JPH075170A - 放射エネルギー検出方法及びシステム - Google Patents

放射エネルギー検出方法及びシステム

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JPH075170A
JPH075170A JP6119539A JP11953994A JPH075170A JP H075170 A JPH075170 A JP H075170A JP 6119539 A JP6119539 A JP 6119539A JP 11953994 A JP11953994 A JP 11953994A JP H075170 A JPH075170 A JP H075170A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】ＤＮＡ配列決定のためのシステムおよび検出方
法であって、時間的及び／又は空間的分離の後に、異な
る励起レポーター染料標識ＤＮＡ断片からの放射エネル
ギーを検出し、放射エネルギーの関数の比からＤＮＡ断
片を同定する。レポーター標識ＤＮＡ断片の発光部位
は、9-カルボキシエチル-6- ヒドロキシ-3-オキソ-3H-
キサンテンをベースとする一群の蛍光染料に代表され
る。 【効果】ＤＮＡの塩基配列を、簡便に、かつ健康に悪影
響を及ぼすことなく決定することができる。また、人為
要素を完全に排除することが可能であり、特別なプライ
マーを用いる必要がないので配列決定用ベクターは任意
に選択することができる。さらに、用いられるレポータ
ーは単一の反応で選択的に導入することができるため、
容易に自動化が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】この発明は、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅ
ｒ）標識ＤＮＡを用いたＤＮＡ塩基配列決定に関し、さ
らに詳細に言うと、この発明は、時間的及び／又は空間
的分離に続く異なる種からの放射エネルギーの存在を検
出するための蛍光系システムに関する。染料は近似する
が識別可能な蛍光染料である。これらの染料を保護し、
活性化し及び連結する方法が開示されている。この方法
により調製された１組の蛍光標識ＤＮＡ鎖ターミネータ
ーが蛍光標識ＤＮＡ塩基配列決定断片として採用され
る。電気泳動分離の最中にこれらの断片を検出し、連結
された蛍光レポーターを同定することができる光学的検
出システムが記載されている。
【０００２】ＤＮＡの塩基配列決定は、現代の分子生物
学における基礎的な分析技術である。塩基配列決定の信
頼できる方法の開発によって、遺伝情報の組織化の理解
が大幅に発展し、遺伝材料の操作（即ち遺伝子工学）が
可能になった。
【０００３】ＤＮＡの塩基配列決定の方法は現在２つあ
る。すなわち、マキサム−ギルバート化学分解法（エイ
・エム・マキサムら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．６
５４９９−５５９（１９８０）及びサンガージデオキシ
鎖ターミネーション法（エフ・サンガーら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４ ５４６３−
５４６７（１９７７））である。これらの２つの方法に
共通する特徴は、電気泳動によって分析される１組のＤ
ＮＡ断片を生成させることである。これらの方法は、そ
れらの断片を調製するのに用いる方法が異なる。
【０００４】マキサム−ギルバート法では、ＤＮＡ断片
は、塩基配列を決定すべきＤＮＡの塩基特異的化学的切
断によって調製される。塩基配列を決定すべきＤＮＡは
先ず32Ｐでその５′末端をラベルされ、４つの部分に分
けられる。それぞれの部分は、特定の塩基に隣接する部
位でＤＮＡを切断するように設計された異なる一連の化
学処理を受ける。その結果、全ての標識断片は元のＤＮ
Ａと同じ５′末端を有し、切断の部位によって決定され
る３′末端を有する。この処理は、ゲル電気泳動による
分離が便利な大きさのＤＡＮ断片を生成するような条件
下で行なわれる。
【０００５】サンガー法では、ＤＮＡ断片は、塩基配列
を決定すべきＤＮＡを部分的な酵素的複製（すなわち、
合成）を介して生産される。最も一般的な方法では、塩
基配列を決定すべきＤＮＡは、標準的な方法により、バ
クテリオファージＭ１３のような大きな円形の一本鎖Ｄ
ＮＡ中に挿入される。これは複製過程のテンプレートと
なる。インサートのすぐ上流のテンプレート領域に相補
的な短いＤＮＡ断片がテンプレートにアニールされ、合
成のためのプライマーとして働く。４つの天然のデオキ
シリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下にお
いて、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーが３′末
端から伸長され、インサート領域のテンプレートの相補
的複製物が生産される。塩基配列決定断片の完全な１組
を生産するために、４つのｄＮＴＰを単一のジデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）ターミネータ
ーと共に含む４つの反応が平行して行なわれる。ｄＮＴ
Ｐがポリメラーゼによって取り込まれるならば、鎖の伸
長は続行され得る。対応するｄｄＮＴＰが選択されるな
らば、鎖は終結される。ｄｄＮＴＰとｄＮＴＰとの比
は、適当な長さのＤＮＡ断片を生成するように調節され
る。４つの反応混合物のそれぞれは、従って、３′末端
に同じジデオキシヌクレオシド残基を有し、プライマー
によって規定される５′末端を有する。
【０００６】両方の方法において、一般的に物理的方法
によって直接決定することができない塩基配列情報が、
測定することができる鎖の長さの情報に変換されてい
る。この測定は電気泳動分離によって行なわれる。変性
条件下（高温、尿素存在等）において、短いＤＮＡ断片
は固い棒として泳動する。ゲルマトリックスが電気泳動
のために採用されると、ＤＮＡ断片はそのサイズの順に
並べられる。塩基配列決定のために必要な単一塩基分解
能は、数百塩基以下の塩基を含むＤＮＡ断片について通
常得られる。
【０００７】完全な配列を決定するために、マキサム−
ギルバート法又はサンガー法において形成された４つの
断片の組は、４つの平行なレーンで電気泳動される。こ
れにより、ゲルの長さ方向に沿って断片が部分的に分離
される。標識断片のパターンは通常、オートラジオグラ
フィーによってフィルムに移される（すなわち、ゲルと
フィルムとを所定の時間挟むことによって露光され
る）。現像されたフィルムは、４つのレーンの間に分配
された連続的なバンドを示し、これはしばしばシークエ
ンシングラダーと呼ばれる。ラダーは、可視的にフィル
ムを走査し（短く、迅速に移動する断片から始める）、
ラダー上のそれぞれのステップについて次のバンドが生
じるレーンを決定することによって読まれる。それぞれ
のレーンは特定の塩基（又はマキサム−ギルバート法の
場合には塩基の組合せ）によって関連しているので、レ
ーン割当の直線的プログレッションは塩基配列を直接的
に翻訳する。
【０００８】サンガー法及びマキサム−ギルバート法は
概念的に優雅で有効であるが、操作的に困難で時間がか
かる。これらの方法を分析すると、多くの問題は単一の
放射同位体レポーターを用いることによってもたらされ
ている。
【０００９】32Ｐのような短命な放射性同位体を用いる
ことは論理的な観点並びに健康及び安全性の観点から問
題である。32Ｐの半減期は短いので、必要な試薬を数日
前に予想し、また、試薬を直ちに使用しなければならな
い。標識ＤＮＡ塩基配列決定断片が生成されると、それ
らは自己分解しやすいので直ちに電気泳動分析にかけな
ければならない。単一の塩基分離に必要な大きな電気泳
動ゲルには大量のバッファーが混入するので、これを適
当に処分しなければならない。引き続きゲル中の標識Ｄ
ＮＡ断片を可視化するために必要なオートラジオグラフ
ィーは、ゆっくりとした工程であり（一夜露光が普
通）、操作全体にかなりの時間をつけ加える。最後に、
このような強力な放射性同位体を用いることによる健康
への危険がある。
【００１０】単一のレポーターを用いて４種類の塩基の
位置を分析することは全体の操作にかなりの操作的複雑
さを与える。化学／酵素工程は別々の容器内で行なわな
ければならず、電気泳動分析は４つの平行なレーン中で
行なわなければならない。熱的に誘導される移動度の歪
により、標識ＤＮＡ断片の歪んだ像が得られ（例えばス
マイル効果）、これはひいては４つのレーンを比較する
ことを困難にする。これらの歪は単一のゲル上で読むこ
とができる塩基の数をしばしば制限する。
【００１１】オートラジオグラフィーでの映像化に必要
な長い時間及び４つの平行なレーンを用いる必要性の故
に、可視化が「スナップ撮影」的になる。多数のバンド
を同時に空間的に分離することが必要なので、通常４０
ｃｍ又はそれ以上の長さのゲルを用いることが必要にな
る。これにより追加的な問題がもたらされる。すなわ
ち、大きなゲルは取扱いが困難で、操作が緩慢であり、
操作全体に要する時間が長くなる。
【００１２】最後に、人手による解析の問題がある。シ
ークエンシングラダーを塩基配列に変換することは時間
がかかり間違い易い工程で、非常に熟練した科学者が全
力集中することが必要である。読み取りを自動化する多
くの試みがなされ、これを助けるいくつかの機械も存在
するが、塩基配列ゲルを解釈する工程はいまなお苦痛を
伴い遅い工程である。
【００１３】この問題を処理するために、32Ｐ／オート
ラジオグラフィーを他の非放射性のレポーター／検出シ
ステムに交換することが考えられる。このような検出系
は32Ｐの感度に匹敵する程度に例外的な高感度を有して
いなければならない。シークエンシングゲル上のそれぞ
れのバンドは１０-16 モルのオーダーのＤＮＡを含む。
このレベルの感度に到達することができる１つの方法は
蛍光を用いることである。ＤＮＡ断片は１又は２以上の
蛍光染料で標識することができる。適当な光源で染料を
励起することによって、染料から特徴的な発光が起き、
バンドを同定することができる。
【００１４】放射性同位体ラベルに対し、蛍光染料を用
いることによって、検出システムをより容易に変更する
ことができる。例えば、何らかの発光特徴（例えばスペ
クトル、寿命、分極化）に基づいて、特定の塩基に関連
した塩基並列決定断片に特定の標識を特異的に結合する
ことができる。この結合を確立すると、断片はまとめら
れ、単一のレーン上で解像され、塩基の割当は選択され
た発光特性に基づいて行なわれ得る。
【００１５】蛍光検出のリアルタイム性の故に、空間的
に分離されたバンド（空間的解像）を含むゲルを迅速に
走査することもできるし、ゲル上の単一の点上に注目し
て、その検出領域を連続的に通過するバンドを検出する
こともできる（時間的解像）。大きなゲルは必ずしも必
要ではない。さらに、リアルタイムの単一レーン検出モ
ードは完全に自動化された塩基割当及びデータ移動に非
常に適している。
【００１６】蛍光系ＤＮＡ塩基配列決定システムを開発
しようとするいくつかの試みが記載されている。カリフ
ォルニア工科大学のグループによって開発された１つの
システムがエル・エム・スミスの西ドイツ特許出願第
３，４４６，６３５ Ａｌ（１９８４）、エル・イー・
フッドら、西ドイツ特許出願第３，５０１，３０６ Ａ
ｌ（１９８５）、及びエル・エム・スミスら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３ ２３９
９−２４１２（１９８５）に開示されている。このシス
テムは上記セクションに記載した問題を処置するための
ものであるが、その解決手段は部分的にしか成功してい
ない。
【００１７】カリフォルニア工科大学のシステムは、４
組のＤＮＡ塩基配列決定断片を採用し、これらのそれぞ
れは４種類の蛍光染料の１つで標識されている。２つの
代表的な組の蛍光染料が記載されている。それぞれの組
は、少なくとも２つの構造的に異なるクラスのものから
誘導された染料を含む。
【００１８】発光の最大値は４つの間の識別を容易にす
るために大きな領域（約１００ｎｍ）に広がるが、不幸
なことに吸収（励起）最大値もまた比較的広がってい
る。このため、単一の単色光源で全ての４つの染料を励
起することが困難であり、得られる発光を十分に検出す
ることが困難である。
【００１９】対照的に、近接した吸光度ピークを有する
（従って対応する発光ピークも近接する）染料を用いて
励起効率を高めると他の問題が起きる。ＤＮＡ塩基配列
決定のための検出システムは個々の標識断片を同定する
ために４つの異なる染料の発光スペクトルを識別するこ
とができなければならない。これらの発光は通常その強
度が低い。従って、検出システムは、高い感度（バンド
当たり１０-16 モル以上）及び選択性を有していなけれ
ばならず、さらに、所望の性能特性に合致するために、
迷光及び背景ノイズを最小化するための手段を有してい
なければならない。システムはまた、検出窓を通ってゲ
ルを泳動するあらゆる断片を失うことを避けるために、
検出領域をしばしばモニターすることができなければな
らない。このような検出システムは、単一の装置中にミ
ルコストに影響を与えることなく複雑の検出器を備える
ために比較的コスト効率が良くなければならない。
【００２０】検出系に蛍光を用いる多くの検出装置が知
られている。これらの装置の１つがナイムスキら、Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６，４７１−４７５ １
９８０，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｓｏｆ
ＤＮＡ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｙｅ．．．ａ
ｎｄ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ”に記載されている。この電気泳動検出シ
ステムでは、比較的大きなＤＮＡ断片を分離するため
に、ガラス管がアガロースゲルで満たされる。次に大き
な断片のそれぞれを規定するための検出システムとして
走査モノクロメーターが用いられる。走査モノクロメー
ターは広い領域のスペクトル特性を正確に測定すること
ができることが知られている。しかしながら、モノクロ
メーターの限られた能力及びこれと共に用いられ、発光
光線を集めたり分散させたりする光学素子の故に多くの
光が失われる。これらの検出方法は感知され測定され得
る光の割合を限定する。従って、低い光が施される場合
の感度が低い。さらに、連続的に集められる光は通常非
効率的である。
【００２１】スミスら（上記参照）によって開示された
検出装置は、単一又は複数の光検出器上に入射する光の
波長を選択するために一連の狭いバンド干渉フィルター
を用いる。この型のシステムはかなり単純で安価である
という利点を有する。しかしながら、これは実質的な欠
陥を有する。記載されている具体的なシステムは、１つ
の光検出器に複数の交換可能なフィルターか、または検
出器に対応する複数の固定フィルターのいずれかを用い
ることが可能なフィルター光度計を使用する。先ず、こ
れらの装置のうち、単一の検出器を有する回転フィルタ
ー（スミスらの第３図参照）は、それぞれのフィルター
領域を測定することができる時間を限定するという欠点
を有する。異なる発光スペクトルを識別するために、検
出時間は異なるフィルターによってシェアされなければ
ならない。スミスらのシステムはここでは取扱う必要の
ない追加的な光学的困難性を有する。
【００２２】異なる正味チャージを有する染料を用いる
ことによってより深刻な問題が生じる。スミスらのＮｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈの論文に記
載された従来のシークエンシングゲルは４つの染料のそ
れぞれによって標識されたプライマーからつくられたＴ
レーンを示す。電気泳動移動度に有意な差動動揺が現わ
れることは明らかである。これらの４種類の染料を有す
る塩基配列決定断片の完全な組を１つにすると、単一の
レーンで電気泳動した時にかなりの重複がみられ、そし
ておそらく順序の入れ替えさえ起きるであろう。この効
果は、上述した信号強度の大きな動的領域の問題と相ま
って、この染料セットを用いて単一レーンでの塩基配列
決定を行なうことを困難にしている。
【００２３】最後に、蛍光標識塩基配列決定断片を調製
するために用いられる方法論は困難な配列決定条件をも
たらす。マキサム−ギルバード法では、５′標識オリゴ
ヌクレオチドが酵素的に、制限酵素切断によってつくら
れた接着末端を有する二本鎖ＤＮＡに連結される。これ
により、このようにして製造された塩基配列決定断片に
制限が加えられる。サンガー法では、５′標識オリゴヌ
クレオチドがプライマーとして用いられる。４つの特殊
なプライマーが必要である。新規のベクター系を用いる
ために、４つの新規な染料染色プライマーを合成し精製
するという複雑な工程を行なわなければならない。
【００２４】非放射標識ＤＮＡ塩基配列決定の自動化の
第２の方法は、アンソージ・ダブリュら、Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３：３１
５−３２３（１９８６）に開示されている。このプライ
マーは、放射標識ヌクレオチドを省略するように修飾さ
れた標準的なジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法に
基づいて４つの容器中で反応され、種々の長さの酵素的
に複製されたＤＮＡ断片の組が生成される。４つの容器
のそれぞれは４つのＤＮＡ塩基の１つに対応するジデオ
キシヌクレオチド鎖ターミネーターを含んでおり、それ
によって４つのゲルレーンにおける従来の電気泳動分離
から末端塩基を割り当てることができる。それぞれの断
片は、５′−テトラメチルローダミン蛍光標識を有して
おり、これはゲルの全幅を介して通過するアルゴンイオ
ンレーザーによって励起される。経時的に解像されたＤ
ＮＡバンドの蛍光発光は、映像化光学素子、視野透孔、
光ガイド、フィルターアセンブリー及び光電子増倍管を
直列に有する、それぞれのレーンに対する別々の据付型
の手段によって４つのレーンから集められる。
【００２５】この方法によって主張される１つの利点
は、据付型の検出器の故に装置内の可動部品の数が少な
く、それによって４つのゲルレーンの連続的なモニタリ
ングが可能になるということである。このモニタリング
法は、１つのレーンに対して用いられるものよりも複雑
であるが、残りの３つのレーンにおけるバンドの不存在
に比較しつつ標識されたバンドの存在を検出することが
できるので、塩基割当の確実性が改善されるとされてい
る。実際、単一の標識を用いると塩基割当のために４つ
のレーンを用いることが必要になり、提供されたシステ
ムはさらに単純化したりその容量や出力を改善すること
ができない。このシステムはまた、単一の配列分析のた
めに忠実なレーン間の相対的位置付けが必要となるの
で、本来的に正確性が低い。熱勾配のような操作的複雑
さ及びゲル不純物はこの位置的一体性を破壊して局所的
なゲル歪を生み出してバンド移動度に影響を与え、ひい
ては塩基配列決定に悪影響を与え得る。
【００２６】アンソージら及びスミスらの標識プライマ
ーの使用は、他の点においても劣っている。ポリメライ
ゼーション反応は別々の容器で行なわなければならな
い。全てのＤＮＡ断片は、それが真正なターミネーショ
ン断片であっても外来性の断片であっても標識される。
これは、アデノシンヌクレオチドを含む実質的に全ての
断片が標識される現存するシステムに類似している。従
って、得られるシークエンシングパターンは、現在の方
法において発生するほとんどのアーチファクト（例えば
フォールス又はシャドウバンド、パイルアップ等）を有
する。
【００２７】最後に、１９８５年１０月９日に発行され
た欧州特許出願第８５１０３１５５．９号は、任意的に
予め標識されたヌクレオシドを含有するＤＮＡストラン
ドを後標識（ｐｏｓｔ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）するため
のシステム及び方法を開示する。予備標識は、ヌクレオ
チドがサンガーＤＮＡ鎖終結法において用いられる前に
所望の鎖終結ヌクレオチドにビオチンを共有結合するる
ことによって行なうことができる。しかしながら、予備
標識されたヌクレオチドは開示されたシステムにおいて
検出可能ではない。別々の容器内で調製された、Ａ、
Ｔ、Ｃ及びＧのＤＮＡ塩基に対応するＤＮＡの予備標識
されたストランドは電気泳動的に分離され、共有結合さ
れたフルオレセインのような蛍光体を有する、相補的結
合物質、通常アビジンに対して露出される。蛍光体は検
出され、信号の存在は、元々調製されたＡ、Ｔ、Ｃ又は
Ｇに対応する特定の容器又はゲルレーンに関係付けられ
る。この後標識法は、標識ＤＮＡの調製及び引き続く電
気泳動分離を別々の容器及びゲルレーンでそれぞれ行な
われなければならない。鎖終結法の反応中に同じ容器内
においてＤＮＡストランドを同時に区別して標識するこ
とができる方法又はシステムも、適当な検出システムの
単一のゲル／レーン中での検出中に区別して標識するシ
ステム又は方法も全く開示されていない。
【００２８】この発明は従来技術の多くの欠点を克服す
ることを目的とする。これは上述した多くの欠陥を有す
ることなく多くの所望の性能特性を有するＤＮＡ塩基配
列決定システムを包含する。この発明は、時間的及び／
又は空間的分離の後に異なる種、通常レポーター標識Ｄ
ＮＡからの放射エネルギーの存在を検出し、種を同定す
るためのシステムである。このシステムは種の本質の関
数として第１のセンスにおいて振幅が異なる第１の信号
を発生するための、種のスペクトルに対して反応的な手
段と、種の本質の関数として第１のセンスとは異なる第
２のセンスにおいて振幅が異なる第２の信号を発生する
ための、スペクトルに対して反応的な手段と、第１及び
第２の信号の関数の比に対応する第３の信号を得るため
の第１及び第２の信号に対して反応的な手段とを有し、
第３の信号の振幅が種の同定を示す。
【００２９】第１及び第２の信号を発生するための手段
は、波長の関数として変化する透過／反射特性を有する
二色フィルターと、発光をフィルターに向けるための手
段と、発射された光の透過光及び反射光をそれぞれ受容
し、そのそれぞれの強度に対応して第１及び第２の信号
を発生するための第１及び第２の検出器とを具備する。
好ましくは、二色フィルター特性は、種発光スペクトル
の中央付近で発生する透過から反射にわたる比較的鋭い
遷移を有する。中央に位置する遷移点においては、第３
の信号の振幅の変化はスペクトル全域にわたるよりも等
しく分配される。
【００３０】通常、分析される種は、近似するスペクト
ルを有する蛍光物質で共有結合的に標識されたＤＮＡ断
片又は他の分子である。これらの分子は通常、その大き
さ、電荷又は他の物理的特性に従って分離できるように
電気泳動ゲル中に収容される。このシステムは、蛍光物
質の励起領域内の出力を有するレーザー又は他の放射エ
ネルギー源を有する。
【００３１】例えばＤＮＡ断片のような、検出すべき標
識された種の発光部分は次の構造を有する。
【００３２】
【化１７】 ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級アル
キル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す。
【００３３】また、この発明は、近似したスペクトルの
波長にわたって異なるセンスにおいて変化する発射され
たエネルギーの関数を得るための工程と、種の同定を示
す、これらの関数の比を決定する工程とを含む、時間及
び／又は空間的分離に続く、異なる種から発射された放
射エネルギーの存在を検出するための方法をも開示す
る。発射されたエネルギーの関数は、波長の関数として
変化する透過／反射特性を有する二色フィルターに放射
エネルギーを通すことによって得ることができる。
【００３４】鎖ターミネーターがレポーターを有する、
サンガー鎖終結法の改変に従ったＤＮＡ塩基配列分析の
ための方法が記載されている。好ましくは鎖ターミネー
ターは着色された、さらに好ましくは蛍光レポーターを
担持する。鎖ターミネーターは次の構造の１つであり得
る。
【００３５】
【化１８】 ここで、(a) ＸはＨ、ＮＨ2 若しくはハロゲン、Ｙは
Ｈ、ＮＨ2 、ＯＨ若しくはハロゲン、又は(b) Ｘ＝Ｙ＝
ＯＨであるか、あるいは
【００３６】
【化１９】 である。Ａは次の構造を有する蛍光レポーターであり得
る。
【００３７】
【化２０】 ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級アル
キル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す。
Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、７−デ
アザグアニン又は７−デアザヒポキサンチンのようなヘ
テロ環塩基であって、ピリミジンはＮ1 位を介して糖部
分に結合し、デアザプリンはＮ9 位（プリンナンバリン
グ）を介して糖部分に結合する。破線は好ましくはアミ
ド結合によって蛍光部分（Ａ）とヘテロ環（Ｂ）とを連
結するリンカー及び任意的スペーサー（原子群）を示
し、Ｂがピリミジンである場合にはリンカーはそのピリ
ミジンの５−位に結合され、Ｂがデアザプリンである場
合にはリンカーはそのデアザプリンの７−位（プリンナ
ンバリング）に結合されている。
【００３８】この発明のもう１つの局面においては、４
つの塩基に対応する４つの鎖ターミネーターが異なる識
別可能なレポーターを担持する、この発明によって修飾
されたサンガーの鎖終結法に従うＤＮＡ塩基配列分析法
が提供される。４つの鎖終結反応は、従って、異なる容
器中で行なわれて電気泳動分析の前にまとめられるか、
又は単一の容器中で行なわれる。
【００３９】１つにまとめられたＤＮＡ塩基配列決定断
片は、単一のレーン中で同時に電気泳動分離にかけるこ
とができる。それぞれのレポーターを担持する断片を単
一の光源で励起することによって、特徴的な発光が起
き、それによって検出及び同定が可能になる。
【００４０】４つのレポーターの組は、単一の光源によ
って効率的に励起することができ、類似するが識別可能
な発光スペクトルを有するものが選択される。結合され
たＤＮＡ断片の電気泳動移動度における示差的動揺は小
さい。この要件は一般的に、４つのレポーターが類似の
分子量、形状及び電荷を有していれば満たされる。
【００４１】これらの基準は、以下の構造を有する蛍光
部分を持つレポーターによって満たされる。
【００４２】
【化２１】 ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級アル
キル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示す。
このようなレポーターは、以下の構造式を有する、保護
され、活性化された中間体を介して導入することができ
る。
【００４３】
【化２２】 ただし、上式において、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は
Ｈ、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン又はアル
コキシ基、Ｒ”はアルキル、Ｒ′はアルキル又はアリー
ル、Ｘは良好な離脱（ｌｅａｖｉｎｇ）基である。
【００４４】この発明のシステム及び方法は、比較的高
い感度を維持したまま発光スペクトルの比較的小さな波
長差をリアルタイムで識別する能力を有する。このシス
テムは光検出器上に利用可能な光の大部分を分配する。
最後に、この検出システムは蛍光種を含むゲルの連続的
なモニタリングを可能にする。この特徴により、間欠型
の検出システムにおいては通常本質的であった、不完全
なデータが誘導される可能性が減少される。上述した全
ての特徴は、比較的低い製造コストでこのユニークなシ
ステムに組み込まれた。
【００４５】極めて近接した発光バンドからの放射はこ
の発明のシステムを用いて検出することができる。これ
らの近接した発光は、システムにおいて分析される物質
に不可逆的に結合した予め選択されたレポーター種から
発っせられる。許容可能なレポーターは一般的に、通常
５０ないし１００ｎｍ、好ましくは２０ないし５０ｎｍ
