JPH0731194B2 - 核酸の検出法 - Google Patents
核酸の検出法Info
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- JPH0731194B2 JPH0731194B2 JP1501143A JP50114389A JPH0731194B2 JP H0731194 B2 JPH0731194 B2 JP H0731194B2 JP 1501143 A JP1501143 A JP 1501143A JP 50114389 A JP50114389 A JP 50114389A JP H0731194 B2 JPH0731194 B2 JP H0731194B2
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、標識された相補性核酸プローブとハイブリツ
ド形成することにより、規定された配列の核酸を検出す
る方法に関する。
ド形成することにより、規定された配列の核酸を検出す
る方法に関する。
たいていの場合に適用される分子生物学的方法の１つは
相同核酸配列を検出するためのDNA/DNA−,RNA/RNA−も
しくはRNA/DNA−ハイブリツド形成である。その際に、
プローブ（Sonde）として使われる核酸（DNA又はRNA）
を標識し、かつこれをほとんどの場合フイルターに固定
された試験すべき核酸（DNA又はRNA）とハイブリツド形
成条件下に接触させる。プローブとして使用した核酸と
検出すべき核酸との間に相同性が存在すればその都度相
補性の核酸一本鎖がハイブリツド二本鎖の形成下にハイ
ブリツド形成される。引続いて、ハイブリツドが検出さ
れる。従来は、たいていの場合プローブの標識は放射性
誘導のデオキシリボヌクレオシドトリホスフエートの導
入により行なつた。ハイブリツドの検出はオートラジオ
グラフイにより行なつた。このような常用の放射性標識
したDNAプローブは非常に効果的で、敏感であるが、こ
れは放射性問題を甘受して達成される。放射性化合物を
扱うためには、扱いが適切でないと実験室の安全性が損
なわれることがあるので特別な教育を受けた人を必要と
する。更に、放射性化合物の廃棄が他の問題をひき起こ
す。しかも放射性標識したプローブは使用した放射性物
質の半減値のために製造してから一定期間しか使用する
ことができない。また、検出すべきDNAの量が僅少であ
る場合の検出にはオートラジオグラフイーの必要露光時
間は非常に長いこともあり、つまり数日間乃至数週間の
ことがある。
相同核酸配列を検出するためのDNA/DNA−,RNA/RNA−も
しくはRNA/DNA−ハイブリツド形成である。その際に、
プローブ（Sonde）として使われる核酸（DNA又はRNA）
を標識し、かつこれをほとんどの場合フイルターに固定
された試験すべき核酸（DNA又はRNA）とハイブリツド形
成条件下に接触させる。プローブとして使用した核酸と
検出すべき核酸との間に相同性が存在すればその都度相
補性の核酸一本鎖がハイブリツド二本鎖の形成下にハイ
ブリツド形成される。引続いて、ハイブリツドが検出さ
れる。従来は、たいていの場合プローブの標識は放射性
誘導のデオキシリボヌクレオシドトリホスフエートの導
入により行なつた。ハイブリツドの検出はオートラジオ
グラフイにより行なつた。このような常用の放射性標識
したDNAプローブは非常に効果的で、敏感であるが、こ
れは放射性問題を甘受して達成される。放射性化合物を
扱うためには、扱いが適切でないと実験室の安全性が損
なわれることがあるので特別な教育を受けた人を必要と
する。更に、放射性化合物の廃棄が他の問題をひき起こ
す。しかも放射性標識したプローブは使用した放射性物
質の半減値のために製造してから一定期間しか使用する
ことができない。また、検出すべきDNAの量が僅少であ
る場合の検出にはオートラジオグラフイーの必要露光時
間は非常に長いこともあり、つまり数日間乃至数週間の
ことがある。
放射性標識した核酸検出系とともに非放射性方法も公知
であり、その場合には使用する核酸プローブはビチオン
分子（米国特許第2915082号明細書，ヨーロツパ公開特
許第0063879号明細書），ジゴキシン−/T3−/T4−分子
（ヨーロツパ公開特許第173251号明細書）又はアルキル
−／ブチル−／エチル−／スルホン酸−／ニトロソ分子
（ヨーロツパ公開特許第128018号明細書）で変性されて
いる。相補性核酸プローブ中へのこれらの低分子量検出
分子の導入は化学的に、光化学的に又は酵素的に行な
う。その後で、検出すべき核酸配列とのハイブリツド形
成を行なう。ハイブリツドの検出は低分子量分子の結合
を介してビオチンの場合は（ストレプト）−アビジン−
標識酵素複合体，ジゴキシン−/T3−/T4−分子の場合は
抗ジゴキシン／−T3−/T4−抗体−標識酵素−複合体に
より又は抗−アルキル−／−ブチル−／−エチル−／−
スルホン酸−／−ニトロソ−抗体−標識酵素−複合体を
介して行なう。ハイブリツド形成による生成物の検出は
標識酵素の酵素活性を結合した色素系を介して測定する
ことにより行なう。しかしヨーロツパ公開特許第173251
号明細書の方法では、ジゴキシン/T3−/T4−分子が、水
素架橋結合に関与する、核酸プローブの塩基１個又は数
個のＮ原子に結合し、それ故検出すべき核酸とのハイブ
リツド形成は−とりわけプローブの多回変性の場合に−
損なわれることがある。ビオチン／（ストレプト）−ア
ビジン−系を除いて、目下知られている非放射性系の感
度は放射性系と比較して少なくとも1/10乃至1/100に低
下する。ビオチン／（ストレプト）−アビジンをベース
とする従来の唯一高い非放射性検出の感度は、特にビオ
チン／（ストレプト）−アビジン系の高い結合定数（Ｋ
＝1015モル-1）に基いている〔Lit.Kinow;“Proc.Natl.
Acad.Sci.USA",第80巻,4045頁（1983年）〕。ビオチン
／（ストレプト）−アビジン系の達成可能な最大感度は
ドツト・ブロツト（Dot−Blot）におけるDNA1pg〜0.1pg
の検出及びゲノムDNAフラグメント10〜１μｇを使つた
ゲノムブロツトの“シクグルコピー（Single−copy）”
遺伝子，即ちゲノムにたつた１回だけ出現する遺伝子の
検出における放射性標識の場合と同じである。しかしビ
オチン／（ストレプト）−アビジン−相互作用の利用に
は、ビタミンであるビオチンが殆んどすべての生物学的
物質中に産生するので、その相互作用が非常に妨害され
易いという決定的な欠点がある〔“Biochem.Biophys.Ac
ad",第29巻,225頁（1985年）；“Biochem.Biophys。Act
a",第41巻,122頁（1960年）〕。
であり、その場合には使用する核酸プローブはビチオン
分子（米国特許第2915082号明細書，ヨーロツパ公開特
許第0063879号明細書），ジゴキシン−/T3−/T4−分子
（ヨーロツパ公開特許第173251号明細書）又はアルキル
−／ブチル−／エチル−／スルホン酸−／ニトロソ分子
（ヨーロツパ公開特許第128018号明細書）で変性されて
いる。相補性核酸プローブ中へのこれらの低分子量検出
分子の導入は化学的に、光化学的に又は酵素的に行な
う。その後で、検出すべき核酸配列とのハイブリツド形
成を行なう。ハイブリツドの検出は低分子量分子の結合
を介してビオチンの場合は（ストレプト）−アビジン−
標識酵素複合体，ジゴキシン−/T3−/T4−分子の場合は
抗ジゴキシン／−T3−/T4−抗体−標識酵素−複合体に
より又は抗−アルキル−／−ブチル−／−エチル−／−
スルホン酸−／−ニトロソ−抗体−標識酵素−複合体を
介して行なう。ハイブリツド形成による生成物の検出は
標識酵素の酵素活性を結合した色素系を介して測定する
ことにより行なう。しかしヨーロツパ公開特許第173251
号明細書の方法では、ジゴキシン/T3−/T4−分子が、水
素架橋結合に関与する、核酸プローブの塩基１個又は数
個のＮ原子に結合し、それ故検出すべき核酸とのハイブ
リツド形成は−とりわけプローブの多回変性の場合に−
損なわれることがある。ビオチン／（ストレプト）−ア
ビジン−系を除いて、目下知られている非放射性系の感
度は放射性系と比較して少なくとも1/10乃至1/100に低
下する。ビオチン／（ストレプト）−アビジンをベース
とする従来の唯一高い非放射性検出の感度は、特にビオ
チン／（ストレプト）−アビジン系の高い結合定数（Ｋ
＝1015モル-1）に基いている〔Lit.Kinow;“Proc.Natl.
Acad.Sci.USA",第80巻,4045頁（1983年）〕。ビオチン
／（ストレプト）−アビジン系の達成可能な最大感度は
ドツト・ブロツト（Dot−Blot）におけるDNA1pg〜0.1pg
の検出及びゲノムDNAフラグメント10〜１μｇを使つた
ゲノムブロツトの“シクグルコピー（Single−copy）”
遺伝子，即ちゲノムにたつた１回だけ出現する遺伝子の
検出における放射性標識の場合と同じである。しかしビ
オチン／（ストレプト）−アビジン−相互作用の利用に
は、ビタミンであるビオチンが殆んどすべての生物学的
物質中に産生するので、その相互作用が非常に妨害され
易いという決定的な欠点がある〔“Biochem.Biophys.Ac
ad",第29巻,225頁（1985年）；“Biochem.Biophys。Act
a",第41巻,122頁（1960年）〕。
それ故本発明の課題は、非放射性標識の使用を可能にし
かつビオチン／（ストレプト）−アビジン−相互作用よ
りも妨害されにくいものであつて、しかも従来の放射性
標識もしくはビオチン／（ストレプト）−アビジン−標
識が持つ無類に高い検出感度を達成する核酸の検出法を
開示することであつた。
かつビオチン／（ストレプト）−アビジン−相互作用よ
りも妨害されにくいものであつて、しかも従来の放射性
標識もしくはビオチン／（ストレプト）−アビジン−標
識が持つ無類に高い検出感度を達成する核酸の検出法を
開示することであつた。
本発明により、この課題は、化学結合を介して少なくと
も１個のハプテンを標識として結合含有する相補性核酸
プローブとハイブリツド形成することにより規定配列の
核酸を検出する方法において、ハプテンとして、水素架
橋形成に関与しない核酸の少なくとも１つの部位に原子
少なくとも４個の長さの架橋員を介して結合しているス
テロイドを使用し、かつハイブリツド形成したプローブ
を標識抗−ハプテン−抗体を介して検出することを特徴
とするその方法により解決される。
も１個のハプテンを標識として結合含有する相補性核酸
プローブとハイブリツド形成することにより規定配列の
核酸を検出する方法において、ハプテンとして、水素架
橋形成に関与しない核酸の少なくとも１つの部位に原子
少なくとも４個の長さの架橋員を介して結合しているス
テロイドを使用し、かつハイブリツド形成したプローブ
を標識抗−ハプテン−抗体を介して検出することを特徴
とするその方法により解決される。
ステロイドとしてジゴキシゲニン又はジゴキシンを使用
すると優れている。
すると優れている。
本発明方法により、ドツト・ブロツトにおいて相同DNA
0.5pg〜0.05pg及びゲノムDNAフラグメント５μｇ〜0.5
μｇにおいてシングルコピー遺伝子の検出が可能であ
る。両方の検出法において、検出感度はビオチン／（ス
トレプト）−アビジン系の検出感度と少なくとも同じで
ある。このことは、ビオチン／（ストレプト）−アビジ
ン−相互作用の結合定数〔Ｋ＝1015モル-1;Green,N.M.,
“Adv.Protein Chem.",第29巻,85〜133頁（1975）;Chai
et,L.,Wolf,F.J.,“Arch.Biochem.Biophys.",第106巻,1
〜５頁（1964）〕がジゴキシゲニン又はジゴキシンと相
応する抗体との相互作用〔Ｋ＝２×108モル-1〜７×10
19モル-1,Hunter及びその他，“J.Immwnol.",Vol129,N
o.3,1165（1982）〕より少なくとも105倍も高く、かつ
更にビオチン／（ストレプト）−アビジン相互作用が
（ストレプト）−アビジン上の４個のビオチン結合部位
の存在により促進されるので驚異的である。
0.5pg〜0.05pg及びゲノムDNAフラグメント５μｇ〜0.5
μｇにおいてシングルコピー遺伝子の検出が可能であ
る。両方の検出法において、検出感度はビオチン／（ス
トレプト）−アビジン系の検出感度と少なくとも同じで
ある。このことは、ビオチン／（ストレプト）−アビジ
ン−相互作用の結合定数〔Ｋ＝1015モル-1;Green,N.M.,
“Adv.Protein Chem.",第29巻,85〜133頁（1975）;Chai
et,L.,Wolf,F.J.,“Arch.Biochem.Biophys.",第106巻,1
〜５頁（1964）〕がジゴキシゲニン又はジゴキシンと相
応する抗体との相互作用〔Ｋ＝２×108モル-1〜７×10
19モル-1,Hunter及びその他，“J.Immwnol.",Vol129,N
o.3,1165（1982）〕より少なくとも105倍も高く、かつ
更にビオチン／（ストレプト）−アビジン相互作用が
（ストレプト）−アビジン上の４個のビオチン結合部位
の存在により促進されるので驚異的である。
もう１つの驚異的な技術的利点は、ジゴキシゲニン又は
ジゴキシンと対応する抗体とを使用する際に、検出すべ
き核酸が固定されているフイルターへの非特異的結合
（バツクグラウンド）がビオチン／（ストレプト）−ア
ビジンを使う場合より著しく低いことである。
ジゴキシンと対応する抗体とを使用する際に、検出すべ
き核酸が固定されているフイルターへの非特異的結合
（バツクグラウンド）がビオチン／（ストレプト）−ア
ビジンを使う場合より著しく低いことである。
核酸を検出するための本発明方法の実施は次の３つの段
階に区分することができる。
階に区分することができる。
1.検出試薬としての核酸プローブをハプテンで誘導合成
する， 2.ハイブリツド形成， 3.ハイブリツドの検出。
する， 2.ハイブリツド形成， 3.ハイブリツドの検出。
核酸（DNA及びRNA）の誘導合成には種々の方法を適用す
ることができる〔Maniatis及びその他，“Molecular Cl
oning",（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory,New
York,Cold Spring Harbor在〕。この際、ハプテンの導
入は酵素的，化学的又は光化学的に行なうことができ
る。
ることができる〔Maniatis及びその他，“Molecular Cl
oning",（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory,New
York,Cold Spring Harbor在〕。この際、ハプテンの導
入は酵素的，化学的又は光化学的に行なうことができ
る。
“ランダム プライムド（Random−primed）”法〔“An
al.Biochem.",132,6（1983）〕では二本鎖デオキシリボ
核酸プローブを初めに変性し、つまり両方の鎖を加熱に
より分離し、それによつて核酸の一本鎖に変える。一本
鎖のデオキシリボ核酸プローブでは変性は行なわない。
デオキシリボ核酸の一本鎖に、一本鎖DNAの相補性配列
断片とハイブリツド形成する異なる配列を有する任意の
短いオリゴデオキシリボヌクレオチドである所謂“ラン
ダムプライマー”を結合させる。引続いて、“ランダム
プライマー”の３′−OH末端から出発して酵素のクレノ
ウポリメラーゼ（Klenow Polymerase）又は他のDNAポリ
メラーゼ（例えばフアージT4又はT7コードした又はTher
mus aquaticusから）の作用により一本鎖に対して相補
性の鎖を合成する。その際に基質として供給した４種の
デオキシリボヌクレオシドトリホスフエートが導入され
る。４種のこのトリホスフエートまで、一部又は全部が
架橋員を介してステロイドの結合により誘導され、そえ
故デオキシリボ核酸合成の際にこのステロイドが一緒に
導入される。ステロイドが誘導合成されたヌクレオシド
トリホスフエートは第１図で２つの異なる優れた架橋鎖
長で図示されている。
al.Biochem.",132,6（1983）〕では二本鎖デオキシリボ
核酸プローブを初めに変性し、つまり両方の鎖を加熱に
より分離し、それによつて核酸の一本鎖に変える。一本
鎖のデオキシリボ核酸プローブでは変性は行なわない。
デオキシリボ核酸の一本鎖に、一本鎖DNAの相補性配列
断片とハイブリツド形成する異なる配列を有する任意の
短いオリゴデオキシリボヌクレオチドである所謂“ラン
ダムプライマー”を結合させる。引続いて、“ランダム
プライマー”の３′−OH末端から出発して酵素のクレノ
ウポリメラーゼ（Klenow Polymerase）又は他のDNAポリ
メラーゼ（例えばフアージT4又はT7コードした又はTher
mus aquaticusから）の作用により一本鎖に対して相補
性の鎖を合成する。その際に基質として供給した４種の
デオキシリボヌクレオシドトリホスフエートが導入され
る。４種のこのトリホスフエートまで、一部又は全部が
架橋員を介してステロイドの結合により誘導され、そえ
故デオキシリボ核酸合成の際にこのステロイドが一緒に
導入される。ステロイドが誘導合成されたヌクレオシド
トリホスフエートは第１図で２つの異なる優れた架橋鎖
長で図示されている。
“スペシフイク プライムド（Specific−primed）”法
では“ランダム・プライマー",つまり種々の配列を有す
る短いオリゴ−デオキシリボヌクレオチドの代りに“ス
ペシフイク・プライマー（Specific−primer）",つまり
特異的配列を有するオリゴ−デオキシリボヌクレオチド
を使用する。この特異的プライマーは均一に一本鎖DNA
の相補的配列断片にだけ結合する。相補的鎖の合成はラ
ンダムプライマー法とは反対にこの一定の配列断片から
だけ開始する。基質として供給した４種のデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフエートが導入される。この４種
のトリホスフエートまでは一部又は全部が架橋員を介す
るステロイドの結合により誘導合成され、そえ故デオキ
シリボ核酸合成ではこのステロイドが一緒に導入され
る。
では“ランダム・プライマー",つまり種々の配列を有す
る短いオリゴ−デオキシリボヌクレオチドの代りに“ス
ペシフイク・プライマー（Specific−primer）",つまり
特異的配列を有するオリゴ−デオキシリボヌクレオチド
を使用する。この特異的プライマーは均一に一本鎖DNA
の相補的配列断片にだけ結合する。相補的鎖の合成はラ
ンダムプライマー法とは反対にこの一定の配列断片から
だけ開始する。基質として供給した４種のデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフエートが導入される。この４種
のトリホスフエートまでは一部又は全部が架橋員を介す
るステロイドの結合により誘導合成され、そえ故デオキ
シリボ核酸合成ではこのステロイドが一緒に導入され
る。
“逆転写”法〔Efstratiadis,A.F.C.,Villa−Koma−rof
f,L.“Genetic Engeneering"（Stelow,J.K.及びHollaen
der,A.,eds.）Plenum Press,New York及びLondon在,Vo
l.1,1頁以下〕では一本鎖のリボ核酸プローブ又は変性
後，即ち一本鎖に変換後の二本鎖リボ核酸プローブを逆
転写する、つまり相応するデオキシリボ核酸を形成す
る。このために、一本鎖リボ核酸プローブにオリゴ−デ
オキシリボヌクレオチドの“プライマー”を相補的配列
断片で結合させる。引続いて、結合した“プライマー”
の３′−OH末端から開始して酵素の逆転写酵素の作用に
よりRNA一本鎖に相補的なDNA鎖が合成される。逆転写酵
素としては例えばウイルスAMV又はMo−MLVコードした酵
素を使用する。DNA鎖合成の際に基質として供給される
４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフエートが導
入される。この４種のトリホスフエートまでは一部又は
全部が架橋員を介するステロイドの結合により誘導合成
され、それ故DNA合成の際にこのステロイドは一緒に導
入される。
f,L.“Genetic Engeneering"（Stelow,J.K.及びHollaen
