ES2575538T3 - Ensayo para Trichomonas vaginalis mediante amplificación y detección del gen AP65-1 de Trichomonas vaginalis - Google Patents

Abstract

Método para detectar la tricomoniasis, que comprende: proporcionar una muestra biológica; poner en contacto la muestra biológica con una sustancia que comprende un conjunto de sondas oligonucleotídicas que comprende por lo menos una sonda oligonucleotídica que está marcada de manera detectable y presenta una longitud de la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 y por lo menos dos cebadores oligonucleotídicos, presentando cada uno de los cuales una longitud de la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 bajo unas condiciones tales que las sondas y los cebadores se aparean con un gen AP65-1 como se especifica en la SEC ID nº 1 en la localización entre aproximadamente los pares de bases 317 a 560 sobre el gen; amplificar la secuencia diana entre los dos cebadores; y detectar el marcador como una indicación de la hibridación del conjunto de sondas a la secuencia diana indicando así la presencia o la cantidad de tricomoniasis; en el que el conjunto de sondas comprende unos cebadores que presentan una secuencia oligonucleotídica que comprende la SEC ID nº 12 y la SEC ID nº 13 y una sonda que presenta una secuencia oligonucleotídica que comprende la SEC ID nº 14.

Description

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Los oligonucleótidos indicados en la presente memoria presentan como diana el gen AP65-1 contenido dentro de T. vaginalis. El gen AP65-1 es conocido de la técnica y su secuencia presenta una longitud aproximada de 1,7 kb. Ver el número de acceso de Genbank U18346.

En la Tabla 3, a continuación, se presenta uno de dichos conjuntos de sondas, diseñado específicamente para el ensayo de ADC.

Tabla 3

SEC ID

Descripción Secuencia oligonucleótida 5'-3' ~Tf (ºC) Localización de ORF* (pb)

SEC ID nº 7

Elemento de desplazamiento izquierdo (cadena arriba) ACCAACTGTCGGTGAAG 52 352-368

SEC ID nº 21

Elemento de desplazamiento izquierdo (cadena arriba) CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGACCGCGGCATCTAC 46 402-415

SEC ID nº 8

Elemento de desplazamiento derecho (cadena abajo) GAGACCGAGAATAC 42 507-520

SEC ID nº 22

Elemento de desplazamiento derecho (cadena abajo) ACCGCATCGAATGACTGTCTCGGGATGTCCTGGCGTG 42 465-477

SEC ID nº 23

Sonda detectora (6-Fam)-TCCCCGAG (dT)-DabciloGGACATCCTCCGCAACTAC 60 445-463

*nº de acceso de GenBank U18346

El oligonucleótido de desplazamiento izquierdo (ACCAACTGTCGGTGAAG, SEC ID nº 7) puede hibridarse con una secuencia diana complementaria contenida dentro del gen AP65-1. Más concretamente, el elemento de desplazamiento ("bumper") izquierdo se une a la localización en aproximadamente 352-368 pares de bases del gen AP65-1. Esta secuencia oligonucleotídica ha sido diseñada específicamente para unirse a dicha región particular del gen AP65-1.

El oligonucleótido cebador izquierdo incluye SEC ID nº 9 (ACCGCGGCATCTAC) y puede hibridarse con una secuencia diana complementaria contenida dentro del gen AP65-1. Más concretamente, el cebador izquierdo se une a la localización en aproximadamente los pares de bases 402-415 del gen AP65-1. El cebador izquierdo ha sido diseñado específicamente para unirse a dicha región particular del gen AP65-1.

El oligonucleótido de desplazamiento derecho (GAGACCGAGAATAC, SEC ID nº 8) puede hibridarse con una secuencia diana complementaria contenida dentro del gen AP65-1. Más concretamente, el elemento de desplazamiento derecho del gen AP65-1 se une a la localización en los pares de bases 507-520 del gen AP65-1. Esta secuencia oligonucleotídica ha sido diseñada para unirse a dicha región particular del gen AP65-1.

El oligonucleótido cebador derecho contiene la SEC ID nº 10 (ATGTCCTGGCGTG) y puede hibridarse con una secuencia diana complementaria contenida dentro del gen AP65-1. Más concretamente, el cebador derecho se une a la localización en aproximadamente los pares de bases 465-477 del gen AP65-1.

La sonda oligonucleotídica que contiene la SEC ID nº 11 (GGACATCCTCCGCAACTAC) ha sido diseñada para unirse específicamente a los pares de bases 445-463 del gen AP65-1.