の狭い波長域にわたって発光することができる１又は２
以上の種が選択される。好ましくは、最大ピークは２ｎ
ｍ未満にまで近づいていてはならない。１つのレポータ
ー種は、物質への結合の態様及びシステム中での分析条
件に依存して、２以上の波長域で発光できるものであっ
てもよい。もっとも、固有の発光特性を有する個々のレ
ポーターが、検出すべき波長域における発光のためによ
り慣習的に選択される。好ましいレポーター種は以下に
記載する。
【００４６】この発明は広い適用性を有するが、ＤＮＡ
塩基配列決定という特定の用途について記載する。
【００４７】この発明のこの好ましい態様において、レ
ポーター標識ＤＮＡ塩基配列決定断片が単一の容器中で
製造される。この容器の内容物、すなわち、レポーター
で標識された種々の長さのＤＮＡ鎖は、分離のための電
気泳動装置を通過させる。この目的のために、図２に示
すように、電気泳動は厚さ約０．２ｍｍないし０．４ｍ
ｍ、長さ約２５ないし４０ｃｍの適当な電気泳動板１０
において行なうことができる。他の寸法も適当に用いる
ことができる。この板１０は適当なゲル１１、通常６％
ないし８％のポリアクリルアミドゲルを有し、ガラス又
はプラスチック支持体１２中に挟まれている。板（ゲ
ル）は従来法により調製される。
【００４８】板１０は通常、ホルダー中に直立して置か
れる。板１０の上端は、緩衝液２４を含む上部容器１６
内に延び、また下方は、緩衝液１８を含む第２の容器１
４内に延びる。緩衝液はいずれの適当な緩衝液であって
もよく、通常、０．１Ｍトリスホウ酸ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．３を用いることができる。このようにして、緩衝液
は、緩衝液間の電気的接触を行なうために、両端部で板
と接する。この配列において、レポーター標識ＤＮＡ断
片は、ゲルの頂部に設けられた穴（図示せず）内にピペ
ットで入れられる。これにより、貯蔵容器１４及び１６
中のターミナル２０を介する電気回路が完成する。この
特定の長さ及び厚みを有するゲルで分離を行なうために
適当な電圧が必要である。陽極が板の下端に位置し、Ｄ
ＮＡ断片を下向きに移動させる。これらの条件下におい
て、断片がゲル中を移動するにつれて、それらは空間的
に分離されてバンドになる。検出領域は板底部近傍に位
置する。この領域において、断片はレーザー光線３１に
よって照射され、断片がこの領域を通過するに従って励
起／発光が起きる。
【００４９】電気泳動板１０に照射するための光学的配
置が図１に示されている。図１のシステムは、近接した
発光バンドの強度を識別し測定するために、いずれの蛍
光又は他の型のレポーターシステムにも用いることがで
きる。もっとも、上述したように、レポーター種が蛍光
化合物である、レポーター標識ＤＮＡ断片からの発光を
検出するための好ましい用途について記載する。これ
は、好ましい励起可能な使用レポーター種の励起波長の
関数として決定される特定の波長を提供するために選択
されるレーザー３０を含む。例えば、ここで開示する蛍
光レポーターに対して用いることができる具体的な光源
として、波長４８８ｎｍ、光束の直径が０．８ｍｍの、
約２５ないし４０ｍＷで操作されるアルゴンレーザーを
挙げることができる。レーザー光線は励起フィルター３
２及び、電気泳動板１０の検出領域において光束の直径
を約０．２ｍｍに絞る合焦レンズ３３を通る。
【００５０】フィルター３２は、検出工程を妨害する不
所望の励起波長をブロックするように選択される。レー
ザー光線が非常に純粋であるならば、このフィルターは
省略することができる。板に入る光線が、ここでは蛍光
標識ＤＮＡ断片であるレポーター標識物質を励起し、励
起波長からシフトした波長の蛍光を発射せしめる。特定
の染料のピーク発光波長特性を後述するが、溶液中に遊
離の状態にある場合には、５０５、５１２、５１９及び
５２６ｎｍである。なお、検出システムは、近接する発
光バンドを有する他の組のレポーターの波長を識別する
こともできる。さらに、レーザー光線は試料に入射する
外来性光が最小になるので好ましい光源であるが、適当
なフィルター及び光学素子を用いると、キセノンアーク
ランプのような非コヒーレント光源を包含する他の光源
も用いることができる。
【００５１】蛍光種によって発っせられた光は適当に配
置された平行化レンズ３４によって集められる。平行化
レンズ３４は発光フィルター３６を介して二色フィルタ
ー３８に移して蛍光の特異的波長特性以外の実質的に全
ての光を排除するための平行光線を生みだす。このフィ
ルターを用いて、５００ｎｍ未満及び５６０ｎｍを越え
る波長の光を実質的に全て排除し、これらの波長の間に
ある波長を有する光は５０％を越える効率で透過する。
【００５２】この発明において、二色干渉フィルター３
８によってこのシステムが非常に近接する発光スペクト
ル同志を識別することが可能になる。これは通常、入射
光線に対して約４５度の角度に置かれる。このフィルタ
ーに入射する光線はこのフィルターによって反射され又
はこれを透過する。ＤＮＡ断片に結合された場合の蛍光
レポーターの発光ピークが５１５、５２４、５３０及び
５３６ｎｍである場合には、フィルター３８は図３に示
すような反射／透過特性を有する。二色フィルター３８
は、これら４つのレポーターに特徴的な蛍光バンドのほ
ぼ中央にある鋭い透過／反射遷移３９を有する。蛍光ス
ペクトルが低波長から高波長にシフトするにつれ、透過
光対反射光の比が連続的に減少する。この特定のフィル
ターはこの用途に選択されたレポーターに対して選択さ
れたものであり、異なる組のレポーターを用いる場合に
は、異なるフィルター特性を有するものが必要になるで
あろう。
【００５３】二色フィルター３８からの光（反射又は透
過光）はそれぞれの合焦レンズ４０を通ってそれぞれの
検出器４２に至る。検出器４２は好ましくは光電子増倍
管である。これらは目的とするスペクトルバンド内で高
い感度を有するものとして知られている。あるいは、シ
リコンフォトダイオード又は他の類似の検出器を用いる
ことができる。検出器４２が平行化透孔から近い所定の
距離だけ離れた位置に置かれる場合には、平行化レンズ
３４は省略することができる。このレンズを省略する場
合には、集光透孔は検出器４２の所望の感知領域に対応
する開口を有することによって規定され、又は、透孔は
光学繊維フェースプレートのような他の代替手段によっ
て規定することもできる。同様に、合焦レンズ４０は検
出器の感知領域が十分に広く、利用可能な光を直接集め
ることができる場合には省略することができる。
【００５４】二色フィルター３８の機能はまた、好まし
くは、２つのフィルターと検出器４２へ発射された光源
の光路に置かれた透孔とによってもたらすことができる
ことが明らかである。この場合に、それぞれのフィルタ
ーは２つの異なる透過特性、すなわち、二色フィルター
の反射又は透過遷移特性を有する。この様にして、２つ
の検出器４２は上述した二色フィルターによって提供さ
れる透過及び反射特性を委ねられる。これら２つのフィ
ルターの透過バンドは図９により明瞭に示されており、
同図中標識フィルター１及びフィルター２である。これ
ら２つのフィルターの透過バンドは、ここで用いる５１
５、５２４、５３０及び５３６ｎｍの４つのレポーター
標識ターミネーターに特徴的な蛍光バンドのほぼ中央で
重複することが分かる。
【００５５】２つのフィルターを用いるこの型のシステ
ムは出願中のロバートソンらの出願中に記載されてい
る。ロバートソンらの出願に記載されているように、一
対のモジュールが、レポーター励起光線が電気泳動ゲル
上の複数のレーンを走査する面の上と下に置かれる。そ
れぞれのチャネルはレポーター標識ＤＮＡ断片を含む。
それぞれの検出モジュールは広い入口領域及びそのＰＭ
Ｔとゲル中の蛍光種との間に置かれた別の波長選択フィ
ルターを有する光電子増倍管を具備する。これらのフィ
ルターは二色フィルターの動作をシミュレートする相補
的な透過バンド特性を有する干渉フィルターである。フ
ィルターは、種の本質の関数として異なる特性における
異なる振幅を有する信号をＰＭＴが発することを許す。
１つのフィルターは低波長の発光をほとんど通し、高波
長の発光を反射するが、他方のフィルターはこの丁度逆
を行なう。透過フィルターをそれぞれの干渉フィルター
について用いて所定の角度よりも大きな、軸からはずれ
た角度からの光を排除することができる。波長フィルタ
ーは、４つの染料の発光領域において、ほぼ相補的な透
過対波長特性を有し、種放射エネルギースペクトルの中
央付近に透過波長を有する。
【００５６】検出器４２からの電気信号は次にそれぞれ
の予備増幅器４６を通過してアナログ−デジタル（Ａ／
Ｄ）変換器に至り、次にシステムコントローラー５２に
至る。システムコントローラー５２の仕事はＩＢＭ Ｐ
Ｃのような小さなコンピューターによって行なうことが
できる。図４ないし６のフローダイアグラムに記載され
たシステムコントローラー５２の機能は、２つの信号関
数の比率を計算することである。二色フィルター３８
は、異なる波長のバンドにおける信号をその波長に従っ
て変調することである。すなわち、反射光検出器につい
ては、短い波長の発光光線は小さな振幅の信号値を得、
長い波長の発光光線は大きな振幅を得る。従って、特定
のレポーター種、すなわち、この発明の好ましい具体例
においては蛍光標識ＤＮＡ断片が、ゲル１０中での空間
的分離に続いて検出領域を通過すると、その発光光線は
波長及び時間（ゲル１０内の移動に基づく）の関数とし
て異なる振幅を有する。この振幅変調光信号は電気信号
に変換され、記載される処理のためにデジタル化され
る。変換後、デジタル信号は比率で示される。すなわ
ち、反射蛍光と透過蛍光の比率が得られる。これらのデ
ジタル信号は１組のＤＮＡ断片に対応する光信号のピー
クを表わすものである。ピーク高さ又はピーク領域に対
応する信号はその比率が表わされる。比率信号の大きさ
は種の同定を示すものである。関数Ｗは１つの検出器の
ピーク強度と他の検出器のピーク強度との比、例えば、
反射光線検出器のピーク強度によって除せられる透過光
線検出器のピーク強度である。それぞれのレポーターの
比率信号の大きさは、後述の例１０においてわかるよう
に、それぞれのレポーターを固有に示すグループ内に入
る傾向を有する。
【００５７】この振幅変調及び比率化工程は、二色フィ
ルターによる場合も、同一の被検種からの同一のスペク
トルに異なって応答するそれぞれ異なる２つの信号を発
生する別々のフィルターを用いた場合でも、数学的に記
載することができる。すなわち、レポーターピーク発光
の際に存在する総電気信号（検出光信号に対応する）は
発散光及び迷走光に基づく成分並びに異なるレポーター
のそれぞれからの蛍光に基づく信号とからなる。電気泳
動中に、レポーター蛍光信号は他の背景成分から識別す
ることができる。なぜなら、蛍光信号は所定の態様で時
間的及び空間的に変化するからである。これは、特に検
出器とゲルとの間に相対的な移動がない場合に比較的一
定の信号を発する背景ノイズ信号と対照的である。ゲル
及び検出器を据付型に配置すると、蛍光信号はゲルを介
するレポーターの移動により時間的に変化する。あるい
は、ゲルは電気泳動後固定されたままで、検出系をゲル
に対して移動させることもできるし、この逆もできる。
さらにまた、検出システムを、ゲル中での移動が起きて
いる間に移動させることもできる。
【００５８】図７には、２つの検出器出力信号が時間の
関数として変化する態様が示されている。図中のそれぞ
れのピーク対は、被検ＤＮＡ中の塩基配列に対応する異
なる組のＤＮＡ断片に対応する。それぞれのピーク対の
比率はそれぞれ特定のＤＮＡ塩基に対応する４つのグル
ープの１つに入る。特定の塩基Ｔ、Ｃ、Ａ及びＧを同定
するのは、これらの比率グループ分けである。
【００５９】レポーター間の感度（Ｗの値によって決定
される）を改善するために、異なる蛍光レポーターの全
ての組合せにおけるＷの変化を最適化しなければならな
い。これは、異なるレポーター発光スペクトルにわたっ
て実質的に変化する透過／反射特性を有する二色フィル
ター又はその上述した均等物を選択することによって達
成される。しかしながら、近接したレポーターについて
は、異なる発光スペクトル（図３）に対してＷの変化を
均等に分配するために、レポーター発光の中央付近に比
較的鋭いフィルター遷移を有するものを用いることが好
ましい。
【００６０】本質的に、このシステムは、稀有の測定感
度及び選択性能を提供する。このユニークなシステムに
おいて、光は２つの近接して結合された検出器に効率的
に向けられる。そして、安価でコンパクトで容易に使用
できるシステムによって高い感度及び選択性を容易に得
ることができる。
【００６１】フローチャート システムコントローラー５２はＡ／Ｄコンバーターから
のデジタル信号をＤＮＡ塩基配列情報に変換する。ほと
んどの場合、これはコンピューターによって実行される
プログラムによりリアルタイムで行なわれる。これは、
検出器からの生データを得るのと並行してデータが処理
され配列情報が得られることを意味する。
【００６２】概念的には、システムコントローラーの操
作は３つの相互作用プロセス、すなわち、データ獲得す
なわち入力、データ分析及び出力、に分解することがで
きる。これらのプロセスはデータを共有し、時間情報を
共有することによって、プロセスを「工程内」に保持し
これらが互いに妨害することを防止する。これらの相互
作用がどのようにして起きるかの詳細は選択された言語
及びハードウェアに依存し、ここでは基本的な問題では
ない。
【００６３】このようにして行なわれるデータ獲得及び
処理は図４ないし６のフローチャートを参照することに
よって理解することができる。この図はＤＮＡシーケン
サー検出器からの生データを出力、すなわち、試料のＤ
ＮＡ配列に変換することができる一般的な方法を示す。
図７は生検出器出力対時間の仮想曲線を示し、以下に述
べる変数のいくつかを例示する。この議論において、以
下の用語を以下のように定義する。
【００６４】１．ｉは獲得される現在のデータポイント
の指数である。このポイントは時間ｔ（ｉ）分に得られ
る。
【００６５】２．ｋは処理される現在のデータポイント
の指数である。このポイントはｔ（ｋ）分で取得される
データに対応する。一般的なデータ処理計画において、
ｋはｉと同一である必要はない。すなわち、データ処理
はデータ獲得よりも遅れていてよい。
【００６６】３．ｔ（ｉ）はデータが獲得された時点の
アレイである。例：ｔ（５）＝６．２分は、第５番目の
データポイントが、操作開始６．２分後に得られたこと
を意味する。
【００６７】４．Ｒ（ｉ）は反射検出器からのデータの
アレイである。
【００６８】５．Ｔ（ｉ）は伝送検出器からのデータア
レイである。
【００６９】６．Ｊは検出されたピークのカウントを示
す。
【００７０】７．Ｎは特定のピークを横切るデータポイ
ントの数を示す。
【００７１】８．ｍはＲ（ｉ）又はＴ（ｉ）において規
定されたピークを横切るポイントの指数である。ピーク
の最初においてｍ＝１、ピークの最後においてｍ＝Ｎで
ある。
【００７２】９．Ｗは上述のセクションで定義した関数
である。 データ獲得 一般的なデータ獲得工程が図４ないし６の左側のフロー
チャートによって示されている。現獲得データを示す指
数ｉが初期化される。プログラムはどれくらいの長さ操
作が行なわれるかを決定する入力、すなわちＩtotal の
データポイントの総数を受容する。生データアレイＲ及
びＴが初期化された後、処理は図４ないし６に示す獲得
ループに入る。データは検出器から読まれ、デジタル化
され、時間ｔ（ｉ）においてそれぞれ獲得されたＲ
（ｉ）及びＴ（ｉ）としてアレイ中に置かれる（この議
論の目的のために２つの読みは同時的である）。この時
点で、指数ｉは増加され、Ｉtotal と比較される。ｉが
Ｉtotal よりも小さい場合には、獲得ループが繰り返さ
れる。ｉがＩtotal と等しいならば操作は停止される。
より精密な計画においては、プログラムは、操作のそれ
ぞれのピークにおいていくつかの性能パラメーター（信
号／ノイズ比、ピーク解像、又は塩基割当における不確
実性のようなもの）を測定することによって自動的に操
作の終了時点を知ることができる。これらの因子の組合
せが予め設定された基準に合致することに失敗した場合
には、操作はコンピューターによって停止される。一次
データは入力は検出器からの生データであり、出力は、
データ獲得及び分析処理の間で共有されるデータアレイ
Ｒ（ｉ）及びＴ（ｉ）中に貯蔵される。この計画は図４
ないし６に模式的に示されている。２つのプログラムは
独立的に同時に走るが、適切なタイミングを維持するた
めに、何らかのコントロール情報がこれらの間で渡され
なければならない。例えば、処理プログラムは獲得工程
を引き次いではならない。なぜなら、そうすることによ
って実存しないデータを処理することを試みることにな
るかもしれないからである。 データ処理 図４ないし６の右側に示されるデータ処理アルゴリズム
はレポーター標識種を検出し同定する一般的な計画の例
を示す。これは全てを包含しているわけではない。これ
は実際の分析器プログラムを開発するために必要な主た
る特徴を例示しているだけである。
【００７３】処理指数ｋ（獲得指数ｉとは区別される）
を初期化した後、プログラムは単純なループに入り、こ
こで獲得プロセスによって提供される生データアレイか
らのデータＲ（ｋ）及びＴ（ｋ）が読まれる。プログラ
ムは次に現時点がピーク上か否かを問う。この条件を決
定する多くのアルゴリズムが存在し、その詳細はここで
は述べない。「ピーク」という語は、一般的な意味を意
味する。Ｒにおけるピークは一般的にＴにおけるピーク
に伴われる。しかしながら、レポーターの同一性に依存
して、これら２つのチャネルにおけるピークはその強度
がかなり異なるかもしれない。しかしながら、これらは
時間的には一致する。従って、２つの信号の荷重平均、
２つの信号の強い方又はＲ（ｋ）とＴ（ｋ）との他の組
合せは時間における「ピーク」を規定するのに用いるこ
とができる。
【００７４】現処理ポイントがピーク上にない場合に
は、指数ｋは増加され、獲得指数ｉと比較される。ｋが
Ｉtotal と同一である場合には、操作は終りプログラム
は停止する。ｋがｉよりも小さな場合には、アレイＲ及
びＴから次のデータポイントがもたらされ、ループが再
び実行される。ｋがｉに等しいならば、それは処理がデ
ータ獲得に追いついたことを意味する。この場合には、
処理プログラムは短時間（通常１秒）待ち、処理が再び
続行することができるまでｋ及びｉの値を試験する。
【００７５】現処理ポイントがピーク上にあるならば、
指数ｍは増加される。指数ｍは現ピークを横切るポイン
トの数を数える。Ｒ（ｋ）及びＴ（ｋ）値はＲ
peak（ｍ）及びＴpeak（ｍ）と呼ばれる一次的アレイ中
に置かれる。プログラムは次に現ポイントがピークの最
終ポイントかどうかを調べる（これを決定するのに公知
のアルゴリズムが存在する）。もしこれがピーク上の最
終ポイントでない場合には、プログラムコントロールは
ｋを増加し、その値をｉと比較し、Ｒ及びＴアレイから
のデータの次の対を読むより上のループに戻る。
【００７６】現ポイントがピーク上の最終の点であるな
らば、ピークカウンターＪが増加され、プログラムはピ
ークの同一性を決定するように進行する。その結果はＤ
ＮＡ配列の次の塩基の同一性である。プログラムは上述
したように現ピークについての関数Ｗを入力データとし
てアレイＲpeak（ｍ）とＴpeak（ｍ）を用いて計算す
る。それぞれのヌクレオチド塩基は特徴的なＷを与える
一対のピークを有する。従って、このピークについての
Ｗの値に基づき、プログラムは出力としてＤＮＡ塩基
Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧの同一性を与える。ピークポイント指
数ｍ及びアレイＲpeak及びＴpeakは０にリセットされ、
プログラムは再び図４ないし６に示す上部データ獲得ル
ープに入る。
【００７７】ＤＮＡ塩基配列決定における標識方法 ＤＮＡ配列決定断片に塩基特異的にレポーターを結合す
るのに用いられる戦略は、あらゆるＤＮＡ配列決定シス
テムにおいて重要な特徴である。それぞれ本質的な利点
及び欠点を有する多くの方法がある。
【００７８】プライマー標識 スミスらによって報告された上記プライマー標識方法
は、自動オリゴヌクレオチド合成機中で生成する中間体
を用いてプライマーの５′末端に染料を結合することが
できるという利点を有する。酵素的な３′鎖伸長はほと
んど起きないと予想される。しかしながら、この方法は
多くの欠点を有する。４つの異なる染料標識オリゴヌク
レオチドプライマーが必要であり、配列決定断片の製造
を４つの別々の反応で行なわなければならず、従ってプ
ロセス全体を自動化しようとするあらゆる試みを複雑化
する。特定のプライマーが必要なので、ベクター（鋳
型）の選択に関する柔軟性が減少する。例えば、標識プ
ライマーの使用は、大量の連続するＤＮＡを迅速に配列
決定するための戦略（例えば「ウォーキング・スルー・
ザ・ジーン」法）の利点をフルに利用することを困難に
する。性能の領域にはより深刻な欠点が存在する。プラ
イマー標識法は全ての断片、すなわち、真正の配列決定
断片及び多くのアーチファクト的断片も標識されること
になる。従って、多くのアーチファクト（シャドウバン
ド、パイルアップ等）が従来の配列決定方法において保
持される。
【００７９】断片後標識 もう１つの可能な方法は後標識計画である。この計画で
は、染料標識は配列決定断片の混合物を生成した後に行
なわれる。この方法の利点は標準的なプロトコール（マ
キサム−ギルバート又はサンガー法）を断片の標識化の
時点まで用いることができるということである。主たる
欠点は標識が例外的に選択的でなければならないことで
ある。レポーターを結合することによってＤＮＡ配列決
定断片の電気泳動移動度に測定可能な増加効果をもたら
すことが予想されるので、この効果は全ての断片につい
て一定でなければならない。複数標識は鎖長と電気泳動
移動度との間の関係を破壊するので破滅的である。
【００８０】鎖ターミネーター標識 この発明では第３のアプローチが好ましい。すなわち、
サンガーＤＮＡ配列決定法の改変における鎖ターミネー
ター標識法である。古典的なサンガー法は、プライマ
ー、ＤＮＡテンプレート、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノーフラグメント）、並びに４つの塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、
Ｇ）に対応する４つの２′，３′−ジデオキシヌクレオ
チドの１つをそれぞれ含む４つの反応容器中の３つの非
標識デオキシヌクレオチド及び１つの放射標識ＤＮＡを
用いる。プライマーの３′末端にヌクレオチドを加える
ことによってポリメラーゼがテンプレートを複製するこ
とを許す適当な反応条件がつくり出される。多くのプラ
イマーコピー上で複数の反応が同時に起き、全てがそれ
ぞれの断片中の適当なヌクレオチドにおいて放射標識を
含む異なる長さのＤＮＡ断片を生成し、ＤＮＡの生成は
４つのジデオキシヌクレオチドの１つによって非可逆的
に終結される。この断片の組は通常ポリアクリルアミド
板電気泳動ゲル上で４つのレーン中で分離される。この
場合、１つのレーンは４つのジデオキシヌクレオチド反
応混合物のそれぞれに対応する。断片を分離した後、感
光性フィルムがゲル上に置かれ、適当な条件下で露光さ
れ、ＤＮＡ配列はゲルの低部からの４つのレーン中の外
観によって、フィルム上のバンドのパターンの読みから
決定される。
【００８１】この発明に従った、サンガー法の改変は、
放射標識ヌクレオチドを省略し、非標識２′，３′−ジ
デオキシヌクレオチドをレポーター標識鎖ターミネータ
ーで置換することである。反応混合物は、４つのＤＮＡ
塩基のそれぞれに対応する適当なレポーターでその３′
末端が非可逆的に標識された断片を含む。反応混合物は
１つにまとめられ、電気泳動により分離される。配列は
この発明の方法に従って、それぞれの断片が有する識別
可能なレポーターの外観の順序によって与えられる。
【００８２】ここで用いられるレポーター標識鎖ターミ
ネーターの構造的範囲及び合理性の輪郭を描くために、
構造を図８に模式的に示すように５つの成分に分解する
ことが有用である。蛍光標識鎖ターミネーターは、例え
ば、（ｉ）三リン酸部分、（ii）「糖」部分、（iii ）
ヘテロ環塩基部分、（iv）リンカー部分、及び（ｖ）レ
ポーターが蛍光化合物であるレポーター部分を含む。
【００８３】上述の記載から、「鎖ターミネーター」と
いう語は、サンガー法におけるＤＮＡ配列決定方法にと
って包括的なものである。この発明の改良された方法
は、有利にレポーターが結合されたより特異的な鎖ター
ミネーターを用いる。これらの新規の化合物は、一般的
な鎖ターミネーターとは、後者が上述したように三リン
酸（ｉ）、糖（ii）及びヘテロ環塩基（iii)部分のみを
有することによって区別される。この発明の鎖ターミネ
ーターは「レポーター標識鎖ターミネーター」と呼ば
れ、通常上記した５つの部分を全て含む。 三リン酸部分
【００８４】
【化２３】 三リン酸部分又は近似する類似体（例えばアルファ−チ
オ三リン酸）はあらゆる酵素基質、鎖終結等にとって必
須の官能部分である。この官能部分は基質に結合エネル
ギーの多くを与え、酵素−基質反応が実際に起きる部位
である。 糖部分
【００８５】
【化２４】 「糖」部分は天然の酵素基質における２′−デオキシリ
ボフラノース構造断片に対応する。分子のこの部分は酵
素認識に寄与し、三リン酸部分とヘテロ環塩基部分との
間の適当な空間関係を維持するために必須である。鎖タ
ーミネーターの１つの要件は、糖部分がリボフラノース
である場合に、３′位がＤＮＡポリメラーゼによって引
き続き用いることができる水酸基を有していてはならな
いことである。水酸基は存在してはならず、他の基によ
って置換するか又は他の方法により利用不可能にしなけ
ればならない。あるいは、アラビノースのようなリボフ
ラノース類似体を用いることができる。現在、多くの修
飾フラノース断片がこの機能を果たすことが知られてお
り、これらは、２′，３′−ジデオキシ−β−Ｄ−リボ
フラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３′−デオ
キシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３′−アミノ−
２′，３′−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、及
び２′，３′−ジデオキシ−３′−フルオロ−β−Ｄ−
リボフラノシルを包含する（エフ・サンガーら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４３
６−５４６７（１９７７）；ゼット・ジー・チドゲアバ
チェら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅａ．，１２，１６７
１−１６８６（１９８４）及びゼット・ジー・チドゲア
バチェら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１８３，２７５−２
７８（１９８５））。 ヘテロ環塩基部分
【００８６】
【化２５】 ヘテロ環塩基部分は特定の空間的配位において水素結合
のアクセプター及びドナーとして働く核酸中の重要な認
識要素として機能する。これらの塩基要素は、正確な配
列決定に必要な高い忠実さをもってテンプレートによっ
て指示される適当なヌクレオチドの取り込みに必須であ
る。この構造部分はまたレポーターを担持する。先行文
献により、ピリミジンの５位及びプリンの７位は全体的
な結合及び認識を有意に妨げることなく比較的大きな置
換基を担持することができることがわかっている（アー
ル・エム・ケイ・デールら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７０，２２３８−２２４２（１９
７３））。従って、好ましいヘテロ環塩基部分は、ウラ
シル、シトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグア
ニン及び７−デアザヒポキサンチンを包含する。人工の
７−デアザプリンは塩基部分に純粋な電荷を与えること
なく、又はグリコシド結合を不安定にすることなくレポ
ーターを結合するために採用される。従って、天然のプ
リンは適当なヘテロ環塩基部分として働かない。なぜな
