JPH1023894A - 試料中の複数種の核酸を検出する方法 - Google Patents
試料中の複数種の核酸を検出する方法Info
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- JPH1023894A JPH1023894A JP8180674A JP18067496A JPH1023894A JP H1023894 A JPH1023894 A JP H1023894A JP 8180674 A JP8180674 A JP 8180674A JP 18067496 A JP18067496 A JP 18067496A JP H1023894 A JPH1023894 A JP H1023894A
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- seq
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】試料中の複数種の核酸を、アルカリホスフ
ァターゼで標識された核酸プローブおよびこれとは異な
る標識を有する核酸プローブと、１つの容器内で同時に
ハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸プローブ
のそれぞれの標識を測定することにより、試料中の複数
種の核酸を検出することを特徴とする試料中の複数種の
核酸の検出方法およびその検出用試薬キット。 【効果】従来個別に測定が必要であった、試料中の複数
の核酸を同時に分別検出することが可能となる。その結
果、定量的増幅反応の増幅産物の測定や共増幅産物の分
別検出が容易にできる。
ァターゼで標識された核酸プローブおよびこれとは異な
る標識を有する核酸プローブと、１つの容器内で同時に
ハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸プローブ
のそれぞれの標識を測定することにより、試料中の複数
種の核酸を検出することを特徴とする試料中の複数種の
核酸の検出方法およびその検出用試薬キット。 【効果】従来個別に測定が必要であった、試料中の複数
の核酸を同時に分別検出することが可能となる。その結
果、定量的増幅反応の増幅産物の測定や共増幅産物の分
別検出が容易にできる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試料中の複数種の核
酸を測定する方法に関する。本発明により、試料中の複
数種の核酸を同時に分別検出することが可能となり、定
量的増幅反応の増幅産物の測定や共増幅産物の分別検出
等に有用である。
酸を測定する方法に関する。本発明により、試料中の複
数種の核酸を同時に分別検出することが可能となり、定
量的増幅反応の増幅産物の測定や共増幅産物の分別検出
等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】核酸増幅技術の発展により、試料中の微
量の核酸の分析が可能となってきた。特に近年において
は、従来の定性的な分析に加えて定量的な分析が重要と
なってきている。定量的増幅反応においては、標的核酸
と同時に、既知濃度の内部標準核酸（内部コントロー
ル）、もしくは競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）など
の定量用核酸の増幅を実施するのが一般的である。この
時、定量用核酸は、試料中に一定量存在する核酸をその
まま用いる場合もあれば、人工的に作製した核酸を添加
する場合もある。定量用核酸の増幅は、標的核酸とは別
の反応容器で行う方法も報告されているが、ほとんどの
場合は同一の反応容器内で行われる。この時、同一容器
内の複数種の核酸を同時に分別定量する方法が望まれる
が、これまでは有効な定量方法は報告されていない。一
方、定性分析においても増幅反応の成否を判定するため
に内部コントロール核酸の使用が望ましい。さらには、
共通配列やプライマーの混合使用による共増幅反応の場
合にも同一反応容器内の複数種の核酸の分別検出法が有
用である。
量の核酸の分析が可能となってきた。特に近年において
は、従来の定性的な分析に加えて定量的な分析が重要と
なってきている。定量的増幅反応においては、標的核酸
と同時に、既知濃度の内部標準核酸（内部コントロー
ル）、もしくは競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）など
の定量用核酸の増幅を実施するのが一般的である。この
時、定量用核酸は、試料中に一定量存在する核酸をその
まま用いる場合もあれば、人工的に作製した核酸を添加
する場合もある。定量用核酸の増幅は、標的核酸とは別
の反応容器で行う方法も報告されているが、ほとんどの
場合は同一の反応容器内で行われる。この時、同一容器
内の複数種の核酸を同時に分別定量する方法が望まれる
が、これまでは有効な定量方法は報告されていない。一
方、定性分析においても増幅反応の成否を判定するため
に内部コントロール核酸の使用が望ましい。さらには、
共通配列やプライマーの混合使用による共増幅反応の場
合にも同一反応容器内の複数種の核酸の分別検出法が有
用である。
【０００３】試料中の複数種の核酸の定量は、公知の種
々の方法が利用可能であるが、これらの方法は基本的に
は、それぞれの核酸を別々に測定する方法である。複数
種の核酸を同時に測定する方法として、ゲル電気泳動法
が考えられるが、この方法では核酸の長さが異なる場合
しか使用できず、定量的な結果が得られにくい。異なる
蛍光色素で標識された核酸プライマーやプローブを用い
る方法も可能であるが、蛍光色素による標識や蛍光標識
の検出は容易には実施できない。
々の方法が利用可能であるが、これらの方法は基本的に
は、それぞれの核酸を別々に測定する方法である。複数
種の核酸を同時に測定する方法として、ゲル電気泳動法
が考えられるが、この方法では核酸の長さが異なる場合
しか使用できず、定量的な結果が得られにくい。異なる
蛍光色素で標識された核酸プライマーやプローブを用い
る方法も可能であるが、蛍光色素による標識や蛍光標識
の検出は容易には実施できない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、試料中の複数種の核酸を同時に分別検出する方法を
提供することである。
は、試料中の複数種の核酸を同時に分別検出する方法を
提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】試料中の複数種の核酸を
同時に分別検出するためには、異なる標識を有するプロ
ーブを用い、特別な分離手段を実施することなく、それ
ぞれの標識を検出する形態がより好ましいと考えられ
る。そこで本発明者らは種々の検討を重ねた結果、試料
中の複数種の核酸を同時に分別検出する方法を確立し、
本発明を完成させるに至った。
同時に分別検出するためには、異なる標識を有するプロ
ーブを用い、特別な分離手段を実施することなく、それ
ぞれの標識を検出する形態がより好ましいと考えられ
る。そこで本発明者らは種々の検討を重ねた結果、試料
中の複数種の核酸を同時に分別検出する方法を確立し、
本発明を完成させるに至った。
【０００６】すなわち、本発明は試料中の複数種の核酸
を、アルカリホスファターゼで標識された核酸プローブ
およびこれとは異なる標識を有する核酸プローブと、１