der,A.,eds.）Plenum Press,New York及びLondon在,Vo
l.1,1頁以下〕では一本鎖のリボ核酸プローブ又は変性
後，即ち一本鎖に変換後の二本鎖リボ核酸プローブを逆
転写する、つまり相応するデオキシリボ核酸を形成す
る。このために、一本鎖リボ核酸プローブにオリゴ−デ
オキシリボヌクレオチドの“プライマー”を相補的配列
断片で結合させる。引続いて、結合した“プライマー”
の３′−OH末端から開始して酵素の逆転写酵素の作用に
よりRNA一本鎖に相補的なDNA鎖が合成される。逆転写酵
素としては例えばウイルスAMV又はMo−MLVコードした酵
素を使用する。DNA鎖合成の際に基質として供給される
４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフエートが導
入される。この４種のトリホスフエートまでは一部又は
全部が架橋員を介するステロイドの結合により誘導合成
され、それ故DNA合成の際にこのステロイドは一緒に導
入される。
“フイル イン（Fill−in）”法では、突出している
５′一本鎖末端を有する二本鎖デオキシリボ核酸プロー
ブを誘導合成する。そのために、酵素のクレノウ・ポリ
メラーゼ又は他のDNAポリメラーゼ（例えばフアージT4
又はT7コードした）により、突出していない一本鎖の
３′−OH末端を相補的に突出している５′一本鎖配列に
対して伸長する。その際に、５′−突出一本鎖領域の配
列に応じて供給される４種のデオキシリボヌクレオシド
トリホスフエートまで導入される。この４種のトリホス
フエートまでは一部又は全部が架橋員を介するステロイ
ドの結合により誘導合成され、それ故ヌクレオチドの導
入の際にこのステロイドは一緒に導入される。
５′一本鎖末端を有する二本鎖デオキシリボ核酸プロー
ブを誘導合成する。そのために、酵素のクレノウ・ポリ
メラーゼ又は他のDNAポリメラーゼ（例えばフアージT4
又はT7コードした）により、突出していない一本鎖の
３′−OH末端を相補的に突出している５′一本鎖配列に
対して伸長する。その際に、５′−突出一本鎖領域の配
列に応じて供給される４種のデオキシリボヌクレオシド
トリホスフエートまで導入される。この４種のトリホス
フエートまでは一部又は全部が架橋員を介するステロイ
ドの結合により誘導合成され、それ故ヌクレオチドの導
入の際にこのステロイドは一緒に導入される。
“ニツクトランスレーシヨン”法〔“J.Mol.Biol.",第1
13巻,237頁（1977年）〕では二本鎖デオキシリボ核酸プ
ローブを酵素のE.コリDNAポリメラーゼＩ並びに少量のD
NアーゼＩと一緒に基質として使われる４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフエートの存在において恒温
保持する。酵素DNアーゼＩにより一本鎖断片、所謂“ニ
ツク”が生じる。これにより切断された一本鎖中に５′
−末端と３′−末端が生じる。引続いて、酵素E.コリDN
AポリメラーゼＩにより内部一本鎖断片で５′−末端デ
オキシリボヌクレオシドが分解され、それと同時に基質
として供給されるデオキシリボヌクレオチドの１つの
３′−OH末端に導入される。ヌクレオチドの分解及び新
規導入が同時に繰返されることにより一本鎖断片は３′
−末端の方向に移動する。基質として供給した４種のト
リホスフエートまでは一部又は全部が架橋員を介するス
テロイドの結合により誘導合成され、それ故ヌクレオチ
ドの新規導入の際にこのステロイドは一緒に導入され
る。
13巻,237頁（1977年）〕では二本鎖デオキシリボ核酸プ
ローブを酵素のE.コリDNAポリメラーゼＩ並びに少量のD
NアーゼＩと一緒に基質として使われる４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフエートの存在において恒温
保持する。酵素DNアーゼＩにより一本鎖断片、所謂“ニ
ツク”が生じる。これにより切断された一本鎖中に５′
−末端と３′−末端が生じる。引続いて、酵素E.コリDN
AポリメラーゼＩにより内部一本鎖断片で５′−末端デ
オキシリボヌクレオシドが分解され、それと同時に基質
として供給されるデオキシリボヌクレオチドの１つの
３′−OH末端に導入される。ヌクレオチドの分解及び新
規導入が同時に繰返されることにより一本鎖断片は３′
−末端の方向に移動する。基質として供給した４種のト
リホスフエートまでは一部又は全部が架橋員を介するス
テロイドの結合により誘導合成され、それ故ヌクレオチ
ドの新規導入の際にこのステロイドは一緒に導入され
る。
“テーリング（Tailing）”法では二本鎖又は一本鎖の
デオキシリボ核酸−又はリボ核酸プローブの３′−OH末
端に、酵素のターミナルトランスフエラーゼを用いて基
質として有用なデオキシリボヌクレオシドトリホスフエ
ート，ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフエート又
はリボヌクレオシドトリホスフエートの少なくとも１種
の存在においてこれらのヌクレオチドの少なくとも１種
を加える。使用したトリホスフエートがここでも一部又
は全部架橋員を介してステロイドが結合することにより
誘導合成され、それ故ヌクレオチドの導入によりこのス
テロイドも一緒に導入される。
デオキシリボ核酸−又はリボ核酸プローブの３′−OH末
端に、酵素のターミナルトランスフエラーゼを用いて基
質として有用なデオキシリボヌクレオシドトリホスフエ
ート，ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフエート又
はリボヌクレオシドトリホスフエートの少なくとも１種
の存在においてこれらのヌクレオチドの少なくとも１種
を加える。使用したトリホスフエートがここでも一部又
は全部架橋員を介してステロイドが結合することにより
誘導合成され、それ故ヌクレオチドの導入によりこのス
テロイドも一緒に導入される。
フアージ−RNA−ポリメラーゼで触媒される“転写（Tra
nskriptions）”法〔“J.Mol.Biol.",第166巻,477頁（1
983年）〕ではデオキシリボ核酸依存性リボ核酸合成の
際に形成されたリボ核酸が誘導合成される。フアージコ
ードしたRNAポリメラーゼとしては、例えばフアージSP6
−,T7−又はT3コードした酵素を使用する。この方法に
は、例えばSP6−,T7−又はT3プロモータを含有する二本
鎖デオキシリボ核酸を使用する。例えばSP6−,T7−又は
T3−RNAポリメラーゼ及び全４種のリボヌクレオシドト
リホスフエートの添加により相同性プロモータから出発
して、コドゲンのデオキシリボ核酸に相補的なリボ核酸
鎖，転写が形成される。その際に、基質として供給した
リボヌクレオシドトリホスフエートが導入される。４種
までのこのトリホスフエートの一部又は全部は架橋員を
介するステロイドの結合により誘導合成され、それ故リ
ボ核酸合成の際にこのステロイドが一緒に導入される。
nskriptions）”法〔“J.Mol.Biol.",第166巻,477頁（1
983年）〕ではデオキシリボ核酸依存性リボ核酸合成の
際に形成されたリボ核酸が誘導合成される。フアージコ
ードしたRNAポリメラーゼとしては、例えばフアージSP6
−,T7−又はT3コードした酵素を使用する。この方法に
は、例えばSP6−,T7−又はT3プロモータを含有する二本
鎖デオキシリボ核酸を使用する。例えばSP6−,T7−又は
T3−RNAポリメラーゼ及び全４種のリボヌクレオシドト
リホスフエートの添加により相同性プロモータから出発
して、コドゲンのデオキシリボ核酸に相補的なリボ核酸
鎖，転写が形成される。その際に、基質として供給した
リボヌクレオシドトリホスフエートが導入される。４種
までのこのトリホスフエートの一部又は全部は架橋員を
介するステロイドの結合により誘導合成され、それ故リ
ボ核酸合成の際にこのステロイドが一緒に導入される。
“光化学的”方法〔“Nucl.Acids Res.",13巻,745〜761
頁（1985年）〕では核酸プローブをフオトジゴキシゲニ
ン（第２図）の存在においてUV部分を含む可視光線で照
射する。窒素（N2）の脱離下にニトレン基が生成し、こ
れが核酸に共有結合する。
頁（1985年）〕では核酸プローブをフオトジゴキシゲニ
ン（第２図）の存在においてUV部分を含む可視光線で照
射する。窒素（N2）の脱離下にニトレン基が生成し、こ
れが核酸に共有結合する。
“化学的”方法に関してはオリゴデオキシリボヌクレオ
チド合成の範囲でホスフイツト−トリエステル法（Phos
phit−Triester−Methods）により、保護されたヌクレ
オシドホスホラミジツト（Nukleosid−phosphora−midi
t:dA/dG/dC/dT）と共に、置換可能なアミノ官能基で変
性され、保護されたヌクレオシド−ホスホラミジツト
（dA/dG/dC/dT）がオリゴデオキシリボヌクレオチド一
本鎖中への導入に使用される。dC/dUの変性は有利にピ
リミジン環の５位で、dA/dGのそれは有利にプリン分子
の８位で起る。
チド合成の範囲でホスフイツト−トリエステル法（Phos
phit−Triester−Methods）により、保護されたヌクレ
オシドホスホラミジツト（Nukleosid−phosphora−midi
t:dA/dG/dC/dT）と共に、置換可能なアミノ官能基で変
性され、保護されたヌクレオシド−ホスホラミジツト
（dA/dG/dC/dT）がオリゴデオキシリボヌクレオチド一
本鎖中への導入に使用される。dC/dUの変性は有利にピ
リミジン環の５位で、dA/dGのそれは有利にプリン分子
の８位で起る。
合成サイクルの終結及び保護基の脱離後に、ヌクレオ塩
基で置換可能なアミノ官能基で変性された一本鎖のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドが生成し、これを好適なハ
プテンで標識することができる。そのようなハプテンは
ステロイド，殊にジゴキシゲニン，ジゴキシンであり、
つまりオリゴデオキシリボヌクレオチドをハプテンの相
応する活性エステル，アミド又はエーテル，殊にそのＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させること
により標識する。
基で置換可能なアミノ官能基で変性された一本鎖のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドが生成し、これを好適なハ
プテンで標識することができる。そのようなハプテンは
ステロイド，殊にジゴキシゲニン，ジゴキシンであり、
つまりオリゴデオキシリボヌクレオチドをハプテンの相
応する活性エステル，アミド又はエーテル，殊にそのＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させること
により標識する。
本発明の優れた実施形では、ハプテンが核酸プローブ中
に酵素的にDNA−ポリメラーゼ,RNA−ポリメラーゼ，リ
バーストランスクリプターゼ又はターミナルトランスフ
エラーゼ及び相応するハプテン変性デオキシ−又はリボ
ヌクレオシドトリホスフエート基質により導入された核
酸プローブを使用する。
に酵素的にDNA−ポリメラーゼ,RNA−ポリメラーゼ，リ
バーストランスクリプターゼ又はターミナルトランスフ
エラーゼ及び相応するハプテン変性デオキシ−又はリボ
ヌクレオシドトリホスフエート基質により導入された核
酸プローブを使用する。
本発明のもう１つの優れた実施形ではハプテンを核酸プ
ローブ中に光化学的にホトハプテンにより導入した核酸
プローブを使用し、かつ第３の優れた実施形ではハプテ
ンを核酸プローブ中に、化学的にオリゴデオキシリボヌ
クレオチド合成の範囲で、置換可能なアミノ官能基で変
性され、保護されたヌクレオシドホスホラミジツトを導
入しかつ保護基の除去後に変性オリゴデオキシリボヌク
レオチドとハプテンの活性エステルとを反応させること
により導入した核酸プローブを使用する。
ローブ中に光化学的にホトハプテンにより導入した核酸
プローブを使用し、かつ第３の優れた実施形ではハプテ
ンを核酸プローブ中に、化学的にオリゴデオキシリボヌ
クレオチド合成の範囲で、置換可能なアミノ官能基で変
性され、保護されたヌクレオシドホスホラミジツトを導
入しかつ保護基の除去後に変性オリゴデオキシリボヌク
レオチドとハプテンの活性エステルとを反応させること
により導入した核酸プローブを使用する。
記載の方法を介して製造し、ステロイドで誘導合成した
核酸プローブを、キヤリアに結合した変性DNA又はRNAと
接触させ、かつこの際に温度，イオン濃度,pH値及び他
の緩衝条件は−核酸プローブの長さ及びそれから得られ
る所定のハイブリツドの溶融温度に相応して−、標識し
たDNA又はRNAが相同性DNA又はRNAに結合し得るように選
択する（ハイブリツド形成）〔“J.Mol.Biol.",第98巻,
503頁（1975年）；“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",76巻,36
83頁（1979年）〕。キヤリアとしては、ニトロセルロー
スをベースとする膜又はキヤリア材料（例えばSchleich
er ＆ Schuell BA 85;Amersham Hybond C），強化又は
結合粉末状ニトロセルロースもしくは種々の官能基で誘
導合成されたナイロン膜（例えばSchleicher ＆ Schuel
l Nytran,NEN Gene Screen,Amersham Hybond N,Pall Bi
odyne）が好適である。
核酸プローブを、キヤリアに結合した変性DNA又はRNAと
接触させ、かつこの際に温度，イオン濃度,pH値及び他
の緩衝条件は−核酸プローブの長さ及びそれから得られ
る所定のハイブリツドの溶融温度に相応して−、標識し
たDNA又はRNAが相同性DNA又はRNAに結合し得るように選
択する（ハイブリツド形成）〔“J.Mol.Biol.",第98巻,
503頁（1975年）；“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",76巻,36
83頁（1979年）〕。キヤリアとしては、ニトロセルロー
スをベースとする膜又はキヤリア材料（例えばSchleich
er ＆ Schuell BA 85;Amersham Hybond C），強化又は
結合粉末状ニトロセルロースもしくは種々の官能基で誘
導合成されたナイロン膜（例えばSchleicher ＆ Schuel
l Nytran,NEN Gene Screen,Amersham Hybond N,Pall Bi
odyne）が好適である。
ハイブリツド形成したDNA又はRNAの検出は、キヤリアを
十分に洗浄しかつ非特異的結合を回避するために抗体又
は抗体フラグメントで飽和した後で恒温保持する。この
抗体又は抗体フラグメントは誘導合成の際に核酸プロー
ブ中に導入されるステロイドハプテンに対して作用す
る。キヤリアは接合して標識を担持する。抗体の恒温保
持後に、特異的に結合した抗体複合体だけを検出するた
めに再び洗浄する。測定は抗体又は抗体フラグメントの
標識を介して公知方法により行なう。
十分に洗浄しかつ非特異的結合を回避するために抗体又
は抗体フラグメントで飽和した後で恒温保持する。この
抗体又は抗体フラグメントは誘導合成の際に核酸プロー
ブ中に導入されるステロイドハプテンに対して作用す
る。キヤリアは接合して標識を担持する。抗体の恒温保
持後に、特異的に結合した抗体複合体だけを検出するた
めに再び洗浄する。測定は抗体又は抗体フラグメントの
標識を介して公知方法により行なう。
ハプテンを核酸プローブに結合する架橋員の長さは４〜
32個の原子であつてもよい。この際に、架橋員は、原子
C,O,S及び／又はＮを含有する分子から構成されてい
る。更に大きな連鎖長も可能であるが、感度低下を考慮
すべきであるので意味がない。
32個の原子であつてもよい。この際に、架橋員は、原子
C,O,S及び／又はＮを含有する分子から構成されてい
る。更に大きな連鎖長も可能であるが、感度低下を考慮
すべきであるので意味がない。
本発明の優れた実施形では、ハプテンは原子11〜16個の
長さの架橋員を介してプローブに結合している。架橋員
が疎水基と親水基を含有すると優れている。
長さの架橋員を介してプローブに結合している。架橋員
が疎水基と親水基を含有すると優れている。
優れた実施形では架橋員は直鎖状である。もう１つの実
施形では架橋員は分枝鎖から成りかつ連鎖末端の少なく
とも１つにハプテン分子を有する。分枝鎖架橋員の連鎖
末端に数個のハプテン分子が存在すると検出の感度を付
加的に高めることができる。
施形では架橋員は分枝鎖から成りかつ連鎖末端の少なく
とも１つにハプテン分子を有する。分枝鎖架橋員の連鎖
末端に数個のハプテン分子が存在すると検出の感度を付
加的に高めることができる。
ステロイドハプテンと架橋員との結合は殊はエステル
‐，アミド‐又はエーテル結合である。
‐，アミド‐又はエーテル結合である。
架橋員を介して行なわれるステロイドハプテンの核酸プ
ローブへの結合は核酸プローブの末端位又は非末端位の
ホスフエート基を介しても可能であり、また糖残基又は
塩基を介しても可能である。しかし架橋員を介して行な
われるハプテンの結合は、両方の相補性核酸鎖の間の水
素架橋形成を損なわないように行なうべきである。
ローブへの結合は核酸プローブの末端位又は非末端位の
ホスフエート基を介しても可能であり、また糖残基又は
塩基を介しても可能である。しかし架橋員を介して行な
われるハプテンの結合は、両方の相補性核酸鎖の間の水
素架橋形成を損なわないように行なうべきである。
ハプテンが架橋員を介して核酸プローブの塩基又はリボ
ース成分に結合していると優れており、その際にハプテ
ンが架橋員を介してウラシル又はシトシンのC5−位，ア
デニン又はグアニンのC8−位にもしくはリボースの２′
−位に結合すると特に優れている。
ース成分に結合していると優れており、その際にハプテ
ンが架橋員を介してウラシル又はシトシンのC5−位，ア
デニン又はグアニンのC8−位にもしくはリボースの２′
−位に結合すると特に優れている。
抗ハプテン抗体又は抗体フラグメントの標識化は公知方
法で行なう。例えば、酵素標識，放射性標識，（バイ
オ）ルミネセンス標識又はけい光標識が好適である。ア
ルカリ性ホスフアターゼ，ペルオキシダーゼ又はβ−ガ
ラクトシダーゼのような酵素による酵素標識を適用する
と優れている。標識酵素としてアルカリ性ホスフアター
ゼを使うと特に優れている。アルカリ性ホスフアターゼ
の測定は酸化可能な化合物としてロイコ系，特にインジ
ゴイド系を介して行なう（ヨーロツパ特許第228663号参
照）。酸化剤としてはテトラゾリウム塩が有用である。
標識酵素のアルカリ性ホスフアターゼではレドツクス系
としてＸ−ホスフエート／ニトロブル−テトラゾリウム
を使用すると優れている〔F.P.Altmann,Tetrazolium Sa
lts and Formazans,Progr.Histochem.Cytochem.,Vol.91
3,第１頁（1976年）,Gustav Fischer Verlag出版,Stutt
gart在〕。Ｘ−ホスフエートとは５−ブロム−４−クロ
ル−３−インドリルホスフエートの一般名であり、かつ
ニトロブル‐テトラゾリウムは化合物3,3′−（3,3′−
ジメトキシ−4,4′−ビフエニレン）−ビス−５−フエ
ニル−２−（４−ニトロフエニル）−テトラゾリウムク
ロリドを表わす〔F.P.Altmann,Tetrazolium Salts and
Formazans,Progr.Histochem.Cytochem.,Vol.913,第１頁
以下（1976年）,Gustav Fischer Verlag出版,Stuttgart
在〕。アルカリ性ホスフアターゼは発色性基質，この場
合にはＸ−ホスフエートを分解し、これがホスフエート
の脱離及び酸化により青色の難溶性の二量体を形成し、
その際に同時にテトラゾリウム化合物が同様に青色であ
る難溶性のホルマザンに還元される。このレドツクス反
応は第３図に示されている。
法で行なう。例えば、酵素標識，放射性標識，（バイ
オ）ルミネセンス標識又はけい光標識が好適である。ア
ルカリ性ホスフアターゼ，ペルオキシダーゼ又はβ−ガ
ラクトシダーゼのような酵素による酵素標識を適用する
と優れている。標識酵素としてアルカリ性ホスフアター
