JP2966524B2 - 赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用 - Google Patents
赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用Info
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- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
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- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
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- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、長波長領域に吸収をもつ蛍光残基を有する
ヌクレオシド−５′−三リン酸及びホスホルアミダイ
ト、好ましくはその塩基部分またはリン原子にカルボシ
アニン基を有するヌクレオシド−５′−三リン酸及びホ
スホルアミダイト、ならびに核酸の標識、検出および配
列決定のためのそれらの使用に関する。
ヌクレオシド−５′−三リン酸及びホスホルアミダイ
ト、好ましくはその塩基部分またはリン原子にカルボシ
アニン基を有するヌクレオシド−５′−三リン酸及びホ
スホルアミダイト、ならびに核酸の標識、検出および配
列決定のためのそれらの使用に関する。
核酸は、遺伝情報の担体または伝達体として生物にお
いてきわめて重要なものである。F.Miescherによる核酸
の発見以来、核酸は広範囲の科学的な興味を刺激し、そ
れらの機能、構造および作用のメカニズムの解明に至っ
た。これらの基礎的な分子生物学的メカニズムの知識が
増えるにしたがって、近年、遺伝子の新しい組み合わせ
を追求することが可能になった。この技術は、例えば、
医学的診断および治療ならびに植物育種において新たな
可能性を開いた。
いてきわめて重要なものである。F.Miescherによる核酸
の発見以来、核酸は広範囲の科学的な興味を刺激し、そ
れらの機能、構造および作用のメカニズムの解明に至っ
た。これらの基礎的な分子生物学的メカニズムの知識が
増えるにしたがって、近年、遺伝子の新しい組み合わせ
を追求することが可能になった。この技術は、例えば、
医学的診断および治療ならびに植物育種において新たな
可能性を開いた。
これらの相互関係を理解し、そしてその問題を解くた
めに必須の手段は、核酸の検出、換言すれば核酸の特異
的検出および核酸の配列すなわち核酸の一次構造に関す
るものであったし、現在もそうである。
めに必須の手段は、核酸の検出、換言すれば核酸の特異
的検出および核酸の配列すなわち核酸の一次構造に関す
るものであったし、現在もそうである。
核酸の特異的検出性は、これらの分子が相互に作用す
る、すなわち、他の核酸と水素結合を介して塩基対を形
成することによりハイブリッドを形成するという特性に
基づく。従って、適切な手法で標識された、すなわち指
示基（indicator groups）を付与された核酸（プロー
ブ）を用いることにより相補的な核酸（ターゲット）を
検出することができる。
る、すなわち、他の核酸と水素結合を介して塩基対を形
成することによりハイブリッドを形成するという特性に
基づく。従って、適切な手法で標識された、すなわち指
示基（indicator groups）を付与された核酸（プロー
ブ）を用いることにより相補的な核酸（ターゲット）を
検出することができる。
核酸の一次構造（配列）の決定、すなわち複素環式塩
基の配列の決定は、配列決定技術によって行う。この配
列の知識もまた、分子生物学的研究および作業技術にお
いて、核酸の目標を定めた特異的な使用にとって必要条
件である。また、最終的に、配列決定は核酸相互の特異
的ハイブリッド形成の原理をも利用する。また、上述し
たように、標識された核酸断片も配列決定に使用され
る。
基の配列の決定は、配列決定技術によって行う。この配
列の知識もまた、分子生物学的研究および作業技術にお
いて、核酸の目標を定めた特異的な使用にとって必要条
件である。また、最終的に、配列決定は核酸相互の特異
的ハイブリッド形成の原理をも利用する。また、上述し
たように、標識された核酸断片も配列決定に使用され
る。
以上のことから、核酸の適当な標識は、いずれの検出
方法にとっても必須条件であるということは明白であ
る。
方法にとっても必須条件であるということは明白であ
る。
とりわけ、32Pまたは35Sなどの適当な同位体を用いる
放射性標識は、すでに早期の段階で配列決定に使用され
ていた。しかしながら、放射性試薬を使用することの欠
点が明らかである：そのような操作には特別の部屋の設
備および許可ならびに放射性廃棄物の管理されたやっか
いな処分が必要である。放射性標識用の試薬は高価であ
る。そのような標識された試料の長期保管は上記核種の
半減期が短いために不可能である。
放射性標識は、すでに早期の段階で配列決定に使用され
ていた。しかしながら、放射性試薬を使用することの欠
点が明らかである：そのような操作には特別の部屋の設
備および許可ならびに放射性廃棄物の管理されたやっか
いな処分が必要である。放射性標識用の試薬は高価であ
る。そのような標識された試料の長期保管は上記核種の
半減期が短いために不可能である。
したがって、近年、これらの重大な欠点を回避する、
すなわち放射性標識から逃れるための多くの試みがなさ
れてきた。そうすることにおいて、かかるタイプの標識
の高い感度は可能なかぎり保持されなければならない。
事実、この場合、大きな改善がなされてきた〔例えば、
Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecu
les,C.Kessler（編集者）、“Springer Verlag Berlin,
Heidelberg"1992を参照のこと〕。
すなわち放射性標識から逃れるための多くの試みがなさ
れてきた。そうすることにおいて、かかるタイプの標識
の高い感度は可能なかぎり保持されなければならない。
事実、この場合、大きな改善がなされてきた〔例えば、
Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecu
les,C.Kessler（編集者）、“Springer Verlag Berlin,