つの容器内で同時にハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズした核酸プローブのそれぞれの標識を測定することに
より、試料中の複数種の核酸を検出することを特徴とす
る試料中の複数種の核酸の検出方法である。
を、アルカリホスファターゼで標識された核酸プローブ
およびこれとは異なる標識を有する核酸プローブと、１
つの容器内で同時にハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズした核酸プローブのそれぞれの標識を測定することに
より、試料中の複数種の核酸を検出することを特徴とす
る試料中の複数種の核酸の検出方法である。
【０００７】また、本発明は試料中の第１標的核酸に相
補的な配列を有するアルカリホスファターゼで標識され
た核酸プローブおよび試料中の第２標的核酸に相補的な
配列を有する、アルカリホスファターゼとは異なる標識
を有する核酸プローブ、それぞれの標識を測定するため
の試薬、ハイブリダイゼーション試薬および反応容器を
含むことを特徴とする試料中の複数種の核酸を検出する
ための試薬キットである。
補的な配列を有するアルカリホスファターゼで標識され
た核酸プローブおよび試料中の第２標的核酸に相補的な
配列を有する、アルカリホスファターゼとは異なる標識
を有する核酸プローブ、それぞれの標識を測定するため
の試薬、ハイブリダイゼーション試薬および反応容器を
含むことを特徴とする試料中の複数種の核酸を検出する
ための試薬キットである。
【０００８】さらに、本発明は試料中の核酸を増幅させ
るための増幅試薬、試料中の第１標的核酸に相補的な配
列を有するアルカリホスファターゼで標識された核酸プ
ローブおよび試料中の第２標的核酸に相補的な配列を有
する、アルカリホスファターゼとは異なる標識を有する
核酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、
ハイブリダイゼーション試薬および反応容器を含むこと
を特徴とする試料中の複数種の核酸を検出するための試
薬キットである。
るための増幅試薬、試料中の第１標的核酸に相補的な配
列を有するアルカリホスファターゼで標識された核酸プ
ローブおよび試料中の第２標的核酸に相補的な配列を有
する、アルカリホスファターゼとは異なる標識を有する
核酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、
ハイブリダイゼーション試薬および反応容器を含むこと
を特徴とする試料中の複数種の核酸を検出するための試
薬キットである。
【０００９】
【発明の実施態様】本発明の一実施態様は、試料中に既
知濃度のＶＺＶ核酸定量用内部標準核酸を添加し、配列
番号１および配列番号２の配列をそれぞれ有する２種の
プライマーを使用して増幅反応を行い、試料中のＶＺＶ
核酸に由来する増幅産物を配列番号４または配列番号５
の配列を有するアルカリホスファターゼで標識された核
酸プローブにて、および内部標準核酸に由来する増幅産
物を配列番号６または配列番号７の配列を有する、アル
カリホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プロー
ブにて検出することを特徴とする試料中のＶＺＶ核酸の
定量検出方法である。
知濃度のＶＺＶ核酸定量用内部標準核酸を添加し、配列
番号１および配列番号２の配列をそれぞれ有する２種の
プライマーを使用して増幅反応を行い、試料中のＶＺＶ
核酸に由来する増幅産物を配列番号４または配列番号５
の配列を有するアルカリホスファターゼで標識された核
酸プローブにて、および内部標準核酸に由来する増幅産
物を配列番号６または配列番号７の配列を有する、アル
カリホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プロー
ブにて検出することを特徴とする試料中のＶＺＶ核酸の
定量検出方法である。
【００１０】また、本発明の別な実施態様は、配列番号
１および配列番号２の配列をそれぞれ有する２種のプラ
イマーを含む試料中の核酸を増幅させるための増幅試
薬、ＶＺＶ核酸定量用内部標準核酸、試料中のＶＺＶ核
酸に相補的な配列を有するアルカリホスファターゼで標
識された核酸プローブであって、配列番号４または配列
番号５の配列を有する核酸プローブ、および試料中に添
加する内部標準核酸に相補的な配列を有する、アルカリ
ホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プローブで
あって、配列番号６または配列番号７の配列を有する核
酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、ハ
イブリダイゼーション試薬および反応容器を含むことを
特徴とする試料中のＶＺＶ核酸定量検出用試薬キットで
ある。
１および配列番号２の配列をそれぞれ有する２種のプラ
イマーを含む試料中の核酸を増幅させるための増幅試
薬、ＶＺＶ核酸定量用内部標準核酸、試料中のＶＺＶ核
酸に相補的な配列を有するアルカリホスファターゼで標
識された核酸プローブであって、配列番号４または配列
番号５の配列を有する核酸プローブ、および試料中に添
加する内部標準核酸に相補的な配列を有する、アルカリ
ホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プローブで
あって、配列番号６または配列番号７の配列を有する核
酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、ハ
イブリダイゼーション試薬および反応容器を含むことを
特徴とする試料中のＶＺＶ核酸定量検出用試薬キットで
ある。
【００１１】本発明のさらに別な実施態様は、第１標的
核酸がＨＳＶ−１、第２標的核酸がＨＳＶ−２であり、
配列番号８および配列番号９の配列を有する２種のプラ
イマーを用いて増幅反応を行い、試料中のＨＳＶ−１核
酸に由来する増幅産物を配列番号１０または配列番号１
１の配列を有するアルカリホスファターゼで標識された
核酸プローブにて、およびＨＳＶ−２核酸に由来する増
幅産物を配列番号１２または配列番号１３の配列を有す
るアルカリホスファターゼとは異なる標識を有する核酸
プローブにて検出することを特徴とする試料中のＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２を分別検出する方法である。
核酸がＨＳＶ−１、第２標的核酸がＨＳＶ−２であり、
配列番号８および配列番号９の配列を有する２種のプラ
イマーを用いて増幅反応を行い、試料中のＨＳＶ−１核
酸に由来する増幅産物を配列番号１０または配列番号１
１の配列を有するアルカリホスファターゼで標識された
核酸プローブにて、およびＨＳＶ−２核酸に由来する増
幅産物を配列番号１２または配列番号１３の配列を有す
るアルカリホスファターゼとは異なる標識を有する核酸
プローブにて検出することを特徴とする試料中のＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２を分別検出する方法である。
【００１２】本発明の別な実施態様は、第１標的核酸が
ＨＳＶ−１、第２標的核酸がＨＳＶ−２であり、配列番
号８および配列番号９の配列をそれぞれ有する２種のプ
ライマーを用いて増幅反応を行い、試料中のＨＳＶ−１
核酸に由来する増幅産物を配列番号１０または配列番号
１１の配列を有するアルカリホスファターゼで標識され