Las sondas indicadas anteriormente se describen en términos de que son 100% complementarias a las secuencias de unión a diana de las mismas. Tal como se indica posteriormente, los cebadores y sondas pueden unirse a secuencias diana aunque sean menos de 100% complementarias a dichas regiones. El grado requerido de complementariedad depende de una diversidad de factores, entre ellos la astringencia de las condiciones de unión. Dependiendo de las condiciones de astringencia utilizadas, los cebadores y sondas pueden modificarse para incluir diferentes bases en su secuencia y todavía ser suficientemente complementarios para unirse a la región diana del ácido nucleico de AP65-1. La expresión suficientemente complementario, tal como se utiliza en la presente memoria,

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incluye una complementariedad de 70% o superior. En formas de realización preferidas, la complementariedad de los cebadores/sondas a su secuencia diana es de por lo menos 80% a lo largo de la longitud de la parte de unión de los cebadores/sondas. Más preferentemente, la complementariedad de los cebadores y sondas respecto a las secuencias diana de los mismos es de 90% o superior.

Aunque los oligonucleótidos indicados en la presente memoria deben ser suficientemente complementarios para unirse a las partes respectivas del ácido nucleico de AP65-1, se reconoce que en cierto punto la secuencia del oligonucleótido se convierte en menos complementaria respecto a la secuencia en el ácido nucleico de AP65-1 y puede unirse a otras secuencias de ácidos nucleicos. Por lo tanto, resulta deseable que las sondas oligonucleotídicas sigan siendo suficientemente complementarias a la parte respectiva de las mismas del gen AP651 y no pierdan selectividad para el sitio de unión a diana respectivo.

El conjunto de sondas oligonucleotídicas indicado anteriormente se configura para la utilización en la ADC. Sin embargo, debe apreciarse que mediante experimentación rutinaria el experto en la materia podrá utilizar las secuencias oligonucleótidas indicadas en la presente memoria con o sin modificación como sondas para la utilización en otros ensayos.

Los oligonucleótidos indicados en la presente memoria pueden utilizarse para amplificar una secuencia de ácidos nucleicos dentro de la región diana del gen AP65-1. Además, cualquier secuencia que pueda producirse como resultado de una reacción de amplificación, denominada producto de amplificación, amplímero o amplicón, puede servir como secuencia diana amplificable para los oligonucleótidos indicados en la presente memoria.

En el contexto de la ADC, el conjunto de sondas oligonucleotídicas indicadas puede amplificar una porción de 75 pares de bases del gen AP65-1. De esta manera, los oligonucleótidos pueden amplificar una secuencia de ácidos nucleicos de AP65-1 natural, la segunda cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucleicos del gen AP651 natural y cualquiera de las cadenas de una copia de la secuencia del gen AP65-1 natural, los cuales pueden producirse como resultado de una reacción de amplificación.

Generalmente se utiliza un cebador de amplificación para amplificar una secuencia diana mediante extensión del cebador después de la hibridación con la secuencia diana. Los cebadores de amplificación típicamente presentan una longitud de aproximadamente 10 a 75 nucleótidos, preferentemente presentan una longitud de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos. La longitud total del cebador de amplificación para la utilización en la ADC típicamente es de aproximadamente 25 a 50 nucleótidos.

Un cebador de amplificación de una forma de realización de la invención tal como se indica en la presente memoria resulta útil para la ADC y generalmente presenta tres tipos de secuencia. Una secuencia, una secuencia de unión a la diana, dentro del cebador puede ser capaz de unirse o hibridarse con la secuencia diana. Otra secuencia dentro del cebador puede ser un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción. Todavía otra secuencia dentro del cebador puede actuar como secuencia de nuevo cebado.

La secuencia de unión a diana dentro del cebador oligonucleotídico de amplificación generalmente puede encontrarse localizada en el extremo 3' de la misma. La secuencia de unión a diana puede presentar una longitud de entre aproximadamente 10 y 25 nucleótidos y puede presentar especificidad de hibridación con el cebador de amplificación. De esta manera, se entiende que el experto en la materia puede modificar la secuencia de unión a diana para modificar eficazmente la especificidad de hibridación del cebador de amplificación y dirigir la hibridación a una secuencia alternativa.