Heidelberg"1992を参照のこと〕。
ハプテン（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）、酵
素（アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼな
ど）または蛍光染料（フルオレセインまたはローダミン
など）は、特に数ある中で非放射性指示分子（non−rad
ioactive indicator molecules）として成功しているこ
とが証明されている。
素（アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼな
ど）または蛍光染料（フルオレセインまたはローダミン
など）は、特に数ある中で非放射性指示分子（non−rad
ioactive indicator molecules）として成功しているこ
とが証明されている。
例えばジゴキシゲニンなどのハプテンでの標識は放射
能の感度の範囲に達するが、放射性標識に類似のハプテ
ン標識核酸の直接的検出は不可能である。例えば、抗体
反応によって達成される次の検出反応が必要である。こ
の間接的な検出にはいくつかのステップ、すなわち多く
の時間と、経済上の費用が必要である。その検出反応の
ためにタンパク質を使用するので、非特異的結合を低減
するために阻止ステップおよび洗浄ステップによる固相
（膜、マイクロタイタープレート）の特別な処理が必要
である。それにもかかわらず、非特異的タンパク質結合
に起因する妨害バックグラウンド染色（interferingbac
kground colouration）が発生するため、この２ステッ
プ検出の感度は、通常、制限される。根本的に同様のこ
とが直接的酵素−標識核酸にあてはまる。
能の感度の範囲に達するが、放射性標識に類似のハプテ
ン標識核酸の直接的検出は不可能である。例えば、抗体
反応によって達成される次の検出反応が必要である。こ
の間接的な検出にはいくつかのステップ、すなわち多く
の時間と、経済上の費用が必要である。その検出反応の
ためにタンパク質を使用するので、非特異的結合を低減
するために阻止ステップおよび洗浄ステップによる固相
（膜、マイクロタイタープレート）の特別な処理が必要
である。それにもかかわらず、非特異的タンパク質結合
に起因する妨害バックグラウンド染色（interferingbac
kground colouration）が発生するため、この２ステッ
プ検出の感度は、通常、制限される。根本的に同様のこ
とが直接的酵素−標識核酸にあてはまる。
蛍光標識核酸を用いると、上述した間接的検出の該欠
点が生じない。原則として蛍光を励起することにより直
接的検出が可能であり、可視化して適当な装置（蛍光顕
微鏡、スキャナー）で測定することができる。しかしな
がら、この場合も細胞および色素、脂肪、タンパク質と
いったような試験される生体材料の組織成分の自己蛍光
（autofluorescence）が妨害する。特に固体担体物質
（例えば、ナイロン膜）を使用すると、その固有の蛍光
によりそのような妨害が生じて、検出を複雑にするか、
または妨げる。
点が生じない。原則として蛍光を励起することにより直
接的検出が可能であり、可視化して適当な装置（蛍光顕
微鏡、スキャナー）で測定することができる。しかしな
がら、この場合も細胞および色素、脂肪、タンパク質と
いったような試験される生体材料の組織成分の自己蛍光
（autofluorescence）が妨害する。特に固体担体物質
（例えば、ナイロン膜）を使用すると、その固有の蛍光
によりそのような妨害が生じて、検出を複雑にするか、
または妨げる。
原則としてこれらの問題を解決するには、励起および
放出が680nmより大きい波長領域すなわち近赤外（NIR）
領域で生ずる染料を使用することである。上述の妨害蛍
光はこれらの環境下では無意味である。さらに重要な利
点は、かなり耐久性のある安価なレーザーダイオードを
励起に使用することができるということである。
放出が680nmより大きい波長領域すなわち近赤外（NIR）
領域で生ずる染料を使用することである。上述の妨害蛍
光はこれらの環境下では無意味である。さらに重要な利
点は、かなり耐久性のある安価なレーザーダイオードを
励起に使用することができるということである。
従って、例えば、DNA断片の蛍光標識後のレーザーお
よびセンサーを用いた光電測定によるDNA配列決定の技
術がある出願（US 4,729,947）の主題である。この方法
では、IR染料で標識されたオリゴヌクレオチドがいわゆ
るサンガー法におけるプライマーとして公知の手法で使
用され、それらはかかる方法においては新しい相補的核
酸鎖の合成のためのスターターとして挙動する。しかし
ながら、この方法の欠点は−−配列決定されるDNAに依
存するが−−特異的標識プライマーを各場合ごとに幾度
も新たに合成しなければならない、すなわちそのような
標識プライマーを多数合成しなければならないというこ
とである。この標識されたオリゴマープライマーの合成
は、第一に非標識オリゴヌクレオチドを合成し、続いて
第二の反応においてシグナル（レポーター）基を化学的
に結合しなければならないので、高価で時間もかかる。
よびセンサーを用いた光電測定によるDNA配列決定の技
術がある出願（US 4,729,947）の主題である。この方法
では、IR染料で標識されたオリゴヌクレオチドがいわゆ
るサンガー法におけるプライマーとして公知の手法で使
用され、それらはかかる方法においては新しい相補的核
酸鎖の合成のためのスターターとして挙動する。しかし
ながら、この方法の欠点は−−配列決定されるDNAに依
存するが−−特異的標識プライマーを各場合ごとに幾度
も新たに合成しなければならない、すなわちそのような
標識プライマーを多数合成しなければならないというこ
とである。この標識されたオリゴマープライマーの合成
は、第一に非標識オリゴヌクレオチドを合成し、続いて
第二の反応においてシグナル（レポーター）基を化学的
に結合しなければならないので、高価で時間もかかる。
従って、本発明の目的は、一般的で、簡単で、かつ特
異的な核酸の標識を可能にする化合物を製造することに
ある。
異的な核酸の標識を可能にする化合物を製造することに
ある。
今や、適切に標識されたヌクレオシド三リン酸をポリ
メラーゼを用いて取り込ませることにより核酸を新たに
合成し、それと同時に標識することができるということ
が判明した。デオキシリボ核酸（DNA）の分野において
は、これは、ニックトランスレーション法〔Rigby,P.W.