らこれらは正味の電荷を獲得し、レポーター標識鎖ター
ミネーターを調製するのに通常用いられるアルキル化反
応の後に急速に分解するからである。さらに、類似の官
能基を有する他のヘテロ環塩基も用いることができる。 リンカー部分 リンカーは単にアミノ基だけであってもよいし、炭素、
窒素、酸素及びイオウのような原子を含む骨格を有する
鎖であってもよい。
【００８７】リンカーは好ましくは、三重結合の一端が
１ないし２０原子の置換又は非置換ジラジカル部分Ｒ1
を介してアミンに結合されたジアルキルアミノ基であ
る。三重結合の他端はピリミジンの５位又はプリンの７
位（プリンナンバリング）に共有結合により結合されて
いる。アルキルアミノ基のアミン窒素は蛍光ラベル上の
反応性官能基（例えばカルボニル基）に結合されてい
る。リンカーはＤＮＡポリメラーゼによる結合及び取り
込みを有意に妨害してはならない。ジラジカル部分は、
任意的に二重結合、三重結合、アリール基又はＮ、Ｏ若
しくはＳのようなヘテロ原子を含む炭素数１ないし２０
の直鎖状アルキレンであってもよい。ヘテロ原子は、エ
ーテル、チオエーテル、エステル、アミン又はアミドの
ような官能基の部分であってもよい。ジラジカル部分の
上の置換基は、Ｃ1 〜Ｃ16アルキル、アリール、エステ
ル、エーテル、アミン、アミド基及び塩素を包含する。
好ましくは、ジラジカル部分は炭素数１ないは１０の直
鎖状アルキレンであり、最も好ましくは−ＣＨ2 −であ
る。この発明のレポーター標識鎖ターミネーターに用い
るのに最も適当なリンカーについてのより詳しい記載は
出願中のホブスらの出願中に見出される。 レポーター部分 上述の開示では、好ましくは発光種として１組の蛍光レ
ポーターからの近似したスペクトルの測定に特に適合し
た検出手段の有用性を強調した。しかしながら、近似し
たスペクトルを有する放射を発射する他の種もまた用い
ることができる。この発明の方法を実施するための適当
なレポーター種を選択するためのいくつかの基準を挙げ
ることができる。これらの基準は以下のものを包含す
る。
【００８８】・単色光源による効率的な励起及び強い、
識別可能な発光応答 ・ヌクレオチド鎖ターミネーターに直接的又は間接的に
共有結合することができる化学的に反応性の官能基の存
在 ・オリゴヌクレオチド断片中での立体的関係を動揺させ
ることを最小化するための比較的小さな質量 ・鎖ターミネーターの区別のために選択された基又はレ
ポーター組の他のメンバーと類似した電荷及び寸法特性 ・試料調製、反応及び断片分離条件における広範囲のｐ
Ｈ、イオン強度及び温度に対する物理的完全さ及び検出
特性の安定さ ・ＤＮＡ配列決定断片の生成及び分離に対して最小の悪
影響を与える性質 適当なレポーター種は上述の特性で機能することができ
る物質のいくつかのカテゴリー中に見出すことができ
る。それらは、発色体、蛍光体、化学発光体、スピンラ
ベル及び密電子材料を包含する。物質のこれらの種の検
出はまた、種々の手段によって達成することができる。
例えば、蛍光種発光は、上述したように、スペクトル分
配を区別化することによって検出することができる。代
替的な蛍光検出システムでは、分極化及びディファレン
シャル時間分離のような追加的な種の性質を、それぞれ
の塩基に対応する標識ＤＮＡ鎖ターミネーターを有する
断片を固有に同定するために採用することができる。選
択された検出手段は、公知の方法によって、信号−ノイ
ズ比を最大化することができ、背景又は外来性信号を最
小化することによって許容可能な感度を達成することが
できる。この発明の固有の性質及び利点は、ＤＮＡ配列
決定において適当な検出手段とレポーター標識鎖ターミ
ネーターとを結合することによって達成することができ
る。
【００８９】同様に、従来の光度測定もこの発明の方法
のレポーターの要件を満たす発色体を検出するために用
いることができる、蛍光性をも有していてよい４つの固
有の発色体を選択することができ、これを鎖ターミネー
ター上に取り込んで、吸光度測定及び光子係数分光光度
計を包含する種々の手段によって検出可能なレポーター
を導入することができる。有用な発色体の典型的な例は
２，４−ジニトロフェノール及びその誘導体である。適
当な置換により類似する一定の条件下における異なる発
光特性をもたらすことができ、それによって上述した装
置をわずかに修飾するだけで検出が可能になる。
【００９０】発光レポーターは再発光放射に必要な時間
が蛍光レポーターとは異なる。蛍光レポーターは通常、
１０-8ないし１０-3秒のオーダーの吸収入射エネルギー
を再発光する。「リン光体」という語もしばしば発光化
合物を示すために用いられ、これらの用語は一般的に同
義的に用いられる。これらの化合物は蛍光化合物より
も、入射吸収エネルギーを再発光するのに時間が長くか
かる。典型的な発光レポーターは、２，２′−ジヒドロ
キシビフェニル−５，５′−ジ酢酸の誘導体、例えば
２，２′−ジヒドロキシ−３，３′−ジメトキシビフェ
ニル−５，５′−酢酸、２，２′−ジヒドロキシビフェ
ニル−５，５′−ジアラニン、２，２′−ジヒドロキシ
ビフェニル−５，５′−ジエチルアミン等である。
【００９１】コロイダル金粒子のような、電子過密化剤
として働く追加的な種を共有結合的に鎖ターミネーター
に結合することができる。これらの物質は、電気泳動ゲ
ルレーンに入射する光の透過性の小さな変化を検出する
ことができる映像化システムに用いることができる。そ
れぞれの鎖ターミネーターを固有にラベルして塩基割当
を行なうために、適当な検出基と共にスピン標識もまた
用いることができる。これらの例における検出手段の複
雑さの故に、分離手段に試料をかける前に、試料を１つ
にまとめるのではなく、それぞれのレポーター標識鎖タ
ーミネーターについて分離した試料を維持する単純化が
必要となるかもしれない。
【００９２】特定のシステムにおいて、４つのレポータ
ー標識ヌクレオチド鎖ターミネーターのさらなる区別化
のために、上述したレポーターの組合せを検出するため
の適当な手段を容易につくることができることは当業者
にとって明らかであろう。これは、強い蛍光及び吸光性
を有する、鎖ターミネーターに共有結合的に結合された
化合物について特に適用可能である。しかしながら、上
述した所望の性質に応じて用いるために選択された上述
のレポーターのあらゆる組合せは、検出手段の相補的な
アレイを有するシステム中で用いることができる。
【００９３】この発明の好ましい具体例におけるより具
体的な例では、蛍光部分は、アルゴンイオンレーザーの
ような適当な光源からのエネルギーの吸収によって励起
された後に、検出可能な発光光線を与える。それぞれの
ＤＮＡ塩基について固有の蛍光レポーターを有すること
が好ましく、識別可能な４つの蛍光レポーターの組で一
般的に十分である。
【００９４】この発明のＤＮＡ配列決定方法において有
用なレポーターの群がこの目的のために特に発明され、
これは公知の染料９−カルボキシエチル−６−ヒドロキ
シ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン系である。エス・ビ
ッグスらは、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３，２９３
４−２９４３（１９２３）において、レゾルシノール環
構造中の２位又は４位（サクシニルエオシン）にホウ素
置換基を有すると推測されるいくつかのサクシニルフル
オレセイン誘導体の製造を開示している。サクシニルフ
ルオレセイン上にジニトロ及びテトラニトロ置換基を有
する追加的な誘導体もまた調製された。これらの染料は
明らかに以前の方法よりも単純で効率的な方法であっ
た。しかしながら、これらの染料間の関係は開示されて
おらず、発光スペクトルを含むそれらの物理的特徴の有
意の特徴づけも行なわれていない。この発明によってＤ
ＮＡ配列決定するために有用であるとわかったこの群の
蛍光レポーターは次の構造を有する。
【００９５】
【化２６】 ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 はＨ、低級アルキ
ル、低級アルコキシ、ハロゲン又はシアノ基である。こ
れらの物質は、無水コハク酸又は無水グルタル酸を、メ
タンスルフォン酸中の適当な置換レゾルシノール中で縮
合することによって容易に製造することができる。これ
は、親化合物の製造についてビッグズらによって報告さ
れた方法の改変である。
【００９６】ピー・カーナらは、（米国特許第４，４８
１，１３６号）において、Ｒ2 がアルキル基でＲ1 がＨ
である場合の構造１を含む化合物の群及びその蛍光抗原
結合体の製造における利用を開示した。蛍光免疫分析に
おけるその個々の利用は開示されているが、ＤＮＡ配列
決定にこれらの染料の群を用いることを要求する有用性
については何も記載されていない。
【００９７】キサンチン染料は、いくつかの異なる、一
般的に互変的な分子形態をとることができることが知ら
れている。親（１、ｎ＝２、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ）について
下記に示すこれらの形態は、キノ−、デルタ−、スピロ
−、及びロイコ−形態として知られている。特定の状況
下において観察される形態は、ｎ、Ｒ1 及びＲ2 の性質
並びに温度、溶媒、ｐＨ及び結晶形態のような条件によ
って決定される。明瞭性及び利便性のために、構造の命
名及び図示にはキノ−形態のみを用いる。
【００９８】
【化２７】 実際の蛍光種は、キノ−形態から形式的に誘導されるジ
アニオン２である。この種は７を越えるｐＨを有する水
溶液中で一般的に多数を占める。親染料（ｎ＝２、Ｒ1
＝Ｒ2 ＝Ｈ）から誘導されるジアニオンは、４８６ｎｍ
で操作されるアルゴンイオンレーザーによって励起する
のに非常に適している。ｐＨ８．２において、この種は
４８７ｎｍに最大吸収を示し、この場合の吸光係数は約
７２，６００である。この種はフルオレセインの効率
（量子効率約０．９）に匹敵する効率を伴って５０５ｎ
ｍで発光する。
【００９９】
【化２８】 ４つの識別可能な蛍光染料の組は、置換基Ｒ1 及びＲ2
を変えることによって親発色体の発光最大値に小さな変
化を導入することによって生成することができる。吸光
スペクトルの対応する小さな相違は、４８６ｎｍで操作
されるアルゴンイオンレーザーによる効率的な励起を維
持する。Ｒ1 及びＲ2 を、正味の電荷を担持しない比較
的小さな置換基に限定して選択することにより、染料が
ＤＮＡ断片に結合された場合の電気泳動移動度における
差別化効果が小さくなることを確保することができる。
【０１００】ＤＮＡ配列決定に適したこれらの染料の好
ましいものは、（構造１、ｎ＝２，１）（１）Ｒ1 ＝Ｒ
2 ＝Ｈ、吸収４８６ｎｍ、発光５０５ｎｍ、（２）Ｒ1
＝Ｈ、Ｒ2 ＝ＣＨ3 、吸収４９４ｎｍ、発光５１２ｎ
ｍ、（３）Ｒ1 ＝ＣＨ3 、Ｒ2＝Ｈ、吸収５００ｎｍ、
発光５１９ｎｍ、（４）Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝ＣＨ3 、吸収５０
９ｎｍ、発光５２６ｎｍのものである。最も長い波長に
最大吸収を有する染料は約５０％の励起効率を示す。こ
れらの４つの染料はＤＮＡ配列決定にとって適当な濃度
において容易に検出し識別できる。
【０１０１】鎖ターミネーターへの染料の結合 これらのキサンテン染料の共有結合的連結は、リンカー
のアミノ基とのアミド結合を介して、カルボン酸官能を
介して行なわれる。染料を適当な形態にロックして連結
中の副反応を最小化するために化学保護基を導入するこ
とは有用である。
【０１０２】染料（１）をピリジン中でアルキル又はア
リール酸無水物（Ｒ′）と反応させ、次いで過剰のアル
キルアルコール（Ｒ″）とで処理することにより、３位
及び６位にアシロキシ基を有し、９位にアルコキシ基
（アルコールから誘導される）を有する新規な保護され
た染料（３）が得られる。アシル基がアセチルであり、
アルコキシ基がエトキシである化合物は製造が容易で良
好な安定性、結晶性及び有機溶解性を示す。濃縮アンモ
ニア水で短時間処理すると遊離の染料が再生成される。
【０１０３】
【化２９】 保護染料（３）は多数の標準的操作の１つを用いてカル
ボキシル基を介してアミンに連結される。アミド結合が
好ましい。なぜならアミド結合は安定で形成するのが容
易で、水系に適合するからである。これらの操作におい
て活性な種は、一般的に−Ｘが良好な離脱基である構造
４の中間体である。
【０１０４】
【化３０】 これらの活性種は通常その場で生成され連結されるが、
中間体を分離精製することができる場合もある。特に有
用な単離可能な活性化中間体の群はＮＨＳエステル５で
ある。これらの化合物は、保護された染料３をＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドの存在下で、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド又は好ましくは１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・塩酸
塩のような適当なカルボジイミドで処理することによっ
て容易に調製することができる。これらは安定で高度に
結晶性の化合物であり、種々の溶媒中で第１及び第２ア
ミンと明瞭に反応する。第１及び第２アミンは、この発
明のシステムにおいて分析される目的とする物質によっ
て提供される。これらの物質は典型的には、改変サンガ
ーＤＮＡ鎖伸長プロトコールにおいて有用な所望のデア
ザプリン及びピリミジン塩基を含むジデオキシヌクレオ
チド又はその類似体である。
【０１０５】ＮＨＳエステル５は、広範囲の第２アミン
を連結するために直接用いることができる。アンモニア
水で生成物を脱保護することによって、完全な蛍光強度
を示す染料標識アミン誘導体６が得られる。
【０１０６】
【化３１】 ＮＨＳエステル５を第１アミンに結合することは迅速で
明瞭であるが、脱保護によって、蛍光強度を減少させる
標識アミンが通常つくられる。これは、蛍光物質７ａの
非蛍光スピロラクタム形態７ｂへの部分的な平衡に起因
する。平衡の程度は、溶媒、ｐＨ及びアミンに依存す
る。この問題は染料とアミンとの間にスペーサーを挿入
することによって軽減することができる。スペーサーは
ジアミン若しくはジアシッドから選択することができ、
又は第２級アミン及びカルボン酸を担持する分子から選
択することができる。好ましいスペーサーは染料のカル
ボキシル基とアミド結合を形成することができる反応性
アミンを含む。スペーサーは主としてレポーター、特に
蛍光染料と関連し、これはスピロラクタム形態への環化
を防止するために反応性アミンを染料から移動させるよ
うに機能する。これはまた、スペーサーがＤＮＡポリメ
ラーゼ活性部位からより遠くに染料を延ばす働きをする
という観察と一致する。この伸長はレポーター標識鎖タ
ーミネーターのＤＮＡ断片への取り込みを改善する。
【０１０７】対照的に、ＮＨＳエステル５を好ましい第
２級アミンに結合すると、スピロラクタム形態への環化
が見られないが、活性化及び目的のアミンに連結するた
めのカルボン酸を担持する種が得られる。
【０１０８】
【化３２】 例えば、単純で有効なスペーサーはアミノ酸ザルコシン
から構築することができる。ＮＨＳエステル５をザルコ
シンベンジルエステルに結合し、次いでベンジルエステ
ルを除去することによって、構造８のカルボン酸が得ら
れる。保護された染料３の場合と同様に、これらのカル
ボン酸８は、多くの標準的な方法のいずれか１つを用い
てアミンに結合することができる。ここでもまた、構造
９のＮＨＳエステルが単離可能で特に有用である。
【０１０９】ＮＨＳエステル９をアミンに結合し、次い
でアンモニア水中で脱保護することによって、完全に蛍
光性の一般構造１０のアミン誘導体が得られる。
【０１１０】
【化３３】
【０１１１】
【化３４】 一般的な規則として、適当なスペーサーで到達すること
ができる第１級アミンを含む目的の物質を設計し又は得
ることが好ましい。スペーサーを挿入することによって
環化反応が防止されるものと信じられる。第２級アミン
を用いることもできるが、第１級アミンと同じようには
迅速にかつ効率的に反応しない。
【０１１２】代表的な蛍光標識鎖ターミネーターは１１
である。この物質は収束型の経路を介して構築すること
ができる。２′，３′−ジデオキシウリジンが市販の
２′−デオキシウリジンから５工程で調製される（ケイ
・イー・フィッツナーら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２
９，１５０８−１５１１（１９６４））。５′−三リン
酸はジェイ・エル・ルースら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．，２０，４１５−４２２（１９８１）の１容器法
を採用することによって直接調製される。３−アミノ−
１−プロペン−１−イルリンカーは、ピー・ランガー
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
８，６６３３（１９８１）及び欧州特許出願第８２３０
１８０４．９（１９８２）に記載された一連の反応を採
用することによってヘテロ環塩基の５位に結合される。
５−（３−アミノ−１−プロペン−１−イル）−２′，
３′−ジデオキシウリジン−５′−三リン酸をＮＨＳエ
ステル９（Ｎ＝２、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ）と反応させ、次い
でアンモニア水で短時間処理することによって、新規な
蛍光標識鎖ターミネーター１１が得られる。
【０１１３】
【化３５】 化合物１１は、改変サンガープロトコールにおいてｄｄ
ＴＴＰを置換する。４つの鎖ターミネーターの完全な組
は化合物１１と、異なるヘテロ環塩基及び蛍光部分を有
する３つの類似体とからなることができる。改変サンガ
ープロトコールの残りの非標識鎖ターミネーターを置換
するための３つの類似体の調製は、化合物１１のヘテロ
塩基部分（ウラシル）をシトシン（ｄｄＣＴＰに対
し）、７−デアザアデニン（ｄｄＡＴＰに対し）又は７
−デアザグアニン（ｄｄＧＴＰに対し）で置換すること
を含む。蛍光部分は、芳香族置換基Ｒ1 及びＲ2 を、両
方ともＨから、それぞれＣＨ3 とＨ、ＨとＣＨ3 、及び
両方ともＣＨ3 に変えることによって変えることができ
る。化合物は、１１について記載されたのと類似する経
路を介して調製される。
【０１１４】３−アミノ−１−プロペン−１−イルリン
カーを３−アミノ−１−プロピン−１−イルリンカーで
置換することによって、より容易に調製することができ
る機能的に均等なレポーター標識鎖ターミネーターが得
られることがわかった。プロピニルリンカーを用いるこ
とにより、プロペニルリンカーを用いて製造されるもの
よりも安定なレポーター標識鎖ターミネーターがより高
い収率で得られる。もう１つの利点は、プロピニルリン
カーは、プロペニルリンカーよりも部分選択的にヌクレ
オチド塩基に結合することができることである。
【０１１５】従って、この発明によって改変されたサン
ガー鎖伸長法において用いるのに好ましいレポーター標
識鎖ターミネーターは１２、１３、１４及び１５であ
る。
【０１１６】
【化３６】
【０１１７】
【化３７】 さらに、蛍光染料が一旦デアザプリン又はピリミジン塩
基にリンカー及び任意的なスペーサーを介して結合され
ると、その正規の発光最大が幾分長波長側にシフトする
ことが予想される。この効果は、塩基の性質並びにｐ
Ｈ、イオン強度、溶媒、分離媒体のような測定条件にあ
る程度依存する。あるいは、蛍光体の発光特性に影響を
与えるように思われない１つの因子は、蛍光標識鎖ター
ミネーターを有するＤＮＡ断片中の隣接するヌクレオシ
ドの性質である。特定の蛍光体の発光は、その鎖ターミ
ネーターがいずれの隣接するピリミジン又はプリンに酵
素的に結合された場合でも一定に保たれるように思われ
る。例えば、上述したレポーター標識鎖ターミネーター
は、４８８ｎｍで励起すると、５１５ｎｍ（１２）、５
２４ｎｍ（１４）、５３０ｎｍ（１３）及び５３６ｎｍ
（１５）に最大発光を有する。同様な測定条件下におい
て、これらの発光体は未結合の、溶液中で遊離の状態に
おいて、正規の最大発光５０５ｎｍ、５１２ｎｍ、５１
９ｎｍ、及び５２６ｎｍをそれぞれ有する。発光最大の
これらのシフトは容易に測定することができ、定型的な
実験により決定することができる。この最大発光のバラ
ツキの特徴づけにより、引き続きこの発明のシステムに
おける二色フィルター又はその均等物の所望の反射／透
過特性を選択することができる。
【０１１８】ＤＮＡ合成酵素の選択は、鎖ターミネータ
ーの特異的な構造によって主に決定される。例えば、化
合物１１がＤＮＡポリメラーゼＩ酵素のクレノーフラグ
メントで配列特異的終結を与えるのに失敗し、ＡＭＶ逆
転写酵素又はバクテリオファージＴ７ポリメラーゼで終
結した場合には、末端は、ｄｄＴＴＰで観察されるもの
（従来の32Ｐラベルを用いて判定されるように）と実質
的に同一の末端を与える。
【０１１９】鎖伸長／終結反応は、状況（例えば所望の
末端の範囲、包含される自動化の程度）に応じて、別々
の容器内又は単一の容器内で行なわれる。蛍光標識鎖タ
ーミネーター及びｄＮＴＰ濃度は配列決定断片の適当な
濃度を与えるように調節される。蛍光標識ＤＮＡ配列決
定断片は、その32Ｐ標識対応物よりも大きな安定性を示
し、時間が経つと分解する32Ｐ標識断片と異なり、直ち
に又は後で電気泳動的に分析することができる。
【０１２０】従来技術の多くの本来的な欠点を克服する
ことに加え、この発明はまた、多くの操作的利点を与え
るので有意義である。最も重要なことには、ターミネー
ター標識が、結合されたレポーターを塩基特異的終結現
象に強く関連づけることがある。正規の終結から得られ
たＤＮＡ配列のみがレポーターを担持する。これによ
り、従来の配列決定において観察された多くのアーチフ
ァクトが排除される。これは配列決定ベクターの選択に
完全な柔軟性を与える。なぜなら、特定のプライマーが
関与してはいないからである。この発明の４つの低分子
鎖ターミネーターによってレポーターが担持されている
という事実によって、自動化が容易に行なわれ、単一の
反応で選択的に導入することができる。本来的な操作的
欠点はない。このアプローチにおける問題はその設計段
階において生じる。一般的に、ＤＮＡポリメラーゼは高
度に基質特異的である。４つのレポーター標識鎖終結化
剤は、結合されたレポーター基が、塩基取り込みの程度
又は忠実さを過度に妨害しないように慎重に設計されな
ければならない。
【０１２１】高い性能ポテンシャル及び多くの操作上の
利点により、レポーター標識鎖ターミネーター法が、改
変サンガー法を介してレポーター標識ＤＮＡ配列決定断
片を調製するための方法として優れたものとなる。
【０１２２】プライマー標識 ここで記載した染料は、蛍光標識鎖ターミネーターの調
製において最も有利に用いられるが、これらはまたプラ
イマー標識アプローチにおいても用いることができる。
検出、識別及び電気泳動移動度に関するこれらの物質の
優れた性能により、この出願が、スミスらのシステムの
実質的な改良となる。
【０１２３】スミスらの方法では、保護された、アミノ
誘導ヌクレオシドフォスフォラミジト（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄｉｔｅ）が、自動合成機を用いて５′−アミ
ノ−５′−デオキシオリゴヌクレオチドを調製するため
に用いられる。この物質は、精製され、次いで別々の非
自動的反応において４つの異なる染料に結合される。４
つの染料標識オリゴヌクレオチドは精製され、通常の放
射標識デオキシヌクレオチドを省略したサンガープロト
コールにおいてプライマーとして用いられる。この出願
において記載された染料の保護された誘導体（例えば
３）の利用可能性により、保護された染料で標識された
ヌクレオシドフォスフォラミジトを設計することが可能
になる。自動合成機中で用いた場合には、この様な試薬
は、最終の５′残基及び蛍光レポーターを同時に導入す
ることを可能にする。この利点により、手動的結合及び
余分な精製を行なう必要性が排除される。
【０１２４】典型的な保護された、染料標識ヌクレオシ
ドフォスフォラミジド試薬は、次のようにして構築する
ことができる。ＮＨＳエスエル５をその場で生成し、
５′−デオキシ−５′−（メチルアミノ）チミジンと反
応させることによって、保護された染料標識ヌクレオシ
ド誘導体１６が得られる。標準的な方法を用いて３′亜
リン酸化を行なうと、対応するフォスフォラミジト１７
が得られる。
【０１２５】
【化３８】 プライマーとして働く５′−染料標識オリゴヌクレオチ
ドを構築するために、５′末端がＴ残基を有する配列が
選択される。１７が最終的なフォスフォラミジト試薬と
して用いられることを除き、自動合成が通常通り行なわ
れる（ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基が存在しな
いので、最後の酸処理は省略することができる）。固体
支持体からオリゴヌクレオチドを放出するアンモニア水
での処理はまた、染料を脱保護化する働きをする。脱保
護は、ヌクレオチド塩基を脱保護するために用いられる
延長されたアンモニア処理に続いて完了する。標準的な
予備ゲル電気泳動により染料標識オリゴヌクレオチドが
もたらされる。
【０１２６】この方法論はプライマー標識方法論固有の
問題を回避はしないが、スミスらのシステムに用いられ
るプライマーよりも優れた性能を提供する。電気泳動度
の区別的シフトは最小化され、検出／識別は上述のよう
に、大いに改良される。
【０１２７】他の染料有用性 ＤＮＡ鎖ターミネーターを標識するのに有用なだけでな
く、これらの染料は蛍光レポーターとして一般的に有用
であると予想される。これらはタンパク質、ハプテン、
リボ核酸又は、免疫分析、特異的結合分析、組織化学染
色における用途若しくは蛍光標識を必要とする他の用途
に用られる生物学的な興味対象分子の標識に用いること
ができる。これらの物質の標識は、アミンの標識につい
て上述したのと類似する公知の方法を用いることによっ
て行なうことができるものと思われる。これらの組成物
は特定の用途において２以上の蛍光レポーターが必要な
場合に特に有用であると予想される。なぜなら、これら
は、単一の単色光源によって効率的に励起することがで
き、そのシフトされた発光最大の故に区別可能なレポー
ターとして検出することができる。これらは、これらの
染料をＤＮＡ配列決定のレポーターとして有用としたの
と同じ蛍光特性である。これらの染料は、公知のフルオ
レセインにおいて一般的に必要な、異なる官能基を用い
るのではなく、同一の化学的官能性を用いることによっ
て結合することができるというさらなる利点を有する。
【０１２８】非環状ヌクレオシド誘導体 従来の32Ｐ配列決定において、２′，３′−ジデオキシ
ヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）は鎖ターミネータ
ーとして実質的に排他的に用いられるが、上述したよう
に、他の糖修飾誘導体もまた用いることができる。これ
らの物質は、製造するのが比較的困難であるという欠点
を有する（ｄｄＮＴＰについても幾分そうである）。よ
り単純でより容易に導入することができる糖を有する鎖
ターミネーターの有効な組が、従来の32ＰＤＮＡ配列決
定及び蛍光系配列決定（蛍光レポーターがヘテロ環塩基
に結合されている）の両方において有用であろう。
【０１２９】抗ウイルス剤アシクロバー（アシクログア
ノシン）において、２−ヒドロキシエトキシメチル基が
２′−デオキシリボフラノシル基に置換されている。ア
シクロバーは対応する三リン酸（ＡｃｙＧＴＰ）にその
場で代謝される。ＡｃｙＧＴＰは種々のポリメラーゼに
対する競合的又は非競合的阻害剤として知られている。
それはまた、広くこれらの酵素の鎖終結代替基質である
が（ピー・ブイ・マクガートら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２
５，５０７（１９８４））、その阻害性成分はその基質
の行動の正しい分析を複雑にした。アシクロバーの抗ウ
イルス活性は選択的にウイルスポリメラーゼを阻害する
その能力によって説明され得るので、ＡｃｙＧＴＰの処
理速度及びそれによって得られる生産物は完全には特徴
づけられていない。（チミジン、アデノシン及びシトシ
ンの対応する非環状三リン酸は報告されているが、それ
らとポリメラーゼとの相互作用はより以上に特徴づけら