Un cebador de amplificación de ADC también puede presentar un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción 5' respecto a la secuencia de unión a la diana. El sitio de reconocimiento en el cebador de amplificación puede permitir que una endonucleasa de restricción realice un corte en una cadena de un ADN dúplex en el caso de que el sitio de reconocimiento esté hemimodificado. Lo anterior ha sido descrito por G. Walker et al. (PNAS 89:392396, 1992, y Nucl. Acids Res. 20:1691-1696, 1992). Los nucleótidos 5' respecto al sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (la "cola") funcionan como sitio de nuevo cebado de la polimerasa al cortarse y desplazarse una muesca en el resto del cebador de amplificación durante la ADC.

La función de nuevo cebado de los nucleótidos de cola sostiene la reacción de ADC y puede permitir la síntesis de múltiples amplicones a partir de una única molécula diana. La cola generalmente presenta una longitud de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos. Su longitud y secuencia generalmente no resultan críticos y pueden seleccionarse y modificarse rutinariamente. Debido a que la secuencia de unión a diana es la parte del cebador que determina su especificidad de diana, para los métodos de amplificación que no requieren secuencias especializadas en los extremos de la diana, el cebador de amplificación generalmente consiste esencialmente de únicamente la secuencia de unión a diana. Para los métodos de amplificación que requieren secuencias especializadas unidas a la diana diferentes del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción cortable y la cola para la ADC (por ejemplo un promotor de ARN polimerasa para la amplificación 3SR, ABSAN o basada en la transcripción) puede requerir secuencias especializadas para unir la secuencia de unión a diana. Lo anterior puede llevarse a cabo utilizando métodos rutinarios para la preparación de oligonucleótidos sin alterar la especificidad de hibridación del

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El marcaje detectable de la sonda de ensayo puede ser una fracción que puede detectarse directa o indirectamente como indicación de la presencia del ácido nucleico diana. Para la detección directa del marcaje, pueden etiquetarse sondas de ensayo con un isótopo radioactivo y detectarse mediante autorradiografía o etiquetarse con una fracción fluorescente y detectarse mediante fluorescencia, tal como es conocido de la técnica. Alternativamente, las sondas de ensayo pueden detectarse indirectamente mediante etiquetaje con un marcaje que requiere reactivos adicionales para convertirlo en detectable. Entre los marcajes indirectamente detectables se incluyen, pro ejemplo, los agentes quimioluminiscentes, los enzimas que producen productos y ligandos de reacción visibles (por ejemplo haptenos, anticuerpos o antígenos) que pueden detectarse mediante unión a parejas de unión específicas marcadas (por ejemplo anticuerpos o antígenos/haptenos). Los ligandos también resultan útiles para inmovilizar el oligonucleótido marcado con ligando (la sonda de captura) en una fase sólida para facilitar su detección. Entre los marcajes particularmente útiles se incluyen biotina (detectable mediante la unión a avidina o estreptavidina marcada) y enzimas tales como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina (detectable mediante la adición de sustratos enzimáticos para producir productos de reacción de color). Los métodos para añadir dichos marcajes a, o para incluir dichos marcajes en, oligonucleótidos son bien conocidos de la técnica y cualesquiera de dichos métodos resultan adecuados para la utilización en la invención descrita en la presente memoria.

Entre los ejemplos de métodos de detección específicos que pueden utilizarse se incluyen un método quimioluminiscente en el que los productos amplificados se detectan utilizando una sonda de captura biotinilada y una sonda detectora conjugada con enzima tal como se indica en la patente US nº 5.470.723. Tras la hibridación de dichas dos sondas de ensayo a sitios diferentes en la región de ensayo de la secuencia diana (entre los sitios de unión de dos cebadores de amplificación), el complejo puede capturarse en una palca de microtitulación recubierta con estreptavidina mediante la sonda de captura, y revelarse la señal quimioluminiscente y leerse en un luminómetro. Como otra alternativa para la detección de productos de amplificación, un cebador de señal tal como se indica en el documento EP 0 678 582 puede incluirse en la reacción de ADC. En dicha forma de realización, se generan productos de amplificación secundaria marcados durante la ADC de una manera dependiente de la amplificación de la diana y puede detectarse como indicación de la amplificación de la diana mediante el marcaje asociado.

