JP4921641B2 - 新規のカルボピロニン蛍光色素 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、一般式（Ｉ）のカルボピロニン化合物の、分析物の検出方法における標識基としての使用、新規のカルボピロニン化合物ならびに該化合物の製造方法に関する。
【０００２】
化学的、医学的及び生物学的分析においては色素が標識−又は検出群として使用される。特に蛍光色素は最近重要になってきて、例えば放射性同位元素を標識のために使用する、しばしば高価な他の方法を排除している。
【０００３】
特にＤＮＡ配列決定の分野では最近蛍光測定法が行われ、放射性同位元素を使用する、これまで使用されている方法がほとんど完全に排除されている。
【０００４】
種々の蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＦＬＵＯＳ（フルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン誘導体等の有効性にも拘らず、背景蛍光、非特異的結合現象及び高価な測定装置の必要による諸問題は従来十分には解決され得なかった。
【０００５】
測定の感度及び精密度は背景蛍光及び非特異的結合によって減少される。さらに有効な蛍光塗料の場合には吸収極大は、安価で小寸法の光源、例えばＨｅ−Ｎｅ−レーザー及びレーザーダイオードの使用を不可能にする範囲に存在する。
【０００６】
したがって本発明の課題は、分析物の検出方法における標識基として使用することができ、従来技術の欠点を少なくとも部分的に避ける蛍光色素を供給することにあった。
【０００７】
この課題は、一般式Ｉ：
【０００８】
【化７】

【０００９】
〔式中
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立的に水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基又はカルボキシ基又はアルデヒド基又は２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基を表し、この炭化水素基はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、特にフェニル基又は／及びヘテロアリール基を含有しかつ場合によりヘテロ原子、例えば酸素原子、硫黄原子又は窒素原子又は／及び好ましくはハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、ホスホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ基又は／及びＣ_１〜Ｃ_４−アルコキシカルボニル基から選択された複数個の置換基を有し、
又は基Ｒ_１〜Ｒ_７の１個以上はそれぞれ隣接置換基と一緒に、１個以上の多重結合を有していてもよい環系を形成し、
Ｒ_８及びＲ_８ａはそれぞれ独立的に２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基、例えばＣ_１〜Ｃ_６−アルキル基、特にメチル、エチル、プロピル又は／及びブチル、又はアリール基又はヘテロアリール基、特にフェニル基を表し、これらの基は場合によりヘテロ原子、例えば酸素原子、硫黄原子又は窒素原子又は／及び好ましくはハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、ホスホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ基又は／及びＣ_１〜Ｃ_４−アルコキシカルボニル基から選択された複数個の置換基を有し、又はＲ_８及びＲ_８ａも１個の環系を有していてもよく、
Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１及びＲ_１２はそれぞれ独立的に２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基、例えばポリエーテル、フェニル、鎖中に１〜３個のＣ原子を有するフェニルアルキルを表し、これらの環状炭化水素基は場合によりヘテロ原子、例えば酸素原子、硫黄原子又は窒素原子又は／及び好ましくはハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、ホスホ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルコキシ基又は／及びアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有していてもよく、又は基Ｒ_９〜Ｒ_１２の１個以上はそれぞれ隣接置換基と一緒に１個以上の多重結合を有していてもよい環系を形成し、
−Ｎ（Ｒ_１１）（Ｒ_１２）は−ＯＲ _９ によって置換されていてもよく、かつ＝Ｎ（Ｒ _９ ）（Ｒ _１０ ）は＝Ｏによって置換されていてもよく、
かつＸは場合により電荷平衡のために存在するアニオンを表す〕
で示される化合物の、分析物の検出方法における標識基としての使用によって解決された。
【００１０】
一般式（Ｉ）の化合物は分析物を定性的又は／及び定量的に測定する方法における標識基として使用することができる。この測定は、水性液体、例えば体液、例えば血液、血清、血漿又は尿の試料、廃水試料又は食品中で行うことができる。該方法は、例えばキュベット中での湿式試験として又は適当な試薬キャリヤー上での乾式試験として行うことができる。この場合分析物の測定は単一の反応によって又は連続的な反応によって行うことができる。意外にも一般式（Ｉ）の化合物の使用は、分析物を測定するための化学的、特に医学的及び生物学的検出方法、特に核酸配列決定法ならびにタンパク質分析において極めて良好な成果を示した。
【００１１】
一般式（Ｉ）の化合物は、蛍光色素が標識基として適当な、当業者に周知のすべての化学的、医学的及び生物学的検出方法において使用することができる。このために一般式（Ｉ）の化合物は、一般に検出すべき分析物に対して特異的な受容体に共有結合される。これは一般に公知の方法で行われる。特異的受容体は適当なすべての化合物又は適当なすべての分子であってよく、好ましくはペプチド、ポリペプチド又は核酸である。これらの化合物又はこれらの化合物の複合体（Ｋｏｎｊｕｇａｔｅ）は例えば核酸−ハイブリダイゼーション法において、特に核酸の配列決定又は免疫化学的方法のために使用することができる。このような方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒに記載されている。
【００１２】
本発明の他の課題は、新規のカルボピロニン化合物を提供することであるが、該化合物は特に分析物の検出方法において標識基として使用するために適しており、簡単で、安価な方法で製造でき、容易に取扱うことができかつ従来技術の欠点を少なくとも部分的に回避する。
【００１３】
前記課題は、一般式Ｉ：
【００１４】
【化８】

