JPH01503647A - 核酸の検出法 - Google Patents
核酸の検出法Info
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- JPH01503647A JPH01503647A JP1501143A JP50114389A JPH01503647A JP H01503647 A JPH01503647 A JP H01503647A JP 1501143 A JP1501143 A JP 1501143A JP 50114389 A JP50114389 A JP 50114389A JP H01503647 A JPH01503647 A JP H01503647A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
核酸の検出法
不発明は、11識された相補性核酸グローブとハイブリッド形成することによ夕
、規定され友配列の核mk検出する方法に関する。
たいていの礪曾に通用さnる分子生物学的方法の1つに相同核酸配列を検出する
丸めのDNA/DNA −、器A/RNA−もしくはMA/DNA−ハイブリッ
ド形成である。
その際に、プローブ(5onae )として使われる核酸(DNA又は鮒人)を
標識し、かつこれをはとんどの場合フィルターに固定された試験子ぺ8核jll
(DNA又はRNA )とハイブリッド形成条件下に接触させる。グローブと
して使用した核酸と検出子べ@核酸との関に相同性が存在すれは七の都度相補性
のafR一本鏝がハイブリッド二本鎖の形成下にハイブリッド形成される。
引続^て、ハイブリッドが検出される。従来は、た^ていの礪会プローブの標識
は放射性誘導のデオキシリボヌクレオシドトリホス7エートの導入により行なっ
た。ハイブリッドの検出はオートラジオグラフィにより行なった。このような常
用の放射性標識したDNAプローブは非常に効果的で、敏感でbるが、これは放
射性問題を甘受して連取される。放射性化合物を扱うためには、扱Vhが適切で
ないと実験室の安全性が損なわれることがbるので特別な教育を受けた人を必要
とする。更に、放射性化合物の廃棄が他の問題をひき起こToしかも放射性m識
したグローブは使用した放射性物質の#−fj、値のために製造してから一足期
間しか使用することができな^。lた、検出子ぺ@ DNAの&が僅少でらる場
合の検出に扛オートラジオグラフィーo必要露光時間は非常に長めこともあり、
っlり数日間乃至数週間のことがある。
放射性標識した核酸検出系とともに非放射性方法も公知でろり、七の場合iCは
使用する核酸グローブはビオチ/分子(米@*jFF第2915082 号BA
m香、 E!−ロッパ公開!F#野第0063879号明細薔へジゴキシン−/
T 3−/T 4−分子(ヨーロッパ公開特許第173251号明細書)又はア
ル中ルー/ブチルー/エチルー/スルホンaE−/ニトロノ分子(ヨーロッパ公
開特許第128018号明細書)で変性されて^る。相補性核酸プローブ中への
これらの低分子型検出分子の導入は化学的に、光化学的に又は*素的に行なう、
その後で、検出子べI!核酸配列とのハイブリッド形gt−行なう。ハイブリッ
ドの検出は低分子量分子の結合を介してピオチンの場合は(ストレプト)−7ビ
ジン一標識#素複曾体、ジゴキシン−/T 5−/T 4−分子の場合は抗ジゴ
キシン/−T 3−/−T 4−抗体一標臓#素−複会体により又は抗−フルキ
ルー/−ブチルー/−エチル−/−スルホン酸−/−ニトロソ−抗体一標識酵素
−a分体を介して行なう。ハイブリッド形成による生成物の検出は標III酵素
の#累活性を結合した色素系を介して測定することにより行なう。
しかしヨーロッパ公ga脅粁第173251号明細書の方法でに、ジゴキシ7/
T5−/T4−分子が、水素架橋結合に関与する、核酸プローブの塩基1個又は
数個のN原子に結合し、それ故検出すべき核酸とのハイブリッド形成は−とりわ
けグローブの多回変性の場合に−損なわれることがある。ビオチン/(ストレプ
ト)−7ピジンー系を除込て、目下知られて^る非放射性系の感度は放射性系と
比較して少なくとも何〇乃至し、。。に低下する。ビオチ//(ストレプト〕−
アとジンをベースとする従来の唯−高い非放射性検出のSWは、特にビオチン/
(ストレプトンー7ビジン系の高い結合定数(C=10”モル−1)に基^てい
る( Lit、 Kinov ; @Proc、 Natl、 Acad、 S
ci、 t7sA″。
第80巻、4045頁(1983年)〕。ビオチン/(ストレプト)−アビジン
系の連取可能な最大感度はドツト・プロット(Dot−Blot )におけるD
NA 1 pJ’ 〜0.1 piの検出及びゲノムDNA7ラグメント10〜
1−#t−使ったrツムプロットの@シングルコピー(Single−copy
)″遺伝子、即ちゲノムにたった1回だけ出現する遺伝子の検出における放射
性標識の場合と同じである。しかしビオチン/(ストレプトンー7ビジンー相互
作用の利用には、ビタミンでろるビオチンが殆んど丁ぺての生物学的物質中IC
産生するので、その相互作用が非常に妨害され易いと込う決定的な欠点がbる(
@Biochem、 Biophys、 Acta”、第298゜225頁(
1985年) ; ” Biochem、 Biophys、 Acta”。
L2J一つビオチン/(ストレプト)−7ピジン一相互作用よりも妨害されにく
いものてらって、しかも従来の放射性標識もしくはビオチン/(ストレプト)−
7ビジンー標識が沖つ魚類に高い検出感度t−達底する核酸の検出法を開示する
ことであった。
不発明により、この線層は、化学M会を介して少なくとも1個のハプテンを標識
としてM会含有する相補性核酸グローブとハイブリッド形成することによp規足
配列の核11!’を検出する方法におりて、ハプテンとして、水素架橋形成に関
与しなtnM酸の少なくとも1つの部位に原子少なくとも4mの長さの架橋員を
介して結合しているステロイドを使用し、かつハイブリッド形成したプロープt
−標識抗−ハゲテンー抗体を介して検出することを特徴とするその万εにより解
決される。
ステロイドとしてジビキシrニン又扛ジデキシンを使用すると優れている。
不発明方法により、ドツト・プロットにおいて相同ff1A O,5P#〜0.
05 pi及びゲノムDNA 7ラグメント5βl〜0.5μlにおいてシング
ルコピー遺伝子の検出が可能である。両方の検出法において、検出感度はビオチ
ン/(ストレプト)−7とジン系の検出感度と少なくとも同じである。このこと
は、ビオチン/(ストレプト)−7ビジン一相互作用のM曾定数[K=10”モ
ルーユ ; Gre@n 、N、M、、@ Adv、Protein Chem
、” 。
第29%、85〜133頁(1975) n Chaiet *L、、 Wol
f、 iF、 、T、、 ” Arch、 Eiochem、 Biophya
、 ’ 。
纂106巻、1〜5頁(19t54))がジゴキシデニン又はジゴキシンと相応
する抗体と04@互作用(K=2X10’モル−λ〜7X1019モルー1*
Huntsr及びその他、@J、工mmwno1. ” 、voll 29a
A3* 1165(1982))よ9少なくとも10’倍も高く、かつ更にビオ
チン/(ストレプト)−アとジン相互作用が(ストレプト)−アとジン上の48
のビオチン結合部位の存在により促進されるので驚異的でわる。
もう1つの驚異的な技術的利点に、ジデキシグニン又はジゴキシンと対応する抗
体とを使用する際に、検出子べ龜IIAaiI!が固定されているフィルターへ
の非特異的結合(バックグラウッド)がビオチン/、(ストレプト)−アとジン
を使う場合より著しく低いことである。
核!!を検出するための本発明方法の実施は次の3つの段階に区分することがで
きる。
t 検出試薬としての核酸プローブをハプテンで誘導会瓜する。
2 ハイブリッド形成。
五へイブリッドの検出。
核酸(DNA及びRNA )の誘導台底には種々の方法を適用することができる
( Maniatis及びその他。
Mo1ecular Cloning”* (1982L Co1n Spri
ngHarbor Laboratory 、 New York 、Co1(
L Spring Rarbar在〕。この際、ハプテンの導入は酵素的、化学
的又は光化学的に行なうことができる。
12/ダム プライムド(Random−primea )”法では二軍鎖デオ
キシリボ°核酸グローブを初めに変性しつ19両1のakmW&により分離し、
七れによって核酸の一本鎖に変える。−不備のデオキシリボ核酸グローブでに変
性は行なわない。デオキシリボamの一本鎖に、−不備DNAの相補性配列断片
とハイブリッド形成する異なる配列を有する任意の短いオリデデオキシリボヌク
レオチドである所v41ランダムプライマー”km合させる。引続−て、1ラン
ダムプライマー1の3’−OE末端から出発して#素のクレノウボリメラーゼ(
K15nov Polymeras・)又は他のDNAボリメ2−ゼ(例えt/
iファージT4又はT7′3−ドした又はThermus aquaticua
から)の作用により一本鎖に対して相補性の鎖を会厖する。その際に基質として
供給した45aのデオキシリボヌクレオシドトリホス7エートが導入さルる。4
種のこのトリホスフェートまで、一部又に全部が架橋員を介してステロイドの結
合により誘導され、それ故デオキシリボ核rR会底の際にこのステロイドが一緒
に導入される。ステロイドが誘導tgされたヌクレオシドトリホスフェートは藁
1図で2つの異なる侵れた架橋鎖長で図示されている。
1スペシフイク プライムド(Specific−primea ) ’法では