La hibridación del oligonucleótido puede ser específica de especie. Es decir, la detección, amplificación o hibridación del oligonucleótido en una especie u organismo o un grupo de especies relacionadas puede producirse sin detección, amplificación o hibridación de oligonucleótidos sustancial en otra especie del mismo género o especie de un género diferente. Los oligonucleótidos dados a conocer en la presente memoria pueden resultar útiles para identificar las tres cepas de T. vaginalis. Lo anterior incluye las cepas 286, 272 e IR78.

Pueden añadirse opcionalmente otras secuencias, según se requiera para realizar una reacción de amplificación seleccionada, a las secuencias de unión a diana dadas a conocer en la presente memoria sin alterar la especificidad de especie del oligonucleótido. A título de ejemplo, los cebadores de amplificación específicos de AP65-1 de T. vaginalis de la invención pueden contener un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BsoBI que crea una mella durante la reacción de ADC.

Resultará evidente para el experto en la materia que otros sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción mellables pueden sustituirse por el sitio de reconocimiento BsoBI, incluyendo, aunque sin limitación, los sitios de reconocimiento dados a conocer en el documento EP 0 684 315. Preferentemente, el sitio de reconocimiento es para una endonucleasa de restricción termofílica de manera que la reacción de amplificación puede llevarse a cabo bajo las condiciones de la ADC termofílica (ADCt). De manera similar, la secuencia de cola del cebador de amplificación (5' respecto al sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción) generalmente no resulta crítica, aunque debe evitarse el sitio de restricción utilizado para la ADC y las secuencias que se hibridan con su propia secuencia de unión a diana o con los otros cebadores.

Por lo tanto, algunos cebadores de amplificación para la ADC según la invención consisten de secuencias 3' de unión a la diana, un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción mellable 5' respecto a la secuencia de unión a diana y una secuencia de cola de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos de longitud 5' respecto al sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción. El sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción mellable y la secuencia de cola son secuencias requeridas para la reacción de ADC. Para otras reacciones de amplificación, los cebadores de amplificación según la invención pueden consistir de las secuencias de unión a diana dadas a conocer únicamente (por ejemplo para la PCR) o la secuencia de unión a diana y secuencias adicionales requeridas para la reacción de amplificación seleccionada (por ejemplo las secuencias requeridas para la ADC tal como se ha indicado anteriormente o un promotor reconocido por la ARN polimerasa para 3SR).

En la ADC, los cebadores de desplazamiento no resultan esenciales para la especificidad de especie, ya que funcionan desplazando los cebadores de amplificación específicos de especie cadena abajo. Sólo se requiere que los cebadores de desplazamiento se hibriden con la diana cadena arriba de los cebadores de amplificación de manera que al extenderse desplacen el cebador de amplificación y el producto de extensión del mismo. Por lo tanto, la secuencia particular del cebador de desplazamiento generalmente no resulta crítica y puede derivarse de cualquier secuencia diana cadena arriba (respecto al cebador de amplificación izquierdo) o cadena abajo (respecto

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distancia entre los pigmentos y reduce la inhibición de la fluorescencia. El despliegue de la estructura secundaria con apareamiento de bases típicamente implica apareamiento de bases intermolecular, entre la secuencia de la estructura secundaria y una cadena complementaria, de manera que la estructura secundaria resulta por lo menos parcialmente interrumpida. Puede linearizarse por completo en presencia de una cadena complementaria de longitud suficiente. En una forma de realización preferente, se encuentra presente un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción (SRER) entre los dos pigmentos de manera que el apareamiento de bases intermolecular, entre la estructura secundaria y una cadena complementaria también convierta el SRER en un sitio de doble cadena y cortable o mellable por la enonucleasa de restricción. El corte o creación de mella por parte de la endonucleasa de restricción separa los pigmentos donante y aceptor en fragmentos de ácido nucleico separados, contribuyendo adicionalmente a una menor inhibición. En cualquiera de las formas de realización, se lleva a cabo un seguimiento de los cambios asociados en un parámetro de la fluorescencia (por ejemplo un incremento de la intensidad de fluorescencia del donante, una reducción de la intensidad de fluorescencia del aceptor o una proporción de fluorescencia antes y después del despliegue) a modo de indicación de la presencia de la secuencia diana. El seguimiento de un cambio en la intensidad de fluorescencia del donante resulta preferente, ya que este cambio típicamente es mayor que el cambio en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. También pueden seguirse otros parámetros de la fluorescencia, tales como el cambio en el tiempo de vida media de la fluorescencia.

