.033（t,J＝6.9hz,3H）,1.674
（m,2H）,2.189（s,6H）,2.19（m,2H）,2.348（s,6H）,
2.878（q,J＝6.9hz,2H）,7.006（d,J＝8.6hz,2H）,7.39
9（d,J＝8.6hz,2H）． C. ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル−3,6−ジアセトキシ−4,5−ジメチル−９
−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−519−NHS）の
調製 Ac2EtSF−519（7.80g,17.6mmol）を175molの塩化メチレ
ンと混合し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（2.75g,2
3.9mmol）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド・塩酸塩（7.00g,36.5mmol）を
加えた。この混合物を90分間かきまぜ、水で洗った（５
×100ml）。１つにまとめた水性層を塩化メチレンで逆
抽出し（２×50ml）、プールした有機層を硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、ストリッピングした。100mlのエタノー
ルでつき崩し、ろ過し、空気乾燥して、淡黄色の固体を
得た（7.45g,78％）。
シクロヘキサン／塩化メチレンから２回再結晶し、チャ
コール処理することによって分析試料を得た。
M.P.:164−５℃． 元素分析：計算値［Ｃ（28）Ｈ（29）Ｎ（１）Ｏ（1
0）］C62.33,H5.42,N2.60.実測値:C62.17,H5.47,N2.48. NMR（DMSO−d6）：δ1.051（t,J＝7.0hz,3H）,2.4−2.1
（m,4H）,2.191（s,6H）,2.337（s,6H）,2.715（s,4
H）,2.912（q,J＝7.0hz,2H）,7.015（d,J＝8.6hz,2H）,
7.429（d,J＝8.6hz,2H）． D. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−4,5−ジメチル−９−アセトキシ−9H−キサ
ンテン（Ac2EtSF−519−Sar−OBn）の調製 19mlの塩化メチレン中のザルコシルベンジルエステル
（0.557g,3.11mmol）の溶液に、Ac2EtSF−519−NHS（1.
30g,2.41mmol）及び15mlの５％炭酸水素ナトリウム水溶
液を加えた。この２層混合物を18時間激しくかきまぜ
た。層を分離し、有機層を３×10mlの水で洗い、硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、10mlに濃縮した。溶液をシクロヘ
キサンで40mlに希釈し、チャコール処理し、窒素気流下
で20mlに濃縮してねばついた固体として生成物の沈殿を
得た。上清をデカンテーションで除き、残渣を塩化メチ
レンと共に共蒸発させて無色の泡（0.97g,67％）を得
た。
激しく真空乾燥することによって分析試料を得た。
元素分析：計算値［Ｃ（34）Ｈ（37）Ｎ（１）Ｏ
（９）］C67.65,C6.18,N2.32.実測値:C67.43,H6.37,N2.
32. NMR（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の5:2の混合物
を示す。）：δ（主および副）1.044および1.020（t,J
＝7.0hz,3H）,1.824および1.714（m,2H）,2.17（m,2
H）,2.195および2.169（s,6H）,2.346および2.337（s,6
H）,2.720および2.691（s,3H）,2.889（q,J＝7.0hz,2
H）,3.959および3.988（s,2H）,5.073および5.048（s,2
H）,7.000および6.945（d,J＝8.6hz,2H）,7.45−7.25
（m,7H）． E. ９−（２−（２−Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシ
ンイミジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド）
エチル）−3,6−ジアセト−オキシ−4,5−ジメチル−９
−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−519−Sar−NH
S）の製造 Ac2EtSF−519−Sar−OBn（1.35g,2.24mmol）の絶対エタ
ノール（50ml）溶液に10％パラジウム付着カーボンを加
えた。この溶液を水素の風船圧力下で20分間かきまぜ
た。触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッピ
ングしてシロップ状の残渣を得た。
この残渣を50mlの塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（0.39g,3.39mmol）及び１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド
・塩酸塩（1.57g,8.19mmol）を加えた。この混合物を75
分間かきまぜ、水で洗った（４×15ml）。この溶液を硫
酸ナトリウム上で乾燥し、25mlに濃縮し、シクロヘキサ
ンで125mlに希釈し、チャコール処理し、窒素気流下で5
0mlに濃縮した。上清をデカンテーションし、残留した
油状物質を5mlの塩化メチレンに取り、激しくかきまぜ
られた75mlのシクロヘキサンに一滴づつ加えて無色の粉
末を得た（0.587g,43％）。
分析試料を得るために、生成物の一部を塩化メチレンに
取り、モレキュラーシーブ上で乾燥し、窒素気流下で蒸
発させ、最後に五酸化リン上で48℃で乾燥乳鉢中で乾燥
した。
元素分析：計算値［Ｃ（31）Ｈ（34）Ｎ（２）Ｏ（1
1）］C60.98,H5.61,N4.59.実測値:C60.15,H5.71,N4.51,
水（Ｋ−Ｆ）1.51％． NMR（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の4:1の混合物
を示す。）：δ（主および副）1.039（t,J＝6.9hz,3
H）,1.841および1.945（m,2H）,2.19（m,2H）,2.194
（s,6H）,2.345（s,6H）,2.767および2.744（s,4H）,2.
778および2.825（s,3H）,2.888（q,J＝6.9hz,2H）,4.32
8および4.461（s,2H）,7.000（d,J＝8.6hz,2H）,7.410
（d,J＝8.6hz,2H）． 例 ４ 526nm蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の調製 A. 2,4−ジヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒド
の調製 リンオキシクロリド（80ml,0.86mol）をかきまぜられて
いるＮ−メチルホルムアミド（102ml,0.82mol）のエー
テル（250ml）溶液に加えた。混合物を室温で１時間か
きまぜ、次いで氷中で冷却した。２−メチルレゾルシノ
ール（アルドリッチ、100g,0.81mol）を加え、この混合
物を一夜撹拌しながら室温まで昇温させた。沈殿した中
間生成物をろ過によって集め、エーテルで３回すすい
だ、この中間体を250mlのアセトンと250mlの水の混合物
中で溶解することによって加水分解し、30分間かきまぜ
た。2Lの水を加え、混合物を沸騰させ、放冷して結晶性
生成物を被着させた。これを4Lの水から再結晶させて純
粋な生成物を得た（70g,57％）。
M.P.150℃（Lit.152−３℃［ダブリュー．ベーカーら,
J.Chem.Soc.,2834−５（1949）］）． NMR（DMSO−d6）：δ1.973（s,3H）,6.551（d,J＝8.5h
z,1H）,7.428（d,J＝8.5hz,1H）,9.703（s,1H）,10.745
（s,1H）,11.592（s,1H）． B. 2,4−ジメチルレゾルシノールの調製 2,4−ジヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒド（30.
0g,197mmol）のイソプロパノール（3L）溶液をマグネテ
ィックスターラー含む5Lの３首フラスコ中で氷冷した。
4mlのリン酸と10％パラジウム付着カーボンとを加え、
溶液を先ず窒素で、次いで水素でパージした。取り込み
が完了したと判定された時点（約1.5時間）で溶液を再
び窒素でパージし、次いでセライト（登録商標）でろ過
した。溶液をストリッピングで除き、残渣を酢酸エチル
に取り、得られた溶液を水で洗った（４×100ml）。水
溶液を酢酸エチルで逆抽出し、１つにまとめた有機層を
硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピングした。昇華
（95℃、0.05トール）すると無色固体が得られた（19.6
g,72％）。
M.P.107−８℃（Lit.108−109℃［ダブリュー．ベーカ
ーら,J.Chem.Soc.,2834−５（1949）］）． NMR（DMSO−d6）：δ1.969（s,3H）,2.037（s,3H）,6.2
20（d,J＝8.1hz,1H）,6.637（d,J＝8.1hz,1H）,7.929
（s,1H）,8.785（s,1H）． C. ９−（２−カルボキシエチリデン）−3,6−ジヒド
ロキシ−2,4,5,7−テトラメチル−9H−キサンテン（SF
−526）の調製 2,4−ジメチルレゾルシノール（28.4g,0.205mol）と無
水コハク酸（20.0g,0.200mol）を丸底フラスコに入れ、
窒素でパージした。231mlのメタンスルホン酸を加え、
溶液を窒素雰囲気下で70℃で20時間かきまぜた。反応混
合物を激しくかきまぜられている水酸化ナトリウム水溶
液（150mlの水中に95g）と氷（3L）との混合物に一滴づ
つ加えた。十分なメタンスルホン酸を加えて最終的なpH
を4.7から1.5にした。得られた固体を遠心によって集
め、遠心し、水からデカントした（５×1.2L）。最終的
な懸濁液をろ過によって集め、空気乾燥し、110℃で６
時間炉中で乾燥してレンガ赤色の固体（30.6g,44％）を
得た。
アルカリ性溶液から再結晶させ、遠心し、水洗して分析
試料を得た。
元素分析：計算値［Ｃ（16）Ｈ（12）Ｏ（５）］C70.5
7,H5.92.実測値:C70.39,H6.00,0.21％ 水（Ｋ−Ｆ）． NMR（DMSO−d6）（ほぼスピロラクトン型）：δ2.172
（s,12H）,2.508（m,2H）,3.342（m,2H）,7.604（s,2
H）． 可視吸光（pH8.2:50mM aq Tris/HCl）:509nm（71,30
0）． D. ９−（２−カルボキシエチル）−3,6−ジアセトキ
シ−９−エトキシ−2,4,5,7−テトラメチル−9H−キサ
ンテン（Ac2EtSF−526）の調製 SF−526（25.2g,74mmol）を450mlの氷冷無水酢酸に加