1ランダム・プライマ−2,つまり種々の配列を有する短いオリデーデオキシリ
ボヌクレオチド(D代りに1スベクフイク・プライマ−(Specific−P
rimerアク1り特異的配列を有するオリゴ−デオキシリボヌクレオチドを使
用する。この特異的プライマーは均一に一本鎖DNA O相補的配列断片にだけ
結合する。相補的鎖のせ底はう/ダムプライマー法とは反対にこの一足の配列断
片からだけ開始する。基質として供給した4種のデオキシリボヌクレオシドトリ
ホス7エートが導入される。この4種のトリホスフェートlでit−g又は全部
が架橋員を介するステロイドの結合により誘導合成され、それ故デオキシリボ核
eR会既ではこのステロイドが一緒に導入される。
0逆転写”法(社5tratlaaia、 A、F、C,、Villa−ICo
ma−roff、 Xs、 ”’ G@netic Engineering
’ (Stelow、 1.K。
及びEolla@nder、 A、、 els、) Plenum Preaa
、 New York及びLondon在e vOl−1t 1頁以下〕では一
本鎖のリボ核酸プローブ又は変性後、即ち一本鎖に変換後の二不備すボ核陵プロ
ーブを逆転写する、りIり相応するデオキシリボ核酸を形成する。このために、
−手鎖リボ核酸プローブにオリゴ−デオキシリボヌクレオチドO°プライマー″
金相補的配列断片で結合させる。引続−て、lli会した°プライマー”の5’
−OH末端から開始して#素の逆転写#素の作用により囲人−不備に相補的なり
NA鎖が@r成される。逆転写酵素としては例えばウィルスん■又はMo−MU
Vコードした璽素を使用する。DNA@合成の際に基質として供給される4a[
のデオキシリボヌクレオシドトリホス2エートが導入さ几る。この4糧のトリホ
スフェート筐では一部又は全部が架橋員を介するステロイドの結合により誘導合
成され、それ故DNA会底の@にζ0ステロイドは−gK導入される。
1ンイル イン(Pill−in )”法では、突出して偽る3一本鯖末)ll
iを有する二本鎖デオキシリボ核酸グローブを誘導合成する。そのために、#素
のフレノウ・ポリメラーゼ又は他のDNAポリメラーゼ(ηえば7アージT4又
にT7コードし友)により、突出して^なわ一本鎖の3’−OH末端を相補的に
突出している5′−一 手鎖配列に対して伸長する。その際に、5′−突出一本
鎖領域の配列に応じて供給される4種のデキシリボヌクレオシドトリホス7エー
トまで導入される。この4種のトリホスフェートまでは一部又は全部が架橋員を
介するステロイドの結合により誘導合成され、セル故ヌクレオチドの導入の際に
このステロイドは一緒に導入される。
w−ックトランスレーシミン”m (@J、 Mol。
Biol、 ” 、第113%、237頁(1977年)〕では二二本鎖デオキ
シリポ酸プa−プを#巣の8.コリDNAポリメラーゼl並びに少量のDNNア
ーゼと一緒に基質として使Qれる41!Iiのデオキシリボヌクレオチドトリホ
スフェートの存在にお^で恒温保持する。酵素DNアーゼIによター手鎖断片、
所M==ツク”が生じる。これにより切断さ几た一本鎖中に5′−木端と3′−
末端が生じる。引続^て%tllRLコリDNAポリメラーゼlにより内部−手
鎖断片で5′−末端デオキシリボヌクレオチドが分解され、そルと同時に基質と
して供給されるデオキシリボヌクレオチドの1つの5−OH末端に導入さルる。
ヌクレオチドの分解及び新規導入が同時に繰返されることにより一本鎖断片は6
′−末端の方向に移動する。 2TFXとして供給し、’c421[のトリホス
フェート1では一部又は全部が架橋員を介するステロイドの結@−により誘導合
成され、それ故ヌクレオチドの新規導入の際にこのステロイドは一緒に導入され
る。
1テーリング(Tailing )”法では二本鎖又は−手鎖のデオキシリボ核
酸−又はリボ核酸プローブの5−OH末端に、酵素のターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて基質として有用なデオキシリボヌクレオシドトリホス7エート、ジ
デオキシリボヌクレオシドトリホスフエート又はリボヌクレオシドトリホスフェ
ートの少なくとも1種の存在にお^てこれらのヌクレオチドの少なくとも1種を
加える。使用したトリホスフェートかここでも一部又は全部架橋員を介してステ
ロイドが1jFItすることにより誘導合成され、それ故ヌクレオチドの導入に
よりこのステロイドも一緒に導入される。
7アージーRNA−ポリメラーゼで触媒される1転写(τranskripti
ona )”法(@J−Mo1. Biol−” e 第166巻、477頁(
1985年〕〕でにデオキシリボaIjitg!存性すボ核megの際に形成さ
れたリボ核酸が誘導合成される。7アージコードしたRNAポリメラーゼとして
は、例えri7アージ5P6−、T7−又はT3コードした#Xを使用する。こ
の方法fcは、例えば5P6−、T7−又はT3プロモータを含[7る二本鎖デ
オキシリボ核酸を使用する。例えば5p6−。
T7−又にT 3− RNAポリメラーゼ及び全48!のりポスクレオシドトリ
ホスフェートの添加にょ9相同性プロモータから出発して、コドrンのデオキシ
リボ核酸に相補的なリボ核酸鎖、転写が形成される。その際に、基質として供給
したりポスクレオシドトリホスフェートが導入される。4種1でのこのトリホス
フェートの一部又は全部な架橋員を介するステロイドの結合により誘導合成され
、それ故すボ核酸曾成の際にこのステロイドが一緒に導入される。
1光化学的2方法(” Null、 Ac1ds Rea、 # @ 13舎、
745〜761頁(1985年)〕では核酸プロ−プを7オトジがキシゲニン(
纂2図)の存在にお匹てUV部分を含む可視光線で照射する。窒素(N2)の脱
離下にニトレン基が缶底し、これが核酸に共有結合する。
1化学的”方法に関してはオリゴデオキシリボヌクレオチド合成の範囲でホスフ
ィツト−トリエステル法(Phosphit−Triester−Method
s )により、保護されたヌクレオシドホスホラミジット(Nukleosi4
−phosphora−m1dit : aVdG/ac/aで)と共に、置換
可能なアミン官能基で変性され、保護されたヌクレオシド−ホスホラミジット(
6kl(LG/(L Q/eLU)がオリイブオキシリボヌクレオチド−重鎖中
への導入に使用される。aCCOO変性は有利にピリミジン環の5位で、(IJ
V’6Gのそnは有利にプリン分子の8位で起る。
合成サイクルの終結及び保護基の脱離後に、ヌクレオ塩基で置換可能なアミン官
能基で変性された一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドが缶底し、これを好
適なハゲテンで標識することができる。七のよプなハプテンはステロイド、殊に
ジゴキシグニン、ジブキシンで6タ、つ1タオリゴデオキシリボヌクレオチドを
ハプテンの相応する活性エステル、アミド又はエーテル、殊にそのN−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルと反応させることにより標識する。
不発明の優れた実施形では、)1ブチ/が核酸プローブ中に酵素的にDNA−ポ
リメラーゼ、RNA−ポリメラーゼ、リバーストランスクリプターゼ又はターミ
ナルトランスフェラーゼ及び相応するハプテン変性デオキシ−又[リボヌクレオ
シドトリホスフェート基質により導入−g n fc a酸プローブを使用する
。
不発明のもう1つの優れた実施形でに71ブテンを核酸プローブ中lCf1化学
的にホトノ・ブチ7により導入した核酸プローブを使用し、かつ第3の優れた実
施形ではハプテンを核酸プローブ中に、化学的にオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド合成の範囲で、置換可能なアミン官能基で変性され、保護されたヌクレオシド
ホスホ2ミジツトを導入しかつ保護基の除去後に変性オリゴデオキシリボヌクレ
オチドと)1ブテンの活性エステルとを反応させることにより導入した核酸グロ
ーブを使用する。
記載の万f:を介して製造し、ステロイドで誘導合成した核酸プローブを、キャ
リアic N’ftした変性DNA又はRNAと接触させ、かつこの際に温度、
イオン製置。
−値及び他の緩衝条件は一核酸プローープの長さ及びセルから得られる所定のノ
)イブリッドの溶融1匿に相応して−、標識したDNA又はRNAが相同性DN
A又はRNA K: M曾し得るように選択する()1イブリツド形底)(@J
、 Mo1. Biol、 ” 、第98巻、503頁(1975年) ; ”
’ Proc、 Natl、 Acad、 Sci、USA”、76巻。
6683頁(1979年)〕。キャリアとしては、ニトロセルロースをベースと
する膜又に午ヤリア材料(例えば5chleieher & 8chuell
BA 85 ; AmershamHybond C) e 強化又は結合粉末
状ニトロセルロースもしくは種々の官能基で誘導合成されたナイロン膜(例えば
5chlaicher & 5chuell Nytran 、 NKN Go
n。
5creen 、Ameraham Eybonl N 、Fall Biod
yne )が好適でろる。
ハイブリッド形成したDNA又はRNAの検出は、キャリアを十分に洗浄しかつ
非特異的結合を回避するために抗体又は抗体7ラグメントで飽和した後で恒温保
持する。この抗体又は抗体フラグメントは誘導合成の際に核酸プローブ中に導入
されるステロイド/1ブテンに対して作用する。キャリアは接仕して標識を担持
する。
抗体の恒温保持後に、特異的に結合した抗体複會体だけを検出するために再び洗
浄する。測定は抗体又は抗体7ラグメントの標識を介して公知方法により行なう
