JPS60220860A - オリゴヌクレオチドの分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＤＮＡ配列決定法に関するものである。

ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）の
信頼しうる配列分析法の開発は、組換ＤＮＡ技術及び遺
伝子工学の成功に対する１つの鍵となっている。近代分
子生物学の他の技術と共に使用すれば、核酸配列決定は
動物、植物及びウィルスのゲノムを所定の化学構造を有
する個々の遺伝子に分解しかつ分析することを可能にす
る。

生物学的分子の機能はその構造により決定されるので、
遺伝子の構造の決定は遺伝情報のこの基本単位を有用な
方法で最終的に処理するのに重要である。遺伝子を単離
しかつ特性化することができれは、これらは原蛋白質が
有するものとは異なる性質を有する遺伝子生成物（すな
わち蛋白質）の産生を可能にするようなその構造におけ
る所望の変化をもたらすべく改変することができる。天
然若しくは合成の遺伝子が組み込まれる微生物を化学「
工場」として使用し、たとえばインタフエロン、成長ホ
ルモン及びインシュリンのような貴重なヒト蛋白質を多
量に産生させることができる。

植物に遺伝情報を与えて、これらを過酷な環境条件で生
存させ、或いはそれ自身の増殖媒介を生産することがで
きる。

近代の核酸配列決定法の開発は、各種の技術における並
行的な開発を含んでいる。その１つは、ＤＮＡの小型乃
至中型ストランドを細菌プラスミド、バクテリオファー
ジ、或いは小動物のウィルスにクローン化させる簡単か
つ確実な方法の出現であった。これは、化学分析するの
に充分な量で純ＤＮＡの産生な可能にした。他の開発は
、オリゴヌクレオチドをその寸法に応じて高度に分解分
離するためのゲル電気泳動法の完成であった。しかしな
がら、鍵となる概念的開発は一連の寸法群のクローン化
されかつ精製されたＤＮＡ断片を生成する方法の導入で
あり、これら断片はその種々な長さのコレクションにお
いて原ＤＮＡ分子を構成するヌクレオチドの配列を決定
゛するのに必要とされる情報を含んでいる。これら断片
群を生成させるための２つの異なる方法が広範に使用さ
れており、その１つはサンガーにより開発されたもの〔
エフ・サンガー、ニス・ニツクレン及びニー・アール・
クールソン、プロシーディング・ナショナル・アカデξ
−・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻第５４６３頁（１９
７７）及びニー・ジエー・エッチ・スミス、メンツヅ・
イン・エンチモロジー、第６５巻、第５６−５８０頁（
１９８０）：］であり、もう１つ゛はマキサム及びギル
バートにより開発されたもの〔ニー・エム・マキサム及
びダフリュー・ギルバート、メソツズ・イン・エンチモ
ロジー、第６５巻、第４９９−５５９頁（１９８０）：
１である。

サンガーにより開発された方法をジデオキシ連鎖末端法
と呼ぶ。この方法の最も一般的に使用される変法におい
ては、ＤＮＡ断片をたとえばＭ１３のような単一鎖ＤＮ
Ａファージにクローン化させる。これらのファージＤＮ
Ａは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片による補完
ストランドのプライム合成に対する離型として使用する
ことができる。このプライマーは合成オリゴヌクレオチ
ド又は制限断片のいずれかであって、クローン化挿入体
の３′末端近くでＭ１３ベクターの領域に特異的にヒブ
リド化する原組換ＤＮＡから単離される。

４種の配列決定反応のそれぞれにおいて、プライム合成
は４種の可能なデオキシヌクレオチドの１種のジデオキ
シ同族体を充分量で存在させて行なわれ、その結果成長
連鎖はこれらの「元端部」ヌクレオチドの組み込みによ
り任意に末端化される。

ジデオキシ型対デオキシ型の相対濃度は、ゲル電気泳動
により分離させうる全ての可能な鎖長に対応する末端化
が生ずるように調整される。４種のプライム合成反応の
それぞれから得られる生成物を、次いで電気泳動により
ポリアクリルアミドゲルの個々の飛跡で分離する。成長
連鎖中に組み込まねた放射能標識を使用して、各市７気
泳動飛跡にてＤ　Ｎ　Ａ　ハターンの放射能写真像を発
生させる。