え、次いで100mlのピリジンを加え、混合物を氷冷しな
がら150分間かきまぜた。反応混合物をろ過し、次いで
ゆっくり、かつしっかりした流れとして、7Lの激しくか
きまぜられている氷冷水に加えた。さらに30分間かきま
ぜた後、中間生成物をろ過し、水で洗い、4Lの水中に再
懸濁し、さらに30分間かきまぜた。固体をろ過によって
集め、空気乾燥して28.9gのスピロラクトン中間体を得
た。この中間体（18.6g）の一部を1Lの絶対エタノール
に溶解し、90分間還流した。この溶液を回転蒸発器上で
300mlに濃縮すると結晶した。生成物をろ過によって集
め、エタノールですすぎ、空気乾燥し、次いで真空乾燥
すると無色の微結晶が得られた（11.6g,用いた中間体の
量を基準として52％）。
塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶させ、チャコ
ール処理を行なうことによって無色の微結晶が得られ
た。M.P.:154−155℃。分析のため、塩化メエチレンか
ら２回蒸発させて痕跡量のシクロヘキサンを除去した。
元素分析：実測値［Ｃ（20）Ｈ（20）Ｏ（５）］C70.5
7,H5.92.実測値:C70.39,H6.00,0.21％ 水（Ｋ−Ｆ）． NMR（DMSO−d6）（ほとんどスピロラクトン型）：δ2.1
72（s,12H）,2.508（m,2H）,3.342（m,2H）,7.604（s,2
H）． 可視吸光（pH8.2:50mM aq Tris/HCl）:509nm（71,30
0）． E. ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル）−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−
2,4,5,7−トリメチル−9H−キサンテン（Ac2EtSF−526
−NHS）の調製 Ac2EtSF−526（4.70g,9.99mmol）を75mlの塩化メチレン
及び１−（３−ジメチル−アミノプロピリル）−３−エ
チルカルボジイミド・塩酸塩（3.10g,16.2mmol）と混合
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（1.50g,13.0mmol）
を加えた。この混合物を90分間かきまぜ、水で洗った
（４×50ml）。１つにまとめた水性層を50mlの塩化メチ
レンで逆抽出し、プールした有機層を硫酸ナトリウム上
で乾燥し、ストリッピングした。75mlのエタノールと共
につき崩し、ろ過し、空気乾燥すると淡黄色の固体とし
て粗生成物が得られた（約4.7g）。この物質を50mlの塩
化メチレンに溶解し、50mlのシクロヘキサンを加えた。
茶さじ１杯のチャコールを加え、この混合物をろ過し、
生成物をさらなる25mlのシクロヘキサンに取った。ろ過
によって回収し、空気乾燥し、真空乾燥すると無色の結
晶が得られた（3.14g,55％）。
シクロヘキサンを含む塩化メチレンから再沈殿すること
によって分析試料を得た。
元素分析：計算値［Ｃ（30）Ｈ（33）Ｎ（１）Ｏ（1
0）］C63.48,H5.86,N2.47.実測値:C63.08,H6.00,N2.37. NMR（DMSO−d6）：δ1.058（t,J＝6.9hz,3H）,2.136
（s,6H）,2.155（s,6H）,2.228（m,4H）,2.371（s,6
H）,2.748（s,4H）,2.918（q,J＝6.9hz,2H）,7.300（s,
2H）． F. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF−5
05−Sar−OBn）の調製 ザルコシンベンジルエステル（0.720,4.02mmol）の塩化
メチレン（40ml）溶液に、Ac2EtSF−526−NHS（1.82g,
3.21mmol）と30mlの５％炭酸水素ナトリウムを加えた。
この２相混合物を20時間激しくかきまぜた。層を分離
し、有機層を４×15mlの水で洗い、硫酸ナトリウム上で
乾燥し、15mlに濃縮した。この溶液を100mlのシクロヘ
キサンで希釈し、チャコール処理し、窒素気流下で50ml
に濃縮すると生成物の沈殿が得られた。ろ過し、空気乾
燥すると無色の固体が得られた（0.96g,47％）。
塩化メチレンと共に共蒸発し、次いで激しく真空乾燥す
ることによって分析試料を得た。
元素分析：計算値［Ｃ（36）Ｈ（41）Ｎ（１）Ｏ
（９）］C68.45,H6.54,N2.22.実測値:C68.29,H6.70,N2.
07. NMR（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の5:2混合物を
示す）：δ（主および副）1.049および1.027（t,J＝6.8
hz,3H）,1.783および1.700（m,2H）,2.129および2.099
（s,6H）,2.159および2.129（s,6H）,2.14（m,2H）,2.3
79および2.371（s,6H）,2.699および2.690（s,3H）,2.8
73（q,J＝6.8hz,2H）,3.958および3.976（s,2H）,5.075
および5.019（s,2H）,7.266および7.233（s,2H）,7.25
−7.40（m,5H）． G. ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エチ
ル）−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−2,4,5,7−テ
トラメチル−9H−キサンテン（Ac2EtSF−526−Sar−NH
S）の調製 Ac2EtSF−526−Sar−OBn（0.96g,1.52mmol）の絶対エタ
ノール（40ml）溶液に0.10gの10％パラジウム付着カー
ボンを加えた。この混合物を水素の風船圧力下で30分間
かきまぜた。触媒をろ過によって除き、エタノールをス
トリッピングして除くとシロップ状の残渣が得られた。
この残渣を40mlの塩化メチンレに溶解し、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（0.26g,2.26mmol）及び１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド
・塩酸塩（0.590,3.08mmol）を加えた。この混合物を30
分間かきまぜ、水で洗った（４×15ml）。溶液を硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、15mlに濃縮し、シクロヘキサンで
100mlに希釈しチャコール処理し、窒素気流下で50mlに
濃縮した。生成物をろ過によって集め、空気乾燥し、真
空乾燥すると無色の微結晶が得られた（0.573g,59
％）。
塩化メチレンと共に共蒸発し、40℃で十分に真空乾燥す
ると痕跡量のシクロヘキサンが除かれ、非晶質の固体と
して分析試料が得られた。
NMR（DMSO−d6）：δ1.043（t,J＝6.7hz,3H）,1.82（m,
2H）,2.130（s,6H）,2.157（s,6H）,2.15（m,2H）,2.37
8（s,6H）,2.748（s,4H）,2.778（s,3H）,2.891（q,J＝
6.7hz,2H）,4.327（s,2H）,7.275（s,2H）． 例 ５ ５−（３−アミノ−１−プロヒニル）−２′,3′−ジデ
オキシシチジン５′−三リン酸（５−AP3−ddCTP）の調
製 A. Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセトアミド（18）
の調製 プロパルギルアミン（24.79g,0.450モル、アルドリッ
チ、99％）をトリフルオロ酢酸メチル（69.19g,0.540モ
ル、1.2eq,アルドリッチ）に１時間にわたって０℃で一
滴づつ加えた。０℃でさらに１時間かきまぜた後、15cm
のビグレアークスカラムを介して蒸留すると、無色の液
体として62.12gのトリフルオロアセトアミド18が得られ
た。この物質はNMR及びGCにおいて均質であり、プロパ
ルギルアミンを無水トリフルオロ酢酸でアシル化するこ
とによって調製された分光光学的に同一の物質と互換的
に用いた。1 H−NMR（CDCl3）:6.85（bs,1H,NHTFA）,4.17（dd,J＝
5.6および2.5,2H,CH2）,2.35（t,J＝2.5,1H,CH）． IR（neat:cm-1）:3300（Ｎ−Ｈ）,3095および2935（Ｃ
−Ｈ）,2130（アセチレン）,1720（Ｃ＝０）,1550（Ｎ
−Ｈ）,1430,1365,1160,1040,998,918,857,829,772およ
び725. B. ５−ヨード−２′,3′−ジデオキシシチジン（19）
の調製 ２′,3′−ジデオキシシチジン（2.11g,10mmol,レイロ
ー）及び酢酸第二水銀（3.35g,10.5mmol,フィッシャ
ー）の50mlメタノール溶液を19時間還流した。得られた
白色の懸濁液を50mlのメタノール及び100mlのジクロロ
メタンで希釈した。ヨウ素（3.05g,12mmol）を加え、懸
濁液を25℃でかきまぜた。４時間後、遊離塩基形態にあ
るAG3 X4A樹脂（20ml,38meq.バイオラド）を加え、硫
化水素を15分間バブルした。水銀（II）の完全な沈殿を
TLCによって確認した。反応物をフィルターエイドを介
してろ過し、このフィルターエイドを1:1メタノール−
ジクロロメタンで洗った。ろ液10gをシリカゲル上で蒸
発させ、これを150gのシリカゲルカラムの頂部におい
た。５％,10％及び20％メタノールジクロロメタン溶液
で溶離すると、無色の結晶固体として2.79g（83％）の
ヨウ素化物19が得られた。沸騰水から２回再結晶し、50
℃で真空乾燥すると、大きな分析的に純粋なプリズム
（mp:d178℃）が得られた。（mp:d178゜）．1 H−NMR（DMSO−d6）:8.50（s,1H,H6）,7.73（bs,1H,−
NH2a）,6.53（bs,1H,−NH2b）,5.86（dd,J＝6.5および
2.1,1H,H1′）,5.19（t,1H,5′OH）,4.04（m,1H,H
4′）,3.75（ddd,J＝12.1,5.2および2.9,1H,H5′ａ）,
3.53（dt,J＝12.1および3.8,1H,H5′ｂ）,2.3−1.7（m,
4H,H2′およびH3′）． C9H12N3O3Iの計算値:C32.07％,H3.59％,N12.46％．実測
値:C32.05％,H3.80％,N12.46％． C. ５−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピ
ニル）−２′,3′−ジデオキシシチジン（20）の調製：
アミノアルキレンのヨウ素化ヌクレオシドへの結合の一
般的手法 50mlの３首フラスコにヨウ素化シチジン19（770mg,2.00
mmol）及びヨウ素化第一銅（76.2mg,0.400mmol,0.20eq;
アルドリッチ、ゴールドラベル）を入れた。フラスコを
アルゴンでフラッシュした後、乾燥ジメチルホルムアミ
ド（10ml、アルドリッチ）を加えると、懸濁されたヨウ
化第一銅を含むヨウ素化シチジンの0.2M溶液が得られ
た。Ｎ−プロパルギル−トリフルオロアセトアミド（0.