【００１５】
〔式中Ｒ_１〜Ｒ_１２及びＸは上記したものを表す、ただしＲ_１〜Ｒ_３及びＲ_５〜Ｒ_７が水素であり、Ｒ_８、Ｒ_８ａ及びＲ_９〜Ｒ_１２がメチル基である場合には、Ｒ_４が水素、メチル、イソプロピル、フェニル、２，６−ジメチルフェニル又は２−イソプロペニルフェニルでないことを条件とする〕で示される化合物によって解決された。
【００１６】
化合物（Ｉ）の利点は、ほとんど任意の置換基変化によって個々の化合物の特性、例えば分光学的特性、吸収−及び蛍光極大の位置、溶解特性、蛍光量子収率及び−崩壊周期が著しく変化され、したがって所望のように選択されうることである。このようにして試料、例えば血清、血液又は血漿等の中の有害物質による妨害が低減され又は完全にすら回避される。式（Ｉ）の化合物の製造は自体公知の方法により行うことができる。しかし好ましくはこの合成は、特に次ぎに記載する、簡単で、安価な新規方法により行う。
【００１７】
化合物（Ｉ）の好ましい種類では、Ｒ_６とＲ_１１又は／及びＲ_７とＲ_１２、Ｒ_１とＲ_１０又は／及びＲ_２とＲ_９が架橋されていて、１個以上の多重結合を有していてもよい環系を形成する。好ましくは環系は５又は６員環を含む。
【００１８】
Ｒ_４は好ましくは水素、Ｃ_１〜Ｃ_６−アルキル又は芳香族環系を含む基、例えばカルボキシ基又は／及びハロゲンを含有する基、例えば２−カルボキシ−フェニル、２−カルボキシ−テトラクロロフェニル又はペンタフルオロフェニルを表す。Ｒ_８及びＲ_８ａは、好ましくはそれぞれ独立的にメチル、エチル又は／及び置換されたフェニルである。
【００１９】
特に好ましい化合物の種類の例は、一般式ＩＶａ〜ＩＶｅ：
【００２０】
【化９】

【００２１】
〔式中破線は場合により二重結合を表し、二重結合が存在する場合には破線により結合された基はなく、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_８ａ、Ｒ_９、Ｒ_１１、Ｒ_１２及びＸは上記定義のものと同じであり、Ｒは生じる場合には同じか又は異なっており、Ｒ_１〜Ｒ_７と同様にに定義されている〕で表される。
【００２２】
該化合物は、好ましくは共有結合を形成することのできる基、例えば−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、−ＯＨ又は／及び−ＳＨを有する。該化合物はこれらの結合基を介して公知法によりキャリヤー又は／及び生体分子に結合されうる。キャリヤーはあらゆる適当な材料、特に検出法にとって適当な材料、例えば多孔性ガラス、プラスチック、イオン交換樹脂、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体又は／及び親水性ポリマーから成っていて良い。生体分子は好ましくはペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、核酸類似物又は／及びハプテンから選択する。
【００２３】
意外にも吸収極大及び蛍光量子収率は、上記のキャリヤー及び生体分子への本発明の化合物の結合によって本質的には変化されない。
【００２４】
本発明の化合物の具体的な例は次ぎの第１表に記載してある。
【００２５】
【表１】

【００２６】
【表２】

【００２７】
【表３】

【００２８】
【表４】

【００２９】
【表５】

【００３０】
【表６】

【００３１】
【表７】

【００３２】
【表８】

【００３３】
【表９】

【００３４】
本発明の他の課題は、簡単に、環境認容的にかつ安価に実施できかつカルボピロニンの公知の製造方法の欠点を少なくとも部分的に回避する、カルボピロニン（Ｃａｒｂｏｐｙｒｏｎｉｎ）化合物の製造方法を提供することであった。
【００３５】
前記課題は本発明により、一般式（Ｉ）：
【００３６】
【化１０】

【００３７】
〔式中Ｒ_１〜Ｒ_１２及びＸは請求項１で記載したものを表す〕で示される化合物を製造するに当たり、一般式（ＩＩ）：
【００３８】
【化１１】

【００３９】
〔式中Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_８ａ、Ｒ_１１及びＲ_１２は上に定義したものと同じである〕で示される化合物又はＩＩの脱水生成物を、一般式ＩＩＩ：
【００４０】
【化１２】