ゼを使うと特に優れている。アルカリ性ホスフアターゼ
の測定は酸化可能な化合物としてロイコ系，特にインジ
ゴイド系を介して行なう（ヨーロツパ特許第228663号参
照）。酸化剤としてはテトラゾリウム塩が有用である。
標識酵素のアルカリ性ホスフアターゼではレドツクス系
としてＸ−ホスフエート／ニトロブル−テトラゾリウム
を使用すると優れている〔F.P.Altmann,Tetrazolium Sa
lts and Formazans,Progr.Histochem.Cytochem.,Vol.91
3,第１頁（1976年）,Gustav Fischer Verlag出版,Stutt
gart在〕。Ｘ−ホスフエートとは５−ブロム−４−クロ
ル−３−インドリルホスフエートの一般名であり、かつ
ニトロブル‐テトラゾリウムは化合物3,3′−（3,3′−
ジメトキシ−4,4′−ビフエニレン）−ビス−５−フエ
ニル−２−（４−ニトロフエニル）−テトラゾリウムク
ロリドを表わす〔F.P.Altmann,Tetrazolium Salts and
Formazans,Progr.Histochem.Cytochem.,Vol.913,第１頁
以下（1976年）,Gustav Fischer Verlag出版,Stuttgart
在〕。アルカリ性ホスフアターゼは発色性基質，この場
合にはＸ−ホスフエートを分解し、これがホスフエート
の脱離及び酸化により青色の難溶性の二量体を形成し、
その際に同時にテトラゾリウム化合物が同様に青色であ
る難溶性のホルマザンに還元される。このレドツクス反
応は第３図に示されている。
他の好適な標識系〔（バイオ）−ルミネセンス標識，け
い光標識，放射性標識〕の検出は公知方法で実施する。
い光標識，放射性標識〕の検出は公知方法で実施する。
本発明方法を更に詳説するために第４図で原子11個の架
橋員を介してdUTPに結合しているハプテンとしてのジゴ
キシゲニンを使つて図示した。
橋員を介してdUTPに結合しているハプテンとしてのジゴ
キシゲニンを使つて図示した。
特に有利に本発明方法を次のものに適用することができ
る： 固定された全細胞，固定された組織塗沫標本及び単離し
た染色体（中期染色体）とのインシトウ（in situ）ハ
イブリツド形成 コロニ‐ハイブリツド形成（細胞）及びプラークハイブ
リツド形成（フアージ及びウイルス） ノザンハイブリツド形成（RNA検出） 血清分析（血清中のウイルス‐及び細菌感染の検出，血
清中の細胞の細胞型分析；例えばスロツトプロツト分
析） もう１つの優れた実施形では本発明による測定法を実施
する前にヨーロツパ公開特許第0200362号明細書に記載
されているように試料の増幅を行なう。
る： 固定された全細胞，固定された組織塗沫標本及び単離し
た染色体（中期染色体）とのインシトウ（in situ）ハ
イブリツド形成 コロニ‐ハイブリツド形成（細胞）及びプラークハイブ
リツド形成（フアージ及びウイルス） ノザンハイブリツド形成（RNA検出） 血清分析（血清中のウイルス‐及び細菌感染の検出，血
清中の細胞の細胞型分析；例えばスロツトプロツト分
析） もう１つの優れた実施形では本発明による測定法を実施
する前にヨーロツパ公開特許第0200362号明細書に記載
されているように試料の増幅を行なう。
本発明の他の目的は規定配列の核酸（試料）の検出法で
あり、これは試料を変性後、一方がその配列において検
出すべき核酸の鎖の部分配列に相補性でありかつ他方が
検出すべき核酸の同じ鎖の他の部分配列と同一である少
なくとも２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）で処
理し（ハイブリツド形成）、ポリメラーゼ，殊にtaq-DN
A−ポリメラーゼ，デオキシリボヌクレオチド及び、水
素架橋結合に関与していないデオキシリボヌクレオチド
の部位に少なくとも４個の原子の架橋員を介して結合し
ているステロイドを化学的に結合含有するデオキシリボ
ヌクレオチド少なくとも１個で処理し（重合）、かつ引
続いて変性、ハイブリツド形成及び重合より成るサイク
ルを少なくとも１回は繰り返すと、試料に相補性の標識
されている核酸が生成し、かつこのようにして生成した
標識核酸を標識抗‐ハプテン‐抗体を介して検出するこ
とを特徴とする。優れた実施形ではデオキシリボヌクレ
オチド，標識デオキシリボヌクレオチド及びプライマー
を既に変性反応前に添加する。
あり、これは試料を変性後、一方がその配列において検
出すべき核酸の鎖の部分配列に相補性でありかつ他方が
検出すべき核酸の同じ鎖の他の部分配列と同一である少
なくとも２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）で処
理し（ハイブリツド形成）、ポリメラーゼ，殊にtaq-DN
A−ポリメラーゼ，デオキシリボヌクレオチド及び、水
素架橋結合に関与していないデオキシリボヌクレオチド
の部位に少なくとも４個の原子の架橋員を介して結合し
ているステロイドを化学的に結合含有するデオキシリボ
ヌクレオチド少なくとも１個で処理し（重合）、かつ引
続いて変性、ハイブリツド形成及び重合より成るサイク
ルを少なくとも１回は繰り返すと、試料に相補性の標識
されている核酸が生成し、かつこのようにして生成した
標識核酸を標識抗‐ハプテン‐抗体を介して検出するこ
とを特徴とする。優れた実施形ではデオキシリボヌクレ
オチド，標識デオキシリボヌクレオチド及びプライマー
を既に変性反応前に添加する。
他の優れた実施形では、サイクルの経過後試料に相補性
の固相に固定された核酸を加え、ハイブリツド形成反応
を実施し、かつ固相と液相との分離後に固相中の標識を
測定する。
の固相に固定された核酸を加え、ハイブリツド形成反応
を実施し、かつ固相と液相との分離後に固相中の標識を
測定する。
本発明の他の目的は、規定配列の核酸（試料）の検出法
であり、これは試料を変性後、一方がその配列において
検出すべき核酸の鎖の部分配列に相補性でありかつ他方
が検出すべき核酸の同じ鎖の他の部分配列と同一である
少なくとも２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）で
処理し（ハイブリツド形成）、デオキシリボヌクレオチ
ド、ポリメラーゼ，殊にtaq-DNA-ポリメラーゼで処理し
（重合）、引続いて変性、ハイブリツド形成及び重合よ
り成るサイクルを少なくとも１回は繰り返し、かつ最後
に水素架橋結合に関与していないデオキシリボヌクレオ
チドの部位に少なくとも４個の原子の架橋員を介して結
合しているステロイドを化学的に結合含有するデオキシ
リボヌクレオチド少なくとも１個の存在においてサイク
ルを繰り返すと、試料に相補性の標識されている核酸が
生成し、かつこのようにして生成した標識核酸を標識抗
ハプテン抗体を介して検出することを特徴とする。
であり、これは試料を変性後、一方がその配列において
検出すべき核酸の鎖の部分配列に相補性でありかつ他方
が検出すべき核酸の同じ鎖の他の部分配列と同一である
少なくとも２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）で
処理し（ハイブリツド形成）、デオキシリボヌクレオチ
ド、ポリメラーゼ，殊にtaq-DNA-ポリメラーゼで処理し
（重合）、引続いて変性、ハイブリツド形成及び重合よ
り成るサイクルを少なくとも１回は繰り返し、かつ最後
に水素架橋結合に関与していないデオキシリボヌクレオ
チドの部位に少なくとも４個の原子の架橋員を介して結
合しているステロイドを化学的に結合含有するデオキシ
リボヌクレオチド少なくとも１個の存在においてサイク
ルを繰り返すと、試料に相補性の標識されている核酸が
生成し、かつこのようにして生成した標識核酸を標識抗
ハプテン抗体を介して検出することを特徴とする。
他の優れた実施形ではサイクルの終結後、試料に相補性
の固相に固定した核酸を添加し、ハイブリツド形成反応
を実施し、かつ固相と液相との分離後に固相中の標識を
測定する。
の固相に固定した核酸を添加し、ハイブリツド形成反応
を実施し、かつ固相と液相との分離後に固相中の標識を
測定する。
この方法の他の条件は例えばヨーロツパ公開特許第0200
362号明細書に記載されておりかつポリメラーゼチエー
ン反応（PCR）という名前で知られている。
362号明細書に記載されておりかつポリメラーゼチエー
ン反応（PCR）という名前で知られている。
次に、本発明を添付図面に基づき実施例により詳説す
る。
る。
第１図は原子数11個の長さの架橋員を介して、ジゴキシ
ゲニン分子で標識されたデオキシウリジントリホスフエ
ートを示し； 第２図はホトジゴキシゲニンを示し； 第３図はレドツクス系のＸ−ホスフエート／ニトロブル
−テトラゾリウムを介して酵素のアルカリ性ホスフアタ
ーゼを検出する際の呈色反応を示し； 第４図は本発明によるDNA検出の優れた実施形を示し； 第５図はSP6−もしくはT7RNAポリメラーゼで触媒される
転写法によりプラスミドpSPT18を用いて行なうRNA転写
の製造を示し； 第６図はプラスミドpSPT18の種々のDNA領域を示し； 第７図はホトジゴキシゲニンを製造するための合成式を
示し； 第８図はサザン法（Southern−Blotting und Hybridisi
erung）により胎盤DNAを検出するに当つて、ハプテンと
してジゴキシゲニンを用いる本発明による検出の感度と
ビオチン／ストレプトアビシンによる検出の感度との比
較を示し； 第９図はDNA検出における本発明による酵素標識（Ａ）
の感度と公知の化学的標識（Ｂ）の感度との比較を示
し； 第10図はpSPT18のDNA配列（Ａ）及び制限地図（Ｂ）を
示す。
ゲニン分子で標識されたデオキシウリジントリホスフエ
ートを示し； 第２図はホトジゴキシゲニンを示し； 第３図はレドツクス系のＸ−ホスフエート／ニトロブル
−テトラゾリウムを介して酵素のアルカリ性ホスフアタ
ーゼを検出する際の呈色反応を示し； 第４図は本発明によるDNA検出の優れた実施形を示し； 第５図はSP6−もしくはT7RNAポリメラーゼで触媒される
転写法によりプラスミドpSPT18を用いて行なうRNA転写
の製造を示し； 第６図はプラスミドpSPT18の種々のDNA領域を示し； 第７図はホトジゴキシゲニンを製造するための合成式を
示し； 第８図はサザン法（Southern−Blotting und Hybridisi
erung）により胎盤DNAを検出するに当つて、ハプテンと
してジゴキシゲニンを用いる本発明による検出の感度と
ビオチン／ストレプトアビシンによる検出の感度との比
較を示し； 第９図はDNA検出における本発明による酵素標識（Ａ）
の感度と公知の化学的標識（Ｂ）の感度との比較を示
し； 第10図はpSPT18のDNA配列（Ａ）及び制限地図（Ｂ）を
示す。
例１ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−〔５−（アミドアリ
ル）−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエ
ート〕−テトラリチウム塩 （Dig−４−dUTP） C39H52O21N3P3Li4 分子量1019.5 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル200mg（0.34ミリモル）をジメチル
ホルムアミド7ml中に溶かし、かつH2O6ml中の５−アリ
ルアミノ−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホス
フエート−テトラリチウム塩186mg（0.34ミリモル）の
溶液に添加する。この反応混合物に0.1m硼酸Na緩衝液
（pH8.5）62mlを加えかつ室温で一晩約15時間攪拌す
る。
ル）−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエ
ート〕−テトラリチウム塩 （Dig−４−dUTP） C39H52O21N3P3Li4 分子量1019.5 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル200mg（0.34ミリモル）をジメチル
ホルムアミド7ml中に溶かし、かつH2O6ml中の５−アリ
ルアミノ−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホス
フエート−テトラリチウム塩186mg（0.34ミリモル）の
溶液に添加する。この反応混合物に0.1m硼酸Na緩衝液
（pH8.5）62mlを加えかつ室温で一晩約15時間攪拌す
る。
この後で、濾紙電気泳動（0.05mクエン酸塩緩衝液,pH5.
0）によりUV光線下に未反応の５−アリルアミノ−dUTP
と共に若干深くまで展開した所望の生成物のスポツトが
認められる。
0）によりUV光線下に未反応の５−アリルアミノ−dUTP
と共に若干深くまで展開した所望の生成物のスポツトが
認められる。
精製は例９と同様に行なう。
収量:130mg＝理論量の37％ UVスペクトル（ホスフエート緩衝液,pH7.0）： 最大値220nm,290nm 例２ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロン
酸 C38H49O9 分子量603.8 250ml−丸底フラスコ中でジゴキシゲニン−Ｏ−スクシ
ニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル5g（8.5
ミリモル）をジメチルホルムアミド（DMF）150ml中に溶
かし、かつこれにDMF20ml中の６−アミノカプロン酸1.1
2g（8.5ミリモル）及びトリエチルアミン1.2mlの懸濁液
を加える。一晩室温で磁気的に攪拌すると、徐々に均質
な溶液が生成する。この後で、反応は薄層クロマトグラ
フイにより（珪酸ゲル；酢酸エチルエステル／石油エー
テル／エタノール1:1:1,検出：氷酢酸10ml＋濃H2SO40.2
ml＋アニスアルデヒド0.1mlの混合物を噴霧し、かつ青
黒色スポツトが現われるまで120℃で加熱する；Rf約0.
7;Rfジゴキシゲニン/OSu−エステル約0.85）実際に完結
している。
酸 C38H49O9 分子量603.8 250ml−丸底フラスコ中でジゴキシゲニン−Ｏ−スクシ
ニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル5g（8.5
ミリモル）をジメチルホルムアミド（DMF）150ml中に溶
かし、かつこれにDMF20ml中の６−アミノカプロン酸1.1
2g（8.5ミリモル）及びトリエチルアミン1.2mlの懸濁液
を加える。一晩室温で磁気的に攪拌すると、徐々に均質
な溶液が生成する。この後で、反応は薄層クロマトグラ
フイにより（珪酸ゲル；酢酸エチルエステル／石油エー
テル／エタノール1:1:1,検出：氷酢酸10ml＋濃H2SO40.2
ml＋アニスアルデヒド0.1mlの混合物を噴霧し、かつ青
黒色スポツトが現われるまで120℃で加熱する；Rf約0.
7;Rfジゴキシゲニン/OSu−エステル約0.85）実際に完結
している。
DMFを高度真空中で残りなく留去させかつ残留油状物をH
2O50mlに濃アンモニア溶液の添加下に溶解する。その
後、クエン酸水溶液（クエン酸100g/l）225mlの添加に
より“遊離”ジゴキシゲニンアミドカプロン酸を沈殿さ
せる。樹脂のように粘稠な物質を水で擦ることにより硬
化させ、吸引濾取し、数回水で後洗浄し、かつ最後にP2
O5上でオイルポンプ真空中で乾燥させる。
2O50mlに濃アンモニア溶液の添加下に溶解する。その
後、クエン酸水溶液（クエン酸100g/l）225mlの添加に
より“遊離”ジゴキシゲニンアミドカプロン酸を沈殿さ
せる。樹脂のように粘稠な物質を水で擦ることにより硬
化させ、吸引濾取し、数回水で後洗浄し、かつ最後にP2
O5上でオイルポンプ真空中で乾燥させる。
収量:3.45g＝理論量の68％ 例３ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロン
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル C37H52O11N2 分子量700.8 100ml−丸底フラスコ中でジゴキシゲニン−Ｏ−スクシ
ニル−ε−アミドカプロン酸3.45g（5.7ミリモル）を無
水ジメチルホルムアミド（DMF）20ml中に溶かし、かつ
連続してＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.7g（６ミリモ
ル）並びにジシクロヘキシルカルボジイミド1.3g（6.3
ミリモル）を加える。室温で一晩攪拌し、翌日沈殿した
ジシクロヘキシル尿素を吸引濾別し、かつDMFをオイル
ポンプ真空中で吸出する。残留油状物を酢酸エチルエス
テル20ml中に取りかつ氷冷（−20℃）石油エーテル約15
0ml中に攪拌装入する。析出した、初めはまだ樹脂状に
粘稠な生成物を数回氷冷の乾燥石油エーテルで硬化する
まで擦る。真空中P2O5上で乾燥した後で3.35g＝理論量
の84％ 元素分析： 計算値 C63.4％ H7.5％ N4.0％ 実測値 C63.1％ H7.7％ N4.07％ 例４ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロイ
ル−〔５−（アミドアリル）−２′−デオキシ−ウリジ
ン−５′−トリホスフエート〕−テトラナトリウム塩 （Dig−11−dUTP） C45H63O22N4P3Na4 分子量1196.7 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロン
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル260mg（0.3
7ミリモル）をDMF7ml中に溶かし、かつH2O6ml中の５−
アリルアミノ−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリ
ホスフエート−テトラリチウム塩200mg（0.37ミリモ
ル）の溶液に加える。この混合物に0.1m硼酸ナトリウム
pH8.5 62mlを添加しかつ室温で一晩攪拌する（約15時
間）。
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル C37H52O11N2 分子量700.8 100ml−丸底フラスコ中でジゴキシゲニン−Ｏ−スクシ
ニル−ε−アミドカプロン酸3.45g（5.7ミリモル）を無
水ジメチルホルムアミド（DMF）20ml中に溶かし、かつ
連続してＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.7g（６ミリモ
ル）並びにジシクロヘキシルカルボジイミド1.3g（6.3
ミリモル）を加える。室温で一晩攪拌し、翌日沈殿した
ジシクロヘキシル尿素を吸引濾別し、かつDMFをオイル
ポンプ真空中で吸出する。残留油状物を酢酸エチルエス
テル20ml中に取りかつ氷冷（−20℃）石油エーテル約15
0ml中に攪拌装入する。析出した、初めはまだ樹脂状に
粘稠な生成物を数回氷冷の乾燥石油エーテルで硬化する
まで擦る。真空中P2O5上で乾燥した後で3.35g＝理論量
の84％ 元素分析： 計算値 C63.4％ H7.5％ N4.0％ 実測値 C63.1％ H7.7％ N4.07％ 例４ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロイ
ル−〔５−（アミドアリル）−２′−デオキシ−ウリジ
ン−５′−トリホスフエート〕−テトラナトリウム塩 （Dig−11−dUTP） C45H63O22N4P3Na4 分子量1196.7 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロン
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル260mg（0.3
7ミリモル）をDMF7ml中に溶かし、かつH2O6ml中の５−
アリルアミノ−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリ
ホスフエート−テトラリチウム塩200mg（0.37ミリモ
ル）の溶液に加える。この混合物に0.1m硼酸ナトリウム
pH8.5 62mlを添加しかつ室温で一晩攪拌する（約15時
間）。
この後で、濾紙電気泳動（0.05mクエン酸塩緩衝液,pH5.