70ml,6.00mmol,3.0eq）及びトリエチルアミン（0.56ml,
4.00mmol,2.0eq、モレキュラーシーブ上に貯蔵）を注射
器を介して加えた。テトラキス（トリフェニルホスフィ
ン）パラジウム（Ｏ）（231mg,0.20mmol,0.10eq）を乾
燥箱中のガラスビン中で計量し、反応混合物に加えた。
ヨウ化第一銅を溶解すると、黄色の溶液が得られ、これ
は数時間かけて徐々に暗色になった。TLCにより、出発
物質が完全に消費されたことが確認されるまで反応を進
行させた。４時間後、反応物を20mlの1:1メタノール−
ジクロロメタンで希釈し、強塩基性アニオン交換樹脂
（バイオラド、AG1X8,2.0g,約6eq.）の炭酸水素型を加
えた。約15分間かきまぜると、ガスの発生が止まった。
30分後、反応混合物をろ過し、樹脂を1:1ジクロロメタ
ン−メタノールで洗った。１つにしたろ液を回転蒸発器
で急速で濃縮した。（ジメチルホルムアミドを除去する
のに、45℃、２トールで約10分間かかった。）残渣を直
ちに150gのシリカゲル上で、10％,15％及び20％メタノ
ールジクロロメタン溶液を用いたクロマトグラフィーに
より精製した。適当な画分から溶媒を除去すると、651m
g（90％）のアルキルアミン20が薄黄色結晶性泡として
得られ、これはTLC及びNMRにおいて均質であった。同様
な調製工程からの生成物は、元素分析によりヘミハイド
レートであることが確認された。1 H−NMR（DMSO−d6）:9.96（bs,1H,NHTFA）,8.32（s,1
H,H6）,7.76（bs,1H,NH2a）,6.78（bs,1H,NH2b）,5.88
（dd,J＝6.5および2.5,1H,H1′）,5.13（t,J＝5.1,1H,
5′OH）,4.28（d,J＝5.0,2H,−CH2−）,4.04（m,1H,H
4′）,3.73（ddd,J＝12.0,5.0および3.1,1H,H5′ａ）,
3.53（dt,J＝12.1および4.0,1H,H5′ｂ）,2.3−1.7（m,
4H,H2′およびH3′）．19 F−NMR（DMSO−d6）：−74.0（ｓ）． UV（MeOH）：最大 238.5（17,100）および295.5（9,30
0）． C14H15N4O4F3・1/2 H2Oの計算値:C45.53,H4.37,N15.17.
実測値:C45.56,H4.52,N15.26. D. トリス（トリス−Ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリ
ン酸の調製 ピロリン酸四ナトリウム・10水塩（4.46g,10mmol）を最
小量の水（約50ml）に溶解し、水に注がれたAG50W X8
樹脂（100−200メッシュ、４×10cmベッド）カラムを通
した。カラムを水で溶離し、溶離された液をそのpHが中
性に近づくまで氷冷フラスコ中に回収した。トリ−ｎ−
ブチルアミン（アルドリッチゴールドラベル、7.1ml,30
mmol）を溶離された液に加え、全てのアミンが溶解され
るまで２相を激しく撹拌した。得られた溶液を凍結乾燥
した。残渣を無水ピリジンで２回共蒸発し、無水ジメチ
ルホルムアミドで１回共蒸発した。残渣を10mlの無水ジ
メチルホルムアミドに溶解し、得られた1.0M溶液を、使
用時まで（１カ月）アルゴン下で０℃で貯蔵した。
E. ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−
ジデオキシシチジン５′−三リン酸（５−AP3−ddCTP）
の調製：保護されたアルキルアミノヌクレオシドをその
対応する５′−三リン酸に転化し、トリフルオロアセチ
ル保護基を除去するための一般的手法 アルキルアミノヌクレオシド20（361mg,1.00mmol）をリ
ン酸トリメチル（2.0ml,アルドリッチゴールドラベル）
にアルゴン下でかきまぜながら、炉で乾燥したフラスコ
内で溶解した。この溶液を−10℃に冷却し、リンオキシ
クロリド（0.093ml,1.00mmol、アルドリッチゴールドラ
ベル）を注射器によって加えた。反応混合物を−10℃で
30分間かきまぜた後、第２のリンオキシクロリド（0.09
3ml,1.00mmol）を加え、溶液をかきまぜながら25℃まで
ゆっくりと昇温させた。反応混合物の一部を1N水酸化物
水溶液で冷却し、HPLCで分析した。対応するヌクレオチ
ド−リン酸への転化が最大である時に（この場合、第２
のリンオキシクロリドの添加から100分後）、反応混合
物を予め−10℃に冷却したトリス（トリス−ｎ−ブチル
アンモニウム）ピロリン酸溶液（上述の1.0M無水ジメチ
ルホルムアミド溶液6.0ml）に一滴づつ加えた。溶液を
アルゴン下でかきまぜながらゆっくりと25℃まで昇温さ
せた。100分後、反応溶液を予め０℃に冷却したトリメ
チルアミン（1.4ml）の水（20ml）溶液にゆっくりと加
えた。溶液を氷冷しながら15分間かきまぜ、約２℃で一
夜放置した。
25℃、0.5トールでの真空蒸発によって揮発物を除去し
た。残渣を再び75mlの水に溶解し、１）pH7.6,1.0M TE
AB水溶液（300ml）、２）1.0M炭酸水素カリウム水溶液
（300ml）、及び３）pH7.6,0.1M TEAB水溶液（300ml）
で予め平衡化されたDEAE−セファデックスＡ−25−120
カラム（2.6×65cmベッド）にかけた。カラムをpH7.6の
TEAB水溶液の0.1M（1L）から1.0M（1L）の直線勾配で溶
離した。12分毎に画分を回収しながら、カラムを100ml/
hで操作した。溶離は270nm（40AUFS）の吸光度によって
監視した。所妙の物質は、勾配の終末付近に、良く分離
された主なバンドとして溶離された。生成物含有画分を
プールし、濃縮し（30℃未満において）、絶対エタノー
ルと共に２回共蒸発した。残渣を20.4mlの水に取り、凍
結乾燥した。
この中間生成物を12.5mlの水に取り、12.5mlの濃水酸化
アンモニウムを加えた。3.5時間かきまぜた後、溶液を
アスピレーターで吸引しながら２時間かきまぜて過剰の
アンモニアガスを除去し、次いで凍結乾燥した。残渣を
pH7.6の0.M TEAB水溶液を10mlに溶解し、上述のように
予め平衡化したDEAE−セファデックスＡ−25−120（1.6
×55cmベッド）に取った。カラムをTEABの0.1M（280m
l）から1.0M（280ml）の直線勾配で、6mlづつ画分を回
収しながら溶離した。生成物は単一の主たるピークとし
て溶離した。純粋生成物を含むと見積られる画分（＃39
−45）をプールし、濃縮し（30℃未満）、絶対エタノー
ル（Zx）と共に共蒸発し、9.8mlの水に取った。この溶
液をUV吸収及びHPLCで分析し、凍結乾燥した。
生成物の希釈液は、pH8.2の50mM Tris緩衝液中で、240
nm及び293.5nmに吸収極大を示した。生成物の吸光係数
が出発物質のそれ（9300）と同一であると仮定すると、
293.5nmでの吸光度を基準とする５−AP3−ddCTPの収量
は0.32mmol（32％）であった。最終生成物のHPLC（ゾー
バックス SAX,0.2M pH6.5 リン酸カリウム水溶液、2
70nmでのモニタリング）において、本質的に単一のピー
ク（＞99％）が認められた。1 H−NMR（D2O）:8.57（s,1H,H6）,6.03（dd,J＝6.4およ
び1.6,1H,H1′）,4.42（m,2H,H4′およびH5′ａ）,4.16
（ddd,J＝12,5.5および3,1H,H5′ｂ）,4.036（s,2H,−C
H2−）,2.5−1.9（m,4H,H2′およびH3′），及び対イオ
ン（トリエチルアンモニウム）ピーク．31 P−NMR（D2O）：−9.02（d,J＝20,IP），−9.74（d,J
＝20,IP），−21.37（t,J＝20,IP）． UV（pH8.2 aq Tris）：最大 240および293.5nm. 例 ６ ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジデ
オキシウリジン５′−三リン酸（５−AP3−ddUTP）の調
製 A. ５−ヨード−２′,3′−ジデオキシウリジン（21）
の調製 ジデオキシウリジン（2.122g,10.0mmol）を30mlの温メ
タノールに溶解し、25℃に冷却した後、一塩化ヨウ素
（4.06g,25mmol,2.5eq,フィッシャー）のメタノール（2
0ml）溶液に５分間にわたって加えた。暗い紫色の反応
混合物を窒素下で50℃の水浴中で20分間加熱し、次いで
直ちに氷水槽中で冷却した。かきまぜずに165分間放置
した後、得られた沈殿をろ過によって集め、冷メタノー
ルで洗った（２×10ml）。一夜真空乾燥すると2.232g
（66％）のヨウ素化物21が灰色がかった白色の微結晶と
して得られた。この物質をさらに精製することなく次の
反応で用いたが、他の沈殿はクロマトグラフィー又は沸
騰メタノールからの再結晶（30ml/g）で精製して、白色
の針状結晶（mp ｄ 160−164℃）を得た。NMRによ
り、粗沈殿は均質であることが示されたが、また５′−
ヒドロキシルプロトンは痕跡量の不純物によって触媒さ
れる交換の故に非常に幅広であった。クロマトグラフィ
ー処理した、又は再結晶した物質のスペクトルは、この
プロトンが通常、鋭い三重線であることを示した。1 H−NMR（DMSO−d6）:11.60（bs,1H,H3）,8.57（s,1H,H
6）,5.90（dd,J＝2.0および6.6,1H,H1′）,5.2（bs,1H,
5′OH）,4.06（m,1H,H4′）,3.75および3.53（m,1H,H
5′）,2.26,2.02および1.84（m,4H,H2′およびH3′）． B. ５−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピ
ニル）−２′,3′−ジデオキシウリジン（22）の調製 例5Cの一般的手法に従って、ヨウ素化ウリジン21をＮ−
プロパルギルトリフルオロアセトアミドに３時間かけて
結合した。０〜５％メタノールジクロロメタン溶液勾配
でのクロマドグラフィーにより、TLCにおいて均質であ
るが乾燥させることが困難な物質が得られた。この生成
物をクロロホルムと数回共蒸発し、真空乾燥すると、53
6.5mgのアルキニルアミノヌクレオシド22が白色泡とし
て得られた。この物質はTLCにおいて均質であり、少量
のクロロホルムを含むことを除いてNMRにおいて純粋で
あった（39mol％、補正収率66％）。1 H−NMR（DMSO−d6）:11.61（s,1H,H3）,10.07（歪んだ
t,1H,NHTFA）,8.35（s,1H,H6）,7.26（s,0.39H,CHC
l3）,5.89（dd,J＝6.6および3.2,1H,H1′）,5.15（t,J
＝5.2,1H,5′OH）,4.22（broad d,2H,−CH2N−）,4.04
（明瞭なhept,J＝3.5,1H,H4′）,3.73および3.53（m,1
H,H5′）,2.26,2.03および1.84（m,4H,H2′およびH
3′）． TLC（95:5 ジクロロメタン−メタノール,2溶離,UV）：
出発ヨウ素化物21 Rf＝0.37;生成物22,0.28;触媒,0.95
及び0.80及びわずかに線状 C. ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−
ジデオキシウリジン５′−三リン酸（５−AP3−ddUTP,2