れていない。）従来技術において、非環状ヌクレオシド
三リン酸（ＡｃｙＮＴＰ）がＤＮＡの重合を、ｄｄＮＴ
Ｐのような化合物の効率及び忠実さと同程度に鎖終結す
ることは全く知られていない。さらに詳細に言うと、Ａ
ｃｙＮＴＰが、ＤＮＡ配列決定実験において潜在的な鎖
ターミネーターとして用いられた際にシークエンシング
ラダーをもたらすということは報告されていない。
【０１３０】この発明の他の局面において、非環状ヌク
レオシド三リン酸（ＡｃｙＮＴＰ）はサンガー法による
ＤＮＡ配列決定における鎖ターミネーターとして有用で
あることが示された。
【０１３１】
【化３９】 これは、ｄｄＮＴＰに代えてＡｃｙＮＴＰを用いて、従
来のサンガー配列決定（32Ｐヌクレオチドレポーター）
を行なうことによって示された。得られたシークエンシ
ングラダーは同様のＤＮＡ断片のバラツキを得るために
より高い濃度の（約１０倍）ＡｃｙＮＴＰが必要である
ということを除き、実質的に同一である。ＡｃｙＮＴＰ
はＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）及び
ＡＭＶ逆転写酵素の両方に対して有効であった。
【０１３２】ＡｃｙＮＴＰは、ｄｄＮＴＰよりも容易に
合成できるという利点を有する。これは従来の配列決定
における主たる問題ではないが、構造的に複雑なレポー
ター標識鎖ターミネーターが調製される場合には有意義
である。２−オキシエトキシメチル基を糖部分（先に定
義した）として用いることによって、許容可能な性能を
維持しながら試薬合成が大幅に単純化された。
【０１３３】実験 以下の例は例示のために記載されたものであり、限定的
なものではない。
【０１３４】全ての温度は摂氏で表わされている（室温
は２５度を意味する）。他に明示がない限り、液体の混
合物を除き（これは体積基準）、全ての部及び％は重量
基準である。次の略記を採用した。ＤＭＦ＝ジメチルホ
ルムアミド、ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド、ＮＨＴ
ＦＡ＝トリフルオロアセトアミド基、ＴＥＡＢ＝炭酸水
素トリエチルアンモニウム、Ｔris=トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン、ＳＦ＝スクシニルフルオレセイ
ン、ＮＭＲ＝核磁気共鳴スペクトル、ＩＲ＝赤外吸収ス
ペクトル、ＵＶ＝紫外スペクトル又は検出、ＴＬＣ＝シ
リカゲル上での薄層クロマトグラフィー、ＧＣ＝ガスク
ロマトグラフィー、ｍｐ＝融点、ｍｐｄ＝分解を伴う融
点、ｂｐ＝沸点。ＮＭＲデータを記載するにあたり、化
学シフトはｐｐｍで示し、結合定数Ｊはヘルツで示し
た。全ての融点は補正していない。イオン交換樹脂は使
用前に適当な水性溶媒及び有機溶媒で洗った。ここで記
載する全ての化合物の同一性は、適当なスペクトル的及
び分析的手法により確立された。他に断りがない限り、
シリカゲル上でのクロマトグラフィーによる精製は、ス
チルら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４３，２９２３−２
９２６（１９７８）に従った。
【０１３５】例 １ ５０５ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の
調製 Ａ． ９−（カルボキシエチリデン）−３，６−ジヒド
ロキシ−９Ｈ−キサンテン（ＳＦ−５０５）の調製 レゾルシノール（３３．０ｇ，０．３００モル）と無水
コハク酸（３０．０ｇ，０．３００モル）とを丸底フラ
スコに入れ、窒素でパージした。メタンスルホン酸（１
５０ｍｌ）を加え、溶液を６５℃で２時間窒素雰囲気下
で撹拌した。反応混合物を、激しくかきまぜている氷冷
水（１Ｌ）に一滴づつ加え、これと同時に５０％水酸化
ナトリウム溶液を加えてｐＨを２．５±０．５に保持し
た。粒状の沈殿として現われた生成物をろ過して集め、
水（３×１００ｍｌ）で洗い、次にアセトン（３×１０
０ｍｌ）で洗った。生成物を空気乾燥し、次いで１１０
℃で１８時間真空乾燥（真空炉）すると、暗赤色の粉末
（３７．７ｇ，８８％）が得られた。
【０１３６】１．０ｇの生成物を熱い０．３Ｎ ＨＣｌ
２５ｍｌに溶解することによって分析試料を調製し
た。冷却することによって形成された沈殿をろ過によっ
て除き捨てた。薄い水酸化ナトリウムを加えてｐＨを
１．２５に上げた。得られた沈殿をろ過によって集め、
水ですすぎ、空気乾燥し、Ｐ2 Ｏ5 上で１４０℃で３６
時間真空乾燥した。
【０１３７】元素分析：計算値［Ｃ（１６）Ｈ（１２）
Ｏ（５）］Ｃ６７．６０，Ｈ４．２６．実測値：Ｃ６．
３７，Ｈ４．３４，０．５２％ 水（Ｋ−Ｆ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（殆どスピログラム型）：δ
２．６９０（ｔ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２Ｈ），３．０７０
（ｔ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２Ｈ），６．５３０（ｄ，Ｊ＝
１．８ｈｚ，２Ｈ），６．６７６（ｄｄ，Ｊ＝８．７，
１．８ｈｚ，２Ｈ），７．４３２（ｄ，Ｊ＝８．７，
１．８ｈｚ，２Ｈ），９．９６４（Ｓ，２Ｈ）． 可視吸収（ｐＨ８．２；５０ｍＭ ａｑ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ）：最大４８６ｎｍ（７２，６００） Ｂ． ９−（２−カルボキシエチル）−３，６−ジアセ
トキシ−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２Ｅｔ
ＳＦ−５０５）の調製 ＳＦ−５０５（２９．３ｇ，１０３ｍｍｏｌ）を氷冷無
水酢酸（５００ｍｌ）に加え、次にピリジン（１００ｍ
ｌ）を加えた。混合物を氷中で２０分かきまぜ、次に氷
冷水（７Ｌ）に迅速にかきまぜながら２０分間にわたっ
て加えた。さらに３０分間かきまぜた後、中間生成物を
ろ過し、水（４Ｌ）に再懸濁し、さらに３０分間かきま
ぜた。固体をろ過によって集め、絶対エタノール（１
Ｌ）に溶解し、４５分間還流した。この溶液を回転蒸発
器上で２００ｍｌに蒸留すると結晶化した。生成物をろ
過によって集め、空気乾燥し、次いで真空乾燥して薄オ
レンジの微結晶（２１．９ｇ，５１％）を得た。
【０１３８】塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶
すると、無色の微結晶が得られた。 Ｍ．Ｐ．：１４２−１４３℃． 元素分析：計算値［Ｃ（２２）Ｈ（２２）Ｏ（８）］Ｃ
６３．７６，Ｈ５．３５．実測値：Ｃ６３．５８，Ｈ
５．３９． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０３５（ｔ，Ｊ＝
６．９ｈｚ，３Ｈ），１．６６７（ｍ，２Ｈ），２．２
３２（ｍ，２Ｈ），２．２９４（ｓ，６Ｈ），２．８８
８（ｑ，Ｊ＝６．９ｈｚ，２Ｈ），７．０−７．１
（ｍ，４Ｈ），７．５７５（ｄ，Ｊ＝９．１ｈｚ，２
Ｈ）． Ｃ． ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル））−エチル−３，６−ジアセトキシ−９−エトキシ
−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５０５−ＮＨ
Ｓ）の製造 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５０５（１０．４ｇ，２５．１ｍｍｏ
ｌ）を塩化メチレン（３００ｍｌ）及び１−（３−ジメ
チル−アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・
塩酸塩（９．７０ｇ，５０．６ｍｍｏｌ）と混合し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド（４．３２ｇ，３７．５ｍ
ｍｏｌ）を加えた。この混合物を１時間かきまぜ、水
（５×５０ｍｌ）で洗った。１つにまとめた水層を塩化
メチレン（５０ｍｌ）で逆抽出し、プールした有機層を
硫酸ナトリウム上で乾燥し、引きはがした。エタノール
（７５ｍｌ）でつき砕き、ろ過し、空気乾燥すると、淡
黄色の固体として粗生成物が得られた（約１０ｇ）。こ
の物質を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、シクロヘ
キサン（５０ｍｌ）を加えた。スプーン１杯のチャコー
ルを加え、混合物をろ過し、生成物を追加的なシクロヘ
キサン（１００ｍｌ）でつき崩した。ろ過による回収、
空気乾燥及び真空乾燥により無色の結晶（６．９４ｇ，
５４％）が得られた。
【０１３９】エタノールからの第２の結晶化によって分
析試料が得られた。
【０１４０】Ｍ．Ｐ．：１６２−３℃． 元素分析：計算値［Ｃ（２６）Ｈ（２５）Ｎ（１）Ｏ
（１０）］Ｃ６１．０５，Ｈ４．９３，Ｎ２．７４．実
測値：Ｃ６０．７８，Ｈ５．０１，Ｎ２．６５． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０５６（ｔ，Ｊ＝
７．０ｈｚ，３Ｈ），２．４−２．１（ｍ，４Ｈ），
２．２９３（ｓ，６Ｈ），２．７５７（ｓ，４Ｈ），
２．９２２（ｑ，Ｊ＝７．０ｈｚ，２Ｈ），７．０６９
（ｍ，４Ｈ），７．６１７（ｐ ｄ，Ｊ＝９．１ｈｚ，
２Ｈ）． Ｄ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカ
ルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６−
ジアセトキシ−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ
２ＥｔＳＦ−５０５−Ｓａｒ−ＯＢｎ）の調整 塩化メチレン（５０ｍｌ）中のザルコシンベンジルエス
テル* （１．１３ｇ，６．１３ｍｍｏｌ）にＡｃ２Ｅｔ
ＳＦ−５０５−ＮＨＳ（２．５８ｇ，５．０５ｍｍｏ
ｌ）及び５％炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）を
加えた。この２相混合物を２０時間激しくかきまぜた。
層を分離し、有機層を３×１５ｍｌの水で洗い、硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、２５ｍｌに濃縮した。この溶液を
シクロヘキサンで１５０ｍｌに希釈し、チャコール処理
し、窒素気流下で７５ｍｌに濃縮すると生成物が沈澱し
た。上清をデカンテーションにより除き、残渣を塩化メ
チレンと共蒸発させると無色の泡（１．７０ｇ，５８
％）が得られた。
【０１４１】激しく真空乾燥すると分析試料が得られ
た。
【０１４２】元素分析：計算値［Ｃ（３２）Ｈ（３３）
Ｎ（１）Ｏ（９）］Ｃ６６．７７，Ｈ５．７８，Ｎ２．
４３．実測値：Ｃ６６．６６，Ｈ５．８９，Ｎ２．２５ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：（アミド結合回転異性体の
５：２混合物を示す）δ（主および副）１．０４０およ
び１．０１８（ｔ，Ｊ＝６．７ｈｚ，３Ｈ），１．７８
９および１．６７０（ｍ，２Ｈ），２．２１１（ｍ，２
Ｈ），２．２９０および２．２７６（ｓ，６Ｈ），２．
７１３および２．６９５（ｓ，３Ｈ），２．８９３
（ｑ，Ｊ＝６．７ｈｚ，２Ｈ），３．９６３（ｓ，２
Ｈ），５．０７５および５．０３９（ｓ，２Ｈ），７．
０４４（ｍ，４Ｈ），７．３２４（ｍ，５Ｈ），７．５
７３および７．５１６（ｐ ｄ，Ｊ＝９．２ｈｚ，２
Ｈ）． ＊ ザルコシンベンジルエステルｐ−トシレート塩（ア
ダムス・ケミカル・カンパニー）を塩化メチレンに取
り、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で繰り返し洗い、次
いで水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピ
ングした。 Ｅ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシン
イミジロキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エチ
ル）３，６−ジアセトキシ−９−エトキシ−９Ｈ−キサ
ンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５０５−Ｓａｒ−ＮＨＳ）の
製造 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５０５−Ｓａｒ−ＯＢｎ（１．５５
ｇ，２．６９ｍｍｏｌ）の絶対エタノール（６０ｍｌ）
溶液に１０％パラジウム付着カーボンを加えた。この混
合物を水素の風船圧力下で３０分間かきまぜた。触媒を
ろ過によって除き、エタノールをストリッピングすると
シロップ状の残渣が得られた。
【０１４３】この残渣を塩化メチレン（８５ｍｌ）に溶
解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４９５ｇ，
４．３０ｍｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−３−エチル−カルボジイミド・塩酸塩（１．１
２ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）を加えた（４×２５ｍｌ）。
この溶液を２５ｍｌに濃縮し、シクロヘキサンで１７５
ｍｌに希釈し、チャコール処理し、窒素気流下で７５ｍ
ｌに濃縮した。固体生成物をろ過によって集め、空気乾
燥し、真空乾燥すると無色の粉末（０．９７ｇ，６２
％）が得られた。
【０１４４】塩化メチレンと共蒸発し、４０℃で激しく
真空乾燥すると痕跡量のシクロヘキサンが除去され、非
晶質固体として分析試料が得られた。
【０１４５】元素分析：計算値［Ｃ（２９）Ｈ（３０）
Ｎ（２）Ｏ（１１）］Ｃ５９．７９，Ｈ５．１９，Ｎ
４．８１．実測値：Ｃ５９．３７，Ｈ４．６２，Ｎ４．
６２，０．９３％水（Ｋ−Ｆ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（アミド結合回転異性体の
４：１混合物を示す。）：δ（主および副）１．０３４
（ｔ，Ｊ＝６．９ｈｚ，３Ｈ），１．８２７および１．
９３５（ｍ，２Ｈ），２．２２３（ｍ，２Ｈ），２．２
８９（ｓ，６Ｈ），２．７５８（ｓ，４Ｈ），２．７７
９および２．８２４（ｓ，３Ｈ），２．８８８（ｑ，Ｊ
＝６．８ｈｚ，２Ｈ），４．３３３および４．４７３
（ｓ，２Ｈ），７．０４３（ｍ，４Ｈ），７．５８７
（ｐｅｒ ｄ，Ｊ＝９．１ｈｚ，２Ｈ）． 例 ２ ５１２ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の
調製 Ａ． ４−メチルレゾルシノールの調製 ２，４−ジヒドロキシベンジルアルデヒド（３３．９７
ｇ，０．２４６ｍｏｌ）（トルエンから再結晶した）
を、ガス入口と泡立て出口とが嵌合された丸底フラスコ
中で３Ｌの分光グレードの２−プロパノールに溶解し
た。１０％パラジウム付着カーボン（１．３５ｇ）を加
え、次いで３ｍｌのリン酸を加え、混合物を窒素でパー
ジした。窒素流を水素に代え、混合物を氷冷しながら激
しくかきまぜた。３時間後、水素の取り込みが完了し、
触媒をろ過によって除去した。ろ液をストリッピングし
て２００ｍｌにし、２００ｍｌの酢酸エチルを加えた。
溶液を４×２００ｍｌの水で洗い、１つにまとめた抽出
物を酢酸エチルで逆抽出した。これらの有機抽出物を水
で洗い、１つにした有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥
し、ストリッピングすると無色の結晶固体（２９．９５
ｇ，９８％）として生成物が得られた。
【０１４６】Ｍ．Ｐ．：１０６℃（Ｌｉｔ．１０６−１
０７℃［ジェイ・シー・ベル、ダブリュー・ブリッジ、
およびエー・ロバートソン、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
１５４２−４５（１９３７）］． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．９６１（ｓ，Ｍ
ｅ），６．０７６（ｄｄ，Ｈ−６，Ｊ［５，６］＝８ｈ
ｚ，Ｊ［２，６］＝２ｈｚ），６．２３１（ｄ，Ｈ−
２），６．７６０（ｄ，Ｈ−５），８．８６７（ｓ，Ｏ
Ｈ），９．００８（ｓ，ＯＨ）． Ｂ． ９−カルボキシエチリデン−３，６−ジヒドロキ
シ−２，７−ジメチル−９Ｈ−キサンテン（ＳＦ−５１
２）の調製 ４−メチルレゾルシノール（２５．８ｇ，０．２０８ｍ
ｏｌ）と無水コハク酸（２０．８ｇ，０．２０８ｍｏ
ｌ）を丸底フラスコに入れ、フラスコを窒素でバージし
た。１５０ｍｌのメタンスルホン酸を加え、溶液を窒素
下で６５℃まで２時間加熱した。溶液を１Ｌの、激しく
かきまぜられた氷冷下に一滴づつ加え、これと同時に５
０％の水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを２．５±
０．５に維持した。生成物を遠心によって集め、水で３
回、アセトンで２回洗った。固体を空気乾燥し、次に１
１０℃で真空乾燥すると、レンガ赤色の粉末が得られた
（２４．１ｇ，７４％）。
【０１４７】酢酸エチルをゆっくりと生成物のジメチル
スルフォキシド溶液中に拡散させることによって生成を
行なった。沈殿をろ過によって集め、空気乾燥し、真空
乾燥した。
【０１４８】ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（１モルの水及
びジメチルスルホキシドと共に純粋なデルタ型を示
す。）：δ２．１２４（ｓ，６Ｈ），３．４２１（ｄ，
Ｊ＝７．２ｈｚ，２Ｈ），５．７６９（ｔ，Ｊ＝７．２
ｈｚ，１Ｈ）：６．５１２（ｓ，１Ｈ），６．５７３
（ｓ，１Ｈ），７．２９５（ｓ，２Ｈ），９．６８１
（ｓ，１Ｈ），９．８２５（ｓ，１Ｈ），１２．３４６
（ｂｓ，１Ｈ）． 可視吸光．（ｐＨ ８．２ ａｑ Ｔｒｉｓ）：最大４
９３．５ｎｍ． Ｃ． ９−カルボキシエチル−３，６−ジアセトキシ−
２，７−ジメチル−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン
（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２）の調製 ＳＦ−５１２（２０．０ｇ，６４．０ｍｍｏｌ）の試料
を３５０ｍｌの無水酢酸に加え、次いで８０ｍｌのピリ
ジンを加えた。これを１時間かきまぜ、ろ過して痕跡量
の未反応染料を除去した。ろ液を３．５Ｌの激しくかき
まぜられている水に注いだ。固体の中間体をろ過によっ
て集め、２Ｌの冷水に再懸濁し、１５分間かきまぜ、次
いで再び集め、空気乾燥するとスピロラクトン中間体
（２０．８ｇ）が得られた。これを６００ｍｌの絶対エ
タノールに溶解し、４５分間還流した。溶液をチャコー
ル処理し、３００ｍｌに濃縮した。生成物をろ過によっ
て集め、冷たいエタノールですすぎ（２×５０ｍｌ）、
空気乾燥し、次いで真空乾燥すると無色の微結晶が得ら
れた（１４．９ｇ，５３％）。
【０１４９】Ｍ．Ｐ．：１４３℃． 元素分析：計算値［Ｃ（２４）Ｈ（２６）Ｏ（８）］Ｃ
６５．１５，Ｈ５．９２．実測値：Ｃ６５．３１，Ｈ
５．９７． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０２７（ｔ，Ｊ＝
６．９ｈｚ，３Ｈ），１．６２８（ｍ，２Ｈ），２．１
３６（ｓ，６Ｈ），２．２０７（ｍ，２Ｈ），２．３０
３（ｓ，６Ｈ），２．８８４（ｑ，Ｊ＝６．９ｈｚ，２
Ｈ），６．９３９（ｓ，２Ｈ），７．４１７（ｓ，２
Ｈ）． Ｄ． ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル）−３，６−ジアセトキシ−２，７−ジメ
チル−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳ
Ｆ−５１２−ＮＨＳ）の調製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−４１２（９．４２ｇ，２１．３ｍｍｏ
ｌ）の塩化メチレン（１７５ｍｌ）溶液にＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド（３．６２ｇ，３１．５ｍｍｏｌ）を
加え、直ちに１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド・塩酸塩（８．０５ｇ，４２．
０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間かきま
ぜた。この混合物を水で洗い（４×１００ｍｌ）、水性
洗液を塩化メチレンで逆抽出した（２×５０ｍｌ）。１
つにまとめた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、スト
リッピングして油状物質にした。絶対エタノールを加
え、ひっかくことによって結晶化を誘導した。生成物を
ろ過によって集め、空気乾燥し、次いで真空乾燥するこ
とにより、薄オレンジ色の微結晶（９．８０ｇ，８５
％）が得られた。
【０１５０】１ｇの生成物を１０ｍｌの塩化メチレン中
に溶解し、４０ｍｌのシクロヘキサンを加えることによ
って分析試料を調製した。チャコール処理し、冷却し、
ひっかいて結晶化を誘導すると、無色の結晶固体が得ら
れた。
【０１５１】Ｍ．Ｐ．：１５９℃． 元素分析：計算値［Ｃ（２８）Ｈ（２９）Ｎ（１）Ｏ
（１０）］Ｃ６２．３３，Ｈ５．４２，Ｎ２．６０．実
測値：Ｃ６２．０６，Ｈ５．７１，Ｎ２．３９．ＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０５３（ｔ，Ｊ＝６．９ｈ
ｚ，３Ｈ），２．１４９（ｓ，６Ｈ），２．３０４
（ｓ，６Ｈ），２．１−２．４（ｍ，４Ｈ），２．７４
７（ｓ，４Ｈ），２．９２０（ｑ，Ｊ＝６．９ｈｚ，２
Ｈ），６．９７５（ｓ，２Ｈ），７．４６４（ｓ，２
Ｈ）． Ｅ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカ
ルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６−
ジアセトキシ−２，７−ジメチル−９−エトキシ−９Ｈ
−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２−Ｓａｒ−ＯＢ
ｎ）の調製 ザルコシンベンジルエステル（０．７２ｇ，４．０２ｍ
ｍｏｌ）の塩化メチレン（２５ｍｌ）溶液にＡｃ２Ｅｔ
ＳＦ−５１２−ＮＨＳ（１．７３ｇ，３．２１ｍｍｏ
ｌ）Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２−ＮＨＳ（１．７３ｇ，
３．２１ｍｍｏｌ）及び５％炭酸水素ナトリウム溶液
（２０ｍｌ）を加えた。この２層混合物を２０時間激し
くかきまぜた。層を分離し、有機層を３×１５ｍｌの水
で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、１０ｍｌに濃縮し
た。溶液をシクロヘキサンで６０ｍｌに希釈し、チャコ
ール処理し、窒素気流下で２５ｍｌに濃縮すると、生成
物の沈殿が得られた。上清をデカンテーションし、無色
固体を真空乾燥した（１２．４４ｇ，７４％）。
【０１５２】塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶
し、チャコール処理して分析試料を得た。
【０１５３】Ｍ．Ｐ．：１５０−２℃． 元素分析：計算値［Ｃ（３４）Ｈ（３７）Ｎ（１）Ｏ
（９）］Ｃ６７．６５，Ｈ６．１８，Ｎ２．３２．実測
値：Ｃ６７．４２，Ｈ６．０８，Ｎ２．３３． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（アミド結合回転異性体の
５：２の結合を示す。）：δ（主および副）１．０４９
および１．００８（ｔ，Ｊ＝６．８ｈｚ，３Ｈ），１．
７４７および１．６６（ｍ，２Ｈ），２．１４４および
２．１１５（ｓ，６Ｈ），２．１８（ｍ，２Ｈ），２．
３１４および２．３０３（ｓ，６Ｈ），２．６９４
（ｓ，３Ｈ），２．９０７および２．８８４（ｑ，Ｊ＝
６．８ｈｚ，２Ｈ），３．９６１（ｓ，２Ｈ），５．０
７５および５．０１６（ｓ，２Ｈ），６．９６０および
６．９１７（ｓ，２Ｈ），７．４３０および７．３９６
（ｓ，２Ｈ），７．３０（ｍ，５Ｈ）． Ｆ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシン
イミジル−オキシカルボニルメチル）カルボキサミド）
エチル）−３，６−ジアセトキシ−９−エトキシ−２，
４，５，７−テトラメチル−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２
ＥｔＳＦ−５１２−Ｓａｒ−ＮＨＳ）の調製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１２−Ｓａｒ−ＯＢｎ（０．４５
ｇ，０．７４５ｍｏｌ）の絶対エタノール（２０ｍｌ）
溶液に１０％パラジウム付着カーボン０．０５ｇを加え
た。混合物を水素の風船圧力下で３０分間かきまぜた。
触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッピング
してシロップ状の残渣を得た。
【０１５４】この残渣を２５ｍｌの塩化メチレンに溶解
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１２９ｇ，
１．１２ｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチル−カルボジイミド・塩酸塩（０．２９
２ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０分間
かきまぜ、水で洗った（３×１５ｍｌ）。溶液を硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、１０ｍｌに濃縮し、シクロヘキサ
ンで４０ｍｌに希釈し、チャコール処理し、窒素気流下
で２０ｍｌに濃縮した。上清をデカンテーションによっ
て除き、残渣を塩化メチレンから再沈殿させて無色の粉
末を得た（０．２７ｇ，４９％）。
【０１５５】元素分析：計算値［Ｃ（３１）Ｈ（３４）
Ｎ（２）Ｏ（１１）］Ｃ６０．９８，Ｈ５．６１，Ｎ
４．５９．実測値：Ｃ６０．２８，Ｈ５．７１，Ｎ４．
４０，１．０８％ 水（Ｋ−Ｆ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（アミド結合の５：１混合物
を示す。）：δ（主および副）１．０４３（ｔ，Ｊ＝
７．０ｈｚ，３Ｈ），１．７９３および１．９３３
（ｍ，２Ｈ），２．１４５および２．１３３（ｓ，６
Ｈ），２．１９８（ｍ，２Ｈ），２．３１４（ｓ，６
Ｈ），２．７４０（ｓ，４Ｈ），２．７７８および２．
８２１（ｓ，３Ｈ），２．９００（ｑ，Ｊ＝７．０ｈ
ｚ，２Ｈ），４．３３４および４．４６９（ｓ，２
Ｈ），６．９６０および６．９２５（ｓ，２０Ｈ），
７．４４１（ｓ，２Ｈ）． 例 ３ ５１９ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の
調製 Ａ． ９−（２−カルボキシエチリデン）−３，６−ジ
ヒドロキシ−４，５−ジメチル−９Ｈ−キサンテン（Ｓ
Ｆ−５１９）の調製 ２−メチルレゾルシノール（３７．２ｇ，０．３００ｍ
ｏｌ）と無水コハク酸（３０．０ｇ，０．３００ｍｏ
ｌ）とを丸底フラスコに入れ、窒素でパージした。１５
０ｍｌのメタンスルホン酸を加え、溶液を窒素雰囲気下
で６５℃で４時間かきまぜた。反応混合物を、激しくか
きまぜられている氷冷水（１ｌ）に一滴づつ入れ、同時
に５０％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを６．０
±０．５に維持した。細かく分割された固体を遠心によ
って集め、水ですすぎ（４×２５０ｍｌ）、そのつど再
懸濁し、遠心し、上清を捨てた。粗生成物を１ｌの水に
懸濁し、十分な５０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて
ｐＨを１０．２に上げた。溶液をろ過し、ろ液のｐＨを
濃ＨＣｌで１．２にした。生成物を上述のように遠心に
よって集め、水ですすぎ（３×３５０ｍｌ）、アセトン
ですすいだ（３×２５０ｍｌ）。得られた固体をトルエ
ンと共に共沸し、ろ過によって集め、１１０℃で真空乾