。
ハプテンを核酸グローブに結合する架橋員の長さは4〜32個の原子であってよ
い。この際に、架橋員は、原子C,O,,S及び/又はNt−含有する分子から
溝底されている。更に大きな連鎖長も可能でbるが、感度低下を考慮丁べきでb
るOで意味がな−。
本発明の優れた実施形では、ノーブテンは原子11〜16個の長さの架橋員を介
してプローブに結合している。架橋員が疎水基と共に親水基を含有すると優れて
いる。
優れた実施形では架橋員は直鎖状でろる。もう1つの実施形では架橋員は分枝鎖
から成りかつ連鎖末端の少なくとも1つにハプテン分子七有する。分枝鎖架橋員
の連鎖末端に数−のハプテン分子が存在すると検出の感度を付加的に高めること
ができる。
ステロイドハプテンと架橋員との結合は殊にエステル−17ミドー又はエーテル
M@−でbる。
架橋員を介して行なわれるステロイトノ1ブテンの核酸グローブへの結合は核酸
プローブの末端位又框非末端位のホスフェート基を介しても可能でろ夕、また糖
残基又は塩基を介しても可能でbる。しかし架橋員を介して行なわれるハプテン
のM曾は、両刃の相補性核酸鎖の閾の水X架橋形gを損なわな込ように行なうべ
きでbる・
ハプテンが架橋員を介して核酸プローブの塩基又はリボース成分に結合している
と優れてお夕、その際にハプテンが架橋員を介してウラシル又はシトシンのC5
−位、アデニン又はグアニンの08−位にもしくはリボースの2−位にM&する
と臀に優れて^る。
抗ハプテン抗体又は抗体72グメントの標識化は公知方法でりなう。例えば、酵
素標識、放射性標識。
(バイオ)ルミネセンス標識又はけい光標識が好適である。アルカリ性ホス77
ターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトクダーゼのような#素による#累標
Rk適用すると優れて^る。標識酵素としてアルカリ性ホスファターゼを使うと
骨に優れてrる。アルカリ性ホス77ターゼの測定は酸化可能な化合物さしてロ
イコ系、特にインジブイド系を介して行なう(ミーロツパ特許第228663号
参照)。酸化剤としてはナトー2ゾリウム塩が有用である。m識#累のアルカリ
性ホス77ターゼではレドックス系として!−ホスフェート/ニトロプルーテト
9fリクムを使用すると優れて込る( P、P、 Altmann、Tetra
golium 5alts andPormagana 、Progr、 Hl
stochem、 Cytochem、、 Van。
913、第1頁(1976年) 、 Gustav Figcher’Verl
ag出版、8tuttgart在〕。x−ホスフェートとa5− フelムー4
−/ロルー5−イ:/ドリルホス7エー)4Z)−fi名でbり、かつニトロブ
ルーテトラゾリウムは化合物3.3’−(3,3′−ジメトキシ−4,4’−ビ
フェニレン)−ビス−5−フェニル−2−(4−=トロフェニル)−テトラシリ
クムクロリドt−表わ丁[F、P、 Altmann 、 テetragoli
um 5alts and IFormagana。
Progr、 Hlatochem、 Cytochsm、、 Tom、 91
3 e 纂I Jt以下(197,6年) 、 Gustav 1F1achs
r Verlag出版。
8tuttgart在〕。アルカリ性ホスファターゼは発色性基質、この場会に
はI−ホスフェート部分解し、これがホスフェートの脱離及び酸化により青色の
難溶性〇二量体を形成し、その際に同時にテトラゾリウム化合物が同様に1色で
あるJIl浴性のホルマデンに還元される。このレドックス反応はwis図に示
されて^る。
他の好適な標識系〔(バイオ)−ルミネセンス標1け^光標識、放射性標識〕の
検出は公知方法で実施する。
本発明方法を更に詳説するために藁4図で原子11個の架橋員を介してtlUT
Pに結合して−るへブテンとしてのジゴキシrニンを使って図示した。
骨に有利に本発明方法を次のものに通用することができる:
固定された全細胞、固定された組礒塗沫標本及び単離し友染色体(r:P期染色
体)とのインシトウ(in aitu)ハイブリッド形成
コロニーハイグリッド形x(ai胞)及びプラークハイブリッド形成(ファージ
及びウィルス)ノデンハイブリッド形E (RNA検出)血清分析(血清中のウ
ィルス−及び細菌感染の検出。
血清中の細胞の細胞屋分析;例えばスロットプロット分析)
も51つの優れた実施形では不発明による測足法を実施する前にヨーロッパ公開
特許第0200362号明細番に記載されてhるように試料の増幅を行なり。
不発明の他の目的は規定配列の核a!(E料)の検出法であり、これは試料を変
性後、一方が七の配列におhて検出子べき核酸の鎖の部分配列に相補性でらりか
つ他方が検出子べ8核酸の同じ鎖の他の部分配列と同一で6る少なくとも2種の
オリゴヌクレオチド(プライマー)で処理しくハイブリッド形成)、ポリメラー
ゼ、殊にtaq −DNA−ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド及び、水
素架橋結合に関与して−な込デオキシリボヌクレオチド0部位に少なくとも4個
の原子の架橋員を介して結合してbるステロイドを化学的に結合含有するデオキ
シリボヌクレオチド少なくとも19I51S理しく1合)、かつ引続いてに注、
ノーイブリッド形成及び重合より成るサイクルを少なくとも1回框繰り返丁と、
試料に相補性のW識されている核rRが生成し、かつこのようにして生成した標
識am’i標職抗−ハブテンー抗体を介して検出することt−特徴とする。
優れた実施形ではデオキシリボヌクレオチド、標識デオキシリボヌクレオチド及
びプライマ−t−5E#C変性反応前に添加する。
他の優れた実施形では、サイクルの経過後試料に相補性の固相に固定された核酸
を加え、ハイブリッド形成反応を笑施し、かつ固相と液相との分離後に固相中の
msを測定する。
本発明の他の目的は、規定配列の核wk(試料)の検出法でわり、これは試料t
″変性後、−万がその配列において検出すべき核酸の鎖の部分配列に相補性でお
りかっ他方が検出すべき核酸の同じ鎖の他の部分配列と同一でおる少なくとも2
種のオリゴヌクレオチド(プライマー)で処理しくへイブリッド形成)、デオキ
シリボヌクレオチド、ボリメ’5F−f、殊にtaq −DNA −ポリメラー
ゼで処理しく重合)、引続いて変性、ノーイブリッド形成及び重合よ夕底るサイ
クルを少なくとも1回は繰夕返し、かつ最後に水X*僑結合に関与して−なりデ
オキシリボヌクレオチドの部位に少なくとも4個の原子の架橋員を介して結合し
てiるステロイドを化学的にM曾含有するデオキシリボヌクレオチド少なくとも
1個の存在におhてティクルを!Iり返Tと、試料に相補性の標識されている核
酸が生成し、かつこのようにして生成した標識核酸を標識抗ハプテン抗体を介し
て検出することを特徴とする。
他の優れた実施形ではサイクルO終WI後、試料に相補性の固相に固定した核酸
を・添加し、ハイブリッド形成反応に冥施し、かつ固相と液相との分離後に固相
中の標at−測定する。
この方法の他の条件は例えばヨーロッパ公開特許第0200362号明細書に記
載されておりかつポリメラーゼチェーン反応(PCR)といり名前で知られて−
る。
次に、本発明を添付図面に基づ1!笑施例によ夕詳説する。
第1図は原子数11個の長さの架橋員を介して、ジゴキシデニン分子で標識され
たデオキシウリジントリホスフェートを示し;
a!2図t!ホトジゴキシr二ンを示し;第3図はレドックス系のX−ホスフェ
ート/ニトロプル−テトラゾリウムを介して#素のアルカリ性ホス7アター″I
/l−検出する際の呈色反応を示し:第4図は本発明によるDNA検出の優れた
実施形を示し:
第5図は5P6−4L(はT7鮒Aポリメラーでで触媒される転写法によりプラ
スミドpsPT 18 t−用いて行なjRN人転写の製造を示し:
第6図はプラスミドpsp’r 18の種々のDNA領域を示し:
第7図はホトー/ゴキシrニンt−装造するたOの会成式を示し:
第8図はサデン法(8outhern−Blotting undHybrid
iaierung )により胎盤DNA ’i検出するに当って、ハプテンとし
てジゴキシデニンを用いる本発明による検出の感度とビオチン/ストレプトアビ
7ノによる検出の感度との比較を示し;
第9図はDNA検出における不発明による酵素標識(A)の感度と公知の化学的
標1m (B)の感度との比較を示し;
第10図はpsP718のDNA配列及び制限地図(B)ジゴキシrニンー〇−
スクシニル−(5−(アミドアリル)−2−デオキシ−クリジン−5’−)!j
ホスフェート〕−テトラリチウム塩
(plg−4−dUTP )
c39Hs2o21”3p3”i4 分子t 1019@5ジデキシrニンー0
−スクシニル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル200#(0,34ミリ
モル)をジメチルホルムアミド7d中に溶かし、かつN206Ilt中の5−ア
リルアミノ−7−ジオキシ−ウリジン−5′−トリホスフエートーテトラリチウ
ム塩186にN9(0,34ミリモル)の溶液iC添加する。この反応混曾物に
0.1 ” fMWI Na 緩衝液(pH8,5) 62dt加えかつ室温で
一晩約15時間攪拌する。
この後で、f11紙電気泳動(0,05Mクエン酸塩緩衝液、PH5,0)VC
よりyvyt、a下に未反[05−7リル7ミノー(LU TPと共IC若干深
く互で展開した所望の生成物のスポットが認められる。
精製は例9と同様に行なり。
収量:1309=理論量の37係
σVスペクトル(ホスフェート緩衝液、p?i7.0):最大値220nm、2
90nm
例 2