3の調製 0.30mmolのアルキルアミノヌクレオシド22を対応する三
リン酸に転化し、そのトリフルオロアセチル基を例5Eの
一般的手法に従って除去した。第２のリンオキシクロリ
ドを加えた後、リン酸化を210分間進行させた。生成物
の吸光係数が出発物質のそれ（13000）と等しいと仮定
すると、三リン酸23の、291.5nmにおけるUV吸光に基づ
く収率は18％であった。
例 ７ ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジデ
オキシグアノシン５′−三リン酸（７−AP3−ddc7GTP）
の調製 A. ６−メトキシ−２−メイルチオ−９−（3,5−ジ−
Ｏ−ｐ−トルイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル）−７−デアザプリン（24）の調製 エフ・シーラとアール・リッチャー、Chem.Ber.,111,29
25（1978）の手法に従って、６−メトキシ−２−メチル
チオ−７−デアザブリン9.2gを調製し、これを無水ピリ
ジン150ml中に溶解して共沸的に乾燥し、30〜35℃で蒸
発乾固した。この物質を室温下で窒素下で450mlの無水
アセトニトリル中に懸濁し、水酸化ナトリウム（2.16g
の油中60％懸濁液）をかきまぜながら加えた。45分後、
１−クロロ−２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルイ
ル−α−Ｄ−リボフラノース（18.6g、エム・ホッファ
ー、Chem.Ber.,93,2777（1960）に従って調製）を20分
間にわたって、３回に均等に分けて加えた。反応混合物
をさらに45分かきまぜた後、1mlの酢酸及び300mlのジク
ロロメタンを加えた。混合物を、フィルターエンドを介
して吸引ろ過し、ろ液を蒸発乾固した。残渣をベンゼン
に溶解し、この溶液を水で２回洗い、塩水で１回洗っ
た。有機層を硫酸ナトリウム上で蒸発させた後、残渣を
400mlのメタノールに溶解し、結晶化させると、無色の
結晶（mp;106−107℃）として19.24g（73.8％）のリボ
シル化生成物24が得られた。1 H−NMR（CDCl3,360MHz）:2.42（s,3H,トルイルCH3）,
2.44（s,3H,トルイルCH3）,2.64（s,3H,SCH3）,2.70お
よび2.89（m,2H,H2′）,4.08（s,3H,OCH3）,4.56（m,1
H,H3′）,4.65（m,2H,H5′）,5.74（m,1H,H4′）,6.44
（d,J＝4,1H,H7）,6.77（dd,J＝８および6,1H,H1′）,
7.50（d,J＝4,1H,H8）,7.25および7.95（m,8H,トルイル
Ｈ）． 上記物質の試料を少量のジクロロメタンを含有するメタ
ノールから再結晶することにより、mp 109−110℃の結
晶が得られた。
B.6−メトキシ−２−メチルチオ−９−（２−デオキシ
−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（25）
の調製 メタノール600ml中エステル24（19g）および水酸化物型
の強塩基性イオン交換樹脂（レキシン（Rexyn）201 38
g）の懸濁液を窒素下において1.5時間還流した。この温
懸濁液を吸引濾過して樹脂を除去し、濾液を蒸発させて
乾固した。この固体残渣をエーテル（450ml）に溶解
し、10分後に、この溶液をフィルターエイドのパッドを
介して濾過して少量の着色不純物を除去した。この溶液
に、予備反応により得られた所望の生成物の結晶を種付
けし、25℃で一晩静置した。濾過により結晶性ジオール
25を集め、母液を濃縮して第２生成物を得た。各生成物
をエーテルで完全に洗浄し、総計8.43g（78.0％）のジ
オール25を無色結晶として得た（mp 129−130℃）。1 H−NMR（DMSO−d6,360MHz）:2.21および2.55（m,2H,H
2′）,2.56（s,3H,SCH3）,3.53（m,2H,H5′）,3.82（m,
1H,H3′）,4.02（s,3H,OCH3）,4.36（m,1H,H4′）,4.90
（t,J＝5.5,1H,5′OH）,5.30（d,J＝5.5,1H,3′OH）,6.
48（d,J＝4,1H,H7）,6.55（dd,J＝８および6,1H,H
1′）,7.48（d,J＝4,1H,H8）。
この物質の試料を少量のメタノールを含むジクロロメタ
ンから再結晶させると融点130−131℃の結晶が得られ
た。
C. ６−メトキシ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−ト
リフェニルメチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル）−７−デアザプリン（26）の調製 ジオール26（7.2g）を無水ピリジンに溶かして共沸的に
乾燥し、この溶液を35℃で蒸発乾固した。残渣を100ml
の無水ピリジンに溶解し、8.0gのトリフェニルメチルク
ロリド、4.0mlのトリエチルアミン、及び300mgの４−
（ジメチルアミノ）ピリジンを加えた。反応混合物を窒
素下で65℃で30分間加熱した後、1.0gの第２のトリフェ
ニルメチルクロリドを加え、16.5時間加熱を続けた。冷
却後、反応混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタンと水
との間で分配した。水層をジクロロメタンで抽出し、１
つにまとめた有機層を0.3N塩酸、炭酸水素ナトリウム水
溶液及び塩水で洗った。硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃
縮した後、粗生成物をシリカゲル上で０％,1％,1.5％及
び２％のメタノールジクロロメタン溶液を用いてクロマ
トグラフィーすると、無水のガラスとして12.1g（94.5
％）のモノトリチルエーテル26が得られた。1 H−NMR（CDCl3,300MHz）:2.58（s,3H,SCH3）,2.42およ
び2.62（m,2H,H2′）,3.37（m,2H,H5′）,4.04（m,1H,H
3′）,4.08（s,3H,OCH3）,4.60（m,1H,H′４）,6.40
（d,J＝4,1H,H7）,6.68（明瞭なt,J＝7,1H,H1′）,7.00
（d,J＝4,1H,H8）,7.27および7.43（m,15H,トリチル
Ｈ）． このデータは、上記の通りに調製した26の異なるバッチ
より得た。
D. ６−メトキシ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−ト
リフェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル）−７−デアザプリン（27）の調製 12.1gのトリチルエーテル26、9.2gの４−ジメチルアミ
ノピリジン、及びフェニルクロロチオカルボネート（7.
5ml、アルドリッチ）の無水ジクロロメタン（220ml）溶
液中を25℃で２時間窒素下でかきまぜた。TLC分析が反
応の完了を示したので4.0mlのフェニルクロロチオノカ
ルボネートを加え、反応混合物をさらに１時間かきまぜ
た。この溶液を280mlのジクロロメタンで希釈し、次い
で500mlの0.5N塩酸、500mlの0.5N塩酸及び塩水で洗っ
た。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固し
た。
得られた粗チオカーボネートを350mlの無水トルエンに
溶解し、350mgのアゾイソビスブチロニトリルと10mlの
水酸化トリ−ｎ−ブチルスズを加えた。得られた溶液を
100〜105℃で10分間加熱した。冷却後、溶液を少量のエ
ーテルで希釈し、350mlの10％フッ化カリウム水溶液と
共に振盪した。２層をフィルターエイドを介してろ過し
て暗いスラッジを除去し、分離した。有機層を0.75Nの
水酸化カリウムと塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥
し、濃縮した。得られた油をシリカゲル上で1:1ジクロ
ロメタン−エーテルで、次いでジクロロメタンでクロマ
トグラフィーすると、9.93g（84.5％）のジデオキシヌ
クレオシド27が無色の固体（融点122〜124℃）として得
られた。1 H−NMR（CDCl3,360MHz）:2.10,2.33および2.43（m,4H,
H2′およびH3′）,2.60（s,3H,SCH3）,3.30（m,2H,H
5′）,4.08（s,3H,OCH3）,4.29（m,1H,H4′）,6.36（d,
J＝3.7,1H,H7）,6.53（dd,J＝７および4,1H,H1′）,7.0
9（d,J＝3.7,1H,H8）,7.25および7.45（m,15H,トリチル
Ｈ）． E. ７−ヨード−６−メトキシ−２−メチルチオ−９−
（５−Ｏ−トリフェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β
−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（28）の調
製 Ｎ−ヨードスクシンイミド（10.0g）を9.9gのデアザプ
リンの無水ジメチルホルムアミド（550ml）溶液に加え
た。暗所にて窒素下で16時間かきまぜた後、2.5mlの10
％炭酸水素ナトリウム溶液を加え、反応混合物を真空下
で50℃で100mlまで濃縮した。この溶液を水と酢酸エチ
ルとの間で分配した。有機層を５％水酸化ナトリウム水
溶液及び塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮
した。この僅かに不純な生成物をシリカゲル上でジクロ
ロメタンを用いてクロマトグラフィーすると、無色のガ
ラス状固体として11.68g（95.6％）のヨウ素化物28が得
られた。1 H−NMR（CDCl3,300MHz）:2.06,2.24および2.41（m,4H,
H2′およびH3′）,2.58（s,3H,SCH3）,3.30（m,2H,H
5′）,4.10（s,3H,OCH3）,4.29（m,1H,H4′）,6.47（d
d,J＝６および4,1H,H1′）,7.19（s,1H,H8）,7.30およ
び7.46（m,15H,トリチル Ｈ）． このデータは、上記の通り調製した28の異なるバッチよ
り得た。
F. ７−ヨード−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−トリ
フェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラ
ノシル）−７−デアザプリ−４−オン（29）の調製 １当量のメトキシナトリウムをチオクレゾールのメタノ
ール溶液に加え、蒸発乾固することによってトリクレゾ
ール酸ナトリウムを調製した。4.0gのメチルエーテル2
8、4.0gのチオクレゾール酸ナトリウム及び10mlのヘキ
サメチルフォスフォラミドの無水トルエン（150ml）中
溶液を窒素下で4.5時間還流した。冷却後、混合物を酢
酸エチルと水との間で分配した。有機層を水及び塩水で
洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固した。得ら
れた粗生成物をシリカゲル上で、０％および２％メタノ