【００４１】
〔式中Ｒ_１〜Ｒ_４、Ｒ_９及びＲ_１０は請求項１で定義したものと同じであり、Ｙはハロゲン、特に臭素、ヒドロキシ基又はチオ基を表す〕で示される化合物と、適当な溶剤中で酸性条件下で触媒の存在で反応させ、化合物ＩＩ又はそれらの脱水生成物と化合物ＩＩＩとの間に閉環によって形成される化合物を酸化によって反応させて構造Ｉを形成させることを特徴とする、一般式（Ｉ）の化合物の製造方法によって解決された。
【００４２】
該方法では、出発物質、生成物及び触媒、好ましくは三塩化ホウ素と相溶性がある、すべての適当な溶剤を使用することができる。溶剤は好ましくは非極性溶剤、特に塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン又はクロロホルムである。
【００４３】
酸としては常用の酸を使用することができる。酸は好ましくは無機酸、例えば硫酸、リン酸又はポリリン酸である。
【００４４】
酸化剤としては同様に常用の酸化剤を使用することができる。好ましくは酸化剤はテトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）である。
【００４５】
特に、該方法が中間生成物の単離なしに行うことができるのが有利である。これは時間−、作業−及び材料消費の低減をもたらす。
【００４６】
本発明を次ぎの実施例によって詳述する。図１、２、３および４は、本発明の化合物 ＡＺ２（１７）、ＡＺ１３（２０）、ＪＡ２６８（１６）及びＡＺ１１（２３）の吸収−及び蛍光スペクトルを示す。
【００４７】
実施例
Ａ．カルボピロニン化合物の本発明による製造方法
本発明方法の場合には、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジルスルファニル酸（ア−ロン（Ａａｒｏｎ）及びバーカー（Ｂａｒｋｅｒ）による方法（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３），２６５５）で使用される）を、４−ヒドロキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンと代え、触媒としての三塩化ホウ素溶液の存在でイソプロペニル誘導体と反応させてカプロピロニンを生成する。反応混合物を、中間生成物を単離することなく濃硫酸と反応させて色素のロイコ塩基（Ｌｅｕｋｏｂａｓｅ）を生成させる。アーロン及びバーカー（上記）の場合に使用する酸化剤・二酸化鉛をテトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）と代える。さらに酸化剤及びロイコ塩基から成るエタノール溶液を加熱して煮沸させる、酸化はすでに数分後に終了していることが薄層クロマトグラフィーにより認めることができる。
【００４８】
酸化後に１０％過塩素酸ナトリウム溶液を加えかつ水を徐々に滴加することによってカルボピロニンをエタノール溶液から難溶の過塩素酸塩として沈殿させる。
【００４９】
新規合成法は一般的に使用することができる。アニリン−、インドリン−、テトラヒドロキノリン−及び１，２−ジヒドロキノリン誘導体からフィルスマイヤー（Ｖｉｌｓｍａｉｅｒ）合成によって次ぎの還元によって相応のアルコールが得られ、このものはイソプロペニル誘導体と反応されて色素を生成する。該合成はアーロン及びバーカーの合成とは異なり１段階で進行する、つまり中間生成物の単離は不要である。
【００５０】
次ぎに化合物・ＪＡ２６１、ＪＡ２６２、ＡＺ４、ＡＺ１４、ＪＡ２６７、ＪＡ２６８、ＪＦ１９、ＪＦ２２及びＪＦ１７の合成処方を記載する。
【００５１】
Ｂ．合成例
化合物ＪＡ２６１
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ヒドロキシメチル−フェニル）−４−アミノ酪酸エチルエステル １ｇ（４ｍモル）及び３−（イソプロペニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン０．７１ｇ（４．４ｍモル）を塩化メチレン２０ｍｌ中に溶かす。撹拌及び氷冷却下に１モルＢＣｌ_３溶液（塩化メチレン中）４ｍｌを徐々に加える。この溶液を室温で一晩中撹拌する。次ぎに反応混合物を濃硫酸（氷／メタノール−浴中で冷却されている）２０ｇ中に滴加する。均質溶液ができるまで撹拌する。塩化メチレンを回転蒸発器で留去する。硫酸溶液を冷却器に一晩中保存する。次ぎにこの溶液を氷上に注ぎ、稀薄苛性ソーダ溶液で中和する。水溶液からクロロホルムで抽出をする。集めた有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥し、濾過し、蒸発乾固する。残留物をエタノール２００ｍｌ中に取り、６０％過塩素酸塩１０滴及びテトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）０．１７ｇ（０．３９ｍモル）を加える。この溶液を３０分還流加熱する。冷却された溶液を水１ｌ中の過塩素酸ナトリウム２０ｇの溶液中に滴加する。一晩中撹拌する。緑色の光沢を有する沈殿を濾取して、乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００５２】
収量：０．５６ｇ
ＣＤＣｌ_３における^１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００５３】
【外１】

【００５４】
化合物ＪＡ２６２
ＪＡ２６１ １００ｍｇをアセトン２０ｍｌ、水４０ｍｌ及び２Ｎ塩酸２ｍｌから成る混合物中に溶かす。この溶液を還流加熱する（内部温度：６４℃）。２４時間後に溶液を冷却し、１０％の過塩素酸ナトリウム水溶液１０ｍｌを加える。沈殿物を濾取し、乾燥する。
【００５５】
収量：０．０４ｇ
化合物ＡＺ４
４−（５−ヒドロキシメチルインドリン−１−イル）−酪酸エチルエステル１．００ｇ（４．２５ｍモル）及び３−（イソプロペニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン０．７６ｇ（４．２５ｍモル）を塩化メチレン１５ｍｌ中に溶かし、氷冷却下でヘキサン中の三塩化ホウ素の１モル溶液４．２５ｍｌ（４．２５ｍモル）を滴加する。反応混合物を室温で３０分撹拌する。次ぎに反応混合物を濃硫酸１０ｍｌ中に滴加し、室温で１時間撹拌する。濃赤色の反応混合物を氷冷却したエタノール１００ｍｌ中に滴加し、テトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）０．７８ｇ（１．８ｍモル）を加え、３分間加熱して煮沸させる。室温に冷却し、２０％過塩素酸ナトリウム溶液 ５０ｍｌを加える。次ぎに水３００ｍｌを滴加して色素を完全に沈殿させる。結晶質生成物を濾取し、乾燥器で真空下でＳＩＣＡＰＥＮＴ（登録商標）で乾燥させる。
【００５６】
収量：０．７ｇ
アセトン−ｄ_６における^１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００５７】
【外２】