0）においてUV光線で若干の未反応アリルアミノ−dUTP
と共に若干深くまで展開した所望化合物のスポツトが認
められる〔別法：薄層クロマトグラフイ（DC），珪酸ゲ
ル上，展開剤イソ酪酸／濃アンモニア溶液／H2O＝66:1:
33,検出:UV光線中又はアニスアルデヒド試薬を噴霧−例
２参照−；Rf値:5−アリルアミノ−dUTP0.2;Dig−アミ
ドカプロン酸−OSu−エステル0.7;Dig−11−dUTP0.4
5）。
0）においてUV光線で若干の未反応アリルアミノ−dUTP
と共に若干深くまで展開した所望化合物のスポツトが認
められる〔別法：薄層クロマトグラフイ（DC），珪酸ゲ
ル上，展開剤イソ酪酸／濃アンモニア溶液／H2O＝66:1:
33,検出:UV光線中又はアニスアルデヒド試薬を噴霧−例
２参照−；Rf値:5−アリルアミノ−dUTP0.2;Dig−アミ
ドカプロン酸−OSu−エステル0.7;Dig−11−dUTP0.4
5）。
精製するに当り、反応混合物をオイルポンプ真空中で蒸
発濃縮して個体残渣を取得し、H2O200ml中に取りかつイ
オン交換体カラム（DEAE−セフアデツクスA25,HCO3 -，
カラムの寸法1.5×30cm）に注ぐ。吸引後短時間水洗
し、その後H2O１から0.4m TEAB（トリエチルアンモニ
ウムビカーボネート）pH8の傾斜で溶離する。純粋な生
成物を含有する画分を合し、真空中で濃縮しかつメタノ
ールで数回蒸発濃縮することにより過剰のTEABを除去す
る（遊離トリエチルアミンの匂いなし）。フラスコの内
容物を数mlの水中に取り、この溶液をNa+型の短いカチ
オン交換体カラムDOWEX50WS8（１×10cm）を通し、カラ
ムを洗浄水のODEがなくなるまで（UVの240nmで測定）洗
浄し、かつ真空中で約20mlまで蒸発濃縮する。凍結乾燥
後にDig−11−dUTP−Na4200mg（理論量の45％）が白色
粉末として得られる。
発濃縮して個体残渣を取得し、H2O200ml中に取りかつイ
オン交換体カラム（DEAE−セフアデツクスA25,HCO3 -，
カラムの寸法1.5×30cm）に注ぐ。吸引後短時間水洗
し、その後H2O１から0.4m TEAB（トリエチルアンモニ
ウムビカーボネート）pH8の傾斜で溶離する。純粋な生
成物を含有する画分を合し、真空中で濃縮しかつメタノ
ールで数回蒸発濃縮することにより過剰のTEABを除去す
る（遊離トリエチルアミンの匂いなし）。フラスコの内
容物を数mlの水中に取り、この溶液をNa+型の短いカチ
オン交換体カラムDOWEX50WS8（１×10cm）を通し、カラ
ムを洗浄水のODEがなくなるまで（UVの240nmで測定）洗
浄し、かつ真空中で約20mlまで蒸発濃縮する。凍結乾燥
後にDig−11−dUTP−Na4200mg（理論量の45％）が白色
粉末として得られる。
分析：H2O測定7.9％ 元素分析（H2O含量を考慮して）： 計算値:C41.8％ H5.3％ N4.3％ P7.2％ 実測値:C41.08％ H5.35％ N4.7％ P7.1％ UVスペクトル（ホスフエート緩衝液pH7.0）：最大値220
nm、290nm 例５ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミド酪酸 C31H45O9N 分子量575.8 この化合物は、例１でカプロン酸誘導体に関して記載し
たようにジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル3g（5.1ミリモル）を４−
アミノ酪酸0.63g（6.1ミリモル）と反応させることによ
り製造する。反応後、反応混合物を真空中で蒸発濃縮
し、残渣をH2O−メタノール（20％）中に溶かしかつH+
型のカチオン交換体カラム（DOWEX50WX8）上に注ぐ。溶
出液及び洗浄水（pH約４）を蒸発濃縮し、残留したグリ
ース状の残渣をｎ−ブタノール中に溶かしかつ３回水で
振出する。ブタノール相が所望の生成物を含有し、かつ
ブタノールの除去及び無水DMFによるコデスチレーシヨ
ン３回（残留水の除去）後に、相応するＮ−ヒドロキシ
−スクシンイミドエステル（例６）に加工するのに使用
する。
nm、290nm 例５ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミド酪酸 C31H45O9N 分子量575.8 この化合物は、例１でカプロン酸誘導体に関して記載し
たようにジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル3g（5.1ミリモル）を４−
アミノ酪酸0.63g（6.1ミリモル）と反応させることによ
り製造する。反応後、反応混合物を真空中で蒸発濃縮
し、残渣をH2O−メタノール（20％）中に溶かしかつH+
型のカチオン交換体カラム（DOWEX50WX8）上に注ぐ。溶
出液及び洗浄水（pH約４）を蒸発濃縮し、残留したグリ
ース状の残渣をｎ−ブタノール中に溶かしかつ３回水で
振出する。ブタノール相が所望の生成物を含有し、かつ
ブタノールの除去及び無水DMFによるコデスチレーシヨ
ン３回（残留水の除去）後に、相応するＮ−ヒドロキシ
−スクシンイミドエステル（例６）に加工するのに使用
する。
収量:2.94g（油状物） 例６ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミド酪酸−Ｎ
−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル C35H48O11N2 分子量672.8 例５からの油状物としてのジゴキシゲニン−Ｏ−スクシ
ニル−γ−アミド酪酸2.94g（約5.1ミリモル）を例３に
記載したようにＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.62g
（5.4ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド
1.16g（5.6ミリモル）と無水DMF20ml中で反応させかつ
後処理する。生成ヒドロキシスクシンイミドエステルを
油状物として−例７に記載したように−ε‐アミノカプ
ロン酸と反応させる。
−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル C35H48O11N2 分子量672.8 例５からの油状物としてのジゴキシゲニン−Ｏ−スクシ
ニル−γ−アミド酪酸2.94g（約5.1ミリモル）を例３に
記載したようにＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.62g
（5.4ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド
1.16g（5.6ミリモル）と無水DMF20ml中で反応させかつ
後処理する。生成ヒドロキシスクシンイミドエステルを
油状物として−例７に記載したように−ε‐アミノカプ
ロン酸と反応させる。
収量:3.46g（油状物） 例７ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸 C37H56O10N2 分子量689.0 250ml-丸底フラスコ中でε−アミドカプロン酸0.8g（6.
2ミリモル）及びトリエチルアミン0.75mlをDMF12ml中に
懸濁させ、かつこれにDMF90ml中のジゴキシゲニン−Ｏ
−スクシニル−γ−アミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（5.1ミリモル，例６からの油状物）
の溶液を加える。室温で一晩（約15時間）攪拌すると、
その後でほぼ均一な溶液が生成している。DC（条件は例
２参照）によれば反応はほぼ定量的である。
−ε−アミドカプロン酸 C37H56O10N2 分子量689.0 250ml-丸底フラスコ中でε−アミドカプロン酸0.8g（6.
2ミリモル）及びトリエチルアミン0.75mlをDMF12ml中に
懸濁させ、かつこれにDMF90ml中のジゴキシゲニン−Ｏ
−スクシニル−γ−アミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（5.1ミリモル，例６からの油状物）
の溶液を加える。室温で一晩（約15時間）攪拌すると、
その後でほぼ均一な溶液が生成している。DC（条件は例
２参照）によれば反応はほぼ定量的である。
後処理は例５に記載したように行なう（DOWEX50−クロ
マトグラフイ,n−ブタノールによる抽出により“遊離”
カルボン酸に変換）。ブタノール相は目的の生成物と共
に若干量の極性及び無極性物質を含有するので、珪酸ゲ
ル60でクロマトグラフイ処理（カラム40×3cm,溶離剤酢
酸エチルエステル／石油エーテル50/75/エタノール1:1:
1）することにより精製する。酸性フラクシヨンを合し
かつ蒸発濃縮した後で油状物が得られる。
マトグラフイ,n−ブタノールによる抽出により“遊離”
カルボン酸に変換）。ブタノール相は目的の生成物と共
に若干量の極性及び無極性物質を含有するので、珪酸ゲ
ル60でクロマトグラフイ処理（カラム40×3cm,溶離剤酢
酸エチルエステル／石油エーテル50/75/エタノール1:1:
1）することにより精製する。酸性フラクシヨンを合し
かつ蒸発濃縮した後で油状物が得られる。
1.48g＝理論量の42％ 例８ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル C41H59O12N3 分子量785.8 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸0.2g（例７からの油状物，約0.
29ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.034g
（0.3ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド6
6mg（0.32ミリモル）と無水DMF8ml中で例３に記載した
ように反応させ、かつ後処理する。得られた油状残渣は
冷い石油エーテルで数回擦つても固くならないので、溶
剤の除去後に直接−例９に記載されているように−5-ア
ミノアリル‐dUTPと反応させる。
−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル C41H59O12N3 分子量785.8 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸0.2g（例７からの油状物，約0.
29ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド0.034g
（0.3ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド6
6mg（0.32ミリモル）と無水DMF8ml中で例３に記載した
ように反応させ、かつ後処理する。得られた油状残渣は
冷い石油エーテルで数回擦つても固くならないので、溶
剤の除去後に直接−例９に記載されているように−5-ア
ミノアリル‐dUTPと反応させる。
収量:0.25g（油状物） 例９ ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロイル−〔（５−アミドアリル）−
２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエート〕
−テトラナトリウム塩 （Dig−16−dUTP） C49H70O23N5P3Li4 分子量1217.7 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル250mg（例８からの油状物,0.3ミリモル）をD
MF7ml中に溶かし、かつH2O6ml中の５−アリルアミノ−
２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエート−
テトラリチウム塩210mg（0.38ミリモル）の溶液に加え
る。この反応混合物に0.2m硼酸ナトリウム緩衝液pH8.5
62mlを添加し、かつ一晩（約15時間）攪拌する。反応
の経過は例４に記載したように追跡する。
−ε−アミドカプロイル−〔（５−アミドアリル）−
２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエート〕
−テトラナトリウム塩 （Dig−16−dUTP） C49H70O23N5P3Li4 分子量1217.7 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル250mg（例８からの油状物,0.3ミリモル）をD
MF7ml中に溶かし、かつH2O6ml中の５−アリルアミノ−
２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフエート−
テトラリチウム塩210mg（0.38ミリモル）の溶液に加え
る。この反応混合物に0.2m硼酸ナトリウム緩衝液pH8.5
62mlを添加し、かつ一晩（約15時間）攪拌する。反応
の経過は例４に記載したように追跡する。
精製するに当つてバツチをオイルポンプ真空中で蒸発濃
縮して個体残渣を得、H2O約200ml中に溶かしかつイオン
交換体カラム（DEAE−セフアデツクスＡ−25,Cl-型，カ
ラムの寸法1.5×30cm）上に注ぐ。H2Oで洗浄後でH2O 2
lから0.3m LiCl2lに直線的に傾斜させて溶離する。純粋
な生成物を含有する画分を合し、真空中でH2Oが留出し
なくなるまで濃縮し、かつ濃縮物を引続いてアセトン−
エタノール混合物（3:1）中で攪拌装入により沈殿させ
る。上澄みを遠心分離し、Cl-が存在しなくなるまでエ
タノールで洗いかつP2O5/KOH上で真空により乾燥させ
る。
縮して個体残渣を得、H2O約200ml中に溶かしかつイオン
交換体カラム（DEAE−セフアデツクスＡ−25,Cl-型，カ
ラムの寸法1.5×30cm）上に注ぐ。H2Oで洗浄後でH2O 2
lから0.3m LiCl2lに直線的に傾斜させて溶離する。純粋
な生成物を含有する画分を合し、真空中でH2Oが留出し
なくなるまで濃縮し、かつ濃縮物を引続いてアセトン−
エタノール混合物（3:1）中で攪拌装入により沈殿させ
る。上澄みを遠心分離し、Cl-が存在しなくなるまでエ
タノールで洗いかつP2O5/KOH上で真空により乾燥させ
る。
収量:250mg＝理論量の68％ 分析H2O測定:6.3％ 元素分析（H2O含量を考慮して）： 計算値:C45.5％ H5.7％ N5.4％ P7.2％ 実測値:C45.1％ H5.6％ N5.6％ P7.0％ UVスペクトル（ホスフエート緩衝液pH7.0）： 最大値220nm（肩部） 289nm 例10 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−アミドカプロイ
ル−〔５−アミドアリル）−ウリジン−５′−トリホス
フエート〕−テトラリチウム塩 （Dig−11−UTP） C45H63O23N4P3Li4 分子量1148.5 この化合物は、ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−
アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル520mg（0.74ミリモル）を５−アリルアミノ−UTP−
テトラリチウム塩416.5mg（0.74ミリモル）と例４と同
様にして反応させることにより製造する。しかしイオン
交換体クロマトグラフイは例９によりCl-型のDEAE−セ
フアデツクスＡ−25を用いて行なう。
ル−〔５−アミドアリル）−ウリジン−５′−トリホス
フエート〕−テトラリチウム塩 （Dig−11−UTP） C45H63O23N4P3Li4 分子量1148.5 この化合物は、ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−ε−
アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル520mg（0.74ミリモル）を５−アリルアミノ−UTP−
テトラリチウム塩416.5mg（0.74ミリモル）と例４と同
様にして反応させることにより製造する。しかしイオン
交換体クロマトグラフイは例９によりCl-型のDEAE−セ
フアデツクスＡ−25を用いて行なう。
収量:560mg＝理論量の66％ 分析H2O測定:8.1％ 元素分析（H2O含量を考慮して）： 計算値 C43.5％ H5.47％ N4.5％ P7.47％ 実測値:C43.1％ H5.3％ N4.5％ P7.35％ UVスペクトル（ホスフエート緩衝液pH7.0）： Dig−11−dUTPに相当 例11 ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−アミドブチリル
−ε−アミドカプロイル−〔５−（アミドアリル）−ウ
リジン−５′−トリホスフエート〕−テトラリチウム塩 （Dig−16−dUTP） C49H70O24N5P3Li4 分子量1233.7 この化合物は、ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−
アミドブチリル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル250mg（0.3ミリモル，例８に
より得られる）を５−アリルアミノ−UTP−Li4214mg
（0.38ミリモル）と例９と同様にして反応させることに
より製造する。
−ε−アミドカプロイル−〔５−（アミドアリル）−ウ
リジン−５′−トリホスフエート〕−テトラリチウム塩 （Dig−16−dUTP） C49H70O24N5P3Li4 分子量1233.7 この化合物は、ジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−γ−
アミドブチリル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル250mg（0.3ミリモル，例８に
より得られる）を５−アリルアミノ−UTP−Li4214mg
（0.38ミリモル）と例９と同様にして反応させることに
より製造する。
収量:218mg＝理論量の59％ 分析：H2O測定＝7.2％ 元素分析（H2O測定値を考慮して）： 計算値 C44.45％ H5.67％ N5.3％ P7.0％ 実測値 C44.3％ H5.5％ N5.3％ P7.1％ UVスペクトル（ホスフエート緩衝液pH7.0）:Dig−16−d
UTPに相当 例12 Ｎ−アジドベンゾイル−1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサ
オクタンの製造 アジド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（Pierce社,D−6054Rodgau 1）5.20g（20ミリモル）
を無水酢酸エステル中に溶かし、かつ1,8−ジアミノ−
3,6−ジオキサオクタン29.3ml（200ミリモル）を加え
る。反応混合物を20℃で20時間暗所で攪拌する。溶剤を
真空中で除去しかつ油状残渣を水300ml中に溶解する。
生成物をトルエン2lを用いてパーホレータ中で水相から
抽出する。その際に装置をアルミニウムオイルで巻付け
る。抽出は約16時間後に終結している。有機相を真空を
用いて溶剤から分離し、かつ生成物を珪酸ゲルの調製カ
ラムクロマトグラフイ（カラム80×10cm,溶離剤：クロ
ロホルム／メタノール／濃アンモニア溶液65:30:5）に
より精製し、かつ高度真空中で溶剤の蒸発除去後に乾燥
させる。
UTPに相当 例12 Ｎ−アジドベンゾイル−1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサ
オクタンの製造 アジド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（Pierce社,D−6054Rodgau 1）5.20g（20ミリモル）
を無水酢酸エステル中に溶かし、かつ1,8−ジアミノ−
3,6−ジオキサオクタン29.3ml（200ミリモル）を加え
る。反応混合物を20℃で20時間暗所で攪拌する。溶剤を
真空中で除去しかつ油状残渣を水300ml中に溶解する。
生成物をトルエン2lを用いてパーホレータ中で水相から
抽出する。その際に装置をアルミニウムオイルで巻付け
る。抽出は約16時間後に終結している。有機相を真空を
用いて溶剤から分離し、かつ生成物を珪酸ゲルの調製カ
ラムクロマトグラフイ（カラム80×10cm,溶離剤：クロ
ロホルム／メタノール／濃アンモニア溶液65:30:5）に
より精製し、かつ高度真空中で溶剤の蒸発除去後に乾燥
させる。
収量:3.2g（55％）；無色の粘稠な油状物 例13 ジゴキシゲニン−３−ヘキスクシネート〔Ｎ′−（４−
アジドベンゾイル）〕−８−アミノ−3,6−ジオキサオ
クチルアミド（ホトジゴキシゲニン）の製造 例12からの生成物2.93g（10ミリモル）を無水ジオキサ
ン200ml中に溶かし、かつジゴキシゲニン−３−ヘキス
クシネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
〔製造はG.C.Oliver,Jr.Brent,M.Parker,D,L.Brasfield
及びCh.W.Parker,“J.clin.Invest.",47巻,1035頁（198
6年）と同様にして行なう〕5.87g（10ミリモル）を加え
る。室温で20時間攪拌し、溶剤を真空中で除去し、かつ
生じた生成物を中圧液体調製クロマトグラフイにより分
離する（カラム容量1640ml,Laboc−hrom Reversed−Pha
se−Silica HD−SIL−18−30−60,溶離剤メタノール／
水7:3＋氷酢酸１％）。相応する画分を集めた後で、溶
剤を真空中で除去しかつ油状残渣をジオキサン中で溶か
す。凍結乾燥及びジイソプロピルエーテル100mlによる
洗浄後に生成物のジゴキシゲニン−３−ヘキスクシネー
ト〔Ｎ′−（４−アジドベンゾイル）〕−８−アミノ−
3,6−ジオキサオクチルアミドが無色の若干粘稠な固体
として得られ、これを高度真空中で乾燥させる。
アジドベンゾイル）〕−８−アミノ−3,6−ジオキサオ
クチルアミド（ホトジゴキシゲニン）の製造 例12からの生成物2.93g（10ミリモル）を無水ジオキサ
ン200ml中に溶かし、かつジゴキシゲニン−３−ヘキス
クシネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
〔製造はG.C.Oliver,Jr.Brent,M.Parker,D,L.Brasfield
及びCh.W.Parker,“J.clin.Invest.",47巻,1035頁（198
6年）と同様にして行なう〕5.87g（10ミリモル）を加え
る。室温で20時間攪拌し、溶剤を真空中で除去し、かつ
生じた生成物を中圧液体調製クロマトグラフイにより分
離する（カラム容量1640ml,Laboc−hrom Reversed−Pha
se−Silica HD−SIL−18−30−60,溶離剤メタノール／
水7:3＋氷酢酸１％）。相応する画分を集めた後で、溶
剤を真空中で除去しかつ油状残渣をジオキサン中で溶か
す。凍結乾燥及びジイソプロピルエーテル100mlによる
洗浄後に生成物のジゴキシゲニン−３−ヘキスクシネー
ト〔Ｎ′−（４−アジドベンゾイル）〕−８−アミノ−
3,6−ジオキサオクチルアミドが無色の若干粘稠な固体
として得られ、これを高度真空中で乾燥させる。
収量:4.9g（64％） IR（アセトン）:2150,1728,1639cm-1 例14 “ランダムプライムド”法による核酸プローブの標識付
け 標識すべき直鎖状DNA1μｇを10μｌの容量で５分間沸騰
させかつ引続いて氷上で急冷することにより変性した。
その後、反応容器中でデオキシアデノシントリホスフエ
ート，デオキシシチジントリホスフエート及びデオキシ
グアノシントリホスフエートの２ミリモル/lの溶液各１
μｌと変性DNAを合した。これに、デオキシチミジント
リホスフエート1.4ミリモル/l及び例４で製造したよう
なジゴキシゲニン−11−dUTP0.6ミリモル/lを含有する
溶液１μｌを加えた。その後、所謂反応混合物２μｌを
添加した。反応混合物は最も重要な成分として所謂“ラ
ンダムヘキサヌクレオチド”を含有していた。これは化
学的に合成した６塩基の長さのオリゴヌクレオチドであ
り、その際に合成に当つて各工程で４種のすべてのヌク
レオチド（A,C,G及びＴ）が供給され、それ故可能なす
べてのオリゴヌクレオチド配列の混合物が生成する。反
応混合物の化学的組成はトリス−HCl0.5モル/l;MgCl20.