ら、（1977）J.Mol.Biol.113,237〕およびランダムプラ
イマー標識法〔Feinberg,A.P.＆ Vogelstein,B.（198
4）Anal.Biochem.137,266〕を用いてDNAポリメラーゼに
より、デオキシヌクレオチドを取り込ませることによっ
て達成され、リボ核酸の場合は、翻訳のラインに沿って
RNAポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを用いること
により達成される。核酸を標識するさらなる方法は、タ
ーミナルトランスフェラーゼおよびリボまたはデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸の補助を伴ういわゆる３′テ
ーリング反応（tailing reaction）によるものである。
メラーゼを用いて取り込ませることにより核酸を新たに
合成し、それと同時に標識することができるということ
が判明した。デオキシリボ核酸（DNA）の分野において
は、これは、ニックトランスレーション法〔Rigby,P.W.
ら、（1977）J.Mol.Biol.113,237〕およびランダムプラ
イマー標識法〔Feinberg,A.P.＆ Vogelstein,B.（198
4）Anal.Biochem.137,266〕を用いてDNAポリメラーゼに
より、デオキシヌクレオチドを取り込ませることによっ
て達成され、リボ核酸の場合は、翻訳のラインに沿って
RNAポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを用いること
により達成される。核酸を標識するさらなる方法は、タ
ーミナルトランスフェラーゼおよびリボまたはデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸の補助を伴ういわゆる３′テ
ーリング反応（tailing reaction）によるものである。
しかしながら、フルオレセインまたはジゴキシゲニン
（MW332または390）などの指示分子を付与されたヌクレ
オシド三リン酸は−−それらの天然の基質と対比すると
−−ポリメラーゼによる基質としての受け取りが相対的
に不完全であり、新しく合成された核酸への取り込みが
相対的に不完全である（Hoeltke,H,−J.ら（1990）Bio
l.Chem.Hoppe−Seyler 371,929）。
（MW332または390）などの指示分子を付与されたヌクレ
オシド三リン酸は−−それらの天然の基質と対比すると
−−ポリメラーゼによる基質としての受け取りが相対的
に不完全であり、新しく合成された核酸への取り込みが
相対的に不完全である（Hoeltke,H,−J.ら（1990）Bio
l.Chem.Hoppe−Seyler 371,929）。
従って、さらにいっそう高分子量（800〜1000）の指
示分子がポリメラーゼにより基質として受け取られ、核
酸に取り込まれることは期待できない。空間的に要求の
きびしい構造が付与されたこれらの分子は強い立体障害
のためにポリメラーゼによって転化されることはほとん
ど起こりそうもない。
示分子がポリメラーゼにより基質として受け取られ、核
酸に取り込まれることは期待できない。空間的に要求の
きびしい構造が付与されたこれらの分子は強い立体障害
のためにポリメラーゼによって転化されることはほとん
ど起こりそうもない。
驚くべきことに、今や、赤外染料で標識されたヌクレ
オシド三リン酸はT7 DNAポリメラーゼなどのポリメラー
ゼにより基質として受け取られ、核酸に取り込まれるこ
とが見いだされた。従って、本発明による化合物は新規
である。
オシド三リン酸はT7 DNAポリメラーゼなどのポリメラー
ゼにより基質として受け取られ、核酸に取り込まれるこ
とが見いだされた。従って、本発明による化合物は新規
である。
本発明のさらなる目的は、上述の本発明による標識核
酸を用いて、そのように標識された核酸を、例えばナイ
ロン膜などの固体担体上、あるいは例えばマイクロタイ
タープレート内などの溶液中で直接的に検出することを
可能にする方法を見いだすことであった。
酸を用いて、そのように標識された核酸を、例えばナイ
ロン膜などの固体担体上、あるいは例えばマイクロタイ
タープレート内などの溶液中で直接的に検出することを
可能にする方法を見いだすことであった。
すでに上記したように、フルオレセインまたはテトラ
メチルローダミンなどの発蛍光団をもちいて核酸を標識
することの欠点は、担体物質の固有の蛍光が、その発蛍
光団の蛍光の測定を妨害することである。
メチルローダミンなどの発蛍光団をもちいて核酸を標識
することの欠点は、担体物質の固有の蛍光が、その発蛍
光団の蛍光の測定を妨害することである。
しかしながら、本発明によるIR染料で標識したヌクレ
オシド三リン酸を核酸の標識に使用すると、測定波長が
近赤外領域にあるのでそのような妨害はもはや無意味で
ある。
オシド三リン酸を核酸の標識に使用すると、測定波長が
近赤外領域にあるのでそのような妨害はもはや無意味で
ある。
本来の位置のハイブリッド形成による核酸検出の利点
は公知である。かかる方法において、標識試料またはプ
ローブは、蛍光顕微鏡で直接的に検出されるか、あるい
はハプテン標識の場合、さらなる操作ステップによって
免疫学的反応（ELISA）において検出される。このよう
な可視化は、通常、試料を、例えばナイロン膜上にまた
はマイクロタイタープレート内の液体均一相中で固定化
することにより達成される。この追加のステップはかな
り時間がかかり、高価である。したがって、このステッ
プを省略することが望まれている。
は公知である。かかる方法において、標識試料またはプ
ローブは、蛍光顕微鏡で直接的に検出されるか、あるい
はハプテン標識の場合、さらなる操作ステップによって
免疫学的反応（ELISA）において検出される。このよう
な可視化は、通常、試料を、例えばナイロン膜上にまた
はマイクロタイタープレート内の液体均一相中で固定化
することにより達成される。この追加のステップはかな
り時間がかかり、高価である。したがって、このステッ
プを省略することが望まれている。
適当なレーザーダイオードによるIR−蛍光標識核酸を
直接的に励起することの可能性および上述の担体物質の
自己蛍光に対する検出の不感受性により、簡単で費用に