【００５８】
化合物ＡＺ１４
ＡＺ４ ４ｇ（８ｍモル）を水３０ｍｌ及びアセトン２０ｍｌ中に溶かし、２Ｎ塩酸ｍｌを加える。反応混合物を１８時間還流加熱する。クロロホルム５０ｍｌを加え、有機相を分離する。さらにクロロホルムで３回抽出した後集めた有機相を水で洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。色素溶液を回転蒸発器により蒸発乾固し、次いでカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【００５９】
アセトン−ｄ_６における^１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００６０】
【外３】

【００６１】
化合物ＪＡ２６７
４−（６−ヒドロキシメチル−２，２，４−トリメチル−１，２−ジヒドロキノル−１−イル）−酪酸エチルエステル１．２ｇ（３．８ｍモル）及び３−（イソプロペニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン０．６８ｇ（３．８ｍモル）を塩化メチレン３０ｍｌ中に溶かす。撹拌及び氷冷却下に塩化メチレン中のＢＣｌ_３の１モル溶液４ｍｌを徐々に加える。この溶液を室温で２０分撹拌する。次いで反応混合物を濃硫酸２０ｍｌ中に滴加する。均質溶液ができるまで撹拌する。塩化メチレンを回転蒸発器により留去し、硫酸溶液を室温で１時間撹拌する。残留物を氷冷却したエタノール４００ｍｌ中に取る。それにテトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）１．２ｇ（２．７ｍモル）を加える。この溶液を短時間加熱煮沸し、冷却し、２０％過塩素酸溶液２００ｍｌを加える。次ぎに水５００ｍｌを滴加する。沈殿物を濾取し、乾燥器で乾燥する。
【００６２】
化合物ＪＡ２６８
ＪＡ２６７ １．８ｇを、アセトン５０ｍｌ、水５０ｍｌ及び２Ｎ塩酸５ｍｌから成る混合物中で６時間還流加熱する。溶剤を留去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
【００６３】
化合物ＪＦ１９
乾燥テトラヒドロフラン１０ｍｌ中の２，１０−ビス−（ジメチルアミノ）−アントロン５０ｍｇ（０．１６ｍモル）の溶液に、アルゴン保護ガス雰囲気内で室温でジエチルエーテル中の３Ｍメチルマグネシウム臭化物溶液０．２７ｍｌ（０．８１ｍモル）を滴加する。反応終了後に氷−水−浴中で冷却し、反応混合物をエタノール５０ｍｌ中に溶かし、トリフルオロ酢酸で酸性化する。この溶液をクロロホルム５０ｍｌ及び水５０ｍｌから成る混合物中で懸濁する。有機相を分離し、回転蒸発器により蒸発乾固し、エタノール中に溶かす。次ぎに過塩素酸ナトリウムの２５％水溶液１００ｍｌ中に滴加する。この滴加終了後さらに水３００ｍｌを滴加する。沈殿する色素を濾取し、真空乾燥する。
【００６４】
収量：０．０４ｇ
化合物ＪＦ２２
リチウム粉末（ナトリウム０．５％、金属社会（Ｍｅｔａｌｌｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ））１１ｍｇ（１．６ｍモル）をアルゴン保護下に乾燥ジエチルエーテル２ｍｌ中で懸濁する。これにジエチルエーテル４ｍｌ中の１−ブロム−２，６−ジエチルベンゾール０．１７ｇ（０．８ｍモル）の溶液を撹拌下に滴加する。この滴加終了後に室温で１５分撹拌する。懸濁液をガラス綿により濾過して残存しているリチウム残部を除去する。これによって得られた溶液を室温で乾燥テトラヒドロフラン１０ｍｌ中の２，１０−ビス−（ジメチルアミノ）−アントロン５０ｍｇ（０．１６ｍモル）の溶液中に滴加する。反応の終了後に氷−水−浴中で冷却し、反応混合物をエタノール５０ｍｌ中で溶かし、トリフルオロ酢酸で酸性化する。この溶液をクロロホルム５０ｍｌ及び水５０ｍｌから成る混合物中で懸濁する。有機相を分離し、回転蒸発器により蒸発乾固し、シリカゲルによりカラムクロマトグラフィー精製する。色素画分を回転蒸発器により蒸発乾固した後、エタノール中に溶かし、次いで過塩素酸ナトリウムの２５％水溶液１００ｍｌ中に滴加する。次いで水３００ｍｌをさらに滴加する。沈殿する色素を濾取し、真空乾燥する。
【００６５】
収量：０．０２ｇ
化合物ＪＦ１７