ジゴキシrニンー0−スクシニル−e−アミドカプロン酸
”311B49C19N 分子量603.8250d−丸底フラスコ中でジイキ
シデニノー〇−スクシニル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル5 、S+
(8,5ミリモル)tジメチルホルムアミド(DMIF)150&j中VC溶
かし、かつこれにDMP 20 J’lj中の6−アミノカプロン酸1.129
(8,5ミリモル)及びトリエチルアミン$、2 al (D懸濁液を加える。
−晩宜温で磁気的に攪拌すると、徐々に均質な溶液が虫取する。この後で、反応
は薄層クロマトグラフィによ5(珪酸デル; 酢酸エチルエステル/石油エーテ
ル/エタノール1 : 1 :1.検出:米酢i11011j十濃H,So、
0.2 d十アニスアルデヒド0.1dの混会物を噴霧し、かつ實黒色スポット
が現われるまで120℃で加熱する:〜約0.7 ; Rfジーr+シrニン1
0Su−エステル約0.85)笑顔に完結して^る。
DMF ’i高夏真空中で残りなく留去させかつ残留油状物t−H2O50IL
t中に濃7ンモ=7溶液の添加下に溶解する。その後、クエン酸水溶液(クエン
酸100g/1)225111の添刀により1遊離”ジゴキシデニンアミドカプ
ロンIl!t−沈殿させる。樹脂のよりに粘稠な物質を水で擦ることにより硬化
させ、吸引濾取し、数回水で後洗浄し、かつ最後にP2O5上でオイルポンプ真
空中で乾燥させる。
収量:3.4ノM=理論量の681
例 3
ジゴキシデニンー〇−スクシニル−C−アミドカプロンfi−N−ヒドロキシス
クシンイミドエステルC3tHb20□、N2 分子量、700.8iooat
−丸m、;rラスコ中でジゴキシデニンー〇−スクシニル−8−アミドカプロン
酸3.459(5,7ミリモル)を無水ジメチルホルムアミド(DMF ) 2
0 aj中に溶かし、かつ連続してN−ヒドロキシスクシンイミド0.7 g(
6ミリモル)並びにジシクロへキクルカルボジイミド1.3.9 (6,3ミリ
モル)を加える。室温で一晩攪拌し、翌日沈殿したジシクロヘキシル尿素を吸引
濾別し、かつDMI’をオイルポンプ真空中で吸出する。残留油状@を酢酸エチ
ルエステル20114中に取りかつ水冷(−20℃)石油エーテル約150IL
t中に攪拌装入する。析出した、初めは1だ樹脂状に粘稠な生成物を数回水冷の
乾燥石油エーテルで硬化するlで擦る。真空中P2O3上で乾燥した後で3.3
5.9 =理論量の84%
元素分析:
計算値 c66.4s a7.5% N4.os夾測値 C63,11N7.7
1 N4.071例 4
ジデキシデニンー〇−スクシニル−g−アミドカプロイル−(5−(アミドアリ
ル)−7−デオキシ−クリジン−5′−トリホスフェートコ−テトラナトリウム
塩(Dig −11−(LUTP )
C41SH13”12N4P5”a4 分子量1196.7ジプキシrニンー〇
−スクシニル−g−7ミドカプロy酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
260Ry(0,37ミリモル) ’i DMtF 7 jlj中に溶かし、か
つ’f12QOd中の5−7リルアミノー2−デオキシークリジン−5′−トリ
ホスンエートーテトラリチクム塩2 D DIJ9CD、37ミリ%ル)C)溶
液にm、する。この混せ物に0.1 m硼酸ナトリウムpH8,562−を添加
しかり室温で一晩攪拌する(約15時間)。
この後で、611紙亀気泳動(0,05−クエン酸塩緩衝液*p’5−0)$C
お藝てσV光疎で若干の未反応7リルアミノーtLU TPと共に若干量く萱で
展開したFfTSa化曾物のスポットが認められる〔別法:薄層クロマトグラフ
ィ(DC)、珪rRグル上、展開剤イソ酪識/磯アンモニア溶液/ H2O”’
66 : 1 : 33e検m:tzvjt巌中又はアニスアルデヒド試薬t
−@霧−例2参照−:Rf値=5−アリル7ミノー(LUTP O−2p D’
g−アミドカプロンel−O8u −xステkO−7e Dig −11−(L
UTP0.45 )。
精製するに当り、反応混曾物tオイルポンプ真空中で蒸発濃縮して一体残渣を取
得し、H,0200−中に取りかつイオン交換体カラム(DKAJ−セファデッ
クスA25.HCO,−型、カラムの寸法1−51−5X30に注ぐ。吸引径短
時間水洗し、その後H2O14!からQ、d a TFiAB ()リエチルア
ンモニウムビカーボネート)−8の傾斜で溶離する。純粋な先広物を含有する画
分を合し、真空中で濃縮しかつメタノールで数回蒸発濃縮することによ夕過剰0
TEABを除去する(遊離トリエチルアミンの匂すなし)。フラスコの内容物を
数dの水中に取り、この溶液k Na+型の短hカチオン又換体カラ*DOwx
Z50wS8(iXl[]cm)’に通ムカラムを洗浄水のODEがなくなるま
で(σVの240−で測定)洗浄し、かつ真空中で約20altで蒸発濃縮する
。凍結乾燥後VCDig −11−dUTP −Na4200ダ(理−量の45
%)ミロ色粉末として得られる。
分析:H20測定7.9係
元素分析(H20含tt考服して):
計算[:C41,8チ N5.3% N4.3僑 P7.2係実測値:C41,
08チ H5,35俤 N4.7% P7.1チσVスペクトル(ホスフェート
緩衝液p)17.0):最大値220nm、290nz
例 5
ジゴキシグニノーO−スクシニル−1−7ミト酪酸c51H430GN 分子量
575.8この化会物は、例1でカプロン酸誘導体に関して記載したようにジゴ
キシrニンー〇−スクシニル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル511
(5,1ミリモル)を4−7ミノ酪酸0.63 、Ii’ (6,1ミリモル)
と反応させることにより1M造する。反応後、反応混合9Jを真空中で蒸発濃縮
し、残渣をH,O−メタノールC20チ)中に溶かしかりH+型のカチオン交換
体力2ム(DOWBX 5ΩWχ8)上に注ぐ。溶出液及び洗浄水(−約4)t
−蒸発濃縮し、残留したグリース状の残渣′kn−ブタノール中1c溶かしかつ
3回水で振出する。
ブタノール相が所望の先広物を含有し、かつブタノールの除去及び無水DMFに
よるコデスチレーシミン3回(残留水の除去)後に、相応するN−ヒドロキシ−
スクシンイミドエステル(例6〕に加工するのに使用する。
収t:2.94.VC油状物)
例 6
ジtキシrニアー〇−スクシニル−1−7ミram−N−ヒトクキクースクシン
イミドエステル’4SH&6011Njl 分子1672.8例5からの油状物
としてのジゴキシデニンー〇−スクシニル−r−アミド開腹2.941約5.1
ミリモル)を例6に記載したよりにN−ヒドロキシスクシンイミド0.62 g
(5,4ミリモル)及びジシクロへキシルカルボジイミド1.169 (5,6
ミリモル)と無水DM?20alj中で反応させかつ後処理する。生成ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを油状物として一例7に記載したように□C−7ミノ
カプロン酸と反応させる。
収量: 3.46 g(油状物)
例 7
ジゴキシグニンー〇−スクシニル−r−7ミドプチリルーε−7ミドカプロン酸
c、 ?H5601ON2 分子量689.02501Lt−丸底フラスコ中で
L−7ミノカプロン酸0.8.9 (6,2ミリモル)及びトリエチルアミン0
.75IILtヲDMF12ILt中に懸濁させ、かつこれKDMP9Qaj中
のジプキシデ二ノー〇−スクシニル−r−アミド酪酸−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル(s、iミリモル、例6からの油状物)の溶液を加える。室温で
一晩(約15時間)攪拌すると、その後では/’f均一な溶液が生成してAる。
DC(条件は例2参照)Kよれば反応はlよぼ足置的である。
後処理は例5に記載したよ51C行なう(DOWJCX 50−クロマトグラソ
イ、n−1タノールによる抽出にょ5−遊離0カルボン酸に変換)。1タノール
相は目的の生成物と共に若干量の極性及び無極性w質を含有するので、珪酸デル
60でクロマトグラフィ処理(カラA 40 X 3cm、浴Fa剤酢酸エチル
エステル/石油エーテル50/75/エタノール1:1:1)することにより精
製する。酸性7ラクシヨン′Jk曾しかつ蒸発濃縮した後で油状物が得られる。
1.48!i=理論量の42%
例 8
ジブキシrニンー〇−スクシニル−r−アミドブチリル−C−アミドカプロン酸
−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
C41ESQO12N3 分子1785.8ジゴキシグニンー〇−スクシニル−
r−7ミドプチリルーε−アミドカプロン酸0.2.9 (例7からの油状’l
i2+、約0.29ミリモル)tN−ヒドロキシスクシンイミド0.034 g
(0,3ミリモル)及びジシクロへキシルカルボジイミド66ダ(0,32ミリ
モル)と無水DMEFaaj中で例31C記載したよりに反応させ、かつ後処理
する。得られた油状残渣は冷い石油エーテルで数回擦っても固くならな込ので、
溶剤の除去後に直接−例91C記載されているよ51C−5−7ミノアリルーa
OTPと反応させる。
収量: 0.25 g(油状物)
例 9
ジゴキシグニンー〇−スクシニル−r−7ミドプチリルーe−アミドカプロイル
−〔(5−7ミドアリル)−7−デオキシ−ウリジン−5′〜トリホスフェート
〕−テトラリチウム塩
(pig −1ts −1rtTp )c4G”?。0□3N5P3Li4 分
子JL1217.vジプキシデニ7−0−スクシニル−r−7ミドプチリルー?