クローン化ＤＮＡにおけるデオキシヌクレオチドの配列
を、４つの軌跡におけるバンドパターンを検査して決定
する。

マキサム及びギルバ−ドにより開発された方法は精製Ｄ
ＮＡの化学処理を用いて、サンガー法により得られるも
のと同様な一連の寸法群のＤＮＡ断片を生成させる。３
′末端若しくは５′末端のいずれかが放射能性リン酸塩
で標識された単−鎖若しくは二重鎖ＤＮＡをこの方法に
より配列決定することができる。４種の反応群において
、４種のヌクレオチド塩基のうち１種若しくは２種につ
き化学処理により開裂を引き起こさせる。開裂は３段階
の過程を含む。すなわち、塩基の改変、改変された塩基
の糖成分からの除去、及びこの糖成分におけるストラン
ド切断である。反応条件は、末端標識された生成断片の
大部分がゲル電気泳動により分離しうる寸法範囲（典型
的には１〜４００個のヌクレオチド）となるように調整
される。電気泳動、放射能写真及びパターン分析が、サ
ンガー法につき行なわれるとほぼ同様忙行なわれる。

（化学断片化はこれが行なわれる都度、２つのＤＮＡ片
を必らず生ずるが、末端標識を有する片のみが放射能写
真で検出される）。

これらＤＮＡ配列決定法の両者は、広範に使用されかつ
それぞれ幾つかの変法を有する。それぞれの場合、１回
の反応群から得られる配列の長さは、主として電気泳動
に使用したポリアクリルアミドゲルの分離能により制限
される。典型的には、１回のゲル飛跡群から２００〜４
００個の塩基を解読することができる。これら両方法は
成功するがｌ太な欠点を有し、これは主として電気泳動
法に伴なう問題である。１つの問題は、ゲルにおけるＤ
ＮＡバンドを位置決定するため標識として放射性標識を
使用する必要があることである。燐−５２の短い半減期
、すなわち放射性標識剤の不安定性を処理せねばならず
、また放射能廃棄及び取り扱いの問題を処理せねばなら
ない。より重要なことに、放射能写真像術の性質（放射
性ゲルパンドのフィルム像はバンド自身よりも幅広いも
のである）及び４種の異なるゲル飛跡の間のバンド位置
の比較（これはバンド移動度の点で均一に挙動したり、
しなかったりする）は１、観察されるノ（ンドの分離、
すなわちゲルから解読しうる配列の長さを制限する。さ
らに、飛跡毎の不規則性は放射能写真の自動化走査を困
難圧し、すなわち現在ではこれらの不規則性の補償はコ
ンピュータによるよりも肉眼の方が良好である。放射能
写真のこの人為的「解読］の必要性は時間がかかり、面
倒かつ誤差の多いものである。さらＫ、隣接するバンド
を分離するＫは解離が不充分である際にも電気泳動を終
了しうるよう、実際に電気泳動を行ないながらゲルパタ
ーンを解読することは不可能であり、成る基準化した時
間で電気泳動を終了させかつ配列解読を開始しうる前に
放射能写真が現像されるのを待たねばならない。

本発明は、ＤＮＡ配列決定法における電気泳動工程に伴
なうこれら及びその他の問題を解決し、かつ当業界に著
しい進歩をもたらすものと信じら要するに、本発明はＤ
ＮＡ配列決定操作の際に生ずるＤＮＡ断片の新規な電気
泳動分析法であって、４種の発色剤若しくは螢光発生剤
の群を使用して、配列決定化学により生じたＤＮＡ断片
を標識しかつゲルによる電気泳動で分離される際に断片
の検出及び特性化を可能にする。この検出は、標識バン
ドがゲル中を移動する際に、これらを監視しうる吸収若
しくは螢光光度計を使用する。

さらに本発明はＤＮＡ断片の新規な分析装置（系）をも
含み、この装置（系）は、 発色性若しくは螢光性標識されたＤＮＡ断片（これら断
片は種々異なって標識される）の原料と、 電気泳動ゲルを含む帯域と、 標識ＤＮＡ断片を前記領域へ導入する手段と、標識’Ｄ
　Ｎ　Ａ断片がゲル中を移動して、これＫより分離され
る際に前記標識ＤＮＡ断片を監視し又は検出する光度測
定手段と からなっている。