２−（２−ブロモフェニル）−４，４−ジメチル−２−オキサゾリン０．１４ｇ（０．５５ｍモル）を保護ガス（アルゴン）下にテトラヒドロフラン７．５ｍｌ中に溶かし、−７８℃に冷却する。これにヘキサン酸中のｔ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液０．７ｍｌ（１．１ｍモル）を滴加すると、温度は−７５℃以下になっている。滴加終了後１５分間撹拌する。この溶液に乾燥テトラヒドロフラン２ｍｌ中の２，１０−ビス−（ジメチルアミノ）−アントロン３４ｍｇ（０．１１ｍモル）を加える。この際温度は−７０℃超えるべきではない。次ぎに加温して−６０℃にし、３時間撹拌する。冷却浴を除去し、室温に加温する。２４時間後に氷−水−浴中で冷却し、反応混合物をエタノール５０ｍｌ中に溶かし、トリフルオロ酢酸で酸性化する。この溶液をクロロホルム５０ｍｌ及び水５０ｍｌから成る混合物中で懸濁する。有機相を分離し、回転蒸発器により蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィーにより精製する。色素画分を回転蒸発器により蒸発乾固し、エタノール中に取り、次ぎに過塩素酸ナトリウムの２５％水溶液１００ｍｌ中に滴加する。滴加終了後になお水３００ｍｌを滴加する。沈殿する色素を濾取して真空乾燥する。
【００６６】
化合物ＡＺ１８
１．段階：
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−トリフェニルカルビノール
マグネシウム２．８ｇ（０．１２ｍモル）及びジエチルエーテル（無水）１０ｍｌにブロモベンゾール２．６ｇ（０．０２モル）を加える。反応を開始するために少し加温する。反応開始は反応混合物の濁りにより認めることができる。次ぎにブロモベンゾール１６．２ｇ（０．１モル）をエーテル１５ｍｌ中に溶かし、反応混合物中に滴加する。１時間還流加熱すると、マグネシウムはほとんど完全に溶解する。氷浴で冷却後に無水エ−テル１５ｍｌ中の３−ジメチルアミノ安息香酸メチルエステル１０ｇ（０．０５５モル）から成る溶液を滴加する。この滴加後に反応混合物を２時間還流加熱し、冷却し、滴状に水を加えて加水分解する。水５０ｍｌ及びエーテル５０ｍｌを加え、白色沈殿が再び溶解するまで飽和塩化アンモニウム溶液を加える。水相からエーテルで抽出を行う。集めた有機相を飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄する。次ぎに硫酸ナトリウムにより乾燥し、溶剤を留去する。残存する単黄色油状物を次ぎの反応のために直接使用することができる。
【００６７】
２．段階：
ＡＺ １８
Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−ヒドロキシメチル−アニリン０．６ｇ（３ｍモル）及び３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−トリフェニルカルビノール０．９ｇ（３ｍモル）を塩化メチレン３０ｍｌ中に溶かす。撹拌及び氷冷却下に塩化メチレン中のＢＣｌ_３の１モル溶液４ｍｌを徐々に加える。この溶液を室温で２時間撹拌する。次ぎに反応混合物を７０％硫酸２０ｍｌ中に滴加する。塩化メチレンを回転蒸発器で留去し、硫酸溶液を室温で２０時間撹拌する。残留物を氷冷却したエタノール１００ｍｌ中に徐々に溶かす。さらにテトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）１．２ｇ（２．７ｍモル）を加える。この溶液を短時間加熱煮沸し、冷却しかつ過塩素酸ナトリウム２０％溶液１００ｍｌを加える。次いで水２５０ｍｌを滴加する。沈殿物を濾取し、乾燥器で乾燥する。
【００６８】
化合物ＪＦ ３０
１５％ｔ−ブチルリチウム溶液（ｎ−ペンタン中）１．８５ｍｌ（３．０５ｍモル）を−７８℃で、乾燥テトラヒドロフラン２０ｍｌ中の２−（４−ブロモフェニル）−４，４−ジメチル−２−オキサゾリン０．３９ｇの溶液に加えると、温度は−７０℃以下になっている。完全な添加後に乾燥テトラヒドロフラン３０ｍｌ中の３，６−ビス−（ジメチルアミノ）−アントロン１５０ｍｇ（０．４８ｍモル）を加えると、温度は−６０℃以下になっている。この溶液を室温に加温し、室温で１８時間撹拌する。氷−水−浴で冷却し、反応混合物をエタノール５０ｍｌ中に溶かし、トリフルオロ酢酸で酸性化する。この溶液をクロロホルム５０ｍｌ及び水５０ｍｌから成る混合物中で懸濁する。有機相を分離し、回転蒸発器により蒸発乾固し、シリカゲルによりカラムクロマトグラフィー精製する。色素を１５％エタノール性クロロホルムで溶離する。生成物相を回転蒸発器により蒸発乾固し、エタノール中に溶かし、次いで過塩素酸ナトリウムの２５％水溶液１００ｍｌ中に滴加する。滴加終了後になお水３００ｍｌを滴加する。沈殿する色素を濾取し、真空乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００６９】