−アミドカプロン酸−N−ヒドロギンスクシンイミドエステル2509C例8か
らの油状物、0.6ミリモル)をDMFZal中に溶かし、かつE120btl
中の5−アリルアミノ−2−デオキシ−ウリジン−5′−トリホス7エートーテ
トラリチウム塩210ダ(0,38ミリそル)の溶液に加える。この反応混会物
に0.21硼酸ナトリウム緩衝液−8,562117を添加し、かつ−晩(約1
5時間)攪拌する。反応の超過は例4に記載したように追跡する。
精製するに当ってバッチをオイルポンプ真空中で蒸発a縮して固体残渣を得、H
2O約200a中に溶かしかつイオン交換体カラム(IBCAI−セファデック
ス人−25、CI−fd、 カラムノ寸法1−5 X 30cx )上に注ぐ。
H2Oで洗#後でH2O2A’から0.3a 5xct 2 l!に直線的に傾
斜させて溶離する。純粋な生成qjJを含有する画分t−曾し、真空中でH2O
が留出しなくなるlで@縮し、かつ磯縮物を引続いてアセトン−エタノール混曾
吻C3:1)中で攪拌装入によ夕沈紋させる。上澄みを遠心分離し、CJ−が存
在しなくなるlでエタノールで況いかつP 20s / KOH上で真空4Cよ
り乾燥させる。
収t:250η=理論量の68係
分析H,O測定=6.3チ
元素分析(H2O含量を考慮して):
計算値: C’ 45.感係 H5,7チ N5.4俤 P7.2チ笑@値:
c 45.14 H5,6% N 5.64 p 7.0*UVスペクトル(ホ
スフェート緩衝液−7,0) :最大* : 220 nm (肩部)
289 nm
例10
ジデキシデニンー〇−スクシニル−t−7ミドカプロイルー(5−(アミドアリ
ル)−ウリジン−51−トリホスフェートコ−テトラリチウム塩
(Dig −11−trrp )
04sHss○23N4P3Lれ 分子量1148.5この化会物は、ジゴキシ
デニンー〇−スクシニル−t−アミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル5209(0,7!ミリモル)ts−アリルアミノ−UTP−テトラ
リチウム塩416.5η(0,74ミリモル)と例4と同様にして反応させるこ
とにより製造する。しかしイオン交換体クロマトグラフィトガ9によりct−型
のDEA3−七7アデツクス人−25を用−て行なり。
収童二56019=理論量の66係
分析H20測足: 8.1 %
元素分析(H2O含量を考慮して):
計算[C43,5% K 5.47% N 4.51 P 7.47%冥測値C
43,1% H5,3% N 4.5% P 7.55%UVスペクトル(ホス
フェート緩衝液−7,0) :Dig −11−dUTP K相当
例11
ジゴキシデニ/−0−スクシニル−r−アミドブチリル−8−7ミドカプロイル
ー[5−(アミドアリル)−クリジン−5′−トリホスフェートコ−テトラリチ
ウム塩
CDig −16−aUTP )
C49H?。024N5PIL14 分子量1233.7この化会物は、ジビキ
シrニンー〇−スクシニル−r−7ミドプチリルー1−アミドカプロン酸−N−
ヒドロキシスクシンイミドエステル250#(0,3ミリモル、例8により得ら
れる)を5−アリルアミノ−17TP −Li、 21419(0,38ミリモ
ル)と例9と同様にして反応させることにより製造する。
収量:218”P=理論量の59係
分析=H20測定=7.2係
元素分析(H2O測定[’に考慮して):計算値C’ 44.451 H5,6
7% N 5.、I P 7.01笑測16 c 44.I E 5.5チ N
5.3チ P7.1チUVスペクトル(ホスフェート緩衝液−7,0) :Di
g −16−aUTPに相当
例12
N−アジドベンゾイルー1.8−ジアミノ−3,6−シオキサオクタンの製造
アジド安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルCPierce社、D
−6054Roagau 1 ) 5.20!IC20ミリモル)t−無水酢
酸エステル中に溶かし、かつ1.8−ジアミノ−3#6−シオー?テオクタン2
9.3jllj(200ミリそル)を加える。反応1会*120℃で20#EI
PM暗所で攪拌する。俗剤を真空中で除去しかつ油状残渣を水300d中に浴解
する。生成物をトルエン21に用論てパーホレータ中で水相から抽出する。その
際に装置t−アルミニウムフォイルで巻付ける。抽出は約16時間後に終結して
いる。有機相を真空を用いて溶剤から分離し、かつ生成物を珪酸ゲルの′v4製
カシカラムクロマトグラフィラム80X10cm。
11!WIli剤:/クロホルム/メタノール/81フンモニフ溶液65:30
:5)により精製し、かつ高度真空中で溶剤の蒸発除去後に乾燥させる。
収量: 3.2.9 (55傷);黒色の粘稠な油状物例13
ジゴキシデニンー3−ヘミスクシネー)(N’−(4−アジドベンゾイル))−
8−7ミノー3.6−シオキサオクチルアミド(ホトジデキシグニン)の製造例
12からの生成物2,93 、S’ (I Dミリモル)を無水ジオキチン20
0d中に溶かし、かつジゴキシr二ンー3−へミスクシ$−)−N−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル〔製造はG、C,01ivsr、 Jr、 Brent
。
M、 Parker、 D、L、 Brasflel及びCh、W、 Park
er 。
” J、 clin、 Invest、 ’、 474je 1 () 35頁
(1986年)と同様にして行なう) 5.87 # (i 0ミリモル)を加
える。室温で20時間攪拌し、溶剤を真空中で除去し、かつ生じた生成物を中圧
液体調製クロマトグラフィにより分離する(カラム容量164 Q ILt、L
aboc−hrom Reversed−Phase−8i1ICa HD −
sxx、−18−30−60,溶離剤メタノール/水7二3+氷酢酸1係)。
相応する両分を集めた後で、溶剤を真空中で除去しかつ油状残渣をジオキサン中
に溶か丁。凍結乾燥及びジイソプロピルエーテル100ILtによる洗浄後に生
成物のジゴキシグニンー3−ヘミスクシネート(N’−(4−アジドベノゾイル
))−8−7ミノー3,6−シオキサオクチルアミドが無色の若干粘稠な固体と
して得られ、これを高度真空中で乾燥させる。
収1: t、91 (64% )
IR(アセトン):2150,1728.1639a−1
例14
1ランダムプライムド′fE、による核酸プα−プの標識性は
標鎗丁べさi鎖状DNA I Ailを10−2の容量で5分間梯騰嘔せかつ引
aいて氷上で急冷することにより変性した。その後、灰石容器中でデオキシアデ
ノクントリホス7エート、デオキシシチジントリホス7エート及びデオキシグア
ノシントリホス7エートの2ミリモル/l(D浴液各1μ)と変性DNAを曾し
た。これに、デオキシシチジントリホス7エート1.4ミリモル/1及び例4で
製造したようなジゴキクデニン−11−dUTP 0.6ミリモル/lを含有す
る溶液lAt−加えた。
その後、所謂反応混会物2μlを添加した。反応混合物は最も重要な取分として
所謂1ランダムへ中テヌクレオチド”を含有していた。これは化学的に合成した
6塩基の長さのオリゴヌクレオチドであり、その際に合成に当って各工程で4種
の丁べてのヌクレオチド(A、C,G及びT)が供給され、そn故可能なすべて
のオリゴヌクレオチド配列の混&物が生氏する。反応混合物の化学的組成はトリ
ス−Hci 0.5モル/l;MgCj、 0.1モル/lニジチオエリトリッ
ト1ミリモル/l:牛血清アルブミン、分子生物学的品質、2m9/d;ランダ
ムへキナヌクレオチド3.1259/ILt; 47.2 (20°C)でbつ
た。最後にクレノウボリメラーゼ1μj(2単位に相当)t−添加し、かつ混せ
物を滅菌水で最終容120μjにしかつ37℃で1時間恒温保持した。
その後、反応ヲ0.2モル/ l IDTA (エチレンジニトリロ−テトラ酢
酸) pHs、o 2 pi OmmK、より停止しかつ導入されなかったデオ
キシリボヌクレオシドトリホス7エートをエタノール沈殿により分離した。
このために恒温バッチに4モル/ l LiCJ 2μE及び−20℃1fζ前
冷却した無水エタノール60μj
【添Xし、1会しかつ沈殿バッチを一70℃で
30分間又は−20℃で一晩恒温保持した。引続いて1200X、9(X刃部速
度)で10分間遠心分離し、出没みをデカ/チージョンにより分離し、沈殿を冷
い70%エタノールで短時間洗^かつ最後に真空中で乾燥させた。標識した精製
DNA ’i T K−緩衝液(トリス−Hct 10ミリ七ル/ 71 ;
IDTA 1ミリモル/l ; pi−18,0) IPK再懸濁させた。
例15
曽ニックトランスレーション”法による核酸グローブの標識性は
標識丁べさDNA 1μI【デオキシアデノクントリホス7エート、デオキシシ
チジントリホス7エート及びデオキシグアノクントリホス7エートの0.4ミリ
モル/l溶液各1μlと1会した。その後、デオキシチミジントリホス7二−)
0.35ミリモル/l及び例4で製造したよりなりig −11−dUTP
Q、i 5ミリモル/lを含有する溶液1μlk添加した。更に、10倍濃y(
o緩衝溶1()すx −HD7 (1,5モル/ l z MgCl20.1モ
ル/l;ジチオエリトリット1ミリモル/I!:pH7,5)2aJiひに#素
溶液2xJ(DNA、trVメラーゼI2σ及びDNアーゼI 1.6 mff
k添加し、2回蒸留した滅菌水で最終容t20aJiC調製しかつバンチを1
4℃で60分間恒温保持した。
反応を例13と同様にKDTAで停止しかり標* DNAを前記のように精製し
かつ溶解した。
例16
テーリング@ (TaiLing Methode )による核酸プローブの標
識性は
酵素末端トランスフェラーゼを用^る3′−末端標識付けの際に、ジゴキシデニ
ンー11−ジデソキシウリジントリホス2エート全使用した。これは、出発物質
として2−デオキシチミジン塩の代りに5−アリルアミ/−2’、3’−ジデソ
キシーウリジンー5′−トリホス7エートーテトラリチウム塩を使用することを
除さ、例40記載と同様にして合成された。標識反応を次のように実施した:
1反応容器中で、標識付は緩衝液(カリウムーカコジレー)200mモル/l
; )リス−HCI 5 Q rnモル/l;牛血清アルプミ70.411h9
/l、 pJ(7−2) 25t−1゜25mモ/’ / I Coct2−溶
液5 DI %Eiael−切断pBR322−DNA1.5.a#及び25単
位に相当する末端トランスフェラーゼ5岸1t−混合し次。この1を、無菌の再
蒸溜水で48plK(、、最後に、ジゴキシグニン−l −(iaffPの0.