対して最も効率のよい装置を使用することができる。免
疫学的検出反応は省略することができる。IR−標識核酸
は、適当なスキャナーまたはマイクロタイタープレート
リーダーの補助を伴うレーザー／検出器の併用によって
光学的手段で簡単に検出される。
直接的に励起することの可能性および上述の担体物質の
自己蛍光に対する検出の不感受性により、簡単で費用に
対して最も効率のよい装置を使用することができる。免
疫学的検出反応は省略することができる。IR−標識核酸
は、適当なスキャナーまたはマイクロタイタープレート
リーダーの補助を伴うレーザー／検出器の併用によって
光学的手段で簡単に検出される。
要約すると、本発明による赤外発蛍光団で標識したヌ
クレオシド５′−三リン酸をポリメラーゼ基質として使
用すると、核酸への直接的な酵素的取り込み、ならびに
配列決定のためにこのように標識された核酸を検出する
ことが可能となり、そして、その使用はまた、この組み
合わせにおいて新規であり、同時に本発明の一部をなす
in situハイブリッド形成をも許容する。
クレオシド５′−三リン酸をポリメラーゼ基質として使
用すると、核酸への直接的な酵素的取り込み、ならびに
配列決定のためにこのように標識された核酸を検出する
ことが可能となり、そして、その使用はまた、この組み
合わせにおいて新規であり、同時に本発明の一部をなす
in situハイブリッド形成をも許容する。
本発明の一般式： （式中、Ｂは複素環式塩基であるアデニン、グアニン、
ヒポキサンチン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−
グアニン、７−デアザ−ヒポキサンチン、７−デアザ−
８−アザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−グアニ
ン、７−デアザ−８−アザ−ヒポキサンチン、ならびに
チミン、シトシンおよびウラシルを示し、 Xnは４〜20原子を有する結合基を表し、 Sigは650〜800nmの励起波長をもつ蛍光分子を表し、 R1およびR2は、それぞれＨおよび／またはOHを表
す。） で表されるヌクレオシド５′−三リン酸は、修飾されて
いないヌクレオシドから出発して周知の方法により製造
される。これら、すなわちピリミジンヌクレオシドの場
合はウリジン、チミジンおよびシチジン、およびプリン
ヌクレオシドの場合はアデノシンおよびグアノシン、な
らびにそれに対応する７−デアザ−プリンおよび７−デ
アザ−８−アザプリンヌクレオシドは、適当な手法でＣ
−５またはＣ−６（ピリミジン）、Ｃ−８（プリン）、
Ｃ−８（３−デアザ−プリン）、Ｃ−７またはＣ−８
（７−デアザ−プリン）の位置で化学的に修飾され、そ
して最終的に５′−リン酸化される。
ヒポキサンチン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−
グアニン、７−デアザ−ヒポキサンチン、７−デアザ−
８−アザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−グアニ
ン、７−デアザ−８−アザ−ヒポキサンチン、ならびに
チミン、シトシンおよびウラシルを示し、 Xnは４〜20原子を有する結合基を表し、 Sigは650〜800nmの励起波長をもつ蛍光分子を表し、 R1およびR2は、それぞれＨおよび／またはOHを表
す。） で表されるヌクレオシド５′−三リン酸は、修飾されて
いないヌクレオシドから出発して周知の方法により製造
される。これら、すなわちピリミジンヌクレオシドの場
合はウリジン、チミジンおよびシチジン、およびプリン
ヌクレオシドの場合はアデノシンおよびグアノシン、な
らびにそれに対応する７−デアザ−プリンおよび７−デ
アザ−８−アザプリンヌクレオシドは、適当な手法でＣ
−５またはＣ−６（ピリミジン）、Ｃ−８（プリン）、
Ｃ−８（３−デアザ−プリン）、Ｃ−７またはＣ−８
（７−デアザ−プリン）の位置で化学的に修飾され、そ
して最終的に５′−リン酸化される。
修飾基は適当な長さのスペーサーおよび適当な活性化
された蛍光染料（例えば、イソチオシアン酸塩またはＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形）で置換され
得る末端第一級または第二級アミノ基から構成されるこ
とが都合がよい。
された蛍光染料（例えば、イソチオシアン酸塩またはＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形）で置換され
得る末端第一級または第二級アミノ基から構成されるこ
とが都合がよい。
そのような蛍光染料は活性化された形、すなわち、例
えば、アミノ基とよく反応する形、好ましくはイソチオ
シアン酸塩として使用される。その反応が完了した後、
その発蛍光団はヌクレオチドの修飾基にNHCS基を介して
共有結合される。
えば、アミノ基とよく反応する形、好ましくはイソチオ
シアン酸塩として使用される。その反応が完了した後、
その発蛍光団はヌクレオチドの修飾基にNHCS基を介して
共有結合される。
このようにして修飾されたヌクレオシドのリン酸化
は、文献〔すなわち、Yoshikawa,M.ら（1967）Tetrah.L
ett.50,5065〕に記載された公知の方法にしたがって三
塩化リンと反応させて一リン酸塩を生成させ、次いでピ
ロリン酸と反応させて所望の５′−三リン酸塩を生成さ
せることにより行われる。またそれに代わる方法とし
て、予め生成させたヌクレオシド５′−三リン酸の直接
修飾も可能である。
は、文献〔すなわち、Yoshikawa,M.ら（1967）Tetrah.L
ett.50,5065〕に記載された公知の方法にしたがって三
塩化リンと反応させて一リン酸塩を生成させ、次いでピ
ロリン酸と反応させて所望の５′−三リン酸塩を生成さ
せることにより行われる。またそれに代わる方法とし
て、予め生成させたヌクレオシド５′−三リン酸の直接
修飾も可能である。
発蛍光団は近赤外領域、すなわち600〜800nmの間に吸
収をもつ化合物である。例えば、カルボシアニンなどの
630nm〜780nmの化合物が好ましい。
収をもつ化合物である。例えば、カルボシアニンなどの
630nm〜780nmの化合物が好ましい。
上記の一般式において、好ましくは、Ｂは上述したと