Un oligonucleótido detector para la ADCt fluorescente en tiempo real homogénea es un oligonucleótido que comprende una sección 5' o 3' de cadena sencilla que se hibrida con la secuencia diana (la secuencia de unión a diana) y una estructura secundaria con apareamiento de bases intramolecular contigua a la secuencia de unión a diana. Los oligonucleótidos detectores de la invención comprenden además una pareja de pigmentos donante/aceptor unido al oligonucleótido detector, de manera que la fluorescencia del donante se encuentra inhibida cuando la estructura secundaria presenta apareamiento de bases intramolecular y el despliegue o linearización de la estructura secundaria resulta en una reducción de la inhibición de la fluorescencia. El corte del oligonucleótido se refiere a la rotura de los enlaces fosfodiéster de ambas cadenas de un ADN dúplex o la rotura del enlace fosfodiéster de un ADN de cadena sencilla. Esto contrasta con la creación de mellas, que se refiere a la rotura del enlace fosfodiéster de únicamente una de las dos cadenas en un ADN dúplex.

Los oligonucleótidos detectores de la invención para la ADCt fluorescente en tiempo real homogénea comprenden una secuencia que forma una estructura secundaria con apareamiento de bases intramolecular bajo las condiciones de reacción seleccionadas para la extensión o hibridación del cebador. La estructura secundaria se posiciona contiguamente a la secuencia de unión diana del oligonucleótido detector de manera que por lo menos una parte de la secuencia de unión a diana forme una cola 3' o 5' de cadena sencilla. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "contiguo a la secuencia de unión a diana" se refiere a que la totalidad o una parte de la secuencia de unión a diana se mantiene como de cadena sencilla en una cola 5' o 3' que se encuentra disponible para la hibridación con la diana. Es decir, la estructura secundaria no comprende la secuencia de unión a diana entera. Una parte de la secuencia de unión a diana puede participar en el apareamiento de bases intramolecular en la estructura secundaria, puede incluir la totalidad o parte de una primera secuencia que participa en el apareamiento de bases intramolecular en la estructura secundaria, puede incluir la totalidad o parte de una primera secuencia que participa en el apareamiento de bases intramolecular en la estructura secundaria pero preferentemente no se extiende hacia el interior de su secuencia complementaria. Por ejemplo, en el caso de que la estructura secundaria sea una estructura de tallo-bucle (por ejemplo una "horquilla") y la secuencia de unión a diana del oligonucleótido detector se encuentre presente en forma de una cola 3' de cadena sencilla, la secuencia de unión a diana puede extenderse también a través de la totalidad o parte del primer brazo del tallo y, opcionalmente, a través de la totalidad o parte del bucle. Sin embargo, la secuencia de unión a diana preferentemente no se extiende hacia el interior del segundo brazo de la secuencia que participa en el apareamiento de bases intramolecular del tallo. Es decir, resulta deseable evitar que ambas secuencias participen en el apareamiento de bases intramolecular en una estructura secundaria capaz de hibridarse con la diana. Las no correspondencias en la parte de apareamiento de bases intramolecular de la estructura secundaria del oligonucleótido detector puede reducir la magnitud del cambio de fluorescencia en presencia de diana, aunque son aceptables en el caso de que no sea importante la sensibilidad del ensayo. Las no correspondencias en la secuencia de unión a diana de la cola de cadena sencilla también son aceptables, aunque de manera similar pueden reducir la sensibilidad y/o especificidad del ensayo. Sin embargo, es una característica de la invención descrita en la presente memoria que el apareamiento de bases perfecto en tanto la estructura secundaria como la secuencia de unión a diana no compromete la reacción. Las correspondencias perfectas en la secuencias que participan en la hibridación mejora la especificidad del ensayo sin efectos negativos sobre la cinética de la reacción.

Al añadirlos a la reacción de amplificación, los cebadores de señal oligonucleótidos detectores de la invención se convierten en la forma de doble cadena mediante hibridación y extensión de un cebador de amplificación tal como se ha indicado anteriormente. El desplazamiento de cadena por la polimerasa también despliega o lineariza la estructura secundaria y la convierte en una doble cadena mediante la síntesis de una cadena complementaria. El SRER, en caso de estar presente, también se convierte en doble cadena y en cortable o mellable por la endonucleasa de restricción. Debido a que la estructura secundaria es desplegada o linearizada por la actividad de desplazamiento de cadena de la polimerasa, se incrementa la distancia entre el pigmento donante y aceptor, reduciendo de esta manera la inhibición de la fluorescencia del donante. El cambio asociado de fluorescencia del pigmento donante o aceptor puede seguirse o detectarse como indicación de la amplificación de la secuencia diana.