燥してレンガ赤色の粉末を得た（２４．６ｇ，５３
％）。
【０１５６】元素分析：計算値［Ｃ（１８）Ｈ（１６）
Ｏ（５）］Ｃ６９．２２，Ｈ５．１６．実測値：Ｃ６
８．９５，Ｈ５．３０，０．８０％ 水（Ｋ−Ｆ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（殆どデルタ型）：δ２．１
６４（ｓ，３Ｈ），２．１７７（ｓ，３Ｈ），３．３７
６（ｄ，Ｊ＝７．１ｈｚ，２Ｈ），５．７４９（ｔ，Ｊ
＝７．２ｈｚ，１Ｈ），６．６４２（ｄ，Ｊ＝８．８ｈ
ｚ，１Ｈ），６．６７２（ｄ，Ｊ＝８．８ｈｚ，１
Ｈ），７．２１６（ｄ，Ｊ＝８．５ｈｚ，１Ｈ），７．
２２７（ｄ，Ｊ＝８．５ｈｚ，１Ｈ），９．６０２（ｂ
ｓ，１Ｈ），９．７５８（ｂｓ，１Ｈ）． 可視吸光（ｐＨ８．２；５０ｍＭ ａｑ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ）最大５００ｎｍ（８９，８００） Ｂ． ９−（２−カルボキシエチル）−３，６−ジアセ
トキシ−４，５−ジメチル−９−エトキシ−９Ｈ−キサ
ンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９）の調製 ＳＦ−５１９（１５．０ｇ，４８．０ｍｍｏｌ）を２５
０ｍｌの無水酢酸に加え、固体を粉砕した。（高度に不
溶性のＳＦ−５１９を分散させるのに超音波処理が有用
である。）懸濁液を氷冷し、５０ｍｌのピリジンを加
え、混合物を２０分間かきまぜた。溶液をろ過し、激し
くかきまぜられている４Ｌの氷冷水にゆっくりと、しか
しながらしっかりとした流れとして加えた。さらに２０
分間かきまぜた後、中間生成物をろ過し、３Ｌの水に再
懸濁し、さらに２５分間かきまぜた。固体をろ過によっ
て集め、空気乾燥した。乾燥した中間体を６００ｍｌの
絶対エタノールに溶解し、１時間還流した。溶液を回転
蒸発器上で２００ｍｌに濃縮すると結晶化した。生成物
をろ過によって集め、空気乾燥し、次いで真空乾燥する
と無色の微結晶が得られた（１２．１３ｇ，５７％）。
【０１５７】塩化メチレンからシクロヘキサンで沈殿化
することにより分析試料を調製した。
【０１５８】ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０３３
（ｔ，Ｊ＝６．９ｈｚ，３Ｈ），１．６７４（ｍ，２
Ｈ），２．１８９（ｓ，６Ｈ），２．１９（ｍ，２
Ｈ），２．３４８（ｓ，６Ｈ），２．８７８（ｑ，Ｊ＝
６．９ｈｚ，２Ｈ），７．００６（ｄ，Ｊ＝８．６ｈ
ｚ，２Ｈ），７．３９９（ｄ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２
Ｈ）． Ｃ． ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル−３，６−ジアセトキシ−４，５−ジメチ
ル−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ
−５１９−ＮＨＳ）の調製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９（７．８０ｇ，１７．６ｍｍｏ
ｌ）を１７５ｍｌの塩化メチレンと混合し、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（２．７５ｇ，２３．９ｍｍｏｌ）
と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカ
ルボジイミド・塩酸塩（７．００ｇ，３６．５ｍｍｏ
ｌ）を加えた。この混合物を９０分間かきまぜ、水で洗
った（５×１００ｍｌ）。１つにまとめた水性層を塩化
メチレンで逆抽出し（２×５０ｍｌ）、プールした有機
層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピングした。
１００ｍｌのエタノールでつき崩し、ろ過し、空気乾燥
して、淡黄色の固体を得た（７．４５ｇ，７８％）。
【０１５９】シクロヘキサン／塩化メチレンから２回再
結晶し、チャコール処理することによって分析試料を得
た。
【０１６０】Ｍ．Ｐ．：１６４−５℃． 元素分析：計算値［Ｃ（２８）Ｈ（２９）Ｎ（１）Ｏ
（１０）］Ｃ６２．３３，Ｈ５．４２，Ｎ２．６０．実
測値：Ｃ６２．１７，Ｈ５．４７，Ｎ２．４８．ＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０５１（ｔ，Ｊ＝７．０ｈ
ｚ，３Ｈ），２．４−２．１（ｍ，４Ｈ），２．１９１
（ｓ，６Ｈ），２．３３７（ｓ，６Ｈ），２．７１５
（ｓ，４Ｈ），２．９１２（ｑ，Ｊ＝７．０ｈｚ，２
Ｈ），７．０１５（ｄ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２Ｈ），７．
４２９（ｄ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２Ｈ）． Ｄ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカ
ルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６−
ジアセトキシ−４，５−ジメチル−９−アセトキシ−９
Ｈ−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９−Ｓａｒ−Ｏ
Ｂｎ）の調製 １９ｍｌの塩化メチレン中のザルコシルベンジルエステ
ル（０．５５７ｇ，３．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ａｃ
２ＥｔＳＦ−５１９−ＮＨＳ（１．３０ｇ，２．４１ｍ
ｍｏｌ）及び１５ｍｌの５％炭酸水素ナトリウム水溶液
を加えた。この２層混合物を１８時間激しくかきまぜ
た。層を分離し、有機層を３×１０ｍｌの水で洗い、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、１０ｍｌに濃縮した。溶液を
シクロヘキサンで４０ｍｌに希釈し、チャコール処理
し、窒素気流下で２０ｍｌに濃縮してねばついた固体と
して生成物の沈殿を得た。上清をデカンテーションで除
き、残渣を塩化メチレンと共に共蒸発させて無色の泡
（０．９７ｇ，６７％）を得た。激しく真空乾燥するこ
とによって分析試料を得た。
【０１６１】元素分析：計算値［Ｃ（３４）Ｈ（３７）
Ｎ（１）Ｏ（９）］Ｃ６７．６５，Ｈ６．１８，Ｎ２．
３２．実測値：Ｃ６７．４３，Ｈ６．３７，Ｎ２．３
２． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（アミド結合回転異性体の
５：２の混合物を示す。）：δ（主および副）１．０４
４および１．０２０（ｔ，Ｊ＝７．０ｈｚ，３Ｈ０，
１．８２４および１．７１４（ｍ，２Ｈ），２．１７
（ｍ，２Ｈ），２．１９５および２．１６９（ｓ，６
Ｈ），２．３４６および２．３３７（ｓ，６Ｈ），２．
７２０および２．６９１（ｓ，３Ｈ），２．８８９
（ｑ，Ｊ＝７．０ｈｚ，２Ｈ），３．９５９および３．
９８８（ｓ，２Ｈ），５．０７３および５．０４８
（ｓ，２Ｈ），７．０００および６．９４５（ｄ，Ｊ＝
８．６ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．２５（ｍ，７
Ｈ）． Ｅ． ９−（２−（２−Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スク
シンイミジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミ
ド）エチル）−３，６−ジアセト−オキシ−４，５−ジ
メチル−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２Ｅｔ
ＳＦ−５１９−Ｓａｒ−ＮＨＳ）の製造 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５１９−Ｓａｒ−ＯＢｎ（１．３５
ｇ，２．２４ｍｍｏｌ）の絶対エタノール（５０ｍｌ）
溶液に１０％パラジウム付着カーボンを加えた。この溶
液を水素の風船圧力下で２０分間かきまぜた。触媒をろ
過によって除き、エタノールをストリッピングしてシロ
ップ状の残渣を得た。
【０１６２】この残渣を５０ｍｌの塩化メチレンに溶解
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３９ｇ，３．
３９ｍｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチル−カルボジイミド・塩酸塩（１．５７
ｇ，８．１９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を７５分
間かきまぜ、水で洗った（４×１５ｍｌ）。この溶液を
硫酸ナトリウム上で乾燥し、２５ｍｌに濃縮し、シクロ
ヘキサンで１２５ｍｌに希釈し、チャコール処理し、窒
素気流下で５０ｍｌに濃縮した。上清をデカンテーショ
ンし、残留した油状物質を５ｍｌの塩化メチレンに取
り、激しくかきまぜられた７５ｍｌのシクロヘキサンに
一滴づつ加えて無色の粉末を得た（０．５８７ｇ，４３
％）。
【０１６３】分析試料を得るために、生成物の一部を塩
化メチレンに取り、モレキュラーシーブ上で乾燥し、窒
素気流下で蒸発させ、最後に五酸化リン上で４８℃で乾
燥乳鉢中で乾燥した。
【０１６４】元素分析：計算値［Ｃ（３１）Ｈ（３４）
Ｎ（２）Ｏ（１１）］Ｃ６０．９８，Ｈ５．６１，Ｎ
４．５９．実測値：Ｃ６０．１５，Ｈ５．７１，Ｎ４．
５１，水（Ｋ−Ｆ）１．５１％． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（アミド結合回転異性体の
４：１の混合物を示す。）：δ（主および副）１．０３
９（ｔ，Ｊ＝６．９ｈｚ，３Ｈ），１．８４１および
１．９４５（ｍ，２Ｈ），２．１９（ｍ，２Ｈ），２．
１９４（ｓ，６Ｈ），２．３４５（ｓ，６Ｈ），２．７
６７および２．７４４（ｓ，４Ｈ），２．７７８および
２．８２５（ｓ，３Ｈ），２．８８８（ｑ，Ｊ＝６．９
ｈｚ，２Ｈ），４．３２８および４．４６１（ｓ，２
Ｈ），７．０００（ｄ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２Ｈ），７．
４１０（ｄ，Ｊ＝８．６ｈｚ，２Ｈ）． 例 ４ ５２６ｎｍ蛍光標識スペーサー活性化エステル中間体の
調製 Ａ． ２，４−ジヒドロキシ−３−メチルベンズアルデ
ヒドの調製 リンオキシクロリド（８０ｍｌ，０．８６ｍｏｌ）をか
きまぜられているＮ−メチルホルムアミド（１０２ｍ
ｌ，０．８２ｍｏｌ）のエーテル（２５０ｍｌ）溶液に
加えた。混合物を室温で１時間かきまぜ、次いで氷中で
冷却した。２−メチルレゾルシノール（アルドリッチ、
１００ｇ，０．８１ｍｏｌ）を加え、この混合物を一夜
撹拌しながら室温まで昇温させた。沈殿した中間生成物
をろ過によって集め、エーテルで３回すすいだ、この中
間体を２５０ｍｌのアセトンと２５０ｍｌの水の混合物
中で溶解することによって加水分解し、３０分間かきま
ぜた。２Ｌの水を加え、混合物を沸騰させ、放冷して結
晶性生成物を被着させた。これを４Ｌの水から再結晶さ
せて純粋な生成物を得た（７０ｇ，５７％）。
【０１６５】Ｍ．Ｐ．１５０℃（Ｌｉｔ．１５２−３℃
［ダブリュ．ベーカーら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２
８３４−５（１９４９）］）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．９７３（ｓ，３
Ｈ），６．５５１（ｄ，Ｊ＝８．５ｈｚ，１Ｈ），７．
４２８（ｄ，Ｊ＝８．５ｈｚ，１Ｈ），９．７０３
（ｓ，１Ｈ），１０．７４５（ｓ，１Ｈ），１１．５９
２（ｓ，１Ｈ）． Ｂ． ２，４−ジメチルレゾルシノールの調製 ２，４−ジヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒド
（３０．０ｇ，１９７ｍｍｏｌ）のイソプロパノール
（３Ｌ）溶液をマグネティックスターラーを含む５Ｌの
３首フラスコ中で氷冷した。４ｍｌのリン酸と１０％パ
ラジウム付着カーボンとを加え、溶液を先ず窒素で、次
いで水素でパージした。取り込みが完了したと判定され
た時点（約１．５時間）で溶液を再び窒素でパージし、
次いでセライト（登録商標）でろ過した。溶液をストリ
ッピングで除き、残渣を酢酸エチルに取り、得られた溶
液を水で洗った（４×１００ｍｌ）。水溶液を酢酸エチ
ルで逆抽出し、１つにまとめた有機層を硫酸ナトリウム
上で乾燥し、ストリッピングした。昇華（９５℃、０．
０５トール）すると無色固体が得られた（１９．６ｇ，
７２％）。
【０１６６】Ｍ．Ｐ．１０７−８℃（Ｌｉｔ．１０８−
１０９℃［ダブリュ．ベーカーら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，２８３４−５（１９４９）］）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．９６９（ｓ，３
Ｈ），２．０３７（ｓ，３Ｈ），６．２２０（ｄ，Ｊ＝
８．１ｈｚ，１Ｈ），６．６３７（ｄ，Ｊ＝８．１ｈ
ｚ，１Ｈ），７．９２９（ｓ，１Ｈ），８．７８５
（ｓ，１Ｈ）． Ｃ． ９−（２−カルボキシエチリデン）−３，６−ジ
ヒドロキシ−２，４，５，７−テトラメチル−９Ｈ−キ
サンテン（ＳＦ−５２６）の調製 ２，４−ジメチルレゾルシノール（２８．４ｇ，０．２
０５ｍｏｌ）と無水コハク酸（２０．０ｇ，０．２００
ｍｏｌ）を丸底フラスコに入れ、窒素でパージした。２
３１ｍｌのメタンスルホン酸を加え、溶液を窒素雰囲気
下で７０℃で２０時間かきまぜた。反応混合物を激しく
かきまぜられている水酸化ナトリウム水溶液（１５０ｍ
ｌの水中に９５ｇ）と氷（３Ｌ）との混合物に一滴づつ
加えた。十分なメタンスルホン酸を加えて最終的なｐＨ
を４．７から１．５にした。得られた固体を遠心によっ
て集め、遠心し、水からデカントした（５×１．２
Ｌ）。最終的な懸濁液をろ過によって集め、空気乾燥
し、１１０℃で６時間炉中で乾燥してレンガ赤色の固体
（３０．６ｇ，４４％）を得た。
【０１６７】アルカリ性溶液から再結晶させ、遠心し、
水洗して分析試料を得た。
【０１６８】元素分析：計算値［Ｃ（１６）Ｈ（１２）
Ｏ（５）］Ｃ７０．５７，Ｈ５．９２．実測値：Ｃ７
０．３９，Ｈ６．００，０．２１％ 水（Ｋ−Ｆ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（ほぼスピロラクトン型）：
δ２．１７２（ｓ，１２Ｈ），２．５０８（ｍ，２
Ｈ），３．３４２（ｍ，２Ｈ），７．６０４（ｓ，２
Ｈ）． 可視吸光（ｐＨ８．２：５０ｍＭ ａｑ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ）：５０９ｎｍ（７１，３００）． Ｄ． ９−（２−カルボキシエチル）−３，６−ジアセ
トキシ−９−エトキシ−２，４，５，７−テトラメチル
−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６）の調製 ＳＦ−５２６（２５．２ｇ，７４ｍｍｏｌ）を４５０ｍ
ｌの氷冷無水酢酸に加え、次いで１００ｍｌのピリジン
を加え、混合物を氷冷しながら１５０分間かきまぜた。
反応混合物をろ過し、次いでゆっくり、かつしっかりし
た流れとして、７Ｌの激しくかきまぜられている氷冷水
に加えた。さらに３０分間かきまぜた後、中間生成物を
ろ過し、水で洗い、４Ｌの水中に再懸濁し、さらに３０
分間かきまぜた。固体をろ過によって集め、空気乾燥し
て２８．９ｇのスピロラクトン中間体を得た。この中間
体（１８．６ｇ）の一部を１Ｌの絶対エタノールに溶解
し、９０分間還流した。この溶液を回転蒸発器上で３０
０ｍｌに濃縮すると結晶した。生成物をろ過によって集
め、エタノールですすぎ、空気乾燥し、次いで真空乾燥
すると無色の微結晶が得られた（１１．６ｇ，用いた中
間体の量を基準として５２％）。
【０１６９】塩化メチレン／シクロヘキサンから再結晶
させ、チャコール処理を行なうことによって無色の微結
晶が得られた。Ｍ．Ｐ．：１５４−１５５℃。分析のた
め、塩化メエチレンから２回蒸発させて痕跡量のシクロ
ヘキサンを除去した。
【０１７０】元素分析：実測値［Ｃ（２０）Ｈ（２０）
Ｏ（５）］Ｃ７０．５７，Ｈ５．９２．実測値：Ｃ７
０．３９，Ｈ６．００，０．２１％ 水（Ｋ−Ｆ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（ほとんどスピロラクトン
型）：δ２．１７２（ｓ，１２Ｈ），２．５０８（ｍ，
２Ｈ），３．３４２（ｍ，２Ｈ），７．６０４（ｓ，２
Ｈ）． 可視吸光（ｐＨ８．２：５０ｍＭ ａｑ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ）：５０９ｎｍ（７１，３００）． Ｅ． ９−（２−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニ
ル）−エチル）−３，６−ジアセトキシ−９−エトキシ
−２，４，５，７−トリメチル−９Ｈ−キサンテン（Ａ
ｃ２ＥｔＳＦ−５２６−ＮＨＳ）の調製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６（４．７０ｇ，９．９９ｍｍｏ
ｌ）を７５ｍｌの塩化メチレン及び１−（３−ジメチル
−アミノプロピリル）−３−エチルカルボジイミド・塩
酸塩（３．１０ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）と混合し、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（１．５０ｇ，１３．０ｍｍ
ｏｌ）を加えた。この混合物を９０分間かきまぜ、水で
洗った（４×５０ｍｌ）。１つにまとめた水性層を５０
ｍｌの塩化メチレンで逆抽出し、プールした有機層を硫
酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピングした。７５ｍ
ｌのエタノールと共につき崩し、ろ過し、空気乾燥する
と淡黄色の固体として粗生成物が得られた（約４．７
ｇ）。この物質を５０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、５
０ｍｌのシクロヘキサンを加えた。茶さじ１杯のチャコ
ールを加え、この混合物をろ過し、生成物をさらなる２
５ｍｌのシクロヘキサンに取った。ろ過によって回収
し、空気乾燥し、真空乾燥すると無色の結晶が得られた
（３．１４ｇ，５５％）。
【０１７１】シクロヘキサンを含む塩化メチレンから再
沈殿することによって分析試料を得た。
【０１７２】元素分析：計算値［Ｃ（３０）Ｈ（３３）
Ｎ（１）Ｏ（１０）］Ｃ６３．４８，Ｈ５．８６，Ｎ
２．４７．実測値：Ｃ６３．０８，Ｈ６．００，Ｎ２．
３７． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０５８（ｔ，Ｊ＝
６．９ｈｚ，３Ｈ），２．１３６（ｓ，６Ｈ），２．１
５５（ｓ，６Ｈ），２．２２８（ｍ，４Ｈ），２．３７
１（ｓ，６Ｈ），２．７４８（ｓ，４Ｈ），２．９１８
（ｑ，Ｊ＝６．９ｈｚ，２Ｈ），７．３００（ｓ，２
Ｈ）． Ｆ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジロキシカ
ルボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−３，６−
ジアセトキシ−９−エトキシ−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ
２ＥｔＳＦ−５０５−Ｓａｒ−ＯＢｎ）の調製 ザルコシンベンジルエステル（０．７２ｇ，４．０２ｍ
ｍｏｌ）の塩化メチレン（４０ｍｌ）溶液に、Ａｃ２Ｅ
ｔＳＦ−５２６−ＮＨＳ（１．８２ｇ，３．２１ｍｍｏ
ｌ）と３０ｍｌの５％炭酸水素ナトリウムを加えた。こ
の２相混合物を２０時間激しくかきまぜた。層を分離
し、有機層を４×１５ｍｌの水で洗い、硫酸ナトリウム
上で乾燥し、１５ｍｌに濃縮した。この溶液を１００ｍ
ｌのシクロヘキサンで希釈し、チャコール処理し、窒素
気流下で５０ｍｌに濃縮すると生成物の沈殿が得られ
た。ろ過し、空気乾燥すると無色の固体が得られた
（０．９６ｇ，４７％）。
【０１７３】塩化メチレンと共に共蒸発し、次いで激し
く真空乾燥することによって分析試料を得た。
【０１７４】元素分析：計算値［Ｃ（３６）Ｈ（４１）
Ｎ（１）Ｏ（９）］Ｃ６８．４５，Ｈ６．５４，Ｎ２．
２２．実測値：Ｃ６８．２９，Ｈ６．７０，Ｎ２．０
７． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（アミド結合回転異性体の
５：２混合物を示す）：δ（主および副）１．０４９お
よび１．０２７（ｔ，Ｊ＝６．８ｈｚ，３Ｈ），１．７
８３および１．７００（ｍ，２Ｈ），２．１２９および
２．０９９（ｓ，６Ｈ），２．１５９および２．１２９
（ｓ，６Ｈ），２．１４（ｍ，２Ｈ），２．３７９およ
び２．３７１（ｓ，６Ｈ），２．６９９および２．６９
０（ｓ，３Ｈ），２．８７３（ｑ，Ｊ＝６．８ｈｚ，２
Ｈ），３．９５８および３．９７６（ｓ，２Ｈ），５．
０７５および５．０１９（ｓ，２Ｈ），７．２６６およ
び７．２３３（ｓ，２Ｈ），７．２５−７．４０（ｍ，
５Ｈ）． Ｇ． ９−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシン
イミジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エ
チル）−３，６−ジアセトキシ−９−エトキシ−２，
４，５，７−テトラメチル−９Ｈ−キサンテン（Ａｃ２
ＥｔＳＦ−５２６−Ｓａｒ−ＮＨＳ）の調製 Ａｃ２ＥｔＳＦ−５２６−Ｓａｒ−ＯＢｎ（０．９６
ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）の絶対エタノール（４０ｍｌ）
溶液に０．１０ｇの１０％パラジウム付着カーボンを加
えた。この混合物を水素の風船圧力下で３０分間かきま
ぜた。触媒をろ過によって除き、エタノールをストリッ
ピングして除くとシロップ状の残渣が得られた。
【０１７５】この残渣を４０ｍｌの塩化メチレンに溶解
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２６ｇ，２．
２６ｍｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチル−カルボジイミド・塩酸塩（０．５９
ｇ，３．０８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を３０分
間かきまぜ、水で洗った（４×１５ｍｌ）。溶液を硫酸
ナトリウム上で乾燥し、１５ｍｌに濃縮し、シクロヘキ
サンで１００ｍｌに希釈しチャコール処理し、窒素気流
下で５０ｍｌに濃縮した。生成物をろ過によって集め、
空気乾燥し、真空乾燥すると無色の微結晶が得られた
（０．５７３ｇ，５９％）。
【０１７６】塩化メチレンと共に共蒸発し、４０℃で十
分に真空乾燥すると痕跡量のシクロヘキサンが除かれ、
非晶質の固体として分析試料が得られた。
【０１７７】ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．０４３
（ｔ，Ｊ＝６．７ｈｚ，３Ｈ），１．８２（ｍ，２
Ｈ），２．１３０（ｓ，６Ｈ），２．１５７（ｓ，６
Ｈ），２．１５（ｍ，２Ｈ），２．３７８（ｓ，６
Ｈ），２．７４８（ｓ，４Ｈ），２．７７８（ｓ，３
Ｈ），２．８９１（ｑ，Ｊ＝６．７ｈｚ，２Ｈ），４．
３２７（ｓ，２Ｈ），７．２７５（ｓ，２Ｈ）． 例 ５ ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジ
デオキシシチジン５′−三リン酸（５−ＡＰ３−ｄｄＣ
ＴＰ）の調製 Ａ． Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセトアミド（１
８）の調製 プロパルギルアミン（２４．７９ｇ，０．４５０モル、
アルドリッチ、９９％）をトリフルオロ酢酸メチル（６
９．１９ｇ，０．５４０モル、１．２ｅｑ，アルドリッ
チ）に１時間にわたって０℃で一滴づつ加えた。０℃で
さらに１時間かきまぜた後、１５ｃｍのビグレアークス
カラムを介して蒸留すると、無色の液体として６２．１
２ｇのトリフルオロアセトアミド１８が得られた。この
物質はＮＭＲ及びＧＣにおいて均質であり、プロパルギ
ルアミンを無水トリフルオロ酢酸でアシル化することに
よって調製された分光光学的に同一の物質と互換的に用
いた。
【０１７８】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：６．８５
（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨＴＦＡ），４．１７（ｄｄ，Ｊ＝
５．６および２．５，２Ｈ，ＣＨ2 ），２．３５（ｔ，
Ｊ＝２．５，１Ｈ，ＣＨ）． ＩＲ（ｎｅａｔ：ｃｍ-1）：３３００（Ｎ−Ｈ），３０
９５および２９３５（Ｃ−Ｈ），２１３０（アセチレ
ン），１７２０（Ｃ＝Ｏ），１５５０（Ｎ−Ｈ），１４
３０，１３６５，１１６０，１０４０，９９８，９１
８，８５７，８２９，７７２および７２５． Ｂ． ５−ヨード−２′，３′−ジデオキシシチジン
（１９）の調製 ２′，３′−ジデオキシシチジン（２．１１ｇ，１０ｍ
ｍｏｌ，レイロー）及び酢酸第二水銀（３．３５ｇ，１
０．５ｍｍｏｌ，フィッシャー）の５０ｍｌメタノール
溶液を１９時間還流した。得られた白色の懸濁液を５０
ｍｌのメタノール及び１００ｍｌのジクロロメタンで希
釈した。ヨウ素（３．０５ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加え、
懸濁液を２５℃でかきまぜた。４時間後、遊離塩基形態
にあるＡＧ３ Ｘ４Ａ樹脂（２０ｍｌ，３８ｍｅｑ．バ
イオラド）を加え、硫化水素を１５分間バブルした。水
銀（II）の完全な沈殿をＴＬＣによって確認した。反応
物をフィルターエイドを介してろ過し、このフィルター
エイドを１：１メタノール−ジクロロメタンで洗った。
ろ液１０ｇをシリカゲル上で蒸発させ、これを１５０ｇ
のシリカゲルカラムの頂部においた。５％，１０％及び
２０％メタノールジクロロメタン溶液で溶離すると、無
色の結晶固体として２．７９ｇ（８３％）のヨウ素化物
１９が得られた。沸騰水から２回再結晶し、５０℃で真
空乾燥すると、大きな分析的に純粋なプリズム（ｍｐ：
ｄ１７８℃）が得られた。
【０１７９】（ｍｐ：ｄ１７８°）．1 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：８．５０（ｓ，１
Ｈ，Ｈ６），７．７３（ｂｓ，１Ｈ，−ＮＨ2 ａ），
６．５３（ｂｓ，１Ｈ，−ＮＨ2 ｂ），５．８６（ｄ
ｄ，Ｊ＝６．５および２．１，１Ｈ，Ｈ１′），５．１
９（ｔ，１Ｈ，５′ＯＨ），４．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），３．７５（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．１，５．２およ
び２．９，１Ｈ，Ｈ５′ａ），３．５３（ｄｔ，Ｊ＝１
２．１および３．８，１Ｈ，Ｈ５′ｂ），２．３−１．
７（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′）． Ｃ9 Ｈ12Ｎ3 Ｏ3 Ｉの計算値：Ｃ３２．０７％，Ｈ３．
５９％，Ｎ１２．４６％．実測値：Ｃ３２．０５％，Ｈ
３．８０％，Ｎ１２．４６％． Ｃ． ５−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロ
ピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジン（２０）の
調製：アミノアルキレンのヨウ素化ヌクレオシドへの結
合の一般的手法 ５０ｍｌの３首フラスコにヨウ素化シチジン１９（７７
０ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）及びヨウ化第一銅（７６．
２ｍｇ，０．４００ｍｍｏｌ，０．２０ｅｑ．；アルド
リッチ、ゴールドラベル）を入れた。フラスコをアルゴ
ンでフラッシュした後、乾燥ジメチルホルムアミド（１