おりであり、Xnは10〜15原子を有する結合基を表し、Si
gは一般式： （式中、R1およびR2はＨであるか、またはR1およびR2が
一緒になってベンゾインドール環に縮合したベンゼン環
を形成し、 R3は、ヌクレオチドとの結合がR5部位を介する場合は
Ｈであり、結合がR3部位を介する場合は−NHCS−であ
り、 R4およびR5はそれぞれ独立に−SO3Hまたは−SO3 -であ
り、 Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレン基であるか、また
はＹおよびR4が一緒になって３−スルホブチル基を形成
し、 Ｚは炭素数３〜５の線状アルキレン基であるか、また
はＺおよびR5が一緒になって３−スルホブチル基を形成
し、または、 結合がR5部位を介する場合はR5は−NHCS−であり、Ｚ
は炭素数３〜８の線状アルキレン基であり、R4は−SO3H
または−SO3 -であり、Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレ
ン基であるか、またはＹおよびR4が一緒になって３−ス
ルホブチル基を形成する。） で示されるカルボシアニンを表す。
おりであり、Xnは10〜15原子を有する結合基を表し、Si
gは一般式： （式中、R1およびR2はＨであるか、またはR1およびR2が
一緒になってベンゾインドール環に縮合したベンゼン環
を形成し、 R3は、ヌクレオチドとの結合がR5部位を介する場合は
Ｈであり、結合がR3部位を介する場合は−NHCS−であ
り、 R4およびR5はそれぞれ独立に−SO3Hまたは−SO3 -であ
り、 Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレン基であるか、また
はＹおよびR4が一緒になって３−スルホブチル基を形成
し、 Ｚは炭素数３〜５の線状アルキレン基であるか、また
はＺおよびR5が一緒になって３−スルホブチル基を形成
し、または、 結合がR5部位を介する場合はR5は−NHCS−であり、Ｚ
は炭素数３〜８の線状アルキレン基であり、R4は−SO3H
または−SO3 -であり、Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレ
ン基であるか、またはＹおよびR4が一緒になって３−ス
ルホブチル基を形成する。） で示されるカルボシアニンを表す。
すでに上記したように、ポリメラーゼを用いて標識ヌ
クレオシドを取り込ませるための上記の方法に加えて、
標識オリゴヌクレオチド、いわゆるプライマーの使用に
基づくさらなる方法が一般的である。すでに言及したよ
うに、多段階反応におけるこれらの分子の通常の合成は
きわめて時間がかかる。この方法において、オリゴヌク
レオチド合成が完了した後、追加のステップにおいてシ
グナル基をオリゴマーの５′−末端に結合させなければ
ならない。実際のオリゴヌクレオチド合成は自動合成装
置で行われるので、シグナル基の結合のステップもすで
にその合成装置内で行うことが可能になることも強く望
まれている。該オリゴヌクレオチド合成は単量体構成単
位を少しずつ結合させること、いわゆるヌクレオシドホ
スホルアミダイトから構成されるので、本発明のさらな
る目的は自動オリゴヌクレオチド合成における最終ステ
ップとしてシグナル基の直接取り込みを可能にする発蛍
光団ホスホルアミダイトを開発することであった。その
ようなNIR−染料−ホスホルアミダイトは今まで知られ
ておらず、発明的に新規である。
クレオシドを取り込ませるための上記の方法に加えて、
標識オリゴヌクレオチド、いわゆるプライマーの使用に
基づくさらなる方法が一般的である。すでに言及したよ
うに、多段階反応におけるこれらの分子の通常の合成は
きわめて時間がかかる。この方法において、オリゴヌク
レオチド合成が完了した後、追加のステップにおいてシ
グナル基をオリゴマーの５′−末端に結合させなければ
ならない。実際のオリゴヌクレオチド合成は自動合成装
置で行われるので、シグナル基の結合のステップもすで
にその合成装置内で行うことが可能になることも強く望
まれている。該オリゴヌクレオチド合成は単量体構成単
位を少しずつ結合させること、いわゆるヌクレオシドホ
スホルアミダイトから構成されるので、本発明のさらな
る目的は自動オリゴヌクレオチド合成における最終ステ
ップとしてシグナル基の直接取り込みを可能にする発蛍
光団ホスホルアミダイトを開発することであった。その
ようなNIR−染料−ホスホルアミダイトは今まで知られ
ておらず、発明的に新規である。
本発明を下記の実施例によってさらに詳細に説明す
る。
る。
実施例１ ５−（３−アミノアリル）−２′−デオキシ−ウリジン
−５′−三リン酸 この誘導体はLangerらのProc.Natl.Acad.Sci.USA（19
81）78,6635の記載にしたがって合成した。
−５′−三リン酸 この誘導体はLangerらのProc.Natl.Acad.Sci.USA（19
81）78,6635の記載にしたがって合成した。
実施例２ 無水−11−フェノキシ−10,12−プロピレン−3,3,3′,
3′−テトラメチル−4,5−ベンズインド−インドトリカ
ルボシアニン−１−（４−スルホブチル）−１′−（３
−アミノプロピル）−チオノ−［５−（３−アミノアリ
ル）−２′−デオキシウリジン−５′三リン酸］ ジメチルホルムアミド1ml中の無水−11−フェノキシ
−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′−テトラメチル−4,
5−ベンズインド−１−（４−スルホブチル）−１′−
（３−イソチオシアノプロピル）−インドトリカルボシ
アニンNa塩50mgの溶液を、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液
（pH8.5）2ml中の５−アミノアリル−dUTP−Li433mg（6
0μmol）の溶液に添加して、その反応混合物を遮光しな
がら室温で約15時間放置した。その後、濾紙電気泳動
（0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5）によれば、出
発物質の大部分が反応していた。所望の物質を単離する
ために、反応混合物を水約50mlで希釈して、深緑色の溶