本発明の目的は、ＤＮＡの新規な配列分析法を提供する
ことである。

本発明の他の目的は、ＤＮＡ断片の新規な分析装＃（系
）を提供することである。

特に１本発明の目的は、ＤＮＡの配列分析に対する改良
方法を提供することである。

本発明のこれら及びその他の目的及び利点は、添付図面
を参照して以下の詳細な説明から明らかとなるであろう
。

サンガー法と共に使用するための標識プライマーの設計 サンガーのジデオキシ連鎖末端法に基づく方法を含めＤ
ＮＡ配列決定の従来法においては、単一の放射性標識、
すなわち燐−３２を使用して全てのバンドをゲル上で同
定する。これは、４種の合成反応で生じた断片群を別々
のゲル飛跡にかけることを必要とし、異１よる飛跡に：
ｔ６けるバンド移動度を比較することに伴なう問題が生
ずる。この問題は、本発明において、それぞれ異なる最
大吸収若しくは螢光を有する４柿の発色剤若しくは螢光
発生剤の群を使用することにより解決される。これら標
識のそれぞれを、断片ストランドの合成を開始させるの
に使用するプライマーへ化学結合させる。次いで、それ
ぞれ標識されたプライマーをジデオキシヌクレオチドの
１種と組み合せ、これを使用してＤＮＡポリメラーゼの
クレノー断片によるプライム合成反応に使用する。

プライマーは次の特性を持たねばならない：（１）ポリ
メラーゼにより連鎖延長させるため遊離のりヒドロキシ
ル基を持たねばならない。（２）クローン化挿入体の独
特の領域５′に補完的でなければならない。（３）ヒプ
リド化して独特の安定二重体を形成するのに充分な長さ
でなければならない。（４）発色団又は螢光発色剤はヒ
プリド化を妨げたり、或いはポリメラーゼによる３′末
端延長を妨げてはならない。

上記条件１．２及び３は、Ｍ１５ベクターを用いるサン
ガー型配列決定に一般に使用される数種の合成オリゴヌ
クレオチドプライマーにより満たされる。この種のプラ
イマーの１つは１２ｍｅｒ５’Ｔ　ＣＡ　ＣＧ　Ａ　Ｃ
Ｇ　１’　ｉ’　Ｇ　１’　３　’であり、ここでＡ。

Ｃ，Ｇ及びＴはＤＮＡの４種の異なるヌクレオチド成分
を示し、Ａはアデノシン、Ｃはシトシン、Ｇはグアノシ
ン　ｔｒはチミジンを、示す。

発色性若しくは螢光性標識の結合に対する化学は本出願
人による１９８３年１２月２０日付は出願の米国特許出
願第５６５，０１０号に記載されており、その開示を参
考のためここに引用する。使用する方法は、オリゴヌク
レオチドプライマーの合成における最後の伺加として５
′末端に脂肪族アミノ基を導入することであるっこの反
応性アミノ基は次いで広範な種類のアミノ反応性発色剤
及び（ヌは）螢光発生剤と容易に結合することができる
。この方法は、上記条件４による標識プライマーにつき
好適である。

使用する４種の染料は、高い吸光係数及び（又は）比較
的高い螢光の収量を持たねばならない。

さらに、充分に分離された最大吸収及び（又は）最大放
出を持たねばならない。この種の４種のアミン反応性染
料の代表的なものは次の通りであるイソチオシアン酸フ
ルオレセイン（ＦＩ’ｌ’Ｃ。

λ烏、＝４９５、λ謳、＝５２０、ε４９５””×１０
４）、イソチオシアン酸エオシン（ＥＩ’ｒＣ１傭’：
、＝５２２、λ譜、＝５４３、ε５２２＝８×１０４）
、インチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＭＲＩ
ＴＣ１襠：、＝５５０、λ譜、＝５７８、ε５５０　＝
４　Ｘ　１０４　）、及び置換イソチオシアン酸ローダ
ミン（ＸＲＩＴＣ，λ烏、＝５８０、襠Ｗｘ＝６０４、
ε５８゜＝ｓｘ１ｏ’）であり、ここでλは波長（ナノ
メートル）を示し、Ｅｘは励起であり、Ｅｍは放出であ
り、ｍａｘは最大であ゛す、かつεはモル吸光係数であ
る。