ールジクロロメタン溶液を用いてクロマトグラフィーに
かけると、無色のガラス状固体として3.80g（97.0％）
のデアザプリン29が得られた。1 H−NMR（CDCl3,360MHz）:2.05,2.25および2.42（m,4H,
H2′およびH3′）,2.60（s,3H,SCH3）,3.30（m,2H,H
5′）,4.28（m,1H,H4′）,6.40（dd,J＝７および4,1H,H
1′）,7.05（s,1H,H8）,7.30および7.46（m,15H,トリチ
ル Ｈ）,10.00（bs,1H,H1）． G. ７−ヨード−５′−Ｏ−トリフェニルメチル−
２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン（30）の
調製 メタ−クロロパーオキシ安息香酸（1.23g,85％、アルド
リッチ）を０℃で窒素下で、3.6gのメチルチオエーテル
29の無水ジクロロメタン（150ml）中溶液にかきまぜな
がら加えた。15分後、冷却槽を外し、撹拌を25℃で40分
間継続した。この溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液及び
塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥した。メタノール
（２体積％）を加え、得られた溶液をシリカゲルの短い
プラグに通して極性不純物を除去した。得られた粗スル
ホキシド（3.07g）を40mlのジオキサンに溶解し、ガラ
ス内張ボンベに入れた。10.0gのアンモニアを加え、混
合物をオートクレーブ中で100℃で２時間加熱した。得
られた溶液を蒸発乾固した。残渣を20mlのジクロロメタ
ン中に溶解し、フィルターエイドを介してろ過した。40
mlのメタノールを溶液に加え、冷却すると、1.57gの無
色生成物が結晶した。母液を蒸発し、シリカゲル上で５
％メタノールジクロロメタン溶液を用いて中圧液体クロ
マトグラフィーにかけると、無色結晶としてさらに328m
gの生成物が得られた。デアザグアノシン30の総収量は
1.90g（55.4％）であった。1 H−NMR（CDCl3,300MHz）:2.05,2.23および2.35（m,4H,
H2′およびH3′）,3.29（m,2H,H5′）,4.26（m,1H,H
4′）,5.90（bs,1H,NH2）,6.24（dd,J＝７および4,1H,H
1′）,6.90（s,1H,H8）,7.30および7.46（m,15,トリチ
ル Ｈ）,10.90（bs,1H,H1）． この試料をメタノール−ジクロロメタンから再結晶させ
るとmp 201〜203℃の結晶が得られた。
H. ２′,3′−ジデオキシ−７−ヨード−７−デアザグ
アノシン（31）の調製 トリチルエーテル30（1.7g）のギ酸（12ml）溶液を室温
で10分間かきまぜた。得られた黄色の懸濁液を真空下で
30℃で急速に蒸発乾固した。残渣をシリカゲル上で５
％,7％及び10％メタノールジクロロメタン溶液を用いて
クロマトグラフィーにかけると、940mgの有色固体が得
られた。この固体を、少量のジクロロメタンを含むエー
テルと共に突き崩すと無色結晶として838mg（81.0％）
のヌクレオシド31が得られた。1 H−NMR（DMSO−d6,360MHz）:1.95,2.09および2.26（m,
4H,H2′およびH3′）,3.48および3.54（m,2H,H5′）,3.
98（m,1H,H4′）,4.90（bt,J＝5,1H,5′OH）,6.08（m,1
H,H1′）,6.32（bs,2H,NH2）,7.12（s,1H,H8）,10.46
（bs,1H,H1）． I. ７−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピ
ニル）−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン
（32）の調製 ヨウ素化物31（376mg,1.00mmol）を例5Cの一般的手法に
よって2.25時間でＮ−プロパルギルトリフルオロアセト
アミドに結合した。生成物と出発物質とがTLCによって
識別不能であったので、反応は逆相HPLC（10cm ODS,1m
l/分、100％水から100％メタノールまでの５分間にわた
る勾配、次いで100％メタノール、280nmまでのUV検出；
ヨウ素化物31から出発して5.49分；生成物32、5.75分；
中間体6.58分）によってモニターした。粗生成物はジク
ロロメタンにあまり溶けなかったので、クロマトグラフ
ィーカラムにかける前に、5gのシリカゲル上に、ジクロ
ロメタン−メタノール溶液から濃縮した。２％,5％,7％
及び10％メタノールジクロロメタン四液で溶離すると、
黄色の固体として300mg（78％）のアルキルアミノヌク
レオシド32が得られた。1 H−NMR（DMSO−d6,360MHz）:1.96,2.08および2.28（m,
4H,H2′およびH3′）,3.47および3.55（m,2H,H5′）,3.
99（m,1H,H4′）,4.22（bs,2H,−CH2−）,4.90（t,J＝
5,1H,5′OH）,6.09（dd,J＝６および4,1H,H1′）,6.33
（bs,2H,NH2）,7.30（s,1H,H8）,10.05（bs,1H,NHTF
A）,10.50（bs,1H,H1）．1 H−脱結合13C−NMR（DMSO−d6）:155.5（q,J＝36.5,ト
リフルオロアセチルカルボニル）,157.8,153.1および14
9.9（C2,C4およびC6）,122.6（C8）,113.9（q,J＝288,C
F3）,99.4および97.5（C7およびC5）,84.2および77.4
（アセチレン性）,83.2および81.0（C1′および４′）,
62.9（C5′）,29.7（プロパルギル）,31.8および25.8
（C2′およびC3′）． この13C−NMRデータは上述のようにして調製された異な
る32のバッチから得られた。
J. ７−（３−アミノ−１−プロパニル）−２′,3′−
ジデオキシ−７−デアザグアノシン５′−三リン酸（７
−AP3−ddc7GTP）の調製 0.90mmolのアルキルアミノヌクレオシドを対応する５′
三リン酸に転化し、トリフルオロアセチル保護基を例5F
の一般的手法に従って除去した。第２のリンオキシクロ
リドを加えた後、反応混合物をさらに165分間かきまぜ
た。生成物の吸光係数が出発物質のそれ（11900）と等
しいと仮定すると、７−AP3−ddc7GTPの収率は、その27
2.5nmの吸光度に基づき18％であった。
例 ８ ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジデ
オキシ−７−デアザアデノシン５′三リン酸（７−AP3
−ddc7ATP）の調製 A. ２′−アセトキシイソブチルブロミド（19.5ml,150
mmol,5eq,ルッセルら、J.Am.Chem.Soc.,95,4016〜4030
（1973）の手法に従って調製した）を無水アセトニトリ
ル（250ml、アルドリッチ）中に懸濁されたチュバーシ
ジン（７−デアザアデノシン、6.66g,25.0mmol,シグ
マ）に15分間にわたって加えた。懸濁された固体は約５
分間で溶け、反応混合物を窒素下で25℃で22時間かきま
ぜた。反応混合物をリン酸水素二カリウム（43.55g,300
mmol,6eq）の400ml水溶液に加えた。30分間かきまぜた
後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した（１×400ml及
び２×200ml）。１つにまとめた有機層を硫酸マグネシ
ウム上で乾燥し、蒸発乾固すると14.73g（118％）の白
色泡が得られた。この物質は、TLCにおいて、僅かに幅
広の95％以上のスポット（UV検出）であるが、NMRでは
１つの主生成物と少なくとも１つの副産物が存在した。
NMRスペクトルは、主生成物がブロモアセテート33であ
ることと一致していた。1 H−NMR（DMSO−d6）（主成分33に対する）8.08（s.1H,
H2）,7.34（d,J＝3.7,1H,H8）,7.12（bs,2H,NH2）,6.70
（d,J＝3.7,1H,H7）,6.32（d,J＝3.8,1H,H1′）,5.61
（dd,J＝2.4および3.8,1H,H2′）,4.89（dd,J＝2.4およ
び4.5,1H,H3′）,4.43（m,1H,H4′）,4.35（dd,J＝12お
よび4,1H,H5′ａ）,4.29（dd,J＝12および7,1H,H5′
ｂ）,2.08（s,3H,OAc）,2.00（s,3H,OAc）,1.49（s,6H,
2CH3）． B. ２′,3′−ジデオキシ−２′,3′−ジデヒドロ−７
−デアザアデノシン（34）の調製 亜鉛ダスト（20g、マリンクロット）を1N塩酸（３×50m
l）、水（２×50ml）、２％硫酸第二銅（２×50ml）、
水（４×50ml）、エタノール（３×50ml）及びエーテル
（２×50ml）で迅速に（全時間約10分）に洗うことによ
って亜鉛−銅結合体を新たに調製した。それぞれの洗浄
において、亜鉛ダストを、これが懸濁されるまでフリッ
ト漏斗中でかきまぜ、洗液は亜鉛を空気にさらすことを
最小限に抑えながら吸引除去した。上述の粗プロモアセ
テート（14.63g）を150mlの無水ジメチルホルムアミド
（アルドリッチ）中に溶解し、回転蒸発器（45℃、２ト
ール）で約25mlの溶媒を除去した。新鮮な亜鉛−銅結合
体（14.63g、約9eq）を加え、得られた懸濁液を25℃で
窒素下でかきまぜた。亜鉛−銅結合体の品質に応じて、
この反応は誘導期間及び／又は異なる速度を有するの
で、反応はTLC（90:9:1ジクロロメタン−メタノール−
濃水酸化アンモニウム；出発物質Rf＝0.45、生成物Rf＝
0.39及び0.36）により出発物質が完全に消費されたこと
が示されるまで続けた。この場合、反応は15分以内に完
了した。100分後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液75ml
を反応混合物に10分間にわたって慎重に加えた。反応混
合物をフィルターエイドを介してろ過し、フィルターエ
イドをメタノールで洗った（２×50ml）。１つにまとめ
たろ液を蒸発乾固し、残渣を水（150ml）と酢酸エチル
（150ml）との間で分配した。水層を酢酸エチルで抽出
し（２×100ml）、１つにまとめた有機抽出物を硫酸マ
グネシウム上で乾燥し、濃縮し、１時間真空乾燥した。
得られた暗オレンジ半固体を100mlのメタノールに溶解
し、次いで25mlの水及びレキシン201樹脂（29g,4.3meq/
g,5eq水酸化物型）を加えた。反応混合物を合計210分間
還流した。TLC（85:13:2ジクロロメタン−メタノール−
濃水酸化アンモニウム；中間体エステルRf＝0.49;最終
生成物34、0.24）による監視により、約70％転化した時
点で反応が急速に停止したことが示された。そのため16
5分後にさらに29gの樹脂を加えた。冷却することなく、
樹脂をろ過によって除き、1:1ジクロロメタン−メタノ
ール（２×75ml）で洗った。１つにまとめたろ液を蒸発
乾固し、得られた紫色の固体を沸騰イソプロパノール15
0mlから再結晶すると、灰色がかった白色の針状結晶（m
p205−206℃）として3.778gのオレフィン34が得られ
た。母液を25mlに濃縮することによって第２の生成物0.