液を塩化物型のDEAE Sephadex A−25を含むイオン交換
カラムに注いだ。生成物を、1M LiClに対する水の直線
グラジエントでカラムから溶離し、生成物画分を減圧で
濃縮して、RP18物質上の逆相クロマトグラフィーによっ
て脱塩した。凍結乾燥後、所望の三リン酸塩６μmol（1
0％）を得た。
3′−テトラメチル−4,5−ベンズインド−インドトリカ
ルボシアニン−１−（４−スルホブチル）−１′−（３
−アミノプロピル）−チオノ−［５−（３−アミノアリ
ル）−２′−デオキシウリジン−５′三リン酸］ ジメチルホルムアミド1ml中の無水−11−フェノキシ
−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′−テトラメチル−4,
5−ベンズインド−１−（４−スルホブチル）−１′−
（３−イソチオシアノプロピル）−インドトリカルボシ
アニンNa塩50mgの溶液を、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液
（pH8.5）2ml中の５−アミノアリル−dUTP−Li433mg（6
0μmol）の溶液に添加して、その反応混合物を遮光しな
がら室温で約15時間放置した。その後、濾紙電気泳動
（0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5）によれば、出
発物質の大部分が反応していた。所望の物質を単離する
ために、反応混合物を水約50mlで希釈して、深緑色の溶
液を塩化物型のDEAE Sephadex A−25を含むイオン交換
カラムに注いだ。生成物を、1M LiClに対する水の直線
グラジエントでカラムから溶離し、生成物画分を減圧で
濃縮して、RP18物質上の逆相クロマトグラフィーによっ
て脱塩した。凍結乾燥後、所望の三リン酸塩６μmol（1
0％）を得た。
スペクトルデータ:Emissionmax786nm、720nm（肩）、
238nm 実施例３ 無水−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′−テトラメチル
−1,1′−ビス（３−スルホブチル）−インドトリカル
ボシアニン−11−（４−アミノ）−フェノキシ−チオノ
−［８−（５−アミノペンチルアミノ）−２′−デオキ
シ−アデノシン−５′−三リン酸］（「IRD−dATP」） この誘導体は、８−アミノペンチルアミノ−dATP38mg
（60μmol）および無水−10,12−プロピレン−3,3,3′,
3′−テトラメチル−1,1′−ビス（３−スルホブチル）
−11−（４−イソチオシアノ）−フェノキシ−インドト
リカルボシアニンNa塩50mg（60μmol）から、実施例２
で述べた方法にしたがって調製した。化合物３μmolが
得られた。
238nm 実施例３ 無水−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′−テトラメチル
−1,1′−ビス（３−スルホブチル）−インドトリカル
ボシアニン−11−（４−アミノ）−フェノキシ−チオノ
−［８−（５−アミノペンチルアミノ）−２′−デオキ
シ−アデノシン−５′−三リン酸］（「IRD−dATP」） この誘導体は、８−アミノペンチルアミノ−dATP38mg
（60μmol）および無水−10,12−プロピレン−3,3,3′,
3′−テトラメチル−1,1′−ビス（３−スルホブチル）
−11−（４−イソチオシアノ）−フェノキシ−インドト
リカルボシアニンNa塩50mg（60μmol）から、実施例２
で述べた方法にしたがって調製した。化合物３μmolが
得られた。
スペクトルデータ:Emissionmax770nm、697nm（肩）、
279nm 実施例４ T7−DNAポリメラーゼの基質としてのIRD−dATPの使用 鋳型DNA3μｇを、反応緩衝液（200mMトリス−HCl、pH
7.5、100mM MgCl2、250mM NaCl）２μｌ、M13/pUCプラ
イマー1pMおよびH2O7μｌの混合物中で37℃で15分間イ
ンキュベートした。
279nm 実施例４ T7−DNAポリメラーゼの基質としてのIRD−dATPの使用 鋳型DNA3μｇを、反応緩衝液（200mMトリス−HCl、pH
7.5、100mM MgCl2、250mM NaCl）２μｌ、M13/pUCプラ
イマー1pMおよびH2O7μｌの混合物中で37℃で15分間イ
ンキュベートした。
DTT1μｌ（100mM）、標識混合物（IRD40−dATP10μ
Ｍ、dCTP、dGTPおよびdTTPをそれぞれ１μＭ）２μｌ、
H2O1μｌおよびT7−DNAポリメラーゼ２μｌ（2.5U/μ
ｌ）を標識反応のために添加して、室温で10分間インキ
ュベートした。
Ｍ、dCTP、dGTPおよびdTTPをそれぞれ１μＭ）２μｌ、
H2O1μｌおよびT7−DNAポリメラーゼ２μｌ（2.5U/μ
ｌ）を標識反応のために添加して、室温で10分間インキ
ュベートした。
続いて、DNA配列決定に使用するために、終止混合物
（ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP）を添加することにより終
止反応を行った。
（ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP）を添加することにより終
止反応を行った。
実施例５ 無水−11−フェノキシ−10,12−プロピレン−3,3,3′,
3′−テトラメチル−4,5−ベンズインド−インドトリカ
ルボシアニン−１−（４−スルホブチル）−１′−（３
−アミノプロピル）−チオノ−［５−（３−アミノアリ
ル）−ウリジン−５′−三リン酸］ この化合物は５−アミノアリル−UTP（実施例１にし
たがって調製した）および対応するイソチオシアン酸塩
から実施例２と同様にして合成した。
3′−テトラメチル−4,5−ベンズインド−インドトリカ
ルボシアニン−１−（４−スルホブチル）−１′−（３
−アミノプロピル）−チオノ−［５−（３−アミノアリ
ル）−ウリジン−５′−三リン酸］ この化合物は５−アミノアリル−UTP（実施例１にし
たがって調製した）および対応するイソチオシアン酸塩
から実施例２と同様にして合成した。
スペクトルデータは実施例２の２′−デオキシ化合物
と一致する。
と一致する。