これらの染料はＭ１３プライマーに結合しており、この
結合物を２０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動Ｋか
ける。標識されたプライマーは、ゲルにおけるその吸収
と螢光とにより見ることができる。４種の標識プライマ
ーは全て同一の電気泳動移動度を有する。染料結合され
たプライマーは、ＤＮＡに特異的にヒプリド化する能力
を保持し、これは配列決定反応に一般に使用される未訪
導化オリゴヌクレオチドを置換する能力により示される
。

マキサム／ギルバート法と共に使用するＤＮＡ末端標識 ＤＮＡ配列決定のマキサム／ギルバート法においては、
決定すべき配列を有するＤＮＡ片の末端を標識せねばな
らない。これは、従来、放射性ヌクレオシドを用いて酵
素的に行なわれている。本発明に開示する染料検出方式
と組み合せてマキサム／ギルバート法を使用するために
は、ＤＮＡ片を染料で標識せねばならない。これを行な
いうる１つの方法を第１図に示す。成る種の制限エンド
ヌクレアーゼは、いわゆるＤ　Ｎ　Ａ　ｉＦｌ裂の生成
物のような３１オーバーハングとして知られたものを生
成する。これらの酵素は、「付着性末端」すなわち二重
鎖ＤＮＡ片の末端における巣−鎖１）ＮＡの短い延長部
を生成する。この領域はＤＮＡの補完部分と融合し、こ
の部分は酵素リガーゼによって二ｌｌＤＮＡに共有結合
することができる。このようにして、ストランドの一方
が検出可能な成分に共有結合される。この成分は染料、
アミン基又は保護アミノ基とすることができる（これは
化学反応の後に保護解除されて染料と反応させることが
できる）。

配列決定反応 ジテオキシ配列決定反応はニー・ジェー・エッチ・スミ
スの標準法〔メソッズ・イン・エッチモロジー、卯、６
５巻、第５＜！−５８０頁（１９８０））で行なわれ、
ただし必要に応じ規模を拡大して検出用の各バンドにお
いて光分な信号強度を与えることができる。反応はそれ
ぞれ異なる反応につき異なる着色プライマーを使用して
行なわれ、たとｔばｒＡＪ　反応ＶＣつい−ＣはＦ　Ｉ
　’Ｉ’Ｃ１「Ｃ」反応についてはＥＩｉ’Ｃ，ＪＱＪ
反応については１’　Ｍ　ＲＩ　’Ｉ’　Ｃ、［Ｔ　Ｊ
反応についてはＸ　ＨＩ　１’　Ｃが使用される。配列
決定反応には、放射標識したヌクレオシド三リン酸を必
要としない。

マキサム／ギルバート配列決定反応は常法〔ニス°エフ
゛ギル、アルドリツチヒミカ・アクタ、第１６（５）巻
、第５９−６１頁（１９８５）〕で行なわわ、ただし末
端標識は１種若しくは４種の着色染料のいずれかとし、
或いは後に染料と反応しうる遊離基しくは保護アミノ基
である。

ゲル電気泳動 配列決定反応の１部を組み合せて、第２図に示した５Ｘ
ポリアクリルアミドカラム１０にその上方の貯槽１２か
ら充填する。混合物における４種の異なる反応物の相対
量は、染料／ＤＮＡ結合物のそれぞれからほぼ同じ螢光
性若しくは吸収性信号強度を与えるように実験的に町整
される。これは、染料吸光係数と染料螢光収量と検出器
感度などとにおける差を補償することができる。カラム
１０に、高電圧をかけて、ゲル中に標識ＤＮＡ断片を！
気泳動させる。単一ヌクレオチドだけ長さの異なる標識
ＤＮＡ断片を、このゲルマトリックスにおいて電気泳動
により分離する。ゲルカラム１０の底部或いはその近傍
において、ＤＮＡのバンドが互いに解離され、かつ検出
器１４を通過する（これ忙ついては、以下に詳細に説明
する）。

検出器１４はゲルにおけるＤＮＡの螢光又は発色バンド
を検出してその色を決定し、したがってそれらの対応す
るヌクレオチドを検出する。この常法はＤＮＡ配列を与
える。