た核酸プローブにて、およびＨＳＶ−２核酸に由来する
増幅産物を配列番号１２または配列番号１３の配列を有
するアルカリホスファターゼとは異なる標識を有する核
酸プローブにて検出することを特徴とする試料中のＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２を分別検出する方法である。
ＨＳＶ−１、第２標的核酸がＨＳＶ−２であり、配列番
号８および配列番号９の配列をそれぞれ有する２種のプ
ライマーを用いて増幅反応を行い、試料中のＨＳＶ−１
核酸に由来する増幅産物を配列番号１０または配列番号
１１の配列を有するアルカリホスファターゼで標識され
た核酸プローブにて、およびＨＳＶ−２核酸に由来する
増幅産物を配列番号１２または配列番号１３の配列を有
するアルカリホスファターゼとは異なる標識を有する核
酸プローブにて検出することを特徴とする試料中のＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２を分別検出する方法である。
【００１３】また、本発明の別な実施態様は、配列番号
８および配列番号９の配列をそれぞれ有する２種のプラ
イマーを含む試料中の核酸を増幅させるための増幅試
薬、試料中のＨＳＶ−１核酸に相補的な配列を有するア
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブであっ
て、配列番号１０または配列番号１１の配列を有する核
酸プローブ、および試料中のＨＳＶ−２に相補的な配列
を有するアルカリホスファターゼとは異なる標識を有す
る核酸プローブであって、配列番号１２または配列番号
１３の配列を有する核酸プローブ、それぞれの標識を測
定するための試薬、ハイブリダイゼーション試薬および
反応容器を含むことを特徴とする試料中のＨＳＶ−１お
よびＨＳＶ−２を分別検出用試薬キットである。
８および配列番号９の配列をそれぞれ有する２種のプラ
イマーを含む試料中の核酸を増幅させるための増幅試
薬、試料中のＨＳＶ−１核酸に相補的な配列を有するア
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブであっ
て、配列番号１０または配列番号１１の配列を有する核
酸プローブ、および試料中のＨＳＶ−２に相補的な配列
を有するアルカリホスファターゼとは異なる標識を有す
る核酸プローブであって、配列番号１２または配列番号
１３の配列を有する核酸プローブ、それぞれの標識を測
定するための試薬、ハイブリダイゼーション試薬および
反応容器を含むことを特徴とする試料中のＨＳＶ−１お
よびＨＳＶ−２を分別検出用試薬キットである。
【００１４】本発明では、まず、試料中の複数種の核酸
を、アルカリホスファターゼで標識された核酸プローブ
およびこれとは異なる標識を有する核酸プローブと、１
つの容器内で同時にハイブリダイズさせる。試料中の複
数種の核酸とは、配列が相違する複数の核酸の意味し、
ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれであってもよい。１本鎖お
よび２本鎖のいずれであってもよい。その一例は核酸増
幅反応産物である。核酸プローブとは、通常、１０〜５
０個のオリゴヌクレオチドを意味し、一方のプローブが
標的核酸、他方のプローブが第２の標的核酸もしくは内
部標準核酸と相補的である。また、ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は特に制限されない。
を、アルカリホスファターゼで標識された核酸プローブ
およびこれとは異なる標識を有する核酸プローブと、１
つの容器内で同時にハイブリダイズさせる。試料中の複
数種の核酸とは、配列が相違する複数の核酸の意味し、
ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれであってもよい。１本鎖お
よび２本鎖のいずれであってもよい。その一例は核酸増
幅反応産物である。核酸プローブとは、通常、１０〜５
０個のオリゴヌクレオチドを意味し、一方のプローブが
標的核酸、他方のプローブが第２の標的核酸もしくは内
部標準核酸と相補的である。また、ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は特に制限されない。
【００１５】次いで、本発明ではハイブリダイズした核
酸プローブのそれぞれの標識を測定することにより、試
料中の複数種の核酸を検出するが、ハイブリダイズした
核酸プローブのアルカリホスファターゼ活性は発光法に
より測定する。
酸プローブのそれぞれの標識を測定することにより、試
料中の複数種の核酸を検出するが、ハイブリダイズした
核酸プローブのアルカリホスファターゼ活性は発光法に
より測定する。
【００１６】アルカリホスファターゼとは異なる標識と
しては、ビオチン、ペルオキシダーゼなどの酵素類、蛍
光物質、抗原、酵素基質などが例示される。ハイブリダ
イズした核酸プローブのアルカリホスファターゼ活性の
測定法としては、１，２−ジオキセタン類などの発光基
質を使用して、その発光強度を測定する方法がある。ハ
イブリダイズした核酸プローブのペルオキシダーゼ活性
の測定法としては、過酸化水素および色原体、例えば４
−アミノアンチピリンおよびフェノール誘導体またはア
ニリン誘導体などを使用する発色法および発光基質であ
る１，２─ジオキセタン類を使用する発光法がある。ビ
オチンは、ペルオキシダーゼ標識アビジンと反応させた
後、ペルオキシダーゼ活性を発色法または発光法により
測定する。
しては、ビオチン、ペルオキシダーゼなどの酵素類、蛍
光物質、抗原、酵素基質などが例示される。ハイブリダ
イズした核酸プローブのアルカリホスファターゼ活性の
測定法としては、１，２−ジオキセタン類などの発光基
質を使用して、その発光強度を測定する方法がある。ハ
イブリダイズした核酸プローブのペルオキシダーゼ活性
の測定法としては、過酸化水素および色原体、例えば４
−アミノアンチピリンおよびフェノール誘導体またはア
ニリン誘導体などを使用する発色法および発光基質であ
る１，２─ジオキセタン類を使用する発光法がある。ビ
オチンは、ペルオキシダーゼ標識アビジンと反応させた
後、ペルオキシダーゼ活性を発色法または発光法により
測定する。
【００１７】本発明では、試料中の複数種の核酸を、ア
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブおよび
これとは異なる標識を有する核酸プローブと、１つの容
器内で同時にハイブリダイズさせる。反応容器として
は、例えばマイクロプレート、ディスポーザブル・チュ
ーブ、プラスティック試験管、バイブリバッグなどがあ
る。反応容器として、マイクロプレートを用いることに
より、より容易に実施可能である。
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブおよび
これとは異なる標識を有する核酸プローブと、１つの容
器内で同時にハイブリダイズさせる。反応容器として
は、例えばマイクロプレート、ディスポーザブル・チュ
ーブ、プラスティック試験管、バイブリバッグなどがあ
る。反応容器として、マイクロプレートを用いることに
より、より容易に実施可能である。
【００１８】本発明の具体例としては、一方のプローブ
はアルカリホスファターゼで標識された核酸プローブで
あり、アルカリホスファターゼ標識でないプローブの標