収率：５０％（クロマトグラフィー後の結晶質物質）
化合物ＪＦ ３１
ＪＦ３０ ８０ｍｇ（０．１４ｍモル）を、２Ｍ塩酸及びアセトンから成る１：３混合物１０ｍｌ中で４０分還流加熱する。冷却し、クロロホルム及び水から成る１：１混合物５０ｍｌ中で懸濁する。水相を飽和炭酸水素ナトリウムで中和する。有機相を分離し、水相に２０％エタノール性クロロホルムで抽出を数回施す。集めた有機相を蒸発濃縮し、シリカゲルによりカラムクロマトグラフィー精製する。色素を２０％エタノール性クロロホルムで溶離する。生成物相を回転蒸発器により蒸発乾固した後エタノール中に溶かし、次いで過塩素酸ナトリウムの２５％水溶液中に滴加する。この滴加の終了後なお水３００ｍｌを滴加する。沈殿する色素を濾取し、真空乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００７０】
収率：７２％（クロマトグラフィー後の結晶質物質）
化合物ＪＦ ３２
ＪＦ３１ ７０ｍｇ（０．１２ｍモル）を、エタノール及び水１：１中の１０％水酸化ナトリウム溶液中で１時間還流加熱する。トリフルオロ酢酸でｐＨ＝８に調節し、有機相を分離する。水相から２０％エタノール性クロロホルムで数回抽出を行う。この抽出は、水相中にほとんどもう色素が存在しなくなる（酸性化によってテスト）まで幾度も反復する。一緒にした有機相をトリフルオロ酢酸でｐＨ＝２に調節し、蒸発濃縮し、シリカゲルによりカラムクロマトグラフィー精製する。該色素を１０％エタノール性クロロホルムで溶離する。生成物相を回転蒸発器により蒸発乾固した後、エタノール中に溶かし、次いで過塩素酸ナトリウムの２５％水溶液１００ｍｌ中に滴加する。この添加の終了後になお水３００ｍｌを滴加する。沈殿する色素を濾取し、真空乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００７１】
収率：５７％（クロマトグラフィー後の結晶質物質）
化合物ＪＦ４２
ＪＦ１７ ７０ｍｇ（０．１２ｍモル）を、エタノール／水（１：１）中の水酸化ナトリウム３ｇの溶液３０ｍｌ中で還流加熱する。冷却し、溶液を半濃縮した塩酸で中和する。該色素を次ぎに水を滴加して沈殿させる。生成物を濾取し、真空乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００７２】
化合物ＪＦ３６
６−（２−カルボキシベンゾイル）−Ｎ−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン２５．３ｇ（０．１モル）及びＮ−エチル−７−イソプロペニル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン２０．１（０．１モル）をジクロロメタン５００ｍｌ中に溶かし、五酸化リンを加える。２時間還流加熱し、冷却し、真空で溶剤を留去する。残留物に濃硫酸を加える。この溶液を室温で３０分撹拌する。そこで氷冷却したエタノール１０００ｍｌ中の硫酸溶液を加え、６０％過塩素酸５０ｍｌ及び５ｌを滴加する。沈殿した色素を濾取し、真空乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００７３】
化合物ＪＦ３７
６−（２−カルボキ−３，４，５，６−テトラクロロベンゾイル）−Ｎ−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン３９．１ｇ（０．１モル）及びＮ−エチル−７−イソプロペニル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン２０．１（０．１モル）をジクロロメタン５００ｍｌ中に溶かし、五酸化リン６０ｇを加える。２時間還流加熱し、冷却し、真空で溶剤を留去する。残留物に濃硫酸を加える。この溶液を室温で３０分撹拌する。次いで氷冷却したエタノール１０００ｍｌ中の硫酸溶液を加え、６０％過塩素酸５０ｍｌ及び５ｌを滴加する。沈殿した色素を濾取し、真空乾燥器で五酸化リンにより乾燥する。
【００７４】
Ｃ．複合体形成のための例
ＪＡ２６２−活性エステル（Ａｋｔｉｖｅｓｔｅｒ）
ＪＡ２６２ ０．１ｍモルをＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．２ｍモル及びジシクロヘキシルカルボジイミド０．２ｍモルと一緒にアセトニトリル２０ｍｌ中に溶かす。室温で４時間撹拌し、生成物混合物を蒸発濃縮する。精製をクロマトグラフィーにより行う （ＨＰＬＣ、ＲＰ１８）。
【００７５】
【化１３】