631g（薄紫針状結晶mp202−203℃）が得られた。両生成
物（合計4.409g、76％）は、TLCで均質であり、痕跡量
のイソプロパノールを除いてNMRで純粋であった。1 H−NMR（DMSO−d6）:8.07（s.1H,H2）,7.15（d,J＝3.
6,1H,H8）,7.12（bs,1H,H1′）,7.01（bs,2H,NH2）,6.5
7（d,J＝3.6,1H,H7）,6.43および6.02（bd,J＝6.0,各1
H,H2′およびH3′）,4.95（t,J＝6.5,1H,5′OH）,4.79
（m,1H,H4′）,3.52（m,2H,H5′）． C. ２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン（3
5）の調製 450mlのパールボトルに3.80gのオレフィン34、76mlのエ
タノール、380mgの10％パラジウム付着カーボン及び40p
siの水素を入れた。25℃で4.67時間振盪した後、14.5ps
iの水素が吸着され、水素の取り込みは終了した。TLC
（85:13:2ジクロロメタン−メタノール−濃水酸化アン
モニウムで２回溶離；出発物質34,0.45;生成物35,0.4
8）により、単一の紫外線活性新規生成物に完全に転化
されたことが示された。触媒をフィルターエイドを介す
るろ過によって除去し、エタノールで洗浄した。ろ液か
ら溶媒を除去し、一夜真空乾燥することによって白色泡
として3.98g（104％）のジデオキシヌクレオシド35が得
られた。NMRにより、生成物は、８重量％のエタノール
を含むことを除いて均質であることが示された（96％補
正収量）。この物質の同様なバッチは結晶化しにくく、
無水溶媒で共沸的に乾燥すると極めて吸湿性の物質にな
った。従って、この物質を約１週間真空下で貯蔵し、NM
Rにより５重量％以下のエタノールが含まれることが示
された後に用いた。この生成物について観察された結晶
性の欠如及びスペクトル特性は、先にロビンソンら、Ca
n.J.Chem.,55,1259（1977）によって示されたものと一
致していた。1 H−NMR（DMSO−d6）:8.04（s,1H,H2）,7.33（d,J＝3.
6,1H,H8）,6.97（bs,2H,NH2）,6.56（d,J＝6.6,1H,H
7）,6.34（dd,J＝5.2および6.4,1H,H1′）,4.96（t,J＝
5.6,1H,5′OH）,4.33（t,J＝5.1,0.43H,エタノールO
H）,4.04（m,1H,H4′）,3.4−3.6（m,2.86H,H5′および
エタノールCH2）,2.33,2.21および2.02（m,4H,H2′およ
びH3′）,1.06（t,J＝7.0,1.3H,エタノールCH3）． D. ７−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシン（36）の調製 純度95％のジデオキシヌレオシド35（2.95g,11.96mmo
l）の機械的に撹拌されている溶液、無水酢酸ナトリウ
ム（4.13g,50.3mmol,4eq）及び酢酸第二水銀（3.81g,1
1.95mmol,1.00eq,フィッシャー、99.9％）の水（190m
l）溶液を窒素下で65℃で２時間加熱した。得られた水
銀含有物質の白色懸濁液を25℃に冷却した後、ヨウ素
（4.79g,18.9mmol,1.6eq）と酢酸エチル（190ml）とを
加えた。１時間後、懸濁された水銀含有物質が消費さ
れ、透明な紫色の溶液が残った。２時間後、6.35gの亜
硫酸ナトリウムを加え、紫色が消失した。30分間かきま
ぜた後、硫化水素ガスをゆっくりと反応混合物中に15分
間バブルした。硫化第二水銀（黒色コロイド）及びヨウ
素化物36（白色粉末）が反応混合物から沈殿した。水銀
（II）の完全な沈殿は、TLCによって２つの主たるUV活
性スポットの１つが消えることをモニタリングすること
によって分析した。反応混合物をフィルターエイドを介
してろ過し、２つの層に分離した。フィルターエイド
を、TLCがさらなる生成物が抽出されないことを示すま
で沸騰酢酸エチルで洗った（９×100ml）。それぞれの
酢酸エチル抽出物を水層で洗った。１つにまとめた酢酸
エチル層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾固し
た。得られた粗固体は空気に触れると赤くなった。この
物質を3:1ジクロロメタン−メタノール（100ml）に溶解
し、遊離塩基性の弱いアニオン交換樹脂（5.0g,バイオ
ラドAG3 X4A,2.9meq/g乾燥）を加えた。硫化水素を赤
い溶液中に10分間バブルすると、赤色が消えた。短時間
暖めることによってわずかな曇りを除き、溶液をシリカ
ゲルの2cmプラグ（15g）を介して迅速にろ過した。シリ
カゲルをさらなる3:1ジクロロメタン−メタノール（100
ml）で溶離した。シリカゲル50gをろ液に加え、硫化水
素を10分間バブルした。溶媒をこの混合物から回転蒸発
器で除き、シリカゲルを200mlのクロロホルムと共蒸発
させることによって「乾燥」させた。このシリカゲル
を、窒素気流で予め脱ガスしたシリカゲルカラム（500
g）上に迅速にかけた。窒素下で５％（6L）及び10％（4
L）メタノールジクロロメタン溶液で溶離すると、白色
粉末として2.92g（64％）のヨウ素化物36及びより極性
の小さな456mg（7.5％）の7,8−ジヨード−２′,3′−
ジデオキシ−７−デアザアデノシンが得られた。主生成
物を200mlの沸騰酢酸エチルから蒸発させると2.626gの
白色針状物（mp158−160℃）が得られた。母液を10mlに
濃縮すると、薄赤色の針状物として第２の生成物が0.39
1g得られた（mp156−158℃）。両方の生成物はNMRおよ
びTLCにおいて均質であり、オレフィン34からの合計収
率は64％であった。
E. ７−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピ
ニル）−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン
37の調製 ヨウ素化物36（720.3mg,2.00mmol）を、90分かけて、例
5Cの方法により、Ｎ−プロパラジルトリフルオロアセト
アミドにと結合させた。ジクロロホルム中７％メタノー
ルでクロマトグラフィーを行なうと、705.8mg（92％）
の生成物37が灰色がかった白色の粉末として得られた。
これはNMR及びTLCにより、均質であることがわかった。
沸騰酢酸エチル（10ml）から再結晶させると、372mgの
白色結晶（融点169−171℃）が得られた。1 H−NMR（DMSO−d6）:10.1（歪んだt,1H,NHTFA）,8.10
（s.1H,H2）,7.78（s,1H,H8）,6.0−7.5（非常に幅広の
s,NH2）,6.34（dd,J＝4.5および7.0,1H,H1′）,4.98
（t,J＝5,1H,5′OH）,4.31（わずかに幅広のs,2H,−CH2
N−）,4.10（明瞭なhept,J＝3.5,1H,H4′）,3.60および
3,40（m,1H,H5′）,2.37,2.18および2.00（m,4H,H2′お
よびH3′）． TLC（90:9:1 ジクロロメタン−メタノール−濃水酸化
アンモニウム:UV）出発ヨウ素化物36,Rf＝0.36;生成物3
7,0.26）． F. ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−
ジデオキシ−７−デアザアデノシン５′−三リン酸（７
−AP3−ddc7ATP）の調製 アルキルアミノヌクレオシド37（1.00mmol）を対応する
５′三リン酸に転化し、トリフルオロアセチル基を例5E
の一般的手法に従って除去した。第二のリンオキシクロ
リドを加えた後、溶液を120分間かきまぜた。生成物の
吸光係数が出発物質のそれ（12700）と等しいと仮定す
ると、279.5nmの吸光度に基づく７−AP3−ddc7ATPの収
率は40％であった。1 H−NMR（D2O）:7.97（s.1H,H2）,7.80（s,1H,H8）,6.3
3（m,1H,H1′）,4.44（m,1H,H4′）,4.27（m,1H,H5′
ａ）,4.14（m,1H,H5′ｂ）,4.11（broad s,2H,−CH
2−）,2.6−2.0（m,4H,H2′およびH3′），並びに対イ
オン（トリエチルアンモニウム）ピーク．31 P−NMR（D2O）：−8.59（bd,J＝20,1P），−9.56（d,
J＝20,1P）および−21.38（m,1P）． UV（pH8.2 aq Tris）：最大 238および279.5nm. 例 ９ 蛍光標識鎖ターミネーターを調製するための一般的結合
操作 Ｔ−ターミネーター:5−（SF−505−Sar−AP3）ddUTPの
調製 例6Cからのアミン５−（AP3）ddUTP（60μモル）を0.30
0mlの水に取り、0.600mlのDMFで希釈した。例1Eからの
染料標識剤Ac2EtSF−505−Sar−NHS（72mg,126マイクロ
モル）のDMF（0.600ml）溶液を加え、混合物を50℃で４
時間かきまぜた。1.5mlの濃アンモニア水を加え、フラ
スコにしっかりと栓をし、50℃で20分間加熱を継続し
た。得られた赤い溶液を水で希釈して60mlにし、予め2.
0M pH7.7 TEAB水溶液（50ml）、次いで0.2M pH7.7
TEAB水溶液（50ml）で平衡化したDEAE−セファデックス
AA−25−120（１×35cmベッド）カラムにかけた。カラ
ムをTEAB水溶液pH7.7の直線勾配で溶離した（0.2M（150
ml）→2.0M（150ml））。カラムは100ml/時間で操作
し、３分毎に画分を回収した。溶離された液を510nmに
おける吸光度により監視した（40AUFS）。２つにより少
量の副産物バンドが先ず溶離され、次いでベースライン
に近い解像度で強いハンドが溶離された。純粋な生成物
を含むと見積られる画分をプールし、30℃未満でストリ
ップし、絶対エタノールと共に３回共蒸発し、少量（5.