1モル/l;ジチオエリトリツト１ミリモル/l;牛血清アル
ブミン，分子生物学的品質,2mg/ml;ランダムヘキサヌク
レオチド3.125mg/ml;pH7.2（20℃）であつた。最後にク
レノウポリメラーゼ１μｌ（２単位に相当）を添加し、
かつ混合物を滅菌水で最終容量20μｌにしかつ37℃で１
時間恒温保持した。
け 標識すべき直鎖状DNA1μｇを10μｌの容量で５分間沸騰
させかつ引続いて氷上で急冷することにより変性した。
その後、反応容器中でデオキシアデノシントリホスフエ
ート，デオキシシチジントリホスフエート及びデオキシ
グアノシントリホスフエートの２ミリモル/lの溶液各１
μｌと変性DNAを合した。これに、デオキシチミジント
リホスフエート1.4ミリモル/l及び例４で製造したよう
なジゴキシゲニン−11−dUTP0.6ミリモル/lを含有する
溶液１μｌを加えた。その後、所謂反応混合物２μｌを
添加した。反応混合物は最も重要な成分として所謂“ラ
ンダムヘキサヌクレオチド”を含有していた。これは化
学的に合成した６塩基の長さのオリゴヌクレオチドであ
り、その際に合成に当つて各工程で４種のすべてのヌク
レオチド（A,C,G及びＴ）が供給され、それ故可能なす
べてのオリゴヌクレオチド配列の混合物が生成する。反
応混合物の化学的組成はトリス−HCl0.5モル/l;MgCl20.
1モル/l;ジチオエリトリツト１ミリモル/l;牛血清アル
ブミン，分子生物学的品質,2mg/ml;ランダムヘキサヌク
レオチド3.125mg/ml;pH7.2（20℃）であつた。最後にク
レノウポリメラーゼ１μｌ（２単位に相当）を添加し、
かつ混合物を滅菌水で最終容量20μｌにしかつ37℃で１
時間恒温保持した。
その後、反応を0.2モル/l EDTA（エチレンジニトリロ−
テトラ酢酸）pH8.0 2μｌの添加により停止しかつ導入
されなかつたデオキシリボヌクレオシドトリホスフエー
トをエタノール沈殿により分離した。このために恒温バ
ツチに４モル/l LiCl2μｌ及び−20℃に前冷却した無水
エタノール60μｌを添加し、混合しかつ沈殿バツチを−
70℃で30分間又は−20℃で一晩恒温保持した。引続いて
1200×ｇ（重力加速度）で10分間遠心分離し、上澄みを
デカンテーシヨンにより分離し、沈殿を冷い70％エタノ
ールで短時間洗いかつ最後に真空中で乾燥させた。標識
した精製DNAをTE−緩衝液（トリス−HCl10ミリモル/l;E
DTA1ミリモル/l;pH8.0）中に再懸濁させた。
テトラ酢酸）pH8.0 2μｌの添加により停止しかつ導入
されなかつたデオキシリボヌクレオシドトリホスフエー
トをエタノール沈殿により分離した。このために恒温バ
ツチに４モル/l LiCl2μｌ及び−20℃に前冷却した無水
エタノール60μｌを添加し、混合しかつ沈殿バツチを−
70℃で30分間又は−20℃で一晩恒温保持した。引続いて
1200×ｇ（重力加速度）で10分間遠心分離し、上澄みを
デカンテーシヨンにより分離し、沈殿を冷い70％エタノ
ールで短時間洗いかつ最後に真空中で乾燥させた。標識
した精製DNAをTE−緩衝液（トリス−HCl10ミリモル/l;E
DTA1ミリモル/l;pH8.0）中に再懸濁させた。
例15 “ニツクトランスレーシヨン”法による核酸プローブの
標識付け 標識すべきDNA1μｇをデオキシアデノシントリホスフエ
ート，デオキシシチジントリホヌフエート及びデオキシ
グアノシントリホスフエートの0.4ミリモル/l溶液各１
μｌと混合した。その後、デオキシチミジントリホスフ
エート0.35ミリモル/l及び例４で製造したようなDig−1
1−dUTP0.15ミリモル/lを含有する溶液１μｌを添加し
た。更に、10倍濃度の緩衝溶液（トリス−HCl0.5モル/
l;MgCl20.1モル/l;ジチオエリトリツト１ミリモル/l;pH
7.5）２μｌ並びに酵素溶液２μｌ（DNAポリメラーゼI2
U及びDNアーゼI 1.6mUを添加し、２回蒸留した滅菌水で
最終容量20μｌに調製しかつバツチを14℃で60分間恒温
保持した。
標識付け 標識すべきDNA1μｇをデオキシアデノシントリホスフエ
ート，デオキシシチジントリホヌフエート及びデオキシ
グアノシントリホスフエートの0.4ミリモル/l溶液各１
μｌと混合した。その後、デオキシチミジントリホスフ
エート0.35ミリモル/l及び例４で製造したようなDig−1
1−dUTP0.15ミリモル/lを含有する溶液１μｌを添加し
た。更に、10倍濃度の緩衝溶液（トリス−HCl0.5モル/
l;MgCl20.1モル/l;ジチオエリトリツト１ミリモル/l;pH
7.5）２μｌ並びに酵素溶液２μｌ（DNAポリメラーゼI2
U及びDNアーゼI 1.6mUを添加し、２回蒸留した滅菌水で
最終容量20μｌに調製しかつバツチを14℃で60分間恒温
保持した。
反応を例13と同様にEDTAで停止しかつ標識DNAを前記の
ように精製しかつ溶解した。
ように精製しかつ溶解した。
例16 テーリング法（Tailing Methode）によく核酸プローブ
の標識付け 酵素末端トランスフラーゼを用いる３′−末端標識付け
の際に、ジゴキシゲニン−11−ジデソキシウリジントリ
ホスフエートを使用した。これは、出発物質として２′
−デソキシウリジン塩の代りに５−アリルアミノ−
２′,3′−ジデソキシ−ウリジン−５′−トリホスフエ
ート−テトラリチウム塩を使用することを除き、例４の
記載と同様にして合成された。標識反応を次のように実
施した： １反応容器中で、標識付け緩衝液（カリウム−カコジレ
ート200mモル/l;トリス−HCl50mモル/l;牛血清アルブミ
ン0.4mg/ml、pH7.2）25μｌ、25mモル/l CoCl2−溶液５
μｌ、HaeII−切断dBR322−DNA1.5μｇ及び25単位に相
当する末端トランスフエラーゼ５μｌを混合した。この
量を、無菌の再蒸溜水で48μｌにし、最後に、ジゴキシ
ゲニン−11−ddUTPの0.1mモル/l溶液２μｌを添加し
た。
の標識付け 酵素末端トランスフラーゼを用いる３′−末端標識付け
の際に、ジゴキシゲニン−11−ジデソキシウリジントリ
ホスフエートを使用した。これは、出発物質として２′
−デソキシウリジン塩の代りに５−アリルアミノ−
２′,3′−ジデソキシ−ウリジン−５′−トリホスフエ
ート−テトラリチウム塩を使用することを除き、例４の
記載と同様にして合成された。標識反応を次のように実
施した： １反応容器中で、標識付け緩衝液（カリウム−カコジレ
ート200mモル/l;トリス−HCl50mモル/l;牛血清アルブミ
ン0.4mg/ml、pH7.2）25μｌ、25mモル/l CoCl2−溶液５
μｌ、HaeII−切断dBR322−DNA1.5μｇ及び25単位に相
当する末端トランスフエラーゼ５μｌを混合した。この
量を、無菌の再蒸溜水で48μｌにし、最後に、ジゴキシ
ゲニン−11−ddUTPの0.1mモル/l溶液２μｌを添加し
た。
混合及び遠心の後に、37℃で、この反応物を１時間恒温
保持した。
保持した。
反応の停止及び導入されなかつたヌクレオチドの分離
は、例14の記載のように行なつた。
は、例14の記載のように行なつた。
例17 転写法を用いる核酸プローブの標識付け 反応原理は第５図に示されている。標識付けのために使
用されるDNAを転写ベクターpSPT18（第６図及び第10
図）中に挿入した。このベクターは、SP6に対するプロ
モータ及びT7RNAポリメラーゼに対するプロモータを含
有する。このDNAを、標識反応の前に、挿入されたDNA−
配列及びプロモータ並びにそのプロモータ及びDNA−配
列を結合する配列の外の１個所で線状化した。
用されるDNAを転写ベクターpSPT18（第６図及び第10
図）中に挿入した。このベクターは、SP6に対するプロ
モータ及びT7RNAポリメラーゼに対するプロモータを含
有する。このDNAを、標識反応の前に、挿入されたDNA−
配列及びプロモータ並びにそのプロモータ及びDNA−配
列を結合する配列の外の１個所で線状化した。
この線状化された基質DNA1μｇに、１反応器中で、アデ
ノシントリホスフエート、シチジントリホスフエート及
びグアノシントリホスフエートの10mモル/l溶液各１μ
ｌを添加した。これに、ウリジントリホスフエート6.5m
モル/l及びジゴキシゲニン−11−UTP3.5mモル/lを含有
する溶液１μｌを添加した。例４におけるジゴキシゲニ
ン−11−dUTPと同様に、例10で、出発物質としてアリル
アミノ−デソキシウリジン塩の代りにアリルアミノ−ウ
リジンを用いるだけで、ジゴキシゲニン−11−UTPを製
造する。
ノシントリホスフエート、シチジントリホスフエート及
びグアノシントリホスフエートの10mモル/l溶液各１μ
ｌを添加した。これに、ウリジントリホスフエート6.5m
モル/l及びジゴキシゲニン−11−UTP3.5mモル/lを含有
する溶液１μｌを添加した。例４におけるジゴキシゲニ
ン−11−dUTPと同様に、例10で、出発物質としてアリル
アミノ−デソキシウリジン塩の代りにアリルアミノ−ウ
リジンを用いるだけで、ジゴキシゲニン−11−UTPを製
造する。
更に、このバツチに、10倍濃度の緩衝液（トリス−HCl
0.4モル/l、MgCl260mモル/l、ジチオスレイトール50mモ
ル/l、スペルミジン40mモル/l、pH7.2）２μｌを添加
し、この量を、無菌再蒸留水を充填して19μｌとし、最
後にRNAポリメラーゼ（SP6もしくはT7）10単位に相当す
る１μｌの添加により、この反応を開始させた。
0.4モル/l、MgCl260mモル/l、ジチオスレイトール50mモ
ル/l、スペルミジン40mモル/l、pH7.2）２μｌを添加
し、この量を、無菌再蒸留水を充填して19μｌとし、最
後にRNAポリメラーゼ（SP6もしくはT7）10単位に相当す
る１μｌの添加により、この反応を開始させた。
短時間の遠心の後に、このバツチを37℃で１時間恒温保
持した。
持した。
この基質−DNAを、引続きDNAseI（RNAse−不含）１μｌ
（10単位に相当）の添加により、37℃で15分間分解させ
た。
（10単位に相当）の添加により、37℃で15分間分解させ
た。
0.2モル/l EDTA（pH8.0）２μｌの添加によりこの反応
を停止させた。得られたジゴキシゲニン−標識されたRN
Aプローブを、１容量のフエノールでの抽出及び引続く
蛋白質及びヌクレオチドのエタノール沈殿により精製
し、最後に無菌緩衝液（トリス−HCl、10mモル/l、EDTA
1mモル/l、pH8.0）中に溶かした。
を停止させた。得られたジゴキシゲニン−標識されたRN
Aプローブを、１容量のフエノールでの抽出及び引続く
蛋白質及びヌクレオチドのエタノール沈殿により精製
し、最後に無菌緩衝液（トリス−HCl、10mモル/l、EDTA
1mモル/l、pH8.0）中に溶かした。
例18 光化学的法による核酸プローブの標識付け 有利に0.5〜1.0μg/lの濃度の、精製DNA−溶液（有機緩
衝剤不含）をエツペンドルフ反応器中、半暗室中で、同
容量の1mg/mlホトジゴキシゲニン溶液（例13）と混合し
た。この混合物に、氷冷下に、フイリツプスHPLR400W灯
で、10cmの間隔で容器開口部上方から10〜30分間照射し
た。この際、反応混合物は冷却保持すべきであつた。
衝剤不含）をエツペンドルフ反応器中、半暗室中で、同
容量の1mg/mlホトジゴキシゲニン溶液（例13）と混合し
た。この混合物に、氷冷下に、フイリツプスHPLR400W灯
で、10cmの間隔で容器開口部上方から10〜30分間照射し
た。この際、反応混合物は冷却保持すべきであつた。
この反応の後に、0.1Mトリス−HCl（pH9.0）、1.0mM ED
TAを充填して100μｌにした。
TAを充填して100μｌにした。
この溶液をブタン−２−オール100μｌで振出し、短時
間遠心し、ブタノール上層を除去した。
間遠心し、ブタノール上層を除去した。
ブタン−２−オール抽出を１回繰り返し、水相を、30〜
40μｌまで濃縮すべきである。
40μｌまで濃縮すべきである。
キヤリアの添加の後に、DNA（少量のDNA）を、3M酢酸ナ
トリウム又は相応する塩（例えば4M LiCl）５μｌ及び
エタノール100μｌの添加により−20℃で一晩かかつて
沈殿させた。
トリウム又は相応する塩（例えば4M LiCl）５μｌ及び
エタノール100μｌの添加により−20℃で一晩かかつて
沈殿させた。
エツペンドルフ遠心機中、４℃で15分間の遠心分離の後
に、ペレツトを冷70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、
0.1mM EDTA中に溶かした。
に、ペレツトを冷70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、
0.1mM EDTA中に溶かした。
例19 標識付けされたDNA−プローブとのハイブリツド形成 ハイブリツド形成のためにリトロセルロースフイルター
（Schleicher ＆ Schuell,BA85）をその上に固定された
DNAと共に使用した。前ハイブリツド形成のために、フ
イルターを、まず、NaCl0.75モル/l、クエン酸ナトリウ
ム75mモル/l、カゼイン0.5（w/v）％、ラウリルサルコ
シン0.1（v/v）％、ドデシル硫酸ナトリウム0.02（w/
v）％よりなる溶液（20℃でのpH7.0）中、65℃で１時間
恒温保持した。引続き、この溶液を、同じ組成であるが
付加的に例14〜16又は18で製造され標識された新製変性
DNA100mg/mlの添加された組成の新製溶液で代えた。65
℃で14時間改めて恒温保持した。その後、非特異的に結
合されたDNAを２洗浄工程により、即ちまずNaCl0.3モル
/l;クエン酸ナトリウム30mモル/l;ドデシル硫酸ナトリ
ウム0.1（w/v）からなる溶液（pH7.0）で、室温で２×
５分間、次いで、NaCl15mモル/l、クエン酸ナトリウム
1.5mモル/l、ドデシル硫酸ナトリウム0.1（w/v）％より
なる溶液（pH7.0）で65％で２×15分間洗浄することに
より除去した。
（Schleicher ＆ Schuell,BA85）をその上に固定された
DNAと共に使用した。前ハイブリツド形成のために、フ
イルターを、まず、NaCl0.75モル/l、クエン酸ナトリウ
ム75mモル/l、カゼイン0.5（w/v）％、ラウリルサルコ
シン0.1（v/v）％、ドデシル硫酸ナトリウム0.02（w/
v）％よりなる溶液（20℃でのpH7.0）中、65℃で１時間
恒温保持した。引続き、この溶液を、同じ組成であるが
付加的に例14〜16又は18で製造され標識された新製変性
DNA100mg/mlの添加された組成の新製溶液で代えた。65
℃で14時間改めて恒温保持した。その後、非特異的に結
合されたDNAを２洗浄工程により、即ちまずNaCl0.3モル
/l;クエン酸ナトリウム30mモル/l;ドデシル硫酸ナトリ
ウム0.1（w/v）からなる溶液（pH7.0）で、室温で２×
５分間、次いで、NaCl15mモル/l、クエン酸ナトリウム
1.5mモル/l、ドデシル硫酸ナトリウム0.1（w/v）％より
なる溶液（pH7.0）で65％で２×15分間洗浄することに
より除去した。
例20 標識付RNAプローブとのハイブリツド形成 ハイブリツド形成及び引続く洗浄を、DNA−プローブに
ついて記載する例19におけると同様に実施した。単に、
この例に記載の変性標識DNA−プローブの代りに、例17
により標識された新製変性RNA−プローブを使用した。
ついて記載する例19におけると同様に実施した。単に、
この例に記載の変性標識DNA−プローブの代りに、例17
により標識された新製変性RNA−プローブを使用した。
このハイブリツド形成溶液中におけるジゴキシゲニン−
標識RNAの濃度は、ハイブリツド形成溶液1ml当り、基質
−DNA100ngの転写が起る程度に選択した。
標識RNAの濃度は、ハイブリツド形成溶液1ml当り、基質
−DNA100ngの転写が起る程度に選択した。
例21 検出系アルカリホスフアターゼ/X−ホスフエート／ニト
ロブル−テトラゾリウムを用いる検出 例19又は20からのハイブリツド形成されたフイルター
を、まず、トリス−HCl0.1モル/l（pH7.5）;NaCl0.15モ
ル/l中で１分間洗浄した。膜の非特異性結合位置のブロ
ツクのために、引続きカゼイン0.5（w/v）％と共にトリ
ス−HCl0.1モル/l（pH7.5）;NaCl0.15モル/l中で軽い振
動下に40分間恒温保持した。
ロブル−テトラゾリウムを用いる検出 例19又は20からのハイブリツド形成されたフイルター
を、まず、トリス−HCl0.1モル/l（pH7.5）;NaCl0.15モ
ル/l中で１分間洗浄した。膜の非特異性結合位置のブロ
ツクのために、引続きカゼイン0.5（w/v）％と共にトリ
ス−HCl0.1モル/l（pH7.5）;NaCl0.15モル/l中で軽い振
動下に40分間恒温保持した。
その後、抗体結合反応を実施した。
このために、膜を、抗−ジゴキシゲニン／アルカリホス
フアターゼ−複合体150m単位/mlと共に、トリス−HCl0.