【００７６】
ＪＦ４３−マレインイミド
ＪＦ４３１００ｍｇ（０．１６ｍモル）を乾燥ＤＭＳＯ１０ｍｌ中に溶かし、無水マレイン酸酸１００ｍｇ（１ｍモル）を加える。この溶液を室温で２４時間撹拌する。過塩素酸ナトリウムの１０％水溶液５０ｍｌを滴加し、沈殿する色素を濾取する。この色素を酢酸ナトリウム２５ｍｇと一緒に無水酢酸５ｍｌ中に懸濁し、３０分間８０℃に加熱する。過塩素酸ナトリウムの１０％水溶液３０ｍｌを滴加する。該色素を濾取し、乾燥する。
【００７７】
【化１４】

【００７８】
ＪＦ４３−システイン−複合体
ＪＦ４３−マレインイミド７０ｍｇ（０．１ｍモル）をエタノール２０ｍｌ中に溶かし。システイン１２ｍｇ（０．１ｍモル）を滴加する。室温で３０分撹拌する。次ぎに過塩素酸ナトリウムの１０％水溶液５０ｍｌを滴加し、沈殿する色素を濾取して乾燥する。
【００７９】
【化１５】

【００８０】
ＪＡ２６２−ｄＵＴＰ−複合体
５−（３−アミノアリル）−ｄＵＴＰ １０μモルを０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ８）中に溶かし、アミン不含のジメチルホルムアミド１ｍｌ中のＪＡ２６２−活性エステル５μモルから成る溶液を加える。この溶液を室温で１５時間撹拌する。この溶液を真空で留去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する（ＲＰ１８）。
【００８１】
【化１６】

【００８２】
ＪＡ２６２−ジゴキシン−３−カルボキシメチルエーテル−ジアミノジオキサオクタン−複合体
（Ｄｉｇ−ＣＭＥ−ＤＡＤＯＯ）
ＪＡ２６２−活性エステル０．０２ｍモルを、アセトニトリル中のＤｉｇ−ＣＭＥ−ＤＡＤＯＯ ０．０２ｍモルと一緒に撹拌する。溶剤を留去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
【００８３】
【化１７】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明の化合物ＡＺ２（１７）の吸収−及び蛍光スペクトルを示す。
【図２】 図２は本発明の化合物ＡＺ１３（２０）の吸収−及び蛍光スペクトルを示す。
【図３】 図３は本発明の化合物ＪＡ２６８（１６）の吸収−及び蛍光スペクトルを示す。
【図４】 図４は本発明の化合物ＡＺ１１（２３）の吸収−及び蛍光スペクトルを示す。

Claims (28)

1. 一般式Ｉ：
   

   

   〔式中
   Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立的に水素、又は２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基を表し、この炭化水素基はアルキル基、アルケニル基、アリール基又は／及びヘテロアリール基を含有し、及びハロゲン、スルホ基、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、及びアミノ基から選択される複数個の置換基を有していてもよく、
   又は基Ｒ_１〜Ｒ_７の１個以上はそれぞれ隣接置換基と一緒に、１個以上の多重結合を有していてもよい５員環又は６員環を形成し、
   Ｒ_８及びＲ_８ａはそれぞれ独立的に、２０個までの炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、又は枝分れ又は環状炭化水素基又はアリール基であり、
   Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１及びＲ_１２はそれぞれ独立的に水素、２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、又は枝分れ又は環状炭化水素基、又はポリエーテルを表し、これらの炭化水素基はカルボキシ基、アミノ基、及びアルコキシカルボニル基から選択される１個以上の置換基を有していてもよく、又は基Ｒ_９〜Ｒ_１２の１個以上はそれぞれ隣接置換基と一緒に１個以上の多重結合を有していてもよい５員環又は６員環を形成し、
   −Ｎ（Ｒ_１１）（Ｒ_１２）は−ＯＲ _９ によって置換されていてもよく、かつ＝Ｎ（Ｒ _９ ）（Ｒ _１０ ）は＝Ｏによって置換されていてもよく、
   かつＸは電荷平衡のために存在するアニオンを表す〕
   で示される化合物の、分析物の検出方法における標識基としての使用。
2. Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、及びＲ_７におけるアリール基がフェニル基である、請求項１記載の使用。
3. Ｒ_８及びＲ_８ａにおける２０個までの炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基がＣ_１〜Ｃ_６−アルキル基である、請求項１記載の使用。
4. Ｃ_１〜Ｃ_６−アルキル基がメチル、エチル、プロピル及びブチルから選択される、請求項３記載の使用。
5. 化合物Ｉが検出すべき分析物に対して特異的な受容体に共有結合される、請求項１から４までのいずれか１項記載の使用。
6. 検出方法を核酸−ハイブリダイゼーション方法及び免疫化学的方法から選択する、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
7. 一般式Ｉ：
   

   