実施例６ 無水−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′−テトラメチル
−1,1′−ビス（３−スルホブチル）−インド−トリカ
ルボシアニン−11−（４−アミノ）−フェノキシ−チオ
ノ−［５−（３−アミノアリル）−2',3′−ジデオキシ
−ウリジン−５′−三リン酸］（「IRD−ddUTP」） ステップ1:2',3′−ジデオキシ−ウリジン−５′−三
リン酸 この誘導体は、市販の2',3′−ジデオキシ−シチジン
−５′−三リン酸（ベーリンガー マンハイム）をNaNO
2/酢酸で脱アミノ化することから出発する不安定なジア
ゾニウム誘導体を介して合成した。
−1,1′−ビス（３−スルホブチル）−インド−トリカ
ルボシアニン−11−（４−アミノ）−フェノキシ−チオ
ノ−［５−（３−アミノアリル）−2',3′−ジデオキシ
−ウリジン−５′−三リン酸］（「IRD−ddUTP」） ステップ1:2',3′−ジデオキシ−ウリジン−５′−三
リン酸 この誘導体は、市販の2',3′−ジデオキシ−シチジン
−５′−三リン酸（ベーリンガー マンハイム）をNaNO
2/酢酸で脱アミノ化することから出発する不安定なジア
ゾニウム誘導体を介して合成した。
ステップ2:5−（３−アミノアリル）−2',3′−ジデ
オキシ−ウリジン−５′−三リン酸 この化合物は、Langerらにしたがって、2',3′−ジデ
オキシ−UTPの５−水銀誘導体を介して実施例１と同様
にして調製した。
オキシ−ウリジン−５′−三リン酸 この化合物は、Langerらにしたがって、2',3′−ジデ
オキシ−UTPの５−水銀誘導体を介して実施例１と同様
にして調製した。
ステップ3:「IRD−ddUTP」 このジデオキシ誘導体は、実施例２にしたがって５−
アミノアリル−ddUTPとそれに対応するイソチオシアン
酸塩とを反応させることにより得られた。
アミノアリル−ddUTPとそれに対応するイソチオシアン
酸塩とを反応させることにより得られた。
そのスペクトルデータは実施例３の２′−デオキシ化
合物のものと一致する。
合物のものと一致する。
実施例７ 無水−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′−テトラメチル
−1,1′−ビス（３−スルホプロピル）−インド−トリ
カルボシアニン−11−［（４−エトキシ）フェノキシ−
０−（２−シアノエチル）−N,N−ジイソプロピル−ホ
スホルアミダイト 50ml丸底フラスコ中で、無水−11−（４−ヒドロキシ
エチル）フェノキシ−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′
−テトラメチル−1,1′−ビス（３−スルホプロピル）
−インドトリカルボシアニン−ハイドロオキサイドのNa
塩425mg（0.5mmol）を、乾燥アセトニトリル5mlに溶解
し、エチルジイソプロピルアミン0.275ml（1.6mmol）を
添加した。次いで、クロロ−β−シアノエトキシ−N,N
−ジイソプロピルアミノホスファン0.125mlを窒素下、
撹拌しながら約３分以内に滴下添加した。さらに室温で
30分間撹拌し、次に、５％NaHCO3水溶液10mlを添加し、
続いてジクロロメタン約10mlをそれぞれ用いて２回抽出
を行った。溜まった有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥
し、溶媒を蒸留により除去して、残留物を移動溶媒ジク
ロロメタン／酢酸エチル／トリエチルアミン45:45:10を
用いてシリカゲルにおけるクロマトグラフィーにかけ
た。
−1,1′−ビス（３−スルホプロピル）−インド−トリ
カルボシアニン−11−［（４−エトキシ）フェノキシ−
０−（２−シアノエチル）−N,N−ジイソプロピル−ホ
スホルアミダイト 50ml丸底フラスコ中で、無水−11−（４−ヒドロキシ
エチル）フェノキシ−10,12−プロピレン−3,3,3′,3′
−テトラメチル−1,1′−ビス（３−スルホプロピル）
−インドトリカルボシアニン−ハイドロオキサイドのNa
塩425mg（0.5mmol）を、乾燥アセトニトリル5mlに溶解
し、エチルジイソプロピルアミン0.275ml（1.6mmol）を
添加した。次いで、クロロ−β−シアノエトキシ−N,N
−ジイソプロピルアミノホスファン0.125mlを窒素下、
撹拌しながら約３分以内に滴下添加した。さらに室温で
30分間撹拌し、次に、５％NaHCO3水溶液10mlを添加し、
続いてジクロロメタン約10mlをそれぞれ用いて２回抽出
を行った。溜まった有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥
し、溶媒を蒸留により除去して、残留物を移動溶媒ジク
ロロメタン／酢酸エチル／トリエチルアミン45:45:10を
用いてシリカゲルにおけるクロマトグラフィーにかけ
た。
収量は480mg（理論値に対して88.7％）であった。
TLC（シリカゲル、上記の移動溶媒）Rf＝0.4 31P−NMR（d6DMSO）:149および153ppm（２ジアステレ
オマー）
オマー）
フロントページの続き (72)発明者 ヘルトケ，ハンス−イェーチム ドイツ連邦共和国 ディー―82327 チ ュトツィンク ハイドンシュトラーセ ５番地 (72)発明者 ビルクナー，クリスチャン ドイツ連邦共和国 ディー―82449 ウ フィンク ヴィリンクシュトラーセ ９ 番地 (72)発明者 フォン デル エルツ，ハーバート ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，イン デル アオ 21番 地 (56)参考文献 特開 昭63−152364（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−128364（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−504144（ＪＰ，Ａ) 実表 平１−500353（ＪＰ，Ｕ) Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，65（５) 1993，ｐ．601−605
Claims (11)
- 【請求項１】一般式： （式中、Ｂは複素環式塩基であるアデニン、グアニン、