、検出 ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いて長さＫより
分離された標識分子を検出し５る多くの異なる方法が存
在する。以下、４種の代表的方式を説明する。すなわち
、（：）種々異なる染料につき異なる波長の光により励
起された螢光の検出、（ＩＩ）種々異なる染料につき同
じ波長を有する光により励起された螢光の検出、Ｒ１１
ｌゲルからの分子の溶出及び化学発光による検出、並び
に（１９分子による光の吸収による検出。方式（１）及
び（ＩＩ）において、螢光検出器は次の要件を満たさね
ばならない。（ａｌ励起光線は、バンドの高さよりも実
質的に大きい高さをもってはならない。これは一般に０
．１〜ａ５簡の範囲である。このような幅狭い励起ビー
ムの使用はバンドの最大分離を可能にする。（ｂ）励起
波長を変化させて種々異なる染料のそれぞれの最大吸収
に適合させ、或いは４種の螢光発生剤を励起するが螢光
放出のいずれとも重ならないような単一の幅狭い高強度
の光バンドとすることができる。

（Ｃ）光学装置は、光検出器１４に対する散乱及び反射
励起光の光束を最小にせねばならない。散乱及び反射励
起光を遮光する光学フィルタは、励起波長が変化する際
に交換される。（ｄ）光検出器１４はかなり低いノイズ
レベルを持たねばならず、かつ染料の放出範囲全体（上
記の染料につき５００〜６００ｎｍ）にわたり良好なス
ペクトル反応と収量効率を持たねばならない。（ｅ）放
出された螢光を集光するための光学系は高い開孔度を持
たねばならない。これは螢光信号を最大化させる。さら
Ｋ、集光レンズの視野の深さは、カラムマトリックスの
全幅を含まねばならない。

２種の代表的な螢光検出装置（系）を第３図及び第４図
に示す。第３図の装置は、単一波長の励起又は複数波長
の励起のいずれにも適する。単一波長の励起の場合、フ
ィルタＦ４は各染料の放出波長ピークに集中する４種の
バンドパスフィルタの１つである。このフィルタは、数
秒毎に切替えて４種の螢光発生剤のそれぞれを連続監視
することができる。複数波長の励起の場合、光学素子Ｆ
３（励起フィルタ）、ＤＭ（二色鏡）及びＦ４（遮光フ
ィルタ）を−緒に切替える。この方法においては、励起
光と観察放出光との両者を変化させる。第４図の装置は
、単一波長の励起の場合に良好な配置である。この装置
は、可動部分を必要としないという利点を有し、４種の
染料の全てからの螢光を同時かつ連続的に監視すること
ができる。検出の第３の方法（上記１１１）は、ゲルの
底部から標識分子を溶出させてこれらをたとえばｔ２−
ジオキシエタンジオンのような化学発光を励起させる薬
剤と結合させ〔ニス・ケー・ギル、アンドリツチヒミカ
・アクタ、第ｉ６（ｇ）巻、第５９−６１頁（１９８５
）；ジー・ジエー・メルビン、Ｌｉｑ　−Ｃｈｒｏｍ、
、第６（９）巻、第１６０３−１６１６頁（１９８５）
かつこの混合物を４種の別々の波長で放出光を測定しう
る検出器に直接流入させることである（この検出器は第
４図に示したものと同様であるが、励起光源を必要とし
ない）。化学発光におけるパックグランド信号は螢光に
おけるよりもずっと低く、その結果、信号対ノイズの比
率が高くなりかつ感度が増大する。最後に、吸光度の測
定により測定を“行なうことができる（上記ｉＶ　）。

この場合、可変波長の光線をゲルに連層させ、標識分子
による光の吸収に基づくビーム強度の減少を測定する。

４種の染料の最大吸収に相当する種々異なる波長の光吸
収を測定することにより、どの染料分子が光路に存在し
たかを決定することができる。この種の測定の欠点は、
吸収測定が螢光測定よりも本質的に低い感度を有するこ
とである。

上記検出装置をコンピュータ１６に臨ませる。

検査の都度、コンピュータ１６は４種の着色標識のそね
ぞれにつきその時点の測定信号強度に比例する信号を受
ける。この情報は、どのヌクレオチドがその時点で観察
窓において特定長さのＤＮＡ断片の末端となるかを示す
。この時点の着色バンドの配列がＤＮＡ配列を与える。