   〔式中
   Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立的に水素、又は２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基を表し、この炭化水素基はアルキル基、アルケニル基、アリール基又は／及びヘテロアリール基を含有し、及びハロゲン、スルホ基、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、及びアミノ基から選択される複数個の置換基を有していてもよく、
   Ｒ_８及びＲ_８ａはそれぞれ独立的に、２０個までの炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、又は枝分れ又は環状炭化水素基又はアリール基を表し、
   Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１及びＲ_１２はそれぞれ独立的に水素、２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、又は枝分れ炭化水素基、又はポリエーテルを表し、これらの炭化水素基はカルボキシ基、アミノ基、及びアルコキシカルボニル基から選択される１個以上の置換基を有していてもよく、又は基Ｒ_９〜Ｒ_１２の１個以上はそれぞれ隣接置換基と一緒に１個以上の多重結合を有していてもよい５員環又は６員環を形成し、
   −Ｎ（Ｒ_１１）（Ｒ_１２）は−ＯＲ _９ によって置換されていてもよく、かつ＝Ｎ（Ｒ _９ ）（Ｒ _１０ ）は＝Ｏによって置換されていてもよく、
   かつＸは電荷平衡のために存在するアニオンを表す、ただしＲ_１〜Ｒ_３及びＲ_５〜Ｒ_７が水素であり、Ｒ_８、Ｒ_８ａ及びＲ_９〜Ｒ_１２がメチル基である場合には、Ｒ_４が水素、ヒドロキシル、メチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、フェニル、ｏ−トリル、ｐ−トリル、２，６−ジメチルフェニル、２−ｔ−ブチルフェニル、２−イソプロペニルフェニル又は４−ジメチルアミノフェニルでないことを条件とする〕で示される化合物。
8. Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、及びＲ_７におけるアリール基がフェニル基である、請求項７記載の化合物。
9. Ｒ_８及びＲ_８ａにおける２０個までの炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基がＣ_１〜Ｃ_６−アルキル基である、請求項７記載の化合物。
10. Ｃ_１〜Ｃ_６−アルキル基がメチル、エチル、プロピル及びブチルから選択される、請求項９記載の化合物。
11. Ｒ_６とＲ_１１ 若しくはＲ _７とＲ_１２、Ｒ _６ とＲ _１１ 及びＲ _７ とＲ _１２ 、Ｒ_１とＲ₉若しくはＲ _２とＲ₁₀、又は、Ｒ _１ とＲ ₉ 及びＲ _２ とＲ ₁₀ が架橋されていて、１個以上の多重結合を有していてもよい、５員環又は６員環を形成する、請求項７記載の化合物。
12. 環系が５又は６員環を含む、請求項１１記載の化合物。
13. Ｒ_４が水素、Ｃ_１〜Ｃ_６−アルキル又は芳香族環系を表す、請求項１１又は１２記載の化合物。
14. Ｒ_８及びＲ_８ａが、それぞれ独立的にメチル、エチル又はフェニルである、請求項１１から１３までのいずれか１項記載の化合物。
15. 化合物が一般式ＩＶａ〜ＩＶｅ：
    

    

    〔式中破線は二重結合を表してもよく、二重結合が存在する場合には破線により結合された基Ｒはなく、
    Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_８ａ、Ｒ_９、Ｒ_１１、Ｒ_１２及びＸは請求項１〜７で定義したものと同じであり、
    Ｒは生じる場合には同じか又は異なっていてもよく、それぞれ独立的に水素、又は２０個までのＣ原子を有する飽和又は不飽和の直鎖、枝分れ又は環状炭化水素基を表し、この炭化水素基はアルキル基、アルケニル基、アリール基又は／及びヘテロアリール基を含有し、及びハロゲン、スルホ基、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、及びアミノ基から選択される複数個の置換基を有していてもよく、
    又はＲの１個以上はそれぞれ隣接置換基と一緒に、１個以上の多重結合を有していてもよい５員環又は６員環を形成する〕の１つに相当する、請求項１１から１３までのいずれか１項記載の化合物。
16. 化合物が共有結合を形成することのできる基を有する、請求項１１から１５までのいずれか１項記載の化合物。
17. 前記結合基が−ＣＯＯＨ及び−ＮＨ_２ から選択される、請求項１６記載の化合物。
18. 前記結合基を介してキャリヤー又は／及び生体分子に共有結合されている、請求項１７記載の化合物を有する複合体。
19. キャリヤーが、多孔性ガラス、イオン交換体樹脂、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体及び親水性ポリマーから選択されている、請求項１８記載の複合体。
20. 生体分子がペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、核酸類似体又は／及びハプテンから選択されている、請求項１８記載の複合体。
21. 一般式Ｉ：
    

    

    〔式中Ｒ_１〜Ｒ_１２及びＸは請求項１〜４で記載したものを表す〕で示される化合物の製造方法において、一般式ＩＩ：
    

    

    〔式中Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_８ａ、Ｒ_１１、Ｒ_１２は請求項１〜４で定義したものと同じである〕で示される化合物又はＩＩの脱水生成物を、一般式ＩＩＩ：
    

    

    〔式中Ｒ_１〜Ｒ_４、Ｒ_９及びＲ_１０は請求項１〜７で定義したものと同じであり、Ｙはハロゲン、又はヒドロキシ基又はチオ基を表す〕で示される化合物と、適当な溶剤中で酸性条件下で触媒の存在で反応させ、化合物ＩＩ又はそれらの脱水生成物と化合物ＩＩＩとの間に閉環によって形成される化合物を酸化によって反応させて色素を生成させることを特徴とする、一般式Ｉの化合物の製造方法。
22. ハロゲンが臭素である、請求項２１記載の方法。
23. 溶剤が無極性溶剤である、請求項２１記載の方法。
24. 無極性溶剤が塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン又はクロロホルムである、請求項２３記載の方法。
25. 触媒が三塩化ホウ素である、請求項２１から２４までのいずれか１項記載の方法。
26. 酸が硫酸、リン酸又はポリリン酸である、請求項２１から２５までのいずれか１項記載の方法。
27. 酸化剤がテトラブチルアンモニウムペリオデート（メタペリオデート）である、請求項２１から２４までのいずれか１項記載の方法。
28. 化合物（Ｉ）を中間生成物の単離なしに製造する、請求項２１から２７までのいずれか１項記載の方法。

Images