1モル/l（pH7.5）:NaCl0.15モル/l中で20分間恒温保持
した。次いで、非特異的に結合した蛋白質を、同じ緩衝
液で２×15分洗浄することにより除去した。その後、こ
のフイルターを、トリス−HCl0.1モル/l（pH9.5）;NaCl
0.1モル/l;MgCl250mモル/l中で、５分間pH9.5まで再平
衡化した。即ち、アルカリホスフアターゼは、高いpH−
値でその活性至適を有する。
フアターゼ−複合体150m単位/mlと共に、トリス−HCl0.
1モル/l（pH7.5）:NaCl0.15モル/l中で20分間恒温保持
した。次いで、非特異的に結合した蛋白質を、同じ緩衝
液で２×15分洗浄することにより除去した。その後、こ
のフイルターを、トリス−HCl0.1モル/l（pH9.5）;NaCl
0.1モル/l;MgCl250mモル/l中で、５分間pH9.5まで再平
衡化した。即ち、アルカリホスフアターゼは、高いpH−
値でその活性至適を有する。
結合した抗体−複合体及びこれとハイブリツド形成され
た標識DNAの検出は、アルカリホスフアターゼにより触
媒作用される呈色反応により行なつた。このために、フ
イルターをトリス−HCl0.1モル/l（pH9.5）;NaCl0.1モ
ル/l;MgCl250mモル/l中で恒温保持し、この際、溶液10m
l当り、ニトロブル−テトラゾリウム−溶液（ジメチル
ホルムアミド70（v/v）％中75mg/ml）45μｌ及びＸ−ホ
スフエート溶液（ジメチルホルムアミド中の５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルホスフエート50mg/ml）3
5μｌを添加した。
た標識DNAの検出は、アルカリホスフアターゼにより触
媒作用される呈色反応により行なつた。このために、フ
イルターをトリス−HCl0.1モル/l（pH9.5）;NaCl0.1モ
ル/l;MgCl250mモル/l中で恒温保持し、この際、溶液10m
l当り、ニトロブル−テトラゾリウム−溶液（ジメチル
ホルムアミド70（v/v）％中75mg/ml）45μｌ及びＸ−ホ
スフエート溶液（ジメチルホルムアミド中の５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルホスフエート50mg/ml）3
5μｌを添加した。
呈色反応は充分な酸素排除のもとに行ない、この際、膜
をこの溶液と共に、１シート（通常の料理用袋又は凍結
用袋）中に封入し、暗所中に保持した。この呈色反応は
迅速に起こつたが、強度は数日間にわたり増加すること
ができた。この結果の記録は、湿つたフイルターの写真
もしくは写真複写により得た。次いでこのフイルターを
乾燥させ、保持した。色は残存するがいくらか青味がか
つた。これは、フイルターの湿潤化により再び強めるこ
とができた。
をこの溶液と共に、１シート（通常の料理用袋又は凍結
用袋）中に封入し、暗所中に保持した。この呈色反応は
迅速に起こつたが、強度は数日間にわたり増加すること
ができた。この結果の記録は、湿つたフイルターの写真
もしくは写真複写により得た。次いでこのフイルターを
乾燥させ、保持した。色は残存するがいくらか青味がか
つた。これは、フイルターの湿潤化により再び強めるこ
とができた。
例22 ａ）例14のａ）でジゴキシゲニンを用いて酵素標識され
たDNA及びｂ）ビオチンで標識されたDNAを用いる際のDN
A−検出（サザン−ブロツト）での感度及びバツクグラ
ウンドの比較 1.ヒト胎盤−DNAを制限酵素EcoRIを用いて切断した。そ
れからの種々の量をアガロースゲルでの電気泳動により
分離し、引続きサザン法（J.Mol.Biol.98（1975）503）
により、ニトロセルロース−膜上に移行させた。この膜
上のDNAを真空箱中80℃で２時間ベーキングすることに
より固定させた。この膜を、ヒトの組織−プラスミノー
ゲンアクチベータのcDNAに相当する標識付きDNA−フラ
グメント（Pennica D.et.al.Nature301（1983）214）と
ハイブリツド形成させた。このヒト組織−プラスミノー
ゲンアクチベータ遺伝子は、ヒトゲノム中に１回存在す
る。この遺伝子のcDNAは、このゲノムの相応するバンド
とハイブリツド形成する。１方で、このDNA−フラグメ
ントを、例14におけるように、ジゴキシゲニンで標識
し、標識DNA100ng/mlと、例19におけると同様にハイブ
リツド形成させ、例21におけるようにこのハイブリツド
を検出した。他方で、このフラグメントを同様な方法で
ビオチンで標識付けた。この場合に、ビオチン16−dUTP
（Brigati等によるVirology126（1983）、32〜50）を使
用した。この膜上のDNAを標識DNA50μg/mlとハイブリツ
ド形成させた。その他は、例19と同様に実施した。検出
は、ストレプトアビジン−アルカリホスフアターゼ−複
合体を使用することを除いて例21の記載と同様に実施し
た。文献に記載のビオチン系に関する方法と比較する
と、ここに記載のビオチン標識付けのための系（Random
primed−Markierung,Mischung Biotin16−dUTP/dTTP、
例19に記載の溶液での前ハイブリツド形成、所定濃度の
DNAとのハイブリツド形成、例21に記載の溶液を用いる
ブロツキング）は、より低いバツクグラウンド（Hinter
grund）及びより高い感度を示した。しかしながら、最
適系中のビオチンの代りにジゴキシゲニンの記載使用の
際には、明白にバツクグラウンドの更なる減少が得ら
れ、この際、感度は残留保持される（第８図参照）。
たDNA及びｂ）ビオチンで標識されたDNAを用いる際のDN
A−検出（サザン−ブロツト）での感度及びバツクグラ
ウンドの比較 1.ヒト胎盤−DNAを制限酵素EcoRIを用いて切断した。そ
れからの種々の量をアガロースゲルでの電気泳動により
分離し、引続きサザン法（J.Mol.Biol.98（1975）503）
により、ニトロセルロース−膜上に移行させた。この膜
上のDNAを真空箱中80℃で２時間ベーキングすることに
より固定させた。この膜を、ヒトの組織−プラスミノー
ゲンアクチベータのcDNAに相当する標識付きDNA−フラ
グメント（Pennica D.et.al.Nature301（1983）214）と
ハイブリツド形成させた。このヒト組織−プラスミノー
ゲンアクチベータ遺伝子は、ヒトゲノム中に１回存在す
る。この遺伝子のcDNAは、このゲノムの相応するバンド
とハイブリツド形成する。１方で、このDNA−フラグメ
ントを、例14におけるように、ジゴキシゲニンで標識
し、標識DNA100ng/mlと、例19におけると同様にハイブ
リツド形成させ、例21におけるようにこのハイブリツド
を検出した。他方で、このフラグメントを同様な方法で
ビオチンで標識付けた。この場合に、ビオチン16−dUTP
（Brigati等によるVirology126（1983）、32〜50）を使
用した。この膜上のDNAを標識DNA50μg/mlとハイブリツ
ド形成させた。その他は、例19と同様に実施した。検出
は、ストレプトアビジン−アルカリホスフアターゼ−複
合体を使用することを除いて例21の記載と同様に実施し
た。文献に記載のビオチン系に関する方法と比較する
と、ここに記載のビオチン標識付けのための系（Random
primed−Markierung,Mischung Biotin16−dUTP/dTTP、
例19に記載の溶液での前ハイブリツド形成、所定濃度の
DNAとのハイブリツド形成、例21に記載の溶液を用いる
ブロツキング）は、より低いバツクグラウンド（Hinter
grund）及びより高い感度を示した。しかしながら、最
適系中のビオチンの代りにジゴキシゲニンの記載使用の
際には、明白にバツクグラウンドの更なる減少が得ら
れ、この際、感度は残留保持される（第８図参照）。
例23 ａ）例14によりジゴキシゲニンで酵素的に標識されたDN
A及びｂ）ヨーロツパ特許第0173251号明細書の例１及び
例２によるジゴキシゲニンで化学的に標識されたDNAを
用いる際のDNA−検出（サザン−ブロツト）における感
度の比較 pBR328DNAを別個に制限酵素BglI及びHinfIで切断した。
得られるフラグメント同部を混合した。その後、この混
合物は次の寸法の15pBR328−フラグメントを含有する:2
176、1766、1230、1033、653、517、453、394、298（2
x）、234（2x）、220及び154（2x）bp。
A及びｂ）ヨーロツパ特許第0173251号明細書の例１及び
例２によるジゴキシゲニンで化学的に標識されたDNAを
用いる際のDNA−検出（サザン−ブロツト）における感
度の比較 pBR328DNAを別個に制限酵素BglI及びHinfIで切断した。
得られるフラグメント同部を混合した。その後、この混
合物は次の寸法の15pBR328−フラグメントを含有する:2
176、1766、1230、1033、653、517、453、394、298（2
x）、234（2x）、220及び154（2x）bp。
次いで、種々の量のフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により分離させ、引続きサザン法（J.Mol.Biol.98
（1975）、503）により、ニトロセルロース膜上に移行
させた。この膜を真空中で80℃に加熱することによるDN
A−フラグメントの固定の後に、これを、例14によりジ
ゴキシゲニンで標識されたDNA100ng/mlと、例19の記載
のようにハイブリツド形成させた。このハイブリツドの
検査を、例21の記載のように正確に実施した。第Ｉ表と
組合せた第9A図に示すように、フラグメントは、１〜0.
1pgの量まで検出できる。
泳動により分離させ、引続きサザン法（J.Mol.Biol.98
（1975）、503）により、ニトロセルロース膜上に移行
させた。この膜を真空中で80℃に加熱することによるDN
A−フラグメントの固定の後に、これを、例14によりジ
ゴキシゲニンで標識されたDNA100ng/mlと、例19の記載
のようにハイブリツド形成させた。このハイブリツドの
検査を、例21の記載のように正確に実施した。第Ｉ表と
組合せた第9A図に示すように、フラグメントは、１〜0.
1pgの量まで検出できる。
比較として、pBR328DNAをNciIで切断した。大きさ810、
724、696、597、522、507、364、351、244及び92bpの10
フラグメントが生じる。ここでも種々のDNA−量を電気
泳動にかけ、引続き、サザン法でニトロセルロース膜上
に移行させた。次いで、この膜を例19の記載と同様にハ
イブリツド形成させた。但し、ここでは、ヨーロツパ公
開特許（EPA）第0173251号例１及び２におけるように、
標識pBR322 200ng/mlをハイブリツド形成に使用した。p
BR328DNAは、プローブとして使用したpBR322DNAとは、8
10bpの大きさのNciI−フラグメント（pBR328はこれを有
するがpBR322は有しない）によるちがいがあるだけであ
る。
724、696、597、522、507、364、351、244及び92bpの10
フラグメントが生じる。ここでも種々のDNA−量を電気
泳動にかけ、引続き、サザン法でニトロセルロース膜上
に移行させた。次いで、この膜を例19の記載と同様にハ
イブリツド形成させた。但し、ここでは、ヨーロツパ公
開特許（EPA）第0173251号例１及び２におけるように、
標識pBR322 200ng/mlをハイブリツド形成に使用した。p
BR328DNAは、プローブとして使用したpBR322DNAとは、8
10bpの大きさのNciI−フラグメント（pBR328はこれを有
するがpBR322は有しない）によるちがいがあるだけであ
る。
従つてこれは、ハイブリツド形成では検査されない。こ
のハイブリツド形成の後に、このハイブリツドを例21の
記載と同様に検査した。第9B図と第II表との組合せが示
すように、この方法では、25〜2.5pgまでの量のDNA−フ
ラグメントを検出することができるだけである。この酵
素的標識付けにより、化学的標識付けに比べて数倍（2
5）も高いDNA−検査の感度に達する。
のハイブリツド形成の後に、このハイブリツドを例21の
記載と同様に検査した。第9B図と第II表との組合せが示
すように、この方法では、25〜2.5pgまでの量のDNA−フ
ラグメントを検出することができるだけである。この酵
素的標識付けにより、化学的標識付けに比べて数倍（2
5）も高いDNA−検査の感度に達する。
例24 インシトウ ハイブリツド形成（in situ−Hybri−disi
erung）による固定HeLa−及びSiHa−細胞系中のHPV−配
列の検出 本発明方法で、インシトウ ハイブリツド形成をキヤリ
ヤー固定細胞及び細胞塗沫を用いて実施することができ
る。
erung）による固定HeLa−及びSiHa−細胞系中のHPV−配
列の検出 本発明方法で、インシトウ ハイブリツド形成をキヤリ
ヤー固定細胞及び細胞塗沫を用いて実施することができ
る。
この非放射性HPV−検出のために、２種の細胞系を用い
た： SiHa−細胞（HPV2〜３コピー／細胞） ATCC−No.HTB35（Biology159（1987）389〜398）、 HeLa−細胞（HPV100〜200コピー／細胞） ATCC−No.CCL2（Human Genetics77（1987）251〜255） DNA−プローブ： HPV−DNA（配列:Progress med.Virol.32（1985）15行以
降参照）。
た： SiHa−細胞（HPV2〜３コピー／細胞） ATCC−No.HTB35（Biology159（1987）389〜398）、 HeLa−細胞（HPV100〜200コピー／細胞） ATCC−No.CCL2（Human Genetics77（1987）251〜255） DNA−プローブ： HPV−DNA（配列:Progress med.Virol.32（1985）15行以
降参照）。
標識付け： ビオチン−11−dUTP（Blugene nonradioaktive DNA det
ection kit、Best.−Nr.8279SA der Fa.Gibco/BRL）ジ
ゴキシゲニン−dUTP（例４及び14で製造及び標識付け）35 S−dATP（Amersham−Buchler,Best.Nr.SJ1304），特
異活性1200キユリー/mモル、ハイブリツド形成及び洗浄
条件は、J.mol.Biol.3（1961）585頁以降の記載によ
る。
ection kit、Best.−Nr.8279SA der Fa.Gibco/BRL）ジ
ゴキシゲニン−dUTP（例４及び14で製造及び標識付け）35 S−dATP（Amersham−Buchler,Best.Nr.SJ1304），特
異活性1200キユリー/mモル、ハイブリツド形成及び洗浄
条件は、J.mol.Biol.3（1961）585頁以降の記載によ
る。
前記細胞系の細胞を、HCl精製（0.1N HCl、燐酸塩緩衝
食塩（pBS）中、100℃で10分）にて洗浄し、引続きプラ
スチツク培養シヤーレ中のUV−照射された載物グラス上
に接種する。このために、培地として牛胎児血清５％を
有する最小必須培地（MEM）を用いた（MEM、PBS、SSCに
関してはScience130（1959）、432頁以降参照）。
食塩（pBS）中、100℃で10分）にて洗浄し、引続きプラ
スチツク培養シヤーレ中のUV−照射された載物グラス上
に接種する。このために、培地として牛胎児血清５％を
有する最小必須培地（MEM）を用いた（MEM、PBS、SSCに
関してはScience130（1959）、432頁以降参照）。
半集密的セルラーゼの形成後に、この載物グラスを培養
シヤーレから取り出し、PBSで数回洗浄した。
シヤーレから取り出し、PBSで数回洗浄した。
次いで、このガラス表面上での細胞の固定を続けて行な
つた。このために、４％パラホルムアルデヒドを用いた
（室温で５分、次いで２×SSC中で洗浄）。
つた。このために、４％パラホルムアルデヒドを用いた
（室温で５分、次いで２×SSC中で洗浄）。
ハイブリツド形成は、シリコン処理されたカバーグラス
の下で行なつた。このために、HPV−プローブのDNAを、
ハイブリツド形成溶液（非放射性プローブ:20ng/ハイブ
リツド形成領域、アイソトープ−標識プローブ:5倍の10
5cpM/ハイブリツド形成領域を有する3ng）中で、セルラ
ーゼ上に与えた（前ハイブリツド形成は例19の記載のよ
うに実施）。カバーグラスを載せた後、これを封じた
（例えばMorabuのFixogumRで）。次いで、細胞及びDNA
−プローブ中のDNAの変性を、載物グラスをヒーター上
に３〜５分間載せることにより行なつた。この際、温度
センサーを用いて載物グラス上の温度90〜92℃を測定し
た。次いで載物グラスを短時間氷上に置き、引続き、湿
つた室（２×SSC）中で１晩恒温保持する。
の下で行なつた。このために、HPV−プローブのDNAを、
ハイブリツド形成溶液（非放射性プローブ:20ng/ハイブ
リツド形成領域、アイソトープ−標識プローブ:5倍の10
5cpM/ハイブリツド形成領域を有する3ng）中で、セルラ
ーゼ上に与えた（前ハイブリツド形成は例19の記載のよ