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Por ejemplo, puede inmovilizarse un oligonucleótido detector marcado con biotina sobre una fase sólida modificada con avidina en donde producirá un cambio de fluorescencia al ser expuesto a la diana bajo condiciones de hibridación apropiadas. La captura de la diana de esta manera facilita la separación de la diana respecto de la muestra y permite la eliminación de sustancias en la muestra que podrían interferir con la detección de la señal u otros aspectos del ensayo.

Por conveniencia comercial, los oligonucleótidos útiles para la detección e identificación específicas de los ácidos nucleicos de AP65-1 de T. vaginalis pueden empaquetarse en forma de un kit. Típicamente, dicho kit contiene los oligonucleótidos según la invención. Los reactivos para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácidos nucleicos también pueden incluirse con los oligonucleótidos específicos de AP65-1 de T. vaginalis. Por ejemplo, pueden incluirse tampones, otros oligonucleótidos, nucleótidos trifosfato, enzimas, etc. Los componentes del kit pueden empaquetarse juntos en un mismo recipiente. Opcionalmente pueden incluirse instrucciones que ilustran una forma de realización descrita para llevar a cabo una forma de realización específica de los métodos inventivos. También pueden incluirse en el kit otros componentes opcionales, por ejemplo un oligonucleótido etiquetado con un marcaje adecuado para la utilización como sonda de ensayo y/o reactivos o medios para detectar el marcaje.

En una forma de realización, un kit puede incluir por lo menos un oligonucleótido útil en el contexto de la ADC. Los oligonucleótidos indicados en la presente memoria pueden resultar útiles como cebadores de amplificación, cebadores de desplazamiento o sondas.

En otra forma de realización, el kit puede incluir por lo menos un oligonucleótido indicado en la presente memoria y componentes opcionales útiles en el contexto de la ADC. Dichos componentes opcionales pueden ser tampones, nucleótidos trifosfato, enzimas, etc. Opcionalmente, los reactivos para la detección simultánea de una secuencia diana, tal como una sonda, pueden incluirse en el kit. El experto en la materia conocerá cómo optimizar dicho kit para las reacciones de amplificación con el fin de detectar e identificar T. vaginalis utilizando los oligonucleótidos indicados en la presente memoria.

En todavía otra forma de realización, el kit puede utilizarse para detectar y diagnosticar si una muestra clínica contiene ADN de AP65-1 de T. vaginalis. La muestra clínica puede añadirse al kit de manera que puede amplificarse y detectarse una secuencia de ácidos nucleicos utilizando los oligonucleótidos indicados en la presente memoria.

Además, el kit puede incluir oligonucleótidos y reactivos para la ADC en formato seco o líquido. Los componentes del kit pueden ser más estables y fáciles de manipular en formato seco. Los componentes secos del kit pueden añadirse o pretratarse a una fase sólida, tal como una placa de microtitulación, micromatriz u otro receptáculo apropiado, en el que sólo se requiere añadir la muestra y tampón de ADC. Este formato facilita el ensayo de múltiples muestras simultáneamente y resulta útil en método de alto rendimiento. Pueden utilizarse los instrumentos BD ProbeTecTM y ViperTM XTR.

Los Ejemplos a continuación ilustran unas formas de realización específicas de la invención descrita en la presente memoria. Tal como resultará evidente para el experto en la materia, son posibles diversos cambios y modificaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: sensibilidad del ensayo

Se evaluó la sensibilidad analítica de Trichomonas vaginalis ATCC nº 30001 utilizando el ensayo de ADC a 104/reacción, 103/reacción y 102/reacción que contiene un tampón de bicina/KOH (pH 8,6) con cosolventes. El sistema de ADC con diana en la región conservada del gen AP65-1 se sometió a ensayo frente a cuatro réplicas del gen AP65-1 (Tabla 4). La sensibilidad del ensayo de ADC de T. vaginalis puede considerarse igual o inferior a las 20 copias de diana en cada ensayo.

Tabla 4

Sensibilidad de ensayo

Réplica 1 2 3 4

104/reacción Positivo Positivo Positivo Positivo 103/reacción Positivo Positivo Positivo Positivo 102/reacción Positivo Positivo Positivo Positivo

El ensayo de ADC del gen AP65-1 presenta como diana una región de 75 pb del gen AP65-1 entre los pares de bases 402 y 477.