2ml）の水に取った。この溶液を可視吸光度によって分
析し（pH8.2,50mM aq Tris緩衝液）、凍結乾燥した。
生成物の希釈溶液は491nmに吸収最大を示した。遊離の
染料吸光係数（72600）から計算した収量は31マイクロ
モル（51％）であった。
開示した一般的手法に従って、蛍光標識鎖ターミネータ
ー化合物をさらに調製した。第１表における命名は上述
の実施例において調製され、DNA配列決定に有用な新規
組成物を調製する一般的な手法により結合された蛍光標
識スペーサー（例えばSF−512−Sar）及びジデオキシヌ
クレオチドリンカー（AP3−ddNTP）を示す。
例 10 蛍光標識鎖ターミネーターを用いた、改変サンガー鎖伸
長プロトコールによるバクテリオファージM13の部分的D
NA塩基配列決定 A. 改変DNA鎖伸長反応 ３μｇのバクテリオファージM13 mp 18 DNAテンプレ
ート（ニューイングランドバイオラブス;0.25μg/μ
ｌ）と60μｇ（−40）プライマー（ニューイングランド
バイオラブス;7.5μg/μｌ）を４つの1.5mlエッペンド
ルフプラスチックチューブのそれぞれに入れた。それぞ
れのチューブを沸騰水中で２分間加熱し、湿った氷上で
５分間直ちに冷却した。室温で１秒パルススピンの微遠
心を行なった後、８μｌの５×反応緩衝液（0.3M Tris
−HCl、pH8.3;0.275M NaCl;37.5mM MgCl2;2.5mMジチ
オトレイトール）、10μｌの試薬グレードH2O、１μｌ
の、ATP,TTP,CTR及びGTP含有（それぞれ25μＭ）溶液、
並びに１μｌの逆転写酵素（鳥ミエロブラストシスウイ
ルス；ニューイングランドニュークリアー;15単位／μ
ｌ）をそれぞれのチューブに入れ、混合した。チューブ
を37℃で10分間インキュベートした。例９の蛍光標識鎖
ターミネーターの200μＭ溶液４μｌを４つのチューブ
に加えた。１つのチューブが７−（SF505−Sar−AP3）d
dc7GTP、他のチューブが７−（SF512−Sar−AP3）ddc7A
TP、他のチューブが５−（SF519−Sar−AP3）ddCTP、及
び他のチューブが５−（SF526−Sar−AP3）を受容し
た。チューブを42℃で30分間インキュベートした。４つ
のチューブのそれぞれからの22μｌの混合物を準備し、
予め試薬グレードの水で洗った５−25セレクト−Ｄスピ
ンカラム（５プライム→３プライム；フィラデルフィ
ア）に通過させ、取り込まれなかった蛍光標識鎖ターミ
ネーターを蛍光標識され、伸長されたDNA鎖から分離し
た。カラムの溶離物を回収し、真空乾燥した。70％エタ
ノールを0.5ml加え、チューブを５秒間遠心した。次に
チューブをマイクロ遠心機中で５分間遠心し、DNAペレ
ットを真空乾燥し、95％ホルムアミド−25mM EDTAに再
懸濁した。チューブを７分間水浴中で65℃に加熱し、10
μｌのDNA試料を予めコンディショニングしたポリアク
リロアミド（8.3M尿素及び１×TEAB緩衝液を含むビス
（19:1）ゲル（15cm×40cm×0.35mm）上にマイクロピペ
ットで滴下した。試料を27ワットで下記Ｂに記載したよ
うにして電気泳動した。
B. 蛍光標識DNAストランド電気泳動 ゲルを27ワットの連続的電力（約2000ボルト）に約30分
間、試料を載せる前にさらすことによってゲルを予備コ
ンディショニングした。この間、ゲルの表面温度を49℃
で安定化させた。
電気泳動中に、アルゴンイオンレーザー（オムニクロ
ム、モデル532）によって、垂直なゲルの試料充填ウェ
ルの下28cmの領域を照射した。レーザーを488nmのライ
ンフィルター（バーアソシエート）を通し、それによっ
て他の波長がゲル内に入ることを排除した。ゲル表面に
おける最終的なレーザー出力は35mWで直径約1mmであっ
た。
蛍光標識DNA鎖からの蛍光発光の検出は、２つの光電子
増倍管（PMT;ハママツR1612）によって−950ボルトのバ
イアスをかけて行なった。波長選択フィルター（バーア
ソシエイツ）を蛍光発光と２つのPMTの間に置いた。こ
の場合、１つとのPMTに関連付けられた１つのフィルタ
ーは496ないし528nmの範囲の発光光線を通過させ、一
方、第２のPMTに関連付けられた他方のフィルターは522
ないし553nmの範囲の発光光線を通過するように選択し
た。さらに、繊維光学フェースプレート（インコム）集
光透孔を蛍光発光と波長選択フィルターとの間の光路上
に置き、検出半角を約22度未満に制限した。予備増幅し
た後、それぞれのPMTからの信号を別々にデジタル化
し、両方のPMTから同時に５秒毎にデータを得た。デジ
タル化したデータを連続データファイルにシステムコン
トローラー（ヒューレット−パッカード9000,モデル2
0）を用いて保存した。
C. バクテリオファージM13部分配列決定 蛍光標識M13 mp18 DNA鎖の電気泳動中の蛍光発光から
誘導されたデータを公知の方法により分析した。例示の
ために、部分的なヌクレオシド配列を第２表に示す。
第 ２ 表 M13 mp18の部分的ヌクレオシド配列決定 塩基性 ヌクレオシド 比率 ３ Ｔ 0.14 ４ Ｇ 0.90 ５ Ｔ 9.19 ６ Ａ 0.78 ７ Ａ 0.75 ８ Ａ 0.80 ９ Ａ 0.75 10 Ｃ 0.35 11 Ｇ 1.88 12 Ａ 0.89 13 Ｃ 0.32 14 Ｇ 1.88 15 Ｇ 1.92 16 Ｃ 0.33 17 Ｃ 0.36 18 Ａ 0.81 19 Ｇ 1.89 20 Ｔ 0.16 このデータは、M13 mp18 DNA 中の４つのヌクレオシ
ドのそれぞれに対応する、狭い、明瞭な比率の範囲を明
確に示している。
例 11 A. １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−ヨウ
素化シトシン（５−IAcyC）の調製 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）シトシン（Acy
C）（1.85g,10.0mmol）と酢酸第２水銀（3.35g,10.5mmo
l）の混合物を50mlのメタノール及び100mlの塩化メチレ
ン中で還流した。ヨウ素（3.05g,12.0mmol）を加え、混
合物を１時間かきまぜた。遊離液型のAG3×４樹脂（38m
eq）を加え、溶液を硫化水素で15分間バブルした。固体
をろ過によって除き、ろ液を10gのシリカゲル上にスト
リッピングした。このシリカをシリカゲルカラム（４×
25cm）に充填し、段階的勾配塩化メチレン／メタノール
（20:1→10:1→5:1）で溶離した。蒸発させ、真空乾燥
させると無色固体（1.73g,56％）が得られた。
95％エタノールから再結晶させると、分析的に純粋な物
質が得られた。
M.P.:172℃． 元素分析：計算値［Ｃ（７）Ｈ（10）Ｎ（３）Ｏ（３）
Ｉ（１）］C27.03,H3.24,N13.51.実測値:C27.08,H3.41,
N13.51. UV（MeOH）：最大292.5（5,300）． NMR（DMSO−d6）：δ3.481（m,4H）,4.659（t,J＝5hz,1
H）,5.070（s,2H）,6.665（bs,1H）,7.869（bs,1H）,8.