識はビオチンであり、アルカリホスファターゼ標識を発
光法により測定し、ビオチン標識をペルオキシダーゼ標
識アビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ活性を発
色法または発光法により測定する。
はアルカリホスファターゼで標識された核酸プローブで
あり、アルカリホスファターゼ標識でないプローブの標
識はビオチンであり、アルカリホスファターゼ標識を発
光法により測定し、ビオチン標識をペルオキシダーゼ標
識アビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ活性を発
色法または発光法により測定する。
【００１９】別の具体例としては、一方のプローブはア
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブであ
り、もう一方のプローブの標識がペルオキシダーゼであ
り、アルカリホスファターゼ標識を発光法により測定
し、また、ペルオキシダーゼ標識を発色法または発光法
により測定することを特徴とする。
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブであ
り、もう一方のプローブの標識がペルオキシダーゼであ
り、アルカリホスファターゼ標識を発光法により測定
し、また、ペルオキシダーゼ標識を発色法または発光法
により測定することを特徴とする。
【００２０】本発明は、第１の標的核酸および第２の標
的核酸もしくは内部標準核酸にそれぞれ特異的でかつ、
一方がアルカリホスファターゼで他方がそれ以外の標識
で標識された核酸プローブ、それぞれの標識を検出する
ための試薬、および複数種の核酸プローブを同時にハイ
ブリダイズさせるための反応容器を含む試料中の核酸を
測定するための試薬キットである。
的核酸もしくは内部標準核酸にそれぞれ特異的でかつ、
一方がアルカリホスファターゼで他方がそれ以外の標識
で標識された核酸プローブ、それぞれの標識を検出する
ための試薬、および複数種の核酸プローブを同時にハイ
ブリダイズさせるための反応容器を含む試料中の核酸を
測定するための試薬キットである。
【００２１】また、本発明には標的核酸、および／また
は第２の標的核酸もしくは内部標準核酸が核酸増幅反応
産物である場合も含まれる。
は第２の標的核酸もしくは内部標準核酸が核酸増幅反応
産物である場合も含まれる。
【００２２】さらに本発明の別な具体例は、標的核酸、
または第２の標的核酸もしくは内部標準核酸の、いずれ
か一方あるいは両方を増幅させるための増幅試薬、同じ
く標的核酸、および第２の標的核酸もしくは内部標準核
酸にそれぞれ特異的でかつ、一方がアルカリホスファタ
ーゼで他方がそれ以外の標識で標識された核酸プロー
ブ、それぞれの標識を検出するための試薬、および複数
種の核酸プローブを同時にハイブリダイズさせるための
反応容器を含む試料中の核酸を測定するための試薬キッ
トである。
または第２の標的核酸もしくは内部標準核酸の、いずれ
か一方あるいは両方を増幅させるための増幅試薬、同じ
く標的核酸、および第２の標的核酸もしくは内部標準核
酸にそれぞれ特異的でかつ、一方がアルカリホスファタ
ーゼで他方がそれ以外の標識で標識された核酸プロー
ブ、それぞれの標識を検出するための試薬、および複数
種の核酸プローブを同時にハイブリダイズさせるための
反応容器を含む試料中の核酸を測定するための試薬キッ
トである。
【００２３】本発明に先だって増幅反応を実施する場
合、標的核酸と第２の標的核酸もしくは内部定量用核酸
を同時に増幅可能な方法であるならば、特にその種類に
は限定されない。例えば、ＰＣＲ法(polymerase chain
reaction) 、ＮＡＳＢＡ法(nucleic acid sequence bas
ed amplification) 、ＰＤＡ法(primer digestion ampl
ification)、ＳＤＡ法(strand displacement amplifica
tion) 、Ｑβレプリカーゼ法等の増幅法が利用可能であ
る。また、標的配列と内部定量用配列を同時に増幅する
方法が、競合増幅であっても、競合増幅でなくてもいず
れの場合であってもよい。試料中に標的核酸および／ま
たは内部定量用核酸配列が十分に存在する場合には、分
別検出に先立つ増幅反応を必要としないことはいうまで
もない。
合、標的核酸と第２の標的核酸もしくは内部定量用核酸
を同時に増幅可能な方法であるならば、特にその種類に
は限定されない。例えば、ＰＣＲ法(polymerase chain
reaction) 、ＮＡＳＢＡ法(nucleic acid sequence bas
ed amplification) 、ＰＤＡ法(primer digestion ampl
ification)、ＳＤＡ法(strand displacement amplifica
tion) 、Ｑβレプリカーゼ法等の増幅法が利用可能であ
る。また、標的配列と内部定量用配列を同時に増幅する
方法が、競合増幅であっても、競合増幅でなくてもいず
れの場合であってもよい。試料中に標的核酸および／ま
たは内部定量用核酸配列が十分に存在する場合には、分
別検出に先立つ増幅反応を必要としないことはいうまで
もない。
【００２４】本発明の特徴は、１つの容器、例えばマイ
クロプレート内で２種類の核酸のハイブリダイゼーショ
ンを同時に進行させ、プローブの標識の違いを利用し
て、それぞれを別々に測定する方法であり、その一実施
態様は、定量増幅（標的核酸と内部標準核酸の同時増
幅）した産物の測定であり、この場合、標的核酸は１種
である。他の実施態様は、２種の標的核酸を同時に増幅
（第１の標的核酸と第２の標的核酸の同時増幅）した産
物の測定である。
クロプレート内で２種類の核酸のハイブリダイゼーショ
ンを同時に進行させ、プローブの標識の違いを利用し
て、それぞれを別々に測定する方法であり、その一実施
態様は、定量増幅（標的核酸と内部標準核酸の同時増
幅）した産物の測定であり、この場合、標的核酸は１種
である。他の実施態様は、２種の標的核酸を同時に増幅
（第１の標的核酸と第２の標的核酸の同時増幅）した産
物の測定である。
【００２５】
【実施例】以下に、本発明の実施例を示すことによっ
て、本発明の効果をより一層明確なものとする。参考例１ 材料の調製および基本条件 （Ａ）各種オリゴヌクレオチドの調製 各種オリゴヌクレオチドはＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザ
ー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成し
た。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２μＭスケ
ールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はア
ンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファルマシア
社製ＦＰＬＣでＭｏｎｏＱカラムにて実施した。なお、
合成したオリゴヌクレオチドは必要によりJablonski ら
の方法（Nucl. Acid Res. 14:6115-6128, 1986）に従っ
て、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、もしくはペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させた。また、ビオチ