うに実施）。カバーグラスを載せた後、これを封じた
（例えばMorabuのFixogumRで）。次いで、細胞及びDNA
−プローブ中のDNAの変性を、載物グラスをヒーター上
に３〜５分間載せることにより行なつた。この際、温度
センサーを用いて載物グラス上の温度90〜92℃を測定し
た。次いで載物グラスを短時間氷上に置き、引続き、湿
つた室（２×SSC）中で１晩恒温保持する。
カバーグラスを除いた後に、室温で２×SSC、１％SDSを
用いて２×15分間及び52℃で0.2×SSC、0.1％SDSを用い
て２×15分間洗浄した。
用いて２×15分間及び52℃で0.2×SSC、0.1％SDSを用い
て２×15分間洗浄した。
非放射性系の場合には、次いで例21の方法で、もしくは
ピチオン系中で操作した（BRL−キツトの操作法参照:3
％牛血清アルプミンでのブロツク、ストレプトアビジン
とアルカリホスフアターゼとからの複合体の添加並びに
基質混合）。ジゴキシゲニン系では、例21と同様に実施
した。酵素反応は、48時間まで観察された。
ピチオン系中で操作した（BRL−キツトの操作法参照:3
％牛血清アルプミンでのブロツク、ストレプトアビジン
とアルカリホスフアターゼとからの複合体の添加並びに
基質混合）。ジゴキシゲニン系では、例21と同様に実施
した。酵素反応は、48時間まで観察された。
プローブとして、HPV型18のゲノムのジゴキシゲニン標
識サブフラグメント（PNAS80（1983）3812〜3815、New
Engl.J.of Med.310（1984）880〜883）を使用した。ジ
ゴキシゲニン系を用いてHeLa−細胞中の核領域の着色が
明白に認められる。ハイブリツド形成前のDNアーゼ消化
の後に、僅かな非特異的バツクグラウンドのみが残る。
標識されたプローブを除くと着色は起こらない。１細胞
当り２〜３個のコピーHPVのみをゲノム中に組込んだSiH
a−細胞でも、一晩かかつてHPV−検出に成功する。この
細胞でも、主として核領域が着色される。DNアーゼ−消
化は僅かなバツクグラウンドをもたらす。標識されたプ
ローブを除くと、細胞は着色されない。
識サブフラグメント（PNAS80（1983）3812〜3815、New
Engl.J.of Med.310（1984）880〜883）を使用した。ジ
ゴキシゲニン系を用いてHeLa−細胞中の核領域の着色が
明白に認められる。ハイブリツド形成前のDNアーゼ消化
の後に、僅かな非特異的バツクグラウンドのみが残る。
標識されたプローブを除くと着色は起こらない。１細胞
当り２〜３個のコピーHPVのみをゲノム中に組込んだSiH
a−細胞でも、一晩かかつてHPV−検出に成功する。この
細胞でも、主として核領域が着色される。DNアーゼ−消
化は僅かなバツクグラウンドをもたらす。標識されたプ
ローブを除くと、細胞は着色されない。
ビオチン標識プローブの使用の際の状態は異なってい
る。このビオチン系は、SiHa−細胞を有するHeLa−細胞
を僅かに着色するが、主として非特異的に、このシトゾ
ール（cytosol）が着色される。核領域は僅かに着色さ
れるだけである。ビオチン検出系の非特異性は、ビオチ
ン標識プローブなしでもこのシドゾールの同様な着色が
行なわれるが、単にストレプトアビジン−アルカリホス
フアターダ−複合体及び相応する色素系の添加の後にの
み行なわれることからも明らかである。
る。このビオチン系は、SiHa−細胞を有するHeLa−細胞
を僅かに着色するが、主として非特異的に、このシトゾ
ール（cytosol）が着色される。核領域は僅かに着色さ
れるだけである。ビオチン検出系の非特異性は、ビオチ
ン標識プローブなしでもこのシドゾールの同様な着色が
行なわれるが、単にストレプトアビジン−アルカリホス
フアターダ−複合体及び相応する色素系の添加の後にの
み行なわれることからも明らかである。
放射性標識された35S−プローブを用いると、HeLa−及
びSiHa−細胞中のHPV−検出が可能であるが、このため
には、２〜３週間のオートラジオグラフイが必要であ
る。
びSiHa−細胞中のHPV−検出が可能であるが、このため
には、２〜３週間のオートラジオグラフイが必要であ
る。
固定細胞でのインシトウハイブリツド形成の際には、放
射性標識プローブの使用下における方法と比べて、本発
明方法は、時間節約の利点を有し、ビオチン標識プロー
ブの使用下における方法に比べて、高い感度及び明白に
高い特異性の利点を有する。
射性標識プローブの使用下における方法と比べて、本発
明方法は、時間節約の利点を有し、ビオチン標識プロー
ブの使用下における方法に比べて、高い感度及び明白に
高い特異性の利点を有する。
固定細胞中でのインシトウハイブリツド形成と並んで、
本発明方法による系を用いると、同様に塗沫組織例えば
膣領域からのHPV−注入組織中でのHPV−検出が可能であ
る。
本発明方法による系を用いると、同様に塗沫組織例えば
膣領域からのHPV−注入組織中でのHPV−検出が可能であ
る。
例25 コロニイ−ハイブリツド形成によるSUP6tRNAの検出 サツカロミセス・セレビジアエ（Saccaromyces cerevis
iae）からのSUP6tRNAの750bp BamHI−フラグメント（Sc
ience209（1978）、1396〜1460）をpUC19（Gene133（19
85）、103〜119）中でクローニングし、E.コリHB101（D
SM1607）中で形質転換した。対照としてpUC19−ペクタ
ーのみをE.コリHB101中で形質転換した。その後、交互
に、インサート含有バクテリアを対照−形質転換体と並
んでニトロセルロース上に塗布した。栄養培地を有する
寒天プレート上、37℃で５時間の恒温保持もの後に、こ
のE.コリ細胞をアルカリ処理し、洗浄しかつ生じるDNA
を、354nmでの交叉結合により膜固定した。引続き、再
び50℃で３時間洗浄し、例19と同様に前ハイブリツド形
成し、ジゴキシゲニン標識SUPtRNA−BamHI−フラグメン
ト（例14により製造）でハイブリツド形成させた。引続
く検査のためには１時間で充分である。
iae）からのSUP6tRNAの750bp BamHI−フラグメント（Sc
ience209（1978）、1396〜1460）をpUC19（Gene133（19
85）、103〜119）中でクローニングし、E.コリHB101（D
SM1607）中で形質転換した。対照としてpUC19−ペクタ
ーのみをE.コリHB101中で形質転換した。その後、交互
に、インサート含有バクテリアを対照−形質転換体と並
んでニトロセルロース上に塗布した。栄養培地を有する
寒天プレート上、37℃で５時間の恒温保持もの後に、こ
のE.コリ細胞をアルカリ処理し、洗浄しかつ生じるDNA
を、354nmでの交叉結合により膜固定した。引続き、再
び50℃で３時間洗浄し、例19と同様に前ハイブリツド形
成し、ジゴキシゲニン標識SUPtRNA−BamHI−フラグメン
ト（例14により製造）でハイブリツド形成させた。引続
く検査のためには１時間で充分である。
このインサート含有バクテリアは、それぞれ、明瞭な信
号を示し、対照形質転換体は検査できない。検査時間の
長期化は、正の信号を強化するが、対照形質転換体は、
長い検査時間でもバツクグラウンドなしのままである。
号を示し、対照形質転換体は検査できない。検査時間の
長期化は、正の信号を強化するが、対照形質転換体は、
長い検査時間でもバツクグラウンドなしのままである。
例26 ラムダプラークのインシトウハイブリツド形成 インサートとしてのヒトウロキナーゼの完全cDNAを有す
るラムダgt10−フアージ（Mol.Gen.Genet.150（197
7）、53）を、インジケータプレート上で、１プレート
上に約500のプラークが認められるまで恒温保持した。
もう１つの他のプレート上に、ウロギナーゼ組換え体及
び同じフアージ量からの、遺伝子バンクのヘテロゲンポ
ピユレーシヨンよりなる混合物を塗布した。このプレー
トは、ウロキナーゼ組換え体のみが、ハイブリツド形成
プローブとしてのウロキナーゼcDNAと共に正の信号を生
じるので、対照としての役目を有する。すべてのプレー
トから、Science196（1977）、180の記載のように、２
個のニトロセルロース−プルーフ（Abkla−tsche）を製
造し、ハイブリツド形成させた。
るラムダgt10−フアージ（Mol.Gen.Genet.150（197
7）、53）を、インジケータプレート上で、１プレート
上に約500のプラークが認められるまで恒温保持した。
もう１つの他のプレート上に、ウロギナーゼ組換え体及
び同じフアージ量からの、遺伝子バンクのヘテロゲンポ
ピユレーシヨンよりなる混合物を塗布した。このプレー
トは、ウロキナーゼ組換え体のみが、ハイブリツド形成
プローブとしてのウロキナーゼcDNAと共に正の信号を生
じるので、対照としての役目を有する。すべてのプレー
トから、Science196（1977）、180の記載のように、２
個のニトロセルロース−プルーフ（Abkla−tsche）を製
造し、ハイブリツド形成させた。
このプローブは、ヒトウロキナーゼcDNAを含有するプラ
スミド12μｇをPst Iで消化することにより製造した。
この場合に、cDNAの1.1kb−部分フラグメントが生じる
から、これを電気泳動により溶離させた（収量約２μ
ｇ）。
スミド12μｇをPst Iで消化することにより製造した。
この場合に、cDNAの1.1kb−部分フラグメントが生じる
から、これを電気泳動により溶離させた（収量約２μ
ｇ）。
この部分フラグメントの標識付けを、例14と同様に実施
する。このフイルターの前ハイブリツド形成及びハイブ
リツド形成は、例19と同様に行なつた。更なる検査工程
は、例21と同様に行なつた。
する。このフイルターの前ハイブリツド形成及びハイブ
リツド形成は、例19と同様に行なつた。更なる検査工程
は、例21と同様に行なつた。
ウロキナーゼ組換えフアージのみを含有するプレートの
フイルターは、すべてのフアージに関して第２のプルー
フ中でも良好に認められる正の信号を示したことが明ら
かであつた。この混合の場合には、組換え体フアージが
添加された程度の多量の正信号を認めることができた。
他のインサートを有するランダフアージは正の信号を示
さなかつた。
フイルターは、すべてのフアージに関して第２のプルー
フ中でも良好に認められる正の信号を示したことが明ら
かであつた。この混合の場合には、組換え体フアージが
添加された程度の多量の正信号を認めることができた。
他のインサートを有するランダフアージは正の信号を示
さなかつた。
例27 ノザン−プロツト−ハイブリツド形成（酵母からのアク
チン−mRNAの検出） この本発明の系は、ノザンプロツトによるRNAの敏感か
つ特異的な検出のために好適である。これを開示するた
めに、全酵母−RNA（サツカロミセス・セルビジアエ）
中のアクチン−mRNAを検出した。このアクチン−遺伝子
（PNAS77（1980）、3912〜3916）は、２個のエキソン
（Exon）及び１個のイントロンより成る。転写の際に、
まず前駆体−mRNAが生じる（1967Basen）。キヤツピン
グ（Capping）、スプライシング（Splicing）及びポリ
アデニル化（Polyadenylierung）（Meth.in Enzymol.65
（1980）、380〜391及びPNAS USA77（1980）5201〜5205
の記載のように実施）の後に、約1400塩基（塩基1370＋
ポリＡ）の長さの成熟mRNAが生じる。
チン−mRNAの検出） この本発明の系は、ノザンプロツトによるRNAの敏感か
つ特異的な検出のために好適である。これを開示するた
めに、全酵母−RNA（サツカロミセス・セルビジアエ）
中のアクチン−mRNAを検出した。このアクチン−遺伝子
（PNAS77（1980）、3912〜3916）は、２個のエキソン
（Exon）及び１個のイントロンより成る。転写の際に、
まず前駆体−mRNAが生じる（1967Basen）。キヤツピン
グ（Capping）、スプライシング（Splicing）及びポリ
アデニル化（Polyadenylierung）（Meth.in Enzymol.65
（1980）、380〜391及びPNAS USA77（1980）5201〜5205
の記載のように実施）の後に、約1400塩基（塩基1370＋
ポリＡ）の長さの成熟mRNAが生じる。
その後、T.Maniatis等によるMolecular Cloning（Cold
Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Yo
rk（1982）に記載のようにニトロセルロース上への移行
を行なう。前−及び主−ハイブリツド形成及び検査（18
時間）は、例19の記載と同様に行なう。検査のために、
アクチン−遺伝子の2.3KB−アクチン−EcoRI/Hind III
−フラグメントより成るジゴキシゲニン標識アクチン特
異性プローブを使用した。
Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Yo
rk（1982）に記載のようにニトロセルロース上への移行
を行なう。前−及び主−ハイブリツド形成及び検査（18
時間）は、例19の記載と同様に行なう。検査のために、
アクチン−遺伝子の2.3KB−アクチン−EcoRI/Hind III
−フラグメントより成るジゴキシゲニン標識アクチン特
異性プローブを使用した。
例28 スロツト−ブロツト分析（Slot−blot−Analyse）によ
るヒト血清中のヘパチチスＢ−ウイルス（HBV）の検出 ヘパチチスＢ−ウイルスは、線状相補的二本鎖より構成
されている約32kbの長さの環状ゲノムを有する。一本鎖
の３′−末端は変動性である。相補的二本鎖の５′−末
端は相互に置換されている。DNA−塩基上のHBV−検出の
ために、二本鎖領域Core−抗体並びにPrae−S1−、Prae
−S2−及びＸ−抗体の部分を有する（1,4−3.2kbの位
置）ジゴキシゲニン標識1.8kb Bam HI−フラグメント
（製造は例14による）をプローブとして使用した。ジゴ
キシゲニン検出と平行して、ビオチン−（例24）及び
32nP−標識プローブ（BRL−キツトの操作と同様に標識
付け。例24参照）を用いた。
るヒト血清中のヘパチチスＢ−ウイルス（HBV）の検出 ヘパチチスＢ−ウイルスは、線状相補的二本鎖より構成
されている約32kbの長さの環状ゲノムを有する。一本鎖
の３′−末端は変動性である。相補的二本鎖の５′−末
端は相互に置換されている。DNA−塩基上のHBV−検出の
ために、二本鎖領域Core−抗体並びにPrae−S1−、Prae
−S2−及びＸ−抗体の部分を有する（1,4−3.2kbの位
置）ジゴキシゲニン標識1.8kb Bam HI−フラグメント
（製造は例14による）をプローブとして使用した。ジゴ
キシゲニン検出と平行して、ビオチン−（例24）及び
32nP−標識プローブ（BRL−キツトの操作と同様に標識
付け。例24参照）を用いた。
試験ヒト血清は、免疫学的マーカーHBSAg、HBCAg、抗−
HBS及び抗−HBCのベースで正又は負に等級付けされてい
る。
HBS及び抗−HBCのベースで正又は負に等級付けされてい
る。
血清−準備： 二重測定のために、遠心分離した血清100μｌに0.5M Na
OH 300μｌを加える。室温で５分間恒温保持の後に、改
めて５分間遠心分離する。各々200μｌの上澄みをMinif
olt −装置の櫛形スリツト中にピペツト装入し、次い
で真空にする。
OH 300μｌを加える。室温で５分間恒温保持の後に、改
めて５分間遠心分離する。各々200μｌの上澄みをMinif
olt −装置の櫛形スリツト中にピペツト装入し、次い
で真空にする。
ナイロン−フイルターの準備： バイオダイナイロン膜（Biodyn Nylon−Membran;孔寸法
1.2μm;Pall Bio Support Div.Glen Cove、N.Y.）を小
室の大きなに切り、次のように準備する： 蒸留水中に５分間入れる、 10×SSC中15分間、 ワツトマン −紙上で加熱ランプ下で５分乾燥させる、 10×SSC−含浸ワツトマン −紙上に置き、 Minifold −装置中に入れる。
1.2μm;Pall Bio Support Div.Glen Cove、N.Y.）を小
室の大きなに切り、次のように準備する： 蒸留水中に５分間入れる、 10×SSC中15分間、 ワツトマン −紙上で加熱ランプ下で５分乾燥させる、 10×SSC−含浸ワツトマン −紙上に置き、 Minifold −装置中に入れる。
次いでこの試料集合プレートをフイルター上に置き、枠
固定し、引続き血清を滴加する。
固定し、引続き血清を滴加する。
フイルターの引続く処理： Minifold −装置からフイルターを取り出し、それぞれ
５分間10×SSC、５×SSC及び１×SSC上に置く。引続き
加熱ランプ下で乾燥させ、真空中80℃で２時間ベーキン
グする。
５分間10×SSC、５×SSC及び１×SSC上に置く。引続き
加熱ランプ下で乾燥させ、真空中80℃で２時間ベーキン
グする。
前ハイブリツド形成及びハイブリツド形成を例19と同様
に行なう。
に行なう。
放射性試料の製造は、BOEHRINGER MANNHEIM GMBH Best.