０ｍｌ、アルドリッチ）を加えると、懸濁されたヨウ化
第一銅を含むヨウ素化シチジンの０．２Ｍ溶液が得られ
た。Ｎ−プロパルギル−トリフルオロアセトアミド
（０．７０ｍｌ，６．００ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）及び
トリエチルアミン（０．５６ｍｌ，４．００ｍｍｏｌ，
２．０ｅｑ、モレキュラーシーブ上に貯蔵）を注射器を
介して加えた。テトラキス（トリフェニルホスフィン）
パラジウム（Ｏ）（２３１ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ，
０．１０ｅｑ）を乾燥箱中のガラスビン中で計量し、反
応混合物に加えた。ヨウ化第一銅を溶解すると、黄色の
溶液が得られ、これは数時間かけて徐々に暗色になっ
た。ＴＬＣにより、出発物質が完全に消費されたことが
確認されるまで反応を進行させた。４時間後、反応物を
２０ｍｌの１：１メタノール−ジクロロメタンで希釈
し、強塩基性アニオン交換樹脂（バイオラド、ＡＧ１Ｘ
８，２．０ｇ，約６ｅｑ．）の炭酸水素型を加えた。約
１５分間かきまぜると、ガスの発生が止まった。３０分
後、反応混合物をろ過し、樹脂を１：１ジクロロメタン
−メタノールで洗った。１つにしたろ液を回転蒸発器で
急速で濃縮した。（ジメチルホルムアミドを除去するの
に、４５℃、２トールで約１０分間かかった。）残渣を
直ちに１５０ｇのシリカゲル上で、１０％，１５％及び
２０％メタノールジクロロメタン溶液を用いたクロマト
グラフィーにより精製した。適当な画分から溶媒を除去
すると、６５１ｍｇ（９０％）のアルキルアミン２０が
薄黄色結晶性泡として得られ、これはＴＬＣ及びＮＭＲ
において均質であった。同様な調製工程からの生成物
は、元素分析によりヘミハイドレートであることが確認
された。
【０１８０】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：９．９
６（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨＴＦＡ），８．３２（ｓ，１Ｈ，
Ｈ６），７．７６（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ2 ａ），６．７８
（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ2 ｂ），５．８８（ｄｄ，Ｊ＝６．
５および２．５，１Ｈ，Ｈ１′），５．１３（ｔ，Ｊ＝
５．１，１Ｈ，５′ＯＨ），４．２８（ｄ，Ｊ＝５．
０，２Ｈ，−ＣＨ2 −），４．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），３．７３（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．０およ
び３．１，１Ｈ，Ｈ５′ａ），３．５３（ｄｔ，Ｊ＝１
２．１および４．０，１Ｈ，Ｈ５′ｂ），２．３−１．
７（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′）．19 Ｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：−７４．０（ｓ）． ＵＶ（ＭｅＯＨ）：最大 ２３８．５（１７，１００）
および２９５．５（９，３００）． Ｃ14Ｈ15Ｎ4 Ｏ4 Ｆ3 ・1/2 Ｈ2 Ｏの計算値：Ｃ４５．
５３，Ｈ４．３７，Ｎ１５．１７．実測値：Ｃ４５．５
６，Ｈ４．５２，Ｎ１５．２６． Ｄ． トリス（トリス−Ｎ−ブチルアンモニウム）ピロ
リン酸の調製 ピロリン酸四ナトリウム・１０水塩（４．４６ｇ，１０
ｍｍｏｌ）を最小量の水（約５０ｍｌ）に溶解し、水に
注がれたＡＧ５０Ｗ Ｘ８樹脂（１００−２００メッシ
ュ、４×１０ｃｍベッド）カラムを通した。カラムを水
で溶離し、溶離された液をそのｐＨが中性に近づくまで
氷冷フラスコ中に回収した。トリ−ｎ−ブチルアミン
（アルドリッチゴールドラベル、７．１ｍｌ，３０ｍｍ
ｏｌ）を溶離された液に加え、全てのアミンが溶解され
るまで２相を激しく撹拌した。得られた溶液を凍結乾燥
した。残渣を無水ピリジンで２回共蒸発し、無水ジメチ
ルホルムアミドで１回共蒸発した。残渣を１０ｍｌの無
水ジメチルホルムアミドに溶解し、得られた１．０Ｍ溶
液を、使用時まで（１カ月）アルゴン下で０℃で貯蔵し
た。 Ｅ． ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，
３′−ジデオキシシチジン５′−三リン酸（５−ＡＰ３
−ｄｄＣＴＰ）の調製：保護されたアルキルアミノヌク
レオシドをその対応する５′−三リン酸に転化し、トリ
フルオロアセチル保護基を除去するための一般的手法 アルキルアミノヌクレオシド２０（３６１ｍｇ，１．０
０ｍｍｏｌ）をリン酸トリメチル（２．０ｍｌ，アルド
リッチゴールドラベル）にアルゴン下でかきまぜなが
ら、炉で乾燥したフラスコ内で溶解した。この溶液を−
１０℃に冷却し、リンオキシクロリド（０．０９３ｍ
ｌ，１．００ｍｍｏｌ、アルドリッチゴールドラベル）
を注射器によって加えた。反応混合物を−１０℃で３０
分間かきまぜた後、第２のリンオキシクロリド（０．０
９３ｍｌ，１．００ｍｍｏｌ）を加え、溶液をかきまぜ
ながら２５℃までゆっくりと昇温させた。反応混合物の
一部を１Ｎ水酸化物水溶液で冷却し、ＨＰＬＣで分析し
た。対応するヌクレオチド一リン酸への転化が最大であ
る時に（この場合、第２のリンオキシクロリドの添加か
ら１００分後）、反応混合物を予め−１０℃に冷却した
トリス（トリス−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸
溶液（上述の１．０Ｍ無水ジメチルホルムアミド溶液
６．０ｍｌ）に一滴づつ加えた。溶液をアルゴン下でか
きまぜながらゆっくりと２５℃まで昇温させた。１００
分後、反応溶液を予め０℃に冷却したトリメチルアミン
（１．４ｍｌ）の水（２０ｍｌ）溶液にゆっくりと加え
た。溶液を氷冷しながら１５分間かきまぜ、約２℃で一
夜放置した。
【０１８１】２５℃、０．５トールでの真空蒸発によっ
て揮発物を除去した。残渣を再び７５ｍｌの水に溶解
し、１）ｐＨ７．６，１．０Ｍ ＴＥＡＢ水溶液（３０
０ｍｌ）、２）１．０Ｍ炭酸水素カリウム水溶液（３０
０ｍｌ）、及び３）ｐＨ７．６，０．１Ｍ ＴＥＡＢ水
溶液（３００ｍｌ）で予め平衡化されたＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−２５−１２０カラム（２．６×６５ｃｍ
ベッド）にかけた。カラムをｐＨ７．６のＴＥＡＢ水溶
液の０．１Ｍ（１Ｌ）から１．０Ｍ（１Ｌ）の直線勾配
で溶離した。１２分毎に画分を回収しながら、カラムを
１００ｍｌ／ｈで操作した。溶離は２７０ｎｍ（４０Ａ
ＵＦＳ）の吸光度によって監視した。所望の物質は、勾
配の終末付近に、良く分離された主なバンドとして溶離
された。生成物含有画分をプールし、濃縮し（３０℃未
満において）、絶対エタノールと共に２回共蒸発した。
残渣を２０．４ｍｌの水に取り、凍結乾燥した。
【０１８２】この中間生成物を１２．５ｍｌの水に取
り、１２．５ｍｌの濃水酸化アンモニウムを加えた。
３．５時間かきまぜた後、溶液をアスピレーターで吸引
しながら２時間かきまぜて過剰のアンモニアガスを除去
し、次いで凍結乾燥した。残渣をｐＨ７．６の０．１Ｍ
ＴＥＡＢ水溶液１０ｍｌに溶解し、上述のように予め
平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５−１２０
（１．６×５５ｃｍベッド）に取った。カラムをＴＥＡ
Ｂの０．１Ｍ（２８０ｍｌ）から１．０Ｍ（２８０ｍ
ｌ）の直線勾配で、６ｍｌづつ画分を回収しながら溶離
した。生成物は単一の主たるピークとして溶離した。純
粋生成物を含むと見積られる画分（＃３９−４５）をプ
ールし、濃縮し（３０℃未満）、絶対エタノール（Ｚ
ｘ）と共に共蒸発し、９．８ｍｌの水に取った。この溶
液をＵＶ吸収及びＨＰＬＣで分析し、凍結乾燥した。
【０１８３】生成物の希溶液は、ｐＨ８．２の５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ緩衝液中で、２４０ｎｍ及び２９３．５ｎｍ
に吸収極大を示した。生成物の吸光係数が出発物質のそ
れ（９３００）と同一であると仮定すると、２９３．５
ｎｍでの吸光度を基準とする５−ＡＰ３−ｄｄＣＴＰの
収量は０．３２ｍｍｏｌ（３２％）であった。最終生成
物のＨＰＬＣ（ゾーバックス ＳＡＸ，０．２Ｍ ｐＨ
６．５ リン酸カリウム水溶液、２７０ｎｍでのモニタ
リング）において、本質的に単一のピーク（＞９９％）
が認められた。
【０１８４】1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：８．５７（ｓ，
１Ｈ，Ｈ６），６．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．４および１．
６，１Ｈ，Ｈ１′），４．４２（ｍ，２Ｈ，Ｈ４′およ
びＨ５′ａ），４．１８（ｄｄｄ，Ｊ＝１２，５．５お
よび３，１Ｈ，Ｈ５′ｂ），４．０３６（ｓ，２Ｈ，−
ＣＨ2 −），２．５−１．９（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′および
Ｈ３′），及び対イオン（トリエチルアンモニウム）ピ
ーク．31 Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：−９．０２（ｄ，Ｊ＝２０，
ＩＰ），−９．７４（ｄ，Ｊ＝２０，ＩＰ），−２１．
３７（ｔ，Ｊ＝２０，ＩＰ）． ＵＶ（ｐＨ８．２ ａｑ Ｔｒｉｓ）：最大 ２４０お
よび２９３．５ｎｍ． 例 ６ ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジ
デオキシウリジン５′−三リン酸（５−ＡＰ３−ｄｄＵ
ＴＰ）の調製 Ａ． ５−ヨード−２′，３′−ジデオキシウリジン
（２１）の調製 ジデオキシウリジン（２．１２２ｇ，１０．０ｍｍｏ
ｌ）を３０ｍｌの温メタノールに溶解し、２５℃に冷却
した後、一塩化ヨウ素（４．０６ｇ，２５ｍｍｏｌ，
２．５ｅｑ，フィッシャー）のメタノール（２０ｍｌ）
溶液に５分間にわたって加えた。暗い紫色の反応混合物
を窒素下で５０℃の水浴中で２０分間加熱し、次いで直
ちに氷水槽中で冷却した。かきまぜずに１６５分間放置
した後、得られた沈殿をろ過によって集め、冷メタノー
ルで洗った（２×１０ｍｌ）。一夜真空乾燥すると２．
２３２ｇ（６６％）のヨウ素化物２１が灰色がかった白
色の微結晶として得られた。この物質をさらに精製する
ことなく次の反応で用いたが、他の沈殿はクロマトグラ
フィー又は沸騰メタノールからの再結晶（３０ｍｌ／
ｇ）で精製して、白色の針状結晶（ｍｐ ｄ １６０−
１６４℃）を得た。ＮＭＲにより、粗沈殿は均質である
ことが示されたが、また５′−ヒドロキシルプロトンは
痕跡量の不純物によって触媒される交換の故に非常に幅
広であった。クロマトグラフィー処理した、又は再結晶
した物質のスペクトルは、このプロトンが通常、鋭い三
重線であることを示した。
【０１８５】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：１１．
６０（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ３），８．５７（ｓ，１Ｈ，Ｈ
６），５．９０（ｄｄ，Ｊ＝２．０および６．６，１
Ｈ，Ｈ１′），５．２（ｂｓ，１Ｈ，５′ＯＨ），４．
０６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４′），３．７５および３．５３
（ｍ，１Ｈ，Ｈ５′），２．２６，２．０２および１．
８４（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′）． Ｂ． ５−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロ
ピニル）−２′，３′−ジデオキシウリジン（２２）の
調製 例５Ｃの一般的方法に従って、ヨウ素化ウリジン２１を
Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセトアミドに３時間か
けて結合した。０〜５％メタノールジクロロメタン溶液
勾配でのクロマトグラフィーにより、ＴＬＣにおいて均
質であるが乾燥させることが困難な物質が得られた。こ
の生成物をクロロホルムと数回共蒸発し、真空乾燥する
と、５３６．５ｍｇのアルキニルアミノヌクレオシド２
２が白色泡として得られた。この物質はＴＬＣにおいて
均質であり、少量のクロロホルムを含むことを除いてＮ
ＭＲにおいて純粋であった（３９ｍｏｌ％、補正収率６
６％）。
【０１８６】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：１１．
６１（ｓ，１Ｈ，Ｈ３），１０．０７（歪んだｔ，１
Ｈ，ＮＨＴＦＡ），８．３５（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），７．
２６（ｓ，０．３９Ｈ，ＣＨＣｌ3 ），５．８９（ｄ
ｄ，Ｊ＝６．６および３．２，１Ｈ，Ｈ１′），５．１
５（ｔ，Ｊ＝５．２，１Ｈ，５′ＯＨ），４．２２（ｂ
ｒｏａｄ ｄ，２Ｈ，−ＣＨ2 Ｎ−），４．０４（明瞭
なｈｅｐｔ，Ｊ＝３．５，１Ｈ，Ｈ４′），３．７３お
よび３．５３（ｍ，１Ｈ，Ｈ５′），２．２６，２．０
３および１．８４（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′）． ＴＬＣ（９５：５ ジクロロメタン−メタノール，２溶
離，ＵＶ）：出発ヨウ素化物２１ Ｒf ＝０．３７；生
成物２２，０．２８；触媒，０．９５及び０．８０及び
わずかに線状 Ｃ． ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，
３′−ジデオキシウリジン５′−三リン酸（５−ＡＰ３
−ｄｄＵＴＰ，２３）の調製 ０．３０ｍｍｏｌのアルキルアミノヌクレオシド２２を
対応する三リン酸に転化し、そのトリフルオロアセチル
基を例５Ｅの一般的手法に従って除去した。第２のリン
オキシクロリドを加えた後、リン酸化を２１０分間進行
させた。生成物の吸光係数が出発物質のそれ（１３００
０）と等しいと仮定すると、三リン酸２３の、２９１．
５ｎｍにおけるＵＶ吸光に基づく収率は１８％であっ
た。
【０１８７】例 ７ ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジ
デオキシグアノシン５′−三リン酸（７−ＡＰ３−ｄｄ
ｃ７ＧＴＰ）の調製 Ａ． ６−メトキシ−２−メチルチオ−９−（３，５−
ジ−Ｏ−ｐ−トルイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル）−７−デアザプリン（２４）の調製 エフ・シーラとアール・リッチャー、Ｃｈｅｍ．Ｂｅ
ｒ．，１１１，２９２５（１９７８）の手法に従って、
６−メトキシ−２−メチルチオ−７−デアザプリン９．
２ｇを調製し、これを無水ピリジン１５０ｍｌ中に溶解
して共沸的に乾燥し、３０〜３５℃で蒸発乾固した。こ
の物質を室温下で窒素下で４５０ｍｌの無水アセトニト
リル中に懸濁し、水酸化ナトリウム（２．１６ｇの油中
６０％懸濁液）をかきまぜながら加えた。４５分後、１
−クロロ−２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルイ
ル−α−Ｄ−リボフラノース（１８．６ｇ、エム・ホッ
ファー、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９３，２７７７（１９６
０）に従って調製）を２０分間にわたって、３回に均等
に分けて加えた。反応混合物をさらに４５分かきまぜた
後、１ｍｌの酢酸及び３００ｍｌのジクロロメタンを加
えた。混合物を、フィルターエイドを介して吸引ろ過
し、ろ液を蒸発乾固した。残渣をベンゼンに溶解し、こ
の溶液を水で２回洗い、塩水で１回洗った。有機層を硫
酸ナトリウム上で蒸発させた後、残渣を４００ｍｌのメ
タノールに溶解し、結晶化させると、無色の結晶（ｍ
ｐ；１０６−１０７℃）として１９．２４ｇ（７３．８
％）のリボシル化生成物２４が得られた。
【０１８８】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，３６０ＭＨ
ｚ）：２．４２（ｓ，３Ｈ，トルイルＣＨ3 ），２．４
４（ｓ，３Ｈ，トルイルＣＨ3 ），２．６４（ｓ，３
Ｈ，ＳＣＨ3 ），２．７０および２．８９（ｍ，２Ｈ，
Ｈ2 ′），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3 ），４．５６
（ｍ，１Ｈ，Ｈ３′），４．６５（ｍ，２Ｈ，Ｈ
５′），５．７４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４′），６．４４
（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ，Ｈ７），６．７７（ｄｄ，Ｊ＝８
および６，１Ｈ，Ｈ１´），７．５０（ｄ，Ｊ＝４，１
Ｈ，Ｈ８），７．２５および７．９５（ｍ，８Ｈ，トル
イルＨ）． 上記物質の試料を少量のジクロロメタンを含有するメタ
ノールから再結晶することにより、ｍｐ １０９−１１
０℃の結晶が得られた。 Ｂ．６−メトキシ−２−メチルチオ−９−（２−デオキ
シ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（２
５）の調製 メタノール６００ｍｌ中エステル２４（１９ｇ）および
水酸化物型の強塩基性イオン交換樹脂（レキシン（Ｒｅ
ｘｙｎ）２０１ ３８ｇ）の懸濁液を窒素下において
１．５時間還流した。この温懸濁液を吸引濾過して樹脂
を除去し、濾液を蒸発させて乾固した。この固体残渣を
エーテル（４５０ｍｌ）に溶解し、１０分後に、この溶
液をフィルターエイドのパッドを介して濾過して少量の
着色不純物を除去した。この溶液に、予備反応により得
られた所望の生成物の結晶を種付けし、２５℃で一晩静
置した。濾過により結晶性ジオール２５を集め、母液を
濃縮して第２生成物を得た。各生成物をエーテルで完全
に洗浄し、総計８．４３ｇ（７８．０％）のジオール２
５を無色結晶として得た（ｍｐ １２９−１３０℃）。
【０１８９】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ，３６０Ｍ
Ｈｚ）： ２．２１および２．５５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２
´），２．５６（ｓ，３Ｈ，ＳＣＨ3 ），３．５３
（ｍ，２Ｈ，Ｈ５´），３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３
´），４．０２（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3 ），４．３６
（ｍ，１Ｈ，Ｈ４´），４．９０（ｔ，Ｊ＝５．５，１
Ｈ，５´ＯＨ），５．３０（ｄ，Ｊ＝５．５，１Ｈ，３
´ＯＨ），６．４８（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ，Ｈ７），６．
５５（ｄｄ，Ｊ＝８および６，１Ｈ，Ｈ１´），７．４
８（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ，Ｈ８）。この物質の試料を少量
のメタノールを含むジクロロメタンから再結晶させると
融点１３０−１３１℃の結晶が得られた。 Ｃ． ６−メトキシ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−
トリフェニルメチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラ
ノシル）−７−デアザプリン（２６）の調製 ジオール２６（７．２ｇ）を無水ピリジンに溶かして共
沸的に乾燥し、この溶液を３５℃で蒸発乾固した。残渣
を１００ｍｌの無水ピリジンに溶解し、８．０ｇのトリ
フェニルメチルクロリド、４．０ｍｌのトリエチルアミ
ン、及び３００ｍｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジン
を加えた。反応混合物を窒素下で６５℃で３０分間加熱
した後、１．０ｇの第２のトリフェニルメチルクロリド
を加え、１６．５時間加熱を続けた。冷却後、反応混合
物を濃縮し、残渣をジクロロメタンと水との間で分配し
た。水層をジクロロメタンで抽出し、１つにまとめた有
機層を０．３Ｎ塩酸、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩
水で洗った。硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した後、
粗生成物をシリカゲル上で０％，１％，１．５％及び２
％のメタノールジクロロメタン溶液を用いてクロマトグ
ラフィーすると、無色のガラスとして１２．１ｇ（９
４．５％）のモノトリチルエーテル２６が得られた。
【０１９０】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，３００ＭＨ
ｚ）：２．５８（ｓ，３Ｈ，ＳＣＨ3），２．４２およ
び２．６２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２′），３．３７（ｍ，２
Ｈ，Ｈ５′），４．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３′），４．０
８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3 ），４．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），６．４０（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ，Ｈ７），６．６
８（明瞭なｔ，Ｊ＝７，１Ｈ，Ｈ１′），７．００
（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ，Ｈ８），７．２７および７．４３
（ｍ，１５Ｈ，トリチル Ｈ）． このデータは、上記の通りに調製した２６の異なるバッ
チより得た。 Ｄ． ６−メトキシ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−
トリフェニルメチル−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リ
ボフラノシル）−７−デアザプリン（２７）の調製 １２．１ｇのトリチルエーテル２６、９．２ｇの４−ジ
メチルアミノピリジン、及びフェニルクロロチオカルボ
ネート（７．５ｍｌ、アルドリッチ）の無水ジクロロメ
タン（２２０ｍｌ）溶液中を２５℃で２時間窒素下でか
きまぜた。ＴＬＣ分析が反応の完了を示したので４．０
ｍｌのフェニルクロロチオノカルボネートを加え、反応
混合物をさらに１時間かきまぜた。この溶液を２８０ｍ
ｌのジクロロメタンで希釈し、次いで５００ｍｌの０．
５Ｎ塩酸、５００ｍｌの０．５Ｎ塩酸及び塩水で洗っ
た。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固し
た。
【０１９１】得られた粗チオカーボネートを３５０ｍｌ
の無水トルエンに溶解し、３５０ｍｇのアゾイソビスブ
チロニトリルと１０ｍｌの水酸化トリ−ｎ−ブチルスズ
を加えた。得られた溶液を１００〜１０５℃で１０分間
加熱した。冷却後、溶液を少量のエーテルで希釈し、３
５０ｍｌの１０％フッ化カリウム水溶液と共に振盪し
た。２層をフィルターエイドを介してろ過して暗いスラ
ッジを除去し、分離した。有機層を０．７５Ｎの水酸化
カリウムと塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃
縮した。得られた油をシリカゲル上で１：１ジクロロメ
タン−エーテルで、次いでジクロロメタンでクロマトグ
ラフィーすると、９．９３ｇ（８４．５％）のジデオキ
シヌクレオシド２７が無色の固体（融点１２２〜１２４
℃）として得られた。
【０１９２】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，３６０ＭＨ
ｚ）：２．１０，２．３３および２．４３（ｍ，４Ｈ，
Ｈ２′およびＨ３′），２．６０（ｓ，３Ｈ，ＳＣ
Ｈ3 ），３．３０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５′），４．０８
（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3 ），４．２９（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），６．３６（ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ，Ｈ７），
６．５３（ｄｄ，Ｊ＝７および４，１Ｈ，Ｈ１′），
７．０９（ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ，Ｈ８），７．２５お
よび７．４５（ｍ，１５Ｈ，トリチル Ｈ）． Ｅ． ７−ヨード−６−メトキシ−２−メチルチオ−９
−（５−Ｏ−トリフェニルメチル−２，３−ジデオキシ
−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（２
８）の調製 Ｎ−ヨードスクシンイミド（１０．０ｇ）を９．９ｇの
デアザプリンの無水ジメチルホルムアミド（５５０ｍ
ｌ）溶液に加えた。暗所にて窒素下で１６時間かきまぜ
た後、２．５ｍｌの１０％炭酸水素ナトリウム溶液を加
え、反応混合物を真空下で５０℃で１００ｍｌまで濃縮
した。この溶液を水と酢酸エチルとの間で分配した。有
機層を５％水酸化ナトリウム水溶液及び塩水で洗い、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。この僅かに不純な
生成物をシリカゲル上でジクロロメタンを用いてクロマ
トグラフィーすると、無色のガラス状固体として１１．
６８ｇ（９５．６％）のヨウ素化物２８が得られた。
【０１９３】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，３００ＭＨ
ｚ）：２．０６，２．２４および２．４１（ｍ，４Ｈ，
Ｈ２′およびＨ３′），２．５８（ｓ，３Ｈ，ＳＣ
Ｈ3 ），３．３０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５′），４．１０
（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3 ），４．２９（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），６．４７（ｄｄ，Ｊ＝６および４，１Ｈ，Ｈ
１′），７．１９（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．３０および
７．４６（ｍ，１５Ｈ，トリチル Ｈ）．このデータ
は、上記の通り調製した２８の異なるバッチより得た。 Ｆ． ７−ヨード−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−ト
リフェニルメチル−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボ
フラノシル）−７−デアザプリ−４−オン（２９）の調
製 １当量のメトキシナトリウムをチオクレゾールのメタノ
ール溶液に加え、蒸発乾固することによってトリクレゾ
ール酸ナトリウムを調製した。４．０ｇのメチルエーテ
ル２８、４．０ｇのチオクレゾール酸ナトリウム及び１
０ｍｌのヘキサメチルフォスフォラミドの無水トルエン
（１５０ｍｌ）中溶液を窒素下で４．５時間還流した。
冷却後、混合物を酢酸エチルと水との間で分配した。有
機層を水及び塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、
蒸発乾固した。得られた粗生成物をシリカゲル上で、０
％および２％メタノールジクロロメタン溶液を用いてク