ン化プローブの合成にはBiotin-ON TMPhosphoramidite
（クロンテック社製）を用いた。
て、本発明の効果をより一層明確なものとする。参考例１ 材料の調製および基本条件 （Ａ）各種オリゴヌクレオチドの調製 各種オリゴヌクレオチドはＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザ
ー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成し
た。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２μＭスケ
ールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はア
ンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファルマシア
社製ＦＰＬＣでＭｏｎｏＱカラムにて実施した。なお、
合成したオリゴヌクレオチドは必要によりJablonski ら
の方法（Nucl. Acid Res. 14:6115-6128, 1986）に従っ
て、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、もしくはペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させた。また、ビオチ
ン化プローブの合成にはBiotin-ON TMPhosphoramidite
（クロンテック社製）を用いた。
【００２６】（Ｂ）ウイルス核酸の調製 ウイルス核酸の調製には下記の各標準株を用いた。 ・ＶＺＶ ： Ｋａｗａｇｕｃｈｉ株 ・ＣＭＶ ： ＡＤ１６９株 ・ＨＳＶ−１ ： Ｓｅｉｂｅｒｔ株 ・ＨＳＶ−２ ： ＵＷ２６８株 ウイルス核酸は常法により調製した。
【００２７】（Ｃ）核酸の増幅反応 反応液９５μｌに核酸溶液５μｌを加え、核酸の増幅反
応を行った。反応液組成は以下の通りである。 反応液組成 ＫＣｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％ dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各０．２ｍＭ プライマー 各０．１μＭ ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ ４０単位／ｍｌ
応を行った。反応液組成は以下の通りである。 反応液組成 ＫＣｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％ dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各０．２ｍＭ プライマー 各０．１μＭ ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ ４０単位／ｍｌ
【００２８】反応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、１分、 アニーリング：５５℃、２分 重合反応： ７５℃、１．５分 を３０回行った。これらの操作はパーキン−エルマー／
シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイ
クラーを用いて行った。
シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイ
クラーを用いて行った。
【００２９】（Ｄ）捕捉プローブ固相化プレートの調製 固相担体として、ポリスチレン製のマイクロタイタープ
レート（マイクロライト２、ダイナテック社製）を用い
た。（Ａ）で得られた標的核酸用および内部標準核酸
（もしくは第２標的核酸）用の捕捉プローブ用オリゴヌ
クレオチドを５０ｍＭほう酸緩衝液で各１０ｐｍｏｌ／
ｍｌに調製し、１ウェルあたり１００μｌずつ分注して
固相化した。
レート（マイクロライト２、ダイナテック社製）を用い
た。（Ａ）で得られた標的核酸用および内部標準核酸
（もしくは第２標的核酸）用の捕捉プローブ用オリゴヌ
クレオチドを５０ｍＭほう酸緩衝液で各１０ｐｍｏｌ／
ｍｌに調製し、１ウェルあたり１００μｌずつ分注して
固相化した。
【００３０】（Ｅ）サンドイッチ・ハイブリダイゼーシ
ョン マイクロプレートを用いたサンドイッチ・ハイブリダイ
ゼーションは吉本のシステム（日本臨床検査自動化学会
会誌、２０巻、１９９５）を用い、以下の条件で洗浄工
程まで実施し、検出工程以降はそれぞれの実験に応じて
実施した。 ・試料量 ２０μｌ ・ハイブリ１ ５０℃、６０分 ・ハイブリ２ ５０℃、６０分 ・洗浄１ ５０℃、 ５分 （２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ） ・洗浄２ 室温、 ５分 （１×ＳＳＣ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
ョン マイクロプレートを用いたサンドイッチ・ハイブリダイ
ゼーションは吉本のシステム（日本臨床検査自動化学会
会誌、２０巻、１９９５）を用い、以下の条件で洗浄工
程まで実施し、検出工程以降はそれぞれの実験に応じて
実施した。 ・試料量 ２０μｌ ・ハイブリ１ ５０℃、６０分 ・ハイブリ２ ５０℃、６０分 ・洗浄１ ５０℃、 ５分 （２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ） ・洗浄２ 室温、 ５分 （１×ＳＳＣ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
【００３１】（Ｆ）内部標準核酸の調製 ＶＺＶ−ＤＮＡの定量用の内部標準核酸は配列表・配列
番号１４，１５のプライマーを用いて、ＣＭＶ−ＤＮＡ
を鋳型にＰＣＲ（条件は（Ｃ）参照）を実施することに
より調製した。得られた増幅産物は QIAquick-spinカラ
ム（QIAGEN社製）を用いて精製し、吸光光度計により濃
度を決定した。
番号１４，１５のプライマーを用いて、ＣＭＶ−ＤＮＡ
を鋳型にＰＣＲ（条件は（Ｃ）参照）を実施することに
より調製した。得られた増幅産物は QIAquick-spinカラ
ム（QIAGEN社製）を用いて精製し、吸光光度計により濃
度を決定した。
【００３２】実施例１ 試料中の複数種の核酸の分別検
出（１） ＶＺＶ由来増幅核酸精製物１，１０，１００ｆｍｏｌと
ＣＭＶ由来増幅核酸精製物を１，１０，１００ｆｍｏｌ
を試料として、配列番号５および７を固相化したプレー
ト上で（Ｅ）の条件でサンドイッチ・ハイブリダイゼー
ションを実施した。この際、ＶＺＶ検出用プローブとし
て配列番号４の配列をアルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）標識した核酸、内部標準検出用プローブとして配列
番号６の配列をビオチン標識した核酸を同時に使用し
た。洗浄２工程後、１００μｌのＡＬＰ発光基質、ルミ
フォス480 （Lumigen 社製）を添加し、３７℃で１５分
間保温してＶＺＶ核酸量を測定した。除液後、１×ＳＳ
Ｃで５回洗浄後、１００μｌのペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識アビジンを添加し、３７℃で６０分間保温し