1mモル/j溶液2 xl t−添加した。
混合及び遠心の後に、37℃で、この反応物を1時間恒温保持した。
反応の停止及び導入されなかったヌクレオチドの分離は、例14の記載のように
行なった。
例17
転写法を用いる核酸プローブの標識付は反応原理は第5図に示されている。標識
付けのために使用されるDNAを転写ベクター$+SFT 181t6図及び第
10図)中に挿入した。このベクターは、SF3に対するプロモータ及びT 7
RNAボリメ2−ゼに対するプロモータを含有する。このDNA t” %標
識反応の前に、挿入されたDNA−配列及び10モータ並びにそのプロモータ及
びDNA−配列を結合する配列の外の1個所で線状化した。
この線状化された基質DNA 1μIに、1反応器中で、7デノシントリホス7
エート、クチジントリホスフェ−)及ヒゲアノシントリホスフェートの10mそ
ル/!溶液各1−lを添加した。これに、ウリジントリホスフェート6.5 m
モル/It及びジゴキシデニン−11−σTP 3.5 mモル/lを含有する
溶液1−jを添加した。例4におけるジコ1キクデニン−11−dUTPと同様
に、例10で、出発物質としてアリル7ミノーデソキシウリジン塩の代りにアリ
ルアミノーウリジ/を用いるだけで、ジゴキシrニンーi j −UTPを製造
する。
更に、このパッチに、10倍濃度の緩衝液(トリス−)ICj O,4モル/
l 、 MgC4260mモル/l、ジチオスレイトール50mモル/l、スペ
ルミジン40mモル/l、 pH7,2) 2 elk添加し、この童を、無菌
再蒸留水を充填して194とし、最後ic RNAポリメラーゼ(8P6もしく
はT7)10単位に相当する1μjの添加により、この反応1−開始させた。
短時間の遠心の後に、このパッチt−37℃で1時間恒温保持した。
この基質−DNAi、引続@ DNA5el (RNA5a−不含)1μ1(1
0単位IC相当)の添Wにより、37℃で15分間分解させた。
0.2モルll EDTA (pH8,0) 2μtの添加によりこの反応を停
止させた。得られたジゴキクーr二ンー標識されたRNAプローブを、1容量の
フェノールでの抽出及び引続く蛋白質及びヌクレオチドのエタノール沈殿によp
WI製し、最後に無菌緩衝液(トリス−HCj 。
10mモル/l、 ICDTA 1 mモル/j、pH8,0)中に溶かした。
有利に0.5〜1.0μ9/4の良度の、精製DNA−溶液(例13)と混合し
た。この混合物に、氷冷下に、フイリ:/、;’XHPLR4001F灯テ、I
Dcxt(D/Ql!隔で容器開口部上方から10〜30分間照射した。この
際、反応混合gIjは冷却保持すべきであった。
この反応の後に、0.1 M )リス−act (pH9,0)、1.0 mM
EDTA ’ii充横して100 atにした。
この溶gtブタンー2−オール1o04で振出し、短詩IQl遠心し、ブタノー
ル上層を除去した。
ブタン−2−オール抽出2ii″1回繰り返し、水相を、30〜40μ11で良
縮丁べきでるる。
キャリアの添加の後に、DNA(少量のDNA)を、3M酢酸す) +7ウム又
は相応する塩(例えば4 M DiCj )5μl及びエタノール100声IO
添mKより−20”0で1晩かかつて沈殿させた。
エッペンドルフ遠心機中、4℃で15分間の遠心分離の後に、ペレットヲ冷70
%エタノールで洗浄し、乾燥させ、0−1 mM EDTA中に溶かした。
ハイブリッド形成のためにニトロセルロースフィルター(5chlaicher
& 8chuell 、BA 135 ) fその上に固定されたDNAと共
に使用した。前ハイブリッド形成のために、フィルターt、xず、NaCj O
,75モル/j1クエン酸ナトリウム75mモル/l、カゼイン0.5 (w/
り係、ラウリルサルコシン0.1 (v/’v)優、ドデシル硫酸ナトリウム0
.02 (w/y)チよりなる浴液(20℃でのpH7,0)中、65’Oで1
時間恒温保持した。引続き、この溶液を1同じ地底でbるが付W的に例14〜1
6又に18で装造され標識された新線変性DNA100IR9/I&tの添加さ
れた組底の新製溶液で代え死。65℃で14時間改めて恒温保持した。その後、
非特異的に結合されたDNAを2洗浄工程により、即ちまずNaCj O,3モ
ル/j;クエ/散ナトリウム30mモル/l;ドデシル硫酸ナトリウム0.1
(w/りかうなる溶液(pi(7,0)で、室温で2X5分間、次りで、NaC
115mモル/l、クエン酸ナトリクム7.5mモル/l、ドデシル硫酸ナトリ
ウム0−1 (w/v)%よりなる溶ff1(pH7,0)で65℃で2×15
分間洗浄することKより除去した。
例20
標識付DNAプローブとのハイブリッド形成ハイブリッド形成及び引続く洗fP
を、記載のDNA −プローブを用^て例19iCおけると同様に実施した。
単に、この例に記載の変性標11 DNA−グローブの代りに、例17により標
識された新R変性RNA−プローブを使用した。
このハイブリッド形成溶液中におけるジデキシデエノー標識団人の濃度は、ハイ
ブリッド形成溶液1jLt当り、基質−DNA 100 n[の転写が起る程度
に選択した。
例21
検出系アルカリホスファターゼ/X−ホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウ
ムを周込る検出例19又は20からO)1イブリツド形属されたフィルターを、
lず、トリス−HCj O,1モル/!(pi−17,5);NaCj O,1
5モル/l中で1分間洗浄した。膜の非特異性茫合位置のブロックのために、引
続き力ぜイン0.5 (W/V) %と共にトリス−Hcl 0.1モル/1(
pki7.5 ) ; NaCj O−15モル/を中で@IAm動下に40分
間恒温保持した。
その後、抗体結合反応t−夾施した。
このために、at、抗−ジプキシグニン/アルカリホスファターゼ−複合体15
0711単位/dと共に、トリス−HCl Q、i%ル/l (pH7,5)
: NaCj O,15モル/l中で20分間恒温保持した。次いで、非特異的
に結合した蛋白質を、同じ緩衝液で2×15分洗浄することにより除去した。そ
の後、このフィルターを1トリス−MCI 0.1モル/ l (p’ 9−5
) s NaCJ D−1モル/ l ; MgCl250 ”モル/l中で
、5分間p)19.51で再平衡化した。即ち、アルカリホスファターゼは、高
い一一値でその活性至適t−有する。
結合した抗体−複合体及びこれとハイブリツド形成された標m DNAの検出に
、アルカリホスファターゼにより触媒作用される呈色反応により行なった。この
ためK、フイにターt−)すx −Hcl O,1モ/’/ l (pH9−5
) ; NaCj Q、iモル/ l z MgCl250 y1モル/l中で
恒温保持し、この際、溶液1Qid当り、ニトロブルーテトラゾリクムー溶液(
ジメチルホルムアミド70 Cv/v)%中7519/J+j ) 45 pl
及びX−lX7エート溶液(ジメチルホルムアミド中の5−プロモー4−クロロ
−3−インドリルホス7エー ) 5019/aIj)35μlt−添加した。
呈色反応は充分なeR素排除のもとに行ない、この際、膜をこの溶液と共に、1
シート(通常の料理用袋又は凍結用袋)中に封入し、暗所中に保持した。この呈
色反応は迅速に起こったが、強度は数日間にわたp増Wすることができた。この
結果の記録は、湿ったフィルターの写真もしくは写真複写により得た。久^でこ
のフィルターを乾燥させ、保持した。色は残存するが^、くらか!床がかった。
これは、フィルターの湿潤化により再び強めることができた。
例22
a)例14のa)でジゴキシデニンを用いて酵素標識されたDNA及びb〕ビオ
チンでg識されたDNAを用いる際のDNA−検出(サデンープロット)での感
度及びパックグラウンドの比較
■、ヒト胎盤−DNAを制限酵素KcoR1を用いて切断した。それからの種々
の量を7ガロースグルでの電気泳動[15分離し、引続きサブy @ (J、
Mo1. Biol。
98(1975)503)によp1ニトロセルロース−膜上に移行させた。この
膜上のDNAを真空箱中80℃で2時間ベーキングすることにより固定させた。
この膜を、ヒトの組織−プジスミノーrンアクチベータのcDNAic相当する
標識付@DN人−72グメン)(Pe−味り、 at、 al、 Nature
301 (1983) 214 )とハイブリッド形成させた。このヒト組織
−プ2スミノーデン7クチペータ遺伝子は、ヒトデツム中に1回存在する。この
遺伝子のcDNAは、このゲノムの相応するバンドとハイブリッド形成する。1
万で、このDNA −72グメントを、例14におけるように、ジゴキシデニン
で標識し、標kw* 100 、nit /lttと、例19におけると同様に
/1イブリッド形成させ、例21におけるようにこのハイブリッドを検出した。
他方で、この7ラグメン)k同様な方法でビオチンで標識付けた。この場会に、
ビオチア16−(lσTP (Brigati等によるVirolOg!’ 1
26 (1983)、32〜50)t−使用した。この膜上のDNA t″標識
DNA 50μI/ILtとハイブリッド形成させた。その他は、例19と同様
に実施した。検出は、ストレプトアビジン−アルカリホス7アターゼー複合体を
使用することを除いて例21の記載と同様に実施した。文献に記載のビオチン系
に関する方法と比較すると、ここに記載のビオチ標識付付けのための系(R8(
10!!1 prtmaa−IJarlcisrung e MlBCbnng
。
Biotin i 6− dσTP/(LTTP 、例19に記載の溶液での前
ハイブリッド形成、所定!1度のDNAとのハイブリッド形成、例21に記載の
溶液t−m^るグロツ中ングンは、より低込バックグラウンド(Einterg
runa )及びより高い感度を示した。しかしながら、最適系中のビオチンの
代りにジゴキシrニノの記載使用の@ICは、明白にパックグラウンドの更なる
減少が得られ、この際、感度は残留保持される(第8回診wA)。
例26
例1及び例2によるジゴキシグニ/で化学的に標識されたDNA t−用^る際
のDNA−検出(サデンープロット)にお−ける感度の比較
pBR328DNA k別個に制限11E RBgI I及びainflで切断
した。得られる7ラグメント同部を1廿した。
その後、この混合物は次の寸法の15 pBR328−;yラグメントを含有す
る: 2176.1766.1230.1033.653.517,453.3
94.298(=s1Mc)、234(2x)、220及び154(2X)bP
a
次いで、種々の量の72グメントを7ガロースデル電気泳動により分離させ、引
続きサデン法(1,Mob。
Biol、98(1975)、503)により、ニトロセルロース膜上に移行さ
せた。この!に真空中で80℃にXI熱することによるDNA−7ラグメントの
固定の後に、これを、例14によりジゴキシデニンで標識されたDNA 100
nl /Iltと、潟19の記載のようにハイブリッド形成させた。このハイ
ブリッドの検査を、例21の記載のよりに正確に笑凡した。第1表と組付せた第
9A図に示すよりに、フラグメントに、1〜0.1pi (D 1に1で検出で
きる。