ロマトグラフィーにかけると、無色のガラス状固体とし
て３．８０ｇ（９７．０％）のデアザプリン２９が得ら
れた。
【０１９４】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，３６０ＭＨ
ｚ）：２．０５，２．２５および２．４２（ｍ，４Ｈ，
Ｈ２′およびＨ３′），２．６０（ｓ，３Ｈ，ＳＣ
Ｈ3 ），３．３０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５′），４．２８
（ｍ，１Ｈ，Ｈ４′），６．４０（ｄｄ，Ｊ＝７および
４，１Ｈ，Ｈ１′），７．０５（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），
７．３０および７．４６（ｍ，１５Ｈ，トリチル
Ｈ），１０．００（ｂｓ．１Ｈ，Ｈ１）． Ｇ． ７−ヨード−５′−Ｏ−トリフェニルメチル−
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン（３
０）の調製 メタ−クロロパーオキシ安息香酸（１．２３ｇ，８５
％、アルドリッチ）を０℃で窒素下で、３．６ｇのメチ
ルチオエーテル２９の無水ジクロロメタン（１５０ｍ
ｌ）中溶液にかきまぜながら加えた。１５分後、冷却槽
を外し、撹拌を２５℃で４０分間継続した。この溶液を
炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩水で洗い、硫酸ナトリ
ウム上で乾燥した。メタノール（２体積％）を加え、得
られた溶液をシリカゲルの短いプラグに通して極性不純
物を除去した。得られた粗スルホキシド（３．０７ｇ）
を４０ｍｌのジオキサンに溶解し、ガラス内張ボンベに
入れた。１０．０ｇのアンモニアを加え、混合物をオー
トクレーブ中で１００℃で２時間加熱した。得られた溶
液を蒸発乾固した。残渣を２０ｍｌのジクロロメタン中
に溶解し、フィルターエイドを介してろ過した。４０ｍ
ｌのメタノールを溶液に加え、冷却すると、１．５７ｇ
の無色生成物が結晶した。母液を蒸発し、シリカゲル上
で５％メタノールジクロロメタン溶液を用いて中圧液体
クロマトグラフィーにかけると、無色結晶としてさらに
３２８ｍｇの生成物が得られた。デアザグアノシン３０
の総収量は１．９０ｇ（５５．４％）であった。
【０１９５】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，３００ＭＨ
ｚ）：２．０５，２．２３および２．３５（ｍ，４Ｈ，
Ｈ２′およびＨ３′），３．２９（ｍ，２Ｈ，Ｈ
５′），４．２６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４′），５．９０（ｂ
ｓ，１Ｈ，ＮＨ2 ），６．２４（ｄｄ，Ｊ＝７および
４，１Ｈ，Ｈ１′），６．９０（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），
７．３０および７．４６（ｍ，１５Ｈ，トリチル
Ｈ），１０．９０（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）． この試料をメタノール−ジクロロメタンから再結晶させ
るとｍｐ ２０１〜２０３℃の結晶が得られた。 Ｈ． ２′，３′−ジデオキシ−７−ヨード−７−デア
ザグアノシン（３１）の調製 トリチルエーテル３０（１．７ｇ）のギ酸（１２ｍｌ）
溶液を室温で１０分間かきまぜた。得られた黄色の懸濁
液を真空下で３０℃で急速に蒸発乾固した。残渣をシリ
カゲル上で５％，７％及び１０％メタノールジクロロメ
タン溶液を用いてクロマトグラフィーにかけると、９４
０ｍｇの有色固体が得られた。この固体を、少量のジク
ロロメタンを含むエーテルと共に突き崩すと無色結晶と
して８３８ｍｇ（８１．０％）のヌクレオシド３１が得
られた。
【０１９６】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ，３６０Ｍ
Ｈｚ）：１．９５，２．０９および２．２６（ｍ，４
Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′），３．４８および３．５４
（ｍ，２Ｈ，Ｈ５′），３．９８（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），４．９０（ｂｔ，Ｊ＝５，１Ｈ，５′ＯＨ），
６．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ１′），６．３２（ｂｓ，２
Ｈ，ＮＨ2），７．１２（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），１０．４
６（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）． Ｉ． ７−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロ
ピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノ
シン（３２）の調製 ヨウ素化物３１（３７６ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）を例
５Ｃの一般的手法によって２．２５時間でＮ−プロパル
ギルトリフルオロアセトアミドに結合した。生成物と出
発物質とがＴＬＣによって識別不能であったので、反応
は逆相ＨＰＬＣ（１０ｃｍ ＯＤＳ，１ｍｌ／分、１０
０％水から１００％メタノールまでの５分間にわたる勾
配、次いで１００％メタノール、２８０ｎｍでのＵＶ検
出；ヨウ素化物３１から出発して５．４９分；生成物３
２、５．７５分；中間体６．５８分）によってモニター
した。粗生成物はジクロロメタンにあまり溶けなかった
ので、クロマトグラフィーカラムにかける前に、５ｇの
シリカゲル上に、ジクロロメタン−メタノール溶液から
濃縮した。２％，５％，７％及び１０％メタノールジク
ロロメタン溶液で溶離すると、黄色の固体として３００
ｍｇ（７８％）のアルキルアミノヌクレオシド３２が得
られた。
【０１９７】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ，３６０Ｍ
Ｈｚ）：１．９６，２．０８および２．２８（ｍ，４
Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′），３．４７および３．５５
（ｍ，２Ｈ，Ｈ５′），３．９９（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），４．２２（ｂｓ，２Ｈ，−ＣＨ2 −），４．９
０（ｔ，Ｊ＝５，１Ｈ，５′ＯＨ），６．０９（ｄｄ，
Ｊ＝６および４，１Ｈ，Ｈ１′），６．３３（ｂｓ，２
Ｈ，ＮＨ2 ），７．３０（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），１０．０
５（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨＴＦＡ），１０．５０（ｂｓ，１
Ｈ，Ｈ１）．1 Ｈ−脱結合13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：１５
５．５（ｑ，Ｊ＝３６．５，トリフルオロアセチルカル
ボニル），１５７．８，１５３．１および１４９．９
（Ｃ２，Ｃ４およびＣ６），１２２．６（Ｃ８），１１
５．９（ｑ，Ｊ＝２８８，ＣＦ３），９９．４および９
７．５（Ｃ７およびＣ５），８４．２および７７．４
（アセチレン性），８３．２および８１．０（Ｃ１′お
よび４′），６２．９（Ｃ５′），２９．７（プロパル
ギル），３１．８および２５．８（Ｃ２′およびＣ
３′）． この13Ｃ−ＮＭＲデータは上述のようにして調製された
異なる３２のバッチから得られた。 Ｊ． ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，
３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン５′−三リン
酸（７−ＡＰ３−ｄｄｃ７ＧＴＰ）の調製 ０．９０ｍｍｏｌのアルキルアミノヌクレオシドを対応
する５′三リン酸に転化し、トリフルオロアセチル保護
基を例５Ｆの一般的手法に従って除去した。第２のリン
オキシクロリドを加えた後、反応混合物をさらに１６５
分間かきまぜた。生成物の吸光係数が出発物質のそれ
（１１９００）と等しいと仮定すると、７−ＡＰ３−ｄ
ｄｃ７ＧＴＰの収率は、その２７２．５ｎｍの吸光度に
基づき１８％であった。
【０１９８】例 ８ ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，３′−ジ
デオキシ−７−デアザアデノシン５′三リン酸（７−Ａ
Ｐ３−ｄｄｃ７ＡＴＰ）の調製 Ａ． ２′−アセトキシイソブチルブロミド（１９．５
ｍｌ，１５０ｍｍｏｌ，５ｅｑ，ルッセルら、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９５，４０１６〜４０３０
（１９７３）の手法に従って調製した）を無水アセトニ
トリル（２５０ｍｌ、アルドリッチ）中に懸濁されたチ
ュバーシジン（７−デアザアデノシン、６．６６ｇ，２
５．０ｍｍｏｌ，シグマ）に１５分間にわたって加え
た。懸濁された固体は約５分間で溶け、反応混合物を窒
素下で２５℃で２２時間かきまぜた。反応混合物をリン
酸水素二カリウム（４３．５５ｇ，３００ｍｍｏｌ，６
ｅｑ）の４００ｍｌ水溶液に加えた。３０分間かきまぜ
た後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した（１×４００
ｍｌ及び２×２００ｍｌ）。１つにまとめた有機層を硫
酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾固すると１４．７３
ｇ（１１８％）の白色泡が得られた。この物質は、ＴＬ
Ｃにおいて、僅かに幅広の９５％以上のスポット（ＵＶ
検出）であるが、ＮＭＲでは１つの主生成物と少なくと
も１つの副産物が存在した。ＮＭＲスペクトルは、主生
成物がブロモアセテート３３であることと一致してい
た。
【０１９９】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）（主成分
３３に対する）８．０８（ｓ．１Ｈ，Ｈ２），７．３４
（ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ，Ｈ８），７．１２（ｂｓ，２
Ｈ，ＮＨ2 ），６．７０（ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ，Ｈ
７），６．３２（ｄ，Ｊ＝３．８，１Ｈ，Ｈ１′），
５．６１（ｄｄ，Ｊ＝２．４および３．８，１Ｈ，Ｈ
２′），４．８９（ｄｄ，Ｊ＝２．４および４．５，１
Ｈ，Ｈ３′），４．４３（ｍ，１Ｈ，Ｈ４′），４．３
５（ｄｄ，Ｊ＝１２および４，１Ｈ，Ｈ５′ａ），４．
２９（ｄｄ，Ｊ＝１２および７，１Ｈ，Ｈ５′ｂ），
２．０８（ｓ，３Ｈ，ＯＡｃ），２．００（ｓ，３Ｈ，
ＯＡｃ），１．４９（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ3 ）． Ｂ． ２′，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒド
ロ−７−デアザアデノシン（３４）の調製 亜鉛ダスト（２０ｇ、マリンクロット）を１Ｎ塩酸（３
×５０ｍｌ）、水（２×５０ｍｌ）、２％硫酸第二銅
（２×５０ｍｌ）、水（４×５０ｍｌ）、エタノール
（３×５０ｍｌ）及びエーテル（２×５０ｍｌ）で迅速
に（全時間約１０分）に洗うことによって亜鉛−銅結合
体を新たに調製した。それぞれの洗浄において、亜鉛ダ
ストを、これが懸濁されるまでフリット漏斗中でかきま
ぜ、洗液は亜鉛を空気にさらすことを最小限に抑えなが
ら吸引除去した。上述の粗ブロモアセテート（１４．６
３ｇ）を１５０ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（アル
ドリッチ）中に溶解し、回転蒸発器（４５℃、２トー
ル）で約２５ｍｌの溶媒を除去した。新鮮な亜鉛−銅結
合体（１４．６３ｇ、約９ｅｑ）を加え、得られた懸濁
液を２５℃で窒素下でかきまぜた。亜鉛−銅結合体の品
質に応じて、この反応は誘導期間及び／又は異なる速度
を有するので、反応はＴＬＣ（９０：９：１ジクロロメ
タン−メタノール−濃水酸化アンモニウム；出発物質Ｒ
f ＝０．４５、生成物Ｒf ＝０．３９及び０．３６）に
より出発物質が完全に消費されたことが示されるまで続
けた。この場合、反応は１５分以内に完了した。１００
分後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液７５ｍｌを反応混
合物に１０分間にわたって慎重に加えた。反応混合物を
フィルターエイドを介してろ過し、フィルターエイドを
メタノールで洗った（２×５０ｍｌ）。１つにまとめた
ろ液を蒸発乾固し、残渣を水（１５０ｍｌ）と酢酸エチ
ル（１５０ｍｌ）との間で分配した。水層を酢酸エチル
で抽出し（２×１００ｍｌ）、１つにまとめた有機抽出
物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮し、１時間真空
乾燥した。
【０２００】得られた暗オレンジ半固体を１００ｍｌの
メタノールに溶解し、次いで２５ｍｌの水及びレキシン
２０１樹脂（２９ｇ，４．３ｍｅｑ／ｇ，５ｅｑ水酸化
物型）を加えた。反応混合物を合計２１０分間還流し
た。ＴＬＣ（８５：１３：２ジクロロメタン−メタノー
ル−濃水酸化アンモニウム；中間体エステルＲf ＝０．
４９；最終生成物３４、０．２４）による監視により、
約７０％転化した時点で反応が急速に停止したことが示
された。そのため１６５分後にさらに２９ｇの樹脂を加
えた。冷却することなく、樹脂をろ過によって除き、
１：１ジクロロメタン−メタノール（２×７５ｍｌ）で
洗った。１つにまとめたろ液を蒸発乾固し、得られた紫
色の固体を沸騰イソプロパノール１５０ｍｌから再結晶
すると、灰色がかった白色の針状結晶（ｍｐ２０５−２
０６℃）として３．７７８ｇのオレフィン３４が得られ
た。母液を２５ｍｌに濃縮することによって第２の生成
物０．６３１ｇ（薄紫針状結晶ｍｐ２０２−２０３℃）
が得られた。両生成物（合計４．４０９ｇ、７６％）
は、ＴＬＣで均質であり、痕跡量のイソプロパノールを
除いてＮＭＲで純粋であった。
【０２０１】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：８．０
７（ｓ．１Ｈ，Ｈ２），７．１５（ｄ，Ｊ＝３．６，１
Ｈ，Ｈ８），７．１２（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１′），７．０
１（ｂｓ，２Ｈ，ＮＨ2 ），６．５７（ｄ，Ｊ＝３．
６，１Ｈ，Ｈ７），６．４３および６．０２（ｂｄ，Ｊ
＝６．０，各１Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′），４．９５
（ｔ，Ｊ＝６．５，１Ｈ，５′ＯＨ），４．７９（ｍ，
１Ｈ，Ｈ４′），３．５２（ｍ，２Ｈ，Ｈ５′）． Ｃ． ２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン
（３５）の調製 ４５０ｍｌのパールボトルに３．８０ｇのオレフィン３
４、７６ｍｌのエタノール、３８０ｍｇの１０％パラジ
ウム付着カーボン及び４０ｐｓｉの水素を入れた。２５
℃で４．６７時間振盪した後、１４．５ｐｓｉの水素が
吸着され、水素の取り込みは終了した。ＴＬＣ（８５：
１３：２ジクロロメタン−メタノール−濃水酸化アンモ
ニウムで２回溶離；出発物質３４，０．４５；生成物３
５，０．４８）により、単一の紫外線活性新規生成物に
完全に転化されたことが示された。触媒をフィルターエ
イドを介するろ過によって除去し、エタノールで洗浄し
た。ろ液から溶媒を除去し、一夜真空乾燥することによ
って白色泡として３．９８ｇ（１０４％）のジデオキシ
ヌクレオシド３５が得られた。ＮＭＲにより、生成物
は、８重量％のエタノールを含むことを除いて均質であ
ることが示された（９６％補正収量）。この物質の同様
なバッチは結晶化しにくく、無水溶媒で共沸的に乾燥す
ると極めて吸湿性の物質になった。従って、この物質を
約１週間真空下で貯蔵し、ＮＭＲにより５重量％以下の
エタノールが含まれることが示された後に用いた。この
生成物について観察された結晶性の欠如及びスペクトル
特性は、先にロビンソンら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，
５５，１２５９（１９７７）によって示されたものと一
致していた。
【０２０２】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：８．０
４（ｓ．１Ｈ，Ｈ２），７．３３（ｄ，Ｊ＝３．６，１
Ｈ，Ｈ８），６．９７（ｂｓ，２Ｈ，ＮＨ2 ），６．５
６（ｄ，Ｊ＝３．６，１Ｈ，Ｈ７），６．３４（ｄｄ，
Ｊ＝５．２および６．４，１Ｈ，Ｈ１′），４．９６
（ｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ，５′ＯＨ），４．３３（ｔ，
Ｊ＝５．１，０．４３Ｈ，エタノールＯＨ），４．０４
（ｍ，１Ｈ，Ｈ４′），３．４−３．６（ｍ，２．８６
Ｈ，Ｈ５′およびエタノールＣＨ2 ），２．３３，２．
２１および２．０２（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′および
Ｈ3 ′），１．０６（ｔ，Ｊ＝７．０，１．３Ｈ，エタ
ノールＣＨ3 ）． Ｄ． ７−ヨード−２′，３′−ジデオキシ−７−デア
ザアデノシン（３６）の調製 純度９５％のジデオキシヌレオシド３５（２．９５ｇ，
１１．９６ｍｍｏｌ）の機械的に撹拌されている溶液、
無水酢酸ナトリウム（４．１３ｇ，５０．３ｍｍｏｌ，
４ｅｑ）及び酢酸第二水銀（３．８１ｇ，１１．９５ｍ
ｍｏｌ，１．００ｅｑ，フィッシャー、９９．９％）の
水（１９０ｍｌ）溶液を窒素下で６５℃で２時間加熱し
た。得られた水銀含有物質の白色懸濁液を２５℃に冷却
した後、ヨウ素（４．７９ｇ，１８．９ｍｍｏｌ，１．
６ｅｑ）と酢酸エチル（１９０ｍｌ）とを加えた。１時
間後、懸濁された水銀含有物質が消費され、透明な紫色
の溶液が残った。２時間後、６．３５ｇの亜硫酸ナトリ
ウムを加え、紫色が消失した。３０分間かきまぜた後、
硫化水素ガスをゆっくりと反応混合物中に１５分間バブ
ルした。硫化第二水銀（黒色コロイド）及びヨウ素化物
３６（白色粉末）が反応混合物から沈殿した。水銀（I
I）の完全な沈殿は、ＴＬＣによって２つの主たるＵＶ
活性スポットの１つが消えることをモニタリングするこ
とによって分析した。反応混合物をフィルターエイドを
介してろ過し、２つの層に分離した。フィルターエイド
を、ＴＬＣがさらなる生成物が抽出されないことを示す
まで沸騰酢酸エチルで洗った（９×１００ｍｌ）。それ
ぞれの酢酸エチル抽出物を水層で洗った。１つにまとめ
た酢酸エチル層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾
固した。得られた粗固体は空気に触れると赤くなった。
この物質を３：１ジクロロメタン−メタノール（１００
ｍｌ）に溶解し、遊離塩基型の弱いアニオン交換樹脂
（５．０ｇ，バイオラドＡＧ３ Ｘ４Ａ，２．９ｍｅｑ
／ｇ乾燥）を加えた。硫化水素を赤い溶液中に１０分間
バブルすると、赤色が消えた。短時間暖めることによっ
てわずかな曇りを除き、溶液をシリカゲルの２ｃｍプラ
グ（１５ｇ）を介して迅速にろ過した。シリカゲルをさ
らなる３：１ジクロロメタン−メタノール（１００ｍ
ｌ）で溶離した。シリカゲル５０ｇをろ液に加え、硫化
水素を１０分間バブルした。溶媒をこの混合物から回転
蒸発器で除き、シリカゲルを２００ｍｌのクロロホルム
と共蒸発させることによって「乾燥」させた。このシリ
カゲルを、窒素気流で予め脱ガスしたシリカゲルカラム
（５００ｇ）上に迅速にかけた。窒素下で５％（６Ｌ）
及び１０％（４Ｌ）メタノールジクロロメタン溶液で溶
離すると、白色粉末として２．９２ｇ（６４％）のヨウ
素化物３６及びより極性の小さな４５６ｍｇ（７．５
％）の７，８−ジヨード−２′，３′−ジデオキシ−７
−デアザアデノシンが得られた。主生成物を２００ｍｌ
の沸騰酢酸エチルから蒸発させると２．６２６ｇの白色
針状物（ｍｐ１５８−１６０℃）が得られた。母液を１
０ｍｌに濃縮すると、薄赤色の針状物として第２の生成
物が０．３９１ｇ得られた（ｍｐ１５６−１５８℃）。
両方の生成物はＮＭＲおよびＴＬＣにおいて均質であ
り、オレフィン３４からの合計収率は６４％であった。 Ｅ． ７−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロ
ピニル）−２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノ
シン３７の調製 ヨウ素化物３６（７２０．３ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）
を、９０分かけて、例５Ｃの方法により、Ｎ−プロパラ
ジルトリフルオロアセトアミドにと結合させた。ジクロ
ロホルム中７％メタノールでクロマトグラフィーを行な
うと、７０５．８ｍｇ（９２％）の生成物３７が灰色が
かった白色の粉末として得られた。これはＮＭＲ及びＴ
ＬＣにより、均質であることがわかった。沸騰酢酸エチ
ル（１０ｍｌ）から再結晶させると、３７２ｍｇの白色
結晶（融点１６９−１７１℃）が得られた。
【０２０３】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：１０．
１（歪んだｔ，１Ｈ，ＮＨＴＦＡ），８．１０（ｓ．１
Ｈ，Ｈ２），７．７８（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），６．０−
７．５（非常に幅広のｓ，ＮＨ2 ），６．３４（ｄｄ，
Ｊ＝４．５および７．０，１Ｈ，Ｈ１′），４．９８
（ｔ，Ｊ＝５，１Ｈ，５′ＯＨ），４．３１（わずかに
幅広のｓ，２Ｈ，−ＣＨ2 Ｎ−），４．１０（明瞭なｈ
ｅｐｔ，Ｊ＝３．５，１Ｈ，Ｈ４′），３．６０および
３．４０（ｍ，１Ｈ，Ｈ５′），２．３７，２．１８お
よび２．００（ｍ，４Ｈ，Ｈ２′およびＨ３′）． ＴＬＣ（９０：９：１ ジクロロメタン−メタノール−
濃水酸化アンモニウム：ＵＶ）出発ヨウ素化物３６，Ｒ
f ＝０．３６；生成物３７，０．２６）． Ｆ． ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′，
３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン５′−三リン
酸（７−ＡＰ３−ｄｄｃ７ＡＴＰ）の調製 アルキルアミノヌクレオシド３７（１．００ｍｍｏｌ）
を対応する５′三リン酸に転化し、トリフルオロアセチ
ル基を例５Ｅの一般的手法に従って除去した。第二のリ
ンオキシクロリドを加えた後、溶液を１２０分間かきま
ぜた。生成物の吸光係数が出発物質のそれ（１２７０
０）と等しいと仮定すると、２７９．５ｎｍの吸光度に
基づく７−ＡＰ３−ｄｄｃ７ＡＴＰの収率は４０％であ
った。
【０２０４】1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：７．９７（ｓ．
１Ｈ，Ｈ２），７．８０（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），６．３３
（ｍ，１Ｈ，Ｈ１′），４．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ
４′），４．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ５′ａ），４．１４
（ｍ，１Ｈ，Ｈ５′ｂ），４．１１（ｂｒｏａｄ ｓ，
２Ｈ，−ＣＨ2 −），２．６−２．０（ｍ，４Ｈ，Ｈ
２′およびＨ３′），並びに対イオン（トリエチルアン
モニウム）ピーク．31 Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：−８．５９（ｂｄ，Ｊ＝２
０，１Ｐ），−９．５６（ｄ，Ｊ＝２０，１Ｐ）および
−２１．３８（ｍ，１Ｐ）． ＵＶ（ｐＨ８．２ ａｑ Ｔｒｉｓ）：最大 ２３８お
よび２７９．５ｎｍ． 例 ９ 蛍光標識鎖ターミネーターを調製するための一般的結合
操作 Ｔ−ターミネーター：５−（ＳＦ−５０５−Ｓａｒ−Ａ
Ｐ３）ｄｄＵＴＰの調製 例６Ｃからのアミン５−（ＡＰ３）ｄｄＵＴＰ（６０μ
モル）を０．３００ｍｌの水に取り、０．６００ｍｌの
ＤＭＦで希釈した。例１Ｅからの染料標識剤Ａｃ２Ｅｔ
ＳＦ−５０５−Ｓａｒ−ＮＨＳ（７２ｍｇ，１２６マイ
クロモル）のＤＭＦ（０．６００ｍｌ）溶液を加え、混
合物を５０℃で４時間かきまぜた。１．５ｍｌの濃アン
モニア水を加え、フラスコにしっかりと栓をし、５０℃
で２０分間加熱を継続した。得られた赤い溶液を水で希
釈して６０ｍｌにし、予め２．０Ｍ ｐＨ７．７ ＴＥ
ＡＢ水溶液（５０ｍｌ）、次いで０．２Ｍ ｐＨ７．７
ＴＥＡＢ水溶液（５０ｍｌ）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡＡ−２５−１２０（１×３５ｃｍベッ
ド）カラムにかけた。カラムをＴＥＡＢ水溶液ｐＨ７．
７の直線勾配で溶離した（０．２Ｍ（１５０ｍｌ）→
２．０Ｍ（１５０ｍｌ））。カラムは１００ｍｌ／時間
で操作し、３分毎に画分を回収した。溶離された液を５
１０ｎｍにおける吸光度により監視した（４０ＡＵＦ
Ｓ）。２つのより少量の副産物バンドが先ず溶離され、
次いでベースラインに近い解像度で強いバンドが溶離さ
れた。純粋な生成物を含むと見積られる画分をプール
し、３０℃未満でストリップし、絶対エタノールと共に
３回共蒸発し、少量（５．２ｍｌ）の水に取った。この
溶液を可視吸光度によって分析し（ｐＨ８．２，５０ｍ
Ｍ ａｑ Ｔｒｉｓ緩衝液）、凍結乾燥した。生成物の
希釈溶液は４９１ｎｍに吸収最大を示した。遊離の染料
吸光係数（７２６００）から計算した収量は３１マイク
ロモル（５１％）であった。
【０２０５】開示した一般的手法に従って、蛍光標識鎖
ターミネーター化合物をさらに調製した。第１表におけ
る命名は上述の実施例において調製され、ＤＮＡ配列決
定に有用な新規組成物を調製する一般的な手法により結
合された蛍光標識スペーサー（例えばＳＦ−５１２−Ｓ
ａｒ）及びジデオキシヌクレオチドリンカー（ＡＰ３−
ｄｄＮＴＰ）を示す。 第 １ 表 他の蛍光標識鎖ターミネーターの調製のデータのまとめ 化 合 物 スケール カラム勾配 収率 吸収最大 5-(SF512-Sar-AP3)ddCTP 40 μmol 0.4-0.7 Ｍ 47％ 501 5-(SF519-Sar-AP3)ddCTP 10 μmol 0.4-0.7 Ｍ 27％ 508 7-(SF512-Sar-AP3)ddc7ATP 10 μmol 0.4-0.7 Ｍ 58％ 505.5 7-(SF526-Sar-AP3)ddc7GTP 50 μmol 0.4-0.7 Ｍ 53％ 519.5 5-(SF505-Sar-AP3)ddCTP 10 μmol 0.4-0.7 Ｍ 33％ 492 7-(SF505-Sar-AP3)ddc7GTP 10 μmol 0.4-0.7 Ｍ 42％ 497.5 5-(SF526-Sar-AP3)ddUTP 7.5μmol 0.4-0.7 Ｍ 60％ 516.5 7-(SF512-Sar-AP3)ddc7GTP 10 μmol 0.4-0.7 Ｍ 60％ 505 5-(SF512-Sar-AP3)AcyCTP 10 μmol 0.4-0.7 Ｍ 45％ 500.5 （acyclo） 例 １０ 蛍光標識鎖ターミネーターを用いた、改変サンガー鎖伸
長プロトコールによるバクテリオファージＭ１３の部分
的ＤＮＡ塩基配列決定 Ａ． 改変ＤＮＡ鎖伸長反応 ３μｇのバクテリオファージＭ１３ ｍｐ １８ ＤＮ
Ａテンプレート（ニューイングランドバイオラブス；
０．２５μｇ／μｌ）と６０μｇ（−４０）プライマー
（ニューイングランドバイオラブス；７．５μｇ／μ
ｌ）を４つの１．５ｍｌエッペンドルフプラスチックチ
ューブのそれぞれに入れた。それぞれのチューブを沸騰
水中で２分間加熱し、湿った氷上で５分間直ちに冷却し