第５図は、常法により得られる種類のデータ、並びに本
発明で説明した改良法により得られる樺類のデータを示
している。

以下の例により本発明を説明する。

μ− 第６図は１回に１種の染料を使用するＤＮＡ配列決定装
置のブロック図を示している。アルゴンイオンレーザ−
１００からのビーム（４８８０人）をビーム操作器１０
４によってポリアクリルアミドケル管（Ｋ料）１０２に
通す。このビームにより励起された螢光を低ｆ−数のレ
ンズ１ｏ６により集め、これを適当な組み合せの光学フ
ィルタ１０８及び１１０に通過させて散乱励起光を除去
し、光電子増培管（ＰＭＴ）１１２を用いて検出する。

信号はチャート記録紙で容易に検出される。

ＤＮＡ配列決定反応は、フルオレセイン標識したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて行なわれる。チャート
紙におけるピークは、配列決定反応で合成されかつ電気
泳動によりゲル管で分離された種々異なる長さを有する
フルオレセイン標識されたＤＮＡの断片に相当する。各
ピークは１ｇ−１５〜１０−１６　モルの程度のフルオ
レセインを含有しこれは放射性同位元素の検出を用いる
同等な配列決定用ゲルにおいて１バンド当りに得られる
ＤＮＡ量忙はば等しい。これは、螢光標識が配列決定反
応においてオリゴヌクレオチドプライマーから除去され
ず或いは分解されないことを証明する。さらに、これは
検出感度が、この手段によりＤＮＡ配列分析を行なうの
に充分であることを示している。