た。０．５％ＰＢＳで５回洗浄後、３％のＰＯＤ発色
剤、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩１００μｌを添
加し、２５℃で６０分保温した。２００μｌの反応停止
液（硫酸）添加後、吸光度計（BIO-TEK 社製）で４９０
ｎｍの吸光度を測定し、ＣＭＶ核酸量を測定した（表
１）。対照実験として、ＡＬＰ発光を実施しない場合の
ＰＯＤ活性を測定した。その結果を表１に示す
出（１） ＶＺＶ由来増幅核酸精製物１，１０，１００ｆｍｏｌと
ＣＭＶ由来増幅核酸精製物を１，１０，１００ｆｍｏｌ
を試料として、配列番号５および７を固相化したプレー
ト上で（Ｅ）の条件でサンドイッチ・ハイブリダイゼー
ションを実施した。この際、ＶＺＶ検出用プローブとし
て配列番号４の配列をアルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）標識した核酸、内部標準検出用プローブとして配列
番号６の配列をビオチン標識した核酸を同時に使用し
た。洗浄２工程後、１００μｌのＡＬＰ発光基質、ルミ
フォス480 （Lumigen 社製）を添加し、３７℃で１５分
間保温してＶＺＶ核酸量を測定した。除液後、１×ＳＳ
Ｃで５回洗浄後、１００μｌのペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識アビジンを添加し、３７℃で６０分間保温し
た。０．５％ＰＢＳで５回洗浄後、３％のＰＯＤ発色
剤、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩１００μｌを添
加し、２５℃で６０分保温した。２００μｌの反応停止
液（硫酸）添加後、吸光度計（BIO-TEK 社製）で４９０
ｎｍの吸光度を測定し、ＣＭＶ核酸量を測定した（表
１）。対照実験として、ＡＬＰ発光を実施しない場合の
ＰＯＤ活性を測定した。その結果を表１に示す
【００３３】
【表１】
【００３４】表１から明らかなように、ＶＺＶ核酸とＣ
ＭＶ核酸を同時に一つの反応容器で測定することができ
た。
ＭＶ核酸を同時に一つの反応容器で測定することができ
た。
【００３５】実施例２ 試料中の複数種の核酸の分別検
出（２） 実施例１と同様の条件でアビジン／ビオチン反応、洗浄
まで実施し、発色剤の代わりにＰＯＤ用発光基質とし
て、２０ｍＭのルミノール（和光純薬製）および２ｍＭ
の過酸化水素水溶液１００μｌを用いて、ＣＭＶ核酸量
を測定した。その結果を表２に示す。
出（２） 実施例１と同様の条件でアビジン／ビオチン反応、洗浄
まで実施し、発色剤の代わりにＰＯＤ用発光基質とし
て、２０ｍＭのルミノール（和光純薬製）および２ｍＭ
の過酸化水素水溶液１００μｌを用いて、ＣＭＶ核酸量
を測定した。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】表２から明らかなように、発色検出と同様
にＶＺＶ核酸とＣＭＶ核酸を同時に一つの反応容器で測
定することができた。
にＶＺＶ核酸とＣＭＶ核酸を同時に一つの反応容器で測
定することができた。
【００３８】実施例３ 試料中の複数種の核酸の分別検
出（３） 実施例１と同様の条件でビオチン標識プローブの代わり
にＰＯＤ直接標識プローブを用い洗浄工程まで実施後、
１００μｌの２０ｍＭルミノール（ＰＯＤ発光基質）お
よび２ｍＭ過酸化水素水溶液を用いてＣＭＶ核酸量を測
定した。次に、プレートを１×ＳＳＣで５回洗浄後、Ａ
ＬＰ発光基質を添加しＶＺＶ核酸量を測定した。その結
果を表３に示す。
出（３） 実施例１と同様の条件でビオチン標識プローブの代わり
にＰＯＤ直接標識プローブを用い洗浄工程まで実施後、
１００μｌの２０ｍＭルミノール（ＰＯＤ発光基質）お
よび２ｍＭ過酸化水素水溶液を用いてＣＭＶ核酸量を測
定した。次に、プレートを１×ＳＳＣで５回洗浄後、Ａ
ＬＰ発光基質を添加しＶＺＶ核酸量を測定した。その結
果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】表３から明らかなように、ビオチン／アビ
ジン系と同様にＶＺＶ核酸とＣＭＶ核酸を同時に一つの
反応容器で測定することができた。
ジン系と同様にＶＺＶ核酸とＣＭＶ核酸を同時に一つの
反応容器で測定することができた。
【００４１】実施例４ 試料中のＶＺＶ核酸の定量 ＶＺＶ核酸の存在が疑われる３つの試料各５μｌを１，
０００コピーの配列番号３の内部標準核酸と共に配列番
号１，２のプライマーを用いて、参考例（Ｃ）の条件で
共増幅反応を実施した。また、検量線を得るためにそれ
ぞれ１００，１０００および１０，０００コピーの既知
濃度ＶＺＶ核酸を１，０００コピーの内部標準核酸と共
増幅反応を行った。得られた増幅産物を２０倍に希釈し
実施例１と同様の条件でサンドイッチ・ハイブリダイゼ
ーションを実施し、ＶＺＶ増幅産物量と内部標準核酸増
幅産物量を同時に測定した。その結果を表４に示す。
０００コピーの配列番号３の内部標準核酸と共に配列番
号１，２のプライマーを用いて、参考例（Ｃ）の条件で
共増幅反応を実施した。また、検量線を得るためにそれ
ぞれ１００，１０００および１０，０００コピーの既知
濃度ＶＺＶ核酸を１，０００コピーの内部標準核酸と共
増幅反応を行った。得られた増幅産物を２０倍に希釈し
実施例１と同様の条件でサンドイッチ・ハイブリダイゼ
ーションを実施し、ＶＺＶ増幅産物量と内部標準核酸増
幅産物量を同時に測定した。その結果を表４に示す。
【００４２】
【表４】
【００４３】表４から明らかなように、３つの試料のＶ
ＺＶ核酸量はそれぞれ、７０，０，１，３００コピーで
あると算出された。
ＺＶ核酸量はそれぞれ、７０，０，１，３００コピーで
あると算出された。
【００４４】実施例５ 共増幅産物の分別検出 ＨＳＶ−１のみを含む試料、ＨＳＶ−２のみを含む試
料、ＨＳＶ−１，２の両方を含む試料、およびいずれも
含まない試料各５μｌを配列番号８と９のプライマーを
用いて増幅反応を行った。得られた増幅産物を２０倍に
希釈し実施例１と同様の条件でサンドイッチ・ハイブリ
ダイゼーションを実施した。ＨＳＶ−１用プローブはＡ
ＬＰで、ＨＳＶ−２用プローブはビオチンで標識したも
のをそれぞれ用いて、ＨＳＶ−１増幅産物量とＨＳＶ−
２増幅産物量を同時に分別検出を行った。その結果を表
５に示す。
料、ＨＳＶ−１，２の両方を含む試料、およびいずれも
含まない試料各５μｌを配列番号８と９のプライマーを
用いて増幅反応を行った。得られた増幅産物を２０倍に
希釈し実施例１と同様の条件でサンドイッチ・ハイブリ
ダイゼーションを実施した。ＨＳＶ−１用プローブはＡ
ＬＰで、ＨＳＶ−２用プローブはビオチンで標識したも
のをそれぞれ用いて、ＨＳＶ−１増幅産物量とＨＳＶ−
２増幅産物量を同時に分別検出を行った。その結果を表
５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】表５から明らかなように、ＨＳＶ−１，２
がそれぞれ単独で存在した場合、または共存した場合で
もそれぞれのウイルスを同時に分別検出することができ
た。
がそれぞれ単独で存在した場合、または共存した場合で
もそれぞれのウイルスを同時に分別検出することができ
た。
【００４７】
【発明の効果】本発明により、従来個別に測定が必要で
あった、試料中の複数の核酸を同時に分別定量すること
が可能となる。その結果、定量的増幅反応の増幅産物の
測定や共増幅産物の分別検出が容易にできる。