Ejemplo 2: sistema de PCR Taqman® para la detección de AP65-1

Se diseñaron conjuntos de sondas para llevar a cabo la PCR Taqman® del gen AP65-1. La PCR en tiempo real Taqman® es un tipo de PCR cuantitativa. Taqman® utiliza una sonda fluorigénica que es un oligonucleótido de 5 cadena sencilla de 20 a 26 nucleótidos y está diseñado para unirse únicamente a la secuencia de ADN entre los dos cebadores de PCR. En Taqman®, los pigmentos informadores y pigmentos inhibidores se unen a la sonda. La sonda se hibrida con el ADN alternando la temperatura para desnaturalizar y rehibridar el ADN. La polimerasa Taq añade nucleótidos al ADN diana y ésta elimina la sonda Taqman® del ADN molde. Al separar el pigmento informador del pigmento inhibidor, el pigmento informador emite energía que es detectable. La energía se cuantifica utilizando un

10 ordenador, que proporciona una señal que indica que la diana ha sido detectada.

Para poner en práctica la PCR Taqman®, se utilizan dos cebadores de PCR con un tamaño de producto preferente de entre 50 y 150 pares de bases y una sonda con un informador fluorescente, o fluoróforo (por ejemplo 6carboxifluoresceína (FAM) y tetraclorofluoresceína (TET)) y un inhibidor tal como tetrametilrodamina (TAMRA) unido

15 covalentemente a sus extremos 5' y 3'. Los informadores fluorescentes y fluoróforos adecuados son bien conocidos y no se describen en detalle en la presente memoria. Se describen tres conjuntos de sondas Taqman® ejemplares para la utilización en el gen AP65-1 altamente conservado en la Tabla 7, a continuación.

Cada conjunto de sondas consiste de un cebador directo (CD), un cebador inverso (CI) y una sonda (S). 20 Tabla 7: ejemplos de conjuntos de sondas de PCR Taqman®

SEC ID nº

Nombre Descripción 5' Secuencia 3' ~Tf (ºC) Localización del ORF (pb)

SEC ID nº 12

CD de Taqman® de AP65-1 Cebador directo Taqman® de AP65-1 GAAGATTCTGGCAAGATCAAGGA 58 448-470

SEC ID nº 13

CI de Taqman® de AP65-1 Cebador inverso Taqman® de AP65-1 ACGACAATGCAGCGGATGT 59 497-515

SEC ID nº 14

S de Taqman® de AP65-1 Sonda Taqman® de AP65-1 ATCCTCCGCAACTACCCACGCCA 69 472-494

SEC ID nº 15

CD2 de Taqman® de AP65-1 Cebador directo Taqman® 2 de AP65-1 TTCACACCAACTGTCGGTGAAG 59 369-391

SEC ID nº 16

CI2 de Taqman® de AP65-1 Cebador inverso Taqman® 2 de AP65-1 ATGTAGATGCCGCGGTATGAT 58 420-440

SEC ID nº 17

S2 de Taqman® de AP65-1 Sonda Taqman® 2 de AP65-1 TTGCCAGAAGTGGGCTACACACA CCGTC 70 393-418

SEC ID nº 18

CD3 de Taqman® de AP65-1 Cebador directo Taqman® 3 de AP65-1 CAGAGGAAACAATGCCAATTCTT 58 347-369

SEC ID nº 19

CI3 de Taqman® de AP65-1 Cebador inverso Taqman® 3 de AP65-1 TGACGGTGTGTAGCCCACTTC 60 399-419

SEC ID nº 20

S3 de Taqman® de AP65-1 Sonda Taqman® 3 de AP65-1 ACACCAACTGTCGGTGAAGCTTG CC 68 373-397

Las sondas se diseñan para aparearse con la localización de ORG en el gen AP65-1 que se indica en la Tabla. La 25 figura 2 ilustra los sitios de unión en el gen AP65-1 para los cebadores y sondas indicados en la Tabla 7.

Además de los cebadores y sondas, la PCR Taqman® requiere reactivos que se utilizan para la PCR habitual (por ejemplo polimerasa, nucleótidos libres), así como un aparato de PCR en tiempo real para el análisis de los datos. Los reactivos y equipos son bien conocidos por el experto en la materia y no se exponen en detalle en la presente

30 memoria.

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