た。室温で１秒パルススピンの微遠心を行なった後、８
μｌの５×反応緩衝液（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．３；０．２７５Ｍ ＮａＣｌ；３７．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ；２．５ｍＭジチオトレイトール）、１０μ
ｌの試薬グレードＨ2 Ｏ、１μｌの、ＡＴＰ，ＴＴＰ，
ＣＴＲ及びＧＴＰ含有（それぞれ２５μＭ）溶液、並び
に１μｌの逆転写酵素（鳥ミエロブラストシスウイル
ス；ニューイングランドニュークリアー；１５単位／μ
ｌ）をそれぞれのチューブに入れ、混合した。チューブ
を３７℃で１０分間インキュベートした。例９の蛍光標
識鎖ターミネーターの２００μＭ溶液４μｌを４つのチ
ューブに加えた。１つのチューブが７−（ＳＦ５０５−
Ｓａｒ−ＡＰ３）ｄｄｃ７ＧＴＰ、他のチューブが７−
（ＳＦ５１２−Ｓａｒ−ＡＰ３）ｄｄｃ７ＡＴＰ、他の
チューブが５−（ＳＦ５１９−Ｓａｒ−ＡＰ３）ｄｄＣ
ＴＰ、及び他のチューブが５−（ＳＦ５２６−Ｓａｒ−
ＡＰ３）を受容した。チューブを４２℃で３０分間イン
キュベートした。４つのチューブのそれぞれからの２２
μｌの混合物を準備し、予め試薬グレードの水で洗った
５−２５セレクト−Ｄスピンカラム（５プライム→３プ
ライム；フィラデルフィア）に通過させ、取り込まれな
かった蛍光標識鎖ターミネーターを蛍光標識され、伸長
されたＤＮＡ鎖から分離した。カラムの溶離物を回収
し、真空乾燥した。７０％エタノールを０．５ｍｌ加
え、チューブを５秒間遠心した。次にチューブをマイク
ロ遠心機中で５分間遠心し、ＤＮＡペレットを真空乾燥
し、９５％ホルムアミド−２５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁
した。チューブを７分間水浴中で６５℃に加熱し、１０
μｌのＤＮＡ試料を予めコンディショニングしたポリア
クリロアミド（８．３Ｍ尿素及び１×ＴＥＡＢ緩衝液を
含むビス（１９：１）ゲル（１５ｃｍ×４０ｃｍ×０．
３５ｍｍ）上にマイクロピペットで滴下した。試料を２
７ワットで下記Ｂに記載したようにして電気泳動した。 Ｂ． 蛍光標識ＤＮＡストランド電気泳動 ゲルを２７ワットの連続的電力（約２０００ボルト）に
約３０分間、試料を載せる前にさらすことによってゲル
を予備コンディショニングした。この間、ゲルの表面温
度を４９℃で安定化させた。
【０２０６】電気泳動中に、アルゴンイオンレーザー
（オムニクロム、モデル５３２）によって、垂直なゲル
の試料充填ウェルの下２８ｃｍの領域を照射した。レー
ザーを４８８ｎｍのラインフィルター（バーアソシエー
ト）を通し、それによって他の波長がゲル内に入ること
を排除した。ゲル表面における最終的なレーザー出力は
３５ｍＷで直径約１ｍｍであった。
【０２０７】蛍光標識ＤＮＡ鎖からの蛍光発光の検出
は、２つの光電子増倍管（ＰＭＴ；ハママツＲ１６１
２）によって−９５０ボルトのバイアスをかけて行なっ
た。波長選択フィルター（バーアソシエイツ）を蛍光発
光と２つのＰＭＴの間に置いた。この場合、１つとのＰ
ＭＴに関連付けられた１つのフィルターは４９６ないし
５２８ｎｍの範囲の発光光線を通過させ、一方、第２の
ＰＭＴに関連付けられた他方のフィルターは５２２ない
し５５３ｎｍの範囲の発光光線を通過するように選択し
た。さらに、繊維光学フェースプレート（インコム）集
光透孔を蛍光発光と波長選択フィルターとの間の光路上
に置き、検出半角を約２２度未満に制限した。予備増幅
した後、それぞれのＰＭＴからの信号を別々にデジタル
化し、両方のＰＭＴから同時に５秒毎にデータを得た。
デジタル化したデータを連続データファイルにシステム
コントローラー（ヒューレット−パッカード９０００，
モデル２０）を用いて保存した。 Ｃ． バクテリオファージＭ１３部分配列決定 蛍光標識Ｍ１３ ｍｐ１８ ＤＮＡ鎖の電気泳動中の蛍
光発光から誘導されたデータを公知の方法により分析し
た。例示のために、部分的なヌクレオシド配列を第２表
に示す。 第 ２ 表 Ｍ１３ ｍｐ１８の部分的ヌクレオシド配列決定 塩基数 ヌクレオシド 比率 ３ Ｔ ０．１４ ４ Ｇ ０．９０ ５ Ｔ ９．１９ ６ Ａ ０．７８ ７ Ａ ０．７５ ８ Ａ ０．８０ ９ Ａ ０．７５ １０ Ｃ ０．３５ １１ Ｇ １．８８ １２ Ａ ０．８９ １３ Ｃ ０．３２ １４ Ｇ １．８８ １５ Ｇ １．９２ １６ Ｃ ０．３３ １７ Ｃ ０．３６ １８ Ａ ０．８１ １９ Ｇ １．８９ ２０ Ｔ ０．１６ このデータは、Ｍ１３ ｍｐ１８ ＤＮＡ 中の４つの
ヌクレオシドのそれぞれに対応する、狭い、明瞭な比率
の範囲を明確に示している。 例 １１ Ａ． １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−ヨ
ウ素化シトシン（５−ＩＡｃｙＣ）の調製 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）シトシン（Ａｃ
ｙＣ）（１．８５ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）と酢酸第２水
銀（３．３５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の混合物を５０ｍ
ｌのメタノール及び１００ｍｌの塩化メチレン中で還流
した。ヨウ素（３．０５ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）を加
え、混合物を１時間かきまぜた。遊離液型のＡＧ３×４
樹脂（３８ｍｅｑ）を加え、溶液を硫化水素で１５分間
バブルした。固体をろ過によって除き、ろ液を１０ｇの
シリカゲル上にストリッピングした。このシリカをシリ
カゲルカラム（４×２５ｃｍ）に充填し、段階的勾配塩
化メチレン／メタノール（２０：１→１０：１→５：
１）で溶離した。蒸発させ、真空乾燥させると無色固体
（１．７３ｇ，５６％）が得られた。
【０２０８】９５％エタノールから再結晶させると、分
析的に純粋な物質が得られた。
【０２０９】Ｍ．Ｐ．：１７２℃． 元素分析：計算値［Ｃ（７）Ｈ（１０）Ｎ（３）Ｏ
（３）Ｉ（１）］Ｃ２７．０３，Ｈ３．２４，Ｎ１３．
５１．実測値：Ｃ２７．０８，Ｈ３．４１，Ｎ１３．５
１． ＵＶ（ＭｅＯＨ）：最大２９２．５（５，３００）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ３．４８１（ｍ，４
Ｈ），４．６５９（ｔ，Ｊ＝５ｈｚ，１Ｈ），５．０７
０（ｓ，２Ｈ），６．６６５（ｂｓ，１Ｈ），７．８６
９（ｂｓ，１Ｈ），８．１０７（ｓ，１Ｈ）． Ｂ． １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−
（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニル）シ
トシン（５−（ＴＦＡ−ＡＰ３）ＡｃｙＣ）の調製 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−ヨウ素化
シトシン（３１１ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）を例９で開
示した一般的な結合方法に供した。シリカゲル（３×２
０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにおい
て、段階的勾配塩化メチレン／メタノール（２０：１→
１０：１→５：１）で溶離すると、薄黄色の泡として生
成物が得られた（７７．４ｍｇ，２３％）。
【０２１０】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：３．４
７２（ｂｓ，４Ｈ），４．２７６（ｄ，Ｊ＝５．０ｈ
ｚ，２Ｈ），４．６５３（ｂｔ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），
５．０９１（ｓ，２Ｈ），６．９２５（ｂｓ，１Ｈ），
７．８６１（ｂｓ，１Ｈ），８．０３７（ｓ，１Ｈ），
９．９６４（ｂｓ，１Ｈ）． Ｃ． １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−
（３−アミノ−１−プロピニル）シトシンの調製 アルキニルアミノヌクレオシド（５−（ＴＦＡ−ＡＰ
３）ＡｃｙＣ）（０．１６７ｍｍｏｌ）の糖部分の水酸
基を例５Ｅの一般的方法に従って三リン酸に転化し、ト
リフルオロアセチル基を除去した。第２のリンオキシク
ロリドを加えた後、７５分間リン酸化を進行させた。生
成物の吸光係数が出発物質のそれ（７，７９０）に等し
いと仮定すると、２９１ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づく
三リン酸の収率は２１％であった。
【０２１１】例 １２ 保護された染料（Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ）で標識されたチミジ
ン誘導体の調製 Ａ． ５′−デオキシ−５′−（メチル−アミノ）−チ
ミジンの調製 ５′−Ｏ−（ｐ−トルエンスルフォニル）チミジン（１
９．８ｇ，５０ｍｍｏｌ）をモノメチルアミン（２５０
ｇ）が濃縮された圧力容器中に入れた。容器を封止し、
室温に３日間放置した。容器を冷却し、開き、モノメチ
ルアミンを蒸発させた。容器内に残留したものを水です
すぐことによって除去した。ＡＧ５０Ｗ×８イオン交換
樹脂（Ｈ+ 型）のカラム（６．５×２０ｃｍ）にこの水
溶液を通した。カラムを洗浄液が中性になるまで水で洗
った。次に、生成物を１Ｎ水酸化アンモニウム水溶液で
溶出した。溶出物をストリッピングし、得られた固体を
シリカゲルのカラム（６．５ｃｍ×２０ｃｍ）上でクロ
マトグラフィーにかけ、溶離液としては塩化メチレン／
メタノール／濃水酸化アンモニウム水溶液（８５：１
３：２）を用いた。生成物含有画分をストリップし、水
に取り、凍結乾燥した。生成物は薄黄色の非晶質固体
（８．８１ｇ，６９％）であった。満足できる燃焼分析
はこの物質については得られなかった。
【０２１２】［α］D 25（水中、ｃ＝１．０）：＋２
５．９°． ＩＲ（ＫＢｒ）：１６９３，１４７２，１２７３，１０
７６ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１．７９０（ｓ，３
Ｈ），２．０５１（ｄｄｄ，１３．４，６．３，３．５
ｈｚ，１Ｈ），２．１４２（ｄｔ，１３．４，６．９ｈ
ｚ，１Ｈ），２．３１４（ｓ，３Ｈ），２．６５８
（ｄ，５．５ｈｚ，２Ｈ），３．７７５（ｔｄ，５．
３，３．２ｈｚ，１Ｈ），４．１７１（ｄｔ，６．３，
３．２ｈｚ，１Ｈ），６．１３４（ｔ，６．９ｈｚ，１
Ｈ），７．６３９（ｓ，１Ｈ）． Ｂ． 結合 例１Ｂからの生成物（４．１４ｇ，１０．０ｍｍｏ
ｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．２１ｇ，１
０．５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（３．０９ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）を１００
ｍｌの無水塩化メチレン中で室温下で１時間かきまぜ
た。混合物を氷中で冷却し、得られた沈殿をろ過によっ
て除去した。残渣を５０ｍｌの冷却塩化メチレンですす
いだ。１つにまとめたろ液を、１つの流れとして、Ａか
らの生成物（３００ｍｌの絶対エタノール中２．６８
ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。室温で９０
分間かきまぜた後、反応混合物をストリッピングして１
００ｍｌの塩化メチレンに取り、２×１００ｍｌの水で
洗った。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッ
ピングした。残渣を塩化メチレン溶液としてシリカゲル
のカラム（６．５×３０ｃｍ）にかけ、カラムを２０：
１塩化メチレン／エタノールで溶離した。溶離は、１
０：１塩化メチレン／エタノール中に漬けたシリカゲル
上でのＴＬＣによってモニタリングした。純粋な生成物
を含む画分を保持し、混合された画分は再びクロマトグ
ラフィーにかけた。純粋生成物の溶液を１つにまとめ、
ストリッピングし、痕跡量の溶媒を十分な真空乾燥によ
って除き、薄黄色の堅固な泡としての生成物を得た
（３．９７ｇ，６１％）。（この非晶質固体については
満足のできる燃焼分析を行なうことができなかった。） ［α］D 25（エタノール中、ｃ＝０．９６）：＋５０．
８°． ＩＲ（ＫＢｒ）：１７６８，１６９１，１６１０，１４
９０，１４２０，１２０５および１１５０ｃｍ-1． ＦＡＢ−ＭＳ（チオグリセロール・マトリックス）ｍ／
ｅ ６０６ （Ｍ−ＣＨ3 ＣＨ2 Ｏ）． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：（新たに形成された第三ア
ミド結合周りの回転異性体の３：１混合物を示した）．
δ（主及び副）１．０３８（ｍ，３Ｈ），１．７８０お
よび１．８００（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｍ，２Ｈ），
２．０４（ｍ，２Ｈ），２．２３（ｍ，２Ｈ），２．２
９１（ｓ，６Ｈ），２．６８３および２．７１１（ｓ，
３Ｈ），２．８９５および２．８５９（ｑ，６ｈｚ，２
Ｈ），３．５−３．２（ｍ，２Ｈ），３．８０５および
３．５７（ｍ，１Ｈ），４．０３２および３．９８
（ｍ，１Ｈ），５．２４９および５．２９５（ｄ，３．
６ｈｚ，１Ｈ），６．１１６および６．０１２（ｔ，
６．９ｈｚ，１Ｈ），７．１−６．９（ｍ，４Ｈ），
７．４６７および７．１８５（ｓ，１Ｈ），７．６−
７．５（ｍ，２Ｈ），１１．２７５および１１．３３２
（ｓ，１Ｈ）． 例 １３ 保護された、染料（Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ）標識ヌクレオシド
ホスホラミジトの調製 例１１からの生成物（２．６１ｇ，４．００ｍｍｏｌ）
をベンゼンに取り、凍結し、凍結乾燥した。３２ｍｌの
無水塩化メチレン、無水ジイソプロピルエチルアミン
（２．８ｍｌ，１７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロ
ピルメチルホスホンアミド塩化物（１．１５ｍｌ，５．
９ｍｍｏｌ）をこの順序に加え、得られた混合物をアル
ゴン雰囲気下で１５分かきまぜた。反応混合物を予め振
盪された１６０ｍｌの酢酸エチルと８０ｍｌの炭酸水素
ナトリウム水溶液との混合物に加え、振盪し、層を分離
した。有機層を８０ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液８
０ｍｌで２回洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリ
ップした。残渣をシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上
でクロマトグラフィーにかけ、溶離溶媒としては４５：
４５：１０塩化メチレン／酢酸エチル／トリエチルアミ
ンを用いた。溶離物を同じ溶媒中に漬けたシリカゲル上
でのＴＬＣによりモニタリングした。生成物を含む画分
をストリップし、痕跡量の溶媒を十分な真空乾燥によっ
て除くと薄黄色の堅固な泡（２．８９ｇ）として生成物
が得られた。生成物の31Ｐ ＮＭＲは、第三アミド結合
の周りの回転異性（６：１）及び３価のリンの周りのジ
アセロメリズム（１：１）に起因する４つの生成物の混
合物を示した。（スペクトルはまた、１３重量％のＮ，
Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミド性の酸の混入
をも示した。この物質は、生成物のオリゴヌクレオチド
合成への使用を妨げなかった。） 補正収率：７７％．31 Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１４７．８１及び１４
６．９９（ｓ，主）並びに１４８．１８及び１４７．７
５（ｓ，副）．
【図面の簡単な説明】
【図１】それぞれ異なるが近似する波長の発光エネルギ
ーを発する異なる、光源からの放射エネルギーの存在を
検出するための、この発明に従って構築されたシステム
の部分ブロック、部分ダイアグラムレイアウトを示す
図。
【図２】第１図のシステムに用いることができる単一の
電気泳動ゲルを模式的に示す図。
【図３】第１図のシステムに用いられる染料発光光線と
二色フィルターの透過／反射特性との関係を示す図。
【図４】検出された発光ピークを評価するために用いら
れるデータ処理工程のフローダイアグラムを、図５およ
び６と共に示す図。
【図５】検出された発光ピークを評価するために用いら
れるデータ処理工程のフローダイアグラムを、図４およ
び６と共に示す図。
【図６】検出された発光ピークを評価するために用いら
れるデータ処理工程のフローダイアグラムを、図４およ
び５と共に示す図。
【図７】標識された塩基Ｔ，Ｇ，Ａ及びＣについて、時
間の関数として得られた典型的な検出器信号を示す図。
【図８】蛍光標識鎖ターミネーターのブロックダイアグ
ラムを示す図。
【図９】二色フィルターに代えて用いられる２つのフィ
ルターの染料発光放射とパスバンドとの関係を示す図。
【符号の説明】
１０…板、１２…プラスチック支持体、１８，２４…緩
衝液。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 19/10 19/20 // Ｃ０７Ｄ 311/82 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (72)発明者 ルデイ・ジョアン・ダム アメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19350、ランデンバーグ、クイーン・レー ン ３ (72)発明者 チャールス・ウイリアム・ロバートソン・ ジュニア アメリカ合衆国、デラウエア州 19732、 ロックランド、ピー・オー・ボックス 154 (72)発明者 フランク・ワーデン・ホッブス・ジュニア アメリカ合衆国、デラウエア州 19809、 ウイルミントン、プライアー・ロード 2227 − エフ (72)発明者 ジョージ・レナード・トレイナー アメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19342、グレン・ミルズ、マーシャル・ロ ード ７

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】時間的及び／又は空間的分離の後に異なる
    種から発射される放射エネルギーの存在及びそれらの種
    の同一性を検出するためのシステムであって、 種の性質の関数として第１のセンスにおいて大きさが異
    なる第１の信号を発生するための、種のスペクトルに応
    答的な手段と、 種の性質の関数として、第１のセンスとは異なる第２の
    センスにおいて大きさが異なる第２の信号を発生するた
    めの、種のスペクトルに対して応答的な手段と、 第１
    及び第２の信号の関数の比率に対応する第３の信号であ
    って、その大きさがそれぞれの種の同一性を示すものを
    得るための、第１及び第２の信号に対して応答的な手段
    とを具備するシステム。
  2. 【請求項２】前記種は、放射エネルギーを発することが
    できるレポーターで共有結合的に標識されたＤＮＡ断片
    であり、ＤＮＡ断片を分離するための手段を含む請求項
    １記載のシステム。
  3. 【請求項３】前記レポーターは下記構造を有する請求項
    ２記載のシステム。 【化１】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示
    す）
  4. 【請求項４】ＤＮＡ断片は、鎖終結現象によって導入さ
    れた３′末端残基にそのレポーターを共有結合している
    請求項３記載のシステム。
  5. 【請求項５】異なるレポーターの励起領域内にある出力
    波長を有するレーザーを含む請求項４記載のシステム。
  6. 【請求項６】ＤＮＡ断片は、鎖終結現象によって導入さ
    れた３′末端残基にそのレポーターを共有結合している
    請求項２記載のシステム。
  7. 【請求項７】前記第１及び第２の信号を発生するための
    手段は、 波長の関数として変化する第１及び第２の透過特性を有
    する、スペクトルを透過するための手段であって、種か
    らの発光が導かれるように配置され得るものと、 第１
    及び第２の透過発光光線をそれぞれ受容するように配置
    することができ、それらの強度に応じた第１及び第２の
    信号を発生し、それぞれの種の存在を示す第１及び第２
    の検出器とを有する請求項１記載のシステム。
  8. 【請求項８】装置特性は、第１の透過特性から第２の透
    過特性への遷移点を、レポーターの発光スペクトルのほ
    ぼ中間付近に有する請求項７記載のシステム。
  9. 【請求項９】透過手段は二色フィルターである請求項８
    記載のシステム。
  10. 【請求項１０】共有結合的にレポーターで標識されたＤ
    ＮＡ断片又は他の分子を分離する手段を含む請求項７記
    載のシステム。
  11. 【請求項１１】前記レポーターは下記構造の発光部分を
    有する請求項１０記載のシステム。 【化２】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示
    す）
  12. 【請求項１２】時間的及び／又は空間的分離の後に異な
    る種から発射される放射エネルギーの存在及びスペクト
    ルを発光するそれらの種の同一性を検出するための方法
    であって、 種の性質に応じて種々のセンスにおいて異なる発光エネ
    ルギーの関数を得る工程と、 種の同一性を示す、これらの関数の比率を求める工程と
    を含む方法。
  13. 【請求項１３】異なるセンスは大小の発光振幅からなる
    請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記関数は、波長の関数として変化する
    透過／反射特性を有する装置に発光放射エネルギーを透
    過させることによって得られ、該装置は二色フィルター
    である請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記種はレポーターで共有結合的に標識
    されたＤＮＡ断片である請求項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記レポーターは下記構造を有する請求
    項１５記載のシステム。 【化３】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示
    す）
  17. 【請求項１７】ＤＮＡ断片は、鎖終結現象によって導入
    された３′末端残基にそのレポーターを共有結合してい
    る請求項１６記載のシステム。
  18. 【請求項１８】以下の構造を有する化合物。 【化４】 （ただし、(a) ｎは２又は３、Ｒ1 はＨ、低級アルキ
    ル、フッ素、塩素、ヨウ素、低級アルコキシ又はシアノ
    基、Ｒ2 はハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基、あ
    るいは(b) ｎは２又は３、Ｒ1 は低級アルキル、フッ
    素、ヨウ素、低級アルキル、シアノ基、Ｒ2 はＨ又は低
    級アルキル基、あるいは(c) ｎは２又は３、Ｒ1 は臭
    素、Ｒ2 は低級アルキル、フッ素、塩素、ヨウ素、低級
    アルキル又はシアノ基、あるいは(d) ｎは２、Ｒ1 は塩
    素、Ｒ2 はＨ又は低級アルキル基、あるいは(e) ｎは
    ３、Ｒ1 は臭素、Ｒ2 はＨ又は臭素を示す）
  19. 【請求項１９】下記の構造を有する化合物。 【化５】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基、
    Ｒ′はアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基を示
    す）
  20. 【請求項２０】３−ヒドロキシ−６−オキソ−９−カル
    ボキシアルキル−６Ｈ−キサンテンをピリジン中で無水
    カルボン酸で処理し、次いでアルコールで処理する工程
    を含む請求項１９記載の化合物の製造方法。
  21. 【請求項２１】下記の構造を有する化合物。 【化６】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基、
    Ｒ′はアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基、Ｘ
    は良好な離脱基を示す）
  22. 【請求項２２】下記構造を有する化合物。 【化７】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基、
    Ｒ′はアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基、Ｘ
    は良好な離脱基を示す）
  23. 【請求項２３】下記構造を有する化合物。 【化８】 （ただし、ＸはＨ、ＮＨ2 又はハロゲン、ＹはＨ、ハロ
    ゲン、ＯＨ、又はＮＨ2、あるいはＸ及びＹは共にＯＨ
    を示し、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニ
    ン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサンチ
    ンを示し、ピリミジンはＮ1 位を介して糖部分に連結さ
    れ、プリンとデアザプリンはＮ9 位を介して糖部分に連
    結され、Ａは 【化９】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示
    す）で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂがデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる）
  24. 【請求項２４】下記構造を有する化合物。 【化１０】 （ただし、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニ
    ン、７−デアザグアニン、又は７−デアザヒポキサンチ
    ンを示し、ピリミジンはＮ1 位を介して糖部分に連結さ
    れ、プリンとデアザプリンはＮ9 位を介して糖部分に連
    結され、 Ａは 【化１１】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 は水素、低級ア
    ルキル、ハロゲン、低級アルコキシ又はシアノ基を示
    す）で示される蛍光体であり、 破線はＢとＡとを連結するリンカー及び任意的なスペー
    サーを示し、Ｂがピリミジンである場合にはその連結は
    ピリミジンの５位を介して行なわれ、Ｂがデアザプリン
    である場合には、連結はデアザプリンの７位を介して行
    なわれる）
  25. 【請求項２５】下記構造を有する化合物。 【化１２】 （ただし、ｎは２又は３、Ｒ1 及びＲ2 はＨ、低級アル
    キル、ハロゲン、低級アルコキシ、又はシアノ基、Ｒ′
    はアルキル又はアリール基、Ｒ″はアルキル基、Ｒ4 は
    Ｈ又は３価のリン部分、Ｂはヘテロ環塩基を示す）
  26. 【請求項２６】下記構造を有する化合物。 【化１３】 （ただし、Ｒ1 及びＲ2 は水素又はメチル基を示す）
  27. 【請求項２７】下記構造を有する化合物。 【化１４】 （ただし、Ｒ1 及びＲ2 は水素又はメチル基を示す）
  28. 【請求項２８】下記構造を有する化合物。 【化１５】 （ただし、Ｒ1 及びＲ2 は水素又はメチル基を示す）
  29. 【請求項２９】下記構造を有する化合物。 【化１６】 （ただし、Ｒ1 及びＲ2 は水素又はメチル基を示す）
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