Nr.999644のSp6/T7転写キツトの操作法に従つて行な
う。
Nr.999644のSp6/T7転写キツトの操作法に従つて行な
う。
前ハイブリツド形成、ハイブリツド形成、洗浄及びＰ−
試料の発生はマニアチス（Maniatis;supra）に記載のよ
うに行なう。
試料の発生はマニアチス（Maniatis;supra）に記載のよ
うに行なう。
本発明方法を用いると、スロツト−ブローツトでの信号
が、正の血清のみで得られ、負の血清では得られないこ
とが明らかである。免疫血清を用いる対照反応は、同様
に負である。相応する放射性検出との比較は、同様な特
異性を示す。これに反して、ビオチン系では、明白に高
められたバツクグラウンドが認められる。
が、正の血清のみで得られ、負の血清では得られないこ
とが明らかである。免疫血清を用いる対照反応は、同様
に負である。相応する放射性検出との比較は、同様な特
異性を示す。これに反して、ビオチン系では、明白に高
められたバツクグラウンドが認められる。
本発明による方法によるHPV−検出は非常に敏感であ
る。希釈列で、10-4〜10-5の血清希釈列までのHPV−列
を検出することができる。このことは、この放射性系で
の感度に相当する。相応する負−血清は、非放射性系で
希釈しない場合に信号を生じる。この希釈列でも、ビオ
チン系では明白なバツクグラウンドが認められる。
る。希釈列で、10-4〜10-5の血清希釈列までのHPV−列
を検出することができる。このことは、この放射性系で
の感度に相当する。相応する負−血清は、非放射性系で
希釈しない場合に信号を生じる。この希釈列でも、ビオ
チン系では明白なバツクグラウンドが認められる。
例29 ジゴキシゲニン標識dUTPをポリメラーゼチエーン反応
（PCR、欧州特許第0200362号と同様）で、増幅DNAの標
識付けに使用する。
（PCR、欧州特許第0200362号と同様）で、増幅DNAの標
識付けに使用する。
試料としてプラスミドpBR322を使用する： プライマー1:5′−GCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGT−３′ プライマー2:5′−CCGCCTACATACCTCGCTCTGC−３′ 試料10pg、プライマー1 300ng、プライマー2 300ng、各
々1mモル/lのdATP、dCTR、dGTP、dTTP、トリス−HCl（p
H8.8）67mモル/l中のジゴキシゲニン−dUTP0.1mモル/
l、MgCl26.7mモル/l、硫酸アンモニウム16.6mモル/l、
メルカプトエタノール1mモル/l及び牛血清0.17mg/mlを9
5℃で２分間変性させ、40℃で３分間ハイブリツド形成
させる。その後、テルムス・アクアチクス（Thermus aq
uaticus）DNA−ポリメラーゼ6Uを添加し、65℃で３分間
恒温保持する（ポリメライズする）（この反応量は50μ
ｌであり、この濃度は、この反応量に関連する）。合計
25サイクル（変性、ハイブリツド形成、ポリメライジン
グ）を実施した。
々1mモル/lのdATP、dCTR、dGTP、dTTP、トリス−HCl（p
H8.8）67mモル/l中のジゴキシゲニン−dUTP0.1mモル/
l、MgCl26.7mモル/l、硫酸アンモニウム16.6mモル/l、
メルカプトエタノール1mモル/l及び牛血清0.17mg/mlを9
5℃で２分間変性させ、40℃で３分間ハイブリツド形成
させる。その後、テルムス・アクアチクス（Thermus aq
uaticus）DNA−ポリメラーゼ6Uを添加し、65℃で３分間
恒温保持する（ポリメライズする）（この反応量は50μ
ｌであり、この濃度は、この反応量に関連する）。合計
25サイクル（変性、ハイブリツド形成、ポリメライジン
グ）を実施した。
引続き、この反応バツチの各1/5を0.8％アガロースゲル
中で分離し、サザン法（J.Mol.Biol.98（1975）、503）
によりナイロン膜（例えばHybond−Ｎ、Amersham）上に
移行させる。1:10〜1:105の稀釈でナイロン膜上に滴加
し、固定してもよい。このフイルターのブロツキング、
複合反応及び着色を例21と同様に実施する。
中で分離し、サザン法（J.Mol.Biol.98（1975）、503）
によりナイロン膜（例えばHybond−Ｎ、Amersham）上に
移行させる。1:10〜1:105の稀釈でナイロン膜上に滴加
し、固定してもよい。このフイルターのブロツキング、
複合反応及び着色を例21と同様に実施する。
フロントページの続き (72)発明者 シユミツツ，グートルン ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8139 ベルンリー ト ヴエターシユタインシユトラーセ ３ (72)発明者 シエーラー，ハンス ローベルト ドイツ連邦共和国 Ｄ‐3400 ゲツチンゲ ン ロツツエシユトラーセ 40 (72)発明者 ケスラー，クリストプ ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8000 ミユンヘン ５ フラウンホーフアー シユトラーセ 12 (72)発明者 マツテス，ラルフ ドイツ連邦共和国 Ｄ‐7000 シユツツト ガルト 75 フリードリツヒ‐ツンデル- シユトラーセ 14 (56)参考文献 特開 昭61−60697（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開63879（ＥＰ，Ａ) Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｑｕｅｓ，６ （10），Ｐ．978−981，（1988) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，16（19），Ｐ．9344，（1988) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，16（24），Ｐ．11839，（1988)
Claims (24)
- 【請求項１】規定された配列の核酸を、化学的結合を介
して標識としてのハプテン少なくとも１個を結合含有す
る相補性核酸プローブとハイブリッド形成することによ
り検出する方法において、水素架橋形成に関与しない核
酸プローブの部位少なくとも１つに少なくとも４原子の
長さの架橋員を介して結合しているステロイドをハプテ
ンとして使用し、かつハイブリッド形成されたプローブ
を標識杭−ハプテン−抗体を介して検出することを特徴
とする核酸の検出法。 - 【請求項２】ステロイドとしてジゴキシゲニン又はジゴ
キシンを使用することを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】ハプテンが原子数４〜32の長さの架橋員を
介してプローブに結合して存在することを特徴とする請
求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】ハプテンが原子数11〜16の長さの架橋員を
介してプローブに結合して存在することを特徴とする請
求項３記載の方法。 - 【請求項５】架橋員が親水基を有することを特徴とする
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】架橋員が直鎖であることを特徴とする請求
項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】架橋員が分枝鎖でありかつ連鎖末端の少な
くとも１つでハプテン分子を含有することを特徴とする
請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】ハプテンが架橋員を介して核酸プローブの
塩基又はリボース部分に結合していることを特徴とする
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】ハプテンが架橋員を介してウラシル又はシ
トシンのC5−位にもしくはアデニン又はグアニンのC8−
位に結合していることを特徴とする請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】ハプテンが架橋員を介してリボースの
２′−位に結合していることを特徴とする請求項８記載
の方法。 - 【請求項１１】ハプテンと架橋員との間の結合がエステ
ル−，アミド−又はエーテル結合であることを特徴とす
る請求項１から10までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】ハプテンを核酸プローブ中に酵素的にDN
Aポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リバーストランスク
リプターゼ又はターミナルトランスフェラーゼ及び相応
するハプテン変性デオキシ−又はリボヌクレオシドトリ
ホスフェート基質を用いて導入した核酸プローブを使用
することを特徴とする請求項１から11までのいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項１３】ハプテンを核酸プローブ中に光化学的に
ホトハプテンを用いて導入した核酸プローブを使用する
ことを特徴とする請求項１から11までのいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１４】ハプテンを核酸プローブ中に化学的にオ
リゴデオキシリボヌクレオチド合成の範囲において、置
換可能なアミノ官能基で変性された保護されているヌク
レオキドホスホアミジットの導入及び−保護基の除去後
に−変性オリゴデオキシリボヌクレオシドとハプテンの
活性エステル、アミド又はエーテルとの反応により導入
した核酸プローブを使用することを特徴とする請求項１
から11までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】抗−ハプテン−抗体の標識として酵素標
識、放射性標識、けい光標識又は（バイオ）ルミネセン
ス標識を使用することを特徴とする請求項１から14まで
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１６】抗−ハプテン−抗体の酵素標識に標識酵
素としてアルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ
又はβ−ガラクトシダーゼを使用することを特徴とする
請求項15記載の方法。 - 【請求項１７】標識酵素の触媒活性の測定をレドックス
系を介して行うことを特徴とする請求項16記載の方法。 - 【請求項１８】標識酵素の触媒活性の測定をロイコ系を
介して行うことを特徴とする請求項16又は17記載の方
法。 - 【請求項１９】測定を酸化可能な化合物としてのインジ
ゴイド系及び酸化剤としてのテトラゾリウム塩を介して
行うことを請求項16から18までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項２０】標識酵素としてアルカリ性ホスファター
ゼを使用しかつ測定をレドックス系のＸ−ホスフェート
／ニトロブル−テトラゾリウムを介して行うことを特徴
とする請求項19記載の方法。 - 【請求項２１】検出すべき核酸を対象キャリア上に固定
された細胞中でインシトウ−ハイブリッド形成により検
出することを特徴とする請求項１から20までのいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項２２】検出すべき核酸を組織−塗沫標本中でイ
ンシトウ−ハイブリッド形成により検出することを特徴
とする請求項１から20までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２３】検出すべき核酸を変性後、 ａ）一方がその配列において検出すべき核酸の鎖の部分
配列に相補性でありかつ他方が検出すべき核酸の同じ鎖
の他の部分配列と同一である少なくとも２種のプライマ
ーでハイブリッド形成し、 ｂ）ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド及び、水
素架橋結合に関与していないデオキシリボヌクレオチド
の部位に少なくとも４個の原子の架橋員を介して結合し
ているステロイドを化学的に結合含有するデオキシリボ
ヌクレオチド少なくとも１個で処理し、 ｃ）変性、ハイブリッド形成及び重合より成るサイクル
を少なくとも１回は繰り返し、かつ ｄ）このようにして生成した標識核酸を標識抗−ハプテ
ン−抗体を介して検出する ことを特徴とする核酸の検出法。 - 【請求項２４】ハプテンを標識として含有するデオキシ
リボ−又はリボーヌクレオシドトリホスフェートにおい
て、ハプテンが水素架橋結合に関与していない位置で少
なくとも４個の原子の架橋員を介して結合しているステ
ロイドであることを特徴とするデオキシリボ−又はリボ
ーヌクレオシドトリホスフェート。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3800642.1 | 1988-01-12 | ||
| DE3800642 | 1988-01-12 | ||
| DE3813278.8 | 1988-04-20 | ||
| DE3813278A DE3813278A1 (de) | 1988-01-12 | 1988-04-20 | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
| PCT/EP1989/000026 WO1989006698A1 (en) | 1988-01-12 | 1989-01-12 | Process for detecting nucleic acids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01503647A JPH01503647A (ja) | 1989-12-07 |
| JPH0731194B2 true JPH0731194B2 (ja) | 1995-04-10 |
Family
ID=25863884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1501143A Expired - Lifetime JPH0731194B2 (ja) | 1988-01-12 | 1989-01-12 | 核酸の検出法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5344757A (ja) |
| EP (1) | EP0324474B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0731194B2 (ja) |
| DE (2) | DE3813278A1 (ja) |
| ES (1) | ES2054883T3 (ja) |
| HK (1) | HK116996A (ja) |
| WO (1) | WO1989006698A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009142214A1 (ja) | 2008-05-19 | 2009-11-26 | 株式会社セリッシュエフディー | RNA in situハイブリダイゼーション |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3813278A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
| ATE193019T1 (de) * | 1989-10-13 | 2000-06-15 | Zeneca Ltd | Sonden |
| DE4001154A1 (de) * | 1990-01-17 | 1991-07-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
| DE4222254A1 (de) * | 1992-07-07 | 1994-01-13 | Bayer Ag | Fotochemische Markierung von Nukleinsäuren mit Digoxigenin-Reagenzien und ihre Verwendung in Gensondentestsystemen |
| GB9220777D0 (en) * | 1992-10-02 | 1992-11-18 | Univ Leicester | Oligonucleotide probes |
| AU5571394A (en) * | 1992-11-30 | 1994-06-22 | Medical Research Council | Identification and purification of serine esterase enzymes |
| CA2153504A1 (en) * | 1993-01-08 | 1994-07-21 | Jamal Temsamani | Detection of synthetic oligonucleotides extracted from body fluids or tissues |
| DE4302459A1 (de) * | 1993-01-29 | 1994-08-04 | Bayer Ag | Sulfocumarinhaltige Nukleotide und deren Verwendung in Nachweisverfahren für Nukleinsäuren |
| US5646126A (en) * | 1994-02-28 | 1997-07-08 | Epoch Pharmaceuticals | Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity |
| DE4420732A1 (de) | 1994-06-15 | 1995-12-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
| EP0752474A1 (en) | 1995-07-07 | 1997-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| US5989813A (en) * | 1995-07-13 | 1999-11-23 | Molecular Innovations, Inc. | Detection of amplified nucleic acid sequences using bifunctional haptenization and dyed microparticles |
| US5955351A (en) * | 1995-07-13 | 1999-09-21 | Gerdes; John C. | Self-contained device integrating nucleic acid extraction amplification and detection |
| WO1997007242A1 (en) * | 1995-08-16 | 1997-02-27 | Steven Lehrer | Method for detecting circulating breast cancer cells |
| DE19537952A1 (de) * | 1995-10-12 | 1997-04-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis eines Analyten |
| DE19608687A1 (de) * | 1996-03-06 | 1997-09-11 | Retro Tech Gmbh | Verfahren und Test-Kit für den nichtradioaktiven, enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase |
| JP3545158B2 (ja) * | 1996-03-14 | 2004-07-21 | シスメックス株式会社 | 遺伝子検出法 |
| EP0934330A1 (en) * | 1996-07-24 | 1999-08-11 | Michelle M. Hanna | Base-protected nucleotide analogs with protected thiol groups |
| AU726045B2 (en) * | 1996-08-28 | 2000-10-26 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Method for detecting cell proliferative disorders |
| US6218114B1 (en) * | 1998-03-27 | 2001-04-17 | Academia Sinica | Methods for detecting differentially expressed genes |
| DE19824900B4 (de) | 1998-06-04 | 2006-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex |
| EP1006184A1 (en) | 1998-12-03 | 2000-06-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | IGF-1 receptor interacting proteins (IIPs) genes coding therefor and uses thereof |
| US20020146728A1 (en) | 1998-12-03 | 2002-10-10 | Tanja Ligensa | IGF-1 receptor interacting proteins |
| AU3274500A (en) | 1999-03-18 | 2000-10-09 | Exiqon A/S | Detection of mutations in genes by specific lna primers |
| EP1230383A2 (en) * | 1999-04-08 | 2002-08-14 | Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital | Quantitative assay for expression of genes in microarray |
| DE19926068C1 (de) * | 1999-06-08 | 2001-01-11 | Arne Skerra | Muteine des Bilin-Bindungsproteins |
| CA2384407C (en) | 1999-08-30 | 2009-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | 2-azapurine compounds and their use |
| EP1099757B1 (en) | 1999-11-11 | 2010-02-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for the determination of CTp11 and for determining whether a tumor sample has metatastic potential |
| US6503736B1 (en) | 1999-11-12 | 2003-01-07 | BIOMéRIEUX, INC. | Antibodies to crosslinkers and methods for using the same |
| US20030077636A1 (en) * | 2000-03-31 | 2003-04-24 | Andreas Bosio | Use of particles which have signal-emitting characteristics and at least one group with an affinity for maked nucleic acids |
| JP2001288197A (ja) | 2000-04-10 | 2001-10-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 蛍光ヌクレオチド |
| EP1287129A1 (en) | 2000-05-19 | 2003-03-05 | F.Hoffmann-La Roche Ag | A process for determing the tumoricidal potential of a sample by the use of a nucleic acid which is downregulated in human tumor cells |
| EP1307469B1 (en) | 2000-08-03 | 2008-01-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo¬3,4-d pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses |
| EP1236804A1 (en) | 2001-03-02 | 2002-09-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | A method for determination of a nucleic acid using a control |
| GB0114852D0 (en) * | 2001-06-18 | 2001-08-08 | Medical Res Council | Happiar mapping |
| EP1647592B1 (en) * | 2003-06-30 | 2009-03-11 | Panasonic Corporation | Method of modifying nucleotide chain |
| US20100291637A1 (en) * | 2003-06-30 | 2010-11-18 | Panasonic Corporation | Method for modifying nucleotide chain |
| DE602006014106D1 (de) | 2005-03-14 | 2010-06-17 | Link Genomics Inc | Verfahren zur diagnose von prostatakrebs |
| CA2611671C (en) | 2005-06-15 | 2013-10-08 | Callida Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| WO2007035527A2 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Duke University | Non-fouling polymeric surface modification and signal amplification method for biomolecular detection |
| EP1951900B1 (en) | 2005-10-07 | 2016-06-15 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| SG170028A1 (en) * | 2006-02-24 | 2011-04-29 | Callida Genomics Inc | High throughput genome sequencing on dna arrays |
| EP1994180A4 (en) | 2006-02-24 | 2009-11-25 | Callida Genomics Inc | GENOME SEQUENCING ON DNA ARRAYS WITH HIGH THROUGHPUT |
| US7910354B2 (en) | 2006-10-27 | 2011-03-22 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US20090111706A1 (en) | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by amplification |
| ES2536996T3 (es) * | 2009-07-06 | 2015-06-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anticuerpos biespecíficos de unión a digoxigenina |
| US9121054B2 (en) * | 2009-12-08 | 2015-09-01 | Biohelix Corporation | Detection of nucleic acid amplification products in the presence of an internal control sequence on an immunochromatographic strip |
| US8865404B2 (en) | 2010-11-05 | 2014-10-21 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for sequencing nucleic acid molecules |
| EP3604555A1 (en) | 2011-10-14 | 2020-02-05 | President and Fellows of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
| US9914967B2 (en) | 2012-06-05 | 2018-03-13 | President And Fellows Of Harvard College | Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes |
| US9476089B2 (en) | 2012-10-18 | 2016-10-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of making oligonucleotide probes |
| US9540685B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-01-10 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of identifying homologous genes using FISH |
| EP3183358B1 (en) | 2014-08-19 | 2020-10-07 | President and Fellows of Harvard College | Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids |
| EP4045887A4 (en) | 2019-10-18 | 2023-11-15 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | SEQUENCING OF INTACT TISSUE AT CLINICAL AND INDUSTRIAL LEVELS |
| US12071667B2 (en) | 2020-11-04 | 2024-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequence analysis using meta-stable nucleic acid molecules |
| US12060603B2 (en) | 2021-01-19 | 2024-08-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods for internally controlled in situ assays using padlock probes |
| WO2022256324A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyte detection and probe resolution |
| EP4347880A1 (en) | 2021-06-02 | 2024-04-10 | 10X Genomics, Inc. | Sample analysis using asymmetric circularizable probes |
| US20230026886A1 (en) | 2021-07-13 | 2023-01-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing polymerized matrix with controllable thickness |
| CA3224093A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Jorge Ivan Hernandez Neuta | Methods and compositions for synchronizing reactions in situ |
| US20230057571A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-23 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same |
| US20230061542A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-03-02 | 10X Genomics, Inc. | Probes comprising a split barcode region and methods of use |
| EP4423296A2 (en) | 2021-12-27 | 2024-09-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for rolling circle amplification |
| US20230279475A1 (en) | 2022-01-21 | 2023-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Multiple readout signals for analyzing a sample |
| WO2023164570A1 (en) | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Insitro, Inc. | Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations |
| US20240026427A1 (en) | 2022-05-06 | 2024-01-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences |
| WO2023215612A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of antigen and antigen receptor interactions |
| US20240035071A1 (en) | 2022-06-17 | 2024-02-01 | 10X Genomics, Inc. | Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis |
| US20240101978A1 (en) | 2022-08-12 | 2024-03-28 | 10X Genomics, Inc. | Puma1 polymerases and uses thereof |
| US12116626B2 (en) | 2022-08-16 | 2024-10-15 | 10X Genomics, Inc. | AP50 polymerases and uses thereof |
| WO2024081869A1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for analysis of biological samples |
| US20240167081A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-23 | 10X Genomics,Inc. | Immobilization methods and compositions for in situ detection |
| US20240158852A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for assessing performance of in situ assays |
| US20240218437A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-07-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for assessing performance |
| US20240263219A1 (en) | 2023-01-06 | 2024-08-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for in situ analysis of variant sequences |
| US20240263220A1 (en) | 2023-02-03 | 2024-08-08 | 10X Genomics, Inc. | In situ analysis of variant sequences in biological samples |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6160697A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-28 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 新規な誘導体化核酸配列、その製法および核酸ないし核酸配列の検出法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| DE3813278A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
| DE3836656A1 (de) * | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung |
-
1988
- 1988-04-20 DE DE3813278A patent/DE3813278A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-01-12 DE DE8989100482T patent/DE58903898D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-12 JP JP1501143A patent/JPH0731194B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-12 EP EP89100482A patent/EP0324474B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-12 WO PCT/EP1989/000026 patent/WO1989006698A1/de unknown
- 1989-01-12 US US07/415,307 patent/US5344757A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-12 ES ES89100482T patent/ES2054883T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-11 US US08/371,320 patent/US5702888A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-04 HK HK116996A patent/HK116996A/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6160697A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-28 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 新規な誘導体化核酸配列、その製法および核酸ないし核酸配列の検出法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｑｕｅｓ，６（１０），Ｐ．９７８−９８１，（１９８８） |
| ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６（１９），Ｐ．９３４４，（１９８８） |
| ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６（２４），Ｐ．１１８３９，（１９８８） |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009142214A1 (ja) | 2008-05-19 | 2009-11-26 | 株式会社セリッシュエフディー | RNA in situハイブリダイゼーション |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK116996A (en) | 1996-07-12 |
| EP0324474B1 (de) | 1993-03-31 |
| JPH01503647A (ja) | 1989-12-07 |
| US5702888A (en) | 1997-12-30 |
| ES2054883T3 (es) | 1994-08-16 |
| US5344757A (en) | 1994-09-06 |
| WO1989006698A1 (en) | 1989-07-27 |
| DE3813278A1 (de) | 1989-07-20 |
| DE58903898D1 (de) | 1993-05-06 |
| EP0324474A1 (de) | 1989-07-19 |
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