あった、試料中の複数の核酸を同時に分別定量すること
が可能となる。その結果、定量的増幅反応の増幅産物の
測定や共増幅産物の分別検出が容易にできる。
【００４８】
配列番号：1 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..23 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 配列 GTTTCTCCCA CTGGTACGTC AAG 23
【００４９】配列番号：2 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..23 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 配列 CAGTGGCCGC TACGTATAAA CAT 23
【００５０】配列番号：3 配列の長さ：330 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状または環状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..23 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 存在位置：24..307 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＣＭＶに特異的な配列 存在位置：308..330 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 配列 GTTTCTCCCA CTGGTACGTC AAGATGCATG GCCAAGACTA ACTCGCCCAA CTATAAGCTC 60 AACACTATGG CCGAGCTTTA CCTGCGGCAA CGCAAGGATG ACCTGTCTTA CAAGGACATC 120 CCGCGTTGTT TCGTGGCTAA TGCCGAGGGC CGCGCCCAGG TAGGCCGTTA CTGTCTGCAG 180 GACGCCGTAT TGGTGCGCGA TATGTTCAAC ACCATTAATT TTCACTACGA GGCCGGGGCC 240 ATCGCGCGGC TGGCTAAAAT TCCGTTGCGG CGTGTCATCT TTGACGGACA GCAGATCCGT 300 ATCTACAATG TTTATACGTA GCGGCCACTG 330
【００５１】配列番号：4 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 配列 TTTTACCACG CTAACGTTAA ATTTTG 26
【００５２】配列番号：5 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 配列 TTATGCCACC TTTACAGTTG A 21
【００５３】配列番号：6 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＣＭＶに特異的な配列 配列 ATTCCGTTGC GGCGTGTCAT CTTT 24
【００５４】配列番号：7 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＣＭＶに特異的な配列 配列 GTTCAACACC ATTAATTTTC ACTACG 26
【００５５】配列番号：8 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＨＳＶに共通の配列 配列 GTTTGTGTGT TGTTCGGTCA TAAGCT 26
【００５６】配列番号：9 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＨＳＶに共通の配列 配列 GCATAGTACA CAGTGATCGG GA 22
【００５７】配列番号：10 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＨＳＶ−１に特異的な配列 配列 AGCGCGAACA ACCAACTACC CCGAT 25
【００５８】配列番号：11 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＨＳＶ−１に特異的な配列 配列 TCAGTTATCC TTAAGGTCTC TTTTG 25
【００５９】配列番号：12 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＨＳＶ−２に特異的な配列 配列 TCCCAATCGA TTTCGCGGGA AGAAC 25
【００６０】配列番号：13 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＨＳＶ−２に特異的な配列 配列 TTCCGGTTTT GGACCAGCTG ACCGA 25
【００６１】配列番号：14 配列の長さ：43 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..23 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 存在位置：24..43 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＣＭＶに特異的な配列 配列 GTTTCTCCCA CTGGTACGTC AAGATGCATG GCCAAGACTA ACT 43
【００６２】配列番号：15 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 存在位置：1..23 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＶＺＶに特異的な配列 存在位置：24..42 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ＣＭＶに特異的な配列 配列 CAGTGGCCGC TACGTATAAA CATTGTAGAT ACGGATCTGC TG 42
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/70 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/70
Claims (14)
- 【請求項１】 試料中の複数種の核酸を、アルカリホス
ファターゼで標識された核酸プローブおよびこれとは異
なる標識を有する核酸プローブと、１つの容器内で同時
にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸プロー
ブのそれぞれの標識を測定することにより、試料中の複
数種の核酸を検出することを特徴とする試料中の複数種
の核酸の検出方法。 - 【請求項２】 試料中の複数種の核酸が核酸増幅反応産
物である請求項１記載の試料中の複数種の核酸の検出方
法。 - 【請求項３】 ハイブリダイズした核酸プローブのアル
カリホスファターゼ活性を発光法により測定する請求項
１記載の試料中の複数種の核酸の検出方法。 - 【請求項４】 アルカリホスファターゼとは異なる標識
がビオチンであり、ハイブリダイズした核酸プローブの
アルカリホスファターゼ活性を発光法により測定し、か