107（s,1H）． B. １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３
−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニル）シトシ
ン（５−（TFA−AP3）AcyC）の調製 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−ヨウ素化
シトシン（311mg,1.00mmol）を例９で開示した一般的な
結合方法に供した。シリカゲル（３×20cm）上でのフラ
ッシュクロマトグラフィーにおいて、段階的勾配塩化メ
チレン／メタノール（20:1→10:1→5:1）で溶離する
と、薄黄色の泡として生成物が得られた（77.4mg,23
％）。1 H−NMR（DMSO−d6）:3.472（bs,4H）,4.276（d,J＝5.0
hz,2H）,4.653（bt,J＝4.5,1H）,5.091（s,2H）,6.952
（bs,1H）,7.861（bs,1H）,8.037（s,1H）,9.964（bs,1
H）． C. １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３
−アミノ−１−プロピニル）シトシンの調製 アルキニルアミノヌクレオシド（５−（TFA−AP3）Acy
C）（0.167mmol）の糖部分の水酸基を例5Eの一般的方法
に従って三リン酸に転化し、トリフルオロアセチル基を
除去した。第２のリンオキシクロリドを加えた後、75分
間リン酸化を進行させた。生成物の吸光係数が出発物質
のそれ（7,790）に等しいと仮定すると、291nmにおける
UV吸収に基づく三リン酸の収率は21％であった。
例 12 保護された染料（R1＝R2＝Ｈ）で標識されたチミジン誘
導体の調製 A. ５′−デオキシ−５′−（メチル−アミノ）−チミ
ジンの調製 ５′−Ｏ−（ｐ−トルエンスルフォニル）チミジン（1
9.8g,50mmol）をモノメチルアミン（250g）が濃縮され
た圧力容器中に入れた。容器を封止し、室温に３日間放
置した。容器を冷却し、開き、モノメチルアミンを蒸発
させた。容器内に残留したものを水ですすぐことによっ
て除去した。AG50WX8イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラ
ム（6.5×20cm）にこの水溶液を通した。カラムを洗浄
液が中性になるまで水で洗った。次に、生成物を1N水酸
化アンモニウム水溶液で溶出した。溶出物をストリッピ
ングし、得られた固体をシリカゲルのカラム（6.5cm×2
0cm）上でクロマトグラフィーにかけ、溶離液としては
塩化メチレン／メタノール／濃水酸化アンモニウム水溶
液（85:13:2）を用いた。生成物含有画分をストリップ
し、水に取り、凍結乾燥した。生成物は薄黄色の非晶質
固体（8.81g,69％）であった。満足できる燃焼分析はこ
の物質については得られなかった。
［α］D 25（水中、ｃ＝1.0）：＋25.9゜． IR（KBr）:1963,1472,1273,1076cm-1. NMR（DMSO−d6）：δ1.790（s,3H）,2.051（ddd,13.4,
6.3,3.5hz,1H）,2.142（dt,13.4,6.9hz,1H）,2.314（s,
3H）,2.658（d,5.5hz,2H）,3.775（td,5.3,3.2hz,1H）,
4.171（dt,6.3,3.2hz,1H）,6.134（t,6.9hz,1H）,7.639
（s,1H）． B. 結合 例1Bからの生成物（4.14g,10.0mmol）、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（1.21g,10.5mmol）及びN,N′−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（3.09g,15.0mmol）を100ml
の無水塩化メチレン中で室温下で１時間かきまぜた。混
合物を氷中で冷却し、得られた沈殿をろ過によって除去
した。残渣を50mlの冷却塩化メチレンですすいだ。１つ
にまとめたろ液を、１つの流れとして、Ａからの生成物
（300mlの絶対エタノール中2.68g,10.5mmol）の懸濁液
に加えた。室温で90分間かきまぜた後、反応混合物をス
トリッピングして100mlの塩化メチレンに取り、２×100
mlの水で洗った。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、
ストリッピングした。残渣を塩化メチレン溶液としてシ
リカゲルのカラム（6.5×30cm）にかけ、カラムを20:1
塩化メチレン／エタノールで溶離した。溶離は、10:1塩
化メチレン／エタノール中に漬けたシリカゲル上でのTL
Cによってモニタリングした。純粋な生成物を含む画分
を保持し、混合された画分は再びクロマトグラフィーに
かけた。純粋生成物の溶液を１つにまとめ、ストリッピ
ングし、痕跡量の溶媒を十分な真空乾燥によって除き、
薄黄色の堅固な泡としての生成物を得た（3.97g,61
％）。（この非晶質固体については満足のできる燃焼分
析を行なうことができなかった。） ［α］D 25（エタノール中、ｃ＝0.96）：＋50.8゜． IR（KBr）:1768,1691,1610,1490,1420,1205および1150c
m-1. FAB−MS（チオグリセロール・マトリックス）m/e 606
（Ｍ−CH3CH2O）． NMR（DMSO−d6）：（新たに形成された第三アミド結合
周りの回転異性体の3:1混合物を示した）．δ（主及び
副）1.038（m,3H）,1.780および1.800（m,2H）,1.78
（m,2H）,2.04（m,2H）,2.23（m,2H）,2.291（s,6H）,
2.683および2.711（s,3H）,2.895および2.859（q,6hz,2
H）,3.5−3.2（m,2H）,3.805および3.57（m,1H）,4.032
および3.98（m,1H）,5.249および5.295（d,3.6hz,1H）,
6.116および6.012（t,6.9hz,1H）,7.1−6.9（m,4H）,7.
467および7.185（s,1H）,7.6−7.5（m,2H）,11.275およ
び11.332（s,1H）． 例 13 保護された、染料（R1＝R2＝Ｈ）標識ヌクレオシドホス
ホラミジトの調製 例11からの生成物（2.61g,4.00mmol）をベンゼンに取
り、凍結し、凍結乾燥した。32mlの無水塩化メチレン、
無水ジイソプロピルエチルアミン（2.8ml,17mmol）及び
N,N−ジイソプロピルメチルホスホンアミド塩化物（1.1
5ml,5.9mmol）をこの順序に加え、得られた混合物をア
ルゴン雰囲気下で15分かきまぜた。反応混合物を予め振
盪された160mlの酢酸エチルと80mlの炭酸水素ナトリウ
ム水溶液との混合物に加え、振盪し、層を分離した。有
機層を80mlの飽和塩化ナトリウム水溶液80mlで２回洗
い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリップした。残渣
をシリカゲルカラム（４×20cm）上でクロマトグラフィ
ーにかけ、溶離溶媒としては45:45:10塩化メチレン／酢
酸エチル／トリエチルアミンを用いた。溶離物を同じ溶
媒中に漬けたシリカゲル上でのTLCによりモニタリング
した。生成物を含む画分をストリップし、痕跡量の溶媒
を十分な真空乾燥によって除くと薄黄色の堅固な泡（2.
89g）として生成物が得られた。生成物の31P NMRは、
第三アミド結合の周りの回転異性（6:1）及び３価のリ
ンの周りのジアセロメリズム（1:1）に起因する４つの
生成物の混合物を示した。（スペクトルはまた、13重量
％のN,N−ジイソプロピルメチルホスホンアミド性の酸
の混入をも示した。この物質は、生成物のオリゴヌクレ
オチド合成への使用を妨げなかった。） 補正収率:77％．31 P NMR（CDCl3）：δ147.81及び146.99（s,主）並び
に148.18及び147.75（s,副）．
【図面の簡単な説明】
第１図は、それぞれ異なるが近似する波長の発光エネル
ギーを発する異なる光源からの放射エネルギーの存在を
検出するための、この発明に従って構築されたシステム
の部分ブロック、部分ダイアグラムレイアウトを示す
図、 第２図は第１図のシステムに用いるこおができる単一の
電気泳動ゲルを模式的に示す図、 第３図は第１図のシステムに用いるられる染料発光光源
と二色フィルターの透過／反射特性との関係を示す図、 第４図は検出された発光ピークを評価するために用いら
れるデータ処理工程のフローダイアグラム、 第５図は、標識された塩基T,G,A及びＣについて、時間
の関数として得られた典型的な検出器信号を示す図、 第６図は蛍光標識鎖ターミネーターのブロックダイアグ
ラム、 第７図は二色フィルターに代えて用いられる２つのフィ
ルターの染料発光放射とパスバンドとの関係を示す図で
ある。 10……板、12……プラスチック支持体、18,24……緩衝
液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールス・ウイリアム・ロバートソン・ ジュニア アメリカ合衆国、デラウエア州 19732, ロックランド、ピー・オー・ボックス 154 (72)発明者 フランク・ワーデン・ホッブス・ジュニア アメリカ合衆国、デラウエア州 19809, ウイルミントン、プライアー・ロード 2227−エフ (72)発明者 ジョージ・レナード・トレイナー アメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19342，グレン・ミルズ、マーシャル・ロ ード ７ (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，321（12）（1986）Ｐ. 674−679

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】適当な塩基配列決定用ベクターに組み込ま
    れたDNA鋳型、プライマー、ポリメラーゼ、DNAヌクレオ
    チド又はその類似体、及び該DNAヌクレオチド又はその
    類似体に対応するレポーター標識鎖ターミネーターを反
    応させて、鎖終結現象によってその３′末端に導入され
    た残基に共有結合的に連結されたレポーターを有するDN
    A断片を調製する工程と、このようにして調製されたDNA
    断片についてレポーターの存在を調べ、それによってDN
    A塩基配列を決定する工程とを含む、鎖伸長によるDNA塩
    基配列決定方法。
  2. 【請求項２】レポーターは、発色体、蛍光体、リン光
    体、スピン標識及び電子高密度物質からなる群より選ば
    れる特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】前記蛍光体は次の構造を有する特許請求の
    範囲第２項記載の方法。 （ただし、ｎは２又は３、R1及びR2は水素、低級アルキ
    ル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す）
  4. 【請求項４】レポーターの鎖ターミネーターへの結合は
    アミド結合によって行なわれる特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  5. 【請求項５】レポーター標識鎖ターミネーターはヘテロ
    環塩基を含み、レポーターの鎖ターミネーターへの結合
    は該ヘテロ環塩基を介して行なわれる特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
  6. 【請求項６】リンカーと任意的なスペーサーがレポータ
    ーとヘテロ環塩基との間に置かれる特許請求の範囲第５
    項記載の方法。
  7. 【請求項７】レポーター標識鎖ターミネーターは （ただし、ＸはＨ、NH2、又はハロゲン、ＹはＨ、ハロ
    ゲン、OH、又はNH2、あるいはＸ及びＹは共にOHを示
    し、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、７
    −デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサンチンを示
    し、ピリミジンはN1位を介して糖部分に連結され、プリ
    ンとデアザプリンはN9位を介して糖部分に連結される） で示される構造を有する化合物であり、 Ａは （ただし、ｎは２又は３、R1及びR2は水素、低級アルキ
    ル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す） で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂがデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる、特許請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】レポーター標識鎖ターミネーターは （ただし、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニ
    ン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサンチ
    ンを示し、ピリミジンはN1位を介して糖部分に連結さ
    れ、プリンとデアザプリンはN9位を介して糖部分に連結
    される） で示される構造を有する化合物であり、 Ａは （ただし、ｎは２又は３、R1及びR2は水素、低級アルキ
    ル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す） で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂがデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる、特許請求の範囲第６項記載の方法。
  9. 【請求項９】DNAヌクレオチド又はその類似体に対応す
    るレポーター標識鎖ターミネーターが、それぞれ異なる
    区別可能なレポーターを担持する４種類のレポーター標
    識鎖ターミネーターを含む特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】区別可能なレポーターは蛍光体である特
    許請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】標識DNA断片を同時に分離する工程を含
    む特許請求の範囲第９項記載の方法。
  12. 【請求項１２】標識DNA断片は分離の前に結合される特
    許請求の範囲第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】全ての４つの鎖終結反応は単一の容器内
    で行なわれる特許請求の範囲第９項記載の方法。
  14. 【請求項１４】異なるレポーターをそれぞれの塩基の鎖
    ターミネーターに結合する工程と、 修飾鎖終結法によって標識DNA断片を調製する工程と、 寸法に基づいてDNA断片を分離する工程と、 それぞれのDNA断片についてのレポーターを検出し、そ
    れによって３′末端塩基を同定する工程とを含む特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】ジデオキシ鎖終結ヌクレオチドを （ただし、Ｂは１−ウラシル、１−シトシン、１−チミ
    ン、９−アデニン、９−グアニン、又は９−ヒポキサン
    チンを示す） の構造式で示される化合物で置換する工程を含む、ジデ
    オキシ鎖終結ヌクレオチドを用いた鎖終結法による特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
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