比較として、PBR328DNA t″Na11で切断した。
大きさ810.724.696.597.522.507.364,351.2
44及び92 bpの1072グメントが生じる。ここでも種々のDNA −t
t−電気泳動にかけ、引続き、サデン法でニトロセルロース膜上に移行させた
。次いで、この膜を例19の記載とるように、標11pBR322200rsl
/1Llkハイブリッド形底に使用した。pBR328DNAは、グローブとし
て使用したpBR322DNAとに、810 bpの大きさC)Nci)−7ラ
グメント(pBR328はこれを有するがPBR322は有しな^)Vcよるち
が込があるだけである。
従ってこれは、ハイブリッド形成では検査されなめ。
このハイブリッド形成の後に、このハイブリッドを例21の記載と同様に検量し
た。第9B図と第1表との組合せが示すように、この方法では、25〜2.5
pilでの倉のDNA −7ラグメントを検出することができるだけである。こ
の醇素的標識付けにより、化学的標識付けに比べて数倍(25)も高いDNA−
検査の感夏に達する。
Q W
第■表: pBR328、NciI−切断:個々の7ラグメント中のDNAの量
と1バンド当夕の全DNA itとの関係
810 16.5 16.5 33.0 165.1 330.1724 14
.8* 14.8* 29.5* 147.5*295.1*696 14.2
* 14.2* 28.4* 141.8*283.7*597 12.2*
12.2* 24.3* 121.7*243.3*522 10.6* 10
.6* 21.3* 106.4*212.8*507 10.3* 10.3
* 20.7* 103.3*206.6*364 7.4 7.4 14.8
* 74.2*148.4*351 7.2 7.2 14.3* 71.5*
143.1*244 5.0 5.0 9.9 49.7* 99.4*92
1.9 1.9 5.7 18.7* 37.5*第9B図のプロットの湿fa
M上でなお良好に見えるフラグメントに*印を付し友。
例24
インシトウ ハイブリッド形成(in 5itu −Hybri−disier
ung )による固定HeLa−及び5iHa−細胞系中のHPV−配列の検出
本発明方法で、インシトウ ハイブリッド形成をキャリアー固定細胞及び細胞塗
床を用いて実施することができる。
この非放射性HPV−検出のために、2種の細胞系を用いた:
5iHa−細胞(RPV 2〜3コピー/M胞〕ATCC−/16HTB35
(Biology 159 (1987)387〜398〕、
HeLa−細胞(HPV 100〜200;ビー/細胞)ATCC−4CcL
2(Human Genettcs 77 (1987)251〜255)
DNA−グローブ:
HPV−DNA (配列: Progress med、 Vitrol、 3
2(1985)15行以降参照)。
標識付け:
ビオチン−11−dUTP (Blugene nonradioaktive
DNA、 Be8t、−Nr、 8279 SA der Fa、 Gibco
/BRL)ジビキシデニンーdUTP (例4及び14で製造及び標識付け)
”5−dATP (Axneraham −Buchler、 Be5t、Nr
、 S Jl 304 ) 、特異活性1200キユリ一/mモル、ハイブリッ
ド形成及び洗浄条件は、J、 mol、 Biol。
3(1961)585頁以降の記載による。
前記細胞系の細胞を、HCL精製(Q、i N HCl 、燐酸塩緩衝食塩(’
pBs )中、100℃で10分)にて洗浄し、引続きプラスチック培養シャー
レ中のU V −照射して牛胎児血清5チを有する最小必須培地(MEM )を
用vh 2 (MRIJ、PBS、 SSCに関しては5cience 130
(1959)、432頁以降参照)。
牛集密的セルラーゼの形成後に、この載物グラスを培養シャーレから取り出し、
PBSで数回洗浄した。
次いで、このガラス表面上での細胞の固定を続けて行なった。このために、4チ
バラホルムアルデヒドを用いた(室温で5分、次いで2 x ssc中で洗浄)
。
ハイブリッド形成は、シリコン処理されたカバーグラスの下で行なった。このた
めに、RPV−グローブのDNA’i、ハイブリッド形成溶液(非放射性プロー
ブ:2 On9/ハイブリツド形成領域、アイントーグー標職プローブ:5倍の
10’cpM/ハイブリッド形成領域を有する6n9)中で、セルラーゼ上に与
えた(前ハイブリッド形庭は例19の記載のように実施)。カバーグラスを載せ
た後、これを封じ九(例えばMorabuのF i xo gum で)。次い
で、11Ill胞又はDNA−グローブ中のDNAの変性を、載物グラスをヒー
ター上に3〜5分間載せることにより行なった。この際、温度センサー全周いて
載物グラス上の温度90〜92℃七測定し友。次いで載物グラスを短時間氷上に
置き、引続き、湿り友室(2x ssc )中で1晩恒温保持する。
カバーグラスを除いた後に、室温で2XSSC,11SDS′t−用いて2×1
5分間及び52℃で0−2 x ssc 。
0.1チSDS′に用いて2×10分間洗浄した。
非放射性系の場奮には、次いで例21の方法で、もしくはビオチン系中で操作し
た( BRL−キットの操作法参照:3チ牛血清アルブミンでのブロック、スト
レプトアビジンとアルカリホスファターゼとからの複合体の添加並びに基質混合
)。ジコ9キシデニン系では、例21と同様に実施した。酵素反応は、48時間
まで観察された。
グローブとして、HPv型18のゲノムのジゴキシゲ二ン標識サブ7ラグメント
(PNAS 80 (1983)3812〜3815、New Engl、 J
、 of Med、 310(1984)880〜886)上側用し友。ノコ9
キンy二ン系を用いてHeLa−細胞中の核領域の着色が明白に認められる。ハ
イブリッド形成前のDNアーゼ消化の後に、僅かな非特異的バックグラウンドの
みが残る。標識されたグローブ食除くと着色は起こらない。
1細胞当92〜3個のコピーHPVのみをゲノム中に組込んだ5iHa−細胞で
も、1晩かかってHPV−検出に成りNアーゼ−消化は僅かなパックグラウンド
をもたらす。標識されたプローブを除くと、細胞は着色されない。
他方、ビオチン標識プローブの使用の際の状態もある。このビオチン系は、5i
Ha−細胞を有するHeLa −細胞を僅かに着色するが、主として非特異的に
、このシトゾール(cytosol )が着色される。核領域は僅かに着色され
るだけでわる。ビオチン検出系の非特異性は、ビオチン標識プローブなしでもこ
のシトゾールの同様な着色が行なわれるが、単にストレプトアビジン−アルカリ
ホスファターダー複合体及び相応する色素系のδ加の後にのみ行なわれることか
らも明らかである。
放射性標識さnた353−プローブを用いると、 HeLa−及び5iHa−細
胞中のHPV−検出が可能であるが、このためには、2〜3週間のオートラジオ
グラフィが必袂である。
固定細胞でのインシトウバイブリット形成の際には、放射性標識プローブの使用
下における方法と比べて、本発明方法は、時間節約の利点を有し、ビオチン標識
グローブの使用下における方法に比べて、高い感度及び明白に高い特異性の利点
を有する。
固定細胞中でのインシトウバイブリット形成と並んで、本発明方法による系を用
いると、同様に塗沫組域例えば膣領域からのHPV−注入組織中でのRPV−検
出が可能である。
例25
クローニイーハイブリッド形成によるSUP 6tRNAの検出
サツカロミセス・セレビジアエ(Saccaromycescereviaia
e )からの5UP6tRNAの750 bp BamHニー7ラグメント(5
cience 209 (1978)、1396〜1460 ) k pUc
19 (Gene 133 (1985)、103〜119)中でクローニング
し、E、コリ臼101 (DSM 1607 )中に移行させた。対照としてp
UC19−ベクターのみ1iI−E、コリHB 101中に移行させた。その後
、交互に、インサート含有バクテリアを対照−形質導入体と並んでニトロセルロ
ース上に塗布し几。栄養培地を有する寒天プレート上、37℃で5時間の恒温保
持もの後に、このE、コリ細胞をアルカリ処理し、洗浄しかつ生じるDNAk
s 354 nmでの又又結合により膜固定した。引続き、再び50℃で6時間
洗浄し、例19と同様に前ハイブリッド形成−ジゴキシrニン標ml SUPt
RNA−BamHI−7ラグメント(例14により製造)でハイブリッド形成さ
せた。引続く検査のためには1時間で充分でらる。
このインサート含有バクテリアは、それぞれ、明瞭な信号を示し、対照形質導入
体に検査できない。検査時間の長期化は、正の信号を強化するが、対照形質導入
体は、長φ検査時間でもバックグラウンドなしのままでおる。
例26
ラムダプラークのインシトウバイブリッド形成インサートとしてのヒトウロキナ
ーゼの完全cDN入を有するラムダgt 10−ファージ(Mo1. Gen。
Genet、 150 (1977)、53)を、インジケータプレート上で、
1プレート上に約500のプラークが認められる1で恒温保持した。もう1つの
他のプレート上に、ウロキナーゼ組換え体及び同じファージ量からの、遺伝子パ
ンクのへテロrンボビュレーションよりなる混合物を塗布した。このプレートは
、クロキナーゼ組換え体のみが、ハイブリッド形成グローブとしてのウロキナー
ゼcDNAと共に正の信号を生じるので、対照としての役目?有する。丁べての
プレートから、5cience 196 (1977)、180の記載のように
、2個のニトロセルロース−プルーフ(Abkla−tsche ) k製造し
、ハイブリッド形成させた。
このプローブは、ヒトウロキナーゼCDNA %−金含有るプラスミド12μg
2 Pst Iで消化することにより製造した。この場合に、cDNへのi、
1kl)一部分フラグメントが生じるから、これ′kt気泳動にLシ溶駈させた
(収菫約2μg)。
この部分7ラグメントの標鐵付けを、例14と同様に実施する。このフィルター
の前ノーイブリッド形成及びハイブリッド形成は、例19と同様に行なった。更
なる検食工8は、例21と同様に行なった。
ウロキナーゼ組換え7アージのみを含有するプレートのフィルターは、すべての
ファージに関して第2のプルーフ中でも良好に認められる正の信号を示し次こと
が明らかであった。この混合の場合には、組換え体7アーシが添加された程度の
多量の正信号を認めることができた。他のインサートを有するラムダファージは
正の信号を示さなかった。
例27
ノデンープロツトーハイブリツド形成【酵母からのアクチン−mRNAの検出】
この本発明の系は、ノデンプロットによるRNAの敏感かつ特異的な検出のため
に好適である。これを開示するために、全酵母−RNA (サツカロミセス・セ
ルビジアエ)中のアクチン−mRNA k検出した。このアクチン−遺伝子(R
NA877 (1980)、6912〜3916)は、2個のエキンン(Exo
n )及び1個のイントロンより広る。転写の際に、まず前駆体−ぶ八が生じる
( 1967 Ba5en )oキャッピング(capplng )、スプライ
シング(Splicing )及びポリアデニル化(Polyadenylie