つ、ハイブリダイズした核酸プローブのビオチンをペル
オキシダーゼ標識アビジンと反応後、該ビオチンと結合
したペルオキシダーゼ標識アビジンのペルオキシダーゼ
活性を発色法により測定する請求項１記載の試料中の複
数種の核酸の検出方法。 - 【請求項５】 アルカリホスファターゼとは異なる標識
がビオチンであり、ハイブリダイズした核酸プローブの
アルカリホスファターゼ活性を発光法により測定し、か
つ、ハイブリダイズした核酸プローブのビオチンをペル
オキシダーゼ標識アビジンと反応後、該ビオチンと結合
したペルオキシダーゼ標識アビジンのペルオキシダーゼ
活性を発光法により測定する請求項１記載の試料中の複
数種の核酸の検出方法。 - 【請求項６】 アルカリホスファターゼとは異なる標識
がペルオキシダーゼであり、ハイブリダイズした核酸プ
ローブのアルカリホスファターゼ活性を発光法により測
定し、かつ、ハイブリダイズした核酸プローブのペルオ
キシダーゼ活性を発色法により測定する請求項１記載の
試料中の複数種の核酸の検出方法。 - 【請求項７】 アルカリホスファターゼとは異なる標識
がペルオキシダーゼであり、ハイブリダイズした核酸プ
ローブのアルカリホスファターゼ活性を発光法により測
定し、かつ、ハイブリダイズした核酸プローブのペルオ
キシダーゼ活性を発光法により測定する請求項１記載の
試料中の複数種の核酸の検出方法。 - 【請求項８】 反応容器がマイクロプレートである請求
項１記載の試料中の複数種の核酸の検出方法。 - 【請求項９】 試料中の第１標的核酸に相補的な配列を
有するアルカリホスファターゼで標識された核酸プロー
ブおよび試料中の第２標的核酸に相補的な配列を有す
る、アルカリホスファターゼとは異なる標識を有する核
酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、ハ
イブリダイゼーション試薬および反応容器を含むことを
特徴とする試料中の複数種の核酸を検出するための試薬
キット。 - 【請求項１０】 試料中の核酸を増幅させるための増幅
試薬、試料中の第１標的核酸に相補的な配列を有するア
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブおよび
試料中の第２標的核酸に相補的な配列を有する、アルカ
リホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プロー
ブ、それぞれの標識を測定するための試薬、ハイブリダ
イゼーション試薬および反応容器を含むことを特徴とす
る試料中の複数種の核酸を検出するための試薬キット。 - 【請求項１１】 試料中に配列番号３の配列を有する既
知濃度のＶＺＶ核酸定量用内部標準核酸を添加し、配列
番号１および配列番号２の配列をそれぞれ有する２種の
プライマーを使用して増幅反応を行い、試料中のＶＺＶ
核酸に由来する増幅産物を配列番号４または配列番号５
の配列を有するアルカリホスファターゼで標識された核
酸プローブにて、および内部標準核酸に由来する増幅産
物を配列番号６または配列番号７の配列を有する、アル
カリホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プロー
ブにて検出することを特徴とする試料中のＶＺＶ核酸の
定量検出方法。 - 【請求項１２】 配列番号１および配列番号２の配列を
それぞれ有する２種のプライマーを含む試料中のＶＺＶ
核酸を増幅させるための増幅試薬、配列番号３の配列を
有するＶＺＶ核酸定量用内部標準核酸、試料中のＶＺＶ
核酸に相補的な配列を有するアルカリホスファターゼで
標識された核酸プローブであって、配列番号４または配
列番号５の配列を有する核酸プローブ、および試料中に
添加する内部標準核酸に相補的な配列を有する、アルカ
リホスファターゼとは異なる標識を有する核酸プローブ
であって、配列番号６または配列番号７の配列を有する
核酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、
ハイブリダイゼーション試薬および反応容器を含むこと
を特徴とする試料中のＶＺＶ核酸定量検出用試薬キッ
ト。 - 【請求項１３】 第１標的核酸がＨＳＶ−１、第２標的
核酸がＨＳＶ−２であり、配列番号８および配列番号９
の配列をそれぞれ有する２種のプライマーを用いて増幅
反応を行い、試料中のＨＳＶ−１核酸に由来する増幅産
物を配列番号１０または配列番号１１の配列を有するア
ルカリホスファターゼで標識された核酸プローブにて、
およびＨＳＶ−２核酸に由来する増幅産物を配列番号１
２または配列番号１３の配列を有するアルカリホスファ
ターゼとは異なる標識を有する核酸プローブにて検出す
ることを特徴とする試料中のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−
２を分別検出する方法。 - 【請求項１４】 配列番号８および配列番号９の配列を
それぞれ有する２種のプライマーを含む試料中のＨＳＶ
核酸を増幅させるための増幅試薬、試料中のＨＳＶ−１
核酸に相補的な配列を有するアルカリホスファターゼで
標識された核酸プローブであって、配列番号１０または
配列番号１１の配列を有する核酸プローブ、および試料
中のＨＳＶ−２に相補的な配列を有するアルカリホスフ
ァターゼとは異なる標識を有する核酸プローブであっ
て、配列番号１２または配列番号１３の配列を有する核
酸プローブ、それぞれの標識を測定するための試薬、ハ
イブリダイゼーション試薬および反応容器を含むことを
特徴とする試料中のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の分別
検出用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8180674A JPH1023894A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 試料中の複数種の核酸を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8180674A JPH1023894A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 試料中の複数種の核酸を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1023894A true JPH1023894A (ja) | 1998-01-27 |
Family
ID=16087332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8180674A Pending JPH1023894A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 試料中の複数種の核酸を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1023894A (ja) |
-
1996
- 1996-07-10 JP JP8180674A patent/JPH1023894A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060831 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061221 |