以上、本発明を夾施例により詳細に説明したが、本発明
はこれらのみに限定されない。

【図面の簡単な説明】

第１図は螢光標識でＤＮＡ断片を末端標識する１手段の
説明図であって、Ｐｓｉ　■及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ
は組換ＤＮＡ技術に一般的に使用される酵素であり、 第２図は自動化ＤＮＡ配列決定装置、すなわちゲル電気
泳動装置のブロック図であり、第６図は検出装置におけ
る光学配置の略図であって、Ｐはランプ源、Ｌｌは対物
レンズ、Ｆ２は集光レンズ、ＦｌはＵＶ遮光フィルタ、
Ｆ２は熱遮断フィルタ、Ｆ３はバンドパス励起フィルタ
、Ｆ４はロングパス放出フィルタ、ＤＭは二色鏡、Ｃは
ポリアクリルアミドゲル、ＰＭＴは光電子増培管であり
、 第４図は検出装置における他の光学配置の略図であって
、Ｆ１〜Ｆ４は種々異なる染料の最大放出に集中するバ
ンドパスフィルタであり、Ｐ１〜Ｐ４は光電子増培管で
あり、励起光はフィルタＦ１〜Ｆ４のいずれをも透過し
ないような波長であり、 第５図は第１図に示した配列のＤＮＡ配列決定により得
られた種類のデータの比較であり、第６図は本発明によ
る好適ＤＮＡ配列決定装置のブロック図である。 １０：カラム １２：貯槽 １４：検出器 １００：レーザー １１２：光電子増培管 ｒｎｖｎ　ＬＬ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、５ Ｉ）　４玖ＤＮＡ配列 ５′ＡＣＧＴＧＣＴＡＣＴＧＡ　３’ ＩＩ）　伎ｔ＝＃’ｒ’ｑ何トよ３直鐘ネ惰力乙列渚匁
に−と゛ノ伜賎ｍ）　Ａ［ｌＪ川に−と°Ｊ杵檄也代ψ
、ｂ−４すにγクリノーγミＦ′ケーｌしに一鉄ｋ　”
Ｓ　’Ｌ’Ｌ　％　ｔｎ　ｉ　’ｌ　ｒＭＡ　ｔ（＞臼
ロコＯム七乙′餐ルｆグーｊ−〆−ｆ・１す３毛で−Ｉ
ぐレドｎす１．ｔ、６−ち　ｎ１’を旭肛ｈ １も”４（Ｔ）、’、” 手続補正書（方式） 昭和６０年　５月１７日 特許庁長官　志　賀　学　殿・ 事件の表示　昭和６０年特願第　４１Ｂ８　号発明の名
称　ＤＮＡ配列決定法 補正をする者 事件との関係　特許出願人 代理人 住所　同　−１〕 補正の対象 願書の出願人の欄 姿任状及びその訳文　各１通 図　面　１通 明細書 補正の内容　別紙の通り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）連鎖末端法によるＤＮＡ配列決定法において、プ
   ライマーオリゴヌクレオチドを着色標識で標識すること
   を特徴とするＤＮＡ配列決定法。 （２）連鎖末端法によるＤＮＡ配列決定法において、プ
   ライマーオリゴヌクレオチドを螢光標識で標識すること
   を特徴とするＤＮＡ配列決定法。 （３）化学分解法によるＤＮＡ配列決定法において、Ｄ
   ＮＡ分子を着色標識で標識することを特徴とするＤＮＡ
   配列決定法。 （４）化学分解法によるＤＮＡ配列決定法において、Ｄ
   ＮＡ分子を螢光標識で標識することを特徴とするＤＮＡ
   配列決定法。 （５）連鎖末端法によるＤＮＡ配列決定法において、４
   種の配列決定反応Ａ、Ｃ，Ｇ及びＴのそれぞれに使用す
   るプライマーオリゴヌクレオチドがそこに異なる着色標
   識を付着させ、前記配列決定反応の１部を組み合せてポ
   リアクリルアミドゲルにて一緒に電気泳動させ、かつゲ
   ル上で分離した後に検出することを特徴とするＤＮＡ記
   列決定法。 （６）連鎖末端法によるＤＮＡ配列決定法において、４
   種の配列決定反応Ａ、Ｃ，Ｇ及びＴのそれぞれに使用す
   るプライマーオリゴヌクレオチドがそこに異なる螢光標
   識を付着させ、前記配列決定反応の１部を組み合せてポ
   リアクリルアミドゲルにて一緒に電気泳動させ、かつゲ
   ル上で分離した後に検出することを特徴とする１）ＮＡ
   配列決定法。 （力　化学分解法によるＤＮＡ配列決定法において、Ｄ
   ＮＡ分子を異なる着色標識で標識し、異なる着色ＤＮＡ
   を化学変化反応のそれぞれに使用し、前記配列決定反応
   の１部を組み合せてポリアクリルアミドゲルにて一緒に
   電気泳動させ、かつゲル上で分離した後に検出すること
   を特徴とするＤＮＡ配列決定法。 （８）化学分解法によるＤＮＡ配列決定法においてＤＮ
   Ａ分子を異なる螢光標識で標識し、異なる螢光性ＤＮＡ
   を化学変化反応のそれぞれに使用し、前記配列決定反応
   の１部を組み合せてポリアクリルアミドゲルにて一緒に
   電気泳動させかつゲル上で分離した後に検出することを
   特徴とするＤＮＡ配列決定法。 （９）化学分解法によるＤＮＡ配列決定法において、Ｄ
   ＮＡ分子をアミノ基で標識し、これを配列決定反応の後
   に染料分子に結合させることを特徴とするＤＮＡ配列決
   定法。 Ｑｌ）　異なる配列決定反応のそれぞれにおける生成物
   を異なる着色染料と結合させ、染料標識反応物の１部を
   組み合せてポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させ、
   かつゲル上で分離した後に検出することを特徴とする特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 ａυ　化学分解法によるＤＮＡ配列決定法において、Ｄ
   ＮＡ分子を保護アミン基で標識し、これを配列決定反応
   の後に保膿解除して染料分子に結合させることを特徴と
   するＤＮＡ配列決定法。 （１２１異なる配列決定反応のそれぞれＫおける生成物
   を異なる着色染料と結合させ、染料標識反応物の１部を
   組み合せてポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させ、
   かつゲル上で分離した後に検出することを特徴とする特
   許請求の帥囲第１１項記載の方法。 αｊ　発色性若しくは螢光性標識したＤＮＡ断片の原料
   と、 電気泳動ゲルを含有する帯域と、 前記標識ＤＮＡ断片を前記帯域へ導入する手段と、 前記標識ＤＮＡ断片が前記ゲル中を移動する際にこれを
   監視する光度測定手段と からなることを特徴とするＤＮＡ断片の新規な分析装置
   。 α４　光度測定手段が吸収光度計である特許請求の範囲
   第１３項記載の新規な装置。 α１　光度測定手段が螢光光度針である特許請求の範囲
   第１３項記載の新規な装置。 （ｌＩ　ＤＮＡ断片をアミノ基で標識し、これを染料分
   子に結合させる特許請求の範囲第１３項記載の新規な装
   置。 ａη　ＤＮＡ断片が異なる着色標識を有する特許請求の
   範囲第１６項記載の新規な装置。