rung ) (Meth、 inEnzymol。65(1980)、380
〜391及びPNAS TTSA 77 (1880) 5201〜5205の
記載のように実施)の後に、約1400塩基(塩基1670+ボIJ A )の
長さの成熟mRNAが生じる。
その後、T、 Maniatis等によるMo1ecular Cloning
(Co1d Spring Harbor Laboratory、Co1d
SpringHarbor、 New York (1982)に記載のように
ニトロセルロース上への移行を行なう。前−及び主−ハイブリッド形成及び検査
(18時間)Fi、例19の記載と同様に行なう。検量のために、アクチン−遺
伝子の2.3 KB−アクチア −EcoFII / Hind I−7ラグメ
ントより成るノコ9キシゲニン標識アクチン特異性グローブ全使用した。
例28
スロット−プロット分析(5lot−blot−Analyse )によるヒト
血清中のへバテチスB−ウィルス(REV )の検出
ヘパテチスB−ウィルスは、粉状相補的二本鎖より構成されている約32 kb
の長さの塊状rツムを有すムー不備の3′−末端は変動性である。相補的二本鎖
の5′−末端は相互に置換されている。DNA−塩基上のHBV−検出のために
、二本鎖領域Core−抗体並びにPrae −81−1Prae −S 2−
及びX−抗体の部分を有する(1.4〜3.2kbの位[)ジゴキシyニン標R
i、8kb Ban HI −7ラグメント(製造は例14による)を10−プ
として使用した。シゴキシrニン検出と平行して、ビオチン−(例24)及び3
2p−標識プロープ(BRL−キットの操作と同様に標誠付け。例24参照)を
用いた。
試験ヒト血清は、免疫学的マーカーHB5Ag% HBcAg。
抗−HB8及び抗−HBcのベースで正又は負に等綴付けきれている。
血清−準備:
二重測定のために、遠心分離した血清100μlに0.5 M NaQH3D
Oμl 7!−加える。室温で5分間恒温保持の後に、改めて5分間遠心分離す
る。各々200μノの上演み7MinifoM■喉置の櫛形スリット中にピペッ
ト装入し、次いで真空にする。
ナイロン−フィルターの準備:
バイオダインナイロンM (Biodyn Nylon−Membran;孔寸
法1.2 ttrx ; Pa1l Bio 5upport Div、 Gl
en Cove 。
N、Y、 ) i小室の大きさに切り、次のように準備する:蒸留水中に5分間
入れる、
10 X 880915分間、
ワットマン[F]−紙上で加熱ランプ下で5分乾燥させる、
10 x 5sc−宮浸ワットマン■−紙上に置き、Mtntfo1#−装置中
に入れる。
次いでこの試料集合プレートラフイルター上に置き、枠固定し、引続き血清を温
顔する。
フィルターの引続く処理:
Minifold”−装置からフィルターを取り出し、それぞれ5分間1 []
X 8SC,5x ssc及び1X SSC上に直ぐ。引続き加熱ランプ下で
乾燥させ、冥窒中80℃で2時間ベーキングする。
前ハイブリッド形成及びハイブリッド形ffk例19と同様に行なう。
放射性試料の製造は、BOEHRINGERMANNHEIM GMBHBes
t、 Nr、 999644のSp 6 / T 7転写キツトの操作法に従っ
て行なう。
前ハイブリッド形成、ハイブリッド形成、洗浄及び32p−試料の発生は−rニ
アテス(Maniatis ; 5upra)に記載のように行なう。
本発明方法を用いると、スロット−プロットでの信号が、正の血清のみで得られ
、負の血清で¥i得られないことが明らかである。免疫血:ar用いる対照反応
は、同様に負でおる。相応する放射性検出との比較は、同様な特異性で示す。こ
れに反して、ビオチン系では、明白に高められたバックグラウンドが認められる
。
本発明による方法によるRPV−検出は非常に敏感でおる。稀釈列で、10−4
〜10−5の血清稀釈列までのHPV−列t@出することができる。このことは
、この放射性基での感度に相当する。相応する負−血清は、非放射性系で稀釈し
ない場合に信号を生じる。この稀釈列でも、ビオチン系では明白なバックグラウ
ンドが認めら几る。
例29
ジゴキシゲニン標識dUTP ’iポリメラーゼチェーン反応(PCB、欧州特
計第0200362号と同様)で、増暢DNAの標R付けに使用する。
試料としてグラスミドpBR322k使用するニプライマー1: 5’ −()
CTCCCTCGTGC()CTCTCCT()T−3’プライマー2 : 5
’ −CCGCCTACATACCTCGCTCTGC−3’試料11011)
、 プライ?−1300’f1g、プライマー2 300ng、各々1mモル/
lのdATP %dCTR。
dGTP、dTTP、)リス−HC1(p88.8 ) 67mモル/11 中
oシコ+シpy−ニン−dUTP O,1m%ル/ l5MgC1@ 6.7
mモ”’ / l %硫酸アンモニウム16.67ILモル/It、メルカプト
エタノール1mモル/l及び牛血溝0.17 FILモルフm295℃で2分間
変性させ、4了Cで3分間ハイブリッド形成させる。その後、テルムス・アクア
チフス(Thermus aquaticus ) DNA−ポリメラーゼ6U
’kl加し、65℃で3分間恒温保持する(ポリメライズする)(この反応量は
50μ!であジ、この濃度は、この反応量に関連する)。合計25サイクル(変
性、ハイブリッド形成、ポリメライジング)會実施した◎
引続き、この反応バッチの各1/sを0.8チアガロースゲル中で分離し、サイ
ン法(J、 Mo1. Biol、 98(1975)、503)によりナイロ
ンwx(例えばHybond −H、AXnersham )上に移行させる。
1:10〜1 : 10’の稀釈でナイロン膜上に温顔し、固定してもよい。こ
のフィルターのブロッキング、複合反応及び着色を例21と同様に実施する。
aコ
ヘ
へ
FIG 、 4
高感度DNA検出
直鎖状変性フくζ
エラ7 p” 、!、wヤケ、り、オヶド ■上 ◆dATP、dCTP、dG
TP、dTTPリレノウ ・ 二t=−11−dUTP↑フィルター結合DJ、
J、4
赤色/青色
FIG、7
ジゴキシデニノー3−ヘミヌクシネートー/p;’ −(4−アジドベンゾイル
)/−8−アミノ−6,6−ジ万キサオクチ・レアミド(ホトジゴキンデニ7)
C1合成式
ジゴキシケ9ニンとビ万チ/の感度の比較FIG、9
本発明による酵素標識(A)の感度と公知の化学的標識(B)の感度の比較
FIG、9A
FIG、9B
3101 TATA
FIG 、 10 B
psP718 制限地図
手続補正書(目射
平成 1 年 9月/Z日
Claims (22)
- 1.規定された配列の核酸を、化学的結合を介して標識としてのハブテン少なく とも1個を結合含有する相補性核酸プローブとハイブリッド形成することにより 検出する方法において、水素架橋形成に関与しない核酸プローブの部位少なくと も1つに少なくとも4原子の長さの架橋員を介して結合しているステロイドをハ プテンとして使用し、かつハイブリッド形成されたプローブを標識抗−ハブテン −抗体を介して検出することを特徴とする核酸の検出法。
- 2.ステロイドとしてジゴキシゲニン又はジゴキシンを使用することを特徴とす る請求項1記載の方法。
- 3.ハブテンが原子数4〜32の長さの架橋員を介してプローブに結合して存在 することを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 4.ハブテンが原子数11〜16の長さの架橋員を介してプローブに結合して存 在することを特徴とする請求項3記載の方法。
- 5.架橋員が親水基を有することを特徴とする請求項1から4までのいずれか1 項記載の方法。
- 6.架橋員が直鎖であることを特徴とする請求項1から5までのいずれか1項記 載の方法。
- 7.架橋員が分枝鎖でありかつ連鎖末端の少なくとも1つでハブテン分子を含有 することを特徴とする請求項1から6までのいずれか1項記載の方法。
- 8.ハブテンが架橋員を介して核酸プローブの塩基又はリボース部分に結合して いることを特徴とする請求項1から7までのいずれか1項記載の方法。
- 9.ハプテンが架橋員を介してウラシル又はシトシンのC5−位にもしくはアデ ニン又はグアニンのC8−位に結合していることを特徴とする請求項8記載の方 法。
- 10.ハブテンが架橋員を介してリボースの2′−位に結合していることを特徴 とする請求項8記載の方法。
- 11.ハブテンと架橋員との間の結合がエステルー,アミド−又はエーテル結合 であることを特徴とする請求項1から10までのいずれか1項記載の方法。
- 12.ハブテンを核酸プローブ中に酵素的にDNAポリメラーゼ,RNAポリメ ラーゼ,リバーストランスクリプターゼ又はターミナルトランスフエラーゼ及び 相応するハブテン変性デオキシ−又はリポヌクレオシドトリホスフエート基質を 用いて導入した核酸プローブを使用することを特徴とする請求項1から11まで のいずれか1項記載の方法。
- 13.ハブテンを核酸プローブ中に光化学的にホトハブテンを用いて導入した核 酸プローブを使用することを特徴とする請求項1から11までのいずれか1項記 載の方法。
- 14.ハブテンを核酸中に化学的にオリゴデオキシリポヌクレオチド合成の範囲 において、置換可能なアミノ官能基で変性された保護されているヌクレオシドホ スホアミジツトの導入及び一保護基の除去後に一変性オリゴデオキシリボヌクレ オシドとハブテンの活性エステル、アミド又はエーテルとの反応により導入した 核酸プローブを使用することを特徴とする請求項1から11までのいずれか1項 記載の方法。
- 15.抗一ハブテン−抗体の標識として酵素標識、放射性標識、けい光標識又は (バイオ)ルミネセンス標識を使用することを特徴とする請求項1から14まで のいずれか1項記載の方法。
- 16.抗−ハブテン−抗体の酵素標識に標識酵素としてアルカリ性ホスフアター ゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼを使用することを特徴とする請 求項15記載の方法。
- 17.標識酵素の触媒活性の測定をレドツクス系を介して行なうことを特徴とす る請求項16記載の方法。
- 18.標識酵素の触媒活性の測定をロイコ系を介して行なうことを特徴とする請 求項16又は17記載の方法。
- 19.測定を酸化可能な化合物としてのインジゴイド系及び酸化剤としてのテト ラゾリウム塩を介して行なうことを特徴とする請求項16から18までのいずれ か1項記載の方法。
- 20.標識酵素としてアルカリ性ホスフアターゼを使用しかつ測定をレドツクス 系のX−ホスフエート/ニトロプルーテトラゾリウムを介して行なうことを特徴 とする請求項19記載の方法。
- 21.検出すべき核酸を対象キャリア上に固定された細胞中でインシトウ−ハイ ブリツド形成により検出することを特徴とする請求項1から20までのいずれか 1項記載の方法。
- 22.検出すべき核酸を組織−塗沫標本中でインシトウ−ハイブリツド形成によ り検出することを特徴とする請求項1から20までのいずれか1項記載の方法。
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