ヒポキサンチン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−
グアニン、７−デアザ−ヒポキサンチン、７−デアザ−
８−アザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−グアニ
ン、７−デアザ−８−アザ−ヒポキサンチン、ならびに
チミン、シトシンおよびウラシルを示し、 Xnは４〜20原子を有する結合基を表し、 Sigは一般式： （式中、R11およびR12は一緒になってインドール環に縮
合したベンゼン環を形成し、 R3は、ヌクレオチドとの結合がR5部位を介する場合はＨ
であり、結合がR3部位を介する場合は−NHCS−であり、 R4およびR5はそれぞれ独立に−SO3Hまたは−SO3 -であ
り、 Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレン基であり、 Ｚは炭素数３〜５の線状アルキレン基であり、または、 結合がR5部位を介する場合はR5は−NHCS−であり、Ｚは
炭素数３〜８の線状アルキレン基であり、R4は−SO3Hま
たは−SO3 -であり、Ｙは炭素数３〜５の線状アルキレン
基である。） で示されるカルボシアニンを表し、 R1およびR2は、それぞれＨおよび／またはOHを表す。） で表されるヌクレオシド−５′−三リン酸。 - 【請求項２】DNAポリメラーゼの基質として請求項１記
載の化合物を使用することにより、該化合物を核酸に取
り込む方法。 - 【請求項３】RNAポリメラーゼの基質として請求項１記
載の化合物を使用することにより、該化合物を核酸に取
り込む方法。 - 【請求項４】請求項１記載の化合物を使用することによ
り、核酸を標識する方法。 - 【請求項５】請求項１記載の化合物を使用することによ
り、核酸を検出する方法。 - 【請求項６】請求項１記載の化合物を使用することによ
り、DNAを配列決定する方法。 - 【請求項７】in situハイブリッド形成において請求項
１記載の化合物を使用する、請求項４〜６のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項８】ハイブリッド形成を膜上で行う、請求項７
記載の方法。 - 【請求項９】ハイブリッド形成を溶液中で行う、請求項
７記載の方法。 - 【請求項１０】ハイブリッド形成をマイクロタイタープ
レート内の溶液中で行う、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】標識されたハイブリッドが適切なレーザ
ーダイオードおよび検出器により検出される、請求項５
記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE4326466A DE4326466A1 (de) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | Infrarot-Farbstoff-markierte Nucleotide und ihre Verwendung in der Nucleinsäure-Detektion |
| DE4326466.2 | 1993-08-06 | ||
| PCT/EP1994/002541 WO1995004747A1 (de) | 1993-08-06 | 1994-07-30 | Infrarot-farbstoff-markierte nucleotide und ihre verwendung in der nucleinsäure-detektion |
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|---|---|
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| JP01297599A Expired - Lifetime JP3266865B2 (ja) | 1993-08-06 | 1999-01-21 | 赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用 |
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|---|---|---|---|
| JP01297599A Expired - Lifetime JP3266865B2 (ja) | 1993-08-06 | 1999-01-21 | 赤外染料で標識されたヌクレオチド及び核酸検出におけるそれらの使用 |
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| US5360523A (en) * | 1984-03-29 | 1994-11-01 | Li-Cor, Inc. | DNA sequencing |
| US4729947A (en) * | 1984-03-29 | 1988-03-08 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | DNA sequencing |
| US6004446A (en) * | 1984-03-29 | 1999-12-21 | Li-Cor, Inc. | DNA Sequencing |
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| US6048982A (en) * | 1986-04-18 | 2000-04-11 | Carnegie Mellon University | Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods |
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| US5808044A (en) * | 1993-01-22 | 1998-09-15 | Pharmacia Biotech Inc. | Indocarbocyanine and benzindocarbocyanine phosphoramidites |
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